EA018381B1 - Синтез эфиров или тиоэфиров адипата - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение касается способа получения сложных эфиров или тиоэфиров адипата. Изобретение также касается способа получения адипиновой кислоты из данных эфиров или тиоэфиров. Изобретением также предусмотрен ряд способов получения промежуточных соединений для данных эфиров или тиоэфиров. Также изобретение касается способа получения 6-аминокапроновой кислоты (6-АСА), способа получения 5-формилвалериановой кислоты (5-FVA) и способа получения капролактама. Кроме того, изобретение касается клеток хозяина для применения в способах по изобретению.

Description

Настоящее изобретение касается способа получения сложных эфиров или тиоэфиров адипата. Изобретение также касается способа получения адипиновой кислоты из данных эфиров или тиоэфиров. Изобретением также предусмотрен ряд способов получения промежуточных соединений для данных эфиров или тиоэфиров. Также изобретение касается способа получения 6-аминокапроновой кислоты (6-АСА), способа получения 5-формилвалериановой кислоты (5-ЕУА) и способа получения капролактама. Кроме того, изобретение касается клеток хозяина для применения в способах по изобретению.

018381 В1

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается способа получения сложных эфиров или тиоэфиров адипата. Изобретение также касается способа получения адипиновой кислоты из данных эфиров или тиоэфиров. Изобретением также предусмотрен ряд способов получения промежуточных соединений для данных эфиров или тиоэфиров. Также изобретение касается способа получения 6-аминокапроновой кислоты (6-АСА), способа получения 5-формилвалериановой кислоты (5-РУА) и способа получения капролактама. Кроме того, изобретение касается клеток-хозяев для применения в способах по изобретению.

Сведения о предшествующем уровне техники

Адипиновая кислота (гександионовая кислота) применяется, среди прочего, для получения полиамида. Кроме того, эфиры адипиновой кислоты могут применяться в пластификаторах, смазывающих веществах, растворителях и в ряде полиуретановых смол. Другие применения адипиновой кислоты - в качестве пищевых подкислителей, а также в адгезивах, инсектицидах, при дублении и окрашивании. Известные способы получения включают окисление циклогексанола или циклогексанона либо их смеси (КА-масла) с помощью азотной кислоты.

Капролактам - это лактам, который тоже может применяться для получения полиамида, к примеру, нейлона-6 или сополимеров капролактама-лауролактама (нейлона-6,12). Известны различные способы получения капролактама из валовых химикатов, которые включают получение капролактама из циклогексанона, толуола, фенола, циклогексанола, бензола или циклогексана.

Промежуточные соединения для получения адипиновой кислоты или капролактама, как-то циклогексанол, циклогексанон или фенол, обычно получают из минерального масла (нефти). Ввиду все возрастающего стремления к получению материалов при помощи более восполняемой технологии было бы желательно обеспечить способ, в котором адипиновая кислота или капролактам получается из такого промежуточного соединения, которое можно получать из биологически возобновляемого источника либо по крайней мере из такого промежуточного соединения, которое превращается в адипиновую кислоту или капролактам биохимическим способом.

В И8 5487987 описан способ получения адипиновой кислоты, в котором используются бактериальные клетки, при этом источник углерода подвергается превращению в 3-дегидрошикимат под действием ферментов общего пути биосинтеза ароматических аминокислот бактериальной клетки с образованием цис, цис-муконовой кислоты при биокаталитическом превращении 3-дегидрошикимата. После этого цис, цис-муконовая кислота подвергается химическому восстановлению (с помощью платинового катализатора) с образованием адипиновой кислоты. Таким образом, на конечной стадии требуется химический катализ. Кроме того, авторы настоящего изобретения предвидят, что образующиеся в бактериальных клетках ароматические промежуточные продукты могут быть токсичными для клеток, из-за чего их концентрации должны быть низкими ίη νίνο, а также в культуре клеток.

Известно получение капролактама из 6-аминокапроновой кислоты (6-АСА), например, как описано в И8-А 6194572. Как изложено в \УО 2005/068643, 6-АСА можно получить биохимическим способом путем превращения 6-аминогекс-2-еновой кислоты (6-АНЕА) в присутствии фермента, обладающего α,β-еноатредуктазной активностью. 6-АНЕА можно получить из лизина, например, биохимическим способом или чисто химическим синтезом. Хотя 6-АСА и можно получить путем восстановления 6-АНЕА способами, изложенными в \УО 2005/068643, но авторы изобретения обнаружили, что - в условиях восстановительной реакции - 6-АНЕА может спонтанно и практически необратимо подвергаться циклизации с образованием нежелательного побочного продукта-β-гомопролина. Такая циклизация может стать узким местом при получении 6-АСА и привести к существенному снижению выхода.

Целью изобретения является получение нового способа получения адипиновой кислоты или капролактама - которые могут использоваться, среди прочего, для получения полиамида - либо промежуточного соединения для адипиновой кислоты или капролактама, который может послужить альтернативой известным способам.

Другой целью является получение нового способа, который мог бы преодолеть один или несколько недостатков, указанных выше.

Одна или несколько других задач, которые могут быть решены в соответствии с изобретением, станут видны из нижеследующего описания.

Сущность изобретения

Авторы изобретения поняли, что адипат (либо его эфир или тиоэфир) может быть получен из сукцината (либо его эфира или тиоэфира). В частности, они решили, что (тио)эфир адипата может быть получен из (тио)эфира сукцината и (тио)эфира ацетата через серию специфических реакций, например, аналогично обратной последовательности β-окисления и биосинтеза жирных кислот в живых клетках, как показано на фиг. 2. При этом каждый В независимо означает активирующую группу (способствующую реакции), например, как описано ниже. Каждый X независимо означает 8 или О. ΕΌ/ΕΌΗ₂ обозначают окисленные/восстановленные доноры электронов, к примеру, ΝΑΟ/ΝΑΟΗ, ΝΑΟΡ/ ΝΑΟΡΗ, РАО/ РАОН₂ или окисленный ферредоксин/восстановленный ферредоксин. Фактический перенос электронов может происходить непосредственно либо при помощи промежуточных переносчиков электронов типа кофер

- 1 018381 ментов или переносящих электроны флавопротеидов (ЕТЕ). Υ-ΝΗ₂ обозначает донора аминогрупп, например, как описано ниже.

Итак, авторы изобретения пришли к выводу, что адипиновую кислоту (либо её эфир или тиоэфир) можно будет получить биокаталитическим путем через каскад реакций из сукцината (либо его эфира или тиоэфира) и ацетата (либо его эфира или тиоэфира). Далее они поняли, что адипиновую кислоту биокаталитическим путем можно превратить в 5-формилпентановую кислоту (5-ЕУА, 5-формилвалериановую кислоту), которая является промежуточным соединением для получения 6-АСА, причем для этого превращения можно использовать специфический биокатализатор.

Соответственно, настоящее изобретение касается способа получения эфиров или тиоэфиров адипата из эфиров или тиоэфиров сукцината посредством нескольких реакций, причем по крайней мере одна из этих реакций катализируется биокатализатором.

В частности, изобретение касается способа получения эфиров адипата или тиоэфиров адипата, включающего превращение эфира 2,3-дегидроадипата (название по системе ГОРАС: 5-карбокси-2пентаноат) или тиоэфира 2,3-дегидроадипата в эфир или тиоэфир адипата в присутствии биокатализатора.

При упоминании карбоновых кислот или карбоксилатов, например, 6-АСА, других аминокислот, 5ЕУА, адипиновой кислоты/адипата, янтарной кислоты/сукцината, уксусной кислоты/ацетата, эти термины должны охватывать протонированную карбоновую кислоту (свободную кислоту), соответствующий карбоксилат (её сопряжённое основание), а также их соли, если не указано иначе. При упоминании аминокислот, например 6-АСА, этот термин должен охватывать аминокислоты в виде цвиттерионов (у которых аминогруппа протонирована, а карбоксигруппа депротонирована), аминокислоты, у которых аминогруппа протонирована, а карбоксигруппа нейтральна, и аминокислоты, у которых аминогруппа нейтральна, а карбоксигруппа депротонирована, а также их соли.

При упоминании эфиров или тиоэфиров карбоновых кислот, например эфиров или тиоэфиров адипата, эфиров или тиоэфиров ацетата, эфиров или тиоэфиров сукцината, эти термины должны охватывать любые активирующие группы, в частности любые биологические активирующие группы, включая кофермент А (также обозначается как СоА), фосфопантетеин, который может быть связан с ацилпереносящим белком или пептидил-переносящим белком (АСР или РСР, соответственно), Νацетилцистеамин, метилтиогликолат, метилмеркаптопропионат, этилмеркаптопропионат, метилмеркаптобутират, этилмеркаптобутират, меркаптопропионат и другие эфиры или тиоэфиры, выполняющие те же или аналогичные функции. В том случае, когда в качестве биокатализатора используются живые клетки, эфир или тиоэфир, в частности, СоА, может вырабатываться под действием данного биокатализатора либо исходить от организма, также способного вырабатывать подходящий фермент, катализирующий эту реакцию. СоА-лигазы и СоА-трансферазы идентифицированы у многих организмов и могут обеспечивать требуемые активированные эфиры или тиоэфиры.

Получение эфира или тиоэфира адипата из эфира или тиоэфира сукцината, в частности, может включать следующие стадии реакции (цифры в скобках также соответствуют фиг. 1):

(1) обеспечение эфира или тиоэфира сукцината и проведение реакции данного эфира или тиоэфира с эфиром или тиоэфиром ацетата, при этом образуется эфир или тиоэфир 3-оксоадипата;

(2) гидрогенизирование 3-оксогруппы эфира или тиоэфира 3-оксоадипата, при этом образуется эфир или тиоэфир 3-гидроксиадипата;

(3) дегидратирование эфира или тиоэфира 3-гидроксиадипата, при этом образуется эфир или тиоэфир 2,3-дегидроадипата;

(4) гидрогенизирование двойной связи С=С эфира или тиоэфира 2,3-дегидроадипата, при этом образуется эфир или тиоэфир адипата.

Изобретение также касается способа получения промежуточных соединений, пригодных для применения в способе получения адипиновой кислоты, который включает проведение одной или нескольких из данных стадий реакций 1-4 в присутствии биокатализатора, катализирующего такую стадию реакции.

В одном воплощении эфир или тиоэфир адипата подвергается превращению в 5-ЕУА (5).

Если нужно, эфир или тиоэфир адипата можно превратить в адипиновую кислоту. Это можно осуществить путем гидролиза сложноэфирной связи или тиоэфирной связи (7), при этом образуется адипиновая кислота, либо при реакции переноса, в которой спиртовая или тиоловая группировка (типа СоА) переносится из эфира или тиоэфира адипата на другую кислоту, чем адипиновая, при этом образуется адипиновая кислота и (тио)эфир другой кислоты, чем адипиновая (7). Если в качестве другой кислоты используется янтарная кислота или ацетат, то эта реакция может оказаться выгодной тем, что можно реутилизировать спиртовую или тиоловую группировку типа СоА. Например, можно подвергнуть превращению адипил-СоА + сукцинат или ацетат (обычно в присутствии СоА-трансферазы) с образованием сукцинил-СоА или ацетил-СоА + адипиновой кислоты. Затем сукцинил-СоА или ацетил-СоА можно использовать как исходное соединение в способе изобретения.

Адипиновую кислоту (либо её эфир или тиоэфир) можно подвергнуть превращению, например, в 5ЕУА (8).

В одном воплощении полученный способом изобретения 5-ЕУА подвергается превращению в 6

- 2 018381

АСА (6). После этого 6-АСА может быть превращена в капролактам, например, известным в этой области способом.

В другом воплощении полученную способом изобретения адипиновую кислоту или капролактам можно использовать для получения полиамида.

Употребление в настоящем изобретении термина в единственном числе определяется как по меньшей мере одно, если не указано иначе.

Если существительное (например, соединение, добавка и т.п.) приводится в единственном числе, то это значит, что включается и множественное число.

Если приводится соединение, у которого есть несколько изомеров (например, цис- и транс-изомер, В- и 8-энантиомер), то соединение в принципе включает все энантиомеры, диастереомеры и цис/трансизомеры этого соединения, которые могут использоваться в определенном способе изобретения.

Если фермент приводится со ссылкой на классификацию фермента (ЕС) в скобках, то класс фермента означает класс, к которому он относится или может быть отнесен на основе Номенклатуры ферментов, представленной Комитетом по номенклатуре Международного союза по биохимии и молекулярной биологии (ΝΟ-ГОВМВ), которая приведена на: 1Шр://\у\у\у.с11ет.српикас.ик/шЬтЬ/епхуте/. Она должна охватывать и другие подходящие ферменты, которые (еще) не были отнесены к определенному классу, но могут быть отнесены.

Если белок приводится со ссылкой на номер доступа, то этот номер, в частности, используется для обозначения белка с последовательностью, приведенной в ϋηίρτοΐ по состоянию на 11 марта 2008 г., если не указано иначе.

Термин гомолог в настоящем изобретении применяется, в частности, для тех полинуклеотидов или полипептидов, у которых последовательности идентичны по меньшей мере на 30%, предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, в особенности по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, на 92%, на 93%, на 94%, на 95%, на 96%, на 97%, на 98% или на 99%. Термин гомолог также охватывает последовательности нуклеиновых кислот (последовательности полинуклеотидов), которые отличаются от последовательности другой нуклеиновой кислоты вследствие вырожденности генетического кода, но кодируют последовательность одного и того же полипептида.

Идентичность или сходство последовательностей при этом определяется как взаимосвязь между последовательностями двух или нескольких полипептидов либо двух или нескольких нуклеиновых кислот при определении путем сравнения последовательностей. Обычно сравнение последовательностей проводится по всей их длине, но оно может проводиться и по какой-то части последовательностей, совмещающихся друг с другом. В данной области идентичность или сходство также означает степень родства между последовательностями полипептидов или же последовательностями нуклеиновых кислот при определении по совпадению между такими последовательностями. Предпочтительные методы определения идентичности или сходства призваны дать наибольшее совпадение между тестируемыми последовательностями. В контексте настоящего изобретения предпочтительный метод определения идентичности или сходства между двумя последовательностями включает компьютерные программы ВЬЛ8ТР и ΒΕΆ8ΤΝ (Л118сйи1 8.Е. е! а1., 1. Μοί. ΒίοΙ. 1990, 215, 403-410), которые общедоступны из ΝΟΒΙ и других источников (ВЬЛ8Т Мапиа1, Л118сйи1 8. е! а1., ΝΟΒΙ ΝΕΜ ΝΙΗ ВеШекйа, ΜΌ 20894). Предпочтительные параметры для сравнения последовательностей полипептидов методом ВЬЛ8ТР: открытие бреши 10.0, расширение бреши 0,5, матрица В1о§ит 62. Предпочтительные параметры для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот методом ВЬЛ8Т№ открытие бреши 10.0, расширение бреши 0.5, полная матрица ДНК (матрица идентичности для ДНК).

В способе по изобретению используется биокатализатор, т.е. по крайней мере одна стадия реакции в способе катализируется биологическим материалом или молекулой, происходящей из биологического источника, к примеру, организмом или происходящей из него биомолекулой. В частности, биокатализатор может включать один или несколько ферментов. Биокатализатор может использоваться в любом виде. В одном воплощении используется один или несколько ферментов, выделенных из естественной среды (из организма, в котором он вырабатывался), например, в виде раствора, эмульсии, дисперсии, (суспензии) лиофилизованных клеток, лизата, либо иммобилизованных на подложке. Использование фермента, выделенного из того организма, из которого он происходит, может быть полезным, в частности, принимая во внимание повышенную гибкость при подборе условий реакции с тем, чтобы равновесие реакции сместилось в нужную сторону.

В одном воплощении один или несколько ферментов входят в состав живого организма (как-то живых целых клеток). Ферменты могут выполнять каталитические функции внутри клетки. Может быть и так, что ферменты секретируются в среду, в которой находятся клетки.

Живые клетки могут представлять собой растущие клетки, покоящиеся или спящие клетки (например, споры) либо клетки в стационарной фазе. Также можно использовать ферменты, входящие в состав пермеабилизованных клеток (т.е. ставших проницаемыми для субстрата фермента либо предшественника

- 3 018381 субстрата фермента или ферментов).

Биокатализатор, используемый в способе по изобретению, в принципе может представлять собой любой организм либо быть полученным или происходить из любого организма. Организм может представлять собой эукариоты, бактерии или архебактерии. В частности, организм может быть выбран из животных (включая человека), растений, бактерий, архебактерий, дрожжей и грибов.

Подходящие бактерии, в частности, могут быть выбраны из числа АЬк1б1а, Ас11готоЬас1сг. АсшеШЬасЮг. АдгоЬас1егшт, Аеготопак, А1са11депек, АгйгоЬас1ег, Ат/оатсик, Аготопак, АгокрпШит, АхоЮЬас1сг, ВасШик, ВеуегтсШа, ВгабугЫ/оЬшт, Вшкйо1бепа, Вуккоск1атук, СйгоЬас1ег, С1ок1пбшт, Сотатопак, СогупеЬас1егшт, Оетососсик, ЕкскепсШа, Еп1егоЬас1ег, ИауоЬаШетшт, ЕикоЬас1етшт, Соккуршт, К1еЬк1е11а, ЬасШЬасШик, Ык1епа, Медакркаега, Мютососсик, МусоЬас1етшт, ЫосатШа, РотрЬуготопак, РторюшЬаШегшт, Ркеиботопак, Ва1к1оша, ВШ/оЫит, Вйоборкеиботопак, Вйобокрш11ит, Вобососсик, ВокеЬшга, 8йе^апе11а, 81гер1отусе1ек, ХапШотопак, Ху1е11а, Уегыша, Тгеропета, У1Ьпо, 81тер1ососсик, Ьас1ососсик, 2утотопак, 81арйу1ососсик, 8а1топе11а, Вгисе11а, МюгоксШа.

Подходящие эукариоты могут быть выбраны, в частности, из числа грибов; метазоа; Ушб1р1ап1ае (в частности, АтаЫборык и СЫатуботопаба1ек); дипломонад (в частности, С1атбппае); Еп1атоеЬ1бае (в частности, Еп1атоеЬа); Еид1епо/оа (в частности, Еид1епа); Ре1оЬюпбба (в частности, МакбдатоеЬа) и А1уео1а1а (в частности, СгурЮкропбшт).

Подходящими грибами, в частности, являются грибки и дрожжи, выбранные из числа ВЫ/орик, №игокрога, РешсШшт, АкрегдШик, Риотусек, Тпсйокрогоп, Сапб1ба, Напкепи1а, К1иууеготусек, 8асскаготусек, Вйобо1оти1а, ЗсЫ/окассйатотусек, УаттоМа (как-то УаттоМа 1уро1убса).

Подходящими многоклеточными, в частности, являются метазоа, выбранные из числа млекопитающих (включая человека), в особенности выбранные из числа Ьеропбае, Мштбае, 8шбае, Воу1бае, Нопйшбае. Биокатализатор может происходить из любой части многоклеточного организма, например печени, поджелудочной железы, мозга, почек, сердца или иного органа. Подходящими многоклеточными также могут быть, в частности, СаепотйаЬбШк и Эгокоркба.

Организмы, которые в особенности могут обеспечить подходящий биокатализатор для определенной стадии реакции, приведены ниже, при описании конкретных стадий реакции способа по изобретению.

Специалистам в этой области должно быть ясно, что в способе по изобретению можно использовать природные биокатализаторы (дикого типа) или мутанты природных биокатализаторов с подходящей активностью. Свойства природных биокатализаторов могут быть улучшены биологическими методами, известными в этой области, такими, к примеру, как метод молекулярной эволюции или рационального проектирования. Так, мутанты биокатализаторов дикого типа могут быть получены путем модификации кодирующей ДНК организма, способного действовать в качестве биокатализатора либо способного вырабатывать биокаталитическую молекулу (как-то фермент), используя методы мутагенеза, известные в этой области (случайного мутагенеза, направленного мутагенеза, направленной эволюции, рекомбинации генов и др.). В частности, можно модифицировать ДНК таким образом, чтобы она кодировала фермент, отличающийся хотя одной аминокислотой от фермента дикого типа, чтобы она кодировала фермент, содержащий одну или несколько замен, делеций и/или вставок аминокислот по сравнению с диким типом, или чтобы мутанты сочетали последовательности двух или нескольких исходных ферментов, либо осуществлять экспрессию модифицированной таким образом ДНК в подходящих клетках-хозяевах. Последнее может совершаться методами, известными в этой области, как-то оптимизации кодонов или оптимизации пар кодонов, например на основе метода, описанного в \УО 2008/000632).

Мутантный биокатализатор может обладать улучшенными свойствами, например, по одному или нескольким из следующих аспектов: избирательности в отношении субстрата, активности, стабильности, устойчивости к растворителям, рН-профиля, температурного профиля, субстратного профиля, подверженности ингибированию, употреблению кофакторов и сродства к субстратам. Мутанты с улучшенными свойствами могут быть идентифицированы, например, с применением подходящих методов высокопроизводительного скрининга или отбора на основе известных методов.

Можно модифицировать субстратную специфичность ферментов, действующих на алкильные эфиры или тиоэфиры. Можно применить метод молекулярной эволюции для создания разнообразия, а затем провести скрининг на наличие нужных мутантов, и/или метод рациональной инженерии связывающих субстрат карманов. Методы модификации субстратной специфичности ферментов, используемых в способе изобретения, могут быть основаны на методах, описанных в этой области. Например, рациональная инженерия с использованием информации о структуре и последовательности для разработки специфических мутаций применялась для модификации субстратной специфичности ацилтрансферазного домена 4 из эритромицин-поликетидсинтазы на прием альтернативных доноров ацильных групп. Было показано, что модификация предполагаемого сайта связывания субстрата привела к тому, что модифицированный связывающий карман может вмещать альтернативные субстраты и давать различные пропорции продуктов (Вееуек СО., МшВ 8., АкЫеу С.У., Р1адепбш М., Ни1сЫпкоп С.В., МсОаше1 В. ВюсйетМгу 2001, 40(51), 15464-15470). Методы рационального проектирования и молекулярной эволюции применялись для изменения субстратной специфичности биокатализатора ВМЗ, что привело к получению большого

- 4 018381 числа мутантов, обладающих способностью к окислению целого ряда различных алкенов, циклоалкенов, аренов и гетероаренов вместо или наряду с природньм субстратом - среднецепочечными жирными кислотами (например, миристиновой кислотой) (Ре1етк Μ.\ν.. Мет1ю1б Р., Сйебет А., Агпо1б Р.Н. 1оитпа1 оГ (Не Атепсап С1ет1са1 8ос1е(у 2003, 125(44), 13442-13450; Арре1 Ό., Ьикг^аЫ 8., Иксйег Р., 8с11\\апеЬегд и., 8с1т1б Κ.Ό. 1оита1 οί Вю(есйио1о§у 2001, 88(2), 167-171 и приведенные там ссылки).

Если указан биокатализатор, в частности фермент, из определенного источника, то рекомбинантные биокатализаторы, в частности ферменты, происходящие из первого организма, но фактически вырабатываемые в (генетически модифицированном) втором организме, определенно причисляются к биокатализаторам, в частности, ферментам, из этого первого организма.

Получение эфира или тиоэфира 3-оксоадипата (реакция 1)

В одном воплощении изобретения эфир или тиоэфир 3-оксоадипата получают из сукцината и ацетата, причем сукцинат и/или ацетат обычно снабжаются активирующей группой, в частности, дающей эфир или тиоэфир, что способствует реакции.

Получение эфира или тиоэфира 3-оксоадипата может осуществляться биокаталитическим или химическим путем, в частности, по конденсации Кляйзена, при которой происходит конденсация эфира или тиоэфира ацетата и эфира или тиоэфира сукцината.

В предпочтительном способе изобретения получение включает биокаталитическую реакцию в присутствии биокатализатора, способного катализировать перенос ацильных групп. Поэтому фермент, обладающий такой каталитической активностью, может быть назван ацилтрансферазой.

В предпочтительном способе происходит перенос ацильных групп между двумя ацилсодержащими тиоэфирами или ацилсодержащими эфирами. Предпочтительными ацил-тиоэфирами являются ацетилСоА и сукцинил-СоА. Предпочтительно данный биокатализатор избирателен в отношении данных ацилтиоэфиров.

Биокатализатор, в частности, может включать фермент, способный переносить ацильные группы, выбранный из числа ацилтрансфераз (ЕС 2.3.1), предпочтительно из числа ацетил-СоА:ацетил-СоА Сацетилтрансфераз (ЕС 2.3.1.9), ацил-СоА:ацетил-СоА С-ацилтрансфераз (ЕС 2.3.1.16) и сукцинилСоА:ацетил-СоА С-сукцинилтрансфераз (ЕС 2.3.1.174, также известных как β-кетоадипил-СоА-тиолазы). В базе данных КЕОС (Куо(о Епсус1ореб1а οί Сепек апб Сепотек) ацилтрансферазная активность описана, к примеру, при β-окислении, биосинтезе жирных кислот, биосинтезе поликетидов или метаболизме бутаноата.

Ацилтрансфераза, в частности, может представлять собой ацилтрансферазу из организма, выбранного из числа архебактерий, бактерий и эукариот.

В частности, фермент может происходить из микроорганизма, способного разлагать органические соединения, содержащие ароматическую или алициклическую кольцевую структуру, в частности 5-, 6или 7-членную кольцевую структуру. Органическое соединение необязательно может содержать один или несколько гетероатомов в кольце или в качестве заместителя или части заместителя. Например, органическая молекула может представлять собой ароматическое соединение, в частности ароматическое соединение, содержащее 6-членное кольцо. В частности, ароматическое соединение может быть выбрано из числа фенилацетата, бензоата, катехола, протокатехата и гентизата. Органическое соединение может представлять собой алициклическое соединение, в частности циклический спирт типа циклогексанола, циклический кетон типа циклогексанона или циклоалкан типа циклогексана. Органическое соединение может представлять собой лактам типа капролактама. В одном воплощении фермент происходит из организма, способного разлагать дикарбоновые кислоты (обычно С₆-С₁₀), в частности неразветвленные насыщенные дикарбоновые кислоты типа адипиновой кислоты.

В другом воплощении фермент происходит из организма, способного синтезировать 3-кетоадипат, предпочтительно как составную часть вторичного метаболита (например, малономицина), к примеру, из 8(тер(ошусе(ек (в частности, 8(тер(ошусек птокик), из Асбпотусек, из других актинобактерий или иных известных продуцентов вторичных метаболитов.

Предпочтительные микроорганизмы для обеспечения биокатализатора, способного катализировать получение эфира или тиоэфира 3-оксоадипата, также включают Асте(оЬас(ет (в частности, штамм АЭР1 Асте(оЬас(ет кр. и А. са1соасебсик), АдтоЬас(егшт (в частности, А. 1итеГас1епк), А1сайдепек (в частности, штаммы Ό2 А1сайдепек и А. еи(горйик), Аг111гоЬас1ег, Агхоагсик (в частности, А. еуапки), Ахотопак, Ахо1оЬас1ег, ВасШик (в частности, В. 1а1обигапк), ВеЦег1пск1а, ВгабугЫхоЬшт, Вигкйо1бепа, С1ок(пбшш (в частности, С. Ииууеп, С. асеЮЬШуКсит, С. Ьецеппски), Сотатопак, СотупеЬас(егшт (в частности, С. ДШатюит и С. аигапбасит), Е. сой, Еп(егоЬас(ег, Е1ауоЬас(етшш, Медакрйета (в частности, М. е1кбепл), Ыосагб1а, Ркеиботопак (в частности, Р. рибба, Р. аетидтока и штамм В13 Ркеиботопак кр.), Ва1к(оша (в частности, В. еи(торйа), ВЫхоЬшш, Вйоборкеиботопак (в частности, В. ра1ик(пк), Вобососсик (в частности, В. етуИтороНк, В. орасик и штамм ВНА1 Вобососсик кр.), АкретдШик (в частности, А. шдет), Еид1епохоа (в частности, Еид1епа дтасШк), Ыеигокрога (в частности, N. сгакка), РешсШшш (в частности, Р. с1гукодепит), Вйобо(оти1а, 8асс1аготусек, Тпсйокротоп (в частности, Т. си(апеиш).

В конкретном воплощении биокатализатор включает фермент, содержащий аминокислотную по

- 5 018381 следовательность, приведенную в любом из 8ЕО Ш N0: 1-13, либо гомологичную ей.

Получение эфира или тиоэфира 3-гидроксиадипата (реакция 2)

В одном воплощении эфир или тиоэфир 3-гидроксиадипата получают из эфира или тиоэфира 3оксоадипата. Обычно 3-оксоадипат снабжается активирующей группой, как указано выше.

В принципе эфир или тиоэфир 3-гидроксиадипата может быть получен химическим путем, например при избирательной гидрогенизации 3-оксогруппы в эфире или тиоэфире 3-оксоадипата.

Эта реакция, в частности, может проводиться в присутствии биокатализатора, катализирующего стадию этой реакции, в частности биокатализатора, способного катализировать восстановление оксогруппы, в частности карбонильной группы, до гидроксильной группы.

В конкретном воплощении 3-оксоадипат присутствует в виде тиоэфира с коферментом А (в дальнейшем тиоэфир 3-оксоадипата и кофермента А именуется как 3-оксоадипил-СоА).

В предпочтительном способе изобретения получение включает биокаталитическую реакцию в присутствии биокатализатора, способного катализировать восстановление 3-оксоацил-(эфира или тиоэфира) до 3-гидроксиацил-(эфира или тиоэфира). Поэтому фермент, обладающий такой каталитической активностью, можно назвать 3-гидроксиацил-(эфир или тиоэфир)дегидрогеназой. А фермент, обладающий такой каталитической активностью в отношении тиоэфира - 3-гидроксиацил-СоА, может быть назван 3гидроксиацил-СоА-дегидрогеназой. Предпочтительно данная 3-гидроксиацил-СоА-дегидрогеназа избирательна в отношении субстрата- 3-оксоадипил-СоА.

Фермент, способный катализировать восстановление 3-оксоацил-(эфира или тиоэфира) до 3гидроксиацил-(эфира или тиоэфира), в частности, может быть выбран из числа дегидрогеназ (ЕС 1.1.1), предпочтительно из числа 3-гидроксиацил-СоА-дегидрогеназ (ЕС 1.1.1.35 и ЕС 1.1.1.36), 3гидроксибутаноил-СоА-дегидрогеназ (ЕС 1.1.1.157), 3-гидроксипимелоил-СоА-дегидрогеназ (ЕС 1.1.1.259) и 3-гидроксиацил-СоА-дегидрогеназ длинноцепочечных жирных кислот (ЕС 1.1.1.211). В качестве кофактора эти ферменты могут использовать ΝΛΌΗ или ΝΆΌΡΗ. Согласно базе данных КЕОС (КуоЮ Еисус1ореб1а оД Сеиез аиб Сеиотез), 3-гидроксиацил-СоА-дегидрогеназная активность описана, к примеру, при метаболизме жирных кислот, биосинтезе поликетидов, метаболизме полигидроксиалканоатов, метаболизме бутаноата, а также при деградации ароматических соединений.

В частности, фермент может происходить из микроорганизмов, способных разлагать органические соединения, приведенные выше (см. реакцию 1), в частности ароматические соединения, алициклические соединения или дикарбоновые кислоты.

Другие предпочтительные организмы для обеспечения биокатализатора, способного катализировать получение эфира или тиоэфира 3-гидроксиадипата, включают АсшеЮЬасЮг (в частности, штамм ΛΏΡ1 АстеЮЬасЮг зр. и А. са1соасейсиз), А1са1щеиез (в частности, штаммы Ό2 А1са1щеиез и А. еиДорйиз), Лгхоагсиз (в частности, А. еуаизп), ВасШиз (в частности, В. йа1обигаиз), Вогбе!е11а (в частности, В. регШззДз), Вцгкйо1беДа (в частности, В. рзеибоша11е1 и В. хеиоуогаиз), СогупеЬасЮпит (в частности, С. д1Шаш1сит, С. аигаибасит и С. ейгаеиз), Эешососсиз (в частности, Ό. габюбигаиз), Е. сой, Е1ауойас!егшт, К1ейз1е11а (в частности, К. риеитоша), Рзеиботоиаз (в частности, Ρ. рцДба и Ρ. Диогезсеиз), Вйоборзеиботоиаз (в частности, В. ра1из!пз), Вобососсиз (в частности, В. егуШгоройз, В. орасиз и штамм ВНА1 Вобососсиз зр.), АзрегдШиз (в частности, А. шдег), №игозрога (в частности, Ν. сгазза), Ρеη^с^11^ит (в частности, Ρ. сйгузодеиит), 8ассйаготусез (в частности, 8. сегеуДзДае).

Подходящим организмом для обеспечения фермента ЕС 1.1.1.35, действующего на 3кетогексаноил-СоА, может быть любой организм, включая млекопитающих, в частности млекопитающих из числа Воз !аигаз, Вайиз иогуещсиз, 8из зсгоДа и Ното зарДеиз.

Подходящий биокатализатор, участвующий в (анаэробном) синтезе жирных кислот, биосинтезе поликетидов или метаболизме полигидроксиалканоатов, может происходить из любых организмов, в частности микроорганизмов, включая С1озйлбшт (в частности, С. асеЮйШуйсит и С. к1иууеД), ЕиЦеиохоа (в частности Еид1еиа дгасШз), Медазрйега (в частности, Медазрйега е1збеип), Ва1з!оша (в частности, Ва1з!оша еШгорйа) и 2оод1оеа (в частности, 2оод1оеа гашщега).

В конкретном воплощении биокатализатор (катализирующий реакцию 2) включает фермент, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любом из 8Е0 Ш N0: 15-26 и 29, либо гомологичную ей. Предусматривается, в частности, что фермент, содержащий аминокислотную последовательность согласно 8Е0 Ш N0: 26, может катализировать как реакцию 2, так и реакцию 3.

Получение эфира или тиоэфира 2,3-дегидроадипата (реакция 3)

В одном воплощении эфир или тиоэфир 2,3-дегидроадипата (5-карбокси-2-пентеноата) получают из эфира или тиоэфира 3-гидроксиадипата. Необязательно 2,3-дегидроадипат и 3-гидроксиадипат конъюгируют с коферментом, АСР или иной активирующей группой, как указано выше.

В одном воплощении изобретения эфир или тиоэфир 2,3-дегидроадипата получают путем химического превращения эфира или тиоэфира 3-гидроксиадипата, например, при дегидратации в безводной среде в присутствии, например, серной кислоты.

В частности, 2,3-дегидроадипат может быть получен из 3-гидроксиадипата с помощью по крайней мере одного биокатализатора.

Предпочтительным биокатализатором является такой биокатализатор, который способен катализи

- 6 018381 ровать дегидратацию 3-гидроксиацил-эфира или -тиоэфира до его 2-еноил-эфира или 2-еноил-тиоэфира.

В конкретном воплощении 2,3-дегидроадипат присутствует в виде тиоэфира с коферментом А (в дальнейшем тиоэфир 2,3-дегидроадипата и кофермента А именуется как 5-карбокси-2-пентеноил-СоА).

В конкретном воплощении биокатализатор катализирует дегидратацию 3-гидроксиадипил-СоА до 5-карбокси-2-пентеноил-СоА.

В частности, биокаталитическая реакция может проводиться в присутствии биокатализатора, способного катализировать дегидратацию 3-гидроксиацил-(тио)эфира до 2,3-дегидроацил-тиоэфира. Поэтому фермент, обладающий такой каталитической активностью, может быть назван 3-гидроксиацил-(эфир или тиоэфир)дегидратазой. А фермент, обладающий такой каталитической активностью в отношении тиоэфира - 3-гидроксиацил-СоА, может быть назван 3-гидроксиацил-СоА-дегидратазой. Предпочтительно данная 3-гидроксиацил-СоА-дегидратаза избирательна в отношении субстрата - 3-гидроксиадипилСоА.

Фермент, способный катализировать дегидратацию 3-гидроксиацил-(эфира или тиоэфира) до 2,3дегидроацил-(эфира или тиоэфира), в частности, может быть выбран из числа гидролиаз (ЕС 4.2.1), предпочтительно из числа еноил-СоА-гидратаз (ЕС 4.2.1.17), 3-гидроксибутирил-СоА-дегидратаз (ЕС 4.2.1.55) и еноил-СоА-гидратаз длинноцепочечных жирных кислот (ЕС 4.2.1.74). Согласно базе данных КЕСС, 3-гидроксиацил-СоА-дегидратазная активность описана, к примеру, при метаболизме жирных кислот, синтезе поликетидов и метаболизме бутаноата, а также при деградации ароматических соединений.

3-Гидроксиацил-(эфир или тиоэфир)дегидратаза может представлять собой 3-гидроксиацил-(эфир или тиоэфир)дегидратазу из организма, выбранного из числа архебактерий, бактерий и эукариот, например из числа дрожжей, грибов и млекопитающих.

В частности, предпочтительным источником биокатализатора, катализирующего получение эфира или тиоэфира 2,3-дегидроадипата, являются микроорганизмы, способные разлагать органические соединения, приведенные выше (см. реакцию 1), в частности, ароматические соединения, алициклические соединения или дикарбоновые кислоты.

Микроорганизмы, способные разлагать ароматические соединения, алициклические соединения или дикарбоновые кислоты, включают Асше1оЬас1ет (в частности, штамм ΑΌΡ1 Асше1оЬас1ет 5р. и А. са1соасе!1сик), А1сайдепек (в частности, А1са11депек Ό2), АкретдШик (в частности, А. шдет), Ахоагсик (в частности, А. еуапкп), ВасШик (в частности, В. йа1обитапк), СотупеЬас1етшт (в частности, С. д1и1ашюит и С. аигапйасит), Е. сой, Е1ауоЬас1егшт, Ыеигокрога (в частности, N. сгакка), РешсШшш (в частности, Ρ. сйтукодепиш), Ркеиботопак (в частности, Р. рийба и Р. Пиогексепк), ВЕоборкеиботопак (в частности, В. ра1ик1т1к), ВЕобососсик (в частности, штамм ВНА1 Вобососсик кр.).

Предпочтительным организмом для обеспечения фермента ЕС 4.2.1.17, действующего на 3гидроксигексаноил-СоА, является организм, выбранный из числа млекопитающих и микроорганизмов. Подходящий фермент ЕС 4.2.1.17 из млекопитающих, в частности, может происходить из млекопитающего, выбранного из числа Вок 1аитик, Ното кар1епк, ВаВик потуедюик и 8ик кстоЕа. Подходящий фермент ЕС 4.2.1.17 из микроорганизмов, в частности, может происходить из микроорганизма, выбранного из числа Аеготопак (в частности, А. сау1ае), С1окВтбшт (в частности, С. асе1оЬШу1юит), Соккуршт (в частности, С. ЫгкШит), Вйобокрт11ит (в частности, В. гиЬгит) и Ва1к1оша (в частности, Ва1к1оша еиВорйа).

Также предпочтительны микроорганизмы, способные к (анаэробному) биосинтезу жирных кислот. Такие микроорганизмы включают С1ок1пбшт (в частности, С. асеЮЬШуЕсит и С. НиууеВ), Еид1епо/оа (в частности, Еид1епа дтасШк), МедакрЕега (в частности, М. е1кбепи) и 8ассЕатотусек (в частности, 8. сегеуШае).

Подходящий фермент, в частности, может содержать аминокислотную последовательность согласно любому из 8ЕО ГО N0: 14, 27, 28, 30-41 и 92 либо гомологичную ей.

Получение эфира или тиоэфира адипата из эфира или тиоэфира 2,3-дегидроадипата (реакция 4)

В одном воплощении эфир или тиоэфир адипата получают из эфира или тиоэфира 2,3дегидроадипата. Эфир или тиоэфир адипата может быть получен из эфира или тиоэфира 2,3дегидроадипата химическим путем, например, при избирательной гидрогенизации двойной связи С₂=С₃, либо биокаталитическим путем.

Обычно 2,3-дегидроадипат снабжается активирующей группой, как указано выше.

Эфир или тиоэфир адипата предпочтительно получают из эфира или тиоэфира 2,3-дегидроадипата с помощью по крайней мере одного биокатализатора, катализирующего гидрогенизацию двойной связи С=С эфира или тиоэфира 5-карбокси-2-пентеноата.

В предпочтительном способе изобретения получение включает биокаталитическую реакцию в присутствии биокатализатора, способного катализировать восстановление цис-или транс-2-еноил-(эфира или тиоэфира) до ацил-(эфира или тиоэфира). Биокатализатор может использовать целый ряд доноров электронов, например, из числа NΑ^Н, NΑ^ΡН, ЕАЭН₂ и восстановленного ферредоксина. Электроны могут переноситься непосредственно с донора электронов на биокатализатор или же при помощи, в частности, так называемых переносящих электроны флавопротеидов (ЕТЕ). Поэтому фермент, обладающий такой каталитической активностью, может быть назван 2-еноил-(эфир или тиоэфир)редуктазой (ЕВ). А фер

- 7 018381 мент, обладающий такой каталитической активностью в отношении тиоэфира - 2-еноил-СоА, может быть назван 2-еноил-СоА-редуктазой. Предпочтительно данная 2-еноил-СоА-редуктаза избирательна в отношении субстрата -2,3-дегидроадипил-СоА.

Фермент, способный катализировать восстановление 2-еноил-(эфира или тиоэфира), в частности, может быть выбран из числа оксидоредуктаз (ЕС 1.3.1 и ЕС 1.3.99), предпочтительно из числа еноилСоА-редуктаз (ЕС 1.3.1.8, ЕС 1.3.1.38 и ЕС 1.3.1.44), из числа еноил[ацил-переносящий белок]редуктаз (ЕС 1.3.1.9, ЕС 1.3.1.10 и ЕС 1.3.1.39), из числа бутирил-СоА-дегидрогеназ (ЕС 1.3.99.2), ацил-СоАдегидрогеназ (ЕС 1.3.99.3) и ацил-СоА-дегидрогеназ длинноцепочечных жирных кислот (ЕС 1.3.99.13). Согласно базе данных КЕОС, транс-2-еноил-(эфир или тиоэфир)редуктазная активность описана, к примеру, при метаболизме жирных кислот, синтезе поликетидов, метаболизме бутаноата и митохондриальном биосинтезе жирных кислот.

В принципе 2-еноил-(эфир или тиоэфир)редуктаза может быть получена или может происходить из любого организма. В частности, организм может быть выбран из числа бактерий, архебактерий и эукариот, как-то из числа дрожжей, грибов, простейших, растений и животных (включая человека).

В одном воплощении организм выбирают из следующих бактерий: Е. сой, У1Ьйо, ВасШиз (в частности, В. зиЬййз), С1озйтбшш (в частности, С. Ицуусй, С. ассЮЬШуНсит, С. Ьс|)сппскн и С. рсгГппдспз), 8йср1отуссз (в частности, 8. сосйсо1от и 8. аусттйШз), Рзсиботопаз (в частности, Р. рцйба и Р. асгищпоза), 8йстеаис11а, ХапШошопаз, Ху1с11а, Усташа, Тгсропста (в частности, Т. бспйсо1а), Асготопаз (в частности, Асготопаз НубгорНба), МктозсШа (в частности, МктозсШа шаппа), Мсдазрйсга (в частности, Мсдазрйсга с1збспп), Эсйюсоссиз (в частности, Эсшососсиз гаШоигаиз), УатгоМа (в частности, Υ. 1уро1уйса) и ЕиЬас1сйит (в частности, Е. рутиуайуотаиз).

В одном воплощении 2-еноил-(эфир или тиоэфир)редуктаза происходит из организма, выбранного из числа Еидкпохоа, в частности Еид1спа дтасШз.

В одном воплощении 2-еноил-(эфир или тиоэфир)редуктаза происходит из организма, выбранного из числа 8ассНаготуссз (в частности, 8. ссгсу1з1ас), К1иуусготуссз (в частности, К. 1асйз), 8с1нхозассНаготуссз (в частности, 8. ротЬс), СапШйа (в частности, С. йорюайз).

В одном воплощении 2-еноил-(эфир или тиоэфир)редуктаза происходит из организма, выбранного из числа АзрстдШиз (в частности, А. шдст и А. пШи1апз) и РсшсШшш (в частности, Р. сНгузодспит).

В одном воплощении 2-еноил-(эфир или тиоэфир)редуктаза происходит из организма, выбранного из числа АтаЬ1йорз1з (в частности, А. Шайапа).

В одном воплощении 2-еноил-(эфир или тиоэфир)редуктаза происходит из организма, выбранного из числа Ното зартпз, Найлз погусщсиз, Воз 1аитиз, Сау1а зр., СаспогйаЬбШз с1сдапз и ЭгозорНба тс1аподаз1сг.

Подходящий фермент, в частности, может содержать аминокислотную последовательность согласно любому из 8ЕО Ш N0: 42-67, 94, 96, 98, 100, 105, 107, 109, 111, 113 либо гомологичную ей, в частности, аминокислотную последовательность согласно любому из 8ЕО Ш N0: 60, 63, 96, 100 либо гомологичную ей. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие подходящие ферменты, катализирующие реакцию 4, т.е. 2-еноил-(эфир или тиоэфир)редуктазы, представлены 8ЕО Ш N0: 93, 95, 97,99, 104, 106, 108, 110 и 112.

В предпочтительном воплощении наряду с 2-еноил-(эфир или тиоэфир)редуктазой используется ЕТР, который может способствовать активности данной редуктазы. Такой ЕТР может быть получен или происходить из того же организма, что и редуктаза, как приведено выше. В частности, он может быть получен или происходить из организма того же рода, что и редуктаза, более предпочтительно того же вида, что и сама редуктаза. Конкретные белки ЕТР содержат аминокислотные последовательности, приведенные в 8ЕО Ш N0: 102, 103, 115, 116. А в 8Е0 Ш N0: 101 и 114 представлены нуклеотидные последовательности, кодирующие определенные ЕТР. Обычно такие ЕТР содержат две субъединицы (сЙА апб сГВ), кодируемые двумя разными генами. Они обычно используются вместе, при этом образуется активный белок ЕТР. Например, можно использовать следующие комбинации: 8Е0 Ш N0: 102 + 8Е0 Ш N0: 103 или 8Е0 Ш N0: 116 + 8Е0 Ш N0: 115. Специалисты смогут выбрать и другие подходящие комбинации ЕТР, известные в данной области.

В одном воплощении изобретения биокатализатор, сам по себе не обладающий требуемой активностью или субстратной специфичностью, может быть модифицирован известными в этой области методами, например, рационального проектирования или молекулярной эволюции, чтобы получить мутантов, способных катализировать превращение эфира или тиоэфира 2,3-дегидроадипата в эфир или тиоэфир адипата с требуемой скоростью или избирательностью. Предпочтительными являются биокатализаторы, обладающие активностью с производными 2-еноил-СоА с длиной цепи = 6, в частности, такие биокатализаторы из С. Ииуусй, Воз 1ангнз, Еид1спа дтасШз, Сау1а зр., 8. ссгсу1з1ас, С. йорюайз, Ното зарюпз и Е. рутиуайуотапз.

Получение адипиновой кислоты (реакция 7)

В соответствии с изобретением для получения адипиновой кислоты можно использовать эфир или тиоэфир адипата путем гидролиза сложноэфирной или тиоэфирной связи. Это может осуществляться химическим путем, например при химическом гидролизе в присутствии кислоты или основания, либо

- 8 018381 биокаталитическим путем.

В предпочтительном способе изобретения получение включает биокаталитическую реакцию в присутствии биокатализатора, способного катализировать гидролиз ацил-(тио)эфира. Поэтому фермент, обладающий такой каталитической активностью, может быть назван ацил-(тио)эфир-гидролазой. А фермент, обладающий такой каталитической активностью в отношении тиоэфира - ацил-СоА, может быть назван ацил-СоА-гидролазой. Предпочтительно данная ацил-СоА-гидролаза избирательна в отношении субстрата - адипил-СоА.

Фермент, способный катализировать гидролиз ацил-(тио)эфира, в частности, может быть выбран из числа гидролаз (ЕС 3.1.2), предпочтительно из числа ацил-СоА-гидролаз (ЕС 3.1.2.20), ацетил-СоАгидролаз (ЕС 3.1.2.1), ацил-СоА-гидролаз длинноцепочечных жирных кислот (ЕС 3.1.2.2), сукцинилСоА-гидролаз (ЕС 3.1.2.3) и ацил-[ацил-переносящий белок]гидролаз (ЕС 3.1.2.14).

Биокатализатор может включать фермент, происходящий из любого организма, включая архебактерии, бактерии и эукариоты.

В частности, биокатализатор может включать фермент из бактерий, выбранных из числа Е. сой, Вгисе11а (в частности, Вгисе11а шеШепкк), АдтоЬас!егшш (в частности, А. 1ишсГас1СП5). ХапШошопак, 81погЫхоЬшт (в частности, 8ίηοιΊιίζο6ίιιιη шеШой), МекотЫ/оЫиш (в частности, МекотЫ/оЫиш 1οΐϊ), VIЬтю, 81тер!ошусек (в частности, 8. сое1юо1ог и 8. ауетшИШк), Р11о,оркеи,о1попак (в частности, Вйойоркеийошопак ра1икйтк), Ху1е11а, Уетыша, Ркеийошопак (в частности, Р. риййа и Р. аетидшока), 8йетапе11а, 8Ыде11а, 8а1шопе11а, СогупеЬас!егшш, МусоЬас!етшш, НурИошопак (в частности, НурИошопак перШшиш) и РгорюшЬасЮпшп.

Подходящий биокатализатор, в частности, может встречаться в дрожжах, выбранных из числа 8ассйатошусек (в частности, 8ассйатошусек сегеуыае) и К1иууегошусе8 (в частности, К. 1асйк).

Подходящий биокатализатор, в частности, может встречаться в грибках, выбранных из числа АкретдШик (в частности, А. шдет, А. ГшшдаШк и А. ш,и1апк) и РешсШшш (в частности, Р. сйтукодепиш).

В следующем воплощении организм выбирается из числа АтаЫйоркк (в частности, А. ШаНаиа), Мштйае (в частности, Вайик погуещси^ Мик шикси1ик), Воу|,ае (в частности, Вок 1аитик, Ονίκ апек), Ношо кар1епк и СаепотйаЬйШк (в частности, СаепотйаЬйШк е1едапк).

В одном воплощении изобретения биокатализатор, сам по себе не обладающий требуемой активностью или субстратной специфичностью, может быть модифицирован известными в этой области методами, например, рационального дизайна или молекулярной эволюции, чтобы получить мутантов, способных эффективно превращать эфиры или тиоэфиры адипата в адипат. Предпочтительными являются биокатализаторы, обладающие исходной активностью с ацил-СоА-производными кислот С₄-С₈, предпочтительно включая дикарбоновые кислоты. Например, можно получить мутантов на основе ацил-СоАтиоэстеразы из Мик шикси1ик (например, приведенной в 8ЕО ΙΌ N0: 73).

В конкретном воплощении изобретения получение включает биокаталитическую реакцию в присутствии биокатализатора, способного катализировать перенос активирующей группы, в частности, эфира или тиоэфира, наиболее предпочтительно СоА. Поэтому фермент, обладающий такой каталитической активностью, может быть назван СоА-трансферазой. Предпочтительно данная СоА-трансфераза избирательна в отношении дикарбоксил-СоА как субстрата-донора СоА. Более предпочтительно данный дикарбоксил-СоА представляет собой адипил-СоА. Предпочтительно данная СоА-трансфераза избирательна в отношении ацетата как субстрата-акцептора СоА.

Фермент, способный катализировать перенос групп СоА, в частности, может быть выбран из числа СоА-трансфераз (ЕС 2.8.3), предпочтительно из числа СоА-трансфераз дикарбоксил-СоА:дикарбоновых кислот, СоА-трансфераз сукцинил-СоА:адипат, СоА-трансфераз 3-оксокислот (ЕС 2.8.3.5), СоАтрансфераз 3-оксоадипата (ЕС 2.8.3.6) и СоА-трансфераз ацетата (ЕС 2.8.3.8).

В принципе СоА-трансфераза может быть получена или может происходить из любого организма. Организм может представлять собой бактерии, архебактерии или эукариоты. В частности, предпочтительны организмы, способные разлагать дикарбоновые кислоты, в частности, адипиновую кислоту.

В частности, организм может представлять собой бактерии, выбранные из числа Асте!оЬас!ег (в частности, штамм АЭР1 Асше1оЬас1ег кр., А. са1соасейсик), С1окйтШиш (в частности, С. к1иуνе^^, С. асеЮЬи1уИсиш или С. ЬеЦегтпскН), Ркеийошопак (в частности, Р. риййа и Р. [котексего), АдтоЬас!егшш, А1са11депек, АШтоЬас!ег, Аζοшοпаκ, Аζοκр^^^11иш, АζοΐοЬасΐе^, ВасШик, ВеуегшсШа, Втайут^оЬшш, ВигкйоШепа, Сошашопак, СогупеЬас!етшш, ШсагШа, ВЫζοЬшш, Вйойо!ош1а, Войососсик, Тйсйокрогоп и ВокеЬшта кр.

В частности, организм может представлять собой дрожжи или грибки, выбранные из числа АкрегдШик (в частности, А. шдет), РешсШшш (в частности, Р. сйтукодепиш) и №итокрога.

В частности, подходящая СоА-трансфераза может быть получена или может происходить из семейства НошЫйеа, в особенности из вида Ношо кар1епк.

Подходящий фермент для реакции 7, в частности, может содержать аминокислотную последовательность согласно любому из 8Е0 ΙΌ N0: 68-73, 85, 116, 117, 119-124 либо гомологичную ей.

Получение адипиновой кислоты из тиоэфира, в частности, может катализироваться биокатализатором, включающим ацил-СоА-гидролазу, содержащую аминокислотную последовательность согласно

- 9 018381 любому из 8ЕО ГО N0: 68-73, 117, 119 либо гомологичную ей.

Получение адипиновой кислоты из тиоэфира, в частности, может катализироваться биокатализатором, включающим СоА-трансферазу, содержащую аминокислотную последовательность согласно любому из 8Е0 ГО N0: 85, 121, 122, 123, 124, 125, 126 либо гомологичную ей.

СоА-трансфераза может кодироваться одним геном или более чем одним геном. Например, некоторые СоА-трансферазы содержат две субъединицы, кодируемые двумя разными генами. Они обычно используются вместе, при этом образуется активный белок СоА-трансферазы. Например, можно использовать следующие комбинации: 8Е0 ГО N0: 121 + 8Е0 ГО N0: 122 или 8Е0 ГО N0: 125 + 8Е0 ГО N0: 126.

Получение 5-ЕУА из эфира адипата или тиоэфира адипата (реакция 5)

В одном воплощении 5-формилпентаноат (5-ЕУА) получают из эфира адипата или тиоэфира адипата. Это может осуществляться химическим или биокаталитическим путем. В частности, адипат может быть конъюгирован с СоА или иной активирующей группой, как указано выше.

В частности, настоящим изобретением также предусмотрен способ получения 5-ЕУА из эфира адипата или тиоэфира адипата, в частности, способ получения 5-ЕУА из тиоэфира - адипил-СоА, в присутствии биокатализатора, способного катализировать восстановление ацил-эфира или ацил-тиоэфира до альдегида. Поэтому фермент, обладающий такой каталитической активностью, может быть назван альдегиддегидрогеназой. А фермент, обладающий такой каталитической активностью в отношении ацилэфира или ацил-тиоэфира, к примеру, тиоэфира - ацил-СоА, может быть назван альдегиддегидрогеназой (ацетилирующей). Предпочтительно биокатализатор, включающий альдегиддегидрогеназу (ацетилирующую), избирателен в отношении субстрата - эфира или тиоэфира адипата.

Фермент, способный катализировать восстановление ацил-(тио)эфира, в частности, может быть выбран из числа оксидоредуктаз (ЕС 1.2.1), предпочтительно из числа альдегиддегидрогеназ (ацетилирующих) (ЕС 1.2.1.10), ацил-СоА-редуктаз жирных кислот (ЕС 1.2.1.42), ацил-СоА-редуктаз длинноцепочечных жирных кислот (ЕС 1.2.1.50), бутанальдегидрогеназ (ЕС 1.2.1.57) и дегидрогеназ янтарного полуальдегида (ацетилирующих) (например, см. 8об1шд с1 а1. 1996. 1 Вас1епо1. 178: 871-880).

В принципе альдегиддегидрогеназа может быть получена или может происходить из любого организма. Предусматривается, что фермент может быть получен и из метагеномного источника путем прямого выделения кодирующей его нуклеиновой кислоты и последующего определения активности в гетерологическом организме-хозяине либо путем выявления его в метагеномной ДНК по гомологичности последовательности. Организм может представлять собой бактерии, архебактерии или эукариоты. В частности, организм может быть выбран из бактерий, в особенности из числа Е. соб, С1озбтбшт (в частности, С. к1иуусп. С. Ьеуеписки, С. ассЮЬШуБсшп. С. ЬШупсит. С. 1с1ап1. С. регйгидеиз и С. иоуу1), Рогрйуготоиаз ^ίη^ίναΐίδ, Ыз1епа, РгорюшЬас1спит (в частности, Р. £геибепте1сЫ1), Еи1етососсиз, ЕизоЬас1епит, Ьас1оЬасШиз (в частности, Ь. 1ас(18), ВасШиз (в частности, В. 1йиг1ид1еп818), Вигк1ю1бепа (в частности, В. 111аПапбеп515 и В. та11е1), Рзеиботоиаз (в частности, Р. рибба), Вбобососсиз (в частности, В. зр. ВНА1) и 8а1тоие11а (в частности, 8. 1урЫтипит). Организм также может быть выбран из эукариот, в особенности из числа 01атб1а (в частности, О. 1атЬба), ЕиатоеЬа (в частности, Е. Ыз1о1убса), МазбдатоеЬа Ьа1ати1Ы, СЫатуботоиаз гешбагббц Ро1у1оте11а, Рботусез, СгурШзропббпп и 8рпоиис1еиз Ьагкбаииз.

Подходящая дегидрогеназа, в частности, может содержать аминокислотную последовательность согласно любому из 8Е0 ГО N0: 74-81, 139-148 либо гомологичную ей.

В одном воплощении изобретения биокатализатор, сам по себе не обладающий требуемой активностью или субстратной специфичностью, может быть модифицирован известными в этой области методами, например, рационального проектирования или молекулярной эволюции, чтобы получить мутантов, способных превращать эфиры или тиоэфиры адипата в 5-ЕУА. Предпочтительными являются биокатализаторы, обладающие альдегиддегидрогеназной (ацетилирующей) активностью с производными ацилСоА с длиной цепи = 4-8, в том числе такие биокатализаторы, как дегидрогеназы янтарного полуальдегида (ацетилирующие) из С. к1иутеп (8Е0 ГО N0: 74) или Р. дшдМабз (8Е0 ГО N0: 75) и бутилальдегиддегидрогеназы (ацетилирующие) из С. асеЮЬШуКсшп (8Е0 ГО N0: 80, 81) или РторюшЬас1епит Ггеибег1ге1с1ш (8Е0 ГО N0: 79).

Получение 5-ЕУА из адипиновой кислоты (реакция 8)

В соответствии с изобретением для получения 5-ЕУА можно использовать адипиновую кислоту. Это может осуществляться химическим путем, например, при избирательной химической реакции, необязательно включающей блокирование одной карбоксильной группы, или биокаталитическим путем. В предпочтительном способе изобретения получение включает биокаталитическую реакцию в присутствии биокатализатора, способного катализировать восстановление карбоновой кислоты. В качестве донора электронов биокатализатор может использовать НАЭН или НАЭРН.

Поэтому фермент, обладающий такой каталитической активностью, может быть назван альдегиддегидрогеназой. Предпочтительно данная альдегиддегидрогеназа избирательна в отношении субстрата адипата.

Фермент, способный катализировать восстановление карбоновой кислоты, в частности, может быть выбран из числа оксидоредуктаз (ЕС 1.2.1), предпочтительно из числа альдегиддегидрогеназ (ЕС 1.2.1.3, ЕС 1.2.1.4 и ЕС 1.2.1.5), дегидрогеназ малонового полуальдегида (ЕС 1.2.1.15), дегидрогеназ янтарного

- 10 018381 полуальдегида (ЕС 1.2.1.16 и ЕС 1.2.1.24), дегидрогеназ глутарового полуальдегида (ЕС 1.2.1.20), дегидрогеназ аминоадипинового полуальдегида (ЕС 1.2.1.31), дегидрогеназ адипинового полуальдегида (ЕС 1.2.1.63), которые также могут быть названы 6-оксогексаноатдегидрогеназами. В базе данных КЕОС активность дегидрогеназ адипинового полуальдегида описана, к примеру, при разложении капролактама. В частности, можно использовать 6-оксогексаноатдегидрогеназу. Примерами 6-оксогексаноатдегидрогеназ являются ферменты, содержащие последовательность, приведенную в 8ЕО ГО N0: 127, 128, либо гомологичную ей.

В принципе альдегиддегидрогеназа может быть получена или может происходить из любого организма. Организм может быть прокариотическим или эукариотическим. В частности, организм может быть выбран из числа бактерий, архебактерий, дрожжей, грибов, простейших, растений и животных (включая человека).

В одном воплощении бактерии выбирают из числа Лсше!оЬас!ет (в частности, Лстс1оЬас1сг 5р. Νί.ΊΜΒ9871). К.а1з!оша, Вогбе(е11а. Вигк1ю1бепа. Ме111у1оЬас1епит. Хап11юЬас1ег. ЗтогЫхоЬшт. ΒΐιίζοЬшт, ЖгоЬасЮг. Вгисе11а (в частности, В. те1йепз1з), Рзеиботопаз, АщоЬасЮпит (в частности, АдгоЬас1етшт ШтеГааепз). ВасШиз, Ыз1епа. А1са1щепез. С’огупеЬасЮпит и Е1ауоЬас!егшт.

В одном воплощении организм выбирают из числа дрожжей и грибков, в частности, из числа АзретдШиз (в частности, А. шдет и А. шби1аи8) и РешсШшт (в частности, Р. сНгузодепит).

В одном воплощении организм представляет собой растение, в частности АтаЫборз1з, в особенности А. 1ЬаИапа.

Получение 6-АСА (реакция 6)

В одном воплощении изобретения для получения 6-АСА используют 5-ЕУА.

В одном воплощении 6-АСА получают посредством гидрогенизации над Р10₂ 6-оксимокапроновой кислоты, полученной при реакции между 5-ЕУА и гидроксиламином (например, см. синтез гомологичной 12-аминододекановой кислоты в Е.0. Ауотшбе, Ε.Υ. Nаηа, РГО. №се1у, А.8. ХУообз. Е.0. Рпсе. С.Р. ШаошсНа. 1. Ат. 011 СНет. 8ос. 1997, 74, 531-538).

6-АСА может быть получена с высоким выходом при восстановительном аминировании 5-ЕУА с помощью аммиака над катализатором гидрогенизации, к примеру, N1 на подложке из 810₂/А1₂0₃, как описано для 9-аминононановой кислоты (9-аминопеларгоновой кислоты) и 12-аминододекановой кислоты (12-аминолауриновой кислоты) в ЕР-А 628535 или ΌΕ 4322065.

В следующем воплощении 6-АСА получают биокаталитическим путем. В предпочтительном способе получение 6-АСА из 5-ЕУА включает энзиматическую реакцию в присутствии фермента, способного катализировать реакцию трансаминирования в присутствии донора аминогрупп и выбранного из числа аминотрансфераз (ЕС 2.6.1).

В общем, подходящая аминотрансфераза обладает 6-аминотрансферазной активностью в отношении 6-АСА и способна катализировать превращение 5-ЕУА в 6-АСА.

В частности, аминотрансфераза может быть выбрана среди аминотрансфераз из млекопитающих; МетсштаПз, в частности Метсштайз ретепшз, в особенности ростков Метсштайз ретепшз; Азр1епшт, в особенности Азр1епшт иш1а!ега1е или Азр1епшт зер1еп1попа1е; СегаЮша. в особенности Сега!оша зШс.|иа; В1юбоЬас1ег. в частности, В1юбоЬас1ег зрНаегснбез. 8(арНу1ососсиз. в частности 81арйу1ососсиз аитеиз; У1Ьпо. в частности У1Ьгю Диу1а11з; Рзеиботопаз. в частности, Рзеиботопаз аетидтоза; РНоборзеизотопаз; ВасШиз, в частности, ВасШиз \\еП1епз1ер11апепз1з и ВасШиз зиЫШз; Ьедюпе11а; Шгозошаз; №1ззепа; или дрожжей, в частности 8ассНаготусез сегеу1з1ае.

В том случае, если фермент из млекопитающих, то он, в частности, может происходить из почек млекопитающих, печени млекопитающих, сердца млекопитающих или мозга млекопитающих. Например, подходящий фермент может быть выбран из числа β-аминоизобутират: α-кетоглутаратаминотрансфераз из почек млекопитающих, в частности из почек свиньи; β-аланин-аминотрансфераз из печени млекопитающих, в частности из печени кролика; аспартат-аминотрансфераз из сердца млекопитающих, в частности из сердца свиньи; 4-аминобутират-аминотрансфераз из печени млекопитающих, в частности, из печени свиньи; 4-аминобутират-аминотрансфераз из мозга млекопитающих, в частности из мозга человека, свиньи или крысы; а-кетоадипат:глутамат-аминотрансфераз из №итозрога, в частности, из №итозрога сгазза; 4-аминобутират-аминотрансферазы из Е. сой либо α-аминоадипатаминотрансферазы из ТНегпшз. в частности из ТНегпшз (НегторНбиз. и 5-аминовалератаминотрансферазы из С’1оз1пбб.1т. в частности, из С1оз1пбшт атбюуа1епсит. Подходящая 2аминоадипат-аминотрансфераза, например, может происходить из РугоЬасиНпп 1з1апб1сит.

В конкретном воплощении используется аминотрансфераза, содержащая аминокислотную последовательность согласно 8ЕО ГО N0: 82, 8ЕО ГО N0: 83, 8ЕА) ГО N0: 84, 8ЕА) ГО N0: 134, 8ЕА) ГО N0: 136, 8Е0 ГО N0: 138 либо гомологичную любой из этих последовательностей. Последовательности 8Е0 ГО N0: 86 (дикого типа) и 88 (с оптимизированными кодонами) - это последовательности, кодирующие фермент, представленный 8Е0 ГО N0: 82 (=87). Последовательности 8Е0 ГО N0: 89 (дикого типа) и 91 (с оптимизированными кодонами) - это последовательности, кодирующие фермент, представленный 8Е0 ГО N0: 83 (=90). Последовательности 8Е0 ГО N0: 133, 135, 137 представляют собой кодирующие после

- 11 018381 довательности для 8ЕО ΙΌ N0: 134, 136, 138 соответственно.

В частности, донор аминогрупп может быть выбран из числа аммиака, ионов аммония, аминов и аминокислот. Подходящими аминами являются первичные амины и вторичные амины. Аминокислоты могут иметь Ό- или Ь-конфигурацию. Примерами доноров аминогрупп являются аланин, глутамат, изопропиламин, 2-аминобутан, 2-аминогептан, фенилметанамин, 1-фенил-1-аминоэтан, глутамин, тирозин, фенилаланин, аспартат, β-аминоизобутират, β-аланин, 4-аминобутират и α-аминоадипат.

В следующем предпочтительном воплощении способ получения 6-АСА включает биокаталитическую реакцию в присутствии фермента, способного катализировать реакцию восстановительного аминирования в присутствии источника аммиака и выбранного из числа оксидоредуктаз, действующих на группу 0Η-ΝΗ₂ у доноров (ЕС 1.4), в частности, из числа дегидрогеназ аминокислот (ЕС 1.4.1). В общем, подходящая дегидрогеназа аминокислоты обладает активностью 6-дегидрогеназы 6-аминокапроновой кислоты, катализируя превращение 5-РУА в 6-АСА, либо обладает активностью 2-дегидрогеназы αаминопимелата, катализируя превращение АКР в ААР. В частности, подходящая дегидрогеназа аминокислоты может быть выбрана из числа диаминопимелатдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.16), лизин-6-дегидрогеназ (ЕС 1.4.1.18), глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.3; ЕС 1.4.1.4) и лейциндегидрогеназ (ЕС 1.4.1.9).

В одном воплощении дегидрогеназа аминокислоты может быть выбрана из числа дегидрогеназ аминокислот, относящихся к глутаматдегидрогеназам, работающим с ΝΑΌ или ΝΑΌΡ в качестве акцептора (ЕС 1.4.1.3), глутаматдегидрогеназам, работающим с ΝΑΌΡ в качестве акцептора (ЕС 1.4.1.4), лейциндегидрогеназам (ЕС 1.4.1.9), диаминопимелатдегидрогеназам (ЕС 1.4.1.16) и лизин-6-дегидрогеназам (ЕС 1.4.1.18).

В частности, дегидрогеназа аминокислоты может происходить из организма, выбранного из числа СогуиеЬас1егшт, в частности СогуиеЬас1егшт д1Шатюит; Рго1еик, в частности, Рго1еик уШдапк; АдгоЬас1егшт, в частности АдгоЬас1егшт 1ишеГас1еи5; СеоЬасШик, в частности СеоЬасШик к1еаго1йегторЫ1ик; Ас1ие1оЬас1ег, в частности Асше1оЬас1ег кр. ΑΌΡ1; Ка1к1оша, в частности, Ка1к1оша ко1аиасеагат; 8а1тоие11а, в частности, 8а1тоие11а !урШтигшт; 8ассйаготусек, в частности, 8ассйаготусек сегеу1к1ае; Вгеу1Ьас1егшш, в частности, Вгеу1Ьас1епит Дауит и ВасШик, в частности, ВасШик крйаепсик, ВасШик сегеик или ВасШик киЫШк. Например, подходящая дегидрогеназа аминокислоты может быть выбрана среди диаминопимелатдегидрогеназ из ВасШик, в частности, ВасШик крйаепсик; диаминопимелатдегидрогеназ из Вгеу1Ьас1епит кр.; диаминопимелатдегидрогеназ из СогуиеЬайегшт, в частности диаминопимелатдегидрогеназ из СогуиеЬайегшт д1Шатюит; диаминопимелатдегидрогеназ из Рго1еик, в частности диаминопимелатдегидрогеназы из Рго1еик уШдапк; лизин-6-дегидрогеназ из АдгоЬайегшт, в частности АдгоЬайегшт ЩтеГаЫеик, лизин-6-дегидрогеназ из СеоЬасШик, в частности, из СеоЬасШик к1еаго1йегторЫ1ик; глутаматдегидрогеназ, работающих с NΑ^Η или NΑ^ΡΗ в качестве кофактора (ЕС 1.4.1.3) из Асше1оЬас1ег, в частности глутаматдегидрогеназ из Асше1оЬас1ег кр. АЭР1; глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.3) из Ка1к1оша, в частности глутаматдегидрогеназы из Ка1к1оша ко1аиасеагит; глутаматдегидрогеназ, работающих с NΑ^ΡΗ в качестве кофактора (ЕС 1.4.1.4) из 8а1тоие11а, в частности глутаматдегидрогеназы из 8а1тоие11а [урЫтипит; глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.4) из 8ассйаготусек, в частности глутаматдегидрогеназы из 8ассйаготусек сегеу1к1ае; глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.4) из ВгеуШайегшт, в частности глутаматдегидрогеназы из Вгеу1Ьас1егшт Дауит; и лейциндегидрогеназ из ВасШик, в частности лейциндегидрогеназ из ВасШик сегеик или ВасШик киЫШк.

В одном воплощении 6-АСА, полученная в способе изобретения, используется для получения капролактама. Такой способ включает циклизацию 6-аминокапроновой кислоты, необязательно в присутствии биокатализатора.

Условия реакции для любой биокаталитической стадии в контексте настоящего изобретения можно выбирать в зависимости от известных условий для биокатализатора, в частности фермента, приведенной здесь информации и необязательно рутинного экспериментирования.

В принципе рН реакционной среды можно выбирать в широких пределах до тех пор, пока биокатализатор будет активным при данном значении рН. Можно использовать щелочные, нейтральные или кислые условия, в зависимости от биокатализатора и других факторов. В том случае, если способ включает использование микроорганизмов, например, для экспрессирования фермента, катализирующего способ изобретения, значение рН выбирают таким образом, чтобы микроорганизм мог выполнять предназначенную ему функцию или функции. В частности, можно выбрать рН в пределах 4 единиц рН ниже нейтрального и 2 единиц рН выше нейтрального, т.е. между рН 3 и рН 9 в случае по сути водной системы при 25°С. Система считается водной, если вода является единственным растворителем или преобладающим растворителем (> 50 мас.%, в частности, > 90 мас.%, исходя из общих липидов), при этом в растворе может быть небольшое количество (< 50 мас.%, в частности, < 10 мас.%, исходя из общих липидов), например, спирта или другого растворителя (например, в качестве источника углерода) в такой концентрации, чтобы присутствующие в нем микроорганизмы оставались активными. В частности, при использовании дрожжей и/или грибков предпочтительными могут быть кислые условия, в частности значение рН может находиться в пределах от рН 3 до рН 8, исходя из практически водной системы при 25°С. При желании можно довести рН с помощью кислоты и/или основания либо забуферить с помощью

- 12 018381 подходящей комбинации кислоты и основания.

В принципе условия инкубации можно выбирать в широких пределах до тех пор, пока биокатализатор проявляет достаточную активность и/или рост. Это включает аэробные, микроаэробные, ограниченные по кислороду и анаэробные условия.

Анаэробные условия при этом определяются как условия без кислорода или при которых кислород практически не потребляется биокатализатором, в частности, микроорганизмом, что обычно соответствует потреблению кислорода менее 5 ммоль/л/ч, в частности, потреблению кислорода менее 2,5 ммоль/л/ч или менее 1 ммоль/л/ч.

Аэробные условия есть такие условия, при которых в среде растворен кислород на уровне, достаточном для неограниченного роста, который может поддерживать потребление кислорода со скоростью по меньшей мере 10 ммоль/л/ч, более предпочтительно больше 20 ммоль/л/ч, еще более предпочтительно больше 50 ммоль/л/ч и наиболее предпочтительно больше 100 ммоль/л/ч.

Условия ограничения кислорода можно определить как условия, при которых потребление кислорода ограничено переносом кислорода из газа в жидкость. Нижний предел условий ограничения кислорода определяется верхним пределом анаэробных условий, т.е. обычно по меньшей мере 1 ммоль/л/ч, в частности, по меньшей мере 2,5 ммоль/л/ч или по меньшей мере 5 ммоль/л/ч. Верхний предел условий ограничения кислорода определяется нижним пределом аэробных условий, т.е. менее 100 ммоль/л/ч, менее 50 ммоль/л/ч, менее 20 ммоль/л/ч или менее 10 ммоль/л/ч.

Будут ли условия аэробными, анаэробными или ограниченными по кислороду - зависит от условий, в которых выполняется способ, в частности от количества и состава поступающего газа, фактических параметров смешивания/массообмена у используемого оборудования, типа используемых микроорганизмов и плотности микроорганизмов.

В принципе температура не играет решающей роли до тех пор, пока биокатализатор, в частности, фермент, проявляет существенную активность. В общем, температура может составлять по меньшей мере 0°С, в частности, по меньшей мере 15°С, более предпочтительно по меньшей мере 20°С. Желательная максимальная температура зависит от биокатализатора. В общем, такая максимальная температура известна, напр., указана в спецификации на изделие в случае коммерчески доступного биокатализатора, либо может быть определена в рабочем порядке, исходя из общераспространенных сведений и приведенной здесь информации. Обычно температура составляет 90°С или меньше, в частности, 50°С или меньше, более предпочтительно 40°С или меньше.

Далее для осуществления или ускорения определенной реакции можно выбирать растворители, дополнительные реагенты и другие вспомогательные вещества, например кофакторы (к примеру, кофакторы БАЭ/БАОН и/или ΝΑΌ/ΝΑΌΗ), исходя из известных принципов реакции, и/или принимать меры для смещения равновесия в нужную сторону. В частности, если биокаталитическая реакция проводится вне организма-хозяина, можно использовать реакционную среду, содержащую органический растворитель в высокой концентрации (например, более 50% или более 90 мас.%), если только используемый фермент сохраняет достаточную активность в такой среде.

Эфир или тиоэфир сукцината и эфир или тиоэфир ацетата, используемые в способе изобретения, в принципе могут быть получены любым способом.

Например, сукцинат образуется естественным путем как промежуточный продукт цикла лимонной кислоты (цикла Кребса) либо как конечный продукт клеточного метаболизма. Таким образом, он может быть получен из возобновляемого источника углерода при помощи соответствующего биокатализатора. Для получения сукцината из подходящего источника углерода можно использовать биокатализаторы, в частности, микроорганизмы. Микроорганизмы могут относиться к прокариотам либо эукариотам. Микроорганизмы могут быть рекомбинантными или дикого типа.

У рекомбинантного микроорганизма можно изменить метаболизм с тем, чтобы повысить выход сукцината и производительность на подходящем источнике углерода. Методы повышения продукции сукцината описаны для прокариот в 8опд апб Бее, Епхушс апб М1егоЫа1 Тсе11по1оду. 2006, 39: 352-361. Сукцинат также может вырабатываться у эукариот. С другой стороны, можно применить метод адаптивной эволюции, как описано в патентной заявке ϋδ 2007/111294.

Эфиры или тиоэфиры сукцината могут быть получены из сукцината любым способом. В частности, эфиры или тиоэфиры сукцината могут быть получены из сукцината при помощи биокатализатора. В частности, из сукцината можно получить сукцинил-СоА при помощи биокатализатора, включающего фермент, выбранный из числа тиоловых лигаз кислот (ЕС 6.2.1), предпочтительно из числа сукцинил-СоА-синтаз (ЕС 6.2.1.4 и ЕС 6.2.1.5). С другой стороны, сукцинил-СоА можно получить из сукцината при помощи биокатализатора, включающего фермент, выбранный из числа СоАтрансфераз (ЕС 2.8.3), приведенных для реакции 7.

Эфиры или тиоэфиры сукцината также могут быть получены из других молекул, чем сукцинат, любым способом. В частности, сукцинил-СоА можно получить из 2-оксоглутарата с помощью биокатализатора, включающего 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс. 2-Оксоглутаратдегидрогеназный комплекс представляет собой многоферментный комплекс, принимающий участие в цикле ТСА, который известен специалистам. С другой стороны, сукцинил-СоА можно получить из 2-оксоглутарата с помо

- 13 018381 щью биокатализатора, включающего 2-оксоглутарат:ферредоксин-оксидоредуктазу (ЕС 1.2.7.3).

Ацетат является естественным промежуточным или конечным продуктом в клеточном метаболизме. Таким образом, он может быть получен из возобновляемого источника углерода при помощи соответствующего биокатализатора. Для получения ацетата из подходящего источника углерода можно использовать биокатализаторы, в частности, микроорганизмы. Микроорганизмы могут относиться к прокариотам либо эукариотам. Микроорганизмы могут быть рекомбинантньми или дикого типа.

Эфиры или тиоэфиры ацетата могут быть получены из ацетата любым способом. В частности, эфиры или тиоэфиры ацетата могут быть получены из ацетата при помощи биокатализатора. В частности, из ацетата можно получить ацетил-СоА при помощи биокатализатора, включающего фермент, выбранный из числа тиоловых лигаз кислот (ЕС 6.2.1), предпочтительно ацетил-СоА-синтаз (ЕС 6.2.1.1 и ЕС 6.2.1.13). С другой стороны, ацетил-СоА можно получить из ацетата при помощи биокатализатора, включающего фермент, выбранный из числа СоА-трансфераз (ЕС 2.8.3), приведенных для реакции 7.

Эфиры или тиоэфиры ацетата также могут быть получены из других молекул, чем ацетат, любым способом. В частности, ацетил-СоА можно получить из пирувата с помощью биокатализатора, включающего фермент, выбранный из числа пируватдегидрогеназного комплекса, пируватдегидрогеназы (ΝΑΌΡ⁺) (ЕС 1.2.1.51), пируват-формиатлиазы (ЕС 2.3.1.54), либо биокатализатора или фермента, эффективно превращающего пируват в ацетил-СоА. Пируватдегидрогеназный комплекс представляет собой многоферментный комплекс, превращающий пируват в ацетил-СоА, который известен специалистам. С другой стороны, сукцинил-СоА можно получить из 2-оксоглутарата с помощью биокатализатора, включающего 2-оксоглутарат:ферредоксин-оксидоредуктазу (ЕС 1.2.7.3).

Ацетил-СоА также может быть получен из ацетальдегида с помощью биокатализатора, включающего фермент, выбранный из числа оксидоредуктаз (ЕС 1.2.1), предпочтительно из числа альдегиддегидрогеназ (ацетилирующих) (ЕС 1.2.1.10), ацил-СоА-редуктаз жирных кислот (ЕС 1.2.1.42), бутанальдегидрогеназ (ЕС 1.2.1.57) и дегидрогеназ янтарного полуальдегида (ацетилирующих) (как описано в ЗойПид е! а1. 1996. 1 Вае1етю1. 178: 871-880).

Если биокатализатор относится к эукариотам, то запас ацетил-СоА, предпочтительно в цитозольном компартменте клеток хозяина, может быть повышен путем суперэкспрессии гомологичных и/или гетерологичных генов, кодирующих ферменты, катализирующие превращение молекул предшественника в ацетил-СоА. Молекулы предшественника, к примеру, могут представлять собой ацетат, как описано в ЗЫЬа е! а1., Ме!аЬо11с Еидтеетшд, 2007, 9: 160-8.

В предпочтительном способе изобретения, в частности, способе получения 6-АСА, адипиновой кислоты или промежуточного соединения для 6-АСА или адипиновой кислоты, применяется биотрансформация целыми клетками субстрата для 6-АСА, адипиновой кислоты или промежуточного соединения для них, включающая использование микроорганизма, в котором вырабатывается один или несколько ферментов, катализирующих любые из вышеприведенных реакций, а также источника углерода для микроорганизма.

Источник углерода, в частности, может содержать по меньшей мере одно соединение, выбранное из числа одноатомных спиртов, многоатомных спиртов, карбоновых кислот, двуокиси углерода, жирных кислот, глицеридов, включая смеси, содержащие любые из данных соединений. Подходящие одноатомные спирты включают метанол и этанол. Подходящие полиоли включают глицерин и углеводы. Подходящие жирные кислоты или глицериды, в частности, могут поступать в виде пищевого масла, предпочтительно растительного происхождения.

В частности, можно использовать углеводы, так как обычно углеводы можно получить в большом количестве из биологически возобновляемых источников, как-то сельскохозяйственных продуктов, к примеру, отходов сельского хозяйства. Предпочтительно используются углеводы из числа глюкозы, фруктозы, сахарозы, лактозы, сахаридов, крахмала, целлюлозы и гемицеллюлозы. Особенно предпочтительны глюкоза, олигосахариды, содержащие глюкозу, и полисахариды, содержащие глюкозу.

В конкретном способе изобретения этот способ является способом брожения (ферментации). Такой способ, в частности, может включать контактирование клеток, составляющих биокатализатор - необязательно клеток хозяина, как описано в нем, со сбраживаемым источником углерода, причем источник углерода содержит любые из тех соединений, которые подлежат превращению в получаемое соединение, или же клетки производят соединение, подлежащее превращению в получаемое соединение, из этого источника углерода.

Клетки, содержащие один или несколько ферментов, катализирующих стадию реакции в способе изобретения, могут быть созданы известными в этой области методами молекулярной биологии. Например, если нужно получить один или несколько биокатализаторов в гетерологической системе, то можно использовать такие методы для получения вектора, содержащего один или несколько генов, кодирующих один или несколько таких биокатализаторов. Вектор, содержащий один или несколько таких генов, может включать один или несколько регуляторных элементов, например один или несколько промоторов, которые могут быть функционально связаны с геном, кодирующим биокатализатор.

В настоящем изобретении термин функционально связан обозначает соединение полинуклеотидных элементов (или кодирующих последовательностей или нуклеотидных последовательностей) в функ

- 14 018381 циональной взаимосвязи. Последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана, если она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию кодирующей последовательности.

В настоящем изобретении термин промотор обозначает фрагмент нуклеиновой кислоты, который функционирует, контролируя транскрипцию одного или нескольких генов, и располагается перед сайтом инициации транскрипции гена относительно направления транскрипции, а в структурном отношении отличается наличием места связывания ДНК-зависимой РНК-полимеразы, сайтов инициации транскрипции и иных последовательностей ДНК, в том числе мест связывания факторов транскрипции, мест связывания белков-репрессоров и белков-активаторов и иных последовательностей нуклеотидов, известных в этой области, которые, действуя прямо или косвенно, регулируют степень транскрипции из промотора. Конститутивный промотор есть такой промотор, который активен в большинстве экологических и онтогенетических ситуаций. Индуцибельный промотор есть такой промотор, который активен при экологической или онтогенетической регуляции.

Термин гомологичные, когда он используется для обозначения взаимосвязи между данной молекулой (рекомбинантной) нуклеиновой кислоты или полипептида и данным организмом или клеткамихозяевами, подразумевает то, что в природе эта молекула нуклеиновой кислоты или полипептида вырабатывается клетками хозяина или организмами того же самого вида, предпочтительно той же самой разновидности или штамма.

Промотор, который может использоваться для осуществления экспрессии нуклеотидных последовательностей, кодирующих ферменты, используемые в способе изобретения, как-то описанные выше, может быть нативным для нуклеотидной последовательности, кодирующей экспрессируемый фермент, или может быть гетерологичным для той нуклеотидной последовательности (кодирующей последовательности), с которой он функционально связан. Предпочтительно промотор является гомологичным, т.е. эндогенным для клеток хозяина.

Если используется гетерологичный (для нуклеотидной последовательности, кодирующей данный фермент) промотор, то он предпочтительно способен обеспечить более высокий стационарный уровень транскрипта, содержащего кодирующую последовательность (или способен продуцировать больше молекул транскрипта, т.е. молекул мРНК, за единицу времени), чем промотор, нативный для кодирующей последовательности. Подходящими промоторами в этом плане являются как конститутивные, так и индуцибельные природные промоторы, а также подвергнутые инженерии промоторы, которые хорошо известны специалистам в этой области.

Сильный конститутивный промотор есть такой промотор, который запускает транскрипцию мРНК с высокой частотой по сравнению с нативными клетками-хозяевами. Примеры таких сильных конститутивных промоторов в грамположительных микроорганизмах включают 8Ρ01-26, 8Ρ01-15, усд. рус (промотор пируваткарбоксилазы) и атуЕ.

Примеры индуцибельных промоторов в грамположительных микроорганизмах включают индуцируемый ΙΡΤΟ промотор Ркрас и индуцируемый ксилозой промотор Рху1А.

Примеры конститутивных и индуцибельных промоторов в грамотрицательных микроорганизмах включают 1ас, 1с1, 1гр-1е1, 1рр, 1ас, 1рр-1ас, 1аск|, Τ7, Τ5, Τ3, да1, 1гс, ага (Рв_Аи), 8Р6, λ-Ρ_Β и λ-Ρ_Σ.

Термин гетерологичные, когда он применяется в отношении нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) или белка, означает то, что нуклеиновая кислота или белок не встречается естественным образом в составе того организма, клетки, генома либо последовательности ДНК или РНК, в которых они находятся, или же они находятся в таких клетках или таком месте в геноме или последовательности ДНК или РНК, которые отличаются от тех, в которых они встречаются в природе. Гетерологичные нуклеиновые кислоты или белки не являются эндогенными для тех клеток, в которые они введены, а были получены из других клеток либо синтетическим или рекомбинантным способом. Обычно, хотя и не обязательно, такие нуклеиновые кислоты кодируют белки, которые в норме не вырабатываются теми клетками, в которых происходит транскрипция или экспрессия ДНК. Аналогичным образом экзогенная РНК кодирует белки, которые в норме не экспрессируются в тех клетках, в которых находится эта экзогенная РНК. Гетерологичные нуклеиновые кислоты и белки также могут именоваться чужеродными нуклеиновыми кислотами или белками. Любая нуклеиновая кислота или белок, которую специалист в этой области признает гетерологичной или чужеродной тем клеткам, в которых она подвергается экспрессии, в настоящем изобретении охватывается термином гетерологичная нуклеиновая кислота или белок.

Способ по изобретению может выполняться с использованием организма, который может представлять собой организм-хозяина, в частности, микроорганизм-хозяина, или микроорганизм дикого типа. Соответственно, изобретение также касается новых клеток (хозяев), которые могут представлять собой микроорганизм, содержащий биокатализатор, способный катализировать по меньшей мере одну стадию реакции в способе изобретения, а предпочтительно клетки способны вырабатывать фермент или несколько ферментов, катализирующих две или несколько стадий реакции в способе изобретения. Изобретение также касается новых векторов, содержащих один или несколько генов, кодирующих один или несколько ферментов, способных катализировать по меньшей мере одну стадию реакции в способе изо

- 15 018381 бретения.

В одном воплощении предусмотрены клетки или вектор, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, которая может быть рекомбинантной, кодирующей фермент с активностью гидрогеназы сложных эфиров или тиоэфиров 5-карбокси-2-пентеноата, в частности, с активностью гидрогеназы 5карбокси-2-пентеноата.

Предпочтительно клетки дополнительно содержат (рекомбинантный вектор, содержащий) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, выбранный из числа ферментов, способных катализировать превращение эфиров или тиоэфиров адипата, в частности адипил-СоА, в 5-ЕУА, и ферментов, способных катализировать превращение сложных эфиров или тиоэфиров адипата, в частности адипил-СоА, в адипиновую кислоту.

В частности, в одном воплощении, в котором клетки содержат фермент, способный катализировать превращение эфиров или тиоэфиров адипата в 5-ЕУА, клетки могут предпочтительно содержать (рекомбинантный вектор, содержащий) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, способный катализировать превращение 5-ЕУА в 6-АСА. Такой фермент, в частности, может обладать активностью аминотрансферазы 5-ЕУА.

Наряду с этим или вместо этого клетки-хозяева или же вектор содержат по меньшей мере одну из следующих последовательностей нуклеиновых кислот:

последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, способный катализировать образование эфира или тиоэфира 3-оксоадипата при реакции эфира или тиоэфира сукцината с эфиром или тиоэфиром ацетата;

последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, способный катализировать образование эфира или тиоэфира 3-гидроксиадипата из эфира или тиоэфира 3-оксоадипата;

последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, способный катализировать образование эфира или тиоэфира 5-карбокси-2-пентеноата из эфира или тиоэфира 3-гидроксиадипата;

последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, способный катализировать образование эфира или тиоэфира адипата из эфира или тиоэфира 5-карбокси-2-пентеноата.

Один или несколько подходящих генов, в частности, можно выбрать среди генов, кодирующих ферменты, приведенные выше, более предпочтительно среди генов, кодирующих ферменты согласно любым из 8ЕО ΙΌ N0: 1-67, 94, 96, 98, 100, 102, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 116, либо гомологичные им.

Клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими. В частности, клеткихозяева могут быть выбраны из числа бактерий, архебактерий, дрожжей, грибов, простейших, растений и животных (включая человека).

В частности, клетки-хозяева по изобретению могут быть выбраны из группы родов, состоящей из АврегдШив, ВасШив, СогупеЬас1егшт, ЕвсйепсЫа, 8ассНаготуссв. Рвеийотопав, О1исопоЬас1ег, Рсшеййит, Р1сЫа. В частности, штамм и тем самым клетки-хозяева могут быть выбраны из числа Е. сой, Васй1ив виЬййв, ВасШив ату1о1|циеГас1епв, СогупеЬас1егшт д1и1ат1сит, АврегдШив шдег, РешсШшт сйгуводепит, РкЫа рав1ог1в, 8ассйаготусев сегеу1в1ае.

Предпочтительными могут быть клетки-хозяева, способные вырабатывать короткоцепочечные жирные кислоты типа сукцината и/или ацетата и/или их эфиры либо тиоэфиры. Способные к этому организмы обычно присутствуют в рубце желудка жвачных. В частности, предпочтительны организмы, способные одновременно вырабатывать сукцинат и ацетат либо их эфиры или тиоэфиры.

Микроорганизмы могут быть рекомбинантными или дикого типа. В частности, микроорганизмы, способные вырабатывать сукцинат, включают Е. сой, АсОпоЬасШив (в частности, А. висстодепев), МаппЙе1т1а (в частности, М. висс1шс1ргойисепв), 8ассйаготусев сегеу1в1ае, АврегдШив (в частности, А. шдег), РешсШшт (в частности, Р. сйгуводепит и Р. в1трйс1вв1тит) и другие организмы, указанные в КаетМсй ТпИата, М.1. Наир!, 8ругов А. 8уогопов, Хией ΖΙππίβ, ЕС. Мооге, К.Т. 8йаптидат, Ь.0. 1пдгат. Вю1есйпо1оду апй Вюепдтеегтд (2007) 99, 5: 1140-1153.

В частности, микроорганизмы, способные вырабатывать ацетат, включают Еп1егоЬас1епасеае (в частности, Е. сой, 8а1топе11а и 8Ь1де11а), уксуснокислые бактерии, в том числе Асе1оЬас1ег (в частности, Асе1оЬас1ег асей), О1исопоЬас1ег (в частности, О1исопоЬас1ег ох1йапв), АсШотопав, 61исопасе1оЬас1ег, Ава1а, Ко/ак1а, 8татшаШаша, 8ассйапЬас1ег, №оава1а, ОгапийЬас1ег, С’1ов1пйшт (в частности, С. асейсит, С. Шегтоасейсит, С. ШегтоаШойорЫсит, С. Гогткоасейсит, С. к1иууей, С. ргорюшсит), Медавркаега (в частности, М. е1вйепй), Асе1оЬас1егшт (в частности, А. мюойй и А. Меппдае), йасЮЬасШив (в частности, Ь. р1ап1агит, Ь. Ьгеуцт), В1ййоЬас1егшт (в частности, В. Ьгййит) и йеисоповЮс.

Изобретение также касается новых полипептидов, соответственно и последовательностей нуклеотидов, кодирующих такие полипептиды. В частности, изобретение также касается полипептидов, содержащих аминокислотные последовательности согласно любым из 8ЕО ΙΌ N0: 57, 68-72, 79, 85, а также гомологичные им. В частности, изобретение также касается полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности согласно любым из 8Е0 ΙΌ N0: 57, 68-72, 79, 85, а также гомологичные им.

Далее изобретение раскрывается на следующих примерах.

- 16 018381

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Примеры

Пример 1. Общие методы

Молекулярные и генетические методы Стандартные генетические методы и методы молекулярной биологии в общем известны и были описаны ранее (Машайк е! а1. 1982 Мо1еси1аг с1опшд: а 1аЬота!оту тапиа1. Со1й 8рппд НатЬот ЬаЬога!оту, Со1й 8рппд НагЬог, Ν.Υ.; М111ег 1972 Е.хрептепй ίη то1еси1аг депейск, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1й 8рппд НагЬог; 8атЬгоок апй ВиккеИ 2001 Мо1еси1аг с1оп1пд: а 1аЬота!оту тапиа1 (3гй еййюп), Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬота!оту, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬота!оту Ргекк; Р. АикиЬе1 е! а1., ейк., СиггегИ рго!осо1к ίη то1еси1аг Ью1оду, Стееп РиЬШЫпд апй Айеу 1п1ег8с1епсе, Νον Υο^к 1987).

Плазмиды и штаммы

Плазмиды рВЛЭ/Мус-Нй С и рЕТ21й получали из фирм 1пуйтодеп (Саг1кЬай, СА, США) и ЕМЭ Вюкаепсек (ЭагткИйк Германия), соответственно. Плазмиды рР1 13 (производная рйЕ119ЕН (ЕшКе ЕР., А. Рапкедгаи, В. Егапк, Н. В1оскег, Р. 8сЬо1/, М. Вадйакапап, апй Е. Ьапка. 1986. Мо1еси1аг с1опшд оГ Не ρΕίδΐηίά ВР4 рптаке тедюп ш а тиЫ-ЬокЕгапде !асР ехртеккюп уес!ог. Сепе 48:119-131), которая содержит два сайта в положениях 515 и 5178, соответственно, при нумерации, начинающейся из промотора 1ас, ρАСΥС-ΐас (Кгатег М. (2000) ИйегкисЬипдеп /ит ЕшПикк етЬбЫет ВетеЙ8!е11ипд уоп Егу1Ьгоке-4РЬокрЬа! ипй РЬокрЬоепо1ругиуа1 аиР йеп КоЫепкЮГГПикк ш йеп Агота1епЬю8уп111е8е\уед уоп ЕксЬепсЫа со11. ВепсЫе йек ЕогксЬипдкхеШгитк Йи11сН, 3824. Ι88Ν 0944-2952 (РЮ ТЬек18, Ишуегкйу оГ Эи88е1йогГ) и рМ8470 (Вакег Ό., 21еде1ш С., Рапкедгаи А., Кгий V., Ьапка Е. Шс1ею Ас1йк ВекеатсЬ 1992, 20(8), 18511858) были описаны ранее. Для всех процедур клонирования использовали Е. со11 Тор10 (1пу|1годеп, Саг1кЬай, СА, США). Для экспрессии белков использовали штаммы Е. со11 Тор10 Цпуйтодеп, Саг1кЬай, СА, США), Ву308 (АТСС31608), Ву308ДатаВ и ВЬ21 А1 Цпуйтодеп, Саг1кЬай, СА, США).

Все векторы адаптировали путем вставки общего линкера, что позволяло применять одинаковую стратегию клонирования. Схема адаптирования и общая схема клонирования представлены на фиг. 2.

Среды

Для культивирования Е. со11 использовали среду 2xΤΥ (16 г/л триптопептона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л №1С1). Для поддержания плазмид добавляли антибиотик (100 мкг/мл ампициллина). Для индуцирования экспрессии генов использовали арабинозу (для производных рВАЭ), 1РТС (для производных рМ8470 и рЕ113) и комбинацию из арабинозы и 1РТС (для производных рЕТ21й в Е. со11 ВЬ21А1) в конечных концентрациях 0,005-0,2% (арабиноза) и 0,1-0,5 мМ (1РТС).

Идентификация плазмид

Плазмиды, несущие различные гены, идентифицировали такими общеизвестными генетическими, биохимическими и/или фенотипическими способами, как устойчивость трансформантов к антибиотикам, диагностический анализ трансформантов методом ПЦР, очистка плазмидной ДНК и рестрикционный анализ очищенной плазмидной ДНК либо анализ последовательности ДНК.

Анализ методом ВЭЖХ-МС для определения производных СоА

Концентрации адипил-СоА и 6-карбокси-2,3-енгексаноил-СоА определяли методом ЖХ-МС. Для разделения использовали колонку Адйеп1 8В-С18 2,1x50 мм со смесью ацетонитрил/вода, забуференной 750 мг/л ацетатом октиламмония (рН=7,5), в качестве подвижной фазы. Расход составлял 300 мкл/мин, а элюция проводилась с помощью градиента (начало: 70% воды, снижение до 58% за 3 мин, снижение до 45%, дальнейшее снижение до 20% за 1,5 мин, а затем уравновешивание колонки таким образом, что общее время работы составляло 7 мин). Использовали ЕТЦ-огЬйгар в режиме электрораспыления с отрицательной ионизацией, сканируя в интервале т/ζ 765-900. Адипил-СоА и 6-карбокси-2,3-енгексаноилСоА выходили через 2,25 и 2,5 мин, соответственно. Избирательность метода повышали путем наблюдения правильным образом протонированных молекул требуемых соединений (адипил-СоА: 894.15123894.16017, 6-карбокси-2,3-енгексаноил-СоА: 892.13437-892.14329). Для определения концентраций строили стандартную кривую на основе синтезированных соединений и рассчитывали детекторные характеристики для соответствующих ионов. Их использовали для расчета концентраций в искомых образцах.

Адипат можно детектировать и количественно определять так, как описано в К1ррепЬетдет М., Аш1егИа11ег В., Моойда! С.К. Апа1. Вюапа1. С1ет. 2008, 392(7-8), 1459-1470.

Пример 2. Определение 6-карбокси-2,3-енгексаноил-СоА-редуктазной активности Экспрессирующие конструкции

Предполагаемые 6-карбокси-2,3-енгексаноил-СоА-редуктазы отбирали из баз данных (табл. 1).

Намеченные гены, кодирующие отобранные белки, подвергали оптимизации пар кодонов (по методике, описанной в АО 08000632) и конструировали путем синтеза (Сепеай, ВедепкЬигд, Германия). Перед оптимизацией из аминокислотной последовательности удаляли наводящие последовательности (напр., сигналы секреции или последовательности, наводящие на пероксисомы/митохондрии). Такие наводящие последовательности можно идентифицировать хорошо известными методами биоинформатики, как-то описанными в Етапиеккоп е! а1. 2007. №11иге Рго1осо1к, 2: 953-971). При оптимизации избегали

- 17 018381 внутренних рестрикционных сайтов, а вводили общие рестрикционные сайты в начале и в конце, которые позволяли клонировать по стратегии, приведенной на фиг. 2. Эти модификации могут привести к небольшим изменениям в последовательностях соответствующих белков, что никоим образом не должно изменить свойства соответствующих белков. Каждому ОЯР предшествовал консенсусный сайт связывания с рибосомой и ведущая последовательность, направляющая трансляцию в плазмидах рБ113, рМ8470 и рЕТ21б. В плазмиде рВАО сигналы инициации трансляции исходят от вектора. Целевые гены 'Аб14', Аб15', 'Аб18' и 'Аб1 9' клонировали во все 4 плазмиды вместе с или без участка считывания до С-концевой Ηίδ-метки, исходящей от последовательности линкера.

Экспрессирование белков в Е. сой

Предварительные культуры выращивали в течение ночи в 96-луночных планшетах при 200 мкл среды на лунку. Переносили 40-160 мкл в новые 24-луночные планшеты с 4 мл среды. Для конструкций рВАО в Е. со11 ТОР10 или Е. сой Яу308ДагаВ эта среда также содержала 0,005% арабинозы для индуцирования. Планшеты инкубировали на круговой качалке (1пГог8, 550 об./мин) при 25°С. Через 4-6 ч добавляли индукторы (0,5 мМ 1РТС для рБ113 и рМ8470 в Е. сой Εν308, Е. сой ВЬ21 или Е. сой ТОР10; 0,5 мМ 1РТС и 0,2% арабинозы для рЕТ21б в Е. сой ВБ21А1) и инкубировали планшеты еще 4-6 ч, после чего собирали клетки центрифугированием.

Получение бесклеточных экстрактов и очистка белков с Ηϊχ-меткой

Клетки из микрокультур (см. предыдущий абзац) собирали центрифугированием и отбрасывали супернатанты. Образовавшиеся при центрифугировании осадки клеток замораживали при -20°С как минимум на 16 ч, а затем оттаивали на льду. В каждую лунку добавляли 2 мл свежеприготовленного буфера для лизиса (50 мМ фосфата калия рН 7,5, 0,1 мг/мл ДНКазы I (Яосйе, А1теге, ΝΣ), 2 мг/мл лизоцима, 0,5 мМ Мд8О₄, 1 мМ дитиотреитола и ингибиторы протеаз (полная смесь в свободных от ЭДТА таблетках Μίηί™, Яосйе, А1теге, ΝΣ, использовали согласно спецификации изготовителя)) и ресуспендировали клетки, обрабатывая планшет на вибрационной мешалке в течение 2-5 мин. Для осуществления лизиса планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Чтобы удалить остатки клеток, планшет центрифугировали при 4°С и 6000/д в течение 20 мин. Супернатанты переносили в новый планшет и держали на льду до дальнейшего использования. Для очистки белков с Нщ-меткой использовали фильтровальные пластины Н18 Миййгар НР (СЕ НеаИйсаге Вюкаепсе АВ, иррка1а, 8\уебеп) согласно инструкциям изготовителя.

Синтез субстратов

Субстраты (ЕЯ. 81егп, А. бе1 СатрШо, I. Вю1. Сйет., 1956, 985; А.К. Оак, М.Ц. ИЫег, А.К. На|га, I. В1о1. Сйет., 2000, 24333; Н. Оки, Ν. Би1атог1, К. Макиба, Υ. 8ЫтаЬикиго, Т. Отте, Н. Еуакакг Вюкс. В1о1есй. Вюсйет., 2003, 2107; ЕМбде е! а1., I. Сйет. 8ос, 1953, 1793; Б. Ыи, Н-Υ. ΖΙιη, Ζ-1. Υао, I. Огд. Сйет., 2003, 6679-6684) и продукты нужных биохимических реакций синтезировали на фирме 8упсот (Сгошпдеп, ΝΣ) по опубликованным методикам.

Энзиматическое определение еноил-СоА

Готовили реакционную смесь, содержащую 50 мМ К-фосфатного буфера (рН7,5), по 0,7 мМ NΑ^Η и НАОРН и примерно 20 мкМ субстрата 6-карбокси-2,3-енгексаноил-СоА. В каждую лунку 96луночного планшета вносили 190 мкл реакционной смеси. В контроли добавляли 10 мкл бесклеточного экстракта, полученного из соответствующего штамма, несущего пустой вектор. Для запуска реакции в каждую лунку добавляли 10 мкл бесклеточного экстракта или очищенного белка. Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре (20-25°С) в течение от 15 мин до 24 ч при непрерывном отслеживании УФ-поглощения при 340 нм. По окончании реакций их останавливали добавлением равного объема МеОН и центрифугировали пробы. Супернатанты переносили в новый планшет и хранили при 80°С до дальнейшего анализа методом ВЭЖХ-МС. Как видно из табл. 1, был обнаружен адипил-СоА.

Таблица 1. Адипил-СоА (количество указано по относительной площади пика), обнаруженный при энзиматическом определении

Биокатализатор	8Е<) ΙΒ ΝΟ:	Модификация 1	Адипил-СоА2
А614	63	с Ν-конца удалены 134 аминокислоты	3266
А615	96		196031
А618	60	с Ν-конца удалены 22 аминокислоты	581859
Α6Ϊ9	100	с Ν-конца удалено 12 аминокислот	117077
- (контроль на вектор)			0

'Если полученный полипептид после модификации не начинается с метионина на Ν-конце, то данный полипептид подвергается дальнейшей модификации добавлением на Ν-конец метионина.

²Приведенные результаты получены с Е. сой ВЬ21, содержащими ген аб1, клонированный в рМ8470, после 20-часовой инкубации. Положительные результаты были также получены с другими экс- 18 018381 прессирующими векторами и штаммами (как-то рЕТ21й в Е. сой ВБ21-А1, рВАЭ/Мус-Нщ С в Е. сой Κν308 и рБ113 в Е. сой ВЬ21) при другой продолжительности инкубации (например, 2 ч).

Пример 3. Получение адипата при помощи гетерологичного микроорганизма Конструирование пути биосинтеза адипата

Был разработан путь синтеза, состоящий из энзиматических активностей, представленных на фиг.

3. Ферменты, кодирующие эти активности, были идентифицированы в базах данных. Намеченные гены, кодирующие эти ферменты, подвергали оптимизации пар кодонов и конструировали путем синтеза (Сепеагк КедепкЬитд, Германия). При оптимизации удаляли внутренние рестрикционные сайты, нежелательные наводящие последовательности (например, сигналы секреции или последовательности, наводящие на пероксисомы/митохондрии), а вводили рестрикционные сайты в начале и в конце, которые позволяли собрать весь путь в экспрессирующих векторах согласно фиг. 4. Эти модификации могут привести к небольшим изменениям в последовательностях белков, что никоим образом не должно изменить свойства соответствующих белков. Каждому ОКБ предшествовал консенсусный сайт связывания с рибосомой и ведущая последовательность, направляющая трансляцию.

Для реакций 1, 2 и 3 использовали комбинации аП121+22+23 или аП126+27+28. Для реакции 7 использовали аФ29, аФ30 или комбинацию аП124+25. Для реакции 4 можно использовать аП11-20 вместе с аФ8, аФ6, аП113+12.

Таблица 2. Номера 8ЕО ΙΌ различных белков Αάί

Белок	ΜΌ ΙΟ ΝΟ:
А(Н21	5
А<П22	18
ΑΠΪ23	33
ΑΠί24	119
Асй25	120
Αώ26	3
ΑΠΪ27	29
ΑΠΪ28	14
Α4Ϊ29	116
ΑΠΪ30	117

Конструирование продуцирующих адипат штаммов Е. еоП

Для конструирования продуцирующих адипат штаммов Е. сой соответствующие штаммы хозяина трансформировали плазмидами, кодирующими весь путь адипата, чтобы экспрессировать клонированные гены. Содержащими весь путь конструкциями рМ8470 трансформировали Е. сой ВЬ21, ТОР10 и Κν308. Конструкциями рВАЭ/Мус-Нщ С трансформировали Е. сой ТОР10 и Еу308АагаВ. Трансформацию конструкциями в рБ113 или рАСУС-1ас проводили вместе с совместимыми конструкциями рБ113, рАСУС-1ас или рМ8470 таким образом, чтобы конечный штамм содержал весь путь адипата. Этими плазмидами совместно трансформировали Е. сой ТОР10, ВЬ21 и Κν308.

Получение адипата

Для получения адипата выращивали предварительные культуры в течение ночи в 96-луночных планшетах с 200 мкл среды при 30°С. Переносили 50 мкл в новые 24-луночные планшеты с 4 мл среды и культивировали 4-6 ч при 25°С, а затем добавляли индукторы для индуцирования экспрессии пути адипата. Культуры инкубировали еще 12-72 ч при 25°С. Планшеты центрифугировали и готовили пробы для анализа методом ЖХ-МС. Супернатанты смешивали 1:1 с МеОН для осаждения белков, а затем подвергали анализу. Из клеток экстрагировали метаболиты, ресуспендируя осадки в 1 мл этанола. Суспензии клеток переносили в пробирки с винтовыми крышками и нагревали на кипящей водяной бане в течение 3 мин. После центрифугирования супернатанты переносили в новые пробирки и упаривали на установке Зреей-тас. Перед анализом сухие образцы ресуспендировали в 100 мкл подвижной фазы.

Пример 4. Получение 8-БУА из адипил-СоА

Анализ методом ВЭЖХ-МС для определения 5-ЕУА

5-БУА детектировали путем избирательного отслеживания реакции (8КМ)-М8, измеряя переход т/ζ 129 83. Концентрации 5-БУА рассчитывали путем измерения площади пика 5-БУА, выходящего примерно через 6 мин. Калибровку проводили по методике внешних стандартов. Все опыты по ЖХ-МС проводили на установке АдПеп! 1200 ЬС, состоящей из насоса для четырех компонентных смесей, автосамплера и печки для колонки, подсоединенной к масс-спектрометру с утроенным квадруполем АдПеп! 6410™.

Условия ЖХ

Колонка: предколонка Шс1ео511 С18, 5 мкм, 50x4,6 мм (Масйегу & №де1), соединенная с колонкой РгеуаП С18, 5 мкм, 250x4,6 мм внутр. диам. (А11!есй)

Температура колонки: комнатная температура

Элюент: А: вода, содержащая 0,1% муравьиной кислоты

В: ацетонитрил, содержащий 0,1% муравьиной кислоты

- 19 018381

Градиент: время (мин) % элюента В

О

6,1

Поток: 1,2 мл/мин, перед вхождением в МС разделяется 1:3

Вводимый объем: 2 мкл

Условия МС

Ионизация: электрораспыление отрицательных ионов параметры источника: напряжение при распылении ионов: 5 кВ температура: 350°С оптимизация напряжения на фрагментере и энергии столкновений

Режим сканирования: режим избирательной реакции: переход т/ζ 129^83.

Экспрессирующие конструкции

Отбирали предполагаемые адипил-СоА-редуктазы (8ЕЭ ΙΌ N0: 74, 75, 77, 79, 80, 139-148). Разрабатывали экспрессирующие конструкции и получали их таким же образом, как описано ранее в примере 2, используя рВАО/Мус-Ηίδ С и рΕΤ21ά.

Экспрессирование, экстрагирование и очистка белков

Все операции выполняли так, как описано в примере 2.

Энзиматическое определение адипил-СоА-редуктазы

Готовили реакционную смесь, содержащую 50 мМ К-фосфатного буфера (рН7,5), по 0,7 мМ ΝΑΌΗ и ΝΑΌΡΗ и от 10 мкМ до 10 мМ субстрата - адипил-СоА. В каждую лунку 96-луночного планшета вносили 190 мкл реакционной смеси. Адипил-СоА получали так, как описано в примере 2. Для запуска реакции в каждую лунку добавляли 10 мкл бесклеточного экстракта или очищенного белка. В контроли добавляли 10 мкл бесклеточного экстракта, полученного из соответствующего штамма, несущего пустой вектор. Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре (20-25°С) в течение от 15 мин до 24 ч при непрерывной регистрации УФ-поглощения при 340 нм. По окончании реакций их останавливали добавлением равного объема МеОН и центрифугировали пробы. Супернатанты переносили в новый планшет и хранили при -80°С до определения 5-РУА методом ВЭЖХ-МС. Измерение 5-РУА отражает адипил-СоА-редуктазную активность отобранных ферментов.

Пример 5. Получение 6-АСА из 5-РУА

Анализ методом ВЭЖХ-МС для определения 6-АСА

Калибровка

Калибровку проводили по внешней калибровочной линии 6-АСА (т/ζ 132 т/ζ 114, В! = 7,5 мин). Все опыты по ЖХ-МС проводили на установке АдПеп! 1100, снабженной насосом дл четырехкомпонентных смесей, дегазатором, автосамплером, печкой для колонки и масс-спектрометром с одинарным квадруполем (АдИей, ^аИЬгопп, Германия).

Условия ЖХ-МС

Колонка: Шс1ео511 50x4 (Мапс11егеу-№де1) + Ρ^еνа^1 С18 250x4,6 (А111есН), обе при комнатной температуре (ΒΤ)

Элюент: А = 0,1% об. муравьиная кислота в ультрачистой воде В = ацетонитрил (ч.д.а., Мегск)

Поток: 1,0 мл/мин, перед вхождением в МС разделяется 1:3

Градиент: начинается в ΐ = 0 при 100% об. А, оставаясь таким в течение 15 мин, и меняется до 80% об. В за 15 мин (ΐ = 30 мин), а с 30 до 31 мин он остается постоянным при 80% об. В

Вводимый объем: 5 мкл

МС-детекция: Е8Д+)-МС

Электрораспылительная ионизация (Ε8Ι) проводилась в положительном режиме сканирования при следующих условиях: т/ζ 50-500, фрагментер на 50 В, длина шага 0,1 т/ζ, температура осушающего газа 350°С, подача осушающего газа 10 л ^/мин, давление в распылителе 50 фунт/квадр.дюйм и напряжение в капилляре 2,5 кВ.

Клонирование намеченных генов

Проектирование экспрессирующих конструкций

Во все гены добавляли сайты айВ перед сайтом связывания с рибосомой и старт-кодоном и после стоп-кодона, что способствует клонированию по технологии Са1е^ау (1пу|1годеп, СаткЬай, СА, США).

Синтез генов и конструирование плазмид

Синтетические гены получали из ^NΑ2.0 и подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в Е. со! по стандартным методикам ^NΑ2.0. Гены аминотрансфераз из У1Ьтю Πυνίη1ί5 1817 |8ЕЭ ΙΌ Νο. 86] и ВасШик \\'е111епйер11апеп515 КВАВ4 |8ЕЭ ΙΌ Νο. 89], которые кодируют аминокислотные последовательности ω-аминотрансферазы У. Γ1υνίη1ί5 1817 |8ЕО ΙΌ Νο. 82] и аминотрансферазы В. теИепйерЬапепйк

- 20 018381

КВАВ4 (ΖΡ_01186960) |8Е0 ΙΌ №. 83], соответственно, подвергали оптимизации кодонов, а полученные при этом последовательности |8Е0 ГО №. 88] и |8Е0 ГО №. 91] получали путем синтеза ДНК.

Клетки, снабженные данными генами, именуются ниже как Е. сой ТОР10/рВАО-УЙ_АТ и Е. сой Т0Р10/рВ АО -В \те_АТ, соответственно.

Клонирование методом ПНР

Различные гены, кодирующие биокатализатор, амплифицировали из геномной ДНК методом ПЦР, используя специальную смесь РСВ 8ирегт1х Н1дй Е1бей1у (ИтуИгодеп) согласно спецификации производителя.

Реакции ПЦР анализировали методом электрофореза в агарозном геле и продукты ПЦР правильного размера элюировали из геля с помощью набора для очистки О1Ас.|шск РСВ ригШсайоп кН (О1адеп, Н11беп, Германия). Очищенные продукты ПЦР клонировали в экспрессирующие векторы рВАО/Мус-Н1кОЕ8Т по технологии Са1е\тау (1иуйгодеи) через введенные сайты аИБ с помощью вектора для введения р00КВ-хео (1пуИгодеп), как описано в методиках производителя. Последовательности генов, клонированных методом ПЦР, проверяли путем секвенирования ДНК. Таким образом получали экспрессирующие векторы рВАО-Вки_дй6077991_АТ (содержащий ген, представленный в 8ЕО ГО N0: 133, кодирующий пептид, представленный в 8Е0 ГО N0: 134), рВАО-Рае_д19946143_АТ (с помощью праймеров, приведенных в 8Е0 ГОк N0: 130 и 131), рВАО-Рае_д19951072_АТ (содержащий ген, представленный в 8Е0 ГО N0: 135, кодирующий пептид, представленный в 8Е0 ГО N0: 136), рВАО-Рае_д19951630_АТ (содержащий ген, представленный в 8Е0 ГО N0: 137, кодирующий пептид, представленный в 8Е0 ГО N0: 138).

Энзиматические реакции для превращения 5-формилпентановой кислоты в 6-АСА

Если не указано иначе, готовили реакционную смесь, содержащую 10 мМ 5-формилпентановой кислоты, 20 мМ рацемического α-метилбензиламина и 200 мкМ пиридоксаль-5'-фосфата в 50 мМ Кфосфатном буфере рН7,0. В каждую лунку 96-луночного планшета вносили 100 мкл реакционной смеси. Для запуска реакции в каждую лунку добавляли 20 мкл бесклеточного экстракта. Реакционные смеси инкубировали на качалке при 37°С в течение 24 ч. Кроме того, при тех же условиях инкубировали химическую холостую смесь (без бесклеточного экстракта) и биологическую холостую пробу (Е. сой ТОР10 с рВАО/Мус-Н1к С). Пробы анализировали методом ВЭЖХ-МС. Результаты приведены в следующей таблице.

Таблица 3. Образование 6-АСА из 5-ЕУА в присутствии аминотрансфераз

Биокатализатор	Концентрация б-АСА [мг/кг]
Е. сой ΤΟΡΙΟ/ρΒΑϋ-νίΙ АТ	43
Е. сой ТОРЮ/рВАО-Рае_рВАО- Рае 9946143	930
Е. сой ΤΟΡΙΟ/ρΒΑΌ-Рае АТ	25
Е. сой ΤΟΡ10/ρΒΑΏ-Β\νβ АТ	24
Е. сой ΤΟΡΙΟ/ρΒΑϋ-Взи 6116077991 АТ	288
Е. сойТОРЮ/рВАО-Рае ¢9951072 АТ	1087
Е. сойТОР 10/рВ Αϋ-Рас ¢9951630 АТ	92
Е. сой ТОРЮ/рВАО/Мус-Н1з С (биологический контроль)	0,6
Нет (химический контроль)	не обнаруживается

*метод отличался тем, что использовали 10 мкл бесклеточного экстракта вместо 20 мкл, концентрация пиридоксаль-5'-фосфата составляла 50 мкМ вместо 200 мкМ, а объем реакционной смеси в лунках составлял 190 мкл вместо 100 мкл

Показано, что 6-АСА образуется из 5-ЕУА в присутствии аминотрансферазы, а Е. сой способны катализировать её образование.

Claims (30)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. (1) обеспечение эфира или тиоэфира сукцината и введение в реакцию данного эфира или тиоэфира с эфиром или тиоэфиром ацетата с образованием эфира или тиоэфира 3-оксоадипата;

   1. Способ получения сложного эфира адипата или тиоэфира адипата, включающий превращение эфира 2,3-дегидроадипата или тиоэфира 2,3-дегидроадипата в эфир адипата или тиоэфир адипата в одну стадию в присутствии биокатализатора, включающего фермент, который способен катализировать восстановление двойной связи углерод-углерод в 2,3-еноатной группировке или в 2-еноильной группировке, в условиях для лучшей активности фермента.
2. (2) гидрогенизирование 3-оксогруппы эфира или тиоэфира 3-оксоадипата с образованием эфира или тиоэфира 3-гидроксиадипата;

   2. Способ по п.1, в котором биокатализатор включает фермент, выбранный из числа оксидоредуктаз, действующих на группу НС-СН доноров (ЕС 1.3.1 или 1.3.99), предпочтительно из числа оксидоредуктаз (ЕС 1.3.1 и 1.3.99), предпочтительно из числа еноил-СоА-редуктаз (ЕС 1.3.1.8, ЕС 1.3.1.38 и ЕС 1.3.1.44), из числа еноил[ацил-переносящий белок]редуктаз (ЕС 1.3.1.9, ЕС 1.3.1.10 и ЕС 1.3.1.39), из числа бутирил-СоА-дегидрогеназ (ЕС 1.3.99.2), ацил-СоА-дегидрогеназ (ЕС 1.3.99.3) и ацил-СоАдегидрогеназ длинноцепочечных жирных кислот (ЕС 1.3.99.13).
3. (3) дегидратацию эфира или тиоэфира 3-гидроксиадипата с образованием эфира или тиоэфира 2,3дегидроадипата;

   3. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором биокатализатор включает фермент, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из числа аминокислотных последовательностей, представленных любой из 8Е0 ГО N0: 42-67, 94, 96, 98, 100, 102, 103, 105, 107, 109, 111, 113,
4. (4) гидрогенизацию двойной связи С=С эфира или тиоэфира 2,3-дегидроадипата с образованием эфира или тиоэфира адипата и (5) гидролиз сложноэфирной связи или тиоэфирной связи с образованием адипиновой кислоты.

   4. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором биокатализатор включает фермент из организма, выбранного из числа ЕзсйепсЫа (в частности, Е. сой), УДЬгДо, ВасШиз (в частности, В. зиЫШз), С1оз!пбшт (в частности, С. Ииууеп, С. асеЮЬШуИсит и С. рейпидеиз), 81герЮтусез (в частности, 8. соейсо1ог и 8. ауегтйШз), Ρзеиботоηаз (в частности, Ρ. рийба и Ρ. аегидшоза), 8йе^аие11а, ХаиШотоиаз, Ху1е11а, УегзДша, Тгероиета (в частности, Т. беийсо1а), ЕиЬас1епит (в частности, Е. ругиуаДуогаиз), М1согзсШа (в частности, МДсогзсШа шаппа), Аегошоиаз (в частности, Аегошоиаз йубгорйПа), Медазрйега (в частности, Медазрйега е1збеий), АстеЮЬаШег зр., Эейюсоссиз (в частности, Эетососсиз габюбигаиз), Уагговда (в частности, Уагго\\Ш 1уро1уйса), Еидкиохоа (в частности, Еид1еиа дгасШз), 8ассйаготусез (в частности, 8. сегеуДзДае), К1иууеготусез (в частности, К. 1асПз), 8сЫхозассйаготусез (в частности, 8. ротЬе), СаибДба (в частности, С. !гор1сайз), АзрегдШиз (в частности, А. шдег и А. шби1аиз), ΡешсШшш (в частности, Р. сйгузодеиит), АгаЫборзДз (в частности, А. Шайаиа), Ното зарДеиз, Вайиз иогуедюиз, Воз !аигиз, СауДа зр., СаеиогйаЬбШз е1едаиз и Огозорййа те1аиодаз!ег.
5. 5. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором эфир 2,3-дегидроадипата или тиоэфир 2,3дегидроадипата получают путем превращения эфира 3-гидроксиадипата или тиоэфира 3гидроксиадипата.
6. 6. Способ по п.5, в котором эфир или тиоэфир 3-гидроксиадипата подвергают биокаталитическому превращению в присутствии биокатализатора, способного катализировать дегидратацию 3гидроксиацилэфира или 3-гидроксиацилтиоэфира до 2-еноилэфира или -тиоэфира, причем биокатализатор предпочтительно содержит фермент, выбранный из числа гидролиаз (ЕС 4.2.1), предпочтительно из числа еноил-СоА-гидратаз (ЕС 4.2.1.17), 3-гидроксибутирил-СоА-дегидратаз (ЕС 4.2.1.55) и еноил-СоАгидратаз длинноцепочечных жирных кислот (ЕС 4.2.1.74).
7. 7. Способ по п.6, в котором биокатализатор содержит фермент из организма, выбранного из числа

   АстеЮЬаШег (в частности, штамма Λ^Ρ1 АстеЮЬаШег зр. и А. саЮоасеДсиз), А1са11деиез (в частности, А1са11деиез Ό2), АзрегдШиз (в частности, А. шдег), Ахоагсиз (в частности, А. еуаизп), ВасШиз (в частности, В. йа1обигаиз), (в частности, С. дйШишсшп и С. аи^аηί^асиш), Е. сой, ЕШуоЬаЫепит, №игозрога (в частности, N. сгазза), Ρеη^с^11^иш (в частности, Ρ. сйгузодеиит), Ρзеибошопаз (в частности, Ρ. риПба и Ρ. Диогезсеиз), Вйоборзеиботоиаз (в частности, В. ра1из!пз), Вйобососсиз (в частности, штамма ВНА1 Вйобососсиз зр.), Аеготоиаз (в частности, А. сауДае), СЮзДлбшт (в частности, С. асеЮЬШуНсит и С. к1иууеп), Соззуртт (в частности, С. ЫгзШит), Вйобозрш11ит (в частности, В. гиЬгиш), Ва1зЮша (в частности, Ва1зЮша еШгорйа), Еид1егюхоа (в частности, Еид1еиа дгасШз), Медазрйега (в частности, М. е1збеш1) и 8ассйаготусез (в частности, 8. сегеуДзДае), а также млекопитающих (в частности, Воз !аигиз, Ното зарДеиз, Вайиз иогуедюиз и 8из зсго£а).
8. 8. Способ по любому из пп.5, 6 или 7, в котором эфир или тиоэфир 3-гидроксиадипата получают путем превращения эфира 3-оксоадипата или тиоэфира 3-оксоадипата.
9. 9. Способ по п.8, включающий биокаталитическое превращение эфира 3-оксоадипата или тиоэфира 3-оксоадипата в присутствии биокатализатора, в частности биокатализатора, способного катализировать восстановление карбонильной группы до спиртовой группы либо способного катализировать восстановление 3-оксоацилэфира или 3-оксоацилтиоэфира до соответствующего 3-гидроксиацилэфира или тиоэфира, выбранного из числа дегидрогеназ (ЕС 1.1.1), предпочтительно из числа 3-гидроксиацил-СоАдегидрогеназ (ЕС 1.1.1.35 и ЕС 1.1.1.36), 3-гидроксибутаноил-СоА-дегидрогеназ (ЕС 1.1.1.157), 3гидроксипимелоил-СоА-дегидрогеназ (ЕС 1.1.1.259) и 3-гидроксиацил-СоА-дегидрогеназ длинноцепочечных жирных кислот (ЕС 1.1.1.211).
10. 10. Способ по п.9, в котором биокатализатор включает фермент из организма, выбранного из числа АстеЮЬаШег (в частности, штамма Λ^Ρ1 АстеЮЬаШег зр. и А. са1соасеДсиз), А1са11деиез (в частности, штамма Ό2 А1сайдеиез и А. еШгорйиз), Агхоагспз (в частности, А. еуаизп), ВасШиз (в частности, В. йа1обигаиз), Вогбе!е11а (в частности, В. рейиззДз), Вигкйо1бепа (в частности, В. рзеибота11е1 и В. хеиоуогаиз), СогуиеЬаШепит (в частности, С. дйШишсшп, С. аигаШ1асит и С. еДтаеиз), Эетососсиз (в частности, Ό. габюбигаиз), Е. сой, Е1ауоЬас!епит, К1еЬз1е11а (в частности, К. риеитоша), Ρзеибошопаз (в частности, Ρ. рийба и Ρ. Диогезсеиз), Вйоборзеиботоиаз (в частности, В. ра1из!пз), Вобососсиз (в частности, В. егуШгоройз, В. орасиз и штамма ВНА1 Вобососсиз зр.), АзрегдШиз (в частности, А. шдег), №игозрога (в частности, N. сгазза), Ρеп^с^11^иш (в частности, Ρ. сйгузодеиит), 8ассйаготусез, Воз !аигиз, Вайиз иогуедюиз, 8из зсго£а, Ното зарДеиз, а также С1оз!пбтт (в частности, С. асеЮЬШуйсит и С. к1иууеп), Еид1егюхоа (в частности, Еид1еиа дгасШз), Медазрйега (в частности, Медазрйега е1збеη^^). Ва1зЮша (в частности, Ва1зЮша еШгорйа) и 2оод1оеа (в частности, 2оод1оеа гапидега).
11. 11. Способ по любому из пп.8, 9 или 10, в котором эфир 3-гидроксиадипата или тиоэфир 3гидроксиадипата получают путем введения в реакцию эфира сукцината или тиоэфира сукцината с эфиром ацетата или тиоэфиром ацетата.
12. 12. Способ по п.11, включающий проведение биокаталитической реакции эфира или тиоэфира сукцината с эфиром или тиоэфиром ацетата в присутствии биокатализатора, предпочтительно биокатализатора, включающего фермент, способный переносить ацетильные группы, выбранный из числа ацил
13. 13. Способ по п.11 или 12, в котором биокатализатор включает фермент из организма, выбранного из числа Асте1оЬас1ег (в частности, штамма АЭР1 Асте1оЬас1ег зр. и А. са1соасебсиз), АдгоЬасЮпит (в частности, А. ШтеЕатеиз), А1сабдеиез (в частности, штаммов Ό2 А1сабдеиез и А. еиЕгорбиз), Аг111гоЬас1ег, Агхоагсиз (в частности, А. емтзп), Ахотоиаз, Ахо1оЬас1ег, ВасШиз (в частности, В. НаШбигаиз), Вецег1иск1а, ВгабугЫхоЬшт, ВигкНо1бег1а, С1оз1г1б1а (в частности, С. Ииутеп), Сотатоиаз, СогуиеЬас1епит (в частности, С. дЫаткит и С. аигаибасит), Е. соб, Еи!егоЬас1ег, Екп'оЬасЮпит, Медазрбега (в частности, М. еЕбеии), Шса^а, Рзеиботоиаз (в частности, Р. рибба, Р. аегидтоза и штамма В13 Рзеиботоиаз зр.), Ва1з1оша (в частности, В. еШгорба), ВЫхоЬшт, ВНоборзеиботопаз (в частности, В. ра1из1г1з), Вобососсиз (в частности, В. егуШгоробз, В. орасиз и штамма ВНА1 Вобососсиз зр.), АзрегдШиз (в частности, А. шдег), Еид1егюхоа (в частности, Еид1еиа дгасШз), №игозрога (в частности, N. сгазза), РешсШшт (в частности, Р. сбгузодеиит), Вбобо!оги1а, 8ассбаготусез, Тпсбозрогои (в частности, Т. сШаиеит).
14. 14. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором любой из указанных эфиров выбран из числа биологических активирующих групп, в частности из числа кофермента А, фосфопантетеина, который может быть связан с ацил- или пептидил-переносящим белком, №ацетилцистеамина, метилтиогликолата, метилмеркаптопропионата, этилмеркаптопропионата, метилмеркаптобутирата, этилмеркаптобутирата и меркаптопропионата.
15. 15. Способ получения адипиновой кислоты, включающий получение эфира адипата или тиоэфира адипата способом по любому из предыдущих пунктов и гидролиз эфира адипата или тиоэфира адипата, полученного способом по любому из предыдущих пунктов, причем гидролиз предпочтительно катализируется биокатализатором, в частности биокатализатором, включающим фермент, выбранный из числа гидролаз (ЕС 3.1.2).
16. 16. Способ получения адипиновой кислоты, включающий получение эфира адипата или тиоэфира адипата способом по любому из пп.1-14 и перенос активирующей группы эфира адипата или тиоэфира адипата, полученного способом по любому из пп.1-14, причем перенос активирующей группы катализируется биокатализатором, предпочтительно биокатализатором, включающим фермент, катализирующий перенос содержащих серу групп (ЕС 2.8), более предпочтительно из числа СоА-трансфераз (ЕС 2.8.3).
17. 17. Способ получения 5-формилпентаноата, включающий получение эфира адипата или тиоэфира адипата способом по любому из пп.1-14 либо получение адипиновой кислоты способом по п.15 или 16 и превращение эфира адипата, тиоэфира адипата или адипиновой кислоты в 5-формилпентаноат.
18. 18. Способ по п.17, в котором превращение в 5-формилпентаноат катализируется биокатализатором, предпочтительно биокатализатором, включающим фермент, выбранный из числа оксидоредуктаз (ЕС 1.2.1), предпочтительно из числа альдегиддегидрогеназ (ЕС 1.2.1.3, ЕС 1.2.1.4 и ЕС 1.2.1.5), дегидрогеназ малонового полуальдегида (ЕС 1.2.1.15), дегидрогеназ янтарного полуальдегида (ЕС 1.2.1.16 и ЕС 1.2.1.24), дегидрогеназ глутарового полуальдегида (ЕС 1.2.1.20), дегидрогеназ аминоадипинового полуальдегида (ЕС 1.2.1.31), дегидрогеназ адипинового полуальдегида (ЕС 1.2.1.63) либо из числа альдегиддегидрогеназ (ацетилирующих) (ЕС 1.2.1.10), ацил-СоА-редуктаз жирных кислот (ЕС 1.2.1.42), ацилСоА-редуктаз длинноцепочечных жирных кислот (ЕС 1.2.1.50), бутанальдегидрогеназ (ЕС 1.2.1.57) и дегидрогеназ янтарного полуальдегида (ацетилирующих).
19. 19. Способ получения 6-аминокапроновой кислоты, включающий получение 5-формилпентаноата способом по п.17 или 18 и превращение 5-формилпентаноата в 6-аминокапроновую кислоту.
20. 20. Способ по п.19, в котором превращение катализируется биокатализатором, в частности биокатализатором, способным катализировать трансаминирование и/или восстановительное аминирование, предпочтительно биокатализатором, включающим фермент, выбранный из числа аминотрансфераз (ЕС 2.6.1) и дегидрогеназ аминокислот (ЕС 1.4.1), более предпочтительно из числа в-аминоизобутират:акетоглутарат-аминотрансфераз, β-аланин-аминотрансфераз, аспартат-аминотрансфераз, 4-аминобутиратаминотрансфераз (ЕС 2.6.1.19), Ь-лизин-6-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.36), 2-аминоадипатаминотрансфераз (ЕС 2.6.1.39), 2-аминовалерат-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.48), 2-аминогексаноатаминотрансфераз (ЕС 2.6.1.67), лизин:пируват-6-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.71) и лизин-6-дегидрогеназ (ЕС 1.4.1.18).
21. 21. Способ по п.19 или 20, в котором используют аминотрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0: 82, 8Е0 ΙΌ N0: 83, 8Е0 ΙΌ N0: 84, 8Е0 ΙΌ N0: 134, 8Е0 ΙΌ N0: 136, 8Е0 ΙΌ N0: 138 либо гомолог любой из этих последовательностей.

    - 21 018381

    115, 116, и их гомологов, в частности аминокислотную последовательность, выбранную из числа аминокислотных последовательностей, представленных любой из 8Е0 Ш N0: 60, 63, 96, 100, и их гомологов.
22. 22. Способ по пп.19, 20 или 21, в котором биокатализатор включает фермент из организма, выбранного из числа У1Ьпо; Рзеиботоиаз; ВасШиз; Мегсибабз; Азр1ешит; СегаЮша; млекопитающих; №игозрога; Езс11епс1па; ТНегтиз; 8ассбаготусез; Вге\'|Ьас1епит; СогуиеЬас1епит; Рго!еиз; АдгоЬас1епит; СеоЬасШиз; Асте1оЬас!ег; Ва1з1оша и 8а1тоие11а.

    - 22 018381 трансфераз (ЕС 2.3.1), в частности из числа ацетил-СоА:ацетил-СоА С-ацетилтрансфераз (ЕС 2.3.1.9), ацил-СоА:ацетил-СоА С-ацилтрансфераз (ЕС 2.3.1.16) и сукцинил-СоА:ацетил-СоА Ссукцинилтрансфераз (ЕС 2.3.1.174), более предпочтительно фермент, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕО ΙΌ N0: 1-13, либо ее гомолог.
23. - 23 018381 бом по любому из пп.19-22 и циклизацию 6-аминокапроновой кислоты с образованием капролактама.

    23. Способ получения капролактама, включающий получение 6-аминокапроновой кислоты спосо
24. 24. Клетка-хозяин, содержащая одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих фермент, охарактеризованный в любом из пп.1-4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 20-22, предпочтительно содержащая по меньшей мере две последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих разные ферменты, охарактеризованные в любом из пп.1-4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 20-22.
25. 25. Клетка-хозяин по п.24, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, представленный любой из 8ЕО Ш N0: 42-67, 8Е0 Ш N0: 74-81, 94, 96, 98, 100, 102, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 116, либо его гомолог.
26. 26. Способ по любому из пп.1-23, включающий приведение в контакт клеток, содержащих биокатализатор, который может включать клетку-хозяина по п.24 или 25, либо другой биокатализатор, со сбраживаемым источником углерода, причем источник углерода содержит любые из тех соединений, которые подлежат превращению в получаемое соединение, или же клетки производят соединение, подлежащее превращению в получаемое соединение, из этого источника углерода.
27. 27. Способ получения адипиновой кислоты из янтарной кислоты либо эфира или тиоэфира янтарной кислоты, необязательно по п.15 или 16, через множество реакций, причем по меньшей мере одна из реакций катализируется биокатализатором.
28. 28. Способ по п.27, включающий:
29. 29. Полипептид с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90% идентичности с любой из последовательностей, соответствующей 8ЕО Ш N0: 57, 68, 69, 70, 71, 72, 79 или 85.
30. 30. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по п.29.