CN105408487A - 通过甲酯保护的碳链延伸生产7碳化学物的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请描述了通过在C7脂族主链底物中形成两个末端官能团来生产庚二酸、7-氨基庚酸、7-羟基庚酸、庚二胺或1,7-庚二醇的生物化学途径，所述官能团包括羧基、胺或羟基。本文所述的这些途径、代谢工程和培养策略依赖于接受甲酯保护的二羧酸作为底物的酶或同源物。

Description

通过甲酯保护的碳链延伸生产7碳化学物的方法
技术领域
本发明涉及使用一种或多种分离的酶例如甲基转移酶、β-酮脂酰-[acp]合酶、β-酮硫解酶、脱氢酶、还原酶、水合酶、硫酯酶、甲酯酶、CoA-转移酶、可逆CoA-连接酶和转氨酶，或使用表达一种或多种这些酶的重组宿主细胞，从丙二酰-CoA或丙二酰-[acp]以及可选的乙酰-CoA生物合成以下一种或多种物质的方法：庚二酸、7-氨基庚酸、7-羟基庚酸、庚二胺(heptamethylenediamine)和1,7-庚二醇(下文称为“C7结构单元”)。
发明背景
尼龙是聚酰胺，其有时通过二胺与二羧酸的缩聚合成。类似地，尼龙可通过内酰胺的缩聚生成。一种无处不在的尼龙是尼龙6,6，其通过六亚甲基二胺(HMD)和己二酸的反应生成。尼龙6通过己内酰胺的开环聚合生成(Anton&Baird,PolyamidesFibers,EncyclopediaofPolymerScienceandTechnology,2001)。
尼龙7和尼龙7,7代表与尼龙6和尼龙6,6相比具有增值特征的新型聚酰胺。尼龙7是通过7-氨基庚酸聚合生成的，而尼龙7,7是通过庚二酸和庚二胺的缩聚生成的。不存在生成用于尼龙7和尼龙7,7的单体的经济上可行的石油化学路径。
鉴于没有经济上可行的石油化学单体给料；生物技术提供了一种经由生物催化的备选方法。生物催化是使用生物催化剂(诸如酶)来实施有机化合物的生物化学转化。
生物衍生给料和石油化学给料两者是用于生物催化过程的可行起始材料。
因而，针对此背景，清楚的是需要用于生成庚二酸、7-氨基庚酸、庚二胺、7-羟基庚酸和1,7-庚二醇(heptanediol)(下文为“C7结构单元”)的方法，其中所述方法是基于生物催化剂的。
然而，无野生型原核生物或真核生物天然过度生成C7结构单元或将其排出至胞外环境。不过，已经报告了庚二酸的代谢。
二羧酸庚二酸作为碳源经由β-氧化被众多细菌和真菌有效转化成中心代谢物。辅酶A(CoA)活化的庚二酸到CoA活化的3-氧代庚二酸的β-氧化经由例如与芳香族底物降解有关的途径促进进一步代谢。已经广泛表征了3-氧代庚二酰基-CoA被几种细菌分解代谢成乙酰基-CoA和戊二酰基-CoA(HarwoodandParales,AnnualReviewofMicrobiology,1996,50:553–590)。
最优性原理陈述微生物调节其生物化学网络以支持最大生物量生长。超出宿主生物体中表达异源路径的需要，将碳流量引向充当碳源而非充当生物量生长成分的C7结构单元与最优性原理矛盾。例如，与天然生产者的产量性能相比，将1-丁醇途径从梭菌(Clostridium)物种转移入其它生产菌株中经常下降一个数量级(Shen等,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9):2905–2915)。
在C7脂肪族主链上形成末端官能团(诸如羧基、胺或羟基基团)前，7碳脂肪族主链前体的有效合成是合成C7结构单元中的重要考虑因素。
发明概述
本申请至少部分地基于以下发现：可构建用于生产七碳链式脂族主链前体的生物化学途径，在所述七碳链式脂族主链前体中可形成一个或两个官能团，例如羧基、胺或者羟基，导致以下一种或者多种物质的合成：庚二酸、7-氨基庚酸、7-羟基庚酸、庚二胺和1,7-庚二醇(下文称为“C7结构单元”)。庚二酸和庚二酸盐(酯)，7-羟基庚酸和7-羟基庚酸盐(酯)，7-氨基庚酸和7-氨基庚酸盐(酯)本文中可替换使用，指代以其任意中性或离子化形式的化合物，包括其任意的盐形式。本领域的技术人员应当理解具体的形式将依赖于pH。本文描述的这些途径、代谢工程和培养策略依赖于脂肪酸延伸和合成酶或同源物，其接受甲酯保护的(shielded)二羧酸作为底物。
面对最优性原理，令人惊讶地发现，可将适当的非天然途径、给料、宿主微生物、对宿主的生物化学网络的弱化策略和培养策略组合起来，从而高效地生产一种或多种C7结构单元。
在一些实施方案中，用于转化为一种或多种C7结构单元的C7脂族主链是庚二酰-[acp]或庚二酰-CoA(也称为6-羧基己酰-CoA)，其可以通过两个碳链延伸循环使用NADH或NADPH依赖的酶，从丙二酰-[acp]或丙二酰-CoA以及可选的乙酰-CoA形成。见图1A、图1B和图1C。
在一些实施方案中，末端羧基可使用庚二酰-[acp]甲酯甲基转移酶、硫酯酶、醛脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶、可逆CoA连接酶(例如可逆琥珀酰-CoA连接酶)或CoA-转移酶(例如戊烯二酸CoA-转移酶)。见图1A、图1B、图1C和图2。
在一些实施方案中，末端胺基可以使用ω-转氨酶或者脱乙酰基酶酶促形成。见图3和图4。
在一些实施方案中，末端羟基可以使用4-羟基丁酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶或6-羟基己酸脱氢酶或醇脱氢酶酶促形成。见图5和图6。
在一个方面，本申请的特征在于生物合成选自下组的产物的方法：庚二酸、7-氨基庚酸、7-羟基庚酸、庚二胺和1,7-庚二醇。所述方法包括从(i)乙酰-CoA和丙二酰-CoA通过两个甲酯保护的碳链延伸循环或(ii)丙二酰-[acp]通过两个甲酯保护的碳链延伸酶促合成七碳链脂族主链，以及在所述主链中酶促形成一个或两个选自羧基、胺和羟基的末端官能团，从而形成所述产物。所述七碳链脂族主链可以是庚二酰-[acp]或庚二酰-CoA。丙二酰-[acp]O-甲基转移酶可以将丙二酰-CoA转化为丙二酰-CoA甲酯或可以将丙二酰-[acp]转化为丙二酰-[acp]甲酯。所述两个碳链延伸循环的每一个可以包括使用(i)β-酮脂酰-[acp]合酶或β-酮硫解酶，(ii)3-氧代酰基-[acp]还原酶、乙酰乙酰-CoA还原酶、3-羟酰-CoA脱氢酶，或3-羟基丁酰-CoA脱氢酶，(iii)烯酰-CoA水合酶或3-羟酰-[acp]脱水酶，和(iv)烯酰-[acp]还原酶或反式-2-烯酰-CoA还原酶，来从丙二酰-[acp]甲酯生产庚二酰-[acp]甲酯，或从丙二酰-CoA甲酯生产庚二酰-CoA甲酯。庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶可以从庚二酰-CoA甲酯或庚二酰-[acp]甲酯移除甲基。所述丙二酰-[acp]O-甲基转移酶可以与列于SEQIDNO:16的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。所述庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶可以与列于SEQIDNO:17的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
所述两个末端官能团可以是相同的(例如胺或羟基)，或者可以是不同的(例如一个末端胺和一个末端羧基；或一个末端羟基和一个末端羧基)。
ω-转氨酶或者脱乙酰基酶可以酶促形成胺基。所述ω-转氨酶可以与列于SEQIDNO.8-13中的任一氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
6-羟基己酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、或醇脱氢酶可以酶促形成羟基基团。
硫酯酶、醛脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶、CoA-转移酶(例如戊烯二酸CoA转移酶)、或可逆CoA-连接酶(例如可逆琥珀酸-CoA连接酶)可以酶促形成末端羧基基团。所述硫酯酶可以与列于SEQIDNO:1中的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶能够形成末端醛基，作为形成所述产物的中间物。所述羧酸还原酶可以与列于SEQIDNO.2-7中的任一氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
任意所述方法可以通过发酵在重组宿主中进行。所述宿主可以经受需氧、厌氧、微氧或混合的氧/反硝化培养条件下的培养策略。所述宿主可以在营养限制的条件下培养。所述宿主可以使用陶瓷中空纤维膜保留以维持发酵期间的高细胞密度。
在任意所述方法中，所述宿主对高浓度C7结构单元的耐受可以通过在选择环境中连续培养来改善。
进料至发酵的主要碳源可以衍生自生物或非生物给料。在一些实施方案中，所述生物给料是以下物质，包括以下物质，或衍生自以下物质：单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩的酒糟可溶物或城市废物。
在一些实施方案中，所述非生物给料是以下物质，或衍生自以下物质：天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸、来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物(NVR)或者碱洗废物流，或对苯二甲酸/异酞酸混合物废物流。
本申请的特征还在于重组宿主，其包括至少一种外源性基因，所述外源性基因编码(i)丙二酰-[acp]O-甲基转移酶，(ii)β-酮脂酰-[acp]合酶或β-酮硫解酶，(iii)3-氧代酰基-[acp]还原酶、乙酰乙酰-CoA还原酶、3-羟酰-CoA脱氢酶，或3-羟基丁酰-CoA脱氢酶，(iv)烯酰-CoA水合酶或3-羟酰-[acp]脱水酶，(v)烯酰-[acp]还原酶或反式-2-烯酰-CoA还原酶，以及(vi)庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶，所述宿主生产庚二酰-[acp]或庚二酰-CoA。
生产庚二酰-[acp]或庚二酰-CoA的重组宿主进一步可以包括至少一种编码以下一种或多种物质的外源性核酸：硫酯酶、醛脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶、戊烯二酸CoA-转移酶、可逆琥珀酰-CoA-连接酶、乙酰化醛脱氢酶、或羧酸还原酶，所述宿主生产庚二酸或庚二酸半醛。
生产庚二酸半醛的重组宿主进一步可以包括至少一种编码ω-转氨酶的外源性核酸，并生产7-氨基庚酸。
生产庚二酸半醛的重组宿主进一步可以包括至少一种编码以下物质的外源性核酸：4-羟基丁酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶或6-羟基己酸脱氢酶，所述宿主生产7-羟基庚酸。
生产庚二酸半醛、7-氨基庚酸，或7-羟基庚酸的重组宿主进一步可以包括羧酸还原酶、ω-转氨酶、脱乙酰基酶、N-乙酰转移酶、或醇脱氢酶，所述宿主生产庚二胺。
生产7-羟基庚酸的重组宿主进一步可以包括至少一种编码羧酸还原酶或醇脱氢酶的外源性核酸，所述宿主生产1,7-庚二醇。
所述重组宿主可以是原核生物，例如来自埃希氏菌属(Escherichia)如大肠杆菌(Escherichiacoli)；来自梭菌属(Clostridia)如杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)或者克鲁佛梭菌(Clostridiumkluyveri)；来自棒状杆菌属(Corynebacteria)如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)；来自贪铜菌属(Cupriavidus)如钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)或者耐金属贪铜菌(Cupriavidusmetallidurans)；来自假单胞菌属(Pseudomonas)如荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)或者食油假单胞菌(Pseudomonasoleavorans)；来自代尔夫特菌属(Delftia)如食酸代尔夫特菌(Delftiaacidovorans)；来自芽孢杆菌属(Bacillus)如枯草芽胞杆菌(Bacillussubtillis)；来自乳杆菌属(Lactobacillus)如德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)；或者来自乳球菌属(Lactococcus)如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)或来自红球菌属(Rhodococcus)如马红球菌(Rhodococcusequi)。
所述重组宿主可以是真核生物，例如，来自曲霉属(Aspergillus)如黑曲霉(Aspergillusniger)；来自酵母属(Saccharomyces)如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；来自毕赤氏酵属(Pichia)如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)；来自耶罗维亚酵母属(Yarrowia)如解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)；来自伊萨酵母属(Issatchenkia)如东方伊萨酵母(Issathenkiaorientalis)；来自德巴利酵母属(Debaryomyces)如汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)；来自Arxula属如Arxulaadenoinivorans；或者来自克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)如乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyceslactis)的真核生物。
本文所述的任意重组宿主进一步可以包括一种或多种以下弱化的酶：聚羟基链烷酸酯合酶、乙酰-CoA硫酯酶、乙酰-CoA特异性β-酮硫解酶；形成乙酸的磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、乳酸脱氢酶、甲基萘醌(menaquinol)-延胡索酸氧化还原酶、产生异丁醇的2-酮酸脱羧酶、形成乙醇的醇脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、丙酮酸脱羧酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、消散NADH或NADPH不平衡的转氢酶、消散NADH或NADPH不平衡的谷氨酸脱氢酶、NADH/NADPH利用型谷氨酸脱氢酶、庚二酰-CoA脱氢酶；接受C7结构单元和中心前体作为底物的酰基-CoA脱氢酶；戊二酰-CoA脱氢酶；或庚二酰-CoA合成酶。
本文所述的任意重组宿主进一步可以过表达编码以下酶的一种或多种基因：乙酰-CoA合成酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶；转酮醇酶；吡啶核苷酸转氢酶；甲酸脱氢酶；甘油醛-3P-脱氢酶；苹果酸酶；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；果糖1,6二磷酸酶；L-丙氨酸脱氢酶；用于产生辅助因子不平衡的NADH或NADPH特异性L-谷氨酸脱氢酶；甲醇脱氢酶、甲醛脱氢酶、二胺转运体、二羧酸转运体；S-腺苷甲硫氨酸合成酶，和/或多药物转运体。
本文所述途径的反应可以在一种或多种细胞(例如宿主细胞)株中进行，所述细胞株(a)天然表达一种或多种相关酶，(b)经遗传工程化而表达一种或多种相关酶，或(c)天然表达一种或多种相关酶并经遗传工程化而表达一种或多种相关酶。或者，可以从以上任意类型的宿主细胞中提取相关酶，并以纯化或半纯化形式使用。提取的酶可选地固定在固体基质上，例如适合的反应容器的底和/或壁。此外，这些提取物包括可以作为相关酶来源使用的裂解物(如细胞裂解物)。在本申请提供的方法中，所有步骤可以在细胞(例如宿主细胞)中进行，所有步骤可以使用提取的酶进行，或一些步骤可以在细胞中进行，而其它步骤可以使用提取的酶进行。
本文所述的多种酶催化可逆反应，并且感兴趣的反应可以是所述反应的逆反应。图1-6所示的示意性途径阐明了对于每种中间物感兴趣的反应。
在一些实施方案中，弱化或增强所述宿主微生物的内源性生物化学网络，来(1)保证2-氧代戊二酸和2-氧代己二酸的细胞内可用度，(2)创造NAD+不平衡，其仅可通过C7结构单元的形成来平衡，(3)阻止通向并包括C7结构单元的中心代谢物、中心前体的降解和(4)保证从细胞的高效流出。
除非另外定义，本申请使用的所有技术和科学术语的定义与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同。虽然与本申请所述的方法和材料相似或者等同的方法和材料也可用于实践本发明，但在下文描述适合的方法和材料。本文提及的所有公开、专利申请、专利和其它参考文献通过提述完整并入本文。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。另外，材料、方法和实施例仅为示例性的而不意图限制。
本发明的一个或多个实施方案的细节列于下面的附图和描述中。根据说明书和附图，并根据权利要求，本发明的其它特征、目的和优点将显而易见。根据专利法的标准实践，词语“包含”在权利要求中可被“基本上由…组成”或者“由…组成”替代。
附图简述
图1A是使用NADPH依赖的酶以及丙二酰-[acp]作为中心代谢物通向庚二酰-[acp]的示例性生物化学途径的示意图。
图1B是使用NADPH依赖的酶以及乙酰-CoA和丙二酰-CoA作为中心代谢物通向庚二酰-CoA的示例性生物化学途径的示意图。
图1C是使用NADH依赖的酶以及乙酰-CoA和丙二酰-CoA作为中心代谢物通向庚二酰-CoA的示例性生物化学途径的示意图。
图2是使用庚二酰-[acp]、庚二酰-CoA或庚二酸半醛作为中心前体通向庚二酸的示例性生物化学途径的示意图。
图3是使用庚二酰-CoA、庚二酸或庚二酸半醛作为中心前体通向7-氨基庚酸的示例性生物化学途径的示意图。
图4是使用7-氨基庚酸、7-羟基庚酸或庚二酸半醛作为中心前体通向庚二胺的示例性生物化学途径的示意图。
图5是使用庚二酸、庚二酰-CoA或庚二酸半醛作为中心前体通向7-羟基庚酸的示例性生物化学途径的示意图。
图6是使用7-羟基庚酸作为中心前体通向1,7-庚二醇的示例性生物化学途径的示意图。
图7含有由tesB编码的大肠杆菌硫酯酶(参见GenBank登录号AAA24665.1，SEQIDNO:1)、海分枝杆菌(Mycobacteriummarinum)羧酸还原酶(参见GenBank登录号ACC40567.1，SEQIDNO:2)、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)羧酸还原酶(参见GenBank登录号ABK71854.1，SEQIDNO:3)、Segniliparusrugosus羧酸还原酶(参见GenBank登录号EFV11917.1，SEQIDNO:4)、耻垢分枝杆菌羧酸还原酶(参见GenBank登录号ABK75684.1，SEQIDNO:5)、马赛分枝杆菌(Mycobacteriummassiliense)羧酸还原酶(参见GenBank登录号EIV11143.1，SEQIDNO:6)、Segniliparusrotundus羧酸还原酶(参见GenBank登录号ADG98140.1，SEQIDNO:7)、紫色色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)ω-转氨酶(参见GenBank登录号AAQ59697.1，SEQIDNO:8)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ω-转氨酶(参见GenBank登录号AAG08191.1，SEQIDNO:9)、丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)ω-转氨酶(参见GenBank登录号AAY39893.1，SEQIDNO:10)、球形红杆菌(Rhodobactersphaeroides)ω-转氨酶(参见GenBank登录号ABA81135.1，SEQIDNO:11)、大肠杆菌ω-转氨酶(参见GenBank登录号AAA57874.1，SEQIDNO:12)、河流弧菌(VibrioFluvialis)ω-转氨酶(参见GenBank登录号AEA39183.1，SEQIDNO:13)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(参见GenBank登录号CAA44858.1，SEQIDNO:14)、诺卡氏菌物种(Nocardiasp.)NRRL5646磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(参见GenBank登录号ABI83656.1，SEQIDNO:15)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)丙二酰-CoA甲基转移酶(参见GenBank登录号AAS43086.1,SEQIDNO:16)或大肠杆菌庚二酰-[acp]甲酯酯酶(参见GenBank登录号AAC76437.1,SEQIDNO:17)的氨基酸序列。
图8是相对于空载体对照20分钟后释放的CoA在412nm处相对吸光度的柱状图，其作为硫酯酶将庚二酰-CoA转化为庚二酸的活性的测量。
图9是总结20分钟后在340nm处吸光度的改变的柱状图，其为相对于只有酶的对照(没有底物)，NADPH的消耗和羧酸还原酶的活性的测量。
图10是20分钟后在340nm处吸光度的改变的柱状图，其为相对于空载体对照，NADPH的消耗和羧酸还原酶将庚二酸转化为庚二酸半醛的活性的测量。
图11是20分钟后在340nm处吸光度的改变的柱状图，其为相对于空载体对照，NADPH的消耗和羧酸还原酶将7-羟基庚酸转化为7-羟基庚醛的活性的测量。
图12是20分钟后在340nm处吸光度的改变的柱状图，其为相对于空载体对照，NADPH的消耗和羧酸还原酶将N7-乙酰-7-氨基庚酸转化为N7-乙酰-氨基庚醛的活性的测量。
图13是20分钟后在340nm处吸光度的改变的柱状图，其为相对于空载体对照，NADPH的消耗和羧酸还原酶将庚二酸半醛转化为庚二醛的活性的测量。
图14是总结4小时后丙酮酸转化为L-丙氨酸(mol/mol)的转化百分比的柱状图，其作为相对于只有酶的对照(没有底物)，ω-转氨酶的活性的测量。
图15是4小时后丙酮酸转化为L-丙氨酸(mol/mol)的转化百分比的柱状图，其作为相对于空载体对照，ω-转氨酶将7-氨基庚酸转化为庚二酸半醛的活性的测量。
图16是4小时后L-丙氨酸转化为丙酮酸(mol/mol)的转化百分比的柱状图，其作为相对于空载体对照，ω-转氨酶将庚二酸半醛转化为7-氨基庚酸的活性的测量。
图17是4小时后丙酮酸转化为L-丙氨酸(mol/mol)的转化百分比的柱状图，其作为相对于空载体对照，ω-转氨酶将庚二胺转化为7-氨基庚醛的活性的测量。
图18是4小时后丙酮酸转化为L-丙氨酸(mol/mol)的转化百分比的柱状图，其作为相对于空载体对照，ω-转氨酶将N7-乙酰-1,7-二氨基庚烷转化为N7-乙酰-7-氨基庚醛的活性的测量。
图19是4小时后丙酮酸转化为L-丙氨酸(mol/mol)的转化百分比的柱状图，其作为相对于空载体对照，ω-转氨酶将7-氨基庚醇转化为7-氧代庚醇的活性的测量。
图20是1小时后庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶将庚二酰-CoA甲酯转化为庚二酰-CoA的表格。
发明详述
本申请提供酶、非天然途径、培养策略、给料、宿主微生物和对宿主的生物化学网络的弱化，其从中心代谢物生成七碳链式脂族主链，在所述七碳链式脂族主链中可形成两个末端官能团，导致以下物质的合成：庚二酸、7-氨基庚酸、庚二胺或1,7-庚二醇(后文称为“C7结构单元”)。如本文所使用的，术语“中心前体”用于表示本文所示的通向C7结构单元的合成的任意代谢途径中的任意代谢物。术语“中心代谢物”用于本文表示在所有微生物中生产以支持生长的代谢产物。
本文中描述的宿主微生物可以包含可以操作为使得可生成一种或多种C7结构单元的内源途径。在一种内源途径中，宿主微生物天然表达催化途径内的反应的所有酶。含有工程化途径的宿主微生物不天然表达催化途径内的反应的所有酶，但是已经工程化改造为使得在宿主中表达途径内的所有酶。
如本文中提及核酸(或蛋白质)和宿主使用的，术语“外源”指不像其在自然界中被发现一样存在于特定类型细胞中(并且不能从特定类型细胞获得)的核酸或由所述核酸编码的蛋白质。如此，非天然存在的核酸一旦在宿主中即视为对于宿主而言外源的。重要的是注意非天然存在的核酸可含有在自然界中发现的核酸序列的核酸亚序列或片段，只要该核酸作为整体不存在于自然界中。例如，表达载体内含有基因组DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，如此一旦导入宿主中对于宿主细胞而言是外源的，因为该核酸分子作为整体(基因组DNA加载体DNA)不存在于自然界中。如此，作为整体不存在于自然界中的任何载体、自主复制的质粒或病毒(例如逆转录病毒、腺病毒、或疱疹病毒)视为非天然存在的核酸。由此得出结论通过PCR或限制内切性核酸酶处理产生的基因组DNA片段以及cDNA也视为非天然存在的核酸，因为它们作为未见于自然界的分开的分子存在。由此还得出结论任何以未见于自然界中的排布含有启动子序列和多肽编码序列(例如cDNA或基因组DNA)的任何核酸也是非天然存在的核酸。天然存在的核酸可以是对于特定宿主微生物而言外源的。例如，从酵母x的细胞分离的完整染色体一旦将该染色体导入酵母y的细胞中就酵母y细胞而言是外源核酸。
比较而言，如本文中提及核酸(例如基因)(或蛋白质)和宿主使用的，术语“内源的”指就像其在自然界中被发现一样的确存在于特定宿主中(并且可以从特定宿主获得)的核酸(或蛋白质)。此外，“内源表达”核酸(或蛋白质)的细胞就像其在自然界中被发现时相同特定类型的宿主那样表达所述核酸(或蛋白质)。此外，“内源生成”核酸、蛋白质、或其它化合物的宿主就像其在自然界中被发现时相同特定类型的宿主那样生成所述核酸、蛋白质、或化合物。
例如，取决于所述宿主和由所述宿主生产的化合物，除了丙二酰-[acp]O-甲基转移酶和庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶以外，所述宿主中可以表达一种或多种以下酶：β-酮脂酰-[acp]合酶、β-酮硫解酶、3-氧代酰基-[acp]还原酶、乙酰乙酰-CoA还原酶、3-羟酰-CoA脱氢酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、烯酰-CoA水合酶、3-羟酰-[acp]脱水酶、烯酰-[acp]还原酶、反式-2-烯酰-CoA还原酶、硫酯酶、可逆CoA连接酶、CoA-转移酶、乙酰化醛脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、醛脱氢酶、羧酸还原酶、ω-转氨酶、N-乙酰转移酶、醇脱氢酶、脱乙酰基酶、6-羟基己酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶，或4-羟基丁酸脱氢酶。在表达羧酸还原酶的重组宿主中，还可以表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，因为其提高羧酸还原酶的活性。
例如，重组宿主可以包括至少一种编码以下酶的外源性核酸(i)丙二酰-[acp]O-甲基转移酶，(ii)β-酮脂酰-[acp]合酶或β-酮硫解酶，(iii)3-氧代酰基-[acp]还原酶、乙酰乙酰-CoA还原酶、3-羟酰-CoA脱氢酶或3-羟基丁酰-CoA脱氢酶，(iv)烯酰-CoA水合酶或3-羟酰-[acp]脱水酶，(v)烯酰-[acp]还原酶或反式-2-烯酰-CoA还原酶和(vi)庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶并生产庚二酰-[acp]或庚二酰-CoA。
这类生产庚二酰-[acp]或庚二酰-CoA的重组宿主进一步可以包括至少一种编码以下一种或多种酶的外源性核酸：硫酯酶、醛脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶、戊烯二酸CoA-转移酶、可逆琥珀酰-CoA连接酶、乙酰化醛脱氢酶，或羧酸还原酶并生产庚二酸或庚二酸半醛。例如，生产庚二酰-[acp]或庚二酰-CoA的重组宿主进一步可以包括硫酯酶、可逆CoA连接酶(例如可逆琥珀酰-CoA连接酶)，或CoA转移酶(例如戊烯二酸CoA-转移酶)并生产庚二酸。例如，生产庚二酰-CoA的重组宿主进一步可以包括乙酰化醛脱氢酶并生产庚二酸半醛。例如，生产庚二酸的重组宿主进一步可以包括羧酸还原酶并生产庚二酸半醛。
生产庚二酸半醛的重组宿主进一步可以包括至少一种编码ω-转氨酶的外源性核酸并生产7-氨基庚酸。在一些实施方案中，生产庚二酰-CoA的重组宿主包括羧酸还原酶和ω-转氨酶来生产7-氨基庚酸。
生产庚二酸或庚二酸半醛的重组宿主进一步可以包括至少一种编码6-羟基己酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶或4-羟基丁酸脱氢酶的外源性核酸，并生产7-羟基庚酸。在一些实施方案中，生产庚二酰-CoA的重组宿主包括乙酰化醛脱氢酶和6-羟基己酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶或4-羟基丁酸脱氢酶来生产7-羟基庚酸。在一些实施方案中，生产庚二酸的重组宿主包括羧酸还原酶和6-羟基己酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶或4-羟基丁酸脱氢酶来生产7-羟基庚酸。
生产7-氨基庚酸、7-羟基庚酸或庚二酸半醛的重组宿主进一步可以包括至少一种编码ω-转氨酶、脱乙酰基酶、N-乙酰基转移酶或醇脱氢酶的外源性核酸，并生产庚二胺。例如，生产7-羟基庚酸的重组宿主可以包括羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶增强剂、ω-转氨酶和醇脱氢酶。
生产7-羟基庚酸的重组宿主可以包括羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶增强剂以及醇脱氢酶的一种或多种，并生产1,7-庚二醇。
在工程化途径中，所述酶可以来自单个来源，例如来自于一个物种或属，或可以来自于多个来源，例如不同的物种或属。编码本文所述的酶的核酸已经从多种生物鉴定，并在公共数据库例如GenBank或EMBL中容易获得。
本文所述的可用于生产一种或多种C7结构单元的任意酶可以与对应野生型酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。应当理解所述序列同一性可以基于成熟的酶(例如移除了任意信号序列)确定。
例如，本文所述的硫酯酶可以与由tesB编码的大肠杆菌硫酯酶的氨基酸序列(见GenBank登录号AAA24665.1，SEQIDNO:1)具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。见图7。
例如，本文所述的羧酸还原酶可以与以下的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％)：海分枝杆菌(参见GenBank登录号ACC40567.1，SEQIDNO:2)，耻垢分枝杆菌(参见GenBank登录号ABK71854.1，SEQIDNO:3)，Segniliparusrugosus(参见GenBank登录号EFV11917.1，SEQIDNO:4)，耻垢分枝杆菌(参见GenBank登录号ABK75684.1，SEQIDNO:5)，马赛分枝杆菌(参见GenBank登录号EIV11143.1，SEQIDNO:6)，或Segniliparusrotundus(参见GenBank登录号ADG98140.1，SEQIDNO:7)羧酸还原酶的氨基酸序列。见图7。
例如，本文所述的ω-转氨酶可以与以下的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％)：紫色色杆菌(参见GenBank登录号AAQ59697.1，SEQIDNO:8)，铜绿假单胞菌(参见GenBank登录号AAG08191.1，SEQIDNO:9)，丁香假单胞菌(参见GenBank登录号AAY39893.1，SEQIDNO:10)，球形红杆菌(参见GenBank登录号ABA81135.1，SEQIDNO:11)，大肠杆菌(参见GenBank登录号AAA57874.1，SEQIDNO:12)，或河流弧菌(参见GenBank登录号AEA39183.1，SEQIDNO:13)ω-转氨酶的氨基酸序列。这些中的一些ω-转氨酶是二胺ω-转氨酶。见图7。
例如，本文所述的磷酸磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶可以与枯草芽孢杆菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(见Genbank登录号CAA44858.1,SEQIDNO:14)或诺卡氏菌属菌种NRRL5646磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(见Genbank登录号ABI83656.1,SEQIDNO:15)的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。见图7。
例如，本文所述的丙二酰-CoA甲基转移酶可以与蜡样芽孢杆菌丙二酰-CoA甲基转移酶(见GenBank登录号AAS43086.1,SEQIDNO:16)的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。见图7。
例如，本文所述的庚二酰-[acp]甲酯酯酶可以与大肠杆菌庚二酰-[acp]甲酯酯酶(见GenBank登录号AAC76437.1,SEQIDNO:17)的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。见图7。
两个氨基酸序列之间的同一性(同源性)百分比可以如下确定。首先，使用来自单机版BLASTZ的BLAST2Sequence(Bl2seq)程序比对氨基酸序列，所述单机版BLASTZ含有BLASTP2.0.14版本。BLASTZ的这一单机版可以从Fish&Richardson的网站(例如www.fr.com/blast/)或者美国政府的NationalCenterforBiotechnologyInformation网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上获得。解释如何使用Bl2seq程序的说明可以在BLASTZ随附的自述文件中找到。Bl2seq使用BLASTP算法进行两个氨基酸序列之间的比较。为了比较两个氨基酸序列，Bl2seq的选项如下设定：-i设置为含有待比较的第一个氨基酸序列的文件(例如C:\seq1.txt)；-j设置为含有待比较的第二个氨基酸序列的文件(例如C:\seq2.txt)；-p设置为blastp；-o设置为任意所需的文件名(例如C:\output.txt)；所有其它选项保留其默认设置。例如，以下命令可以用于生成含有两个氨基酸序列之间比较的输出文件：C:\Bl2seq–ic:\seq1.txt–jc:\seq2.txt–pblastp–oc:\output.txt。如果两个比较的序列共有同源性(同一性)，则指定的输出文件将呈现那些同源区域作为比对序列。如果两个比较序列不具有同源性(同一性)，则指定的输出文件将不呈现比对序列。除了使用blastn外，可以遵循类似的程序用于核酸序列。
一旦比对后，匹配的数量通过数两个序列中都出现的相同氨基酸残基位置的数量来确定。百分比同一性(同源性)通过将匹配的数量除以多肽氨基酸序列全长的长度，接着将所得值乘以一百来确定。应当注意百分比同一性(同源性)值四舍五入到最近的十分位。例如，78.11、78.12、78.13和78.14舍到78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19入到78.2。还应当注意所述长度值总是整数。
应当理解若干核酸可以编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码子的简并是本领域公知的，即对于许多氨基酸，存在多于一种核苷酸三联体作为该氨基酸的密码子。例如，可以使用对于该物种适合的密码子偏好表修饰所给酶的编码序列中的密码子，来得到在特定物种(例如细菌或真菌)中的最优表达。
本文所述的任意酶的功能片段也可以用于本申请的方法。术语“功能片段”用于本文指代蛋白的肽片段，其具有相应成熟、全长、野生型蛋白的至少25％(例如至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、95％、98％、99％、100％；或甚至超过100％)的活性。所述功能片段通常可以是，但不总是由蛋白的连续区域组成，其中所述区域具有功能活性。
本申请还提供(i)用于本申请方法的酶的功能变体和(ii)上文所述功能片段的功能变体。酶和功能片段的功能变体可以含有相对于对应野生型序列的增加、缺失或取代。带有取代的酶通常具有不多于50个(例如不多于一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、12、15、20、25、30、35、40或50)氨基酸取代(例如保守取代)。这适用于本文所述的任意酶和功能片段。保守取代是一个氨基酸对具有相似特性的另一个氨基酸的取代。保守取代包括下组中的取代：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。非极性疏水氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。上述极性、碱性或酸性组中一个成员被同组另一个成员的任意取代认为是保守取代。相比之下，非保守取代是一个氨基酸对具有不相似特性的另一个氨基酸的取代。
缺失变体可以缺少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸片段(由两个或更多氨基酸组成)或非连续的单个氨基酸。加入(添加变体)包括含有下述项的融合蛋白：(a)本文所述的任意酶或其片段；和(b)内部或末端(C或N)不相关或异源的氨基酸序列。在此类融合蛋白的语境中，术语“异源氨基酸序列”指代除了(a)以外的氨基酸序列。异源性序列可以是，例如，用于重组蛋白纯化的序列(例如FLAG、多聚组氨酸(例如六聚组氨酸)、血细胞凝集素(HA)、谷胱甘肽-s-转移酶(GST)、或麦芽糖结合蛋白(MBP))。异源性序列也可以是作为可检测标记物有用的蛋白，例如萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。在一些实施方案中，所述融合蛋白含有来自于另一个蛋白的信号序列。在某些宿主细胞中(例如酵母宿主细胞)，目标蛋白的表达和/或分泌可以通过使用异源性信号序列增加。在一些实施方案中，所述融合蛋白可以含有载体(例如KLH)(例如在引起免疫应答抗体产生中有用)或ER或高尔基体驻留信号。异源性序列可以是不同的长度，并在一些情况下可以是比该异源性序列所附着的全长目标蛋白更长的序列。
工程化宿主可以天然不表达或表达一些(例如一种或更多、两种或更多、三种或更多、四种或更多、五种或更多、或六种或更多)本文所述途径的酶。因此，工程化宿主中的途径可以包括所有外源性的酶，或可以包括内源性和外源性酶。也可以扰乱工程化宿主的内源性基因来阻止不需要的代谢产物的形成，或通过作用于中间物的其它酶阻止所述途径中该中间物的流失。工程化的宿主可称为重组宿主或重组宿主细胞。如本文所述重组宿主可以包括编码以下一种或多种物质的核酸：甲基转移酶、合酶、β-酮硫解酶、脱水酶、水合酶、脱氢酶、甲基酯酶、硫酯酶、可逆CoA-连接酶、CoA转移酶、还原酶、脱乙酰基酶、N-乙酰转移酶、或ω-转氨酶，如下文中详述的。
另外，可以使用本文所述的分离的酶，使用来自于作为所述酶的来源的宿主微生物的裂解物(例如细胞裂解物)，或使用来自于作为所述酶的来源的不同宿主微生物的多种裂解物，在体外进行一种或多种C7结构单元的生产。
产生用于转化为C7结构单元的C7脂族主链的酶
如图1A、图1B和图1C中所描述，用于转化为一种或多种C7结构单元的C7脂族主链可以使用NADH或NADPH依赖的酶，通过两个与生物素合成相关的甲酯保护的碳链延伸循环，从丙二酰-[acp]，或乙酰-CoA和丙二酰-CoA形成。
在一些实施方案中，与生物素生物合成途径相关的甲酯保护的碳链延伸包括使用丙二酰-[acp]O-甲基转移酶来形成丙二酰-[acp]甲酯，接着使用β-酮脂酰-[acp]合酶、3-氧代酰基-[acp]还原酶、3-羟酰-[acp]脱水酶和烯酰-[acp]还原酶进行两个碳链延伸循环。可以使用庚二酰-[acp]甲酯酯酶来裂解所得的庚二酰-[acp]甲酯。
在一些实施方案中，甲酯保护的碳链延伸途径包括使用丙二酰-[acp]O-甲基转移酶来形成丙二酰-[acp]甲酯，接着使用(i)β-酮硫解酶或β-酮脂酰-[acp]合酶，(2)乙酰乙酰-CoA还原酶、3-氧代酰基-[acp]还原酶，或3-羟酰-CoA脱氢酶，(iii)烯酰-CoA水合酶，和(iv)反式-2-烯酰-CoA还原酶进行两个碳链延伸循环。可以使用庚二酰-[acp]甲酯酯酶来裂解所得的庚二酰-CoA甲酯。
在一些实施方案中，甲基转移酶可以是归类于，例如EC2.1.1.197下的丙二酰-[acp]O-甲基转移酶，例如来自蜡样芽孢杆菌的bioC的基因产物(见Genbank登录号AAS43086.1,SEQIDNO:16)(见，例如Lin,2012,BiotinSynthesisinEscherichiacoli,Ph.D.Dissertation,UniversityofIllinoisatUrbana-Champaign)。
在一些实施方案中，β-酮硫解酶可以归类于，例如EC2.3.1.16下，例如bktB的基因产物。由来自钩虫贪铜菌的bktB编码的β-酮硫解酶接受丙酰-CoA和戊酰-CoA作为底物，形成CoA激活的C7脂族主链(见，例如Haywood等，FEMSMicrobiologyLetters,1988,52:91-96；Slater等，J.Bacteriol.,1998,180(8):1979-1987)。
在一些实施方案中，β-酮脂酰-[acp]合酶可以归类于，例如EC2.3.1.-下(例如EC2.3.1.41、EC2.3.1.179或EC2.3.1.180)例如fabB、fabF或fabH的基因产物。
在一些实施方案中，3-羟酰-CoA脱氢酶可以归类于，例如EC1.1.1.35下，例如fadB的基因产物，或归类于EC1.1.1.157下，例如hbd的基因产物(可以称为3-羟基丁酰-CoA脱氢酶)，或归类于EC1.1.1.36下，例如phaB的基因产物(见，例如Liu&Chen,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2007,76(5),1153–1159；Shen等，Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9),2905–2915；orBudde等，J.Bacteriol.,2010,192(20),5319–5328)。
在一些实施方案中，3-氧代酰基-CoA还原酶可以归类于EC1.1.1.100下，例如fabG的基因产物(Budde等，2010,见上文；Nomura等，Appl.Environ.Microbiol.,2005,71(8),4297–4306)。
在一些实施方案中，烯酰-CoA水合酶可以归类于，例如EC4.2.1.17下，例如crt的基因产物，或归类于EC4.2.1.119下，例如phaJ的基因产物(Shen等，2011,见上文；或Fukui等，J.Bacteriol.,1998,180(3),667–673)。
在一些实施方案中，烯酰-[acp]脱水酶例如3-羟酰-[acp]脱水酶可以归类于EC4.2.1.59下，例如fabZ的基因产物。
在一些实施方案中，反式-2-烯酰-CoA还原酶可以归类于EC1.3.1.-下(例如EC1.3.1.38、EC1.3.1.8、EC1.3.1.44)，例如ter(Nishimaki等，J.Biochem.,1984,95,1315–1321；Shen等，2011,见上文)或tdter的基因产物(Bond-Watts等，Biochemistry,2012,51,6827–6837)。
在一些实施方案中，烯酰-[acp]还原酶可以归类于EC1.3.1.10下例如fabI的基因产物。
在一些实施方案中，庚二酰-[acp]甲酯酯酶可以归类于，例如EC3.1.1.85下，例如来自大肠杆菌的bioH的基因产物。见Genbank登录号AAC76437.1,SEQIDNO:17。
在C7结构单元的生物合成中产生末端羧基的酶
如图2中所描述，可以使用硫酯酶、醛脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶、CoA-转移酶或可逆CoA-连接酶酶促形成末端羧基。
在一些实施方案中，导致C7结构单元合成的第二个末端羧基由归类于例如EC3.1.2.-下的硫酯酶酶促形成，例如YciA、tesB(Genbank登录号AAA24665.1,SEQIDNO:1)或Acot13的基因产物(见，例如Cantu等，ProteinScience,2010,19,1281–1295；Zhuang等，Biochemistry,2008,47(9),2789–2796；或Naggert等，J.Biol.Chem.,1991,266(17),11044–11050)。
在一些实施方案中，导致C7结构单元合成的第二个末端羧基由归类于EC3.1.2.-下的烯酰-[acp]硫酯酶酶促形成，例如fatB或tesA的基因产物。由Genbank登录号ABJ63754.1和CCC78182.1编码的烯酰-[acp]硫酯酶具有C6-C8链长度特异性(Jing等，2011,BMCBiochemistry,12(44))。
在一些实施方案中，导致庚二酸合成的第二个末端羧基由归类于，例如EC1.2.1.3下的醛脱氢酶酶促形成(见，例如Guerrillot&Vandecasteele,Eur.J.Biochem.,1977,81,185–192)。
在一些实施方案中，导致庚二酸合成的第二个末端羧基由归类于EC.1.2.1.-下的脱氢酶，例如6-氧代己酸脱氢酶(例如来自于不动杆菌物种(Acinetobactersp.)的ChnE的基因产物)或7-氧代庚酸脱氢酶(例如来自Sphingomonasmacrogolitabida的ThnG的基因产物)酶促形成。见，例如Iwaki等，Appl.Environ.Microbiol.,1999,65(11),5158–5162；或López-Sánchez等，Appl.Environ.Microbiol.,2010,76(1),110-118。例如，6-氧代己酸脱氢酶可以归类于EC1.2.1.63下。例如，7-氧代庚酸脱氢酶可以归类于EC1.2.1.-下。
在一些实施方案中，导致庚二酸合成的第二个末端羧基由CoA-转移酶酶促形成(例如戊烯二酸CoA-转移酶)，其归类于例如EC2.8.3.12下，例如来自于发酵氨基酸球菌(Acidaminococcusfermentans)。见，例如Buckel等，1981,Eur.J.Biochem.,118:315–321。
在一些实施方案中，导致庚二酸合成的第二个末端羧基由可逆CoA-连接酶酶促形成(例如琥珀酸CoA-连接酶)，其归类于例如EC6.2.1.5下，例如来自于Thermococcuskodakaraensis。见，例如，Shikata等，2007,J.Biol.Chem.,282(37):26963–26970。
在C7结构单元的生物合成中产生末端胺基的酶
如图3和图4所描述，末端胺基团可以使用ω-转氨酶或脱乙酰基酶酶促形成。
在一些实施方案中，导致7-氨基庚酸合成的第一个或第二个末端胺基团由ω-转氨酶酶促形成，所述ω-转氨酶归类于，例如，EC2.6.1.18、EC2.6.1.19、EC2.6.1.29、EC2.6.1.48或EC2.6.1.82下，例如从紫色色杆菌(见Genbank登录号AAQ59697.1,SEQIDNO:8)，铜绿假单胞菌(Genbank登录号AAG08191.1，SEQIDNO:9)，丁香假单胞菌(Genbank登录号AAY39893.1，SEQIDNO:10)，球形红杆菌(Genbank登录号ABA81135.1，SEQIDNO:11)，大肠杆菌(见Genbank登录号AAA57874.1，SEQIDNO:12)，河流弧菌(Genbank登录号AAA57874.1，SEQIDNO:13)，灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)，或绿色梭菌(Clostridiumviride)的获得。这些ω-转氨酶中的一些是二胺ω-转氨酶(例如SEQIDNO:12)。例如，归类于EC2.6.1.29或EC2.6.1.82下的ω-转氨酶可能是二胺ω-转氨酶。
来自于紫色色杆菌的可逆ω-转氨酶(Genbank登录号AAQ59697.1,SEQIDNO:8)已经展示了接受6-氨基己酸作为氨基供体，从而形成己二酸半醛中的第一个末端胺基团的类似活性(Kaulmann等，EnzymeandMicrobialTechnology,2007,41,628–637)。
来自于灰色链霉菌的可逆4-氨基丁酸:2-酮戊二酸转氨酶已经展示了将6-氨基己酸转化为己二酸半醛的类似活性(Yonaha等，Eur.J.Biochem.,1985,146:101-106)。
来自于绿色梭菌的可逆5-氨基戊酸转氨酶已经展示了将6-氨基己酸转化为己二酸半醛的类似活性(Barker等，J.Biol.Chem.,1987,262(19),8994–9003)。
在一些实施方案中，导致7-氨基庚酸或庚二胺合成的末端胺基团由二胺ω-转氨酶酶促形成。例如，第二个末端氨基基团可以由归类于例如EC2.6.1.29或归类于例如EC2.6.1.82下的二胺ω转氨酶酶促形成，例如来自于大肠杆菌的YgjG的基因产物(Genbank登录号AAA57874.1,SEQIDNO:12)。
ygjG的基因产物接受广泛的二胺碳链长度底物，例如腐胺、尸胺和亚精胺(见，例如Samsonova等，BMCMicrobiology,2003,3:2)。
来自于大肠杆菌菌株B的二胺ω转氨酶已经展示了对于1,7-二氨基庚烷的活性(Kim,TheJournalofChemistry,1964,239(3),783–786)。
在一些实施方案中，导致庚二胺合成的第二个末端胺基团由脱乙酰基酶酶促形成，例如归类于，例如EC3.5.1.62下的乙酰腐胺脱乙酰基酶。来自藤黄微球菌(Micrococcusluteus)K-11的乙酰腐胺脱乙酰基酶接受广泛的碳链长度底物，例如乙酰腐胺、乙酰尸胺和N8-乙酰亚精胺(见，例如Suzuki等，1986,BBA–GeneralSubjects,882(1):140–142)。
在C7结构单元的生物合成中产生末端羟基的酶
如图5和图6中所描述的，末端羟基可以使用醇脱氢酶酶促形成。
在一些实施方案中，导致1,7-庚二醇合成的末端羟基可以由归类于EC1.1.1.-(例如1、2、21或184)下的醇脱氢酶，例如YMR318C的基因产物(归类于，例如EC1.1.1.2下，见Genbank登录号CAA90836.1)(Larroy等，2002,BiochemJ.,361(Pt1),163–172)，YghD的基因产物，cpnD的基因产物(Iwaki等，2002,Appl.Environ.Microbiol.,68(11):5671–5684)，gabD的基因产物(Lütke-Eversloh&Steinbüchel,1999,FEMSMicrobiologyLetters,181(1):63–71)，或归类于，例如EC1.1.1.258下的6-羟基己酸脱氢酶，例如ChnD的基因产物(Iwaki等，Appl.Environ.Microbiol.,1999,见上文)酶促形成。
生物化学途径
使用NADPH特异性酶通向作为通向C7结构单元的中心前体的庚二酰-[acp]的途径
在一些实施方案中，庚二酰-[acp]从中心代谢物丙二酰-[acp]合成，由归类于，例如EC2.1.1.197下的丙二酰-CoAO-甲基转移酶，例如bioC的基因产物将丙二酰-[acp]转化为丙二酰-[acp]甲酯；接着由归类于，例如EC2.3.1.-下(例如EC2.3.1.41、EC2.3.1.179或EC2.3.1.180)下的β-酮脂酰-[acp]合酶例如fabB、fabF或fabH的基因产物和丙二酰-[acp]一起转化为3-氧代戊二酰-[acp]甲酯；接着由归类于，例如EC1.1.1.100下的3-氧代酰基-[acp]还原酶例如fabG的基因产物转化为3-羟基-戊二酰-[acp]甲酯；接着由归类于，例如EC4.2.1.59下的3-羟酰-[acp]脱水酶例如fabZ的基因产物转化为2,3-脱氢戊二酰-[acp]甲酯；接着由归类于，例如EC1.3.1.10下的烯酰-[acp]还原酶，例如fabI的基因产物转化为戊二酰-[acp]甲酯；接着由归类于，例如EC2.3.1.-下(例如EC2.3.1.41或EC2.3.1.179)的β-酮脂酰-[acp]合酶例如fabB或fabF的基因产物转化为3-氧代庚二酰-[acp]甲酯；接着由归类于，例如EC1.1.1.100下的3-氧代酰基-[acp]还原酶例如fabG的基因产物转化为3-羟基-庚二酰-[acp]甲酯；接着由归类于，例如EC4.2.1.59下的3-羟酰-[acp]脱水酶例如fabZ的基因产物转化为2,3-脱氢庚二酰-[acp]甲酯；接着由归类于，例如EC1.3.1.10下的烯酰-[acp]还原酶例如fabI的基因产物转化为庚二酰-[acp]甲酯；接着由归类于，例如EC3.1.1.85下的庚二酰-[acp]甲酯酯酶例如bioH的基因产物转化为庚二酰-[acp]。见图1A。
使用NADPH特异性酶通向作为通向C7结构单元的中心前体的庚二酰-CoA的途径
在一些实施方案中，庚二酰-CoA从中心代谢物丙二酰-CoA合成，由归类于，例如EC2.1.1.197下的丙二酰-CoAO-甲基转移酶例如bioC的基因产物将丙二酰-CoA转化为丙二酰-CoA甲酯；接着由归类于，例如EC2.3.1.16下的β-酮硫解酶例如bkB的基因产物与乙酰-CoA一起转化为3-氧代戊二酰-CoA甲酯，或由归类于，例如EC2.3.1.180下的β-酮脂酰-[acp]合酶，例如fabH的基因产物与丙二酰-CoA一起转化；接着由归类于，例如EC1.1.1.100下的3-氧代酰基-[acp]还原酶，例如fabG的基因产物或归类于，例如EC1.1.1.36下的乙酰乙酰-CoA还原酶例如phaB的基因产物转化为3-羟基-戊二酰-CoA甲酯；接着由归类于，例如EC4.2.1.119下的烯酰-CoA水合酶例如phaJ的基因产物转化为2,3-脱氢戊二酰-CoA甲酯；接着由归类于，例如EC1.3.1.-下的还原酶例如归类于EC1.3.1.10下的烯酰-[acp]还原酶例如fabI的基因产物或反式-2-烯酰-CoA还原酶(归类于EC1.3.1.38、EC1.3.1.8，或EC1.3.1.44)例如ter或tdter的基因产物转化为戊二酰-CoA甲酯；接着由归类于，例如EC2.3.1.-下(例如EC2.3.1.41或EC2.3.1.179)的β-酮脂酰-[acp]合酶例如fabB或fabF的基因产物，或归类于，例如EC2.3.1.16下的β-酮硫解酶例如bktB的基因产物转化为3-氧代庚二酰-CoA甲酯；接着由归类于，例如EC1.1.1.100下的3-氧代酰基-[acp]还原酶例如fabG的基因产物或归类于，例如EC1.1.1.36下的乙酰乙酰-CoA还原酶例如phaB的基因产物转化为3-羟基-庚二酰-CoA甲酯；接着由归类于，例如EC4.2.1.119下的烯酰-CoA水合酶，例如phaJ的基因产物转化为2,3-脱氢庚二酰-CoA甲酯；接着由归类于，例如EC1.3.1.-下的还原酶例如烯酰-[acp]还原酶(EC1.3.1.10)例如fabI的基因产物或反式-2-烯酰-CoA还原酶(EC1.3.1.38、EC1.3.1.8，或EC1.3.1.44)例如ter或tdter的基因产物转化为庚二酰-CoA甲酯；接着由归类于，例如EC3.1.1.85下的庚二酰-[acp]甲酯酯酶例如bioH的基因产物转化为庚二酰-CoA。见图1B。
使用NADH特异性酶通向作为通向C7结构单元的中心前体的庚二酰-CoA的途径
在一些实施方案中，庚二酰-CoA从中心代谢物丙二酰-CoA合成，由归类于，例如EC2.1.1.197下的丙二酰-CoAO-甲基转移酶，例如bioC的基因产物将丙二酰-CoA转化为丙二酰-CoA甲酯；接着由归类于，例如EC2.3.1.16下的β-酮硫解酶例如bkB的基因产物与乙酰-CoA一起转化为3-氧代戊二酰-CoA甲酯，或由归类于，例如EC2.3.1.180下的β-酮脂酰-[acp]合酶，例如fabH的基因产物与丙二酰-CoA一起转化；接着由归类于，例如EC1.1.1.-下(例如EC1.1.1.35或EC1.1.1.157)下的3-羟酰-CoA脱氢酶，例如fadB或hbd的基因产物转化为3-羟基-戊二酰-CoA；接着由归类于，例如EC4.2.1.17下的烯酰-CoA水合酶例如crt的基因产物转化为2,3-脱氢戊二酰-CoA甲酯；接着由归类于，例如EC1.3.1.44下的反式-2-烯酰-CoA还原酶例如ter或tdter的基因产物转化为戊二酰-CoA甲酯；接着由归类于，例如EC2.3.1.-下(例如EC2.3.1.41或EC2.3.1.179)下的β-酮脂酰-[acp]合酶例如fabB或fabF的基因产物，或归类于，例如EC2.3.1.16下的β-酮硫解酶例如bktB的基因产物转化为3-氧代庚二酰-CoA甲酯；接着由归类于，例如EC1.1.1.35下的3-羟酰-CoA脱氢酶，例如fadB的基因产物或归类于EC1.1.1.157下例如hbd的基因产物转化为3-羟基-庚二酰-CoA甲酯；接着由归类于，例如EC4.2.1.17下的烯酰-CoA水合酶，例如crt的基因产物转化为2,3-脱氢庚二酰-CoA甲酯；接着由归类于，例如EC1.3.1.44下的反式-2-烯酰-CoA还原酶例如ter或tdter的基因产物转化为庚二酰-CoA甲酯；接着由归类于，例如EC3.1.1.85下的庚二酰-[acp]甲酯酯酶例如bioH的基因产物转化为庚二酰-CoA。见图1C。
使用庚二酰-CoA或庚二酰-[acp]作为中心前体通向庚二酸的途径
在一些实施方案中，庚二酸从中心前体庚二酰-CoA合成，由归类于，例如EC1.2.1.10下的乙酰化醛脱氢酶，例如PduB或PduP的基因产物(见，例如Lan等，2013,EnergyEnviron.Sci.,6:2672–2681)将庚二酰-CoA转化为庚二酸半醛；接着由归类于，例如EC1.2.1.-下的7-氧代庚酸脱氢酶例如ThnG的基因产物，归类于，例如EC1.2.1.-下的6-氧代己酸脱氢酶例如ChnE的基因产物，或归类于例如EC1.2.1.3下的醛脱氢酶转化为庚二酸。见图2。
在一些实施方案中，庚二酸从中心前体庚二酰-CoA合成，由归类于，例如EC3.1.2.-下的硫酯酶例如YciA、tesB(Genbank登录号AAA24665.1,SEQIDNO:1)或Acot13的基因产物将庚二酰-CoA转化为庚二酸。见图2。
在一些实施方案中，庚二酸从中心前体庚二酰-[acp]合成，由归类于，例如EC3.1.2.-下的硫酯酶将庚二酰-[acp]转化为庚二酸，例如由Genbank登录号ABJ63754.1、Genbank登录号CCC78182.1、tesA或fatB编码的基因产物。见图2。
在一些实施方案中，庚二酸从中心前体庚二酰-CoA合成，由CoA-转移酶例如归类于EC2.8.3.12下的戊烯二酸CoA-转移酶将庚二酰-CoA转化为庚二酸。见图2。
在一些实施方案中，庚二酸从中心前体庚二酰-CoA合成，由可逆CoA-连接酶例如归类于EC6.2.1.5下的可逆琥珀酸-CoA连接酶将庚二酰-CoA转化为庚二酸。见图2。
在一些实施方案中，庚二酸从中心前体庚二酸半醛合成，由6-氧代己酸脱氢酶或7-氧代庚酸脱氢酶(归类于例如EC1.2.1.-下)例如ThnG或ChnE的基因产物，或归类于，例如EC1.2.1.3下的醛脱氢酶将庚二酸半醛转化为庚二酸。见图2。
使用庚二酰-CoA或庚二酸半醛作为中心前体通向7-氨基庚酸的途径
在一些实施方案中，7-氨基庚酸从中心前体庚二酰-CoA合成，由归类于，例如EC1.2.1.10下的乙酰化醛脱氢酶，例如PduB或PduP的基因产物将庚二酰-CoA转化为庚二酸半醛；接着由归类于，例如EC2.6.1.18、EC2.6.1.19、EC2.6.1.29、EC2.6.1.48或EC2.6.1.82下的ω-转氨酶将庚二酸半醛转化为7-氨基庚酸。见图3。
在一些实施方案中，7-氨基庚酸从中心前体庚二酸半醛合成，由ω-转氨酶(例如EC2.6.1.18、EC2.6.1.19，或EC2.6.1.48)将庚二酸半醛转化为7-氨基庚酸。见图3。
在一些实施方案中，7-氨基庚酸从中心前体庚二酸合成，由归类于，例如EC1.2.99.6下的羧酸还原酶，例如car的基因产物与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自于枯草芽孢杆菌的sfp基因编码(Genbank登录号CAA44858.1,SEQIDNO:14)或由来自于诺卡氏菌的npt基因编码(Genbank登录号ABI83656.1,SEQIDNO:15))的组合，或来自于灰色链霉菌GriC和GriD的基因产物(Suzuki等，J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)将庚二酸转化为庚二酸半醛；接着由ω-转氨酶(例如EC2.6.1.18、EC2.6.1.19，EC2.6.1.48、EC2.6.1.29、EC2.6.1.82例如SEQIDNOs:8-13)将庚二酸半醛转化为7-氨基庚酸。所述羧酸还原酶可以从，例如海分支杆菌(见Genbank登录号ACC40567.1,SEQIDNO:2)、耻垢分支杆菌(见Genbank登录号ABK71854.1,SEQIDNO:3)、Segniliparusrugosus(见Genbank登录号EFV11917.1,SEQIDNO:4)、耻垢分支杆菌(见Genbank登录号ABK75684.1,SEQIDNO:5)、马赛分枝杆菌(见Genbank登录号EIV11143.1,SEQIDNO:6)或Segniliparusrotundus(见Genbank登录号ADG98140.1,SEQIDNO:7)获得。见图3。
使用7-氨基庚酸、7-羟基庚酸或庚二酸半醛作为中心前体通向庚二胺的途径
在一些实施方案中，庚二胺从中心前体7-氨基庚酸合成，由归类于，例如EC1.2.99.6下的羧酸还原酶，例如car的基因产物(见上文)与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自于枯草芽孢杆菌的sfp基因编码(Genbank登录号CAA44858.1,SEQIDNO:14)或由来自于诺卡氏菌的npt基因编码(Genbank登录号ABI83656.1,SEQIDNO:15))的组合，或GriC和GriD的基因产物将7-氨基庚酸转化为7-氨基庚醛；接着由ω-转氨酶(归类于，例如EC2.6.1.18、EC2.6.1.19、EC2.6.1.29、EC2.6.1.48或EC2.6.1.82下，例如SEQIDs:NOs:8-13，见上文)将7-氨基庚醛转化为庚二胺。见图4。
由car的基因产物编码的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂npt或sfp具有广泛的底物特异性，包括末端双官能的C4和C5羧酸(Venkitasubramanian等，EnzymeandMicrobialTechnology,2008,42,130–137)。
在一些实施方案中，庚二胺从中心前体7-羟基庚酸(其可以如图5中所述产生)合成，由归类于，例如EC1.2.99.6下的羧酸还原酶例如car的基因产物(见上文)与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自于枯草芽孢杆菌的sfp基因或来自于诺卡氏菌的npt基因编码)的组合，或GriC和GriD的基因产物(Suzuki等，J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)将7-羟基庚酸转化为7-羟基庚醛；接着由归类于例如EC2.6.1.18、EC2.6.1.19、EC2.6.1.29、EC2.6.1.48、EC2.6.1.82下的ω-转氨酶例如SEQIDs:NOs:8-13将7-氨基庚醛转化为7-氨基庚醇，见上文；接着由归类于，例如EC1.1.1.-(例如EC1.1.1.1、EC1.1.1.2、EC1.1.1.21、或EC1.1.1.184)下的醇脱氢酶，例如YMR318C(归类于，例如EC1.1.1.2下，见Genbank登录号CAA90836.1)或YqhD的基因产物(来自大肠杆菌，GenBank登录号AAA69178.1)(Liu等，Microbiology,2009,155,2078–2085；Larroy等，2002,BiochemJ.,361(Pt1),163–172；Jarboe,2011,Appl.Microbiol.Biotechnol.,89(2),249-257)，或具有GenBank登录号CAA81612.1的蛋白(来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus))转化为7-氨基庚醛；接着由归类于例如EC2.6.1.18、EC2.6.1.19、EC2.6.1.29、EC2.6.1.48、或EC2.6.1.82下的ω-转氨酶，例如SEQIDNOs:8-13转化为庚二胺，见上文。见图4。
在一些实施方案中，庚二胺从中心前体7-氨基庚酸合成，由N-乙酰基转移酶例如归类于例如EC2.3.1.32下的赖氨酸N-乙酰基转移酶将7-氨基庚酸转化为N7-乙酰-7-氨基庚酸；接着由归类于，例如EC1.2.99.6下的羧酸还原酶，例如car的基因产物(见上文)与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自于枯草芽孢杆菌的sfp基因或来自于诺卡氏菌的npt基因编码)的组合，或GriC和GriD的基因产物转化为N7-乙酰-7-氨基庚醛；接着由归类于，例如EC2.6.1.18、EC2.6.1.19、EC2.6.1.29、EC2.6.1.48、EC2.6.1.46或EC2.6.1.82下的ω-转氨酶例如SEQIDNOs:8-13转化为N7-乙酰-1,7-二氨基庚烷，见上文；接着由归类于例如EC3.5.1.62下的乙酰腐胺脱乙酰基酶转化为庚二胺。见图4。
在一些实施方案中，庚二胺从中心前体庚二酸半醛合成，由归类于例如EC1.2.99.6下的羧酸还原酶例如car的基因产物(见上文)与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自于枯草芽孢杆菌的sfp基因或来自于诺卡氏菌的npt基因编码)的组合，或GriC和GriD的基因产物将庚二酸半醛转化为庚二醛；接着由归类于例如EC2.6.1.18、EC2.6.1.19或EC2.6.1.48下的ω-转氨酶转化为7-氨基庚醛；接着由归类于例如EC2.6.1.18、EC2.6.1.19、EC2.6.1.29、EC2.6.1.48、EC2.6.1.46或EC2.6.1.82下的ω-转氨酶例如SEQIDNOs:8-13转化为庚二胺。见图4。
使用庚二酸和庚二酸半醛作为中心前体通向1,7-庚二醇的途径
在一些实施方案中，7-羟基庚酸从中心前体庚二酸合成，由归类于，例如EC1.2.99.6下的羧酸还原酶，例如car的基因产物(见上文)与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自于枯草芽孢杆菌的sfp基因或来自于诺卡氏菌的npt基因编码)的组合，或GriC和GriD的基因产物将庚二酸转化为庚二酸半醛；接着由归类于，例如EC1.1.1.-下的脱氢酶例如归类于例如EC1.1.1.258下的6-羟基己酸脱氢酶，例如来自ChnD的基因，或归类于例如EC1.1.1.-下的5-羟基戊酸脱氢酶，例如CpnD的基因产物(见，例如Iwaki等，2002,Appl.Environ.Microbiol.,68(11):5671–5684)，或4-羟基丁酸脱氢酶例如gabD(见，例如Lütke-Eversloh&Steinbüchel,1999,FEMSMicrobiologyLetters,181(1):63–71)转化为7-羟基庚酸。见图5。
在一些实施方案中，1,7-庚二醇从中心前体7-羟基庚酸合成，由归类于例如EC1.2.99.6下的羧酸还原酶，例如car的基因产物(见上文)与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自于枯草芽孢杆菌的sfp基因或来自于诺卡氏菌的npt基因编码)的组合，或GriC和GriD的基因产物将7-羟基庚酸转化为7-羟基庚醛；接着由归类于例如EC1.1.1.-例如EC1.1.1.1、EC1.1.1.2、EC1.1.1.21或EC1.1.1.184)下的醇脱氢酶，例如YMR318C或YqhD的基因产物(见，例如Liu等，Microbiology,2009,155,2078–2085；Larroy等，2002,BiochemJ.,361(Pt1),163–172；或Jarboe,2011,Appl.Microbiol.Biotechnol.,89(2),249-257)或具有GenBank登录号CAA81612.1(来自嗜热脂肪土芽孢杆菌)的蛋白将7-羟基庚醛转化为1,7庚二醇。见图6。
培养策略
在一些实施方案中，培养策略需要达到需氧、厌氧或微氧的培养条件。
在一些实施方案中，所述培养策略需要营养限制，例如氮、磷酸盐或氧限制。
在一些实施方案中，可以采用使用例如陶瓷中空纤维膜的细胞保留策略来实现并维持补料分批或连续发酵期间的高细胞密度。
在一些实施方案中，在一种或多种C7结构单元合成中对发酵补料的主要碳源可以源自生物或非生物给料。
在一些实施方案中，生物给料可以是、可以包括或者可以源自单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩酒糟或城市废物。
已经在几种微生物(诸如大肠杆菌、钩虫贪铜菌、食油假单胞菌、恶臭假单胞菌和解脂耶罗维亚酵母)中证明了源自生物柴油生产的粗制甘油的有效分解代谢(Lee等,Appl.Biochem.Biotechnol.,2012,166:1801–1813；Yang等,BiotechnologyforBiofuels,2012,5:13；Meijnen等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,90:885-893)。
已经在几种生物体(诸如钩虫贪铜菌和恶臭假单胞菌)中在经由前体丙酰基-CoA合成3-羟基戊酸中证明了木质纤维素衍生的乙酰丙酸的有效分解代谢(Jaremko和Yu,JournalofBiotechnology,2011,155,2011,293–298；Martin和Prather,JournalofBiotechnology,2009,139,61–67)。
已经在几种微生物(诸如恶臭假单胞菌、钩虫贪铜菌)中证明了木质素衍生的芳香族化合物诸如苯甲酸类似物的有效分解代谢(Bugg等,CurrentOpinioninBiotechnology,2011,22,394–400；Pérez-Pantoja等,FEMSMicrobiol.Rev.,2008,32,736–794)。
已经在几种微生物(包括解脂耶罗维亚酵母)中证明了农业废物(诸如橄榄磨坊废水)的有效利用(Papanikolaou等,Bioresour.Technol.,2008,99(7):2419-2428)。
已经对几种微生物(诸如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌和德氏乳杆菌和乳酸乳球菌)证明了可发酵糖类(诸如源自纤维素、半纤维素、甘蔗和甜菜糖蜜、木薯、玉米和其它农业来源的单糖和二糖)的有效利用(参见例如Hermann等,JournalofBiotechnology,2003,104:155–172；Wee等,FoodTechnol.Biotechnol.,2006,44(2):163–172；Ohashi等,JournalofBioscienceandBioengineering,1999,87(5):647-654)。
已经对钩虫贪铜菌证明了源自多种农业木质纤维素来源的糠醛的有效利用(Li等,Biodegradation,2011,22:1215–1225)。
在一些实施方案中，非生物给料可以是或者可以源自天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸、来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物(NVR)或碱洗废物流、或对苯二甲酸/异酞酸混合物废物流。
已经对甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母证明了甲醇的有效分解代谢。
已经对克鲁佛梭菌证明了乙醇的有效分解代谢(Seedorf等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2008,105(6)2128-2133)。
已经对钩虫贪铜菌证明了CO2和H2(其可以源自天然气和其它化学和石油化学来源)的有效分解代谢(Prybylski等,Energy,SustainabilityandSociety,2012,2:11)。
已经对多种微生物(诸如杨氏梭菌和自产乙醇梭菌)证明了合成气的有效分解代谢(等,AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2011,77(15):5467–5475)。
已经对多种微生物(诸如食酸代尔夫特菌和钩虫贪铜菌证明了来自环己烷过程的非挥发性残留物废物流的有效分解代谢(Ramsay等,AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1986,52(1):152–156)。
在一些实施方案中，宿主微生物是原核生物。例如，原核生物可以是来自以下的细菌：埃希氏菌属如大肠杆菌；梭菌属如杨氏梭菌、自产乙醇梭菌或者克鲁佛梭菌；棒状杆菌属如谷氨酸棒状杆菌；贪铜菌属如钩虫贪铜菌或者耐金属贪铜菌；假单胞菌属如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌或者食油假单胞菌；代尔夫特菌属如食酸代尔夫特菌；芽孢杆菌属如枯草芽胞杆菌；乳杆菌属如德氏乳杆菌；或者乳球菌属如乳酸乳球菌。此类原核生物也可以是构建能够生成一种或多种C7结构单元的本文中描述的重组宿主细胞的基因来源。
在一些实施方案中，宿主微生物是真核生物。例如，真核生物可以是丝状真菌，例如来自曲霉属如黑曲霉的。或者，真核生物可以是酵母，例如来自酵母属如酿酒酵母；来自毕赤氏酵属如巴斯德毕赤酵母；来自耶罗维亚酵母属如解脂耶罗维亚酵母；来自伊萨酵母属如东方伊萨酵母；来自德巴利酵母属如汉逊德巴利酵母；来自Arxula属如Arxulaadenoinivorans；或者来自克鲁维酵母菌属如乳酸克鲁维酵母菌的。此类真核生物也可以是构建能够生成一种或多种C7结构单元的本文中描述的重组宿主细胞的基因来源。
代谢工程
本文件提供方法，所述方法牵涉对所有上述途径描述的少于所有的步骤。这种方法可牵涉例如此类步骤中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或者更多个。在这种方法包含少于所有步骤的情况下，第一个且在一些实施方案中唯一的步骤可为所列步骤中的任何步骤。
此外，本文中描述的重组宿主可以包括上述酶中的任何组合，使得所述步骤中的一个或者多个，例如此类步骤中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多个可以在重组宿主内实施。本文件提供所列出的和基因工程化以表达本文件中列举的任何酶的一种或者多中(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或者更多种)重组形式的任何属和种的宿主细胞。如此，例如，宿主细胞可含有外源核酸，其编码催化本文中描述的任何途径的一个或者多个步骤的酶。
另外，本文件认识到，在酶已经被描述为接受CoA活化的底物的情况下，存在与[acp]结合底物相关的相似的酶活性，其不一定为相同的酶种类。
此外，本文件认识到，在酶已经被描述为接受底物的(R)-对映异构体的情况下，存在与底物的(S)-对映异构体相关的相似的酶活性，其不一定为相同的酶种类。
本文件还认识到，在已经显示酶接受特定辅因子如NADPH或者共底物如乙酰基-CoA的情况下，许多酶在催化特定酶活性中在接受大量不同辅因子或者共底物方面是泛宿主性的(promiscuous)。此外，本文件认识到，在酶对例如特定辅助因子如NADH具有高特异性的情况下，对辅助因子NADPH具有高特异性的具有相似或者相同活性的酶可为不同的酶种类。
在一些实施方案中，本文中概述的途径中的酶是经由非直接或者合理酶设计方法的酶工程的结果，目的在于改善活性、改善特异性、降低反馈抑制、降低阻抑、改善酶溶解度、改变立体特异性，或者改变辅助因子特异性。
在一些实施方案中，可以将本文概述的途径中的酶经由附加型或者染色体整合方法基因给予(即，通过在宿主生物体中具有多个拷贝的基因来过表达)至所得的遗传修饰的生物体中。
在一些实施方案中，可以利用基因组级别(genome-scale)系统生物学技术如通量平衡分析来设计用于将碳流量引导至C7结构单元的基因组级别的弱化或者敲除策略。
弱化策略包括但不限于使用转座子、同源重组(双交叉方法)、诱变、酶抑制剂和RNA干扰(RNAi)。
在一些实施方案中，可以利用通量组(fluxomic)、代谢物组(metabolomic)和转录物组(transcriptomal)数据来告知或者支持基因组级别的系统生物学技术，由此在将碳流量导向C7结构单元中设计基因组级别的弱化或者敲除策略。
在一些实施方案中，宿主微生物的对高浓度的C7结构单元的耐受性可以通过在选择性环境中的连续培养来改善。
在一些实施方案中，可以弱化或增强所述宿主微生物的内源性生物化学网络，来(1)保证乙酰-CoA和丙二酰-CoA的细胞内可用度，(2)创造NADH或NADPH的不平衡，其仅可以通过一种或多种C7结构单元的形成来平衡，(3)阻止通向和包括一种或多种C7结构单元的中心代谢物、中心前体的降解，和/或(4)保证从细胞的高效流出。
在一些要求乙酰-CoA的细胞内可用度用于C7结构单元的合成的实施方案中，可以在宿主生物体弱化催化乙酰-CoA水解的内源性酶，例如短链长度硫酯酶。
在一些要求在一些要求乙酰-CoA和丙酰-CoA的缩合用于C7结构单元的合成的实施方案中，可以弱化一种或多种催化仅乙酰-CoA缩聚为乙酰乙酰-CoA的内源性β-酮硫解酶，例如AtoB或phaA的内源性基因产物。
在一些要求乙酰-CoA的细胞内可用度用于C7结构单元的合成的实施方案中，可以弱化产生乙酸的内源性磷酸转乙酰酶，例如pta(Shen等，Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9):2905–2915)。
在一些要求乙酰-CoA的细胞内可用度用于C7结构单元的合成的实施方案中，可以弱化乙酸合成途径中编码乙酸激酶的内源性基因，例如ack。
在一些要求乙酰-CoA和NADH的细胞内可用度用于C7结构单元的合成的实施方案中，可以弱化编码催化丙酮酸降解为乳酸的酶的内源性基因，例如由ldhA编码的乳酸脱氢酶(Shen等，2011,见上文)。
在一些要求乙酰-CoA和NADH的细胞内可用度用于C7结构单元的合成的实施方案中，可以弱化编码催化磷酸烯醇丙酮酸降解为琥珀酸的酶，例如甲基萘醌-延胡索酸氧化还原酶例如frdBC的基因(见Shen等，2011,见上文)。
在一些要求乙酰-CoA和NADH的细胞内可用度用于C7结构单元的合成的实施方案中，可以弱化编码催化乙酰-CoA降解为乙醇的酶的内源性基因，例如由adhE编码的醇脱氢酶(Shen等，2011,见上文)。
在一些实施方案中，在途径需要过量的NADH辅助因子用于C7结构单元合成的情况下，可以在宿主生物体重过表达重组甲酸脱氢酶基因(Shen等，2011,见上文)。
在一些实施方案中，在途径需要过量的NADH或NADPH辅助因子用于C7结构单元合成的情况下，可以弱化消散所述辅助因子不平衡的内源性转氢酶。
在一些实施方案中，可以弱化编码催化丙酮酸降解为乙醇的酶的内源性基因，例如丙酮酸脱羧酶。
在一些实施方案中，可以弱化编码催化异丁醇的生成的酶的内源性基因，例如2-酮酸脱羧酶。
在一些要求乙酰-CoA的细胞内可用度用于C7结构单元的合成的实施方案中，可以在微生物中过表达重组乙酰-CoA合成酶，例如acs的基因产物(Satoh等，J.BioscienceandBioengineering,2003,95(4):335–341)。
在一些实施方案中，通过弱化内源性葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC5.3.1.9)，可以将碳通量导入戊糖磷酸循环中，来增加NADPH的供给。
在一些实施方案中，通过过表达6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和/或转酮醇酶，可以将可以将碳通量重导入戊糖磷酸循环中，来增加NADPH的供给(Lee等，2003,BiotechnologyProgress,19(5),1444–1449)。
在一些实施方案中，在C7结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅助因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达编码吡啶核苷酸转氢酶的基因例如UdhA(Brigham等，AdvancedBiofuelsandBioproducts,2012,Chapter39,1065-1090)。
在一些实施方案中，在C7结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅助因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因，例如GapN(Brigham等，2012,见上文)。
在一些实施方案中，在C7结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅助因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组苹果酸酶基因，例如maeA或maeB(Brigham等，2012,见上文)。
在一些实施方案中，在C7结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅助因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因，例如zef(Lim等，J.BioscienceandBioengineering,2002,93(6),543-549)。
在一些实施方案中，在C7结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅助因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组果糖1,6-二磷酸酶基因，例如fbp(Becker等，J.Biotechnol.,2007,132:99-109)。
在一些实施方案中，在C7结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅助因子的情况下，可以弱化内源性磷酸丙糖异构酶(EC5.3.1.1)。
在一些实施方案中，在C7结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅助因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组葡萄糖脱氢酶，例如gdh的基因产物(Satoh等，J.BioscienceandBioengineering,2003,95(4):335–341)。
在一些实施方案中，可以弱化促进NADPH转化为NADH的内源性酶，例如可能通过归类于EC1.4.1.2(NADH特异性)和EC1.4.1.4(NADPH特异性)下的谷氨酸脱氢酶的相互转化产生的NADH生成循环。例如，可以弱化NADPH特异性谷氨酸脱氢酶，避免通向C7结构单元的NADH不平衡消散。
在一些实施方案中，可以弱化使用NADH和NADPH两者作为辅助因子的内源性谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.3)。
在一些实施方案中，可以通过与小的可溶蛋白例如麦芽糖结合蛋白一同表达为融合蛋白，来使烯酰-CoA还原酶溶解(Gloerich等，FEBSLetters,2006,580,2092–2096)。
在一些使用天然积累聚羟基链烷酸酯的宿主的实施方案中，在所述宿主菌株中可以弱化内源性聚合物合酶。
在一些实施方案中，可以在宿主中过表达L-丙氨酸脱氢酶，来从丙酮酸再生L-丙氨酸，作为ω-转氨酶反应的氨基供体。
在一些实施方案中，可以在宿主中过表达用来达到辅助因子不平衡的辅助因子特异性的L-谷氨酸脱氢酶，来从2-氧代戊二酸再生L-谷氨酸，作为ω-转氨酶反应的氨基供体。例如，可以过表达NADH-特异性谷氨酸脱氢酶，促进通向C7结构单元的NADH不平衡的消散。
在一些实施方案中，可以弱化降解通向和包括C7结构单元的中心代谢物和中心前体的酶，例如归类于EC1.3.8.62下的庚二酰-CoA脱氢酶；归类于例如EC1.3.8.7或EC1.3.8.1下的酰基-CoA脱氢酶；和/或归类于例如EC1.3.8.6下的戊二酰-CoA脱氢酶。
在一些实施方案中，可以弱化通过辅酶A酯化激活C7结构单元的内源性酶，例如归类于，例如EC6.2.1.14下的CoA-连接酶(例如庚二酰-CoA合成酶)。
在一些实施方案中，可以在宿主中过表达甲醇脱氢酶和甲醛脱氢酶，来允许通过甲酸的甲醇分解代谢。
在一些实施方案中，可以在宿主中过表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶，来生成S-腺苷-L-甲硫氨酸作为丙二酰-[acp]O-甲基转移酶的辅助因子。
在一些实施方案中，C7结构单元穿过细胞膜流出到细胞外基质可以通过对细胞膜遗传工程化结构修饰，或增加与C7结构单元相关的任意转运体的活性来提高或放大。
庚二胺的流出可以通过过表达广泛底物范围多药物转运体来提高或放大，例如来自枯草芽孢杆菌的Blt(Woolridge等，1997,J.Biol.Chem.,272(14):8864–8866)；来自大肠杆菌的AcrB和AcrD(Elkins&Nikaido,2002,J.Bacteriol.,184(23),6490–6499)或来自金黄色酿脓葡萄球菌的NorA(Ng等，1994,AntimicrobAgentsChemother,38(6),1345–1355)或来自枯草芽孢杆菌的Bmr(Neyfakh,1992,AntimicrobAgentsChemother,36(2),484–485)。
7-氨基庚酸和庚二胺的流出可以通过过表达可溶性转运体来提高或放大，例如来自于谷氨酸棒状杆菌的lysE转运体(Bellmann等，2001,Microbiology,147,1765–1774)。
庚二酸的流出可以通过过表达二羧酸转运体来提高或放大，例如来自于谷氨酸棒状杆菌的SucE转运体(Huhn等，Appl.Microbiol.&Biotech.,89(2),327–335)。
使用重组宿主生产C7结构单元
通常，可以通过提供宿主微生物并且用含有如上文描述的合适碳源的培养基培养提供的微生物生成一种或多种C7结构单元。一般地，培养基和/或培养条件可以使得微生物生长至足够的密度，并且有效生成C7结构单元。对于大规模生产工艺，可以使用任何方法，诸如那些在别处描述的(ManualofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology,2ndEdition,Editors:A.L.DemainandJ.E.Davies,ASMPress；andPrinciplesofFermentationTechnology,P.F.StanburyandA.Whitaker,Pergamon)。简言之，用特定的微生物接种含有合适培养基的大罐(例如，100加仑，200加仑，500加仑，或更大的罐)。在接种后，温育微生物以容许生成生物量。一旦达到期望的生物量，可以将含有微生物的培养液转移到第二个罐。此第二个罐可以是任何大小。例如，第二个罐可以比/与第一个罐大、小或相同大小。通常，第二个罐大于第一个，从而可以对来自第一个罐的培养液添加额外的培养基。另外，此第二个罐内的培养基可以与第一个罐中使用的培养基相同或不同。
一旦转移，可以温育微生物以容许生成C7结构单元。一旦生成，可以使用任何方法来分离C7结构单元。例如，可以经由吸附方法从发酵液选择性回收C7结构单元。在庚二酸和7-氨基庚酸的情况中，所得的洗脱液可以经由蒸发进一步浓缩，经由蒸发和/或冷却结晶来结晶，并且经由离心回收晶体。在庚亚甲基二胺和1,7-庚二醇的情况中，可以采用蒸馏来实现期望的产物纯度。
本发明在以下实施例中进一步描述，所述实施例不限制权利要求书中描述的本发明范围。
实施例
实施例1：硫酯酶使用庚二酰-CoA作为底物并形成庚二酸的酶活性
编码N端His标签的序列加到来自于大肠杆菌的编码硫酯酶的tesB基因(SEQIDNO1，见图7)，使得可以产生N端HIS标记的硫酯酶。所述修饰的tesB基因克隆到pET15b表达载体中，在T7启动子的控制下。所述表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。所得的重组大肠杆菌菌株在含有50mLLuriaBroth(LB)培养基和抗生素选择压力的500mL摇瓶中在37℃培养，在230rpm下振荡。所述培养物使用0.5mMIPTG在17℃诱导过夜。
通过离心从所述诱导的摇瓶培养物收获团粒。所述团粒重悬并裂解于Y-perTM溶液中(ThermoScientific,Rockford,IL)。通过离心将细胞碎片从上清分离。使用Ni-亲和层析从所述上清纯化硫酯酶，洗出液通过超滤进行缓冲液交换并浓缩。
酶活性试验以一式三份在由50mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)、0.1mMEllman’s试剂和667μM的庚二酰-CoA(作为底物)组成的缓冲液中进行。通过向所述含有庚二酰-CoA的试验缓冲液中加入0.8μMtesB基因产物起始酶活性试验反应，并在37℃孵育20分钟。辅酶A的释放通过在412nm处的吸光度来监控。从活性酶试验的吸光度减去与只有底物的对照相关的吸光度，所述对照含有经煮沸的酶，并与空载体对照比较。tesB基因产物接受庚二酰-CoA作为底物通过相对分光光度法确定(见图8)，并合成庚二酸作为反应产物。
实施例2：使用庚二酸半醛作为底物并且形成7-氨基庚酸的ω-转氨酶的酶活性
将编码N-末端His标签的序列添加至分别编码SEQIDNO:8、10、11和13的ω-转氨酶的来自紫色色杆菌、丁香假单胞菌、球形红杆菌、和河流弧菌的基因(参见图7)，使得可以产生N-末端有HIS标签的ω-转氨酶。将每种所得的经修饰基因在T7启动子的控制下克隆入pET21a表达载体中，并且将每种表达载体转化入BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。于37℃在含有50mLLB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶培养物中在以230rpm摇动的情况中培养所得的重组大肠杆菌菌株。使用1mMIPTG于16℃诱导每种培养物过夜。
经由离心收获来自每种经诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每个团粒，并经由超声处理裂解。经由离心分开细胞碎片与上清液，并且立即在酶活性测定法中使用无细胞提取物。
在缓冲液中实施逆向(即7-氨基庚酸至庚二酸半醛)的酶活性测定法，所述缓冲液由终浓度50mMHEPES缓冲液(pH＝7.5)、10mM7-氨基庚酸、10mM丙酮酸和100μM吡哆(pyridoxyl)5’磷酸盐组成。通过添加ω-转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物到含有7-氨基庚酸的测定缓冲液启动每个酶活性测定反应，并在以250rpm摇动的情况下于25℃温育4小时。经由RP-HPLC量化从丙酮酸形成L-丙氨酸。
每种没有7-氨基庚酸的仅酶对照表明丙酮酸至L-丙氨酸的低基线转化。参见图14。SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO11和SEQIDNO13的基因产物接受7-氨基庚酸作为底物，如相对于空载体对照确认的。参见图15。
对SEQIDNO10、SEQIDNO11和SEQIDNO13的转氨酶确认正向(即庚二酸半醛至7-氨基庚酸)的酶反应。在缓冲液中实施酶活性测定法，所述缓冲液由终浓度50mMHEPES缓冲液(pH＝7.5)、10mM庚二酸半醛、10mML-丙氨酸和100μM吡哆5’磷酸盐组成。通过添加ω-转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物到含有庚二酸半醛的测定缓冲液启动每个酶活性测定反应，并在以250rpm摇动的情况下于25℃温育4小时。经由RP-HPLC量化丙酮酸的形成。
SEQIDNO10、SEQIDNO11和SEQIDNO13的基因产物接受庚二酸半醛作为底物，如相对于空载体对照确认的。参见图16。确认ω-转氨酶活性的可逆性，证明了SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO11、和SEQIDNO13的ω-转氨酶接受庚二酸半醛作为底物，并且合成7-氨基庚酸作为反应产物。
实施例3：羧酸还原酶使用庚二酸作为底物并形成庚二酸半醛的酶活性
将编码HIS标签的序列添加至分别编码SEQIDNO:4和7的羧酸还原酶的来自Segniliparusrugosus和Segniliparusrotundus的基因(参见图7)，使得可以生成N-末端有HIS标签的羧酸还原酶。将每种经修饰的基因与编码有HIS标签的来自枯草芽孢杆菌的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶一起(两者都在T7启动子下)克隆入pETDuet表达载体中。将每种表达载体转化入BL21[DE3]大肠杆菌宿主，并且于37℃在含有50mLLB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶培养物中在以230rpm摇动的情况中培养所得的重组大肠杆菌菌株。使用自身诱导培养基于37℃诱导每种培养物过夜。
经由离心收获来自每种经诱导的摇瓶培养物的团粒。重选每个团粒，并经由超声处理裂解，并经由离心分开细胞碎片与上清液。使用Ni-亲和层析从上清液中纯化羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，以10倍稀释入50mMHEPES缓冲液(pH＝7.5)中，并经由超滤浓缩。
在缓冲液中一式三份实施酶活性测定法(即从庚二酸盐至庚二酸半醛)，所述缓冲液由终浓度50mMHEPES缓冲液(pH＝7.5)、2mM庚二酸、10mMMgCl2、1mMATP和1mMNADPH组成。通过添加纯化的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因产物或空载体对照至含有庚二酸的测定缓冲液启动每个酶活性测定反应，然后于室温温育20分钟。通过于340nm的吸光度监测NADPH的消耗。每种没有庚二酸的仅酶对照表明NADPH的低基线消耗。参见图9。
SEQIDNO4和SEQIDNO7的基因产物(得到sfp的基因产物增强)接受庚二酸作为底物，如相对于空载体对照确认的(参见图10)，并且合成庚二酸半醛。
实施例4：羧酸还原酶使用7-羟基庚酸作为底物并形成7-羟基庚醛的酶活性
将编码His标签的序列添加至分别编码SEQIDNO:2-7的羧酸还原酶的来自海分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、Segniliparusrugosus、耻垢分枝杆菌、马赛分枝杆菌、和Segniliparusrotundus的基因(参见图7)，使得可以生成N-末端有HIS标签的羧酸还原酶。将每种经修饰的基因与编码有His标签的来自枯草芽孢杆菌的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶一起(两者都在T7启动子下)克隆入pETDuet表达载体中。
将每种表达载体转化入BL21[DE3]大肠杆菌宿主中，并于37℃在含有50mLLB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶培养物中在以230rpm摇动的情况中培养所得的重组大肠杆菌菌株。使用自身诱导培养基于37℃诱导每种培养物过夜。
经由离心收获来自每种经诱导的摇瓶培养物的团粒。重选每个团粒，并经由超声处理裂解。经由离心分开细胞碎片与上清液。使用Ni-亲和层析从上清液中纯化羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，以10倍稀释入50mMHEPES缓冲液(pH＝7.5)中，并经由超滤浓缩。
在缓冲液中一式三份实施酶活性测定法(即从7-羟基庚酸至7-羟基庚醛)，所述缓冲液由终浓度50mMHEPES缓冲液(pH＝7.5)、2mM7-羟基庚醛、10mMMgCl2、1mMATP和1mMNADPH组成。通过添加纯化的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶或空载体对照至含有7-羟基庚酸的测定缓冲液启动每个酶活性测定反应，然后于室温温育20分钟。通过于340nm的吸光度监测NADPH的消耗。每种没有7-羟基庚酸的仅酶对照表明NADPH的低基线消耗。参见图9。
SEQIDNO2-7的基因产物(得到sfp的基因产物增强)接受7-羟基庚酸作为底物，如相对于空载体对照确认的(参见图11)，并且合成7-羟基庚醛。
实施例5：ω-转氨酶对于7-氨基庚醇形成7-氧代庚醇的酶活性
将编码N-末端His标签的核苷酸序列添加至分别编码SEQIDNO:8、10、和11的ω-转氨酶的来自紫色色杆菌、丁香假单胞菌、和球形红杆菌基因(参见图7)，使得可以产生N-末端有HIS标签的ω-转氨酶。将经修饰基因在T7启动子的控制下克隆入pET21a表达载体中。将每种表达载体转化入BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。于37℃在含有50mLLB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶培养物中在以230rpm摇动的情况中培养每种所得的重组大肠杆菌菌株。使用1mMIPTG于16℃诱导每种培养物过夜。
经由离心收获来自每种经诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每个团粒，并经由超声处理裂解。经由离心分开细胞碎片与上清液，并且立即在酶活性测定法中使用无细胞提取物。
在缓冲液中实施逆向(即7-氨基庚醇至7-氧代庚醇)的酶活性测定法，所述缓冲液由终浓度50mMHEPES缓冲液(pH＝7.5)、10mM7-氨基庚醇、10mM丙酮酸和100μM吡哆5’磷酸盐组成。通过添加ω-转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物到含有7-氨基庚醇的测定缓冲液启动每个酶活性测定反应，并在以250rpm摇动的情况下于25℃温育4小时。经由RP-HPLC量化L-丙氨酸形成。
每种没有7-氨基庚醇的仅酶具有丙酮酸至L-丙氨酸的低基线转化。参见图14。
SEQIDNO8、10和11的基因产物接受7-氨基庚醇作为底物，如相对于空载体对照确认的(参见图19)，并且合成7-氧代庚醇作为反应产物。鉴于ω-转氨酶活性的可逆性(参见实施例2)，可以推断SEQID8、10和11的基因产物接受7-氧代庚醇作为底物，并且形成7-氨基庚醇。
实施例6：ω-转氨酶使用庚二胺作为底物并形成7-氨基庚醛的酶活性
将编码N-末端His标签的序列添加至分别编码SEQIDNO:8-13的ω-转氨酶的紫色色杆菌、铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、球形红杆菌、大肠杆菌、和河流弧菌基因(参见图7)，使得可以产生N-末端有HIS标签的ω-转氨酶。将经修饰基因在T7启动子的控制下克隆入pET21a表达载体中。将每种表达载体转化入BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。于37℃在含有50mLLB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶培养物中在以230rpm摇动的情况中培养每种所得的重组大肠杆菌菌株。使用1mMIPTG于16℃诱导每种培养物过夜。
经由离心收获来自每种经诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每个团粒，并经由超声处理裂解。经由离心分开细胞碎片与上清液，并且立即在酶活性测定法中使用无细胞提取物。
在缓冲液中实施逆向(即庚二胺至7-氨基庚醛)的酶活性测定法，所述缓冲液由终浓度50mMHEPES缓冲液(pH＝7.5)、10mM庚亚甲基二胺、10mM丙酮酸和100μM吡哆5’磷酸盐组成。通过添加ω-转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物到含有庚二胺的测定缓冲液启动每个酶活性测定反应，并在以250rpm摇动的情况下于25℃温育4小时。经由RP-HPLC量化L-丙氨酸形成。
每种没有庚二胺的仅酶具有丙酮酸至L-丙氨酸的低基线转化。参见图14。
SEQIDNO8-13的基因产物接受庚二胺作为底物，如相对于空载体对照确认的(参见图17)，并且合成7-氨基庚醛作为反应产物。鉴于ω-转氨酶活性的可逆性(参见实施例2)，可以推断SEQID8–13的基因产物接受7-氨基庚醛作为底物，并且形成庚二胺。
实施例7：羧酸还原酶对于N7-乙酰-7-氨基庚酸形成N7-乙酰-7-氨基庚醛的酶活性
一式三份在缓冲液中测定用于将N7-乙酰基-7-氨基庚酸转化成N7-乙酰基-7-氨基庚醛的N末端有His标签的SEQIDNO:3、6、和7的羧酸还原酶的活性(参见实施例4，及图7)，所述缓冲液由终浓度50mMHEPES缓冲液(pH＝7.5)、2mMN7-乙酰基-7-氨基庚酸、10mMMgCl2、1mMATP、和1mMNADPH组成。通过添加纯化的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶或空载体对照至含有N7-乙酰基-7-氨基庚酸的测定缓冲液启动测定法，然后于室温温育20分钟。通过于340nm的吸光度监测NADPH的消耗。每种没有N7-乙酰基-7-氨基庚酸的仅酶对照表明NADPH的低基线消耗。参见图9。
SEQIDNO3、6、和7的基因产物(其得到sfp的基因产物增强)接受N7-乙酰基-7-氨基庚酸作为底物，如相对于空载体对照确认的(参见图12)，并且合成N7-乙酰基-7-氨基庚醛。
实施例8：ω-转氨酶使用N7-乙酰-1,7-二氨基庚烷并形成N7-乙酰-7-氨基庚醛的酶活性
在缓冲液中测定用于将N7-乙酰基-1,7-二氨基庚烷转化成N7-乙酰基-7-氨基庚醛的N末端有His标签的SEQIDNO:8-13的ω-转氨酶的活性(参见实施例6，及图7)，所述缓冲液由终浓度50mMHEPES缓冲液(pH＝7.5)、10mMN7-乙酰基-1,7-二氨基庚烷、10mM丙酮酸和100μM吡哆5’磷酸盐组成。通过添加ω-转氨酶或空载体对照的无细胞提取物至含有N7-乙酰基-1,7-二氨基庚烷的测定缓冲液启动每种酶活性测定反应，然后在以250rpm摇动的情况中于25℃温育4分钟。经由RP-HPLC量化L-丙氨酸的形成。
每种没有N7-乙酰基-1,7-二氨基庚烷的仅酶对照表明丙酮酸至L-丙氨酸的低基线转化。参见图14。
SEQIDNO:8–13的基因产物接受N7-乙酰基-1,7-二氨基庚烷作为底物，如相对于空载体对照确认的(参见图18)，并且合成N7-乙酰基-7-氨基庚醛作为反应产物。
鉴于ω-转氨酶活性的可逆性(参见实施例2)，SEQIDNO:8-13的基因产物接受N7-乙酰基-7-氨基庚醛作为底物，形成N7-乙酰基-1,7-二氨基庚烷。
实施例9：羧酸还原酶使用庚二酸半醛作为底物并形成庚二醛的酶活性
使用庚二酸半醛作为底物测定N-末端有His标签的SEQIDNO7的羧酸还原酶(参见实施例4和图7)。一式三份在缓冲液中实施酶活性测定法，所述缓冲液由终浓度50mMHEPES缓冲液(pH＝7.5)、2mM庚二酸半醛、10mMMgCl2、1mMATP、和1mMNADPH组成。通过添加纯化的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶或空载体对照至含有庚二酸半醛的测定缓冲液启动测定法，然后于室温温育20分钟。通过于340nm的吸光度监测NADPH的消耗。每种没有庚二酸半醛的仅酶对照表明NADPH的低基线消耗。参见图9。
SEQIDNO7的基因产物(其得到sfp的基因产物增强)接受庚二酸半醛作为底物，如相对于空载体对照确认的(参见图13)，并且合成庚二醛。
实施例10：庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶使用庚二酰-CoA甲酯作为底物并形成庚二酰-CoA的酶活性
编码C端His标签的核苷酸序列加到来自大肠杆菌编码SEQIDNO:17的庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶的基因(见图7)使得能够产生C端HIS标记的庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶。所得的修饰基因克隆到pET28+表达载体中，在T7启动子的控制下，所述表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。所得的重组大肠杆菌菌株在含有100mL的LB培养基和抗生素选择压力的500mL摇瓶中在37℃培养，在230rpm振荡。每个培养物使用0.3mMIPTG在18℃诱导过夜。
通过离心从每个诱导的摇瓶培养物收获团粒。每份团粒重悬并通过超声裂解。通过离心将细胞碎片从上清分离。所述庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶使用Ni-亲和层析从所述上清中纯化，通过超滤更换缓冲液并浓缩到20mMHEPES缓冲液中(pH＝7.5)。
将庚二酰-CoA甲酯转化为庚二酰-CoA的酶活性测定法以一式三份在包含终浓度为25mM的Tris:HCl缓冲液(pH＝7.0)和5[mM]庚二酰-CoA甲酯的缓冲液中进行。所述酶活性试验通过向含有庚二酰-CoA甲酯的试验缓冲液中加入终浓度为10[μM]的庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶起始，并在30℃孵育1小时，在250rpm振荡。庚二酰-CoA的形成通过LC-MS定量。
只有底物没有酶的对照显示了没有底物庚二酰-CoA甲酯转化为庚二酰-CoA。见图20。通过LC-MS确定了SEQIDNO.17的庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶接受庚二酰-CoA甲酯作为底物，并合成庚二酰-CoA作为反应产物。见图20。
其它实施例
应理解的是，尽管协同发明的具体描述描述了本发明，但是前面的描述意图说明并且不限制发明的范围，发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和修改也在权利要求的范围内。

Claims (40)

1.一种用于生物合成选自下组的产物的方法：庚二酸、7-氨基庚酸、7-羟基庚酸、庚二胺和1,7-庚二醇，所述方法包括从(i)乙酰-CoA和丙二酰-CoA通过两个甲酯保护的(shielded)碳链延伸循环或(ii)丙二酰-[acp]通过两个甲酯保护的碳链延伸循环酶促合成七碳链脂族主链，以及在所述主链中酶促形成两个选自下组的末端官能团：羧基、胺和羟基基团，从而形成所述产物。
2.权利要求1的方法，其中所述七碳链脂族主链是庚二酰-[acp]或庚二酰-CoA。
3.权利要求1或2的方法，其中丙二酰-[acp]O-甲基转移酶将丙二酰-CoA转化为丙二酰-CoA甲酯，或将丙二酰-[acp]转化为丙二酰-[acp]甲酯。
4.权利要求3的方法，其中所述两个碳链延伸循环的每一个包括使用(i)β-酮脂酰-[acp]合酶或β-酮硫解酶，(ii)3-氧酰-[acp]还原酶、乙酰乙酰-CoA还原酶、3-羟酰-CoA脱氢酶，或3-羟基丁酰-CoA脱氢酶，(iii)烯酰-CoA水合酶或3-羟酰-[acp]脱水酶，和(iv)烯酰-[acp]还原酶或反式-2-烯酰-CoA还原酶，来从丙二酰-[acp]甲酯生产庚二酰-[acp]甲酯，或从丙二酰-CoA甲酯生产庚二酰-CoA甲酯。
5.权利要求4的方法，其中庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶从庚二酰-CoA甲酯或庚二酰-[acp]甲酯中移除甲基基团。
6.权利要求3-5任一项的方法，其中所述丙二酰-[acp]O-甲基转移酶与列于SEQIDNO:16中的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
7.权利要求5或6的方法，其中所述庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶与列于SEQIDNO:17中的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述两个末端官能团是相同的。
9.权利要求1-7任一项的方法，其中所述两个末端官能团是不同的。
10.权利要求9的方法，其中所述产物包含末端胺和末端羧基基团。
11.权利要求9的方法，其中所述产物包含末端羟基基团和末端羧基基团。
12.权利要求1-8任一项的方法，其中所述两个末端官能团是胺。
13.权利要求1-8任一项的方法，其中所述两个末端官能团是羟基基团。
14.权利要求11或13的方法，其中6-羟基己酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶、4-羟基丁酸脱水酶或醇脱氢酶酶促形成羟基基团。
15.权利要求1-10任一项的方法，其中硫酯酶、醛脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶、戊烯二酸CoA-转移酶，或可逆琥珀酰-CoA连接酶酶促形成末端羧基基团。
16.权利要求15的方法，其中所述硫酯酶与列于SEQIDNO:1中的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
17.权利要求10或12的方法，其中ω-转氨酶或脱乙酰基酶酶促形成所述胺基团。
18.权利要求17的方法，其中所述ω-转氨酶与列于SEQIDNO:8-13中任一项的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
19.权利要求1-11任一项的方法，其中由磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶增强的羧酸还原酶形成末端醛基团作为形成所述产物的中间物。
20.权利要求19的方法，其中所述羧酸还原酶与列于SEQIDNO.2-7中任一项的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
21.前述权利要求任一项的方法，其中所述方法通过发酵在重组宿主中进行。
22.权利要求21的方法，其中所述宿主经历需氧、厌氧、微氧或混合的氧/反硝化培养条件下的培养策略。
23.权利要求21或22的方法，其中所述宿主在营养限制的条件下培养。
24.根据权利要求21-23任一项的方法，其中所述宿主使用陶瓷中空纤维膜保留以维持发酵期间的高细胞密度。
25.权利要求21-24任一项的方法，其中对发酵进料的主要碳源衍生自生物或非生物给料。
26.权利要求25的方法，其中所述生物给料是以下物质，或衍生自以下物质：单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸、甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩的酒糟可溶物，或城市废物。
27.权利要求25的方法，其中所述非生物给料是以下物质，或衍生自以下物质：天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸、来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物(NVR)碱洗废物流，或对苯二甲酸/异酞酸混合物废物流。
28.权利要求21-27任一项的方法，其中所述宿主是原核生物。
29.权利要求28的方法，其中所述原核生物来自埃希氏菌属(Escherichia)如大肠杆菌(Escherichiacoli)；来自梭菌属(Clostridia)如杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)或者克鲁佛梭菌(Clostridiumkluyveri)；来自棒状杆菌属(Corynebacteria)如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)；来自贪铜菌属(Cupriavidus)如钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)或者耐金属贪铜菌(Cupriavidusmetallidurans)；来自假单胞菌属(Pseudomonas)如荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)或者食油假单胞菌(Pseudomonasoleavorans)；来自代尔夫特菌属(Delftia)如食酸代尔夫特菌(Delftiaacidovorans)；来自芽孢杆菌属(Bacillus)如枯草芽胞杆菌(Bacillussubtillis)；来自乳杆菌属(Lactobacillus)如德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)；或者来自乳球菌属(Lactococcus)如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)或来自红球菌属(Rhodococcus)如马红球菌(Rhodococcusequi)。
30.权利要求21-27任一项的方法，其中所述宿主是真核生物。
31.权利要求30的方法，其中所述真核生物来自曲霉属(Aspergillus)如黑曲霉(Aspergillusniger)；来自酵母属(Saccharomyces)如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；来自毕赤酵母属(Pichia)如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)；来自耶罗维亚酵母属(Yarrowia)如解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)；来自伊萨酵母属(Issatchenkia)如东方伊萨酵母(Issathenkiaorientalis)；来自德巴利酵母属(Debaryomyces)如汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)；来自Arxula属如Arxulaadenoinivorans；或者来自克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)如乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyceslactis)。
32.权利要求21的方法，其中所述宿主对高浓度C7结构单元的耐受通过在选择环境中连续培养改善。
33.权利要求21-32任一项的方法，其中所述宿主含有一种或多种以下弱化的酶：聚羟基链烷酸酯合酶、乙酰-CoA硫酯酶、乙酰-CoA特异性β-酮硫解酶、形成乙酸的磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、乳酸脱氢酶、甲基萘醌(menaquinol)-延胡索酸氧化还原酶、生成异丁醇的2-酮酸脱羧酶、形成乙醇的醇脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、丙酮酸脱羧酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、消散NADH或NADPH不平衡的谷氨酸脱氢酶、NADH/NADPH利用型谷氨酸脱氢酶、庚二酰-CoA脱氢酶；接受C7结构单元和中心前体作为底物的酰基-CoA脱氢酶；戊二酰-CoA脱氢酶；或庚二酰-CoA合成酶。
34.权利要求21、32和33任一项的方法，其中所述宿主过表达编码以下物质的一种或多种基因：乙酰-CoA合成酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶；转酮醇酶；吡啶(puridine)核苷酸转氢酶；甲酸脱氢酶；甘油醛-3P-脱氢酶；苹果酸酶；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；果糖1,6二磷酸酶；L-丙氨酸脱氢酶；用于产生辅助因子不平衡的NADH或NDDPH特异性L-谷氨酸脱氢酶；甲醇脱氢酶、甲醛脱氢酶、二胺转运体；二羧酸转运体；S-腺苷甲硫氨酸合成酶；和/或多药物转运体。
35.一种重组宿主，其包含至少一种编码以下物质的外源性核酸：(i)丙二酰-[acp]O-甲基转移酶，(ii)β-酮脂酰-[acp]合酶或β-酮硫解酶，(iii)3-氧代酰基-[acp]还原酶、乙酰乙酰-CoA还原酶、3-羟酰-CoA脱氢酶，或3-羟基丁酰-CoA脱氢酶，(iv)烯酰-CoA水合酶或3-羟酰-[acp]脱水酶，(v)烯酰-[acp]还原酶或反式-2-烯酰-CoA还原酶，和(vi)庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶，所述宿主生产庚二酰-[acp]或庚二酰-CoA。
36.权利要求35的任一种重组宿主，所述宿主包含至少一种编码以下一种或多种酶的外源性核酸：硫酯酶、醛脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶、戊烯二酸CoA-转移酶、可逆琥珀酰-CoA连接酶、乙酰化醛脱氢酶或羧酸还原酶，所述宿主生产庚二酸或庚二酸半醛。
37.权利要求36的重组宿主，所述宿主包含至少一种编码ω-转氨酶的外源性基因，所述宿主生产7-氨基庚酸。
38.权利要求36的重组宿主，所述宿主进一步包含一种或多种以下酶：4-羟基丁酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶或6-羟基己酸脱氢酶，所述宿主生产7-羟基庚酸。
39.权利要求35-38任一项的重组宿主，所述宿主进一步包含至少一种编码ω-转氨酶、脱乙酰基酶、N-乙酰转移酶或醇脱氢酶的外源性核酸，所述宿主生产庚二胺。
40.权利要求38的重组宿主，所述宿主进一步包含至少一种编码以下物质的外源性核酸：(i)由磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶增强的羧酸还原酶或(ii)醇脱氢酶，所述宿主生产1,7-庚二醇。
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