KR20110011675A

KR20110011675A - 4 탄소 알코올의 생산을 위해 개선된 효모 균주

Info

Publication number: KR20110011675A
Application number: KR1020107027769A
Authority: KR
Inventors: 로버트 에이. 라로싸
Original assignee: 부타맥스 어드밴스드 바이오퓨얼스 엘엘씨
Priority date: 2008-05-12
Filing date: 2009-05-08
Publication date: 2011-02-08
Also published as: US8389252B2; NZ588170A; AU2009246622B2; MX2010012191A; BRPI0907704A2; US20130130342A1; CA2724304A1; US20090280546A1; ZA201006984B; WO2009140159A1; EP2276837A1; AU2009246622A1; US8940511B2

Abstract

아미노산 기아에 대한 일반 제어 반응이 감소된 효모 세포는 성장 배지 내의 부탄올에 대해 증가된 내성을 가진다는 것을 발견하였다. 반응에 관련된 유전자인 GCN 유전자를 유전적으로 개질하여 암호화된 단백질의 활성을 제거함으로써 반응의 감소를 조작하였다. 조작된 부탄올 생합성 경로 및 아미노산 기아에 대한 일반 제어 반응에 관련된 유전자의 유전적 개질을 가지며 부탄올 내성이 증가된 효모 균주는 부탄올의 생산에 있어서 유용하다.

Description

4 탄소 알코올의 생산을 위해 개선된 효모 균주 {IMPROVED YEAST STRAIN FOR PRODUCTION OF FOUR CARBON ALCOHOLS}

본 출원은 2008년 5월 12일자 출원되어 현재 계류중인 미국 출원 제61/052286호 및 제61/052289호에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명은 미생물학 및 유전공학 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 부탄올에 대한 반응에 관련된 효모 유전자를 동정하였다. 동정된 유전자의 발현이 감소된 효모 균주에서는 부탄올 존재하의 성장 수율(growth yield)이 개선되는 것을 발견하였다.

부탄올은 연료 첨가제, 플라스틱 산업에서의 공급 원료 화학물질, 및 식품 및 향미료 산업에서의 식용 등급 추출제로서 유용한 산업용 화학물질이다. 매년 4.5 내지 5.4 테라그램(100 내지 120억 파운드)의 부탄올이 석유화학적 수단에 의해 생산되며 이 범용 화학물질의 수요는 증가할 것으로 보인다.

부탄올의 화학적 합성 방법이 공지되어 있으나, 이들 공정은 석유화학물질 유래의 출발 물질을 사용하며, 일반적으로 비용이 많이 들고, 환경친화적이지 못하다. 발효에 의해 부탄올을 생산하는 방법 또한 공지되어 있으며, 그 중에 가장 많이 쓰이는 공정은 ABE 공정이라고 지칭되는 것으로서 아세톤, 1-부탄올 및 에탄올의 혼합물을 생산한다(Blaschek et al., 미국 특허 제6,358,717호). 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)에 의한 아세톤-부탄올-에탄올(ABE) 발효는 가장 오래된 공지의 산업적 발효 중의 하나이며, 이들 용매의 생산을 담당하는 경로 및 유전자가 보고되어 있다(Girbal et al., Trends in Biotechnology 16:11-16 (1998)). 효모 발효의 부산물로서 아이소부탄올이 생물학적으로 생성된다. 이 그룹의 진균에 의한 불완전한 아미노산 대사작용의 결과로서 형성되는 것은 "퓨젤유(fusel oil)" 성분이다. 아이소부탄올은 L-발린의 이화작용으로부터 특이적으로 생성된다. L-발린의 아민 그룹이 질소 공급원으로서 수거된 후에, 생성된 a-케토산은 소위 에를리히 경로(Ehrlich pathway)의 효소들에 의해 탈탄산화되고 환원되어 아이소부탄올이 된다(Dickinson et al., J. Biol. Chem. 273(40):25752-25756 (1998)). 음료 발효 과정에서 얻어지는 퓨젤유 및/또는 그의 성분의 수율은 통상적으로 낮다.

또한, 1-부탄올 생합성 경로(Donaldson et al., 동시계류중이며 공유인 미국 특허출원공개 제20080182308호), 2-부탄올 생합성 경로(Donaldson et al., 동시계류중이며 공유인 미국 특허출원공개 제US 20070259410A1호 및 제US 2007-0292927호) 및 아이소부탄올 생합성 경로(Maggio-Hall et al., 동시계류중이며 공유인 미국 특허출원공개 제US 20070092957)를 발현하는 재조합 미생물 생산 숙주가 기술된 바 있다.

부탄올 생산을 위한 발효에 사용되는 숙주 미생물에 대한 부탄올 독성으로 인해 부탄올의 생물학적 생산이 제한되는 것으로 생각되고 있다. 화학적 돌연변이 유발(Jain et al. 미국 특허 제5,192,673호; 및 Blaschek et al. 미국 특허 제6,358,717호), 스트레스 반응 단백질을 발현시키는 것과 같은 특정 부류의 유전자의 과발현(Papoutsakis et al. 미국 특허 제6,960,465호; 및 Tomas et al., Appl. Environ. Microbiol. 69(8):4951-4965 (2003)), 및 연쇄적 강화(serial enrichment)(Quratulain et al., Folia Microbiologica (Prague) 40(5):467-471 (1995); 및 Soucaille et al., Current Microbiology 14(5):295-299 (1987))에 의해 1-부탄올에 대한 내성을 가진 클로스트리디움 균주가 분리되었다. 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 및 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei)에서 2 개의 스트레스 반응성 단백질 GroESL을 과발현시키면 0.5% 부피/부피(v/v)[0.4% 중량/부피(w/v)] 1-부탄올의 존재하에 성장할 수 있는 균주가 생성된다는 것이 문헌( Desmond et al., Appl. Environ. Microbiol. 70(10):5929-5936 (2004))에 보고되었다. 또한, 하구 퇴적물(estuary sediment)(Sardessai et al., Current Science 82(6):622-623 (2002)) 및 활성 슬러지(activated sludge)(Bieszkiewicz et al., Acta Microbiologica Polonica 36(3):259-265 (1987))로부터 분리된 1-부탄올 내성 균주가 문헌에 기술된 바 있다. 미생물 컨소시엄(microbial consortia)(동시계류중이며 공유인 미국 특허공개 제20070259411호, 제20080124774호 및 제20080138870호)으로부터, 또는 돌연변이체 스크리닝(동시계류중이며 공유인 미국 특허출원 제12/330530호, 제12/330531호 및 제12/330534호)에 의해 부탄올 내성 박테리아 균주가 분리되었다.

부탄올에 대해 더욱 강한 내성을 지닌 부탄올 생산 효모 균주와 더불어, 이들 화학물질에 더욱 강한 내성을 지니며 부탄올을 생산하도록 조작된 효모 숙주 균주를 사용하여 부탄올을 생산하는 방법이 여전히 필요하다.

본 발명은, 부탄올을 생산하며 아미노산 기아(amino acid starvation)에 대한 일반 제어 반응(general control response)에 있어서 반응의 감소를 유발하는 유전적 개질을 포함하는 재조합 효모 숙주를 제공한다. 이러한 세포는 유전적 개질을 하지 않은 세포에 비해 부탄올에 대한 내성이 강하다. 아미노산 기아에 대한 일반 제어 반응에 있어서의 반응의 감소는 반응에 영향을 미치는 내인성 유전자의 돌연변이를 통해 달성할 수 있다. 본 발명의 숙주 세포는 자연적으로 부탄올을 생산할 수도 있고, 조작된 경로를 통해 부탄올을 생산하도록 조작될 수도 있다.

따라서 본 발명은 부탄올을 생산하는 재조합 효모 숙주 세포를 제공하며,여기에서 효모 세포는 아미노산 기아에 대한 일반 제어 반응에서 반응을 감소시키는 적어도 하나의 유전적 개질을 포함한다.

한 구현예에서 본 발명의 효모 세포는 Gcn1p, Gcn2p, Gcn3p, Gcn4p, Gcn5p 및 Gcn20p로부터 선택된 단백질을 암호화하는 유전자에 유전적 개질을 포함한다.

다른 구현예에서 효모 세포는 하기의 경로들로 구성된 그룹으로부터 선택된 재조합 생합성 경로를 포함한다:

a) 1-부탄올 생합성 경로;

b) 2-부탄올 생합성 경로; 및

c) 아이소부탄올 생합성 경로.

다른 구현예에서 본 발명은 하기의 단계들을 특징으로 하여 부탄올을 생산하는 방법을 제공한다:

(a) 1) 부탄올을 생산하며

2) 아미노산 기아에 대한 일반 제어 반응에서 반응을 감소시키는 적어도 하나의 유전적 개질을 포함하는

재조합 효모 숙주 세포를 제공하는 단계; 및

(b) 부탄올이 생산되는 조건하에 단계 (a)의 균주를 배양하는 단계.

도면의 간단한 설명 및 서열 설명
본 발명의 다양한 구현예는 하기의 상세한 설명, 도면 및 첨부된 서열 설명으로부터 더욱 완전하게 이해될 수 있으며, 이들은 본 출원의 일부를 형성한다.
<도 1>
도 1은 상이한 농도의 아이소부탄올을 함유하는 YVCM 내에서의 성장에 있어서 8 시간(A) 및 24 시간(B) 시점에서 야생형, 돌연변이체 GCN2 및 돌연변이체 GCN4 균주의 분획 성장 수율(fractional growth yield)을 나타낸다.
<도 2>
도 2는 상이한 농도의 아이소부탄올을 함유하는 YPD 내에서의 성장에 있어서 7 시간(A) 및 23 시간(B) 시점에서 야생형, 돌연변이체 GCN2 및 돌연변이체 GCN4 균주의 분획 성장 수율을 나타낸다.
본 발명은 하기의 상세한 설명 및 첨부된 서열 설명으로부터 더욱 완전하게 이해될 수 있으며, 이들은 본 출원의 일부를 형성한다.
하기의 서열들은 37 C.F.R. 1.821-1.825("뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열 개시를 포함하는 특허출원에 관한 요건 - 서열 규정")을 따르며 세계지적재산권기구(WIPO: World Intellectual Property Organization) 표준 ST.25(1998), 및 EPO 및 PCT의 서열 목록 요건(규정 5.2 및 49.5(a-bis), 및 시행세칙의 섹션 208 및 부칙 C)에 부합한다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이터에 사용된 기호 및 체제는 37 C.F.R. §1.822에 제시된 규정을 준수한다.
[표 1]

[표 2]

[표 3]

[표 4]

서열번호 76은 실시예 2에 기술된 GPD 프로모터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 77은 실시예 2에 기술된 CYC1 터미네이터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 78은 실시예 2에 기술된 FBA 프로모터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 79는 실시예 2에 기술된 ADH1 프로모터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 80은 실시예 2에 기술된 ADH1 터미네이터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 81은 실시예 2에 기술된 GPM 프로모터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 82-137은 본 명세서에 기술된 실시예에서 사용된 올리고뉴클레오티드 클로닝, 스크리닝 또는 서열분석 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 138은 "URA3 반복" 단편의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 139 및 140은 gcn2 결실에 대한 DNA 단편을 증폭하기 위해 사용된 PCR 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 141 및 142는 gcn4 결실에 대한 DNA 단편을 증폭하기 위해 사용된 PCR 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 143 및 144는 "URA3 반복" 단편에서 URA3^{+ :} 양 옆의 직접 반복에 경계를 이루는 프라이머 결합 서열이다.
서열번호 145 및 146은 "URA3 반복" 단편에서 프로모터 및 코딩 서열의 양 옆에 있는 직접 반복 서열이다.
서열번호 147은 "URA3 반복" 단편의 프로모터 서열이다.
서열번호 148은 "URA3 반복" 단편의 URA3 코딩 서열이다.

본 발명은, 부탄올을 생산하며 아미노산 기아에 대한 일반 제어 반응에서 반응의 감소를 유발하는 유전적 개질을 포함하는 재조합 효모 숙주를 제공한다. 이러한 세포는 유전적 개질을 하지 않은 세포에 비해 부탄올에 대한 내성이 강하다. 본 발명의 내성 효모 균주는 아미노산 기아에 대한 일반 제어 반응의 감소를 유발하는 적어도 하나의 유전적 개질을 가진다. 반응에 영향을 미치는 내인성 유전자의 돌연변이를 통해 상기의 반응 감소를 달성할 수 있다.

본 발명의 숙주 세포는 천연적으로 부탄올을 생산할 수도 있고, 조작된 경로를 통해 부탄올을 생산하도록 조작될 수도 있다.

본 균주를 사용하여 생산된 부탄올은 화석 연료의 대체 에너지원으로 사용될 수 있다. 발효에 의한 부탄올의 생산은 통상적인 석유화학적 합성에 비해 적은 오염 물질을 발생시킨다.

명세서 및 청구범위를 설명하기 위해 하기의 약어 및 정의를 사용한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "포함하다", "포함하는", "함유하다", "함유하는", "갖는다", "갖는", "포함되어 있다" 또는 "포함되어 있는" 이라는 용어 또는 이들의 임의의 다른 변형은 배타적이지 않은 포함을 커버하고자 한다. 예를 들어, 요소들의 목록을 포함하는 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 용품, 또는 장치는 반드시 그러한 요소만으로 제한되지는 않고, 명확하게 열거되지 않거나 그러한 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 용품, 또는 장치에 내재적인 다른 요소를 포함할 수도 있다. 더욱이, 명백히 반대로 기술되지 않는다면, "또는"은 포괄적인 '또는'을 말하며, 배타적인 '또는'을 말하는 것은 아니다. 예를 들어, 조건 A 또는 B는 하기 중 어느 하나에 의해 만족된다: A는 참(또는 존재함)이고 B는 거짓(또는 존재하지 않음), A는 거짓(또는 존재하지 않음)이고 B는 참(또는 존재함), A 및 B 모두가 참(또는 존재함).

또한, 본 발명의 요소 또는 성분 앞의 부정 관사 ("a" 및 "an")는 요소 또는 성분의 경우 (즉, 존재)의 수에 관해서는 비제한적인 것으로 의도된다. 따라서, 부정 관사 ("a" 및 "an")는 하나 또는 적어도 하나를 포함하는 것으로 파악되어야 하며, 당해 요소 또는 성분의 단수형은 그 수가 명백하게 단수임을 의미하는 것이 아니라면 복수형도 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "발명" 또는 "본 발명"은 비한정적 용어로서 특정 발명의 단일 구현예를 지칭하기 위한 것이 아니고 명세서 및 청구범위에 기술된 모든 가능한 구현예를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 채용된 발명의 성분 또는 반응물의 분량을 수정하는 용어 "약"은, 예를 들어, 현실에서 농축물을 제조하거나 용액을 사용함에 있어서의 통상적 측정 및 액체 취급 과정; 이들 과정에서의 우발적인 오차; 조성물을 제조하거나 방법을 실행하기 위해 채용된 성분의 제조, 공급원 또는 순도의 차이; 등을 통해 발생할 수 있는 숫자상의 분량 편차를 지칭한다. 용어 "약"은 또한 특정 초기 혼합물로부터 유발되는 조성물에 대한 상이한 평형 조건으로 인해 달라지는 양을 포함한다. 용어 "약"에 의한 수정 여부를 불문하고, 청구범위는 분량의 균등물을 포함한다. 한 구현예에서, 용어 "약"은 보고된 수치의 10% 이내, 바람직하게는 보고된 수치의 5% 이내를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "부탄올"은 1-부탄올, 2-부탄올, 아이소부탄올, 또는 그의 혼합물을 지칭한다.

용어 "부탄올 내성 효모 균주" 및 "내성"은, 본 발명의 개질된 효모 균주를 기술하기 위해 사용되는 경우에, 그것이 유래된 모균주에 비해 부탄올 존재하에서의 성장이 더 우수한 개질 효모를 지칭한다.

용어 "부탄올 생합성 경로"는 1-부탄올, 2-부탄올 또는 아이소부탄올을 생산하는 효소 경로를 지칭한다.

용어 "1-부탄올 생합성 경로"는 아세틸-조효소 A(아세틸-CoA)로부터 1-부탄올을 생산하는 효소 경로를 지칭한다.

용어 "2-부탄올 생합성 경로"는 파이루베이트로부터 2-부탄올을 생산하는 효소 경로를 지칭한다.

용어 "아이소부탄올 생합성 경로"는 파이루베이트로부터 아이소부탄올을 생산하는 효소 경로를 지칭한다.

용어 "아세틸-CoA 아세틸트랜스페라제"는 2 분자의 아세틸-CoA가 아세토아세틸-CoA 및 조효소 A(CoA)로 전환되는 것을 촉매하는 효소를 지칭한다. 바람직한 아세틸-CoA 아세틸트랜스페라제는 단쇄 아실-CoA 및 아세틸-CoA에 대한 기질 선호도(정방향 반응)를 가지며 E.C. 2.3.1.9 [Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego]로 분류되는 아세틸-CoA 아세틸트랜스페라제이지만, 더 넓은 기질 범위를 가진 효소(E.C. 2.3.1.16)도 마찬가지로 기능할 것이다. 아세틸-CoA 아세틸트랜스페라제는 다수의 공급원, 예를 들어 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli)(젠뱅크(GenBank) 번호: NP_416728, NC_000913; NCBI(국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)) 아미노산 서열, NCBI 뉴클레오티드 서열), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (젠뱅크 번호: NP_349476.1 (서열번호 2), NC_003030; NP_149242 (서열번호 4), NC_001988), 바실러스 서브틸리스(젠뱅크 번호: NP_390297, NC_000964), 및 사카로마이세스 세레비시아(젠뱅크 번호: NP_015297, NC_001148 (서열번호 39))로부터 이용가능하다.

용어 "3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제"는 아세토아세틸-CoA로부터 3-하이드록시부티릴-CoA로의 전환을 촉매하는 효소를 지칭한다. 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제는 환원형 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NADH)-의존성일 수 있고, (S)-3-하이드록시부티릴-CoA 또는 (R)-3-하이드록시부티릴-CoA에 대한 기질 선호도를 가지며, E.C. 1.1.1.35 및 E.C. 1.1.1.30으로 각각 분류된다. 또한, 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제는 환원형 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트(NADPH)-의존성일 수 있고, (S)-3-하이드록시부티릴-CoA 또는 (R)-3-하이드록시부티릴-CoA에 대한 기질 선호도를 가지며, E.C. 1.1.1.157 및 E.C. 1.1.1.36으로 각각 분류된다. 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제는 다수의 공급원, 예를 들어, 씨. 아세토부틸리쿰(젠뱅크 번호: NP_349314 (서열번호 6), NC_003030), 비. 서브틸리스(젠뱅크 번호: AAB09614, U29084), 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)(젠뱅크 번호: ZP_0017144, NZ_AADY01000001, 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus)(젠뱅크 번호: YP_294481, NC_007347), 및 에이. 유트로퍼스(젠뱅크 번호: P14697, J04987)로부터 이용가능하다.

용어 "크로토나제"는 3-하이드록시부티릴-CoA로부터 크로토닐-CoA 및 H₂O로의 전환을 촉매하는 효소를 지칭한다. 크로토나제는 (S)-3-하이드록시부티릴-CoA 또는 (R)-3-하이드록시부티릴-CoA에 대한 기질 선호도를 가질 수 있으며 E.C. 4.2.1.17 및 E.C. 4.2.1.55로 각각 분류된다. 크로토나제는 다수의 공급원, 예를 들어, 이. 콜라이(젠뱅크 번호: NP_415911 (서열번호 8), NC_000913), 씨. 아세토부틸리쿰(젠뱅크 번호: NP_349318, NC_003030), 비. 서브틸리스(젠뱅크 번호: CAB13705, Z99113), 및 에어로모나스 카비아(Aeromonas caviae)(젠뱅크 번호: BAA21816, D88825)으로부터 이용가능하다.

트랜스-에노일 CoA 리덕타제라고도 하는 용어 "부티릴-CoA 데하이드로게나제"는 크로토닐-CoA로부터 부티릴-CoA로의 전환을 촉매하는 효소를 지칭한다. 부티릴-CoA 데하이드로게나제는 NADH-의존성 또는 NADPH-의존성일 수 있으며, E.C. 1.3.1.44 및 E.C. 1.3.1.38로 각각 분류된다. 부티릴-CoA 데하이드로게나제는 다수의 공급원, 예를 들어, 씨. 아세토부틸리쿰(젠뱅크 번호: NP_347102 (서열번호 10), NC_003030), 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)(젠뱅크 번호: Q5EU90, AY741582), 스트렙토마이세스 콜리너스(Streptomyces collinus)(젠뱅크 번호: AAA92890, U37135), 및 스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor)(젠뱅크 번호: CAA22721, AL939127)로부터 이용가능하다.

용어 "부티르알데히드 데하이드로게나제"는 NADH 또는 NADPH를 보조인자로 사용하여 부티릴-CoA로부터 부티르알데히드로의 전환을 촉매하는 효소를 지칭한다. NADH를 선호하는 부티르알데히드 데하이드로게나제는 E.C. 1.2.1.57로서 공지되어 있으며, 예를 들어 클로스트리디움 베이어린키(젠뱅크 번호: AAD31841 (서열번호 12), AF157306) 및 씨. 아세토부틸리쿰(젠뱅크 번호: NP_149325, NC_001988)로부터 이용가능하다.

용어 "1-부탄올 데하이드로게나제"는 부티르알데히드로부터 1-부탄올로의 전환을 촉매하는 효소를 지칭한다. 1-부탄올 데하이드로게나제는 알코올 데하이드로게나제의 넓은 패밀리의 서브셋이다. 1-부탄올 데하이드로게나제는 NADH- 또는 NADPH-의존성일 수 있다. 1-부탄올 데하이드로게나제는, 예를 들어, 씨. 아세토부틸리쿰(젠뱅크 번호: NP_149325, NC_001988; NP_349891 (서열번호 14), NC_003030; 및 NP_349892 (서열번호 16), NC_003030) 및 이. 콜라이(젠뱅크 번호: NP_417484, NC_000913)로부터 이용가능하다.

"아세토하이드록시산 신타제"로도 공지된 용어 "아세토락테이트 신타제"는, 2 분자의 피루브산을 1 분자의 알파-아세토락테이트로 전환시키는 것을 촉매하는 효소 활성을 가진 폴리펩티드(또는 폴리펩티드들)을 지칭한다. EC 2.2.1.6 [이전에는 4.1.3.18]으로 공지된 아세토락테이트 신타제(Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego)는 그의 활성에 있어서 보조인자 티아민 파이로포스페이트에 의존성일 수 있다. 적합한 아세토락테이트 신타제 효소는 다수의 공급원, 예를 들어, 바실러스 서브틸리스(젠뱅크 번호: AAA22222 NCBI (국립생물공학정보센터) 아미노산 서열(서열번호 42), L04470 NCBI 뉴클레오티드 서열(서열번호 41)), 클렙시엘라 테리게나(Klebsiella terrigena)(젠뱅크 번호: AAA25055, L04507), 및 클렙시엘라 뉴모니아(젠뱅크 번호: AAA25079(서열번호 20), M73842(서열번호 19)로부터 이용가능하다.

용어 "아세토락테이트 데카복실라제"는 알파-아세토락테이트로부터 아세토인으로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 가진 폴리펩티드(또는 폴리펩티드들)을 지칭한다. 아세토락테이트 데카복실라제는 EC 4.1.1.5로서 공지되어 있으며, 예를 들어 바실러스 서브틸리스(젠뱅크 번호: AAA22223, L04470), 클렙시엘라 테리게나(젠뱅크 번호: AAA25054, L04507) 및 클렙시엘라 뉴모니아(서열번호 18(아미노산) 서열번호 17(뉴클레오티드))로부터 이용가능하다.

용어 "부탄다이올 데하이드로게나제"는 "아세토인 리덕타제"로도 공지되어 있으며, 아세토인으로부터 2,3-부탄다이올로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 가진 폴리펩티드(또는 폴리펩티드들)을 지칭한다. 부탄다이올 데하이드로게나제는 알코올 데하이드로게나제의 넓은 패밀리의 서브셋이다. 부탄다이올 데하이드로게나제 효소는 알코올 산물 중에 R- 또는 S-입체화학의 생성에 대한 특이성을 가질 수 있다. S-특이적 부탄다이올 데하이드로게나제는 EC 1.1.1.76으로서 공지되어 있으며, 예를 들어 클렙시엘라 뉴모니아(젠뱅크 번호: BBA13085 (서열번호 22), D86412로부터 이용가능하다. R-특이적 부탄다이올 데하이드로게나제는 EC 1.1.1.4로서 공지되어 있으며, 예를 들어 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)(젠뱅크 번호 NP_830481, NC_004722; AAP07682, AE017000), 및 락토코커스 락티스(젠뱅크 번호 AAK04995, AE006323)로부터 이용가능하다.

용어 "부탄다이올 데하이드라타제"는 "다이올 데하이드라타제" 또는 "프로판다이올 데하이드라타제"로도 공지되어 있으며, 2,3-부탄다이올로부터 2-부타논(메틸 에틸 케톤(MEK)이라고도 함)으로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 가진 폴리펩티드(또는 폴리펩티드들)을 지칭한다. 부탄다이올 데하이드라타제는 보조인자 아데노실 코발라민을 이용할 수 있다. 아데노실 코발라민-의존성 효소는 EC 4.2.1.28로서 공지되어 있으며, 예를 들어 클렙시엘라 옥시토카(젠뱅크 번호: BAA08099(알파 서브유닛)(서열번호 24), BAA08100(베타 서브유닛)(서열번호 26) 및 BBA08101(감마 서브유닛)(서열번호 28), (3 개 서브유닛 모두가 활성을 위해 필요함에 유의), D45071)로부터 이용가능하다.

용어 "2-부탄올 데하이드로게나제"는 2-부타논으로부터 2-부탄올로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 가진 폴리펩티드(또는 폴리펩티드들)를 지칭한다. 2-부탄올 데하이드로게나제는 알코올 데하이드로게나제의 넓은 패밀리의 서브셋이다. 2-부탄올 데하이드로게나제는 NADH- 또는 NADPH-의존성일 수 있다. NADH-의존성 효소는 EC 1.1.1.1로서 공지되어 있으며, 예를 들어 로도코커스 루버(젠뱅크 번호: CAD36475(서열번호 30), AJ491307(서열번호 29))로부터 이용가능하다. NADPH-의존성 효소는 EC 1.1.1.2로서 공지되어 있으며, 예를 들어 파이로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus)(젠뱅크 번호: AAC25556, AF013169)로부터 이용가능하다.

용어 "아세토하이드록시산 아이소머로리덕타제" 또는 "아세토하이드록시산 리덕토아이소머라제"는 NADPH(환원형 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트)를 전자 공여체로 사용하여 아세토락테이트로부터 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트로의 전환을 촉매하는 효소를 지칭한다. 바람직한 아세토하이드록시산 아이소머로리덕타제는 EC 번호 1.1.1.86으로 공지되어 있으며, 그 서열은 에스체리키아 콜라이(젠뱅크 번호: NP_418222(서열번호 32), NC_000913(서열번호 31)), 사카로마이세스 세레비시아(젠뱅크 번호: NP_013459(서열번호 44), NC_001144(서열번호 43)), 메타노코커스 마리팔루디스(Methanococcus maripaludis)(젠뱅크 번호: CAF30210, BX957220), 및 바실러스 서브틸리스(젠뱅크 번호: CAB14789 (서열번호 46), Z99118 (서열번호 45))를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 미생물로부터 이용가능하다.

용어 "아세토하이드록시산 데하이드라타제" 또는 "다이하이드록시산 데하이드라타제"는 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트로부터 α-케토아이소발레레이트로의 전환을 촉매하는 효소를 지칭한다. 바람직한 아세토하이드록시산 데하이드라타제는 EC 번호 4.2.1.9로 공지되어 있다. 이들 효소는 이.콜라이 (젠뱅크 번호: YP_026248(서열번호 34), NC_000913(서열번호 33)), 에스. 세레비시아(젠뱅크 번호: NP_012550(서열번호 48), NC_001142(서열번호 47)), 엠. 마리팔루디스(젠뱅크 번호: CAF29874, BX957219) 및 비. 서브틸리스(젠뱅크 번호: CAB14105, Z99115)를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 미생물로부터 이용가능하다.

용어 "분지쇄 α-케토산 데카복실라제"는 α-케토아이소발레레이트로부터 아이소부티르알데히드 및 CO₂로의 전환을 촉매하는 효소를 지칭한다. 바람직한 분지쇄 α-케토산 데카복실라제는 EC 번호 4.1.1.72로 공지되어 있으며, 락토코커스 락티스(젠뱅크 번호: AAS49166, AY548760; CAG34226 (서열번호 36), AJ746364, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)(젠뱅크 번호: NP_461346, NC_003197), 및 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(젠뱅크 번호: NP_149189, NC_001988)을 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 공급원으로부터 이용가능하다.

용어 "분지쇄 알코올 데하이드로게나제"는 아이소부티르알데히드로부터 아이소부탄올로의 전환을 촉매하는 효소를 지칭한다. 바람직한 분지쇄 알코올 데하이드로게나제는 EC 번호 1.1.1.265로 공지되어 있으나, 다른 알코올 데하이드로게나제(구체적으로는, EC 1.1.1.1 또는 1.1.1.2)로 분류될 수도 있다. 이들 효소는 NADH(환원형 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드) 및/또는 NADPH를 전자 공여체로 이용하며, 에스. 세레비시아(젠뱅크 번호: NP_010656, NC_001136; NP_014051, NC_001145), 이. 콜라이(젠뱅크 번호: NP_417484 (서열번호 38), NC_000913 (서열번호 37)), 및 씨. 아세토부틸리쿰(젠뱅크 번호: NP_349892, NC_003030)을 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 공급원으로부터 이용가능하다.

용어 "유전자"는, 특이적 단백질로서 발현이 가능하고 코딩 서열의 전방(5' 비-코딩 서열) 및 후방(3' 비-코딩 서열)에 있는 조절 서열을 임의로 포함하는 핵산 단편을 지칭한다. "천연 유전자(native gene)"는 자기 자신의 조절 서열을 동반하여 자연에서 발견되는 유전자를 지칭한다. "융합 유전자(Chimeric gene)"는, 자연에서 함께 발견되지 않는 조절 및 코딩 서열을 포함하는, 천연 유전자가 아닌 임의의 유전자를 지칭한다. 따라서, 융합 유전자는 상이한 공급원으로부터 유래된 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되나 자연에서 발견되는 것과는 상이한 방법으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. "내인성 유전자"는 유기체의 게놈 내에서 자연적인 위치에 있는 천연 유전자를 지칭한다. "외래" 유전자는 숙주 유기체 내에서 정상적으로 발견되는 것이 아니라 유전자 전달에 의해 숙주 유기체 내로 도입된 유전자를 지칭한다. 외래 유전자는 비-천연 유기체 내로 삽입된 천연 유전자, 또는 융합 유전자를 포함할 수 있다. "형질전환 유전자(transgene)"는 형질전환 과정에 의해 게놈 내로 도입된 유전자이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "코딩 서열"은 특이적 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 지칭한다. "적합한 조절 서열"은 코딩 서열의 업스트림(5' 비-코딩 서열), 내부, 또는 다운스트림(3' 비-코딩 서열)에 위치하여 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 연계 코딩 서열의 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열(translation leader sequence), 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 프로세싱 부위, 효과기(effector) 결합 부위 및 스템-루프 구조(stem-loop structure)를 포함할 수 있다.

용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대해 3' 쪽에 위치한다. 프로모터는, 천연 유전자로부터 그 전체가 유래될 수도 있고, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 구성될 수도 있으며, 심지어 합성 DNA 분절을 포함할 수도 있다. 상이한 프로모터는 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발생 단계에서, 또는 상이한 환경적 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 유도할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 대부분의 시간에 대부분의 세포 유형에서 유전자의 발현을 유발하는 프로모터를 통상적으로 "구성성(constitutive) 프로모터"라고 지칭한다. 또한, 대부분의 경우에 조절 서열의 정확한 경계는 완벽하게 정의되지 않았으므로, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 인정된다.

용어 "작동적으로 연결된(operably linked)"은, 하나의 기능이 다른 하나에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편상에서 핵산 서열들이 연계됨을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우에, 프로모터는 그 코딩 서열에 작동적으로 연결된다(즉, 코딩 서열은 프로모터의 전사 제어하에 있다). 코딩 서열은 센스(sense) 또는 안티센스(antisense) 배향으로 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "발현"은, 본 발명의 핵산 단편으로부터 유래된 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 지칭한다. 발현은 mRNA로부터 폴리펩티드로의 번역을 지칭할 수도 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환"은 숙주 유기체 내로 핵산 단편을 전달하여 유전적으로 안정한 유전을 유발함을 지칭한다. 형질전환 핵산 단편을 포함하는 숙주 유기체는 "형질변환(transgenic)" 또는 "재조합" 또는 "형질전환" 유기체라고 지칭된다.

용어 "플라스미드" 및 "벡터"는, 세포의 중요 대사작용의 일부가 아닌 유전자를 종종 운반하며 통상적으로 원형의 이중 가닥 DNA 단편의 형태인 염색체 밖의 요소를 지칭한다. 이러한 요소는 임의의 공급원으로부터 유래된 선형 또는 원형의 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA인 자가복제 서열(autonomously replicating sequence), 게놈 통합성 서열(genome integrating sequence), 파아지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 여기에 다수의 뉴클레오티드 서열이 결합 또는 재조합되어 적절한 3' 비번역 서열과 함께 선택된 유전자 산물의 DNA 서열 및 프로모터 단편을 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 작제물이 만들어져왔다. "형질전환 벡터"는, 외래 유전자를 포함하고 외래 유전자에 부가하여 특정 숙주 세포의 형질전환을 촉진하는 요소들을 가진 특이적 벡터를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "코돈 축중성(codon degeneracy)"은 암호화된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 영향을 주지 않으면서 뉴클레오티드 서열의 변이를 허용하는 유전 암호의 성질을 지칭한다. 주어진 아미노산을 특정하기 위한 뉴클레오티드 코돈의 사용에 있어서 특정 숙주 세포에서 나타나는 "코돈-바이어스(codon-bias)가 당업자에게 주지되어 있다. 그러므로, 숙주 세포 내의 발현을 개선하기 위한 유전자를 합성할 경우에는, 그의 코돈 사용 빈도가 숙주 세포가 선호하는 코돈의 사용 빈도에 근접하도록 유전자를 고안하는 것이 바람직하다.

다양한 숙주의 형질전환을 위한 핵산 분자의 코딩 영역 또는 유전자에 관련된 용어 "코돈-최적화"는, DNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 변경하지 않으면서 숙주 유기체의 통상적 코돈 이용을 반영하도록 핵산 분자의 코딩 영역 또는 유전자 내의 코돈을 변경함을 지칭한다.

"탄소 기질"은, 효모의 에너지원으로서 유용한 탄소 함유 화합물을 의미하며, 단당류, 예를 들어 포도당 및 과당, 올리고당류, 예를 들어 락토스 또는 수크로스, 다당류, 예를 들어 전분 또는 셀룰로오스 또는 그 혼합물 및 재생가능한 원료(renewable feedstock)로부터의 미정제 혼합물, 예를 들어 유청 투과액(cheese whey permeate), 옥수수 침지수(cornsteep liquor), 사탕무우 당밀(sugar beet molasses) 및 보리 맥아(barley malt)를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 "아미노산 기아에 대한 일반 제어 반응에서 반응이 감소된 세포"는, 아미노산이 붙지 않은 tRNA(uncharged tRNA)를 아미노산 생합성 유전자의 전사 유도를 위한 신호로서 감지하지 않는 세포, 및/또는 아미노산 생합성 유전자의 전사 유도에 의해 아미노산 기아에 반응하지 않는 세포를 지칭한다(Hinnebusch (2005) Ann. Rev. Microbiol. 59:407-450).

본 명세서에서 사용된 "분리된 핵산 단편" 또는 "분리된 핵산 분자"는 호환적으로 사용되며, 합성, 비자연적 또는 변경된 뉴클레오티드 염기를 임의로 포함하는 단일- 또는 이중-가닥 RNA 또는 DNA 중합체를 의미한다. DNA의 중합체 형태인 분리된 핵산 단편은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 분절로 이루어질 수 있다.

온도 및 용액 이온 강도의 적절한 조건하에 핵산 단편의 단일-가닥 형태가 다른 핵산 단편에 어닐링(annealing)될 수 있는 경우에, 핵산 단편은 다른 핵산 단편, 예를 들어 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA 분자에 "혼성가능(hybridizable)"하다. 혼성화 및 세척 조건은 주지되어 있으며 문헌(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989)), 특히 이에 수록된 제11장 및 표 11.1에 예시되어 있다(원용에 의해 그 전체 내용이 본 명세서에 포함됨). 온도 및 이온 강도 조건은 혼성화의 "엄격성(stringency)"을 결정한다. 엄격성 조건을 조정하여, 중간 정도로 유사한 단편(예를 들어 관계가 먼 유기체로부터의 상동 서열) 내지 고도로 유사한 단편(예를 들어 밀접하게 관련된 유기체로부터의 기능성 효소를 중복시키는 유전자)을 스크리닝할 수 있다. 혼성화후 세척은 엄격성 조건을 결정한다. 한 세트의 바람직한 조건에서는, 실온에서 15 분 동안 6X SSC, 0.5% SDS로 시작하여 45℃에서 30 분 동안 2X SSC, 0.5% SDS로 반복하고, 50℃에서 30 분 동안 0.2X SSC, 0.5% SDS로 2회 반복하는 일련의 세척을 사용한다. 더욱 바람직한 세트의 엄격성 조건에서는 더 높은 온도를 사용하며, 0.2X SSC, 0.5% SDS 내에서의 최종 2회 30 분 세척의 온도를 60℃까지 증가시킨다는 점을 제외하고는 세척이 상기와 동일하다. 다른 바람직한 세트의 높은 엄격성 조건에서는 65℃에서 0.1X SSC, 0.1% SDS 내에서의 2회 최종 세척을 사용한다. 추가의 세트에서 엄격성 조건은, 예를 들어 0.1X SSC, 0.1% SDS, 65℃에서의 혼성화 및 2X SSC, 0.1% SDS에 의한 세척 후에 0.1X SSC, 0.1% SDS에 의한 세척을 포함한다.

혼성화의 엄격성에 따라 염기 사이의 불일치가 가능하지만, 혼성화를 위해서는 2 개의 핵산이 상보적 서열을 포함해야 한다. 혼성화되는 핵산에 대해 적절한 엄격성은, 당업계에 주지된 변수인 핵산의 길이 및 상보성의 정도에 의존한다. 2 개 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성 또는 상동성의 정도가 클수록, 이들 서열을 가진 핵산의 혼성체의 Tm 수치가 커진다. 핵산 혼성화의 상대적 안정성(높은 Tm에 상응함)은 하기의 순서로 감소한다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 길이가 100 뉴클레오티드를 초과하는 혼성체에 대하여 Tm을 계산하는 수학식이 유도되었다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51). 더 짧은 핵산, 즉, 올리고뉴클레오티드의 혼성화에 있어서는 불일치의 위치가 더욱 중요해지며 올리고뉴클레오티드의 길이가 그의 특이성을 결정한다(Sambrook et al., supra, 11.7-11.8). 한 구현예에서는 혼성가능한 핵산의 길이가 적어도 약 10 뉴클레오티드이다. 바람직하게는 혼성가능한 핵산의 최소 길이가 적어도 약 15 뉴클레오티드이고; 더욱 바람직하게는 적어도 약 20 뉴클레오티드이며; 가장 바람직하게는 길이가 적어도 약 30 뉴클레오티드이다. 또한, 탐침의 길이와 같은 인자에 따라 필요한 경우에 온도 및 세척 용액 염 농도를 조정할 수 있음을 당업자는 인식할 것이다.

용어 "상보적"은, 서로 혼성화될 수 있는 뉴클레오티드 염기 사이의 관계를 기술하기 위해 사용된다. 예를 들어, DNA에 있어서 아데노신은 티민에 상보적이고 사이토신은 구아닌에 상보적이다.

당업계에 공지된 바와 같이, 용어 "동일성 백분율"은 2 개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2 개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계로서, 서열들을 비교함으로써 결정된다. 당업계에서 "동일성"은 또한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미하며, 경우에 따라 이러한 서열의 스트링(string) 사이의 일치에 의해 결정된다. "동일성" 및 "유사성"은, 하기의 문헌에 기술된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는 공지 방법을 통해 용이하게 계산할 수 있다: 1.) 계산 분자생물학(Computational Molecular Biology)(Lesk, A. M., Ed.) 옥스포드 대학교: 뉴욕(1988); 2.) 생물전산학(Biocomputing): 정보학 및 게놈 프로젝트(Informatics and Genome Projects)(Smith, D. W., Ed.) 아카데믹: 뉴욕(1993); 3.) 서열 데이터의 전산 분석, 제1부(Computer Analysis of Sequence Data, Part I)(Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds.) 휴머니아(Humania): 뉴저지(1994); 4.) 분자생물학에서의 서열 분석(Sequence Analysis in Molecular Biology)(von Heinje, G., Ed.) 아카데믹(1987); 및 5.) 서열 분석 프라이머(Sequence Analysis Primer)(Gribskov, M. and Devereux, J., Eds.) 스톡턴(Stockton): NY (1991).

동일성을 결정하는 바람직한 방법은 시험 서열 사이에 최상의 일치를 부여하도록 고안된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공중에게 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 명시되어 있다. 레이저진(LASERGENE) 생물정보학 계산 모음(bioinformatics computing suite)(위스콘신주 메디슨 소재의 디엔에이스타 인코포레이티드(DNASTAR Inc.))의 멕얼라인(등록상표)(MegAlign™) 프로그램을 사용하여 서열 정렬 및 동일성 백분율 계산을 수행할 수 있다. 몇가지 종류의 알고리듬, 예를 들어 클러스탈 V로 분류된 정렬 방법(Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992))에 상응하고 레이저진 생물정보학 계산 모음의 멕얼라인(등록상표) 프로그램(디엔에이스타 인코포레이티드)에서 찾을 수 있는 "클러스탈 V 정렬 방법"을 포함하는 "클러스탈(Clustal) 정렬 방법"을 사용하여 서열의 다중 정렬을 수행할 수 있다. 다중 정렬에 있어서 내정값은 GAP PENALTY=10 및 GAP LENGTH PENALTY=10에 상응한다. 클러스탈 방법을 사용하는 단백질 서열의 동일성 백분율 계산 및 짝 정렬(pairwise alignment)에 있어서 내정 지표는 KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 및 DIAGONALS SAVED=5이다. 핵산에 있어서 이들 지표는 KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 및 DIAGONALS SAVED=4이다. 클러스탈 V 프로그램을 사용하여 서열들을 정렬한 후에, 동일한 프로그램 내의 "서열 거리" 표를 보면 "동일성 백분율"을 얻을 수 있다. 부가적으로 "클러스탈 W 정렬 방법"이 이용가능하며, 이는 클러스탈 W로 분류된 정렬 방법(Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189-191(1992))에 상응하고 레이저진 생물정보학 계산 모음(디엔에이스타 인코포레이티드)의 멕얼라인(등록상표) v6.1 프로그램에서 찾을 수 있다. 다중 정렬을 위한 내정 지표(GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0.2, Delay Divergen Seqs(%)=30, DNA Transition Weight=0.5, Protein Weight Matrix=Gonnet Series, DNA Weight Matrix=IUB ). 클러스탈 W 프로그램을 사용하여 서열들을 정렬한 후에, 동일한 프로그램 내의 "서열 거리" 표를 보면 "동일성 백분율"을 얻을 수 있다.

동일하거나 유사한 기능 또는 활성을 가진 폴리펩티드를 다른 종으로부터 동정함에 있어서 여러 수준의 서열 동일성이 유용하다는 것이 당업자에게 주지되어 있다. 동일성 백분율의 유용한 예는 하기의 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%, 또는 70% 내지 100% 범위의 임의의 정수 백분율, 예를 들어 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 본 발명을 기술함에 있어서 유용할 수 있다. 적합한 핵산 단편은 상기 동일성을 가진 폴리펩티드를 암호화하며, 통상적으로 적어도 약 250 개 아미노산, 바람직하게는 적어도 300 개 아미노산, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 약 348 개 아미노산을 가진 폴리펩티드를 암호화한다.

용어 "서열 분석 소프트웨어"는, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 분석에 유용한 임의의 컴퓨터 알고리듬 또는 소프트웨어 프로그램을 지칭한다. "서열 분석 소프트웨어"는 상업적으로 이용가능하거나 독립적으로 개발할 수 있다. 통상적인 서열 분석 소프트웨어는 하기의 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 1.) GCG 프로그램 모음(위스콘신 패키지 버전 9.0, 위스콘신주 메디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(GCG: Genetics Computer Group)); 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)); 3.) 디엔에이스타(위스콘신주 메디슨 소재의 디엔에이스타 인코포레이티드); 4.) 시퀀처(Sequencher)(미시간주 앤아버 소재의 젠 코드 코포레이션(Gene Codes Corporation)); 및 5.) 스미스-워터만 알고리듬(W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY)을 포함하는 FASTA 프로그램. 본 출원과 관련하여, 서열 분석 소프트웨어를 분석에 이용하는 경우에, 달리 특정하지 않는 한, 분석 결과는 인용된 프로그램의 "내정값"에 기초한다는 것을 이해하여야 한다. 본 명세서에서 사용된 "내정값"은 최초 초기화할 때에 소프트웨어에 원래 로딩된 임의의 수치 또는 지표 세트를 의미한다.

아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 "상당한 부분"은, 당업자가 서열의 수동 평가 또는 BLAST(Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1993))와 같은 알고리듬을 사용하는 컴퓨터-자동화 서열 비교 및 동정에 의해 폴리펩티드 또는 유전자를 추정상으로 동정하기에 충분한 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 부분이다. 일반적으로, 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 공지의 단백질 또는 유전자와 상동적인 것으로 추정상 동정하기 위해서는 10 개 이상 연속되는 아미노산 또는 30 개 이상의 뉴클레오티드의 서열이 필요하다. 더욱이, 뉴클레오티드 서열에 있어서는, 서열-의존적인 유전자 동정(예를 들어, 서던 혼성화(Southern hybridization)) 및 분리(예를 들어, 박테리아 콜로니 또는 박테리오파아지 플라크의 제자리 혼성화(in situ hybridization)) 방법에 20-30 개의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 탐침이 사용될 수 있다. 또한, 12-15 염기의 짧은 올리고뉴클레오티드를 PCR에서 증폭 프라이머로 사용하여, 프라이머를 포함하는 특정 핵산 단편을 수득할 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열의 "상당한 부분"은, 서열을 포함하는 핵산 단편을 특이적으로 동정 및/또는 분리하기에 충분한 서열을 포함한다. 본 명세서는, 특정 알코올 데하이드로게나제 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 및 아미노산의 완전한 서열을 교시한다. 본 명세서에 보고된 서열의 유익성을 가지고, 당업자는 개시된 서열의 전체 또는 상당 부분을 당업계에 공지된 목적으로 사용할 수 있게 되었다. 따라서 본 발명은, 첨부하는 서열 목록에 보고된 완전 서열과 더불어 상기 정의된 서열들의 상당한 부분을 포함한다.

암호화된 단백질의 기능적 특성에 영향을 주지 않으면서, 화학적으로 균등한 아미노산이 주어진 부위에서 치환되는 아미노산 서열 또는 코딩 영역 내의 변경이 흔하다는 사실이 당업계에 주지되어 있으므로, 본 발명은 구체적으로 예시된 서열을 초과하는 범위를 포함한다. 본 발명의 목적상, 치환은 하기 5 개 그룹 중 하나 내에서의 교환으로 정의된다:

1. 작은 지방족의, 비극성 또는 약한 극성 잔기: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);

2. 극성의, 음성 하전된 잔기 및 그의 아미드: Asp, Asn, Glu, Gln;

3. 극성의, 양성 하전된 잔기: His, Arg, Lys;

4. 큰 지방족인, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val (Cys); 및

5. 큰 방향족 잔기: Phe, Tyr, Trp.

따라서, 소수성 아미노산인 아미노산 알라닌에 대한 코돈은 소수성이 좀 더 낮은 다른 잔기(예를 들어, 글리신) 또는 소수성이 좀 더 높은 잔기(예를 들어, 발린, 류신 또는 아이소류신)를 암호화하는 코돈으로 치환될 수 있다. 마찬가지로, 음성 하전된 하나의 잔기로 다른 하나를 치환하거나(예를 들어 글루탐산을 아스파르트산으로) 양성 하전된 하나의 잔기로 다른 하나를 치환하는(예를 들어, 알지닌을 라이신으로) 변화도 기능적으로 균등한 산물을 생성시킬 수 있을 것으로 예상된다. 많은 경우에, 단백질 분자의 N-말단 및 C-말단 부분의 변경을 유발하는 뉴클레오티드 변화도 단백질의 활성을 변경하지 않을 것으로 예상된다. 따라서 상기의 코돈 변이를 수반하는 코딩 영역, 및 상기의 아미노산 변이를 수반하는 단백질은 본 발명에 포함된다.

여기서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 주지된 것으로서 문헌(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, New York, 1989 (이하 "Maniatis"로 약칭함); 및 Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W. Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, New York, 1984; 및 Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology; Greene Publishing and Wiley-Interscience, 1987)에 기술되어 있다. 여기서 사용된 부가적 방법들은 효소학 방법론 문헌(Methods in Enzymology, Volume 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology(Part A, 2004, Christine Guthrie and Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, CA)에 있다.

효모에서의 부탄올 내성 조작을 위한 일반 제어 반응 표적 유전자

본 발명은, 사카로마이세스 세레비시아에서 아미노산 기아에 대한 일반 제어 반응에 관련된 유전자의 발현을 감소시키면 부탄올에 대한 세포의 내성이 증가한다는 발견에 관한 것이다. 효모에서의 아미노산 기아에 대한 일반 제어 반응은, 아미노산이 붙지 않은 tRNA의 존재를 감지하고 아미노산 생합성 유전자의 전사를 유도함으로써 반응하는 복잡한 시스템이다. 문헌(Hinebusch (2005) Ann. Rev. Microbiol. 59: 407-450)에 개관된 이 제어 시스템은, 돌연변이가 일어날 경우에 광범위한 아미노산 길항제 및 유사체에 대한 감도를 부여하는 유전자들을 포함하며; 아미노산 기아에 반응하지 않는 돌연변이체 표현형에 있어서, 이들 유전자를 비억제성 일반 제어(general control non-depressible) 또는 GCN이라고 부른다.

예를 들어 GCN2는, 아미노산이 붙지 않은 tRNA를 감지하고 카르복시-말단 도메인인 하나의 Gcn2p 도메인을 통해 리보솜에 결합하는 단백질(Gcn2p)을 암호화한다. HisRS라고 명명된(히스티딜-tRNA 신테타제 유사) Gcn2p의 제2 내부 도메인에 의해 아미노산이 붙지 않은 tRNA가 감지된다. 아미노산이 붙지 않은 tRNA가 HRS 도메인에 이렇게 결합하면, GDP에 연계된 진핵세포 개시 인자 2(eIF2~GDP)를 또 다른 Gcn2p 도메인(PK)이 인산화(kinasing)하여 eIF2-P~GDP를 생성시킨다. 그 다음에는, eIF2-P~GDP가 GCN4 암호화 mRNA의 번역을 자극하고 Gcn4p(GCN4 암호화 단백질)는 아미노산 생합성에 관련된 다수의 유전자의 발현을 활성화시킨다.

번역의 개시는 개시 인자 eIF2의 활성화 형태를 필요로 한다: eIF2~GTP. 이 활성화 형태는 개시 tRNA인 fmet-tRNA를 리보솜에 제공한다. eIF2-fmet-tRNA~GTP가 리보솜에 결합하면서 번역이 정상적으로 시작되며, 여기서 궁극적으로 eIF2~GDP가 방출된다. 이 형태의 개시 인자는 비활성이므로 GDP를 GTP로 교환하여 eIF2-GTP를 생성시킴으로써 활성화되어야 한다. Gcn2p의 키나제가 활성화되면 eIF2~GDP를 장악하여 eIF2~P를 생산한다. 이 형태의 eIF2~P는 구아닌 교환 인자 eIF2B가 하기 반응을 촉매하지 못하도록 차단한다: eIF2~GDP +GTP ->eIF2~GTP +GDP. 따라서, 아미노산 생합성 유전자의 전사활성 인자인 Gcn4p의 번역이 증가되어 있는 동안, 대부분의 번역 개시는 지연된다.

사카로마이세스 세레비시아에서 아미노산 기아 시스템에 대한 일반 제어 반응에 관련된 부가적인 GCN 유전자 암호화 단백질은 하기의 것들을 포함한다:

Gcn1p: Gcn2p 키나제 활성의 양성 조절 인자

Gcn3p: 번역 개시 인자 eIF2B의 알파 서브유닛, GCN4 발현의 양성 조절 인자

Gcn5p: 히스톤 H2B 및 H3의 N-말단 라이신을 아세틸화하는 히스톤 아세틸트랜스페라제; ADA 및 SAGA 히스톤 아세틸트랜스페라제 복합체의 촉매 서브유닛

Gcn6p: GCN4 전사의 양성 조절 인자

Gcn7p: GCN4 전사의 양성 조절 인자

Gcn8p: 불확실한 역할

Gcn9p: 불확실한 역할

Gcn20p: Gcn1p와 복합체를 형성하는, Gcn2p 키나제 활성의 양성 조절 인자

사카로마이세스 세레비시아 Gcn1-5p 및 Gcn20p 단백질 및 그의 코딩 영역의 서열번호를 표 4에 제공한다. 야로위아 리폴리티카 및 칸디다 알비칸스의 GCN 유전자에 대한 대표적인 코딩 영역 및 단백질 또한 표 4에 제공한다.

효모에서 아미노산 기아에 대한 일반 제어 반응에 관련된 단백질의 발현을 감소시키거나 제거하는 돌연변이는 반응을 감소시키고 부탄올 내성에 의외의 증가를 제공할 것이다. 따라서 본 효모 숙주는 아미노산 기아에 대한 일반 제어 반응에 관련된 적어도 하나의 단백질의 활성을 감소시키는 유전적 개질을 가진다. 아미노산 기아에 대한 일반 제어 반응을 감소시키는 유전적 개질을 위해 적합한 유전자는 Gcn1p, Gcn2p, Gcn3p, Gcn4p, Gcn5p, Gcn6p, Gcn7p, Gcn8p, Gcn9p 및 Gcn20p를 암호화하는 유전자를 포함한다. 이들 단백질의 예는 표 4에 서열번호 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 및 74로서 제공된다. 이들 단백질에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가지며 GCN 활성을 보유하는 단백질을 암호화하는 유전자는 아미노산 기아에 대한 일반 제어 반응을 감소시키는 유전적 개질의 표적이 될 수 있다. 더욱 적합한 표적은 Gcn1p, Gcn2p, Gcn3p, Gcn4p, Gcn5p 및 Gcn20p를 암호화하는 유전자이다. 가장 적합한 표적은 Gcn2p 및 Gcn4p를 암호화하는 유전자이다.

Gcn1p, Gcn2p, Gcn3p, Gcn4p, Gcn5p, Gcn6p, Gcn7p, Gcn8p, Gcn9p 또는 Gcn20p 단백질을 암호화하는 것으로 동정된 임의의 효모 유전자, 또는 아미노산 기아에 대한 일반 제어 반응에 관련된 단백질을 암호화하는 다른 유전자는, 부탄올 내성이 증가된 본 발명의 균주를 창출하기 위한 상응하는 효모 균주에서의 개질을 위한 표적 유전자이다. 본 발명의 방법을 사용하여 GCN 시스템을 가진 임의의 유형의 효모를 부탄올 내성에 대해 조작할 수 있다. 사카로마이세스, 야로위아, 칸디다 및 한세눌라(Hansenula)를 포함하는 효모 속은 GCN 시스템을 보유하며(Bode et al. (199) J. Basic. Microbiol. 30(1):31-5), 내성을 제공하기 위한 개질의 표적인 사카로마이세스 세레비시아, 야로위아 리폴리티카 및 칸디다 알비칸스의 GCN 유전자의 예를 표 4에 열거한다. 사카로마이세스 세레비시아의 GCN 암호화 단백질의 예는 서열번호 50, 52, 54, 56, 58 및 60을 포함한다. 야로위아 리폴리티카의 GCN 암호화 단백질의 예는 서열번호 62, 64, 66 및 68을 포함한다. 칸디다 알비칸스의 GCN 암호화 단백질의 예는 서열번호 70, 72 및 74를 포함한다. 또한, 사상균(mold) 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)에서 GCN2 및 GCN4의 상동체가 발견되었다(Paluh et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 85(11):3728-3732).

당업자에게 주지된 생물정보학 데이터베이스 및 문헌에 다른 GCN 시스템 표적 유전자가 동정되어 있을 수 있다. 또한, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 열거된 서열을 사용하여 다른 상동체를 자연에서 동정할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 각각의 GCN 핵산 단편을 사용하여 동일하거나 다른 효모로부터 상동 단백질을 암호화하는 유전자를 분리할 수 있다. 서열-의존성 프로토콜을 사용하는 상동 유전자의 분리는 당업계에 주지되어 있다. 서열-의존성 프로토콜의 예는 하기의 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 1.) 핵산 혼성화 방법; 2.) DNA 및 RNA 증폭 방법, 예를 들어 핵산 증폭 기술의 다양한 용도[예를 들어, 중합효소 연쇄반응(PCR: polymerase chain reaction), 미국 특허 제4,683,202호(Mullis et al.); 리가제 연쇄반응(LCR: ligase chain reaction)(Tabor, S. et al., Proc. Acad. Sci. USA 82:1074 (1985)); 또는 가닥 대체 증폭(SDA: strand displacement amplification)(Walker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:392 (1992))]; 및 3.) 상보성에 의한 스크리닝 및 라이브러리 구축 방법.

예를 들어, 본 핵산 단편의 전부 또는 일부를 DNA 혼성화 탐침으로 사용하여 임의의 목적하는 효모 라이브러리를 당업자에게 주지된 방법론으로 스크리닝함으로써, 본 명세서에 기술된 GCN 유전자와 유사한 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 직접 분리할 수 있다. 개시된 핵산 서열에 기초한 특이적 올리고뉴클레오티드 탐침은 당업계에 공지된 방법(Maniatis, supra)에 의해 고안되고 합성될 수 있다. 또한, 전체 서열을 직접 사용하여, 당업자에게 공지된 방법(예를 들어 무작위 프라이머 DNA 표지화(random primers DNA labeling), 새김눈 번역(nick translation) 또는 종단 표지화(end-labeling) 기술)에 의해 DNA 탐침을 합성하거나, 이용가능한 시험관내 전사 시스템을 사용하여 RNA 탐침을 합성할 수 있다. 또한, 특이적 프라이머를 고안하고 사용하여 본 서열의 일부(또는 전체 길이)를 증폭할 수 있다. 생성된 증폭 산물을 증폭 반응중에 직접 표지화하거나 증폭 반응후에 표지화하여, 적절한 엄격성 조건하에 전체 길이 DNA 단편을 분리하기 위한 탐침으로 사용할 수 있다. 문헌(Paluh et al., ibid.)에 기술된 GCN 기능에 대한 상보성 선택(complementation selection)에 의해 설명되는 바와 같이 기능적 선택을 사용하여 이종 유전자도 동정할 수 있다.

통상적으로, PCR 유형의 증폭 기술에서는 프라이머들이 상이한 서열을 가지며 서로에 대해 상보적이지 않다. 목적하는 시험 조건에 따라, 표적 핵산의 효율적이면서도 충실한 복제를 제공하도록 프라이머의 서열을 고안해야 한다. PCR 프라이머 고안 방법은 일반적인 것으로서 당업계에 주지되어 있다(Thein and Wallace, "The use of oligonucleotides as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders", in Human Genetic Diseases: A Practical Approach, K. E. Davis Ed., (1986) pp 33-50, IRL: Herndon, VA; 및 Rychlik, W., In Methods in Molecular Biology, White, B. A. Ed., (1993) Vol. 15, pp 31-39, PCR Protocols: Current Methods and Applications. Humania: Totowa, NJ).

일반적으로, 기술된 서열의 2 개 짧은 분절을 중합효소 연쇄반응 프로토콜에 사용하여 DNA 또는 RNA로부터 상동 유전자를 암호화하는 더 긴 핵산 단편을 증폭할 수 있다. 중합효소 연쇄반응을 클로닝된 핵산 단편의 라이브러리 상에서 수행할 수도 있으며, 여기에서 한 프라이머의 서열은 기술된 핵산 단편으로부터 유래되고, 다른 프라이머의 서열은 미생물 유전자를 암호화하는 mRNA 전구체의 3' 말단의 폴리아데닐산 구역의 존재를 이용한다.

대안적으로, 제2 프라이머 서열은 클로닝 벡터로부터 유래된 서열에 기초할 수 있다. 예를 들어, 당업자는 전사체 내의 단일 지점 및 3' 또는 5' 말단 사이의 영역의 카피를 증폭하는 PCR을 이용함으로써 RACE 프로토콜(Frohman et al., PNAS USA 85:8998 (1988))에 따라 cDNA를 생성시킬 수 있다. 본 서열로부터 3' 및 5' 방향으로 배향된 프라이머를 고안할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 3' RACE 또는 5' RACE 시스템(예를 들어, 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 BRL)을 사용하여 특이적 3' 또는 5' cDNA 단편을 분리할 수 있다(Ohara et al., PNAS USA 86:5673 (1989); Loh et al., Science 243:217 (1989)).

대안적으로, 상동체의 동정을 위한 혼성화 시약으로서, 기술된 GCN 서열을 채용할 수 있다. 핵산 혼성화 시험의 기본 구성요소는 탐침, 관심의 대상인 유전자 또는 유전자 단편을 함유하는 것으로 추정되는 시료, 및 특이적 혼성화 방법을 포함한다. 통상적으로 탐침은, 검출하고자 하는 핵산 서열에 상보적인 단일-가닥 핵산 서열이다. 탐침은 검출하고자 하는 핵산 서열에 "혼성가능"하다. 탐침의 길이는 5 염기 내지 수만 염기 범위에서 변동될 수 있으며, 실행하고자 하는 구체적 시험에 의존한다. 통상적으로 약 15 염기 내지 약 30 염기의 탐침 길이가 적합하다. 검출하고자 하는 핵산 서열에는 탐침 분자의 일부만이 상보적일 필요가 있다. 또한, 탐침 및 표적 서열 사이의 상보성이 완벽할 필요는 없다. 불완전하게 상보적인 분자 사이에도 혼성화가 일어나며, 이 경우에 혼성화 영역 내의 어떤 분획의 염기들은 적절한 상보적 염기와 대합하지 않는다.

혼성화 방법은 잘 정립되어 있다. 통상적으로, 핵산 혼성화가 가능한 조건하에 탐침 및 시료를 혼합해야 한다. 이는 적절한 농도 및 온도 조건하에 무기 또는 유기염의 존재하에 탐침 및 시료를 접촉시킴을 포함한다. 탐침 및 시료 핵산 사이에 임의의 가능한 혼성화가 일어날 수 있도록 충분히 긴 시간 동안 탐침 및 시료 핵산을 접촉시켜야 한다. 혼합물 내의 탐침 또는 표적의 농도는 혼성화가 일어나기 위해 필요한 시간을 결정한다. 탐침 또는 표적의 농도가 높을수록, 필요한 혼성화 인큐베이션 시간은 짧아진다. 임의로, 무질서 유발제(chaotropic agent)를 첨가할 수 있다. 무질서 유발제는 뉴클레아제 활성을 저해함으로써 핵산을 안정화시킨다. 또한, 무질서 유발제는 짧은 올리고뉴클레오티드 탐침의 민감하고 엄격한 혼성화를 실온에서 가능하게 한다(Van Ness and Chen, Nucl. Acids Res. 19:5143-5151 (1991)). 적합한 무질서 유발제는 특히, 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 소듐 티오시아네이트, 리튬 테트라클로로아세테이트, 소듐 퍼클로레이트, 루비듐 테트라클로로아세테이트, 포타슘 요오다이드 및 세슘 트라이플루오로아세테이트를 포함한다. 통상적으로, 무질서 유발제는 약 3 M의 최종 농도로 존재한다. 필요한 경우, 혼성화 혼합물에 포름아미드를 통상 30-50%(v/v)로 첨가할 수 있다.

다양한 혼성화 용액을 채용할 수 있다. 통상적으로, 이들은 약 20 내지 60 부피%, 바람직하게는 30%의 극성 유기용매를 함유한다. 일반적인 혼성화 용액은 약 30-50% v/v 포름아미드, 약 0.15 내지 1 M 소듐 클로라이드, 약 0.05 내지 0.1 M 완충제(예를 들어, 소듐 시트레이트, 트리스-HCl, PIPES 또는 HEPES(약 6-9의 pH 범위)), 약 0.05 내지 0.2% 세제(detergent)(예를 들어, 소듐 도데실설페이트), 또는 0.5-20 mM 범위의 EDTA, FICOLL(파마시아 인코포레이티드(Pharmacia Inc.))(약 300-500 kdal), 폴리비닐피롤리돈(약 250-500 kdal) 및 혈청 알부민을 채용한다. 통상적인 혼성화 용액에는, 약 0.1 내지 5 ㎎/㎖의 표지되지 않은 담체 핵산, 단편화된 핵 DNA(예를 들어, 송아지 흉선 또는 연어 정자 DNA, 또는 효모 RNA), 및 임의로 약 0.5 내지 2% wt/vol 글리신도 포함된다. 다양한 극성 수용성 또는 팽윤성 약제(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜), 음이온성 중합체(예를 들어, 폴리아크릴레이트 또는 폴리메틸아크릴레이트) 및 음이온성 당류 중합체(saccharidic polymer)(예를 들어, 덱스트란 설페이트)를 포함하는 부피 배제 약제(volume exclusion agent)와 같은 다른 첨가제도 포함될 수 있다.

핵산 혼성화는 다양한 에세이 체제에 적응시킬 수 있다. 가장 적합한 것 중의 하나는 샌드위치 에세이(sandwich assay) 체제이다. 샌드위치 에세이는 비변성(non-denaturing) 조건하에서의 혼성화에 특히 적응가능하다. 샌드위치-유형 에세이의 주요 구성요소는 고체 지지체이다. 고체 지지체에는, 서열의 일부에 대해 상보적이고 표지되지 않은 핵산 탐침이 흡착되거나 공유적으로 결합되어 고정화된다.

대안적으로, GCN 서열이 주지되어 있고 진균 게놈의 서열분석이 보편화되어 있으므로(10 개는 완성되고, 다른 71 개에는 전체 게놈 산탄식 접근방법(whole genome shotgun approach)을 적용하여 취합중에 있으며, 다른 42 개는 진행중임), 당업자에게 주지된 생물정보학적 접근방법만을 사용하여 서열 유사성을 기초로 적합한 GCN 시스템 표적 유전자를 동정할 수 있다.

부탄올 내성을 위한 효모 내의 일반 제어 반응 유전자의 유전적 개질

표적 유전자의 유전적 개질을 위한 다수의 방법이 당업자에게 공지되어 있으며, 본 발명의 효모 균주를 창출하기 위해 사용될 수 있다. 표적 단백질의 발현을 감소시키거나 제거하기 위해 사용될 수 있는 개질은, Gcnp를 암호화하는 유전자의 일부 또는 전체 유전자를 결실시키는 개질, 단백질이 발현되지 않거나 낮은 수준으로 발현되도록 GCN 유전자 내에(프로모터 또는 코딩 영역 내에) DNA 단편을 삽입하는 개질, 기능성 단백질이 발현되지 않도록 정지 코돈 또는 해독틀 이동(frame shift)을 가하는 돌연변이를 GCn 코딩 영역에 도입하는 개질, 및 비기능성 또는 효소 활성이 낮은 단백질이 발현되도록 아미노산을 변경하는 하나 이상의 돌연변이를 GCN 코딩 영역에 도입하는 개질을 포함하나 이에 한정되지 않는 교란(disruption)이다. 또한, GCN 유전자의 발현은 안티센스 RNA 또는 간섭 RNA의 발현에 의해 차단될 수 있으며, 동시억제(cosuppression)를 유발하는 작제물을 도입할 수 있다. 또한, 풍부한 코돈을 희귀 코돈으로 치환하여 발현을 감소시킨 GCN 유전자를 합성하고, 상응하는 내인성 GCN 유전자를 이 유전자로 치환할 수 있다. 이러한 유전자는 동일한 폴리펩티드를 낮은 속도로 생산한다. 또한, 전사체의 합성 또는 안정성은 돌연변이에 의해 저감될 수 있다. 마찬가지로, mRNA로부터 단백질이 번역되는 효율을 돌연변이에 의해 조정할 수 있다. 당업자는 Gcn 단백질을 암호화하는 공지 서열을 이용하여 이들 방법 모두를 용이하게 실행할 수 있다. 효모 GCN 서열은 공중에게 이용가능하며, 대표적인 서열들을 표 4에 열거한다. 당업자는 부탄올 내성을 증가시키기 위한 목적으로 GCN 유전자의 발현을 제거하거나 감소시키는 구체적인 개질 전략을 선택할 수 있다.

일부 개질 과정에서는 GCN 코딩 서열을 둘러싼 DNA 서열도 유용하며, NCBI(국립생물공학정보센터)가 주관한 게놈 프로젝트의 게놈 프로젝트 ID9518에 의해 편성된 완전 게놈 서열에서 고유번호 GOPID #13838로 사카로마이세스 세레비시아와 같은 효모에 대해 이용가능하다. 효모 게놈 서열의 부가적 예는 야로위아 리폴리티카, GOPIC #13837, 및 GPID #10771, #10701 및 #16373으로 포함된 칸디다 알비칸스의 서열을 포함한다. 공중에게 이용가능한 데이터베이스에서 당업자는 다른 효모 게놈 서열들을 용이하게 발견할 수 있다.

특히, GCN 코딩 서열을 둘러싼 DNA 서열은 상동성 재조합을 사용하는 개질 방법에 있어서 유용하다. 예를 들어, 이 방법에서 GCN 유전자 양 옆의 서열들은 선택가능한 표지자 유전자와 경계를 이루며 위치하여, 표지자 유전자가 GCN 유전자를 대체하는 상동성 재조합을 매개한다. 또한, 부분적 GCN 유전자 서열, 및 선택가능한 표지자 유전자와 경계를 이루는 GCN 양 옆의 서열을 사용하여, 표지자 유전자가 표적 GCN 유전자의 일부를 대체하는 상동성 재조합을 매개할 수 있다. 부가적으로, 선택가능한 표지자가 부위-특이적 재조합 부위와 경계를 이룸으로써, 상응하는 부위-특이적 재조합효소의 발현에 이어서 내성 유전자가 GCN 유전자로부터 삭제되어 후자를 재활성화시키지 못한다. 부위-특이적 재조합의 결과로서, Gcn 단백질의 발현을 방해하는 재조합 부위가 생성된다. 당업자에게 주지된 바와 같이, 상동성 재조합 벡터를 작제함으로써, 선택가능한 표지자의 삭제 후에 GCN 유전자에 결실이 생기게 할 수도 있다.

유사분열 재조합(mitotic recombination)을 사용하여 결실이 생기게 할 수 있다(Wach et al. (1994) Yeast 10:1793-1808). 이 방법은, 표적 DNA 서열과 경계를 이루며 20 bp만큼 짧을 수 있는 선택가능한 표지자를 게놈 영역 사이에 포함하는 DNA 단편의 제조에 관한 것이다. 표지자 유전자의 말단에 혼성화되고 효모 게놈에 재결합할 수 있는 게놈 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여, 선택가능한 표지자 유전자의 PCR 증폭에 의해 이 DNA 단편을 제조할 수 있다. 선형의 DNA 단편은 효모 내에 효율적으로 형질전환되고 게놈 내에 재조합됨으로써, 표적 DNA 서열의 결실을 포함하는 유전자 대체를 유발한다(Methods in Enzymology, v194, pp 281-301 (1991)).

또한, 프로모터 대체 방법을 사용하여 내인성 전사 제어 요소를 교체함으로써 문헌(Mnaimneh et al. (2004) Cell 118(1):31-44)에 기술된 바와 같이 발현을 조정하는 또 다른 수단을 가능하게 할 수 있다.

본 발명의 개질된 효모 균주의 부탄올 내성

아미노산 기아에 대한 일반 제어 반응에 있어서 반응이 감소되도록 유전적으로 개질된 본 발명의 효모 균주에서는 부탄올에 대한 내성이 개선된다. 반응이 감소된 균주의 내성은, 모균주(유전적 개질 전의)의 성장에 해로운 부탄올 농도에서 그들의 성장을 에세이함으로써 평가할 수 있다. 개선된 내성은 1-부탄올, 아이소부탄올 및 2-부탄올을 포함하는 부탄올 화합물에 대한 것이다. 저해 화학물질 및 그의 농도, 성장 조건, 성장 기간 및 유전적으로 개질된 구체적 균주에 따라 관찰된 내성의 크기가 달라질 것이다. 예를 들어, 본 명세서의 실시예 1에 나타낸 바와 같이, 히스티딘 및 류신 이외의 아미노산이 결여된 배지 내에서 8 시간 동안 1% - 2%의 아이소부탄올 내에서의 성장에 있어서 개선된 내성이 관찰되었다. 이 배지에서 세포는, 히스티딘 및 류신을 함유하는 완전 배지(rich medium)의 경우에 비해 더 많은 생합성 요구량을 가진다. 본 발명의 효모 균주의 개선된 부탄올 내성을 입증하기 위한 다른 조건은, 생합성 요구량이 완전 배지 조건에서보다 높은 조건, 예를 들어 다른 아미노산, 뉴클레오티드 또는 지방산과 같은 임의의 대사 산물의 결여를 포함한다. 부가적으로 저해제의 존재, 삼투 불균형(osmotic imbalance) 또는 다른 비이상적 성장 조건은, 개선된 부탄올 내성을 입증하기 위한 조건을 제공할 수 있다.

부탄올 생합성 경로

본 발명에서는, 상기한 바와 같이, 부탄올 생합성 경로가 발현되도록 조작된 효모 세포에 증가된 부탄올 내성을 부여하는 유전적 개질을 조작하였다. 각 유전적 개질은 다른 것에 앞서 일어날 수 있다.

부탄올 생합성 경로는 1-부탄올, 2-부탄올, 또는 아이소부탄올 생합성 경로일 수 있다. 증가된 부탄올 내성을 위한 아미노산 기아에 대한 일반 제어 반응의 개질 및 부탄올의 생산에 있어서 특히 적합한 효모 숙주는 사카로마이세스, 칸디다, 한세눌라 및 야로위아 속의 구성원들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 숙주는 사카로마이세스 세레비시아, 칸디다 알비칸스 및 야로위아 리폴리티카를 포함한다.

1-부탄올 생합성 경로

1-부탄올을 생산하는 생합성 경로는, 원용에 의해 본 명세서에 포함된 동시계류중이며 공유인 미국 특허출원공개 제0080182308호(Donaldson et al.)에 기술되어 있다. 이 생합성 경로는 하기와 같은 기질로부터 산물로의 전환을 포함한다:

a) 예를 들어, 서열번호 1, 3 또는 39로 제공된 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 2, 4 또는 40과 같은 단백질 서열을 가진 아세틸-CoA 아세틸트랜스페라제가 촉매하는, 아세틸-CoA로부터 아세토아세틸-CoA로의 전환;

b) 예를 들어, 서열번호 5로 제공된 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 6과 같은 단백질 서열을 가진 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제가 촉매하는, 아세토아세틸-CoA로부터 3-하이드록시부티릴-CoA로의 전환;

c) 예를 들어, 서열번호 7로 제공된 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 8과 같은 단백질 서열을 가진 크로토나제가 촉매하는 3-하이드록시부티릴-CoA로부터 크로토닐-CoA로의 전환;

d) 예를 들어, 서열번호 9로 제공된 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 10과 같은 단백질 서열을 가진 부티릴-CoA 데하이드로게나제가 촉매하는, 크로토닐-CoA로부터 부티릴-CoA로의 전환;

e) 예를 들어, 서열번호 11로 제공된 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 12와 같은 단백질 서열을 가진 부티르알데히드 데하이드로게나제가 촉매하는, 부티릴-CoA로부터 부티르알데히드로의 전환; 및

f) 예를 들어, 서열번호 13 또는 15로 제공된 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 14 또는 16과 같은 단백질 서열을 가진 1-부탄올 데하이드로게나제가 촉매하는, 부티르알데히드로부터 1-부탄올로의 전환.

이 경로는 ATP를 필요로 하지 않으며 NAD⁺ 및/또는 NADP⁺를 생성시키므로, 이는 아세틸-CoA를 생성시키는 중심적 대사 경로와 균형을 이룬다.

2-부탄올 생합성 경로

2-부탄올을 생산하는 생합성 경로는, 각각 원용에 의해 본 명세서에 포함된 동시계류중이며 공유인 미국 특허출원공개 제20070259410호 및 제20070292927호(Donaldson et al.)에 기술되어 있다. 2-부탄올 생합성의 한가지 경로는 하기와 같은 기질로부터 산물로의 전환을 포함한다:

a) 예를 들어, 서열번호 19로 제공된 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 20과 같은 단백질 서열을 가진 아세토락테이트 신타제가 촉매하는, 파이루베이트로부터 알파-아세토락테이트로의 전환;

b) 예를 들어, 서열번호 17로 제공된 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 18과 같은 단백질 서열을 가진 아세토락테이트 데카복실라제가 촉매하는, 알파-아세토락테이트로부터 아세토인으로의 전환;

c) 예를 들어, 서열번호 21로 제공된 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 22와 같은 단백질 서열을 가진 부탄다이올 데하이드로게나제가 촉매하는, 아세토인으로부터 2,3-부탄다이올로의 전환;

d) 예를 들어, 서열번호 23, 25, 또는 27로 제공된 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 24, 26, 또는 28과 같은 단백질 서열을 가진 부탄다이올 데하이드라타제가 촉매하는, 2,3-부탄다이올로부터 2-부타논으로의 전환; 및

e) 예를 들어, 서열번호 29로 제공된 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 30과 같은 단백질 서열을 가진 2-부탄올 데하이드로게나제가 촉매하는, 2-부타논으로부터 2-부탄올로의 전환.

아이소부탄올 생합성 경로

아이소부탄올을 생산하는 생합성 경로는, 원용에 의해 본 명세서에 포함된 동시계류중이며 공유인 미국 특허출원공개 제20070092957호(Maggio-Hall et al.)에 기술되어 있다. 아이소부탄올 생합성의 한가지 경로는 하기와 같은 기질로부터 산물로의 전환을 포함한다:

a) 예를 들어, 서열번호 19 또는 41로 제공된 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 20 또는 42와 같은 단백질 서열을 가진 아세토락테이트 신타제가 촉매하는, 파이루베이트로부터 아세토락테이트로의 전환;

b) 예를 들어, 서열번호 31, 43 또는 45로 제공된 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 32, 44 또는 46과 같은 단백질 서열을 가진 아세토하이드록시산 아이소머로리덕타제가 촉매하는, 아세토락테이트로부터 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트로의 전환;

c) 예를 들어, 서열번호 33으로 제공된 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 34와 같은 단백질 서열을 가진 아세토하이드록시산 데하이드라타제; 또는 서열번호 47로 제공된 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 48과 같은 단백질 서열을 가진 다이하이드록시산 데하이드라타제가 촉매하는, 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트로부터 α-케토아이소발레레이트로의 전환;

d) 예를 들어, 서열번호 35로 제공된 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 36과 같은 단백질 서열을 가진 분지쇄 케토산 데카복실라제가 촉매하는, α-케토아이소발레레이트로부터 아이소부티르알데히드로의 전환; 및

e) 예를 들어, 서열번호 37로 제공된 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 38과 같은 단백질 서열을 가진 분지쇄 알코올 데하이드로게나제가 촉매하는, 아이소부티르알데히드로부터 아이소부탄올로의 전환.

부탄올을 생산하는 효모 균주의 작제

본 명세서에 기술된 바와 같이 부탄올 내성을 위해 유전적으로 개질된 임의의 효모 균주는, 부가적으로 부탄올 생합성 경로가 혼입되도록 당업자에게 주지된 방법에 의해 유전적으로 개질된다(내성을 위한 개질 전 또는 후에). 당업자에게 주지되고 상기 기술된 것들과 같은 통상적으로 사용되는 방법에 의해 동정되고 수득될 수 있는 상기의 효소 활성을 암호화하는 유전자 또는 상동체를 효모 숙주 내에 도입한다. 사용할 수 있는 경로 효소에 대한 대표적인 코딩 및 아미노산 서열들이 표 1, 2 및 3에 서열번호 1-48로 제공된다.

효모에서의 유전자 발현 방법은 당업계에 공지되어 있다; 구체적으로, 형질전환, 세포 성장, 유전자 발현, 갭 수선 재조합(gap repair recombination) 등을 포함하는 기초적 효모 분자생물학 프로토콜은 문헌(Methods in Enzymology, Volume 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part A, 2004, Christine Guthrie and Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, CA)에 기술되어 있다. 효모에서의 유전자 발현은 통상적으로 프로모터, 그 뒤에 이어진 관심의 대상인 코딩 영역, 및 전사 터미네이터(terminator)를 필요로 하며, 이들 모두는 작동적으로 연결되어 발현 카세트를 제공한다. 구성성 프로모터 FBA, GPD 및 GPM, 및 유도성 프로모터 GAL1, GAL10 및 CUP1을 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 효모 프로모터를 사용하여, 부탄올 생합성 경로를 암호화하는 유전자의 발현 카세트를 작제할 수 있다. 적합한 전사 터미네이터는 FBAt, GPDt, GPMt, ERG10t 및 GAL1t를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 실시예 2에 기술된 바와 같이, 적합한 프로모터, 전사 터미네이터, 및 1-부탄올 또는 아이소부탄올 생합성 경로의 유전자를 이. 콜라이-효모 셔틀 벡터에 클로닝할 수 있다.

효모에서 통상적으로 사용되는 플라스미드는 셔틀 벡터 pRS423, pRS424, pRS425 및 pRS426 (메릴랜드주 락빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection))으로서, 이들은 이. 콜라이 복제 기원(예를 들어, pMB1), 효모 2μ 복제 기원, 및 영양 선택(nutritional selection)을 위한 표지자를 포함한다. 이들 4 가지 벡터를 위한 선택 표지자는 His3(벡터 pRS423), Trp1 (벡터 pRS424), Leu2 (벡터 pRS425) 및 Ura3 (벡터 pRS426)이다. 이들 벡터는 이. 콜라이 및 효모 균주 모두에서 균주 증식을 허용한다. 유전자 클로닝 및 발현을 위한 통상적 숙주는 효모 반수체(haploid) 균주 BY4741(MAT a his3 Δ1 leu2 Δ0 met15 Δ0 ura3 Δ0) (알라바마주 헌츠빌 소재의 리서치 제네틱스(Research Genetics), 또한 ATCC 201388로부터 이용가능함) 및 배수체(diploid) 균주 BY4743(MATa/alpha his3Δ1/his3Δ1 leu2Δ0/leu2Δ0 lys2Δ0/LYS2 MET15/met15Δ0 ura3Δ0/ura3Δ0) (알라바마주 헌츠빌 소재의 리서치 제네틱스, 또한 ATCC 201390으로부터 이용가능함)을 포함한다. 이. 콜라이에서의 표준 분자 클로닝 기술 또는 효모에서의 갭 수선 재조합 방법에 의해, 부탄올 생합성 경로 효소를 암호화하는 유전자를 위한 발현 벡터를 작제할 수 있다.

갭 수선 클로닝 접근방법은 효모에서의 고효율 상동성 재조합을 이용한다. 통상적으로, 효모 벡터 DNA를 분해하여(예를 들어, 그의 다중 클로닝 부위에서) 그의 서열 내에 "갭"을 만든다. 서로, 및 벡터 DNA의 5' 및 3' 말단과 서열상 중복되는 ≥ 21 bp 서열을 5' 및 3' 말단 모두에 포함하는, 관심의 대상인 다수의 삽입 DNA가 생성된다. 예를 들어, "유전자 X'를 위한 효모 발현 벡터를 작제하기 위해서는, 발현 카세트를 위한 효모 프로모터 및 효모 터미네이터를 선택한다. 프로모터 및 터미네이터는 효모 게놈 DNA로부터 증폭되고, 유전자 X는 그의 공급원 유기체로부터 PCR 증폭되거나 유전자 X 서열을 포함하는 클로닝 벡터로부터 수득된다. 선형화된 벡터의 5' 말단 및 프로모터 서열의 사이, 프로모터 및 유전자 X의 사이, 유전자 X 및 터미네이터 서열의 사이, 및 터미네이터 및 선형화된 벡터의 3' 말단 사이에는 적어도 21 bp의 중복 서열이 있다. 그 다음에 "갭이 있는" 벡터 및 삽입 DNA를 효모 균주에 동시-형질전환시키고, 플라스미드상의 영양 선택 표지자의 상보성을 허용하는 적절한 화합물 혼합물을 함유하는 배지상에 평판배양한다. 선택된 세포로부터 제조된 플라스미드 DNA를 사용하는 PCR 맵핑에 의해 정확한 삽입 조합의 존재를 확인할 수 있다. 그 다음에는, 효모로부터 분리된 플라스미드 DNA(통상적으로 농도가 낮음)를 이. 콜라이 균주, 예를 들어, TOP10에 형질전환시킨 후, 미니 프렙(mini prep) 및 제한효소 맵핑(restriction mapping)으로 플라스미드 작제물을 추가로 확인할 수 있다. 마지막으로, 서열 분석에 의해 작제물을 확인할 수 있다. 양성 플라스미드의 효모 형질전환체를 성장시켜, 관심의 대상인 유전자에 의해 발현되는 효소들의 활성을 조사하는 효소 에세이를 수행한다.

발효 배지

본 발명의 발효 배지는 적합한 탄소 기질을 함유해야 한다. 적합한 기질은 단당류, 예를 들어 포도당 및 과당, 올리고당류, 예를 들어 락토스 또는 수크로스, 다당류, 예를 들어 전분 또는 셀룰로오스 또는 그 혼합물 및 재생가능한 원료로부터의 미정제 혼합물, 예를 들어 유청 투과액, 옥수수 침지수, 사탕무우 당밀 및 보리 맥아를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 탄소 기질은 1-탄소 기질, 예를 들어, 이산화탄소, 또는 중요 생화학적 중간체로의 대사적 전환이 입증된 메탄올일 수도 있다. 메탄올 자화유기체(methylotrophic organism)는 또한, 1 탄소 및 2 탄소 기질에 부가하여 다수의 다른 탄소 함유 화합물, 예를 들어 메틸아민, 글루코사민 및 다양한 아미노산을 대사 활성에 이용하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 메탄올 자화효모는 메틸아민으로부터의 탄소를 이용하여 트레할로스 또는 글리세롤을 형성하는 것으로 공지되어 있다(Bellion et al., Microb. Growth C1 Compd., [Int. Symp.], 7th (1993), 415-32. Editor(s): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, UK). 마찬가지로, 다양한 종의 칸디다는 알라닌 또는 올레산을 대사작용한다(Sulter et al., Arch. Microbiol. 153:485-489 (1990)). 그러므로, 본 발명에 이용되는 탄소 공급원은 광범위한 탄소 함유 기질을 포함할 수 있으며 유기체의 선택에 의해서만 한정되는 것으로 생각된다.

상기 언급한 탄소 기질 및 그 혼합물 모두가 본 발명에 적합한 것으로 생각되지만, 바람직한 탄소 기질은 포도당, 과당 및 수크로스이다.

적절한 탄소 공급원에 부가하여, 발효 배지는 적합한 무기물, 염, 보조인자, 완충제, 및 배양물의 성장 및 부탄올 생산에 필요한 효소 경로의 촉진에 적합한, 당업자에게 공지된 다른 성분들을 함유해야 한다.

배양 조건

통상적으로 세포는 약 20℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서 적절한 배지 내에 성장시킨다. 본 발명에서 적합한 성장 배지는, 효모 질소 베이스(yeast nitrogen base), 암모늄 설페이트, 및 탄소/에너지 공급원으로서의 덱스트로스를 포함하는 브로스(broth) 또는 대부분의 사카로마이세스 세레비시아 균주의 성장을 위한 최적 비율로 펩톤, 효모 추출물 및 덱스트로스를 블렌딩한 YPD 배지와 같이 상업적으로 제조된 통상적인 배지이다. 그밖에 정의되거나 합성된 성장 배지도 사용할 수 있으며, 특정 미생물의 성장에 적절한 배지는 미생물학 또는 발효과학 분야의 당업자에게 공지되어 있다.

발효에 있어서 적합한 pH 범위는 pH 3.0 내지 pH 7.5이며, 여기서 초기 조건으로서 바람직한 범위는 pH 4.5.0 내지 pH 6.5 이다.

발효는 유산소 또는 무산소 조건하에서 수행될 수 있으며, 여기서 유산소 또는 미량산소(microaerobic) 조건이 바람직하다.

당업계에 공지된 다수의 방법, 예를 들어, 고속액체 크로마토그래피(HPLC: high performance liquid chromatography) 또는 기체 크로마토그래피(GC: gas chromatography)를 사용하여 발효 배지 내에 생성된 부탄올의 양을 결정할 수 있다.

발효 배지로부터 부탄올을 분리하는 방법

생물생산된 부탄올은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 발효 배지로부터 분리할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 경사분리(decantation) 등에 의해 발효 배지로부터 고체를 제거할 수 있다. 그 다음에, 증류, 액-액 추출 또는 막-기제의 분리와 같은 방법을 사용하여, 상기와 같이 고체를 제거하기 위해 처리한 발효 배지로부터 부탄올을 분리할 수 있다. 부탄올과 물은 비등점이 낮은 공비 혼합물(azeotropic mixture)을 형성하므로, 증류를 이용하면 혼합물을 그의 공비 조성까지만 분리할 수 있다. 다른 분리 방법과 조합하여 증류를 사용하여 공비점 부근의 분리를 달성할 수 있다. 부탄올의 분리 및 정제를 위하여 증류와 조합하여 사용할 수 있는 방법은 경사분리, 액-액 추출, 흡착 및 막-기제의 기술을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 동반물질(entrainer)을 사용하는 공비 증류를 이용하여 부탄올을 분리할 수 있다(예를 들어, Doherty and Malone, Conceptual Design of Distillation Systems, McGraw Hill, New York, 2001).

부탄올-물 혼합물은 불균질 공비 혼합물을 형성하므로, 경사분리와 조합하여 증류를 이용함으로써 부탄올을 분리 정제할 수 있다. 이 방법에서는 부탄올을 함유하는 발효 브로스를 공비 조성 부근까지 증류한다. 그 다음에, 공비 혼합물을 응축시키고 경사분리에 의해 발효 배지로부터 부탄올을 분리한다. 경사분리된 수성상은 제1 증류 컬럼에 환류되어 돌아갈 수 있다. 부탄올이 풍부한 경사분리 유기상을 제2 증류 컬럼에서 증류에 의해 추가로 정제할 수 있다.

증류와 조합한 액-액 추출을 사용하여 발효 배지로부터 부탄올을 분리할 수도 있다. 이 방법에서는 적합한 용매로 액-액 추출하여 발효 브로스로부터 부탄올을 추출한다. 그 후에 부탄올-함유 유기상을 증류하여 용매로부터 부탄올을 분리한다.

흡착과 조합한 증류를 사용하여 발효 배지로부터 부탄올을 분리할 수도 있다. 이 방법에서는, 부탄올을 함유하는 발효 브로스를 공비 조성 부근까지 증류한 후에 분자체와 같은 흡착제를 사용하여 잔류하는 물을 제거한다(Aden et al. Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover, Report NREL/TP-510-32438, National Renewable Energy Laboratory, June 2002).

또한, 투과증발(pervaporation)과 조합한 증류를 사용하여 발효 배지로부터 부탄올을 분리 정제할 수도 있다. 이 방법에서는, 부탄올을 함유하는 발효 브로스를 공비 조성 부근까지 증류한 후에 친수성 막을 통한 투과증발에 의해 잔류하는 물을 제거한다(Guo et al., J. Membr. Sci. 245, 199-210 (2004)).

실시예

본 발명은 하기 실시예에서 추가로 정의된다. 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내는 한편, 단지 예시로 주어짐을 이해해야 한다. 당업자라면, 상기 논의 및 이러한 실시예로부터 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고서도 본 발명을 다양하게 변경하고 수정하여 본 발명을 다양한 용도 및 조건에 적합하게 할 수 있다.

일반 방법

본 실시예들에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 주지된 것으로서 문헌(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY (1989) (Maniatis); 및 T. J. Silhavy, M. L. Bennan, and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984); 및 Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987))에 기술되어 있다.

박테리아 배양물의 유지 및 성장을 위해 적합한 재료 및 방법은 당업계에 주지되어 있다. 하기 실시예에서 사용하기에 적합한 기술들은 문헌(Manual of Methods for General Bacteriology, Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips, eds, American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994); 또는 Thomas D. Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989))에 정리된 바와 같이 찾을 수 있다. 다르게 특정하지 않는 한, 박테리아 세포의 성장 및 유지를 위해 사용된 모든 시약, 제한효소 및 재료는 알드리치 케미컬즈(Aldrich Chemicals)(위스콘신주 밀워키 소재), BD 다이아그노스틱 시스템즈(BD Diagnostic Systems)(메릴랜드주 스파크 소재), 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)(메릴랜드주 락빌 소재), 또는 시그마 케미컬 컴퍼니(Sigma Chemical Company)(미주리주 세인트루이스 소재)로부터 입수하였다.

다르게 표시하지 않는 한, 미생물 균주는 버지니아주 메너서스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)으로부터 입수하였다.

배양 배지로부터 아이소부탄올 농도를 결정하는 방법

배양 배지 내의 아이소부탄올 농도는 당업계에 공지된 다수의 방법으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 구체적인 고속액체 크로마토그래피(HPLC) 방법에서는, 굴절률(RI: refractive index) 검출기와 함께, 워터스 코퍼레이션(Waters Corporation)(메사추세츠주 밀포드 소재)으로부터 구입한 쇼덱스(Shodex) SH-G 가드 컬럼을 동반하는 쇼덱스SH-1011 컬럼을 사용한다. 0.01 M H₂SO₄를 이동상으로 사용하여 50℃의 컬럼 온도 및 0.5 ㎖/min의 유속으로 크로마토그래피 분리를 수행한다. 기술된 조건하에서 아이소부탄올은 46.6 min의 체류시간을 나타낸다. 대안적으로, 기체 크로마토그래피(GC) 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 구체적인 GC 방법에서는 불꽃 이온화 검출기(FID: flame ionization detector)와 함께 HP-이노왁스(INNOWax) 컬럼(30 m x 0.53 ㎜ id,1 ㎛ 필름 두께, 델라웨어주 윌밍톤 소재의 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies))을 이용한다. 운반 기체로는, 150℃에서 측정할 때 유속이 4.5 ㎖/min인 헬륨을 일정한 헤드 압력(head pressure)으로 사용하고; 주입기 스플릿(injector split)은 200℃에서 1:25이며; 오븐 온도는 45℃에서 1 min, 10℃/min으로 45℃에서 220℃까지 상승, 및 220℃에서 5 min이고; 26 ㎖/min 헬륨 보충 기체를 동반하는 240℃에서의 FID 검출을 채용한다. 아이소부탄올의 체류시간은 4.5 min이다.

약어의 의미는 하기와 같다: "s"는 초(들)를 의미하고, "min"은 분(들)을 의미하며 , "h"는 시간(들)을 의미하고, "psi"는 평방 인치당 파운드를 의미하며, "㎚"는 나노미터를 의미하고, "d"는 일(들)을 의미하며, "㎕"는 마이크로리터(들)를 의미하고, "㎖"는 밀리리터(들)를 의미하며, "L"는 리터(들)를 의미하고, "㎜"는 밀리미터(들)를 의미하며, "㎚"는 나노미터를 의미하고, "mM"은 밀리몰 농도를 의미하며, "㎛"은 마이크로몰 농도를 의미하고, "M"은 몰 농도를 의미하며, "mmol"은 밀리몰(들)을 의미하고, "μmol"은 마이크로몰(들)을 의미하며, "g"은 그램(들)을 의미하고, "㎍"은 마이크로그램(들)을 의미하며 "ng"은 나노그램(들)을 의미하고, "PCR"은 중합효소 연쇄반응을 의미하며, "OD"는 광학 밀도를 의미하고, "OD₆₀₀"은 600 ㎚의 파장에서 측정한 광학 밀도를 의미하며, "kDa"는 킬로달톤을 의미하고, "g"는 중력 상수를 의미하며, "bp"는 염기쌍(들)을 의미하고, "kbp"는 킬로염기쌍(들)을 의미하며, "% w/v"는 중량/부피 백분율을 의미하고, % v/v"는 부피/부피 백분율을 의미하며, "HPLC"는 고속액체 크로마토그래피를 의미하고, "GC"는 기체 크로마토그래피를 의미한다. 용어 "몰 선택성"은 소모된 당 기질의 몰 당 생성된 산물의 몰 수이며, 백분율로 보고한다.

실시예 1

gcn2 및 gcn4 돌연변이체에서의 부탄올 내성

배수체 a/α 사카로마이세스 세레비시아 균주 BY4743의 GCN2 유전자 및 GCN4 유전자 결실 돌연변이체 (Brachmann et al., Yeast 14:115-132 (1998))는 거의 완전하고 질서있는 결실 균주 콜렉션(nearly complete, ordered deletion strain collection)으로서 이용가능하다(Giaever et al. Nature 418, 387-391 (2002); Saccharomyces Genome Deletion Project). GCN2 유전자 및 GCN4 유전자 결실 돌연변이체 세포를 30℃에서 250 rpm으로 진탕하면서 YPD 또는 YVCM 배지(하기의 제조법) 내의 YPD 플레이트 상에서 14 ㎖ 팔콘(Falcon) 튜브 내에 단일 콜로니로부터 밤새 성장시켰다. 밤새 배양물을 동일한 배지로 1:100 (2 ㎖ 대 200 ㎖) 희석하고, 1 배증(doubling)이 일어날 때까지 60 분마다 성장을 관찰하였다. 그 시점에서 배양물을 25 ㎖ 시료로 나누어 독립적인 125 ㎖ 플라스틱 플라스크에 분주하였다. 양성 대조군으로 사용할 하나의 플라스크를 제외하고 각 배양물의 모든 플라스크에 0.5% 내지 2% w/v 범위의 시험농도(challenging concentration)로 아이소부탄올을 첨가하였다. 대조군 및 시험 배양물을 30℃ 물 중탕조에서 진탕중에 인큐베이션하면서 약 1 시간 기준으로 흡광도를 관찰하였다.

사용된 2 가지의 배지는, 효모 추출물 10 g, 펩톤 20 g, 및 덱스트로스 20 g을 리터당 함유하는 완전 배지 YPD; 및, 아미노산은 없고 암모늄 설페이트가 있는 효모 질소 베이스 6.67g, 덱스트로스 20 g, L-히스티딘 20 ㎎, L-류신 30 ㎎, 우라실 20 ㎎을 리터당 함유하는 정의된 합성 배지 YVCM이었다.

아이소부탄올을 함유하는 YVCM 내에서의 성장에서 8 및 24 hr 시점을 사용하여 분획 성장 수율을 결정하였고 그 결과를 도 1에 제공한다. 합성 배지에서 성장시킨 GCN2 및 GCN4 결실 라인(line)은 모두 모균주에 비해서 8 hr 아이소부탄올 시험에 대한 내성이 대체로 강했다. 누적된 장점은 밤새 인큐베이션 후에 사라졌다. 내성의 증가는 1-2 % 아이소부탄올 농도 범위에 걸쳐 관찰되었다.

아이소부탄올을 함유하는 YPD 내에서의 성장에서 7 및 23 hr 시점을 사용하여 분획 성장 수율을 결정하였고 그 결과를 도 2에 제공한다. 이 조건하에서 짧은 시점에서는 내성의 증가가 관찰되지 않았고, 상이한 아이소부탄올 농도에서의 GCN2 및 GCN4 돌연변이체에서 미약한 개선이 관찰되었다.

실시예 2

사카로마이세스 세레비시아에서 아이소부탄올 경로 유전자의 발현

사카로마이세스 세레비시아에서 아이소부탄올 경로 유전자를 발현시키기 위하여, 다수의 이. 콜라이-효모 셔틀 벡터를 작제하였다. PCR 접근방법(Yu, et al. Fungal Genet. Biol. 41:973-981(2004))을 사용하여 효모 프로모터 및 터미네이터와 유전자를 융합시켰다. 구체적으로, GPD 프로모터(서열번호 76) 및 CYC1 터미네이터(서열번호 77)를 바실러스 서브틸리스의 alsS 유전자(서열번호 41)에 융합시켰고, FBA 프로모터(서열번호 78) 및 CYC1 터미네이터를 에스. 세레비시아의 ILV5 유전자(서열번호 43)에 융합시켰으며 , ADH1 프로모터(서열번호 79) 및 ADH1 터미네이터(서열번호 80)를 에스. 세레비시아의 ILV3 유전자(서열번호 47)에 융합시켰고, GPM 프로모터(서열번호 81) 및 ADH1 터미네이터를 락토코커스 락티스의 kivD 유전자(서열번호 35)에 융합시켰다. 표 5에 제공된 프라이머는 pRS400 계열의 이. 콜라이-효모 셔틀 벡터(Christianson et al. Gene 110:119-122 (1992))에 프로모터/유전자/터미네이터 산물을 클로닝하고 작제물 사이에 프로모터를 교환하기 위한 제한효소 부위를 포함하도록 고안되었다. ILV5 및 ILV3(각각 서열번호 92 및 104로 제공된, 각각 N138 및 N155)의 5' 말단에 대한 프라이머에 의해 새로운 개시 코돈이 생성됨으로써 이들 효소의 미토콘드리아 표적화가 제거되었다.

먼저, TOPO 클로닝 반응(인비트로젠(Invitrogen))에 의해 모든 융합 PCR 산물을 pCR4-블런트(blunt)에 클로닝하고, 표 5에 제공된 서열분석 프라이머 및 M13 정방향 및 역방향 프라이머(인비트로젠)를 사용하여 서열을 확인하였다. 2 개의 부가적 프로모터(CUP1 및 GAL1)를 TOPO 반응에 의해 pCR4-블런트에 클로닝하고 서열분석으로 확인하였다; 프라이머 서열은 표 5에 나타낸다. 작제된 플라스미드는 표 6에 기술한다. 플라스미드를 사카로마이세스 세레비시아 BY4743(ATCC 201390) 또는 YJR148w(ATCC 4036939)에 형질전환시켜 효소 특이적 활성을 평가하였다. 효소 활성을 결정하기 위하여, 발현 플라스미드(들)의 선택을 위해 필요한 임의의 대사산물(들)이 결여된 합성 완전 배지 내에서 배양물을 OD₆₀₀ 1.0까지 성장시키고(Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202) , 원심분리로 수확하여(4℃에서 8 min 동안 2600 x g) 완충제로 세척하고, 다시 원심분리한 후에 -80℃에서 냉동시켰다. 세포를 해동시켜 20 mM 트리스-HCl, pH 8.0에 최종 부피 2 ㎖로 재현탁한 후에, 1.2 g의 유리 비드(0.5 ㎜ 크기)가 있는 비드 비터(bead beater)를 사용하여 파쇄하였다. 각 시료를 총 3 분간 고속으로 처리하였다(각 1 분의 비팅(beating) 후에 빙상 인큐베이션을 하면서). 추출물을 원심분리하여(4℃에서 10 min 동안 20,000 x g) 세포 잔해를 제거하였다.

문헌(Bauerle et al.,Biochim. Biophys. Acta 92(1):142-149 (1964))에 기술된 방법을 사용하여 세포가 없는 추출물 내의 아세토락테이트 신타제 활성을 측정한다. 문헌 (Arfin and Umbarger, J. Biol. Chem. 244(5):1118-1127 (1969))에 기술된 방법을 사용하여 세포가 없는 추출물 내의 아세토하이드록시산 리덕토아이소머라제 활성을 측정한다. 문헌(Flint et al., J. Biol. Chem. 268(20):14732-14742 (1993))에 기술된 방법을 사용하여 세포가 없는 추출물 내의 아세토하이드록시산 데하이드라타제 활성을 측정한다. 푸르팔드(등록상표)(Purpald®) 시약(알드리치, 카탈로그 번호 162892)을 사용하여 알데히드 반응 산물을 검출하고 정량한 점을 제외하고는, 문헌(Smit et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 64:396-402 (2003))에 기술된 방법을 사용하여 세포가 없는 추출물 내의 분지쇄 케토산 데카복실라제 활성을 측정한다.

[표 5]

[표 6]

실시예 3(예견(PROPHETIC))

사카로마이세스 세레비시아 내성 균주를 사용하는 아이소부탄올의 생산

본 연구의 개시 균주는 BY4741(Brachmann, et al. Yeast. 14: 115-132 (1998)) 및 그의 Δbat2 유도체, YJR148W BY4741, MATa his3delta1 leu2delta0 met15delta0 ura3delta0 deltaTWT2의 유전자형으로 ATCC(# 406939)로부터 이용가능한 교배형 a(6939)이다. bat2는 세포질 분지쇄 아미노산 아미노트랜스페라제를 암호화하며, URA3의 결실과 조합된 bat2의 결실은 우라실의 부재하에 성장을 허용하므로 URA3 삽입의 존재에 대한 선택으로 사용된다.

먼저 ATCC 균주 # 406939를 사용하여 ΔGCN2 및 ΔGCN4 유도체를 제조한다. 결실의 표적인 서열을 대체하는 양 옆의 직접 반복 서열과 함께 URA3⁺가 게놈에 통합된 GCN 삽입-결실 대립유전자를 위한 선택가능 표지자로서 URA3⁺ 대립유전자를 사용하는 효모에 통상적으로 사용되는 유전자 대체 전략에 의해 이를 수행할 수 있다. 이어서, URA3⁺ 기능을 반대 선택(select against)하는 플루오로-오로트산(FOA: fluoro-orotic acid) 내성 요구에 의해 직접 반복 사이의 재조합 사건을 선택한다.

URA3 발현을 위한 유전자 및 양 옆의 직접 반복을 포함하는 DNA 단편("URA3 반복" 단편; 서열번호 138)은 하기의 것들을 포함한다(위치 번호는 서열번호 138의 "URA3 반복" 단편 내의 위치를 나타낸다):

1) URA3^{+ :} 양 옆의 직접 반복에 경계를 이루는 프라이머 결합 서열: gcattgcggattacgtattctaatg (위치 1-25; 서열번호 143) 및 gatgatacaacgagttagccaaggtg (서열번호 144의 위치 1449-1474);

2) 프로모터 및 코딩 서열의 양 옆에 있는 직접 반복 서열: ttcagcccgcggaacgccagcaaatcaccacccatgcgcatgatactgagtcttgtacacgctgggcttccagtg (서열번호 145의 위치 26-100) 및 ttcagcccgcggaacgccagcaaatcaccacccatgcgcatgatactgagtcttgtacacgctgggcttccagtg (서열번호 146의 위치 1375-1449)

3) 프로모터 서열:

ttttttattcttttttttgatttcggtttctttgaaatttttttgattcggtaatctccgaacagaaggaagaacgaaggaaggagcacagacttagattggtatatatacgcatatgtagtgttgaagaaacatgaaattgcccagtattcttaacccaactgcacagaacaaaaacctgcaggaaacgaagataaatc (서열번호 147의 위치 149-348) 및

4) 코딩 영역:

atgtcgaaagctacatataaggaacgtgctgctactcatcctagtcctgttgctgccaagctatttaatatcatgcacgaaaagcaaacaaacttgtgtgcttcattggatgttcgtaccaccaaggaattactggagttagttgaagcattaggtcccaaaatttgtttactaaaaacacatgtggatatcttgactgatttttccatggagggcacagttaagccgctaaaggcattatccgccaagtacaattttttactcttcgaagacagaaaatttgctgacattggtaatacagtcaaattgcagtactctgcgggtgtatacagaatagcagaatgggcagacattacgaatgcacacggtgtggtgggcccaggtattgttagcggtttgaagcaggcggcagaagaagtaacaaaggaacctagaggccttttgatgttagcagaattgtcatgcaagggctccctatctactggagaatatactaagggtactgttgacattgcgaagagcgacaaagattttgttatcggctttattgctcaaagagacatgggtggaagagatgaaggttacgattggttgattatgacacccggtgtgggtttagatgacaagggagacgcattgggtcaacagtatagaaccgtggatgatgtggtctctacaggatctgacattattattgttggaagaggactatttgcaaagggaagggatgctaaggtagagggtgaacgttacagaaaagcaggctgggaagcatatttgagaagatgcggccagcaaaactaa (서열번호 148의 위치 349-1152).

GCN2 코딩 영역의 100 bp 업스트림에 있는 50 bp 서열, 상기의 URA3 반복 단편, 및 GCN2 코딩 영역의 100 bp 다운스트림에 있는 50 bp 서열을 포함하는 DNA 단편을 PCR을 사용하여 제조한다. 5' 프라이머는 GCN2의 업스트림에 있는 50 bp의 서열 및 상기 (1)의 위치 1-25 프라이머 결합 서열을 포함하는 융합 서열이다: 50 (GCN2 5' 양 옆의 서열 )+ 5'ura3 프라이머 (I) (서열번호::139). 3' 프라이머는 GCN2의 다운스트림에 있는 50 bp의 서열의 상보서열(complement) 및 위치 1449-1474 프라이머 결합 서열의 상보서열을 포함하는 융합 서열이다: 50 (GCN2 3' 양 옆의 서열의 역상보서열(reverse compl)) + 3'ura3 프라이머(역상보서열)(II)(서열번호 :140).

PCR 반응은 50 ㎕ 반응 혼합물로서, 1 ㎕의 주형(template) DNA (총 50 ng), 1 ㎕의 각 프라이머(20 μM), 25 ㎕의 2X 타카라 엑스(TaKaRa Ex) Taq 프리믹스(premix), 22 ㎕의 물을 함유한다. 주형은, "URA3 반복"이 다중-클로닝 부위에 삽입된 pUC19(Yanisch-Perron et al. (1985) Gene, 33:103-119) 유도체인 pUC19- URA3 반복이다. 사용된 PCR 조건은 하기와 같다:

94℃ 1 min, 이어서 30 주기의 94℃ 20 sec, 55℃ 20 sec 및 72℃ 2 min, 이어서 72℃에서 7 min . 연장 시간은 kb 당 1 min이다.

생성된 PCR 산물, ΔGCN2::URA3⁺ 단편을 퀴아젠(Qiagen) PCR 정제 키트를 사용하여 정제한다.

유사한 DNA 단편을 상기와 같이 제조하되, GCN4 코딩 영역의 업스트림 및 다운스트림에 있는 서열들을 포함하는 프라이머를 사용한다: 50 (GCN4 5' 양 옆의 서열) + 5'ura3 프라이머(III)(서열번호 141) 및 50 (GCN4 3' 양 옆의 서열의 역상보서열) + 3'ura3 프라이머(역상보서열)(GCN4)(IV)(서열번호 142).

생성된 PCR 산물, ΔGCN4::URA3⁺ 단편을 퀴아젠 PCR 정제 키트를 사용하여 정제한다.

PCR 산물을 사용하여 균주 ATCC #406939를 형질전환시킨다. 우라실 부재하의 성장에 대해 통합체(integrant)를 선택한다. "URA3 반복"의 삽입 및 GCN2 또는 GCN4의 결실을 동반하는 통합 균주(integrant strain)를 하기와 같이 각각 명명한다:

DYW1: MATa his3delta1 leu2delta0 met15delta0 ura3delta0 deltaTWT2 Δgcn2::URA3⁺및

DYW2: MATa his3delta1 leu2delta0 met15delta0 ura3delta0 deltaTWT2 Δgcn4::URA3^+.URA3⁺대립유전자의 제거를 선택하는 5-FOA 선택을 사용하여, 직접 반복 사이에 재조합을 동반하는 균주를 수득하고 하기와 같이 명명한다:

DYW3: MATa his3delta1 leu2delta0 met15delta0 ura3delta0 deltaTWT2 Δgcn2 및

DYW4: MATa his3delta1 leu2delta0 met15delta0 ura3delta0 deltaTWT2 Δgcn4

플라스미드 pRS423::CUP1-alsS+FBA-ILV3 및 pHR81::FBA-ILV5+GPM-kivD(실시예 2에 기술함)를 사카로마이세스 세레비시아 DYW3 및 DYW4에 형질전환시켜 균주 DYW3(Δgcn2)/pRS423::CUP1-alsS+FBA-ILV3/ pHR81::FBA-ILV5+ GPM-kivD 및 DYW4(Δgcn4)/pRS423::CUP1-alsS+FBA-ILV3/ pHR81::FBA-ILV5+ GPM-kivD를 생성시킨다. 벡터 pRS423 및 pHR81(실시예 2에 기술함)을 사카로마이세스 세레비시아(ATCC 균주 # 406939) [균주 406939(GCN2⁺ GCN4⁺)/pRS423/pHR81]에 형질전환 시킴으로써 대조군 균주를 생성시킨다. 플라스미드의 유지를 보장하기 위하여 2% 포도당 또는 수크로스를 포함하나 우라실 및 히스티딘은 결여된 표준 에스. 세레비시아 합성 완전 배지(Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202)에서 균주들을 유지한다.

아이소부탄올의 생산을 위하여, 우라실, 히스티딘 및 류신이 결여된 합성 완전 배지에 세포를 이전한다. 배지에서 류신을 제거하는 것은, leu2-d 대립유전자의 전사 불량에 기인하는 pHR81-기제 플라스미드의 카피 수 증가를 촉발시키기 위한 것이다(Erhart and Hollenberg, J. Bacteriol. 156:625-635 (1983)). 이노바(Innova)4000 인큐베이터(뉴저지주 에디슨 소재의 뉴 브룬스위크 사이언티픽(New Brunswick Scientific)) 내에서, 50 ㎖의 배지를 포함하는 175 ㎖ 용량 플라스크 내에 30℃ 및 200 rpm으로 유산소 배양물을 성장시킨다. 45 ㎖의 배지를 60 ㎖ 혈청 바이알에 가하고 접종 후에 권축 마개(crimped cap)로 밀봉하여 30℃에 유지함으로써 저산소 배양물을 제조한다. 필요에 따라 시료 채취 및 유도물질(inducer) 첨가를 위해 멸균 주사기를 사용한다. 접종으로부터 대략 24 h 후에, 유도물질 CuSO₄를 최종 농도 0.03 mM로 첨가한다. 각 균주에 대해 CuSO₄를 첨가하지 않은 대조군 배양물도 제조한다. 일반 방법 섹션에 기술된 바와 같이, CuSO₄ 첨가 후 18 또는 19 h 및 35 h에 HPLC (굴절률 검출기(RI)가 있는 쇼덱스 슈가(Sugar) SH1011 컬럼(뉴욕 소재의 쇼와 덴코 아메리카 인코포레이티드(Showa Denko America, Inc.)) 및 GC (불꽃 이온화 검출기(FID)가 있는 베리안(Varian) CP-WAX 58(FFAP) CB, 0.25 ㎜ X 0.2 ㎛ X 25 m (캘리포니아주 팔로 알토 소재의 베리안 인코포레이티드(Varian, Inc.))로 배양물 상등액의 아이소부탄올 함량을 분석한다. 돌연변이체 gcn 대립유전자의 존재에 의해 아이소부탄올의 생산이 증진된다. 일반적으로, GCN 돌연변이체는 광학 밀도 단위당 더 높은 수준의 아이소부탄올을 생산한다.

SEQUENCE LISTING <110> E.I. du Pont de Nemours and Co. <120> Improved yeast strain for production of four carbon alcohols <130> CL4132 <160> 148 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1179 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <400> 1 atgaaagaag ttgtaatagc tagtgcagta agaacagcga ttggatctta tggaaagtct 60 cttaaggatg taccagcagt agatttagga gctacagcta taaaggaagc agttaaaaaa 120 gcaggaataa aaccagagga tgttaatgaa gtcattttag gaaatgttct tcaagcaggt 180 ttaggacaga atccagcaag acaggcatct tttaaagcag gattaccagt tgaaattcca 240 gctatgacta ttaataaggt ttgtggttca ggacttagaa cagttagctt agcagcacaa 300 attataaaag caggagatgc tgacgtaata atagcaggtg gtatggaaaa tatgtctaga 360 gctccttact tagcgaataa cgctagatgg ggatatagaa tgggaaacgc taaatttgtt 420 gatgaaatga tcactgacgg attgtgggat gcatttaatg attaccacat gggaataaca 480 gcagaaaaca tagctgagag atggaacatt tcaagagaag aacaagatga gtttgctctt 540 gcatcacaaa aaaaagctga agaagctata aaatcaggtc aatttaaaga tgaaatagtt 600 cctgtagtaa ttaaaggcag aaagggagaa actgtagttg atacagatga gcaccctaga 660 tttggatcaa ctatagaagg acttgcaaaa ttaaaacctg ccttcaaaaa agatggaaca 720 gttacagctg gtaatgcatc aggattaaat gactgtgcag cagtacttgt aatcatgagt 780 gcagaaaaag ctaaagagct tggagtaaaa ccacttgcta agatagtttc ttatggttca 840 gcaggagttg acccagcaat aatgggatat ggacctttct atgcaacaaa agcagctatt 900 gaaaaagcag gttggacagt tgatgaatta gatttaatag aatcaaatga agcttttgca 960 gctcaaagtt tagcagtagc aaaagattta aaatttgata tgaataaagt aaatgtaaat 1020 ggaggagcta ttgcccttgg tcatccaatt ggagcatcag gtgcaagaat actcgttact 1080 cttgtacacg caatgcaaaa aagagatgca aaaaaaggct tagcaacttt atgtataggt 1140 ggcggacaag gaacagcaat attgctagaa aagtgctag 1179 <210> 2 <211> 392 <212> PRT <213> Clostridium acetobutylicum <400> 2 Met Lys Glu Val Val Ile Ala Ser Ala Val Arg Thr Ala Ile Gly Ser 1 5 10 15 Tyr Gly Lys Ser Leu Lys Asp Val Pro Ala Val Asp Leu Gly Ala Thr 20 25 30 Ala Ile Lys Glu Ala Val Lys Lys Ala Gly Ile Lys Pro Glu Asp Val 35 40 45 Asn Glu Val Ile Leu Gly Asn Val Leu Gln Ala Gly Leu Gly Gln Asn 50 55 60 Pro Ala Arg Gln Ala Ser Phe Lys Ala Gly Leu Pro Val Glu Ile Pro 65 70 75 80 Ala Met Thr Ile Asn Lys Val Cys Gly Ser Gly Leu Arg Thr Val Ser 85 90 95 Leu Ala Ala Gln Ile Ile Lys Ala Gly Asp Ala Asp Val Ile Ile Ala 100 105 110 Gly Gly Met Glu Asn Met Ser Arg Ala Pro Tyr Leu Ala Asn Asn Ala 115 120 125 Arg Trp Gly Tyr Arg Met Gly Asn Ala Lys Phe Val Asp Glu Met Ile 130 135 140 Thr Asp Gly Leu Trp Asp Ala Phe Asn Asp Tyr His Met Gly Ile Thr 145 150 155 160 Ala Glu Asn Ile Ala Glu Arg Trp Asn Ile Ser Arg Glu Glu Gln Asp 165 170 175 Glu Phe Ala Leu Ala Ser Gln Lys Lys Ala Glu Glu Ala Ile Lys Ser 180 185 190 Gly Gln Phe Lys Asp Glu Ile Val Pro Val Val Ile Lys Gly Arg Lys 195 200 205 Gly Glu Thr Val Val Asp Thr Asp Glu His Pro Arg Phe Gly Ser Thr 210 215 220 Ile Glu Gly Leu Ala Lys Leu Lys Pro Ala Phe Lys Lys Asp Gly Thr 225 230 235 240 Val Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Leu Asn Asp Cys Ala Ala Val Leu 245 250 255 Val Ile Met Ser Ala Glu Lys Ala Lys Glu Leu Gly Val Lys Pro Leu 260 265 270 Ala Lys Ile Val Ser Tyr Gly Ser Ala Gly Val Asp Pro Ala Ile Met 275 280 285 Gly Tyr Gly Pro Phe Tyr Ala Thr Lys Ala Ala Ile Glu Lys Ala Gly 290 295 300 Trp Thr Val Asp Glu Leu Asp Leu Ile Glu Ser Asn Glu Ala Phe Ala 305 310 315 320 Ala Gln Ser Leu Ala Val Ala Lys Asp Leu Lys Phe Asp Met Asn Lys 325 330 335 Val Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Leu Gly His Pro Ile Gly Ala 340 345 350 Ser Gly Ala Arg Ile Leu Val Thr Leu Val His Ala Met Gln Lys Arg 355 360 365 Asp Ala Lys Lys Gly Leu Ala Thr Leu Cys Ile Gly Gly Gly Gln Gly 370 375 380 Thr Ala Ile Leu Leu Glu Lys Cys 385 390 <210> 3 <211> 1179 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <400> 3 atgagagatg tagtaatagt aagtgctgta agaactgcaa taggagcata tggaaaaaca 60 ttaaaggatg tacctgcaac agagttagga gctatagtaa taaaggaagc tgtaagaaga 120 gctaatataa atccaaatga gattaatgaa gttatttttg gaaatgtact tcaagctgga 180 ttaggccaaa acccagcaag acaagcagca gtaaaagcag gattaccttt agaaacacct 240 gcgtttacaa tcaataaggt ttgtggttca ggtttaagat ctataagttt agcagctcaa 300 attataaaag ctggagatgc tgataccatt gtagtaggtg gtatggaaaa tatgtctaga 360 tcaccatatt tgattaacaa tcagagatgg ggtcaaagaa tgggagatag tgaattagtt 420 gatgaaatga taaaggatgg tttgtgggat gcatttaatg gatatcatat gggagtaact 480 gcagaaaata ttgcagaaca atggaatata acaagagaag agcaagatga attttcactt 540 atgtcacaac aaaaagctga aaaagccatt aaaaatggag aatttaagga tgaaatagtt 600 cctgtattaa taaagactaa aaaaggtgaa atagtctttg atcaagatga atttcctaga 660 ttcggaaaca ctattgaagc attaagaaaa cttaaaccta ttttcaagga aaatggtact 720 gttacagcag gtaatgcatc cggattaaat gatggagctg cagcactagt aataatgagc 780 gctgataaag ctaacgctct cggaataaaa ccacttgcta agattacttc ttacggatca 840 tatggggtag atccatcaat aatgggatat ggagcttttt atgcaactaa agctgcctta 900 gataaaatta atttaaaacc tgaagactta gatttaattg aagctaacga ggcatatgct 960 tctcaaagta tagcagtaac tagagattta aatttagata tgagtaaagt taatgttaat 1020 ggtggagcta tagcacttgg acatccaata ggtgcatctg gtgcacgtat tttagtaaca 1080 ttactatacg ctatgcaaaa aagagattca aaaaaaggtc ttgctactct atgtattggt 1140 ggaggtcagg gaacagctct cgtagttgaa agagactaa 1179 <210> 4 <211> 392 <212> PRT <213> Clostridium acetobutylicum <400> 4 Met Arg Asp Val Val Ile Val Ser Ala Val Arg Thr Ala Ile Gly Ala 1 5 10 15 Tyr Gly Lys Thr Leu Lys Asp Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ala Ile 20 25 30 Val Ile Lys Glu Ala Val Arg Arg Ala Asn Ile Asn Pro Asn Glu Ile 35 40 45 Asn Glu Val Ile Phe Gly Asn Val Leu Gln Ala Gly Leu Gly Gln Asn 50 55 60 Pro Ala Arg Gln Ala Ala Val Lys Ala Gly Leu Pro Leu Glu Thr Pro 65 70 75 80 Ala Phe Thr Ile Asn Lys Val Cys Gly Ser Gly Leu Arg Ser Ile Ser 85 90 95 Leu Ala Ala Gln Ile Ile Lys Ala Gly Asp Ala Asp Thr Ile Val Val 100 105 110 Gly Gly Met Glu Asn Met Ser Arg Ser Pro Tyr Leu Ile Asn Asn Gln 115 120 125 Arg Trp Gly Gln Arg Met Gly Asp Ser Glu Leu Val Asp Glu Met Ile 130 135 140 Lys Asp Gly Leu Trp Asp Ala Phe Asn Gly Tyr His Met Gly Val Thr 145 150 155 160 Ala Glu Asn Ile Ala Glu Gln Trp Asn Ile Thr Arg Glu Glu Gln Asp 165 170 175 Glu Phe Ser Leu Met Ser Gln Gln Lys Ala Glu Lys Ala Ile Lys Asn 180 185 190 Gly Glu Phe Lys Asp Glu Ile Val Pro Val Leu Ile Lys Thr Lys Lys 195 200 205 Gly Glu Ile Val Phe Asp Gln Asp Glu Phe Pro Arg Phe Gly Asn Thr 210 215 220 Ile Glu Ala Leu Arg Lys Leu Lys Pro Ile Phe Lys Glu Asn Gly Thr 225 230 235 240 Val Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Leu Asn Asp Gly Ala Ala Ala Leu 245 250 255 Val Ile Met Ser Ala Asp Lys Ala Asn Ala Leu Gly Ile Lys Pro Leu 260 265 270 Ala Lys Ile Thr Ser Tyr Gly Ser Tyr Gly Val Asp Pro Ser Ile Met 275 280 285 Gly Tyr Gly Ala Phe Tyr Ala Thr Lys Ala Ala Leu Asp Lys Ile Asn 290 295 300 Leu Lys Pro Glu Asp Leu Asp Leu Ile Glu Ala Asn Glu Ala Tyr Ala 305 310 315 320 Ser Gln Ser Ile Ala Val Thr Arg Asp Leu Asn Leu Asp Met Ser Lys 325 330 335 Val Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Leu Gly His Pro Ile Gly Ala 340 345 350 Ser Gly Ala Arg Ile Leu Val Thr Leu Leu Tyr Ala Met Gln Lys Arg 355 360 365 Asp Ser Lys Lys Gly Leu Ala Thr Leu Cys Ile Gly Gly Gly Gln Gly 370 375 380 Thr Ala Leu Val Val Glu Arg Asp 385 390 <210> 5 <211> 849 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <400> 5 atgaaaaagg tatgtgttat aggtgcaggt actatgggtt caggaattgc tcaggcattt 60 gcagctaaag gatttgaagt agtattaaga gatattaaag atgaatttgt tgatagagga 120 ttagatttta tcaataaaaa tctttctaaa ttagttaaaa aaggaaagat agaagaagct 180 actaaagttg aaatcttaac tagaatttcc ggaacagttg accttaatat ggcagctgat 240 tgcgatttag ttatagaagc agctgttgaa agaatggata ttaaaaagca gatttttgct 300 gacttagaca atatatgcaa gccagaaaca attcttgcat caaatacatc atcactttca 360 ataacagaag tggcatcagc aactaaaaga cctgataagg ttataggtat gcatttcttt 420 aatccagctc ctgttatgaa gcttgtagag gtaataagag gaatagctac atcacaagaa 480 acttttgatg cagttaaaga gacatctata gcaataggaa aagatcctgt agaagtagca 540 gaagcaccag gatttgttgt aaatagaata ttaataccaa tgattaatga agcagttggt 600 atattagcag aaggaatagc ttcagtagaa gacatagata aagctatgaa acttggagct 660 aatcacccaa tgggaccatt agaattaggt gattttatag gtcttgatat atgtcttgct 720 ataatggatg ttttatactc agaaactgga gattctaagt atagaccaca tacattactt 780 aagaagtatg taagagcagg atggcttgga agaaaatcag gaaaaggttt ctacgattat 840 tcaaaataa 849 <210> 6 <211> 282 <212> PRT <213> Clostridium acetobutylicum <400> 6 Met Lys Lys Val Cys Val Ile Gly Ala Gly Thr Met Gly Ser Gly Ile 1 5 10 15 Ala Gln Ala Phe Ala Ala Lys Gly Phe Glu Val Val Leu Arg Asp Ile 20 25 30 Lys Asp Glu Phe Val Asp Arg Gly Leu Asp Phe Ile Asn Lys Asn Leu 35 40 45 Ser Lys Leu Val Lys Lys Gly Lys Ile Glu Glu Ala Thr Lys Val Glu 50 55 60 Ile Leu Thr Arg Ile Ser Gly Thr Val Asp Leu Asn Met Ala Ala Asp 65 70 75 80 Cys Asp Leu Val Ile Glu Ala Ala Val Glu Arg Met Asp Ile Lys Lys 85 90 95 Gln Ile Phe Ala Asp Leu Asp Asn Ile Cys Lys Pro Glu Thr Ile Leu 100 105 110 Ala Ser Asn Thr Ser Ser Leu Ser Ile Thr Glu Val Ala Ser Ala Thr 115 120 125 Lys Arg Pro Asp Lys Val Ile Gly Met His Phe Phe Asn Pro Ala Pro 130 135 140 Val Met Lys Leu Val Glu Val Ile Arg Gly Ile Ala Thr Ser Gln Glu 145 150 155 160 Thr Phe Asp Ala Val Lys Glu Thr Ser Ile Ala Ile Gly Lys Asp Pro 165 170 175 Val Glu Val Ala Glu Ala Pro Gly Phe Val Val Asn Arg Ile Leu Ile 180 185 190 Pro Met Ile Asn Glu Ala Val Gly Ile Leu Ala Glu Gly Ile Ala Ser 195 200 205 Val Glu Asp Ile Asp Lys Ala Met Lys Leu Gly Ala Asn His Pro Met 210 215 220 Gly Pro Leu Glu Leu Gly Asp Phe Ile Gly Leu Asp Ile Cys Leu Ala 225 230 235 240 Ile Met Asp Val Leu Tyr Ser Glu Thr Gly Asp Ser Lys Tyr Arg Pro 245 250 255 His Thr Leu Leu Lys Lys Tyr Val Arg Ala Gly Trp Leu Gly Arg Lys 260 265 270 Ser Gly Lys Gly Phe Tyr Asp Tyr Ser Lys 275 280 <210> 7 <211> 786 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <400> 7 atggaactaa acaatgtcat ccttgaaaag gaaggtaaag ttgctgtagt taccattaac 60 agacctaaag cattaaatgc gttaaatagt gatacactaa aagaaatgga ttatgttata 120 ggtgaaattg aaaatgatag cgaagtactt gcagtaattt taactggagc aggagaaaaa 180 tcatttgtag caggagcaga tatttctgag atgaaggaaa tgaataccat tgaaggtaga 240 aaattcggga tacttggaaa taaagtgttt agaagattag aacttcttga aaagcctgta 300 atagcagctg ttaatggttt tgctttagga ggcggatgcg aaatagctat gtcttgtgat 360 ataagaatag cttcaagcaa cgcaagattt ggtcaaccag aagtaggtct cggaataaca 420 cctggttttg gtggtacaca aagactttca agattagttg gaatgggcat ggcaaagcag 480 cttatattta ctgcacaaaa tataaaggca gatgaagcat taagaatcgg acttgtaaat 540 aaggtagtag aacctagtga attaatgaat acagcaaaag aaattgcaaa caaaattgtg 600 agcaatgctc cagtagctgt taagttaagc aaacaggcta ttaatagagg aatgcagtgt 660 gatattgata ctgctttagc atttgaatca gaagcatttg gagaatgctt ttcaacagag 720 gatcaaaagg atgcaatgac agctttcata gagaaaagaa aaattgaagg cttcaaaaat 780 agatag 786 <210> 8 <211> 261 <212> PRT <213> Clostridium acetobutylicum <400> 8 Met Glu Leu Asn Asn Val Ile Leu Glu Lys Glu Gly Lys Val Ala Val 1 5 10 15 Val Thr Ile Asn Arg Pro Lys Ala Leu Asn Ala Leu Asn Ser Asp Thr 20 25 30 Leu Lys Glu Met Asp Tyr Val Ile Gly Glu Ile Glu Asn Asp Ser Glu 35 40 45 Val Leu Ala Val Ile Leu Thr Gly Ala Gly Glu Lys Ser Phe Val Ala 50 55 60 Gly Ala Asp Ile Ser Glu Met Lys Glu Met Asn Thr Ile Glu Gly Arg 65 70 75 80 Lys Phe Gly Ile Leu Gly Asn Lys Val Phe Arg Arg Leu Glu Leu Leu 85 90 95 Glu Lys Pro Val Ile Ala Ala Val Asn Gly Phe Ala Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Cys Glu Ile Ala Met Ser Cys Asp Ile Arg Ile Ala Ser Ser Asn Ala 115 120 125 Arg Phe Gly Gln Pro Glu Val Gly Leu Gly Ile Thr Pro Gly Phe Gly 130 135 140 Gly Thr Gln Arg Leu Ser Arg Leu Val Gly Met Gly Met Ala Lys Gln 145 150 155 160 Leu Ile Phe Thr Ala Gln Asn Ile Lys Ala Asp Glu Ala Leu Arg Ile 165 170 175 Gly Leu Val Asn Lys Val Val Glu Pro Ser Glu Leu Met Asn Thr Ala 180 185 190 Lys Glu Ile Ala Asn Lys Ile Val Ser Asn Ala Pro Val Ala Val Lys 195 200 205 Leu Ser Lys Gln Ala Ile Asn Arg Gly Met Gln Cys Asp Ile Asp Thr 210 215 220 Ala Leu Ala Phe Glu Ser Glu Ala Phe Gly Glu Cys Phe Ser Thr Glu 225 230 235 240 Asp Gln Lys Asp Ala Met Thr Ala Phe Ile Glu Lys Arg Lys Ile Glu 245 250 255 Gly Phe Lys Asn Arg 260 <210> 9 <211> 1197 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <400> 9 atgatagtaa aagcaaagtt tgtaaaagga tttatcagag atgtacatcc ttatggttgc 60 agaagggaag tactaaatca aatagattat tgtaagaagg ctattgggtt taggggacca 120 aagaaggttt taattgttgg agcctcatct gggtttggtc ttgctactag aatttcagtt 180 gcatttggag gtccagaagc tcacacaatt ggagtatcct atgaaacagg agctacagat 240 agaagaatag gaacagcggg atggtataat aacatatttt ttaaagaatt tgctaaaaaa 300 aaaggattag ttgcaaaaaa cttcattgag gatgcctttt ctaatgaaac caaagataaa 360 gttattaagt atataaagga tgaatttggt aaaatagatt tatttgttta tagtttagct 420 gcgcctagga gaaaggacta taaaactgga aatgtttata cttcaagaat aaaaacaatt 480 ttaggagatt ttgagggacc gactattgat gttgaaagag acgagattac tttaaaaaag 540 gttagtagtg ctagcattga agaaattgaa gaaactagaa aggtaatggg tggagaggat 600 tggcaagagt ggtgtgaaga gctgctttat gaagattgtt tttcggataa agcaactacc 660 atagcatact cgtatatagg atccccaaga acctacaaga tatatagaga aggtactata 720 ggaatagcta aaaaggatct tgaagataag gctaagctta taaatgaaaa acttaacaga 780 gttataggtg gtagagcctt tgtgtctgtg aataaagcat tagttacaaa agcaagtgca 840 tatattccaa cttttcctct ttatgcagct attttatata aggtcatgaa agaaaaaaat 900 attcatgaaa attgtattat gcaaattgag agaatgtttt ctgaaaaaat atattcaaat 960 gaaaaaatac aatttgatga caagggaaga ttaaggatgg acgatttaga gcttagaaaa 1020 gacgttcaag 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Ile 145 150 155 160 Leu Gly Asp Phe Glu Gly Pro Thr Ile Asp Val Glu Arg Asp Glu Ile 165 170 175 Thr Leu Lys Lys Val Ser Ser Ala Ser Ile Glu Glu Ile Glu Glu Thr 180 185 190 Arg Lys Val Met Gly Gly Glu Asp Trp Gln Glu Trp Cys Glu Glu Leu 195 200 205 Leu Tyr Glu Asp Cys Phe Ser Asp Lys Ala Thr Thr Ile Ala Tyr Ser 210 215 220 Tyr Ile Gly Ser Pro Arg Thr Tyr Lys Ile Tyr Arg Glu Gly Thr Ile 225 230 235 240 Gly Ile Ala Lys Lys Asp Leu Glu Asp Lys Ala Lys Leu Ile Asn Glu 245 250 255 Lys Leu Asn Arg Val Ile Gly Gly Arg Ala Phe Val Ser Val Asn Lys 260 265 270 Ala Leu Val Thr Lys Ala Ser Ala Tyr Ile Pro Thr Phe Pro Leu Tyr 275 280 285 Ala Ala Ile Leu Tyr Lys Val Met Lys Glu Lys Asn Ile His Glu Asn 290 295 300 Cys Ile Met Gln Ile Glu Arg Met Phe Ser Glu Lys Ile Tyr Ser Asn 305 310 315 320 Glu Lys Ile Gln Phe Asp Asp Lys Gly Arg Leu Arg Met Asp Asp Leu 325 330 335 Glu Leu Arg Lys Asp Val Gln Asp Glu Val Asp Arg Ile Trp Ser Asn 340 345 350 Ile Thr Pro Glu Asn Phe Lys Glu Leu Ser Asp Tyr Lys Gly Tyr Lys 355 360 365 Lys Glu Phe Met Asn Leu Asn Gly Phe Asp Leu Asp Gly Val Asp Tyr 370 375 380 Ser Lys Asp Leu Asp Ile Glu Leu Leu Arg Lys Leu Glu Pro 385 390 395 <210> 11 <211> 1407 <212> DNA <213> Clostridium beijerinckii <400> 11 atgaataaag acacactaat acctacaact aaagatttaa aagtaaaaac aaatggtgaa 60 aacattaatt taaagaacta caaggataat tcttcatgtt tcggagtatt cgaaaatgtt 120 gaaaatgcta taagcagcgc tgtacacgca caaaagatat tatcccttca ttatacaaaa 180 gagcaaagag aaaaaatcat aactgagata agaaaggccg cattacaaaa taaagaggtc 240 ttggctacaa tgattctaga agaaacacat atgggaagat atgaggataa aatattaaaa 300 catgaattgg tagctaaata tactcctggt acagaagatt taactactac tgcttggtca 360 ggtgataatg gtcttacagt tgtagaaatg tctccatatg gtgttatagg tgcaataact 420 ccttctacga atccaactga aactgtaata tgtaatagca taggcatgat agctgctgga 480 aatgctgtag tatttaacgg acacccatgc gctaaaaaat gtgttgcctt tgctgttgaa 540 atgataaata aggcaattat ttcatgtggc ggtcctgaaa atctagtaac aactataaaa 600 aatccaacta tggagtctct agatgcaatt attaagcatc cttcaataaa acttctttgc 660 ggaactgggg gtccaggaat ggtaaaaacc ctcttaaatt ctggtaagaa agctataggt 720 gctggtgctg gaaatccacc agttattgta gatgatactg ctgatataga aaaggctggt 780 aggagcatca ttgaaggctg ttcttttgat aataatttac cttgtattgc agaaaaagaa 840 gtatttgttt ttgagaatgt tgcagatgat ttaatatcta acatgctaaa aaataatgct 900 gtaattataa atgaagatca agtatcaaaa ttaatagatt tagtattaca aaaaaataat 960 gaaactcaag aatactttat aaacaaaaaa tgggtaggaa aagatgcaaa attattctta 1020 gatgaaatag atgttgagtc tccttcaaat gttaaatgca taatctgcga agtaaatgca 1080 aatcatccat ttgttatgac agaactcatg atgccaatat tgccaattgt aagagttaaa 1140 gatatagatg aagctattaa atatgcaaag atagcagaac aaaatagaaa acatagtgcc 1200 tatatttatt ctaaaaatat agacaaccta aatagatttg aaagagaaat agatactact 1260 atttttgtaa agaatgctaa atcttttgct ggtgttggtt atgaagcaga aggatttaca 1320 actttcacta ttgctggatc tactggtgag ggaataacct ctgcaaggaa ttttacaaga 1380 caaagaagat gtgtacttgc cggctaa 1407 <210> 12 <211> 468 <212> PRT <213> Clostridium beijerinckii <400> 12 Met Asn Lys Asp Thr Leu Ile Pro Thr Thr Lys Asp Leu Lys Val Lys 1 5 10 15 Thr Asn Gly Glu Asn Ile Asn Leu Lys Asn Tyr Lys Asp Asn Ser Ser 20 25 30 Cys Phe Gly Val Phe Glu Asn Val Glu Asn Ala Ile Ser Ser Ala Val 35 40 45 His Ala Gln Lys Ile Leu Ser Leu His Tyr Thr Lys Glu Gln Arg Glu 50 55 60 Lys Ile Ile Thr Glu Ile Arg Lys Ala Ala Leu Gln Asn Lys Glu Val 65 70 75 80 Leu Ala Thr Met Ile Leu Glu Glu Thr His Met Gly Arg Tyr Glu Asp 85 90 95 Lys Ile Leu Lys His Glu Leu Val Ala Lys Tyr Thr Pro Gly Thr Glu 100 105 110 Asp Leu Thr Thr Thr Ala Trp Ser Gly Asp Asn Gly Leu Thr Val Val 115 120 125 Glu Met Ser Pro Tyr Gly Val Ile Gly Ala Ile Thr Pro Ser Thr Asn 130 135 140 Pro Thr Glu Thr Val Ile Cys Asn Ser Ile Gly Met Ile Ala Ala Gly 145 150 155 160 Asn Ala Val Val Phe Asn Gly His Pro Cys Ala Lys Lys Cys Val Ala 165 170 175 Phe Ala Val Glu Met Ile Asn Lys Ala Ile Ile Ser Cys Gly Gly Pro 180 185 190 Glu Asn Leu Val Thr Thr Ile Lys Asn Pro Thr Met Glu Ser Leu Asp 195 200 205 Ala Ile Ile Lys His Pro Ser Ile Lys Leu Leu Cys Gly Thr Gly Gly 210 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atagaatggc agaagcgtta 660 ttaagaactt gtattaaata tggaggaata gctcttgaga agccggatga ttatgaggca 720 agagccaatc taatgtgggc ttcaagtctt gcgataaatg gacttttaac atatggtaaa 780 gacactaatt ggagtgtaca cttaatggaa catgaattaa gtgcttatta cgacataaca 840 cacggcgtag ggcttgcaat tttaacacct aattggatgg agtatatttt aaataatgat 900 acagtgtaca agtttgttga atatggtgta aatgtttggg gaatagacaa agaaaaaaat 960 cactatgaca tagcacatca agcaatacaa aaaacaagag attactttgt aaatgtacta 1020 ggtttaccat ctagactgag agatgttgga attgaagaag aaaaattgga cataatggca 1080 aaggaatcag taaagcttac aggaggaacc ataggaaacc taagaccagt aaacgcctcc 1140 gaagtcctac aaatattcaa aaaatctgtg taaaacgcct ccgaagtcct acaaatattc 1200 aaaaaatctg tgtaa 1215 <210> 14 <211> 390 <212> PRT <213> Clostridium acetobutylicum <400> 14 Met Val Asp Phe Glu Tyr Ser Ile Pro Thr Arg Ile Phe Phe Gly Lys 1 5 10 15 Asp Lys Ile Asn Val Leu Gly Arg Glu Leu Lys Lys Tyr Gly Ser Lys 20 25 30 Val Leu Ile Val Tyr Gly Gly Gly Ser Ile Lys Arg Asn Gly Ile Tyr 35 40 45 Asp Lys Ala Val Ser Ile Leu 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ttagtattag caataggggg aggaagtgca 300 atagactgtt ctaaggtaat tgcagctgga gtttattatg atggcgatac atgggacatg 360 gttaaagatc catctaaaat aactaaagtt cttccaattg caagtatact tactctttca 420 gcaacagggt ctgaaatgga tcaaattgca gtaatttcaa atatggagac taatgaaaag 480 cttggagtag gacatgatga tatgagacct aaattttcag tgttagatcc tacatatact 540 tttacagtac ctaaaaatca aacagcagcg ggaacagctg acattatgag tcacaccttt 600 gaatcttact ttagtggtgt tgaaggtgct tatgtgcagg acggtatagc agaagcaatc 660 ttaagaacat gtataaagta tggaaaaata gcaatggaga agactgatga ttacgaggct 720 agagctaatt tgatgtgggc ttcaagttta gctataaatg gtctattatc acttggtaag 780 gatagaaaat ggagttgtca tcctatggaa cacgagttaa gtgcatatta tgatataaca 840 catggtgtag gacttgcaat tttaacacct aattggatgg aatatattct aaatgacgat 900 acacttcata aatttgtttc ttatggaata aatgtttggg gaatagacaa gaacaaagat 960 aactatgaaa tagcacgaga ggctattaaa aatacgagag aatactttaa ttcattgggt 1020 attccttcaa agcttagaga agttggaata ggaaaagata aactagaact aatggcaaag 1080 caagctgtta gaaattctgg aggaacaata ggaagtttaa gaccaataaa tgcagaggat 1140 gttcttgaga tatttaaaaa atcttattaa 1170 <210> 16 <211> 389 <212> PRT <213> Clostridium acetobutylicum <400> 16 Met Leu Ser Phe Asp Tyr Ser Ile Pro Thr Lys Val Phe Phe Gly Lys 1 5 10 15 Gly Lys Ile Asp Val Ile Gly Glu Glu Ile Lys Lys Tyr Gly Ser Arg 20 25 30 Val Leu Ile Val Tyr Gly Gly Gly Ser Ile Lys Arg Asn Gly Ile Tyr 35 40 45 Asp Arg Ala Thr Ala Ile Leu Lys Glu Asn Asn Ile Ala Phe Tyr Glu 50 55 60 Leu Ser Gly Val Glu Pro Asn Pro Arg Ile Thr Thr Val Lys Lys Gly 65 70 75 80 Ile Glu Ile Cys Arg Glu Asn Asn Val Asp Leu Val Leu Ala Ile Gly 85 90 95 Gly Gly Ser Ala Ile Asp Cys Ser Lys Val Ile Ala Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Tyr Asp Gly Asp Thr Trp Asp Met Val Lys Asp Pro Ser Lys Ile Thr 115 120 125 Lys Val Leu Pro Ile Ala Ser Ile Leu Thr Leu Ser Ala Thr Gly Ser 130 135 140 Glu Met Asp Gln Ile Ala Val Ile Ser Asn Met Glu Thr Asn Glu Lys 145 150 155 160 Leu Gly Val Gly His Asp Asp Met Arg Pro Lys Phe Ser Val Leu Asp 165 170 175 Pro Thr Tyr Thr Phe Thr Val Pro Lys 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Klebsiella pneumoniae <400> 18 Met Asn His Ser Ala Glu Cys Thr Cys Glu Glu Ser Leu Cys Glu Thr 1 5 10 15 Leu Arg Ala Phe Ser Ala Gln His Pro Glu Ser Val Leu Tyr Gln Thr 20 25 30 Ser Leu Met Ser Ala Leu Leu Ser Gly Val Tyr Glu Gly Ser Thr Thr 35 40 45 Ile Ala Asp Leu Leu Lys His Gly Asp Phe Gly Leu Gly Thr Phe Asn 50 55 60 Glu Leu Asp Gly Glu Leu Ile Ala Phe Ser Ser Gln Val Tyr Gln Leu 65 70 75 80 Arg Ala Asp Gly Ser Ala Arg Lys Ala Gln Pro Glu Gln Lys Thr Pro 85 90 95 Phe Ala Val Met Thr Trp Phe Gln Pro Gln Tyr Arg Lys Thr Phe Asp 100 105 110 His Pro Val Ser Arg Gln Gln Leu His Glu Val Ile Asp Gln Gln Ile 115 120 125 Pro Ser Asp Asn Leu Phe Cys Ala Leu Arg Ile Asp Gly His Phe Arg 130 135 140 His Ala His Thr Arg Thr Val Pro Arg Gln Thr Pro Pro Tyr Arg Ala 145 150 155 160 Met Thr Asp Val Leu Asp Asp Gln Pro Val Phe Arg Phe Asn Gln Arg 165 170 175 Glu Gly Val Leu Val Gly Phe Arg Thr Pro Gln His Met Gln Gly Ile 180 185 190 Asn Val Ala Gly Tyr His Glu His Phe Ile Thr Asp Asp Arg Lys Gly 195 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coli <400> 34 Met Pro Lys Tyr Arg Ser Ala Thr Thr Thr His Gly Arg Asn Met Ala 1 5 10 15 Gly Ala Arg Ala Leu Trp Arg Ala Thr Gly Met Thr Asp Ala Asp Phe 20 25 30 Gly Lys Pro Ile Ile Ala Val Val Asn Ser Phe Thr Gln Phe Val Pro 35 40 45 Gly His Val His Leu Arg Asp Leu Gly Lys Leu Val Ala Glu Gln Ile 50 55 60 Glu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Glu Phe Asn Thr Ile Ala Val Asp 65 70 75 80 Asp Gly Ile Ala Met Gly His Gly Gly Met Leu Tyr Ser Leu Pro Ser 85 90 95 Arg Glu Leu Ile Ala Asp Ser Val Glu Tyr Met Val Asn Ala His Cys 100 105 110 Ala Asp Ala Met Val Cys Ile Ser Asn Cys Asp Lys Ile Thr Pro Gly 115 120 125 Met Leu Met Ala Ser Leu Arg Leu Asn Ile Pro Val Ile Phe Val Ser 130 135 140 Gly Gly Pro Met Glu Ala Gly Lys Thr Lys Leu Ser Asp Gln Ile Ile 145 150 155 160 Lys Leu Asp Leu Val Asp Ala Met Ile Gln Gly Ala Asp Pro Lys Val 165 170 175 Ser Asp Ser Gln Ser Asp Gln Val Glu Arg Ser Ala Cys Pro Thr Cys 180 185 190 Gly Ser Cys Ser Gly Met Phe Thr Ala Asn Ser Met Asn Cys Leu Thr 195 200 205 Glu Ala 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PRT <213> Lactococcus lactis <400> 36 Met Tyr Thr Val Gly Asp Tyr Leu Leu Asp Arg Leu His Glu Leu Gly 1 5 10 15 Ile Glu Glu Ile Phe Gly Val Pro Gly Asp Tyr Asn Leu Gln Phe Leu 20 25 30 Asp Gln Ile Ile Ser His Lys Asp Met Lys Trp Val Gly Asn Ala Asn 35 40 45 Glu Leu Asn Ala Ser Tyr Met Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Thr Lys Lys 50 55 60 Ala Ala Ala Phe Leu Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser Ala Val 65 70 75 80 Asn Gly Leu Ala Gly Ser Tyr Ala Glu Asn Leu Pro Val Val Glu Ile 85 90 95 Val Gly Ser Pro Thr Ser Lys Val Gln Asn Glu Gly Lys Phe Val His 100 105 110 His Thr Leu Ala Asp Gly Asp Phe Lys His Phe Met Lys Met His Glu 115 120 125 Pro Val Thr Ala Ala Arg Thr Leu Leu Thr Ala Glu Asn Ala Thr Val 130 135 140 Glu Ile Asp Arg Val Leu Ser Ala Leu Leu Lys Glu Arg Lys Pro Val 145 150 155 160 Tyr Ile Asn Leu Pro Val Asp Val Ala Ala Ala Lys Ala Glu Lys Pro 165 170 175 Ser Leu Pro Leu Lys Lys Glu Asn Ser Thr Ser Asn Thr Ser Asp Gln 180 185 190 Glu Ile Leu Asn Lys Ile Gln Glu Ser Leu Lys Asn Ala Lys Lys 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tcggcgcttc attggtgaaa 1320 ccgggagaaa aagtggtttc tgtctctggt gacggcggtt tcttattctc agcaatggaa 1380 ttagagacag cagttcgact aaaagcacca attgtacaca ttgtatggaa cgacagcaca 1440 tatgacatgg ttgcattcca gcaattgaaa aaatataacc gtacatctgc ggtcgatttc 1500 ggaaatatcg atatcgtgaa atatgcggaa agcttcggag caactggctt gcgcgtagaa 1560 tcaccagacc agctggcaga tgttctgcgt caaggcatga acgctgaagg tcctgtcatc 1620 atcgatgtcc cggttgacta cagtgataac attaatttag caagtgacaa gcttccgaaa 1680 gaattcgggg aactcatgaa aacgaaagct ctctag 1716 <210> 42 <211> 571 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 42 Met Leu Thr Lys Ala Thr Lys Glu Gln Lys Ser Leu Val Lys Asn Arg 1 5 10 15 Gly Ala Glu Leu Val Val Asp Cys Leu Val Glu Gln Gly Val Thr His 20 25 30 Val Phe Gly Ile Pro Gly Ala Lys Ile Asp Ala Val Phe Asp Ala Leu 35 40 45 Gln Asp Lys Gly Pro Glu Ile Ile Val Ala Arg His Glu Gln Asn Ala 50 55 60 Ala Phe Met Ala Gln Ala Val Gly Arg Leu Thr Gly Lys Pro Gly Val 65 70 75 80 Val Leu Val Thr Ser Gly Pro Gly Ala Ser Asn Leu Ala Thr Gly Leu 85 90 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ctatgtggtc actgaaagtc acaaatttgt tcgtatgttt 720 ccattgtctt cagatgatct acctatggcc ggccctcctt tggatttcac acgtcgtacg 780 gacgatctag aagatgcatt gcgtgggccc acgatcgact ataccgccca agaatacatt 840 actgcattga ttacagattt aggggtcctc actccaagtg ccgtttcaga agagttaatc 900 aagatgtggt atgattaa 918 <210> 54 <211> 305 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 54 Met Ser Glu Phe Asn Ile Thr Glu Thr Tyr Leu Arg Phe Leu Glu Glu 1 5 10 15 Asp Thr Glu Met Thr Met Pro Ile Ala Ala Ile Glu Ala Leu Val Thr 20 25 30 Leu Leu Arg Ile Lys Thr Pro Glu Thr Ala Ala Glu Met Ile Asn Thr 35 40 45 Ile Lys Ser Ser Thr Glu Glu Leu Ile Lys Ser Ile Pro Asn Ser Val 50 55 60 Ser Leu Arg Ala Gly Cys Asp Ile Phe Met Arg Phe Val Leu Arg Asn 65 70 75 80 Leu His Leu Tyr Gly Asp Trp Glu Asn Cys Lys Gln His Leu Ile Glu 85 90 95 Asn Gly Gln Leu Phe Val Ser Arg Ala Lys Lys Ser Arg Asn Lys Ile 100 105 110 Ala Glu Ile Gly Val Asp Phe Ile Ala Asp Asp Asp Ile Ile Leu Val 115 120 125 His Gly Tyr Ser Arg Ala Val Phe Ser Leu Leu Asn His Ala 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120 ggccaattga tttttgataa attcatcaag actgaagagg atccaattat caaacaggat 180 accccttcga accttgattt tgattttgct cttccacaaa cggcaactgc acctgatgcc 240 aagaccgttt tgccaattcc ggagctagat gacgctgtag tggaatcttt cttttcgtca 300 agcactgatt caactccaat gtttgagtat gaaaacctag aagacaactc taaagaatgg 360 acatccttgt ttgacaatga cattccagtt accactgacg atgtttcatt ggctgataag 420 gcaattgaat ccactgaaga agtttctctg gtaccatcca atctggaagt ctcgacaact 480 tcattcttac ccactcctgt tctagaagat gctaaactga ctcaaacaag aaaggttaag 540 aaaccaaatt cagtcgttaa gaagtcacat catgttggaa aggatgacga atcgagactg 600 gatcatctag gtgttgttgc ttacaaccgc aaacagcgtt cgattccact ttctccaatt 660 gtgcccgaat ccagtgatcc tgctgctcta aaacgtgcta gaaacactga agccgccagg 720 cgttctcgtg cgagaaagtt gcaaagaatg aaacaacttg aagacaaggt tgaagaattg 780 ctttcgaaaa attatcactt ggaaaatgag gttgccagat taaagaaatt agttggcgaa 840 cgctga 846 <210> 56 <211> 281 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 56 Met Ser Glu Tyr Gln Pro Ser Leu Phe Ala Leu Asn Pro Met Gly Phe 1 5 10 15 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atcacttaaa agactatgtt 600 agaaatacct cgaacataaa atattttttg acatatgcag ataattacgc tattggatac 660 tttaaaaagc aaggcttcac taaagaaatc acgttggata aaagtatatg gatgggatat 720 attaaagatt atgaaggtgg tacgctgatg caatgttcta tgttaccaag aatacgatat 780 ttggacgcag gtaagattct attattacaa gaagcggccc tgcgaagaaa aataagaacg 840 atttcgaaat cgcatattgt aaggcctggt ttagagcaat tcaaagactt aaacaatatc 900 aaaccgattg atccaatgac tattcctggc ttgaaagaag ccggctggac tcccgagatg 960 gatgcgttgg cacaacgtcc caagcgtggt ccacacgatg cagcaataca gaatatactc 1020 acagagctac aaaatcatgc agcagcttgg cccttcttac aacccgttaa taaagaggag 1080 gtccccgact attatgattt tatcaaagag ccaatggact tgagcaccat ggaaataaaa 1140 ttagagagca acaaatatca gaagatggaa gacttcatat atgatgccag attggtgttt 1200 aacaattgcc gaatgtacaa tggcgagaat acgtcgtatt acaagtatgc taataggcta 1260 gagaaattct tcaataataa agtaaaagaa atacctgaat attctcacct tattgattaa 1320 <210> 58 <211> 439 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 58 Met Val Thr Lys His Gln Ile Glu Glu Asp His Leu Asp Gly Ala 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Yarrowia lipolytica <400> 63 atggagttac aggaactgca agaaaacgag gcggaggctt tgaaggccat ctacatggac 60 gattttgttg acaccacaaa gtcatctgca tggaacaaaa cgccttcgcc atcatttgag 120 attcacatgc gatcgaccga cccggacgcc gaagatgccc tatccagttt aacgctccag 180 gtcgagctca cgagtaccta ccccaaaacg gtccctgtta ttcgcatcaa aaaccccaaa 240 aacattttag catcacaggt ggccaagtta gagaagtgga tcgccgccac ctgcaaggag 300 ctcattggcg cagagatgat cttcgaggtc acctcgtata tccaggagcg actggaggat 360 tttcaacaga aggtgtccac cgccagtctg gaggaggagc ggcagatgaa gatcgagaag 420 caacaggagc agctacgaaa gcaaaagagc gacgaggcca aaaagcggga acaggaaaac 480 gcggaggaag acagagtgct agagatgatg gttgtggagg agctcaagcg acgcaaacag 540 cgggatgatg aagcgcaaaa ggcgcttact gcggagcgac aattgtcaaa cggcggccca 600 gtcatggccg attgcattga gtttgacaga ataacaacaa tctcgcgagc aggacaccca 660 gcaatcagtt tcagaagagt aggaggacaa atacccgtgc gagggtactc ttttggtaac 720 aattttttgg tgcggcccgt gacagaccca ccaaccgaca tatccctgct tctcacagaa 780 gttagacttc agggcacata ctggatccag gcagagggaa agaagatgat 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aatttgcggc cggtacccaa 270 <210> 78 <211> 643 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 78 gaaatgaata acaatactga cagtactaaa taattgccta cttggcttca catacgttgc 60 atacgtcgat atagataata atgataatga cagcaggatt atcgtaatac gtaatagttg 120 aaaatctcaa aaatgtgtgg gtcattacgt aaataatgat aggaatggga ttcttctatt 180 tttccttttt ccattctagc agccgtcggg aaaacgtggc atcctctctt tcgggctcaa 240 ttggagtcac gctgccgtga gcatcctctc tttccatatc taacaactga gcacgtaacc 300 aatggaaaag catgagctta gcgttgctcc aaaaaagtat tggatggtta ataccatttg 360 tctgttctct tctgactttg actcctcaaa aaaaaaaaat ctacaatcaa cagatcgctt 420 caattacgcc ctcacaaaaa cttttttcct tcttcttcgc ccacgttaaa ttttatccct 480 catgttgtct aacggatttc tgcacttgat ttattataaa aagacaaaga cataatactt 540 ctctatcaat ttcagttatt gttcttcctt gcgttattct tctgttcttc tttttctttt 600 gtcatatata accataacca agtaatacat attcaaatct aga 643 <210> 79 <211> 760 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 79 tcttttccga tttttttcta aaccgtggaa tatttcggat atccttttgt tgtttccggg 60 tgtacaatat ggacttcctc ttttctggca accaaaccca tacatcggga ttcctataat 120 accttcgttg gtctccctaa catgtaggtg gcggagggga gatatacaat agaacagata 180 ccagacaaga cataatgggc taaacaagac tacaccaatt acactgcctc attgatggtg 240 gtacataacg aactaatact gtagccctag acttgatagc catcatcata tcgaagtttc 300 actacccttt ttccatttgc catctattga agtaataata ggcgcatgca acttcttttc 360 tttttttttc ttttctctct cccccgttgt tgtctcacca tatccgcaat gacaaaaaaa 420 tgatggaaga cactaaagga aaaaattaac gacaaagaca gcaccaacag atgtcgttgt 480 tccagagctg atgaggggta tctcgaagca cacgaaactt tttccttcct tcattcacgc 540 acactactct ctaatgagca acggtatacg gccttccttc cagttacttg aatttgaaat 600 aaaaaaaagt ttgctgtctt gctatcaagt ataaatagac ctgcaattat taatcttttg 660 tttcctcgtc attgttctcg ttccctttct tccttgtttc tttttctgca caatatttca 720 agctatacca agcatacaat caactatctc atatacaatg 760 <210> 80 <211> 316 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 80 gagtaagcga atttcttatg atttatgatt tttattatta aataagttat aaaaaaaata 60 agtgtataca aattttaaag tgactcttag gttttaaaac gaaaattctt attcttgagt 120 aactctttcc tgtaggtcag gttgctttct caggtatagc atgaggtcgc tcttattgac 180 cacacctcta ccggcatgcc gagcaaatgc ctgcaaatcg ctccccattt cacccaattg 240 tagatatgct aactccagca atgagttgat gaatctcggt gtgtatttta tgtcctcaga 300 ggacaacacc tgtggt 316 <210> 81 <211> 753 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 81 gcatgcttgc atttagtcgt gcaatgtatg actttaagat ttgtgagcag gaagaaaagg 60 gagaatcttc taacgataaa cccttgaaaa actgggtaga ctacgctatg ttgagttgct 120 acgcaggctg cacaattaca cgagaatgct cccgcctagg atttaaggct aagggacgtg 180 caatgcagac gacagatcta aatgaccgtg tcggtgaagt gttcgccaaa cttttcggtt 240 aacacatgca gtgatgcacg cgcgatggtg ctaagttaca tatatatata tatagccata 300 gtgatgtcta agtaaccttt atggtatatt tcttaatgtg gaaagatact agcgcgcgca 360 cccacacaca agcttcgtct tttcttgaag aaaagaggaa gctcgctaaa tgggattcca 420 ctttccgttc cctgccagct gatggaaaaa ggttagtgga acgatgaaga ataaaaagag 480 agatccactg aggtgaaatt tcagctgaca gcgagtttca tgatcgtgat gaacaatggt 540 aacgagttgt ggctgttgcc agggagggtg gttctcaact tttaatgtat ggccaaatcg 600 ctacttgggt ttgttatata acaaagaaga aataatgaac tgattctctt cctccttctt 660 gtcctttctt aattctgttg taattacctt cctttgtaat tttttttgta attattcttc 720 ttaataatcc aaacaaacac acatattaca ata 753 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N98SeqF1 <400> 82 cgtgttagtc acatcaggac 20 <210> 83 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N98SeqF2 <400> 83 ggccatagca aaaatccaaa cagc 24 <210> 84 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N98SeqF3 <400> 84 ccacgatcaa tcatatcgaa cacg 24 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N98SeqF4 <400> 85 ggtttctgtc tctggtgacg 20 <210> 86 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N99SeqR1 <400> 86 gtctggtgat tctacgcgca ag 22 <210> 87 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N99SeqR2 <400> 87 catcgactgc attacgcaac tc 22 <210> 88 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N99SeqR3 <400> 88 cgatcgtcag aacaacatct gc 22 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N99SeqR4 <400> 89 ccttcagtgt tcgctgtcag 20 <210> 90 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N136 <400> 90 ccgcggatag atctgaaatg aataacaata ctgaca 36 <210> 91 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N137 <400> 91 taccaccgaa gttgatttgc ttcaacatcc tcagctctag atttgaatat gtattacttg 60 gttat 65 <210> 92 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N138 <400> 92 atgttgaagc aaatcaactt cggtggta 28 <210> 93 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N139 <400> 93 ttattggttt tctggtctca ac 22 <210> 94 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N140 <400> 94 aagttgagac cagaaaacca ataattaatt aatcatgtaa ttagttatgt cacgctt 57 <210> 95 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N141 <400> 95 gcggccgccc gcaaattaaa gccttcgagc 30 <210> 96 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N142 <400> 96 ggatccgcat gcttgcattt agtcgtgc 28 <210> 97 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N143 <400> 97 caggtaatcc cccacagtat acatcctcag ctattgtaat atgtgtgttt gtttgg 56 <210> 98 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N144 <400> 98 atgtatactg tgggggatta cc 22 <210> 99 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N145 <400> 99 ttagctttta ttttgctccg ca 22 <210> 100 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N146 <400> 100 tttgcggagc aaaataaaag ctaattaatt aagagtaagc gaatttctta tgattta 57 <210> 101 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N147 <400> 101 actagtacca caggtgttgt cctctgag 28 <210> 102 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N151 <400> 102 ctagagagct ttcgttttca tg 22 <210> 103 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N152 <400> 103 ctcatgaaaa cgaaagctct ctagttaatt aatcatgtaa ttagttatgt cacgctt 57 <210> 104 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N155 <400> 104 atggcaaaga agctcaacaa gtact 25 <210> 105 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N156 <400> 105 tcaagcatct aaaacacaac cg 22 <210> 106 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N157 <400> 106 aacggttgtg ttttagatgc ttgattaatt aagagtaagc gaatttctta tgattta 57 <210> 107 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N158 <400> 107 ggatcctttt ctggcaacca aacccata 28 <210> 108 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N159 <400> 108 cgagtacttg ttgagcttct ttgccatcct cagcgagata gttgattgta tgcttg 56 <210> 109 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N160SeqF1 <400> 109 gaaaacgtgg catcctctc 19 <210> 110 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N160SeqF2 <400> 110 gctgactggc caagagaaa 19 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N160SeqF3 <400> 111 tgtacttctc ccacggtttc 20 <210> 112 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N160SeqF4 <400> 112 agctacccaa tctctatacc ca 22 <210> 113 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N160SeqF5 <400> 113 cctgaagtct aggtccctat tt 22 <210> 114 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N160SeqR1 <400> 114 gcgtgaatgt aagcgtgac 19 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N160SeqR2 <400> 115 cgtcgtattg agccaagaac 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N160SeqR3 <400> 116 gcatcggaca acaagttcat 20 <210> 117 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N160SeqR4 <400> 117 tcgttcttga agtagtccaa ca 22 <210> 118 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N160SeqR5 <400> 118 tgagcccgaa agagaggat 19 <210> 119 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N161SeqF1 <400> 119 acggtatacg gccttcctt 19 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N161SeqF2 <400> 120 gggtttgaaa gctatgcagt 20 <210> 121 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N161SeqF3 <400> 121 ggtggtatgt atactgccaa ca 22 <210> 122 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N161SeqF4 <400> 122 ggtggtaccc aatctgtgat ta 22 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N161SeqF5 <400> 123 cggtttgggt aaagatgttg 20 <210> 124 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N161SeqF6 <400> 124 aaacgaaaat tcttattctt ga 22 <210> 125 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N161SeqR1 <400> 125 tcgttttaaa acctaagagt ca 22 <210> 126 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N161SeqR2 <400> 126 ccaaaccgta acccatcag 19 <210> 127 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N161SeqR3 <400> 127 cacagattgg gtaccacca 19 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N161Seqr4 <400> 128 accacaagaa ccaggacctg 20 <210> 129 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N161SeqR5 <400> 129 catagctttc aaacccgct 19 <210> 130 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N161SeqR6 <400> 130 cgtataccgt tgctcattag ag 22 <210> 131 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N162 <400> 131 atgttgacaa aagcaacaaa aga 23 <210> 132 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N189 <400> 132 atccgcggat agatctagtt cgagtttatc attatcaa 38 <210> 133 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequemce <220> <223> Primer N190.1 <400> 133 ttcttttgtt gcttttgtca acatcctcag cgtttatgtg tgtttattcg aaa 53 <210> 134 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N176 <400> 134 atccgcggat agatctatta gaagccgccg agcgggcg 38 <210> 135 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N177 <400> 135 atcctcagct tttctccttg acgttaaagt a 31 <210> 136 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N191 <400> 136 atccgcggat agatctccca ttaccgacat ttgggcgc 38 <210> 137 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N192 <400> 137 atcctcagcg atgattgatt gattgattgt a 31 <210> 138 <211> 1474 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> constructed URA3 gene bounded by repeats <400> 138 gcattgcgga ttacgtattc taatgttcag cccgcggaac gccagcaaat caccacccat 60 gcgcatgata ctgagtcttg tacacgctgg gcttccagtg tactgagagt gcaccatacc 120 acagcttttc aattcaattc atcatttttt ttttattctt ttttttgatt tcggtttctt 180 tgaaattttt ttgattcggt aatctccgaa cagaaggaag aacgaaggaa ggagcacaga 240 cttagattgg tatatatacg catatgtagt gttgaagaaa catgaaattg cccagtattc 300 ttaacccaac tgcacagaac aaaaacctgc aggaaacgaa gataaatcat gtcgaaagct 360 acatataagg aacgtgctgc tactcatcct agtcctgttg ctgccaagct atttaatatc 420 atgcacgaaa agcaaacaaa cttgtgtgct tcattggatg ttcgtaccac caaggaatta 480 ctggagttag ttgaagcatt aggtcccaaa atttgtttac taaaaacaca tgtggatatc 540 ttgactgatt tttccatgga gggcacagtt aagccgctaa aggcattatc cgccaagtac 600 aattttttac tcttcgaaga cagaaaattt gctgacattg gtaatacagt caaattgcag 660 tactctgcgg gtgtatacag aatagcagaa tgggcagaca ttacgaatgc acacggtgtg 720 gtgggcccag gtattgttag cggtttgaag caggcggcag aagaagtaac aaaggaacct 780 agaggccttt tgatgttagc agaattgtca tgcaagggct ccctatctac tggagaatat 840 actaagggta ctgttgacat tgcgaagagc gacaaagatt ttgttatcgg ctttattgct 900 caaagagaca tgggtggaag agatgaaggt tacgattggt tgattatgac acccggtgtg 960 ggtttagatg acaagggaga cgcattgggt caacagtata gaaccgtgga tgatgtggtc 1020 tctacaggat ctgacattat tattgttgga agaggactat ttgcaaaggg aagggatgct 1080 aaggtagagg gtgaacgtta cagaaaagca ggctgggaag catatttgag aagatgcggc 1140 cagcaaaact aaaaaactgt attataagta aatgcatgta tactaaactc acaaattaga 1200 gcttcaattt aattatatca gttattaccc tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt 1260 aaggagaaaa taccgcatca ggaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta 1320 aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcttcagc 1380 ccgcggaacg ccagcaaatc accacccatg cgcatgatac tgagtcttgt acacgctggg 1440 cttccagtga tgatacaacg agttagccaa ggtg 1474 <210> 139 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 139 ctttacattg ttggaaagcc tcgttgtctt ttaagatttt ataagcattg gcattgcgga 60 ttacgtattc taatg 75 <210> 140 <211> 76 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 140 tgaattagat gaatcagcta gcctaaatat agtatctaag acattgtata caccttggct 60 aactcgttgt atcatc 76 <210> 141 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 141 ataaaaattt ccctatacta tcattaatta aatcattatt attactaaag gcattgcgga 60 ttacgtattc taatg 75 <210> 142 <211> 76 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 142 aaattggcat aaaaaagatt aaattcttat ctaagtgaat gtatctattt caccttggct 60 aactcgttgt atcatc 76 <210> 143 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer binding sequence <400> 143 gcattgcgga ttacgtattc taatg 25 <210> 144 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer binding sequence <400> 144 gatgatacaa cgagttagcc aaggtg 26 <210> 145 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> direct repeat sequence <400> 145 ttcagcccgc ggaacgccag caaatcacca cccatgcgca tgatactgag tcttgtacac 60 gctgggcttc cagtg 75 <210> 146 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> direct repeat sequence <400> 146 ttcagcccgc ggaacgccag caaatcacca cccatgcgca tgatactgag tcttgtacac 60 gctgggcttc cagtg 75 <210> 147 <211> 200 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> promoter to express URA3 <400> 147 ttttttattc ttttttttga tttcggtttc tttgaaattt ttttgattcg gtaatctccg 60 aacagaagga agaacgaagg aaggagcaca gacttagatt ggtatatata cgcatatgta 120 gtgttgaaga aacatgaaat tgcccagtat tcttaaccca actgcacaga acaaaaacct 180 gcaggaaacg aagataaatc 200 <210> 148 <211> 804 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> coding region for URA3 <400> 148 atgtcgaaag ctacatataa ggaacgtgct gctactcatc ctagtcctgt tgctgccaag 60 ctatttaata tcatgcacga aaagcaaaca aacttgtgtg cttcattgga tgttcgtacc 120 accaaggaat tactggagtt agttgaagca ttaggtccca aaatttgttt actaaaaaca 180 catgtggata tcttgactga tttttccatg gagggcacag ttaagccgct aaaggcatta 240 tccgccaagt acaatttttt actcttcgaa gacagaaaat ttgctgacat tggtaataca 300 gtcaaattgc agtactctgc gggtgtatac agaatagcag aatgggcaga cattacgaat 360 gcacacggtg tggtgggccc aggtattgtt agcggtttga agcaggcggc agaagaagta 420 acaaaggaac ctagaggcct tttgatgtta gcagaattgt catgcaaggg ctccctatct 480 actggagaat atactaaggg tactgttgac attgcgaaga gcgacaaaga ttttgttatc 540 ggctttattg ctcaaagaga catgggtgga agagatgaag gttacgattg gttgattatg 600 acacccggtg tgggtttaga tgacaaggga gacgcattgg gtcaacagta tagaaccgtg 660 gatgatgtgg tctctacagg atctgacatt attattgttg gaagaggact atttgcaaag 720 ggaagggatg ctaaggtaga gggtgaacgt tacagaaaag caggctggga agcatatttg 780 agaagatgcg gccagcaaaa ctaa 804

Claims

하기의 특징을 가진 재조합 효모 숙주 세포:
a) 탄소 기질을 함유하는 배지 내에서 성장할 때 부탄올을 생산하는 효모 숙주; 및
b) 아미노산 기아(amino acid starvation)에 대한 일반 제어 반응(general control response)에서 반응을 감소시키는 적어도 하나의 유전적 개질을 포함하는 효모 숙주 세포.
제1항에 있어서, 하기의 것들로 구성된 그룹으로부터 선택된 재조합 생합성 경로를 포함하는 효모 세포:
a) 1-부탄올 생합성 경로;
b) 2-부탄올 생합성 경로; 및
c) 아이소부탄올 생합성 경로.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 유전적 개질이 Gcn1p, Gcn2p, Gcn3p, Gcn4p, Gcn5p, Gcn6p, Gcn7p, Gcn8p, Gcn9p 및 Gcn20p로 구성된 그룹으로부터 선택된 단백질의 생산을 감소시키는 효모 세포.
제3항에 있어서, 적어도 하나의 유전적 개질이 Gcn1p, Gcn2p, Gcn3p, Gcn4p, Gcn5p, Gcn6p, Gcn7p, Gcn8p, Gcn9p 및 Gcn20p로 구성된 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 내인성 유전자 내에서의 교란(disruption)인 효모 세포.
제1항에 있어서, 세포가 사카로마이세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 야로위아(Yarowia) 및 한세눌라(Hansenula)로 구성된 그룹으로부터 선택된 속(genus)의 구성원인 효모 세포.
제1항에 있어서, 세포가 Gcn1p, Gcn2p, Gcn3p, Gcn4p, Gcn5p 및 Gcn20p로 구성된 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 내인성 유전자 내에서의 교란을 포함하는 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)인 효모.
제1항에 있어서, 세포가 Gcn1p, Gcn2p, Gcn3p 및 Gcn5p로 구성된 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 내인성 유전자 내에서의 교란을 포함하는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)인 효모.
제1항에 있어서, 세포가 Gcn2p, Gcn3p 및 Gcn5p로 구성된 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 내인성 유전자 내에서의 교란을 포함하는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)인 효모.
제2항에 있어서, 아이소부탄올 생합성 경로가 하기의 것들을 포함하는 재조합 효모 세포:
a) 아세토락테이트 신타제(acetolactate synthase)를 암호화하는 적어도 하나의 유전자;
b) 아세토하이드록시산 아이소머로리덕타제(acetohydroxy acid isomeroreductase)를 암호화하는 적어도 하나의 유전자 작제물;
c) 아세토하이드록시산 데하이드라타제(acetohydroxy acid dehydratase)를 암호화하는 적어도 하나의 유전자;
d) 분지쇄 케토산 데카복실라제(branched-chain keto acid decarboxylase)를 암호화하는 적어도 하나의 유전자; 및
e) 분지쇄 알코올 데하이드로게나제(branched-chain alcohol dehydrogenase)를 암호화하는 적어도 하나의 유전자.
하기의 단계를 포함하여 재조합 효모 세포로부터 부탄올을 생산하는 방법:
(a) 1) 부탄올을 생산하며;
2) 아미노산 기아에 대한 일반 제어 반응에서 반응을 감소시키는 적어도 하나의 유전적 개질을 포함하는
재조합 효모 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
(b) 부탄올이 생산되는 조건하에 단계 (a)의 균주를 배양하는 단계.
제10항에 있어서, 재조합 효모 숙주 세포가 하기의 것들로 구성된 그룹으로부터 선택된 재조합 생합성 경로를 포함하는 방법:
a) 1-부탄올 생합성 경로;
b) 2-부탄올 생합성 경로; 및
c) 아이소부탄올 생합성 경로.
제11항에 있어서, 아이소부탄올 생합성 경로가 하기의 것들을 포함하는 방법:
a) 아세토락테이트 신타제를 암호화하는 적어도 하나의 유전자;
b) 아세토하이드록시산 아이소머로리덕타제를 암호화하는 적어도 하나의 유전자;
c) 아세토하이드록시산 데하이드라타제를 암호화하는 적어도 하나의 유전자;
d) 분지쇄 케토산 데카복실라제를 암호화하는 적어도 하나의 유전자; 및
e) 분지쇄 알코올 데하이드로게나제를 암호화하는 적어도 하나의 유전자.
제10항에 있어서, 적어도 하나의 유전적 개질이 Gcn1p, Gcn2p, Gcn3p, Gcn4p, Gcn5p, Gcn6p, Gcn7p, Gcn8p, Gcn9p 및 Gcn20p로 구성된 그룹으로부터 선택된 단백질의 생산을 감소시키는 방법.