TW201525140A

TW201525140A - 己二酸（酯或硫酯）之合成技術

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Publication number: TW201525140A
Application number: TW103131606A
Authority: TW
Inventors: Liang Wu; Axel Christoph Trefzer; Wildeman Stefaan Marie Andre De; Den Berg Marco Alexander Van
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 2008-03-11
Filing date: 2009-03-11
Publication date: 2015-07-01
Also published as: BRPI0908946A2; CN116515915A; ES2655710T3; US20110091944A1; LT2252698T; AU2009224087A1; US20140178949A1; SI2252698T1; EA018381B1; EP2252698B1; AU2009224087B2; HUE037878T2; WO2009113853A3; TWI567201B; US9096873B2; US20200239917A1; EA201001444A1; MY177321A; EP3346011A1; NO2252698T3

Abstract

本發明係關於一種用於製備己二酸酯或硫酯之方法。本發明進一步係關於一種用於由該酯或硫酯製備己二酸之方法。進一步本發明提供多種用於製備該酯或硫酯之中間物之方法。又復本發明係關於一種用於製備6-胺己酸(6-ACA)之方法、一種用於製備5-甲醯戊酸(5-FVA)之方法及一種用於製備己內醯胺之方法。此外，本發明係關於一種用於根據本發明之方法之宿主細胞。

Description

己二酸(酯或硫酯)之合成技術

發明領域

發明背景

己二酸(己烷二酸)可用於聚醯胺之製備等。此外，己二酸之酯類可用於塑化劑、潤滑劑、溶劑及多種聚胺甲酸酯樹脂。己二酸之其它用途為食品酸化劑、黏著劑、殺蟲劑、鞣皮及染色應用。已知之製備方法包括以硝酸氧化環己醇或環己酮或其混合物(KA油)。

己內醯胺為一種內醯胺，其也可用於聚醯胺例如尼龍-6或己內醯胺-月桂內醯胺共聚物(尼龍-6,12)之製造。技藝界已知多種由散裝化學品製備己內醯胺之方式，包括由環己酮、甲苯、酚、環己醇、苯或環己烷製備己內醯胺。

用於製備己二酸或己內醯胺之中間化合物諸如環己醇、環己酮或酚通常係得自礦油，有鑑於使用更佳綠色永續性技術來製備材料之需求的增長，期望提供一種方法，其中己二酸或己內醯胺係由可得自生物可再生來源或至少得自使用生物化學方法可轉化成己二酸或己內醯胺之中間化合物之一種中間化合物而製備。

於US 5,487,987，說明一種用於製備己二酸之方法，其中使用細菌細胞，其中碳源係以細菌細胞常見徑路或芳香族胺基酸生物合成而藉酶轉化成3-去氫莽草酸，來藉3-去氫莽草酸之生物催化轉化而製造順，順-己二烯二酸。隨後該順，順-己二烯二酸被化學還原(使用鉑催化劑)而製造己二酸。如此，最末步驟要求化學催化。本發明人進一步預期於細菌細胞所形成之芳香族中間物對細胞有毒，可能要求其於活體內以及於細胞培養中之濃度低。

已知由6-胺己酸(6-ACA)製備己內醯胺，例如 US-A 6,194,572所述。如於WO 2005/068643之揭示，經由於具有α,β-烯酸還原酶活性之酶存在下，經由轉化6-胺己-2-烯酸(6-AHEA)可以生物化學方式合成6-ACA。6-AHEA可由離胺酸例如以生物化學方式或藉純化學合成而製備。雖然藉WO 2005/068643所揭示之方法6-ACA可透過6-AHEA之還原而製備，但發明人發現於還原反應條件下，6-AHEA可能自發地實質上不可逆地環化而形成非期望的副產物，值得注意者為β-高脯胺酸。環化作用成為6-ACA製造上的瓶頸，結果導致產率的相當大損失。

發明概要

本發明之一個目的係提供一種用於製備可用於聚醯胺之製備及己二酸或己內醯胺或用於己二酸或己內醯胺之中間化合物之新穎方法，該方法可作為已知方法之替代方法。

又一目的係提供一種可克服前述缺點中之一項或多項之新穎方法。

根據本發明可解決之一個或多個目的將遵循後文說明。

發明人實現可由丁二酸(或其酯或硫酯)製備己二酸(或其酯或硫酯)。特別，發明人獲得結論，透過一系列特定反應例如類似於活細胞中之反向β-氧化反應及脂肪酸之生物合成，可由丁二酸(硫)酯及乙酸(硫)酯製備己二酸(硫)酯，如第2圖所示。此處，各個R分別表示活性基團(協助反應)，例如如後文說明。各個X分別表示S或O。ED/EDH₂表示已氧化的/已還原的電子施體，例如NAD/NADH、NADP/NADPH、FAD/FADH₂、或已氧化的鐵氧化還原蛋白/已還原的鐵氧化還原蛋白。電子的實際轉移可直接發生，或可藉中間電子載劑諸如輔酶或電子傳輸黃蛋白(ETF)媒介。Y-NH₂表示胺基施體，例如如後文說明。

如此，發明人獲得結論，須透過始於丁二酸(或其酯或硫酯)及乙酸(或其酯或硫酯)之反應串級而以生物催化方式製備己二酸(或其酯或硫酯)。進一步，實現己二酸可藉生物催化而轉化成5-甲醯戊酸(「5-FVA」，5-甲醯纈草酸)，其為6-ACA製備上的中間物，且用於本轉化可使用特定生物催化劑。

如此本發明係關於一種透過多個反應而由丁二酸酯或硫酯製備己二酸酯或硫酯之方法，其中該等反應中之至少一種反應係藉生物催化劑催化。

特別本發明係關於一種用於製備己二酸酯或己二酸硫酯之方法，包含於生物催化劑存在下將2,3-去氫己二酸(IUPAC名稱：5-羧-2-戊酸)酯或2,3-去氫己二酸硫酯轉化成己二酸酯或硫酯。

第1圖顯示由丁二酸酯或硫酯製備己二酸酯或硫酯；第2圖顯示轉殖策略綜論，只顯示相關特徵及限剪位置；第3圖顯示己二酸生物合成徑路；第4圖顯示用於組裝己二酸徑路之轉殖策略。

較佳實施例之詳細說明

於此處述及羧酸或羧酸鹽例如6-ACA、其它胺基酸、5-FVA、己二酸/己二酸鹽、丁二酸/丁二酸鹽、乙酸/乙酸鹽時，除非另行規定，否則此等術語表示包括以質子化之羧酸(自由態酸)、相對應之羧酸根(其軛合鹼)以及其鹽。當於此處述及胺基酸例如6-ACA時，本術語表示包括呈其兩性離子形式之胺基酸(其中胺基係呈質子化形式而羧酸基係呈去質子化形式)、其中胺基經質子化而羧基呈中性形式之胺基酸、及其中胺基呈中性形式及羧酸基呈去質子形式之胺基酸及其鹽類。

當述及羧酸之酯或硫酯例如己二酸酯或硫酯、乙酸酯或硫酯、丁二酸酯或硫酯時，此等術語表示包括任何活性基團，特別為任何生物活性基團包括輔酶A(也稱作為CoA)、磷代泛硫醇其可結合至醯基或胜肽載劑蛋白(分別為ACP或PCP)、N-乙醯基-半胱胺、甲基-硫代乙醇酸酯、甲基巰代丙酸酯、乙基-巰代丙酸酯、甲基-巰代丁酸酯、甲基-巰代丁酸酯、巰代丙酸酯及可提供相同的或類似的功能之其它酯類或硫酯類。於使用活細胞作為生物催化劑之情況下，酯或硫酯特別為CoA可使用生物催化劑製造或源自於也可製造用於催化該反應之適當酶之有機體。於多種有機體已經識別CoA-接合酶及CoA-轉移酶且可提供期望的活化酯或硫酯。

由丁二酸酯或硫酯製備己二酸酯或硫酯特別包含下列反應步驟(括弧間之數字也與第1圖之數字相對應)：(1)提供丁二酸酯或硫酯且將該酯或硫酯與乙酸酯或硫酯反應，藉此形成3-酮己二酸酯或硫酯；(2)氫化該3-酮己二酸酯或硫酯之3-酮基藉此形成3-羥己二酸酯或硫酯；(3)將該3-羥己二酸酯或硫酯去氫藉此形成2,3-去氫己二酸酯或硫酯；及(4)氫化該2,3-去氫己二酸酯或硫酯之C-C雙鍵，藉此形成己二酸酯或硫酯。

本發明亦係關於一種適合用於製備適合用於己二酸之製法之中間化合物之方法，包含於可催化此種反應步驟之生物催化劑存在下進行反應步驟1-4中之一或多者。

於一個實施例中，己二酸酯或硫酯被轉化成5-FVA(5)。

若有所需，己二酸酯或硫酯可轉化成己二酸。可藉水解酯鍵或硫酯鍵而達成(7)，藉此形成己二酸；或藉轉移反應而達成，其中「醇」部分或「硫醇」部分(諸如CoA)由該己二酸酯或硫酯轉移至與己二酸不同的酸，藉此形成己二酸及與己二酸不同的酸之(硫)酯(7)。若使用丁二酸或乙酸作為不同的酸，則本反應之優點在於醇部分或硫醇部分諸如CoA可被回收，例如己二醯-CoA+丁二酸根或乙酸根可被轉換(通常係於CoA轉移酶存在下)而形成丁二醯-CoA或乙醯-CoA+己二酸。丁二醯-CoA或乙醯-CoA然後可用作為本發明方法之起始化合物。

己二酸(或其酯或硫酯)例如可轉化成5-FVA(8)。

於一個實施例中，本發明方法所得之5-FVA轉化成6-ACA(6)。隨後6-ACA例如可以技藝界已知方式而轉化成己內醯胺。

於又一個實施例中，於根據本發明方法所得之己二酸或己內醯胺係用於聚醯胺之製備。

如此處使用之「一」等詞除非另行規定，否則係定義為「至少一個」。

當以單數型述及一個名詞(例如一化合物、一添加劑等)時，表示也包括複數型。

當述及存在有數種異構物之化合物(例如順式及反式異構物、R及S對映異構物)，原則上該等化合物包括特別可用於本發明方法之該化合物之全部對映異構物、非對映異構物及順/反異構物。

當酶係參照括弧內之酶類別(EC)說明時，該酶類別為基於國際生物化學及分子生物學聯合會命名委員會(NC-IUBMB)所提供之酶命名而歸類或可歸類，該命名可參考http：//www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/。其它尚未歸類為特定類別但可就此而歸類之適當酶也含括於此。

於此處以存取號碼述及蛋白質時，除非另行規定，否則該號碼特別係用來指2008年3月11日具有出現於Uniprot之序列之蛋白質。

「同系物」一詞用於此處特別係用於具有至少30%，較佳至少40%，更佳至少60%，更佳至少65%，更佳至少70%，更佳至少75%，更佳至少80%，特別至少85%，更特別至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%之序列相同度之多核苷酸或多胜肽。同系物一詞也表示由於遺傳密碼的簡併而與其它核酸序列不同，但編碼相同多胜肽序列之核酸序列(多核苷酸序列)。

序列相同度或類似度於此處定義為經由比較二序列而判定兩個或多個多胜肽序列或兩個或多個核酸序列間之關係。通常，序列相同度或類似度係比較序列的全長，但也可只比較彼此校準之序列部分。於技藝界，「相同度」或「類似度」也表示視情況而定由序列間之匹配程度，多胜肽序列或核酸序列間之序列相關程度。較佳測定相同度或類似度之方法係設計成可獲得所測試序列間之最大匹配度。於本發明之內文，測定二序列間之相同度及類似度之較佳電腦程式包括BLASTP及BLASTN(Altschul,S.F.等人，J.Mol.Biol.1990,215,403-410，由NCBI及其它來源可由工作取得(BLAST手冊，Altschul,S.等人，NCBI NLM NIH馬里蘭州貝斯達20894))。使用BLASTP做多胜肽序列比較之較佳參數為間隙開口10.0，間隙延長0.5，Blosum 62矩陣。使用BLASTN做核酸序列比較之較佳參數為序列開口10.0、序列延長0.5、DNA全矩陣(DNA相同度矩陣)。

於本發明方法中，使用生物催化劑，換言之，方法中之至少一個反應步驟係藉衍生自生物來源例如有機體，或衍生自有機體之生物分子之生物材料或生物部分所催化。生物催化劑特別包含一種或多種酶。生物催化劑可以任一種形式使用。於一個實施例中，使用分離自天然環境(分離自製造該酶之有機體)一種或多種酶例如呈溶液、乳液、分散液、凍乾細胞(之懸浮液)、溶解產物、或制動於撐體上之形式使用。使用分離自其來源有機體之酶特別有用，原因在於調整反應條件之彈性增高，故反應平衡朝向期望端移動。

於一個實施例中，一種或多種酶形成活有機體(諸如活全細胞)之一部分。酶可於細胞內部進行催化功能。也可能酶可分泌入細胞所存在的介質內。

活細胞可為生長中的細胞、休息靜止的細胞或休眠細胞(例如孢子)或於穩定期之細胞。也可使用構成可通透化細胞(亦即變成可通透酶基質或酶基質之前驅物)之一部分之酶。

用於本發明方法之生物催化劑原則上為任一種有機體，或可得自或衍生自任何有機體。有機體可為真核生物、原核生物或古菌。特別有機體可選自於動物(包括人類)、植物、細菌、古菌、酵母及真菌。

適當細菌特別係選自於由下列所組成之組群：棘子鬚黴屬(Absidia)、無色桿菌屬(Achromobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、產氣單胞菌屬(Aeromonas)、產鹼桿菌屬(Alcaligenes)、關節桿菌屬(Arthrobacter)、脫氮菌屬(Arzoarcus)、固氮單胞菌屬(Azomonas)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、固氮桿菌屬(Azotobacter)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、拜葉林克氏菌屬(Beijerinckia)、緩根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、Byssochlamys、檸檬酸菌屬(Citrobacter)、梭菌屬(Clostridium)、冠單胞菌屬(Comamonas)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、迪諾球菌屬(Deinococcus)、埃希氏菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、黃桿菌屬 (Flavobacterium)、細梭菌屬(Fusobacterium)、棉菌屬(Gossypium)、克雷白氏菌屬(Klebsiella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、李斯特氏菌屬(Listeria)、巨球菌屬(Megasphaera)、微球菌屬(Micrococcus)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、諾卡氏菌屬(Norcadia)、齒齦卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、初油酸菌屬(propionibacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、拉斯東氏菌屬(Ralstonia)、根瘤菌屬(Rhizobium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)、紅球菌屬(Rodococcus)、羅斯堡菌屬、許旺氏菌屬(Shewanella)、鏈絲菌屬(Streptomycetes)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、木質菌屬(Xylella)、耶氏菌屬(Yersinia)、密螺旋體屬(Treponema)、弧菌屬(Vibrio)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、發酵單胞菌屬(Zymomonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、沙門氏菌屬(Salmonella)、布魯氏菌屬(Brucella)、微顫菌屬(Microscilla)。

適當真核生物特別可選自於由下列所組成之組群：真菌；多細胞動物；Viridiplantae(特別為擬南芥屬(Arabidopsis)及衣滴蟲(Chlamydomonadales)；雙滴蟲目(Diplomonads)(特別賈第蟲(Giardiinae)；內阿米巴蟲(Entamoebidae)(特別為內阿米巴蟲(Entaboeba))；眼蟲門(Euglenozoa)(特別為眼蟲(Euglena)；Pelobiontida(特別為根足鞭毛藻(Mastigamoeba))；及Alveolata(特別為隱孢子蟲(Cryptosporidium))。

適當真菌特別包括選自於由下列所組成之組群中之真菌及酵母：黑黴屬(Rhizopus)、紅黴屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、麴菌屬(Aspergillus)、皮羅菌屬(Piromyces)、毛孢黴屬(Trichosporon)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、酵母屬(Saccharomyces)、紅酵母屬(Rhodotorula)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、雅羅氏菌屬(Yarrowia)(諸如分解脂肪雅羅氏菌(Yarrowia lypolytica))。

適當多細胞動物特別包括選自於由哺乳動物(包括人類)所組成之組群中之多細胞動物，更特別係選自於由兔科(Leporidae)、鼠科(Muridae)、豬科(Suidae)、牛科(Bovidae)、人科(hominidae)。生物催化劑可源自於多細胞生物之任何部分例如肝、胰、腦、腎、心或其它器官。適當多細胞動物也特別包括扁形蟲(Caenorhabditis)及果蠅(Drosophila)。

當描述本發明方法之特定反應步驟時特別可提供用於特定反應步驟之適當生物催化劑之有機體說明如下。

熟諳技藝人士顯然易知可使用具有用於根據本發明之方法之適當活性的天然生物催化劑(野生型)或天然生物催化劑之突變株。天然生物催化劑之性質可藉熟諳技藝人士已知之生物技術改良，諸如分子演化或理論設計而改良。野生型生物催化劑之突變株例如可經由使用熟諳技藝人士已知之突變發生技術(隨機突變發生、位置導向突變發生、導向演化、基因重組等)，經由修改可發揮生物催化劑作用或可製造生物催化部分(諸如酶)之有機體之編碼DNA而製造。特定言之，DNA經修改使得DNA編碼與野生型酶差異至少一個胺基酸之酶，因此編碼比較野生型包含一個或多個胺基酸取代、刪失及/或插入之酶，或讓突變株組合兩種或多種親代酶序列，或經由執行如此已修改之DNA於適當(宿主)細胞的表現。後者可藉熟諳技藝人士已知方法達成，諸如密碼子最適化或密碼子對最適化方法，例如基於WO 2008/000632所述方法。

突變株生物催化劑具有改良性質，例如就下列各面相中之一者或多者具有改良性質：對酶基質之選擇性、活性、安定性、溶劑耐性、pH輪廓資料、溫度輪廓資料、酶基質輪廓資料、對抑制作用之易感性、輔因子利用及酶基質親和力。具有改良性質之突變株可基於熟諳技藝人士已知方法應用例如適當高產出量篩檢或選擇方法加以識別。

作用於烷基或烷基酯或硫酯之酶之酶基質特異性可經修改。可利用分子演化而形成多樣性，接著為篩檢期望之突變株及/或合理基因改造酶基質結合口袋。用於本發明方法之酶之酶基質特異性修改技術可基於熟諳技藝人士已知方法。舉例言之，採用結構及序列資訊合理改造來設計特定突變株，已經用來修改得自紅黴素(erythromycin)聚酮化合物合成酶之醯基轉移酶作用部位4之酶基質特異性，俾接受其它醯基施體。業已顯示修改所提示之酶基質結合位置，結果導致已改性之結合口袋可配合其它酶基質，獲得不同的產物比(Reeves,C.D.；Murli,S.；Ashley,G.W.；Piagentini,M.；Hutchinson,C.R.；McDaniel,R.生物化學2001,40(51),15464-15470)。理論設計辦法及分子演化辦法皆曾用來變更生物催化劑BM3之酶基質特異性，結果導致替代中鏈脂肪酸(例如肉豆蔻酸)之天然酶基質或中鏈脂肪酸天然酶基質除外，獲得大量可氧化多種不同烯類、環烯類、芳烯類及雜芳烯類之突變株(Peters,M.W.；Meinhold,P.；Glieder,A.；Arnold,F.H.美國化學會期刊2003,125(44),13442-13450；Appel,D.；Lutz-Wahl,S.；Fischer,P.；Schwaneberg,U.；Schmid,R.D.生物技術期刊2001,88(2),167-171及其中之參考文獻)。

當述及得自特定來源之生物催化劑特別為酶時、特別表示含括源自於第一有機體但實際上係於(經基因修改的)第二有機體內製造之重組生物催化劑特別為酶作為得自第一有機體之生物催化劑特別為酶。

3-酮己二酸(酯或硫酯)之製備(「反應1」)

於本發明之實施例中，3-酮己二酸(酯或硫酯)係由丁二酸鹽及乙酸鹽製備，該丁二酸鹽及乙酸鹽實際上具有活化基，特別可獲得酯或硫酯來協助反應。

3-酮己二酸(酯或硫酯)可以生物催化方式或化學方式達成，特別係藉克萊森(Claisen)縮合反應達成，其中乙酸酯或硫酯與丁二酸酯或硫酯偶合。

於較佳本發明方法中，製備包含於可催化醯基轉移之生物催化劑存在下進行生物催化反應。具有此種催化活性之酶因而可稱作為轉醯酶。

於較佳方法中，醯基轉移係於兩種醯硫酯或醯酯之間進行。較佳醯硫酯為乙醯-CoA及丁二醯-CoA。較佳該催化劑對該醯硫酯具有選擇性。

生物催化劑特別包含可進行醯基轉移之酶，該酶係選自於由轉醯酶(E.C.2.3.1)所組成之組群，較佳係選自於由乙醯-CoA：乙醯-CoA C-乙醯轉移酶(EC 2.3.1.9)、醯-CoA：乙醯-CoA C-轉醯酶(EC 2.3.1.16)及丁二醯-CoA：乙醯-CoA C-丁二醯轉移酶(EC 2.3.1.174，也稱作為β-酮己二醯-CoA硫醇酶)所組成之組群。轉醯酶活性例如係說明於KEGG(基因及基因體之京都百科)基因庫中之β-氧化、脂肪酸生物合成、聚酮化合物之生物合成、或丁酸代謝中。

轉醯酶特別為選自於由古菌、細菌及真核生物所組成之組群中之有機體之轉醯酶。

特別，酶可源自於可分解包含芳香環結構或環脂族環結構特別為5、6、或7員環結構之有機化合物之微生物。有機化合物視需要可於環中包含一個或多個雜原子或作為取代基或取代基之一部分。舉例言之，有機部分可為芳香族化合物，特別為包含6-員環之芳香族化合物。特別該芳香族化合物可選自於苯基乙酸酯、苯甲酸酯、兒茶酚、藜蘆酸酯及龍膽酸酯。有機化合物可為環脂族化合物，特別為環狀醇諸如環己醇、環狀酮諸如環己酮、或環烷諸如環己烷。有機化合物可為內醯胺，諸如己內醯胺。於一個實施例中，酶係源自於可分解二羧酸(通常為C₆-C₁₀)，特別直鏈飽和二羧酸諸如己二酸之有機體。

於又一實施例中，以酶係源自於可合成3-酮-己二酸例如作為二次代謝物之一部分(例如馬洛諾黴素(malonomycin))之酶為佳，例如源自鏈絲菌屬(特別為裂紋鏈絲菌(Streptomyces rimosus)、得自放線菌屬(Actinomyces)、得自其它放線桿菌屬(Actinobacteria)或其它已知之二次代謝物製造者。

用於提供可催化3-酮己二酸(酯或硫酯)之製備之生物催化劑之較佳微生物進一步包括不動桿菌屬(特別為不動桿菌種系ADP1及乙酸鈣不動桿菌(A.calcoaceticus))、土壤桿菌屬(特別為根瘤土壤桿菌(A.tumefaciens))、產鹼桿菌屬(Alcaligenes)(特別為產鹼桿菌種系D2及營養產鹼桿菌(A.eutrophus))、關節桿菌屬、脫氮菌屬(特別衣凡氏脫氮菌(A.evansii))、固氮單胞菌屬、固氮桿菌屬、芽胞桿菌屬(特別為嗜鹽芽胞桿菌(B.halodurans))、拜葉林克氏菌屬、緩根瘤菌屬、伯克氏菌屬、梭菌屬(特別為克魯維梭菌(C.kluyveri)、乙醯丁酸梭菌(acetobutylicum)、拜葉林克梭菌(C.beijerinckii))、冠單胞菌屬、棒桿菌屬(特別為麩胺酸棒桿菌(C.glutamicum)及金橙黃棒桿菌(C.aurantiacum))、大腸桿菌(E.coli)、腸桿菌屬、黃桿菌屬、巨球菌屬(特別為艾氏巨球菌(M.elsdenii))、諾卡氏菌屬、假單胞菌屬(特別為普氏假單胞菌(P.putida)、綠膿桿菌(P.aeruginosa)及假單胞菌種系B13)、拉斯東氏菌屬(Ralstonia)(特別為營養拉斯東氏菌 (R.eutropha))、根瘤菌屬、紅假單胞菌屬(特別為沼澤紅假單胞菌(R.palustris))、紅球菌屬(特別為產紅紅球菌(R.erythropolis)、乳白紅球菌(R.opacus)及紅球菌種系RHA1)、麴菌屬(特別為黑麴菌(A.niger))、眼蟲門(特別為薄眼蟲(Euglena gracilis))、紅黴屬(特別為粗糙紅黴(N.crassa))、青黴屬(特別為產黃青黴(P.chrysogenum))、紅酵母屬、酵母屬、毛孢黴屬(特別為表皮毛孢黴(T.cutaneum))。

於特定實施例中，生物催化劑包含含以序列ID 1-13或其同系物中之任一者識別之胺基酸序列之酶。

3-羥己二酸(酯或硫酯)之製備(「反應2」)

於一實施例中，3-羥己二酸(酯或硫酯)係由3-酮己二酸(酯或硫酯)製備。通常3-酮己二酸被提供以如前文說明之活性基團。

原則上3-羥己二酸(酯或硫酯)可以化學方式製備，例如經由3-酮己二酸(酯或硫酯)中之3-酮基經選擇性氫化反應製備。

此種反應特別係於催化本反應步驟之生物催化劑存在下進行，特別為可催化酮基之還原，更特別為羰基還原成為羥基之生物催化劑。

於特定實施例中，3-酮己二酸係呈其帶有輔酶A之硫酯形式存在(後文中3-酮己二酸之硫酯及輔酶A將稱作為3-酮己二醯-CoA)。

於本發明之較佳方法中，該製備包含於可催化3-酮醯(酯或硫酯)還原成為3-羥醯(酯或硫酯)之生物催化劑存在下之生物催化反應。

具有此種催化活性之酶因而稱作為3-羥醯(酯或硫酯)去氫酶。因此對3-羥醯CoA-硫酯具有此種催化活性之酶稱作為3-羥醯CoA-去氫酶。較佳該3-羥醯CoA-去氫酶對酶基質3-酮己二醯-CoA具有選擇性。

可催化3-酮醯(酯或硫酯)還原成為3-羥醯(酯或硫酯)之酶特別係選自於由去氫酶(E.C.1.1.1)所組成之組群，較佳係選自於由3-羥醯-CoA去氫酶(EC 1.1.1.35及EC 1.1.1.36)、3-羥丁醯-CoA去氫酶(EC 1.1.1.157)、3-羥庚二醯-CoA去氫酶(EC 1.1.1.259)、及長鏈3-羥醯-CoA去氫酶(EC 1.1.1.211)所組成之組群。該等酶可使用NADH或NADPH作為輔因子。根據KEGG(京都基因及基因體百科)資料庫，3-羥醯-CoA去氫酶活性已經說明於例如脂肪酸代謝、聚酮化合物生物合成、聚羥烷酸代謝、丁酸代謝及芳香族化合物之分解。

特定言之，微生物可分解如前文識別之有機化合物(參考「反應1」)特別為芳香族化合物、環脂族化合物或二羧酸。

其它較佳用於提供可催化3-羥己二酸(酯或硫酯) 之製備之生物催化劑之有機體包括：不動桿菌屬(特別為不動桿菌種系ADP1及乙酸鈣不動桿菌(A.calcoaceticus))、產鹼桿菌屬(Alcaligenes)(特別為產鹼桿菌種系D2及營養產鹼桿菌(A.eutrophus))、脫氮菌屬(特別衣凡氏脫氮菌)、芽胞桿菌屬(特別為嗜鹽芽胞桿菌(B.halodurans))、博德氏菌屬 (Bordetella)(特別為百日咳桿菌(B.pertussis)、伯克氏菌屬(特別B.pseudomallei及B.xenovorans)、棒桿菌屬(特別為麩胺酸棒桿菌、金橙黃棒桿菌及有效棒桿菌(C.efficiens))、迪諾球菌屬(特別為輻射狀迪諾球菌(D.radiodurans))、大腸桿菌、黃桿菌屬、克雷白氏菌屬(Klebsiella)(特別肺炎桿菌(K.pneumonia))、假單胞菌屬(特別為普氏假單胞菌及螢光假單胞菌(P.fluorescens))、紅假單胞菌屬(特別為沼澤紅假單胞菌(R.palustris))、紅球菌屬(特別為產紅紅球菌(R.erythropolis)、乳白紅球菌(R.opacus)及紅球菌種系RHA1)、麴菌屬(特別為黑麴菌(A.niger))、紅黴屬(特別為粗糙紅黴(N.crassa))、青黴屬(特別為產黃青黴(P.chrysogenum))、酵母屬(特別為釀酒酵母(S.cerevisiae))。

用於提供作用於3-酮己醯-CoA之EC 1.1.1.35酶之適當有機體可得自任一種有機體包括哺乳動物，特別為選自於由歐洲牛(Bos taurus)、褐鼠(Rattus norvegicus)、歐洲豬(Sus scrofa)及人類(Homo sapiens)所組成之組群中之哺乳動物。

涉及(無氧)脂肪酸合成、聚酮化合物生物合成或聚羥烷酸代謝作用之適當生物催化劑可得自任一種有機體，特別為微生物包括：梭菌屬(特別乙醯丁酸梭菌及克魯維梭菌)、眼蟲門(特別為薄眼蟲)、巨球菌屬(特別為艾氏巨球菌)、拉斯東氏菌屬(特別為營養拉斯東氏菌)、及菌膠團(Zoogloea)(特別為分枝菌膠團(Zoogloea ramigera))。

於特定實施例中，生物催化劑(催化「反應2」) 包含一酶，該酶包含如序列ID 15-26、29或其同系物中之任一者所識別之胺基酸序列。特別預期包含根據序列ID 26之胺基酸序列之酶可催化「反應2」及「反應3」。

2,3-去氫己二酸(酯或硫酯)之製備(「反應3」)

於一實施例中，2,3-去氫己二酸(5-羧-2-戊酸)(酯或硫酯)係由3-羥己二酸(酯或硫酯)製備。任選地，2,3-去氫己二酸及3-羥己二酸偶合至如前文說明之輔酶、ACP或其它活性基團。

於本發明之一實施例中，經由以化學方式轉化3-羥己二酸(酯或硫酯)，例如於無水環境下於例如硫酸存在下去水可製備2,3-去氫己二酸(酯或硫酯)。

2,3-去氫己二酸特別係使用至少一種生物催化劑而由3-羥己二酸製備。

較佳生物催化劑為可催化3-羥醯酯或硫酯去水成為其2-烯醯酯或其2-烯醯硫酯之生物催化劑。

於特定實施例中，2,3-去氫己二酸係呈與輔酶A之硫酯形式存在(後文2,3-去氫己二酸與輔酶A之硫酯將稱作為5-羧-2-戊烯醯-CoA)。

於特定實施例中，生物催化劑催化3-羥己二醯-CoA去水成為5-羧-2-戊烯醯-CoA。

特定言之，生物催化反應可於可催化3-羥醯(硫)酯去水成為2,3-去氫醯硫酯之生物催化劑存在下進行。

因此具有此種活性之酶稱作為3-羥醯(酯或硫酯)去水酶。對3-羥醯CoA-硫酯具有此種催化活性之酶因而稱作為3-羥醯-CoA去水酶。較佳該3-羥醯-CoA去水酶係對酶基質3-羥己二醯-CoA具有選擇性。

可催化3-羥醯(酯或硫酯)去水成為2,3-去氫醯(酯或硫酯)之酶特別係選自於脫水酶(EC 4.2.1)所組成之組群，較佳係選自於由烯醯-CoA水合酶(EC 4.2.1.17)、3-羥丁醯-CoA去水酶(EC 4.2.1.55)及長鏈-烯醯-CoA水合酶(EC 4.2.1.74)所組成之組群。根據KEGG資料庫，3-羥醯-CoA去水酶活性例如已經說明於脂肪酸代謝、聚酮化合物之合成、或丁酮酸之代謝，以及芳香族化合物之分解作用。

3-羥醯(酯或硫酯)去水酶可為選自於古菌、細菌、及真核生物所組成之組群例如選自於酵母、真菌及哺乳動物所組成之組群中之一種有機體之3-羥醯(酯或硫酯)去水酶。

特定言之，如上識別之可分解有機化合物(參考「反應1」)特別為芳香族化合物、環脂族化合物或二羧酸之微生物為催化2,3-去氫己二酸(酯或硫酯)之製備用之生物催化劑的較佳來源。

可分解芳香族化合物、環脂族化合物、或二羧酸之微生物包括不動桿菌屬(特別為不動桿菌種系ADP1及乙酸鈣不動桿菌)、產鹼桿菌屬(特別為產鹼桿菌D2)、麴菌屬(特別為黑麴菌)、脫氮菌屬(特別為衣凡氏脫氮菌)、固氮單胞菌屬、固氮桿菌屬、芽胞桿菌屬(特別為嗜鹽芽胞桿菌)、棒桿菌屬(特別為麩胺酸棒桿菌及金橙黃棒桿菌)、大腸桿菌、黃桿菌屬、紅黴屬(特別為粗糙紅黴)、青黴屬(特別為產黃青黴)、假單胞菌屬(特別為普氏假單胞菌及螢光假單胞菌)、紅假單胞菌屬(特別為沼澤紅假單胞菌)、紅球菌屬(特別為紅球菌種系RHA1)。

提供作用於3-羥己醯-CoA之EC4.2.1.17酶之較佳有機體包括選自於哺乳動物及微生物所組成之組群中之有機體。適當得自哺乳動物之EC4.2.1.17酶特別係得自選自於由歐洲牛、人類、褐鼠及歐洲豬所組成之組群。適當得自微生物之EC4.2.1.17之酶特別為得自選自於由產氣單胞菌屬(Aeromonas)(特別天竺產氣單胞菌(A.caviae))、梭菌屬(特別乙醯丁酸梭菌)、棉菌屬(Gossypium)(特別美洲棉菌)(G.hirsutum))、紅螺菌屬(特別深紅紅螺菌(R.rubrumi))及拉斯東氏菌屬(特別營養拉斯東氏菌)所組成之組群。

也屬較佳為可進行(無氧的)脂肪酸生物合成之微生物。此等微生物包括梭菌(特別為乙醯丁酸梭菌及克魯維梭菌)、眼蟲門(特別薄眼蟲)、巨球菌屬(特別艾氏巨球菌)、及酵母屬(特別為釀酒酵母)。

適當酶特別包含根據序列ID 14、27、28、30-41、92或其同系物中之任一者之一胺基酸序列。

由2,3-去氫己二酸(酯或硫酯)製備己二酸(酯或硫酯)(「反應4」)

於一個實施例中，己二酸(酯或硫酯)係由2,3-去氫己二酸(酯或硫酯)製備。己二酸(酯或硫酯)可以化學方式由2,3-去氫己二酸(酯或硫酯)製備，例如藉C₂-C₃雙鍵之選擇性氫化製備或以生物催化方式製備。

通常2,3-去氫己二酸具有活性基，如前文指示。

己二酸(酯或硫酯)較佳係使用至少一種可催化5- 羧-2-戊酸(酯或硫酯)之碳-碳雙鍵之氫化的生物催化劑而由2,3-去氫己二酸(酯或硫酯)製備。

於本發明之較佳方法中，該製備包含於可催化順或反2-烯醯(酯或硫酯)還原成為醯(酯或硫酯)之生物催化劑存在下進行生物催化反應。生物催化劑可使用一定範圍之電子施體，例如選自於由NADH、NADPH、FADH₂及已還原的鐵氧化還原蛋白所組成之組群中之電子施體。電子可由電子施體直接轉移至生物催化劑，或另外特別藉所謂之電子轉移黃蛋白(ETF)之媒介而由電子施體轉移至生物催化劑。因此具有此種催化活性之酶稱作為2-烯醯(酯或硫酯)還原酶(ER)。因此對2-烯醯-CoA硫酯具有此種催化活性之酶稱作為2-烯醯-CoA還原酶。較佳該2-烯醯-CoA還原酶對酶基質2,3-去氫己二醯-CoA具有選擇性。

可催化2-烯醯(酯或硫酯)之還原之酶特別係選自於由氧化還原酶(EC 1.3.1及EC 1.3.99)所組成之組群，較佳係選自於由烯醯-CoA還原酶(EC 1.3.1.8、EC 1.3.1.38及EC 1.3.1.44)所組成之組群；選自於由烯醯-[醯-載劑-蛋白]還原酶EC 1.3.1.9、EC 1.3.1.10及EC 1.3.1.39所組成之組群；及選自於由丁醯-CoA去氫酶(EC 1.3.99.2)、醯-CoA去氫酶(1.3.99.3)及長鏈醯-CoA去氫酶(EC 1.3.99.13)所組成之組群。反-2-烯醯(酯或硫酯)還原酶活性例如已經根據KEGG資料庫說明於脂肪酸代謝、聚酮化合物合成、丁酸代謝及粒線體脂肪酸生物合成。

2-烯醯(酯或硫酯)還原酶原則上可得自或衍生自任一種有機體。特別有機體可選擇於細菌、古菌或真核生物，諸如選自於酵母、真菌、原生生物、植物及動物(包括人類)所組成之組群。

於一個實施例中，該有機體可選自於下列細菌：大腸桿菌、弧菌屬、芽胞桿菌屬(特別為枯草桿菌)、梭菌屬(特別為克魯維梭菌、乙醯丁酸梭菌、拜葉林克梭菌及產氣莢膜梭菌(C.perfringens))、鏈絲菌屬(特別為天藍色鏈絲菌(S.coelicolor)及阿維氏鏈絲菌(S.avermitilis))、假單胞菌屬(特別普氏假單胞菌及綠膿桿菌)、許旺氏菌屬、黃單胞菌屬、木質菌屬、耶氏菌屬、密螺旋體屬(特別為齒密螺旋體(T.denticola))、產氣單胞菌屬(特別為嗜水產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila))、微顫菌屬(特別為海洋微顫菌(Microscilla marina))、巨球菌屬(特別為艾氏巨球菌)、迪諾菌屬(特別為輻射狀迪諾球菌)、雅羅氏菌屬(特別為分解脂肪雅羅氏菌)及真桿菌屬(Eubacterium)(特別為嗜丙酮酸真桿菌(E.pyruvativorans))。

於一實施例中，2-烯醯(酯或硫酯)還原酶係得自選自於眼蟲門(特別薄眼蟲)所組成之組群中之有機體。

於一實施例中，2-烯醯(酯或硫酯)還原酶係得自選自於由酵母屬(特別釀酒酵母)、克魯維酵母屬(特別乳酸克魯維酵母(K.lactis)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)(特別龐貝裂殖酵母(S.pombe))、假絲酵母屬(特別熱帶假絲酵母(C.tropicalis))所組成之組群中之有機體。

於一實施例中，2-烯醯(酯或硫酯)還原酶係得自選自於由麴菌屬(特別黑麴菌及巢麴菌(A.nidulans))及青黴屬(特別產黃青黴)所組成之組群中之有機體。

於一實施例中，2-烯醯(酯或硫酯)還原酶係得自選自於由擬南芥屬(特別為阿拉伯芥(A.thaliana))所組成之組群中之有機體。

於一實施例中，2-烯醯(酯或硫酯)還原酶係得自選自於由人類、褐鼠、歐洲牛、天竺鼠(Cavia sp.)、麗紋扁形蟲(Caenorhabditis elegans)及黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)所組成之組群中之有機體。

適當酶特別包含根據序列ID 42-67、94、96、98、 100、105、107、109、111、113或其同系物中之任一者之胺基酸序列，更特別根據序列ID 60、63、96、100或其同系物中之任一者之胺基酸序列。編碼用於催化「反應4」之適當酶之核苷酸序列實例係以2-烯醯(酯或硫酯)還原酶93、95、97、99、104、106、108、110及112表示。

於較佳實施例中，除了2-烯醯(酯或硫酯)還原酶外，使用ETF有利於該還原酶之活性。此等ETF可得自或衍生自如前文識別之可獲得或衍生還原酶之有機體。特別可得自或衍生自與所使用之還原酶同屬有機體，更特別為同種有機體。特定ETF包含序列ID 102、103、115、116表示之胺基酸序列。序列ID 101及114表示編碼特定ETF之核苷酸序列。通常此種ETF包含由兩種不同基因所編碼的兩個亞單元(etfA及etfB)。一般係共同用來製造活性ETF蛋白質。例如可使用下述組成物：序列ID 102與序列ID 103或序列ID 116與序列ID 115之組合物。技藝精湛人士可選擇技藝界已知之其他適當ETF組成物。

於本發明之實施例中，具有期望活性或酶基質特異性之生物催化劑可藉技藝界已知方法改性，例如藉理論設計或分子演化改性來形成可以合理速率或合理選擇性催化2,3-去氫己二酸(酯或硫酯)轉化成己二酸(酯或硫酯)之突變株。以與鏈長度為6之2-烯醯-CoA衍生物具有活性之生物催化劑為佳，以得自克魯維梭菌、歐洲牛、薄眼蟲、天竺鼠種屬、釀酒酵母、熱帶假絲酵母、人類及嗜丙酮酸真桿菌之生物催化劑為特佳。

己二酸之製備(「反應7」)

根據本發明，己二酸酯或硫酯可藉酯鍵或硫酯鍵之水解而用於製備己二酸。可以化學方式達成，例如於酸或鹼存在下或藉生物催化而進行化學水解。

於本發明之較佳方法中，製備包含於可催化醯(硫)酯之水解之生物催化劑之存在下進行生物催化反應。

因此具有催化活性之酶可稱作為醯(硫)酯水解酶。對醯-CoA硫酯具有此種催化活性之酶因而稱作為醯-CoA水解酶。較佳醯-CoA水解酶係對酶基質己二醯-CoA具有選擇性。

可催化醯(硫)酯之水解之酶特別係選自於由水解酶(EC 3.1.2)所組成之組群，較佳係選自於由醯-CoA水解酶(EC 3.1.2.20)、乙醯-CoA水解酶(EC 3.1.2.1)、長鏈脂肪-醯-CoA水解酶(EC 3.1.2.2)、丁二醯-CoA水解酶(EC 3.1.2.3)及醯-[醯-載劑-蛋白]-水解酶(EC 3.1.2.14)所組成之組群。

生物催化劑包含源自於任何有機體包括古菌、細菌或真核生物之酶。

特別生物催化劑包含選自於由下列所組成之組群中之細菌之酶：大腸桿菌、布魯氏菌屬(Brucella)(特別地中海布魯氏菌(Brucella melitensis))、土壤桿菌屬(特別根瘤土壤桿菌)、黃單胞菌屬、中國根瘤菌屬(Sinorhizobium)(特別草木犀中國根瘤菌(Sinorhizobium meliloti))、中根瘤菌屬(Mesorhizobium)(特別百脈根中根瘤菌(Mesorhizobium loti))、弧菌屬、鏈絲菌屬(特別天藍色鏈絲菌及阿維氏鏈絲菌)、紅假單胞菌屬(特別沼澤紅假單胞菌)、木質菌屬、耶氏菌屬、假單胞菌屬(特別普氏假單胞菌及綠膿桿菌)、許旺氏菌屬、志賀氏菌屬(Shigella)、沙門氏菌屬、棒桿菌屬、分枝桿菌屬、叢生單胞菌屬(Hyphomonas)(特別水叢生單胞菌(Hyphomonas neptunium))及初油酸桿菌屬。

適當生物催化劑特別係出現於選自於由酵母屬 (特別釀酒酵母)及克魯維酵母屬(特別乳酸克魯維酵母)所組成之組群中之酵母。

適當生物催化劑特別係出現於選自於由麴菌屬 (特別黑麴菌、煙麴菌(A.fumigatus)及巢麴菌)及青黴屬(特別產黃青黴)所組成之組群中之真菌。

於又一實施例中，有機體係選自於由擬南芥屬 (特別為阿拉伯芥)、鼠科(Muridae)(特別為褐鼠、小鼠(Mus musculus)、牛科(Bovidae)(特別歐洲牛、綿羊(Ovis aries))、人類、及扁形蟲屬(Caenorhabditis)(特別麗紋扁形蟲(Caenorhabditis elegans))所組成之組群。

於本發明之一個實施例中，本身不具有期望之活性或酶基質特異性之生物催化劑可藉技藝界已知方法例如藉理論設計或分子演化改性來形成可將己二酸酯或硫酯有效轉化成己二酸之突變株。以具有與C4-C8酸特別為二羧酸之醯-CoA衍生物具有初始活性之生物催化劑為佳。例如可基於得自小鼠之醯-CoA-硫酯酶而形成突變株(例如列舉於Seq ID 73)。

於本發明之特定實施例中，製備程序包含於可催化活性劑特別為酯或硫酯最特別為CoA之轉移之生物催化劑存在下進行生物催化反應。

因此具有此種催化活性之酶可稱作為CoA轉移酶。較佳該CoA轉移酶對作為CoA施予酶基質的二羧酸-CoA具有選擇性。更佳該二羧酸-CoA為己二醯-CoA。較佳該CoA係對乙酸作為CoA-接受酶基質具有選擇性。

可催化CoA基團轉移之酶特別係選自於由CoA 轉移酶(EC 2.8.3)所組成之組群，較佳係選自於由二羧酸-CoA：二羧酸CoA轉移酶、己二酸：丁二醯-CoA CoA轉移酶、3-酮酸CoA-轉移酶(EC 2.8.3.5)、3-酮己二酸CoA-轉移酶(EC 2.8.3.6)及乙酸CoA-轉移酶(EC 2.8.3.8)所組成之組群。

CoA轉移酶原則上可得自或衍生自任何有機體。有機體可為細菌、古菌或真核生物。特別，以可分解二酸特別分解己二酸之有機體為佳。

有機體特別為選自於由下列所組成之組群中之細菌：不動桿菌屬(特別不動桿菌種系ADP1、乙酸鈣不動桿菌)、梭菌屬(特別克魯維梭菌、乙醯丁酸梭菌或拜葉林克梭菌)、假單胞菌屬(特別為普氏假單胞菌及螢光假單胞菌)、土壤桿菌屬、產鹼桿菌屬、關節菌屬、固氮單胞菌屬、固氮螺菌屬、固氮桿菌屬、芽胞桿菌屬、拜葉林克氏菌屬、緩根瘤菌屬、伯克氏菌屬、冠單胞菌屬、棒桿菌屬、諾卡氏菌屬、根瘤菌屬、紅酵母屬、紅球菌屬、毛孢黴屬、羅斯氏菌種屬(Roseburia sp.)。

有機體特別為選自於由麴菌屬(特別黑麴菌)、青黴屬(特別產黃青黴)、及紅黴屬所組成之組群中之酵母或真菌。

特別適當CoA轉移酶可得自於或衍生自人科 (Hominidea)中之一種，更特別係得自人類。

適當用於反應7之酶特別包含根據序列ID 68-73、85、116、117、119-124或其同系物中之任一者之胺基酸序列。

由硫酯製備己二酸特別可藉包含含有根據序列 ID 68-73、117、119或其同系物中之任一者之一胺基酸序列之醯-CoA水解酶之生物催化劑催化。

由硫酯製備己二酸特別可藉包含含有根據序列 ID 85、121、122、123、124、125、126或其同系物中之任一者之一胺基酸序列之CoA轉移酶之生物催化劑催化。

CoA轉移酶可由單一基因編碼或由多於一個基因編碼。例如若干CoA轉移酶包含由兩種不同基因編碼之兩個亞單位。此等亞單位通常係共同用來讓CoA轉移酶蛋白質具有活性。例如可使用下述組成物：序列ID 121與序列ID 122之組合或序列ID 125與序列ID 126之組合。

由己二酸酯或己二酸硫酯製備5-FVA(「反應5」)

於一實施例中，5-甲醯戊酸(5-FVA)係由己二酸酯或己二酸硫酯製備。其製備可以化學方式或生物催化方式進行。己二酸酯特別係偶合至CoA或如前文指示偶合至其他活性基團。

特別，本發明也提供一種於可催化醯酯或醯硫酯還原成為醛之生物催化劑存在下，用於由己二酸酯或己二酸硫酯製備5-FVA之方法，特別用於由己二醯-CoA硫酯製備5-FVA之方法。

因此具有此種催化活性之酶可稱作為醛去氫酶。因此對醯酯或醯硫酯例如為醯-CoA硫酯具有此種催化活性之酶可稱作為醛去氫酶(乙醯化)。較佳包含醛去氫酶(乙醯化)之生物催化劑對酶基質己二酸酯或己二酸硫酯具有選擇性。

可催化醯(硫)酯之還原的酶特別係選自於由氧化還原酶(EC 1.2.1)所組成之組群，較佳係選自於由醛去氫酶(乙醯化)(EC 1.2.1.10)、脂肪醯-CoA還原酶(EC 1.2.1.42)、長鏈脂肪醯-CoA還原酶(EC 1.2.1.50)、丁醛去氫酶(EC 1.2.1.57)及丁二酸半醛去氫酶(乙醯化)所組成之組群(例如參考Sohling等人，1996，J Bacteriol.178：871-880)。

醛去氫酶原則上可得自或衍生自任何有機體。須了解經由直接分離編碼核酸及隨後測定於非同源宿主之活性，或藉於多源基因體DNA中發現的序列同源性而由多元基因體來源獲得酶。有機體可為細菌、古菌或真核生物。特別有機體可選自細菌，更特別係選自於由下列細菌所組成之組群：大腸桿菌、梭菌屬(特別克魯維梭菌、拜葉林克梭菌、乙醯丁酸梭菌、丁酸梭菌(C.botylicum)、破傷風梭菌(C.tetani)、產氣莢膜梭菌及諾維氏梭菌(C.novyi))、齒齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、李斯特氏菌屬(Listeria)、初油酸桿菌屬(特別為佛氏初油酸桿菌)、腸球菌屬(Enterococcus)、細梭菌屬、乳桿菌屬(特別為乳酸乳桿菌)、芽胞桿菌屬(特別為蘇雲金芽胞桿菌(B.thuringiensis))、伯克氏菌屬(特別為類鼻疽菌(B.thailandensis)及鼻疽菌(B.mallei))、假單胞菌屬(特別為普氏假單胞菌)、紅球菌屬(特別為紅球菌種屬RHA1)及沙門氏菌屬(特別為傷寒桿菌)。有機體也可選自於真核生物，更特別係選自於由吉亞爾鞭蟲屬(Giardia)(特別為蘭氏吉亞爾鞭蟲(G.lamblia))、阿米巴蟲屬(Entamoeba)(特別為痢疾阿米巴(E.Histolytica))、巴氏變形鞭毛蟲(Mastigamoeba balamuthi)、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、梭藻屬(Polytomella)、瘤胃絲菌屬(Piromyces)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)、及新月形旋核鞭毛蟲(Spironucleus barkhanus)。

適當去氫酶特別包含根據序列ID 74-81、 139-148、或其同系物中之任一者之胺基酸序列於本發明之實施例中，本身不具有期望之活性或酶基質特異性之生物催化劑可藉技藝界已知方法例如藉理論設計或分子演化改性而形成可將己二酸酯或硫酯轉化成5-FVA之突變株。以具有可使用鏈長度為4-8之醯-CoA衍生物來醯化醛去氫酶活性之生物催化劑為佳，包括但非限於得自克魯維梭菌(序列ID 74)或齒齦卟啉單胞菌(序列ID 75)之丁二酸半醛去氫酶(乙醯化)及得自乙醯丁酸縮醛(序列ID 80、81)或佛氏初油酸桿菌(序列ID 79)之丁醛去氫酶(乙醯化)之生物催化劑為佳。

由己二酸製備5-FVA(「反應8」)

根據本發明，己二酸可用於藉還原羧酸基中之一者而製備5-FVA。此項目的可以化學方式達成，例如藉選擇性化學還原視需要可包括羧酸基之質子化反應達成或藉生物催化方式達成。於本發明之較佳方法中，該製備包含於可催化羧酸之還原之生物催化劑存在下進行生物催化反應。生物催化劑可使用NADH或NADPH作為電子施體。

因此具有此種催化活性之酶稱作為醛去氫酶。較佳該醛去氫酶對酶基質己二醛具有選擇性。

可催化羧酸之還原之酶特別係選自於由氧化還原酶(EC 1.2.1)所組成之組群，較佳係選自於由醛去氫酶(EC 1.2.1.3、EC 1.2.1.4及EC 1.2.1.5)、丙二酸半醛去氫酶(EC 1.2.1.15)、丁二酸半醛去氫酶(EC 1.2.1.16及EC 1.2.1.24)；麩胺酸半醛去氫酶(EC 1.2.1.20)、胺己二酸半醛去氫酶(EC 1.2.1.31)、己二酸半醛去氫酶(EC 1.2.1.63)又名6-酮己酸去氫酶所組成之組群。己二酸半醛去氫酶活性已經於KEGG資料庫中說明於己內醯胺分解徑路。特別可使用6-酮己酸去氫酶。6-酮己酸去氫酶之實例為包含序列ID 127、128或其同系物所表示之序列之酶。

醛去氫酶原則上可得自或衍生自任一種有機體。有機體可為原核或真核。特別有機體可選自於細菌、古菌、酵母、真菌、原生生物、植物及動物(包括人類)。

於一實施例中，細菌係選自於由下列所組成之組群：不動桿菌(特別為不動桿菌種屬NCIMB9871)、拉斯東氏菌屬、博德氏菌屬、伯克氏菌屬、甲烷桿菌屬、黃桿菌屬、中國根瘤菌屬、根瘤菌屬、硝化桿菌屬(Nitrobacter)、布氏桿菌屬(特別為地中海布氏桿菌)、假單胞菌屬、土壤桿菌屬(特別為根瘤土壤桿菌)、芽胞桿菌屬、李斯特氏菌屬、產鹼桿菌屬、棒桿菌屬、及黃桿菌屬。

於一個實施例中，有機體係選自於酵母及真菌所組成之組群，特別係選自於麴菌屬(特別為黑麴菌及巢麴菌)及青黴屬(特別為產黃青黴)所組成之組群。

於一實施例中，有機體為植物，特別為擬南芥屬，更特別為阿拉伯芥。

6-ACA之製備(「反應6」)

於本發明之一個實施例中，使用5-FVA來製備 6-ACA。

於一個實施例中，經由將5-FVA與羥基胺反應所得之6-肟基己酸使用PtO₂進行氫化獲得6-ACA(F.O.Ayorinde,E.Y.Nana,P.D.Nicely,A.S.Woods,E.O.Price,C.P.Nwaonicha J.Am.OilChem.Soc.1997,74,531-538也參考同系物12-胺十二烷酸之合成)。

經由以氫化催化劑例如Ni於SiO₂/Al₂O₃撐體，使用氨進行5-FVA之還原胺化反應，可以高產率製備6-ACA，如於EP-A 628 535或DE 4 322 065對9-胺壬酸(9-胺天竺葵酸)及12-胺十二烷酸(12-胺月桂酸)所述。

於又一實施例中，以生物催化方式製備6-ACA。於較佳方法中，由5-FVA製備6-ACA包含於選自於轉胺酶(E.C.2.6.1)之可於胺施體存在下催化轉胺化反應之酶存在下進行酶催化反應。

大致上，適當轉胺酶具有6-ACA 6-轉胺酶活性，可催化5-FVA轉化成6-ACA。

轉胺酶特別係選自得自於下列之轉胺酶：哺乳動物；山靛屬特別為多年生山靛，更特別為多年生山靛之嫩枝；鐵齒蕨屬，更特別為單側鐵齒蕨或北方鐵齒蕨；角豆屬(Ceratonia)，更特別為長角豆(Ceratonia siliqua)；紅桿菌屬特別為球形紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides)；葡萄球菌屬特別為金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；弧菌屬特別為河流弧菌；假單胞菌屬特別為綠膿桿菌；紅假單胞菌屬；芽胞桿菌屬特別為韋氏芽胞桿菌及枯草桿菌；嗜肺病菌屬；亞硝酸菌屬；奈瑟氏菌屬；或酵母，特別為釀酒酵母。

於該酶為哺乳動物酶之情況下，該酶特別係源自於哺乳動物腎、哺乳動物肝、哺乳動物心或哺乳動物腦。例如適當酶可選自於由下列所組成之組群：得自哺乳動物腎之β-胺異丁酸：α-酮戊二酸轉胺酶特別為得自豬腎之β-胺異丁酸：α-酮戊二酸轉胺酶；得自哺乳動物肝之β-丙胺酸轉胺酶，特別為得自兔肝之β-丙胺酸轉胺酶；得自哺乳動物心之天冬酸轉轉胺酶特別為得自豬心之天冬酸轉胺酶；得自哺乳動物肝之4-胺-丁酸轉胺酶特別為得自豬肝之4-胺-丁酸轉胺酶；得自哺乳動物腦之4-胺-丁酸轉胺酶特別為得自人、豬、或大鼠腦之4-胺-丁酸轉胺酶；得自紅黴屬之α-酮己二酸-麩胺酸轉胺酶，特別得自粗糙紅黴之α-酮己二酸-麩胺酸轉胺酶；得自大腸桿菌之4-胺-丁酸轉胺酶，或得自棲熱菌屬之α-胺己二酸轉胺酶特別為得自嗜熱棲熱菌之α-胺己二酸轉胺酶，及得自梭菌屬特別係得自胺戊酸梭菌之5-胺戊酸轉胺酶。例如可由冰島熱桿菌(Pyrobaculum islandicum)提供適當2-胺己二酸轉胺酶。

於特定實施例中，使用之轉胺酶包含根據序列ID 82、序列ID 83、序列ID 84、序列ID 134、序列ID 136、序列138、或此等序列中之任一者之同系物之一胺基酸序列。序列ID 86(野生型)及88(密碼子最佳化)表示由序列ID 82(=87)表示之酶的編碼序列。序列ID 89(野生型)及91(密碼子最佳化)表示由序列ID 82(=87)表示之酶的編碼序列。序列ID 133、序列ID 135、序列ID 137分別表示序列ID 134、序列ID 136、序列138之編碼序列。

特別胺基施體可選自於由氨、銨離子、胺及胺基酸所組成之組群。適當胺為第一胺及第二胺。胺基酸具有D-組態或L-組態。胺施體之實例為丙胺酸、麩胺酸、異丙胺、2-胺丁烷、2-胺庚烷、苯甲胺、1-苯-1-胺乙烷、麩胺、酪胺酸、苯丙胺酸、天冬酸、β-胺異丁酸、β-丙二酸、4-胺丁酸、及α-胺己二酸。

於又更較佳實施例中，用於製備6-ACA之方法包含於氨源存在下可催化還原胺化反應之酶存在下進行生物催化反應，該酶係選自於作用於施體之CH-NH₂基之氧化還原酶(E.C.1.4)所組成之組群，特別係選自於胺基酸去氫酶(E.C.1.4.1)所組成之組群。大致上，適當胺基酸去氫酶具有6-胺己酸6-去氫酶活性而催化5-FVA轉化成6-ACA；或具有α-胺庚二酸2-去氫酶活性來催化AKP轉化成AAP。特別適當胺基酸去氫酶可選自於由二胺庚二酸去氫酶(EC 1.4.1.16)、離胺酸6-去氫酶(EC 1.4.1.18)、麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.3；EC 1.4.1.4)及白胺酸去氫酶(EC 1.4.1.9)所組成之組群。

於一個實施例中，胺基酸去氫酶可選自於歸類如下之胺基酸去氫酶：以NAD或NADP作為受體發揮作用之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.3)、以NADP作為受體發揮作用之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.4)、白胺酸去氫酶(EC 1.4.1.9)、二胺庚二酸去氫酶(EC 1.4.1.16)、及離胺酸6-去氫酶(EC 1.4.1.18)。

胺基酸去氫酶特別可源自於選自於由下列所組成之組群中之有機體：棒桿菌屬特別為麩胺酸棒桿菌；變形桿菌屬特別為普通變形桿菌；土壤桿菌屬特別為根瘤土壤桿菌；地桿菌屬特別為固定嗜熱地桿菌；不動桿菌屬特別為不動桿菌種屬ADP1；拉斯東氏菌屬特別為青枯病菌(Ralstonia solanacearum)；沙門氏菌屬特別為傷寒桿菌；酵母屬，特別為釀酒酵母；短桿菌屬特別為黃短桿菌；及芽胞桿菌屬特別為球形芽胞桿菌、仙人掌芽胞桿菌或枯草桿菌。例如適當胺基酸去氫酶可選自於得自芽胞桿菌特別球形芽胞桿菌之二胺庚二酸去氫酶；得自短桿菌種屬之二胺庚二酸去氫酶；得自棒桿菌種屬之二胺庚二酸去氫酶，特別為得自麩胺酸棒桿菌之二胺庚二酸去氫酶；得自變形桿菌種屬之二胺庚二酸去氫酶，特別為得自普通變形桿菌之二胺庚二酸去氫酶；得自土壤桿菌屬特別根瘤土壤桿菌之離胺酸6-去氫酶；得自地桿菌屬特別固定嗜熱地桿菌之離胺酸6-去氫酶；得自不動桿菌之以NADH或NADPH作為輔因子發揮作用之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.3)，特別得自不動桿菌種屬ADP1之麩胺酸去氫酶；得自拉斯東氏菌屬之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.3)，特別得自青枯病菌之麩胺酸去氫酶；得自沙門氏菌屬之以NADPH作為輔因子發揮作用之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.4)，特別得自傷寒桿菌之麩胺酸去氫酶；得自酵母屬之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.4)，特別得自啤酒酵母之麩胺酸去氫酶；得自短桿菌屬之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.4)，特別得自黃短桿菌之麩胺酸去氫酶；及得自芽胞桿菌之白胺酸去氫酶特別得自仙人掌芽胞桿菌或枯草桿菌之白胺酸去氫酶。

於一個實施例中，於本發明方法所製備之6-ACA 用於製備己內醯胺。此種方法包含視需要可於生物催化劑存在下循環利用6-胺己酸。

用於本發明內文之任何生物催化步驟之反應條件可依據對該生物催化劑特別為對該酶之已知條件、本文揭示之資訊及視需要地經由若干例行實驗而選用。

原則上，所使用之反應介質之pH可選自於寬廣限度範圍，只要生物催化劑於該等pH條件下具有活性即可。依據生物催化劑及其他因素，可使用鹼性、中性或酸性條件。於該方法包括使用微生物例如用於表現可催化本發明方法之酶之情況下，選用pH使得微生物可發揮其預期功能。pH特別可選自於低於中性pH之4個pH單位及高於中性pH之2個pH單位，亦即於25℃於大致水性系統之情況下介於pH 3至pH 9之範圍。若水為唯一溶劑或主要溶劑(以總液體為基準，大於50wt.%特別大於90wt.%)則該系統被視為水性，其中例如可溶解小量(以總液體為基準，小於50wt.%特別小於10wt.%)醇或其他溶劑(例如作為碳源)之濃度讓可存在的微生物維持具有活性。特別於使用酵母及/或真菌之情況下，以酸性條件為佳，特別基於大致水性系統於25℃，pH係於pH 3至pH 8之範圍。若有所需，可使用酸及/或鹼調整pH或以酸與鹼之適當組合物緩衝pH。

原則上，只要生物催化劑顯示足夠活性及/或生長，則培養條件可選自於寬廣範圍。此種條件包括有氧、微氧、氧有限及無氧條件。

無氧條件於此處定義為不含任何氧之條件，或其中實質上並無任何氧由生物催化劑所耗用特別為由微生物所耗用之條件，通常相當於低於5毫莫耳/升.小時之氧耗用量，特別相當於低於2.5毫莫耳/升.小時或低於1毫莫耳/升.小時之氧耗用量。

有氧條件為其中有用於未受限制的生長之足量氧濃度溶解於介質因而可支持至少10毫莫耳/升.小時，更佳大於20毫莫耳/升.小時，又更佳大於50毫莫耳/升.小時及最佳大於100毫莫耳/升.小時之氧耗用速率之條件。

氧有限條件定義為其中氧之耗用受到由氣體移轉至液體之氧所限制之條件。氧有限條件之下限係由無氧條件之上限決定，亦即通常至少為1毫莫耳/升.小時且特別至少為2.5毫莫耳/升.小時或至少為5毫莫耳/升.小時。氧有限條件之上限係由有氧條件之下限決定，亦即低於100毫莫耳/升.小時，低於50毫莫耳/升.小時，低於20毫莫耳/升.小時或低於10毫莫耳/升.小時。

條件為有氧條件、無氧條件或氧有限條件係依據進行該方法之條件決定，特別係由進氣氣體流之數量及組成、所使用設備之實際混合/質量移轉性質，所使用之微生物類別及微生物密度決定。

原則上，只要生物催化劑特別為酶顯示實質活性，則所使用之溫度並無特殊限制。大致上溫度至少為 0℃，特別至少為15℃，更特別至少為20℃。期望之最高溫係依據生物催化劑決定。通常此種最高溫為技藝界所已知，例如於市售生物催化劑之情況下由產品資料單指示，或可基於普通常識及此處揭示之資訊以例行方式判定。溫度通常為90℃或以下，較佳為70℃或以下，特別為50℃或以下，更特別為40℃或以下。

此外，可基於已知反應原理選擇溶劑、額外試劑及其他助劑例如輔因子(例如FAD/FADH及/或NAD/NADH輔因子)來達成或加速特定反應，及/或可採行措施來將平衡移至期望側。特別若於宿主有機體外側進行生物催化反應，於使用可於此種介質中保有足夠活性之酶之情況下，可使用包含高濃度(例如大於50wt.%或大於90wt.%)有機溶劑之反應介質。

於本發明方法所使用之丁二酸(酯或硫酯)及乙酸(酯或硫酯)原則上可以任一種方式獲得。

丁二酸例如天然形成為檸檬酸週期(克雷白氏週期(Krebs cycle))之中間物或形成為細胞代謝之終產物。如此可使用適當生物催化劑而得自可再生的碳源。生物催化劑特別為微生物可用於由適當碳源製造丁二酸。微生物可為原核生物或真核生物。微生物可為重組或野生型。

於重組微生物中，可變更代謝來增高於適當碳源之丁二酸產量及生產力。提高丁二酸產量之方法已經對原核生物說明於Song及Lee，酶及微生物技術，2006,39：352-361。丁二酸也可以真核生物製造。此外及另外，可應用調整適應演化，諸如說明於美國專利案2007/111294。

丁二酸酯或硫酯可以任一種方式得自丁二酸。特別丁二酸酯或硫酯可使用生物催化劑得自丁二酸。特別經由使用包含選自於由酸硫醇接合酶(EC 6.2.1)所組成之組群之酶，較佳選自於由丁二醯-CoA合成酶(EC 6.2.1.4及EC 6.2.1.5)所組成之組群之酶之催化劑，可由丁二酸獲得丁二醯-CoA。此外或另外，經由使用包含選自於由CoA轉移酶(EC 2.8.3)之酶之生物催化劑，如對反應7之規定，可由丁二酸獲得丁二醯-CoA。

丁二酸酯或硫酯也可以任一種方式得自丁二酸以外之分子。特定言之，使用包含2-酮戊二酸去氫酶複體之生物催化劑，可由2-酮戊二酸獲得丁二醯-CoA。熟諳技藝人士已知，酮戊二酸去氫酶複體為參與TCA週期之多酶複體。此外或另外，使用包含2-酮戊二酸：鐵氧化還原蛋白(ferredoxin)氧化還原酶(EC 1.2.7.3)之生物催化劑，可由2-酮戊二酸獲得丁二醯-CoA。

乙酸為細胞代謝之天然中間物或終產物。如此乙酸可經由使用適當生物催化劑而得自可再生碳源。生物催化劑特別為微生物可用於由適當碳源製造丁二酸。微生物可為原核生物或真核生物。微生物可為重組或野生型。

乙酸酯或乙酸硫酯可以任一種方式得自乙酸。特別，經由使用包含選自於由酸硫醇接合酶(EC 6.2.1)所組成之組群之酶，較佳為乙醯-CoA合成酶(EC 6.2.1.1及EC 6.2.1.13)之生物催化劑，可由乙酸獲得乙醯-CoA。此外或另外，使用如對反應7所規定之包含選自於CoA轉移酶(EC 2.8.3)所組成之組群之酶之生物催化劑，可由乙酸獲得乙醯-CoA。

乙酸酯或乙酸硫酯也可以任一種方式得自乙酸以外之分子。特定言之，使用包含選自於由丙酮酸去氫酶複體、丙酮酸去氫酶(NADP+)(EC 1.2.1.51)、丙酮酸甲酸溶解酶(EC 2.3.1.54)或可將丙酮酸有效轉化成乙醯-CoA之生物催化劑或酶所組成之組群之酶之生物催化劑，可由丙酮酸獲得乙醯-CoA，如熟諳技藝人士已知，丙酮酸去氫酶複體為將丙酮酸轉化成乙醯-CoA之多酶複體。

使用包含選自於由氧化還原酶(EC 1.2.1)所組成之組群之酶之生物催化劑，也可由乙醛獲得乙醯-CoA，較佳該酶係選自於由醛去氫酶(乙醯化)(EC 1.2.1.10)、脂肪酸乙醯-CoA還原酶(EC 1.2.1.42)、丁醛去氫酶(EC 1.2.1.57)及丁二酸半醛去氫酶(乙醯化)所組成之組群(述於Sohling等人1996.J Bacteriol.178：871-880)。

當該生物催化劑為真核生物時，經由過度表現編碼催化前驅分子轉化成乙醯-CoA之酶之同源基因及/或非同源基因，可增加乙醯-CoA之供給，較佳增加於宿主細胞之細胞溶質隔間之乙醯-CoA之供給。前驅物分子例如為乙酸，如Shiba等人，代謝工程，2007,9：160-8所述。

於本發明之優異方法中，特別於用於製備6-ACA 己二酸或用於6-ACA或己二酸之中間化合物之方法中，使用用於6-ACA、己二酸或其中間物之酶基質之全細胞生物轉形，包含使用其中製造可催化前述反應中之任一者之一種或多種酶之微生物及用於該微生物之碳源。

碳源特別含有選自於由一元醇、多元醇、羧酸二氧化碳、脂肪酸、甘油酯包括包含該等化合物中之任一者之混合物所組成之組群中之至少一種化合物。適當一元醇包括甲醇及乙醇。適當多元醇包括甘油及碳水化合物。適當脂肪酸或甘油酯特別係以食用油形式較佳為植物來源之食用油提供。

特別使用碳水化合物，原因在於通常碳水化合物可大量得自生物可再生來源，諸如農產品例如農業廢料。較佳所使用之碳水化合物係選自於由葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、蔗糖、澱粉、纖維素及半纖維素所組成之組群。特佳為葡萄糖、包含葡萄糖之寡醣及包含葡萄糖之多醣。

於本發明之特定方法中，該方法為發酵法。此等方法特別包含包含生物催化劑之細胞視需要可為此處所述之宿主細胞接觸可發酵碳源，其中該碳源含有將轉化成預製備之化合物之任一種化合物，或其中該等細胞製備欲轉化成將由該碳源所製備之化合物之該化合物。

包含用於催化本發明方法中之反應步驟之一種或多種酶之細胞可使用技藝界已知之分子生物技術組成。舉例言之，若欲於非同源系統製造一種或多種生物催化劑，則此等技術可用於提供包含編碼該等催化劑中之一者或多者之一個或多個基因之一載體。包含該等基因中之一者或多者之載體可包含可工作式鏈接至編碼生物催化劑之一基因之一個或多個調節元件，例如一個或多個啟動基因。

如此處使用，「工作式鏈接」一詞表示多核苷酸元件(或編碼序列或核酸序列)呈功能關係鏈接。當核酸序列係與其他核酸序列呈功能關係時，該核酸序列為「工作式鏈接」。例如，若啟動基因或加強基因影響編碼序列的轉錄，則該啟動基因或加強基因係工作式鏈接至該編碼序列。

如此處使用，「啟動基因」一詞係指一種核酸片段，該核酸片段係用於控制相對於基因之轉錄起點的轉錄方向位在上游之一個或多個基因的轉錄，結構上係以DNA相依性RNA聚合酶之結合位置、轉錄起始位置及任何其他DNA的存在加以識別，該等DNA序列包括但非限於轉錄因子結合位置、阻遏蛋白質及活化蛋白質結合位置、及熟諳技藝人士已知直接或間接作用於調解由啟動基因之轉錄量之任何其他核苷酸序列。「組成性」啟動基因為於大部分環境及發育條件下具有活性之啟動基因。「誘導性啟動基因」為於環境或發育調節下具有活性之啟動基因。「同源」一詞當用於指示給定的(重組的)核酸或多胜肽分子與一給定的宿主有機體或宿主細胞間之關係時，須瞭解表示於自然界該核酸或該多胜肽分子係由同種且較佳為相同變種或相同種系之宿主細胞或有機體製造。

可用於表現用於本發明方法之酶之編碼核酸序列(諸如前文說明者)之啟動基因可為編碼欲表現之酶之該核酸序列所本有；或可為該核酸序列(編碼序列)所非同源性，係藉工作式鏈接。較佳啟動基因為同源，亦即啟動基因為該宿主細胞所內生。

若使用非同源啟動基因(相對於該感興趣之酶之編碼核酸序列)，則該非同源啟動基因較佳可製造比較該編碼序列本有的啟動基因，具有更高穩態濃度之包含編碼序列之轉錄本(或每單位時間可製造更大量轉錄本分子，亦即mRNA分子)。於本內文之適當啟動基因包括組成性及誘導性天然啟動基因以及基因改造啟動基因，其為熟諳技藝人士眾所周知。

「強力組成性啟動基因」為比較天然宿主細胞造成mRNA以更高頻率起始之啟動基因。於革蘭氏(Gram)陽性微生物中之此種強力組成性啟動基因之實例包括SP01-26、SP01-15、veg,pyc(丙酮酸羧酸酶啟動基因)及amyE。

於革蘭氏陽性微生物中之誘導性啟動基因之實例包括IPTG誘導性Pspac啟動基因、木糖誘導性PxylA啟動基因。

於革蘭氏陰性微生物之組成性啟動基因及誘導性啟動基因之實例包括tac,tet,trp-tet,lpp,lac,lpp-lac,laclq,T7,T5,T3,gal,trc,ara(P_BAD),SP6,λ-P_R，及λ-P_L。

「非同源」一詞當用於核酸(DNA或RNA)或蛋白質時，係指一種核酸或蛋白質其天然不會出現作為其所存在的有機體、細胞、基因體或DNA序列或RNA序列之一部分，或該核酸或蛋白質出現於與天然出現者不同的細胞或基因體不同位置或不同DNA或RNA序列。非同源核酸或非同源蛋白質並非其所導入之該細胞的內生者，反而係得自其他細胞或以合成方式或重組方式製造。大致上但非必要，此種核酸編碼其中該DNA於其中轉錄或於其中表現的細胞正常不會製造的蛋白質。同理，外生性RNA編碼該外生性RNA所存在的細胞正常不會表現的蛋白質。非同源核酸及蛋白質也可稱作為外來核酸或蛋白質。熟諳技藝人士認知為表現該核酸之細胞之非同源核酸或外來核酸或蛋白質如此處係涵蓋於非同源核酸或蛋白質一詞之範圍。

根據本發明方法可使用有機體進行，有機體可為宿主有機體，特別為宿主微生物或野生型微生物。如此，本發明亦係關於一種新穎(宿主)細胞，其可為微生物，包含可催化本發明方法之至少一個反應步驟之生物催化劑，較佳該細胞可製造一種酶或多種酶，藉此可催化本發明方法中之兩個或多個反應步驟。本發明亦係關於一種新穎載體，其包含編碼可催化本發明方法中之至少一個反應步驟之一種或多種酶之一個或多個基因。

於一實施例中，提供一種細胞或一種載體其包含一核酸序列，該核酸序列可為重組核酸序列，編碼具5-羧-2-戊烯醯酯或硫酯氫化酶活性，特別為5-羧-2-戊烯醯氫化酶活性之一種酶。

較佳該細胞進一步包含編碼一酶之至少一種(重組載體包含一個)核酸序列，該酶係選自於由可催化己二醯酯或硫酯特別為己二醯-CoA轉化成5-FVA之酶及可催化己二醯酯或硫酯特別為己二醯-CoA轉化成己二酸之酶所組成之組群。

特別於一實施例中，其中該細胞包含可催化己二醯酯或硫酯轉化成5-FVA之酶，該細胞較佳包含(一重組載體其包含)編碼可將5-FVA轉化成6-ACA之一酶之一核酸序列。此種酶特別可為具5-FVA轉胺酶活性之酶。

此外或另外，(宿主)細胞或載體包含下列核酸序列中之至少一者：- 編碼可催化藉由丁二醯酯或硫酯與乙酸酯或硫酯反應而形成3-酮己二醯酯或硫酯之酶之一核酸序列；- 編碼可催化由3-酮己二醯酯或硫酯形成3-羥己二醯酯或硫酯之一酶之一核酸序列；- 編碼可催化由3-羥己二醯酯或硫酯形成5-羧-2-戊烯醯酯或硫酯之酶之一核酸序列；- 編碼可催化由5-羧-2-戊烯醯酯或硫酯形成己二醯酯或硫酯之酶之一核酸序列。

一種或多種適當基因特別係選自於編碼如前文說明之酶之基因，更特別係選自於編碼根據序列ID 1-67、94、96、98、100、102、103、105、107、109、111、113、115、116或其同系物中之任一者之酶之基因。

宿主細胞可為原核細胞或真核細胞。特別宿主細胞可選自於細菌、古菌、酵母、真菌、原生生物、植物及動物(包括人類)。

特定言之，根據本發明之宿主細胞可選自於由麴菌屬、芽胞桿菌屬、棒桿菌屬、埃希氏菌屬、酵母屬、假單胞菌屬、葡萄糖桿菌屬、青黴屬、畢赤酵母屬等屬所組成之組群。特別為宿主種系如此宿主細胞可選自於由大腸桿菌、枯草桿菌、澱粉液化芽胞桿菌、麩胺酸棒桿菌、黑麴菌、產黃青黴、巴氏畢赤酵母、釀酒酵母所組成之組群。

以可製造短鏈脂肪酸諸如丁二酸及/或乙酸及/或其酯或其硫酯之宿主細胞為較佳。可達成此種功能之有機體通常係存在於反雛動物之瘤位。特別以可共同製造丁二酸及乙酸或其酯或其硫酯之有機體為佳。

微生物可為重組或野生型微生物。特別，可製造丁二酸之微生物包括大腸桿菌、不動桿菌屬(特別為產丁二酸不動桿菌(A.succinogenes))、曼罕氏菌屬(Mannheimia)(特別為產丁二酸曼罕氏菌(M.succiniciproducens))、釀酒酵母、麴菌屬(特別為黑麴菌)、青黴屬(特別為產黃青黴及簡單青黴(P.simplicissimum))及Kaemwich Jantama,M.J.Haupt,Spyros A.Svoronos,Xueli Zhang,J.C.Moore,K.T.Shanmugam L.O.Ingram。生物技術及生物工程(2007)99,5：1140-1153中所述之其他有機體。

特別可製造乙酸之微生物包括腸細菌科(特別為大腸桿菌、沙門氏菌屬及志賀氏菌屬)、乙酸細菌(包括醋桿菌屬(Acetobcter)(特別為乙酸醋桿菌(Acetobacter aceti))、葡萄桿菌屬(特別為氧化葡萄桿菌(Gluconobacter oxidans))、酸單胞菌屬(Acidomonas)、葡萄醋桿菌屬(Gluconacetobacter)、阿薩氏菌屬(Asaia)、柯札氏菌屬(Kozakia)、沙明氏菌屬(Swaminarhania)、糖桿菌屬 (Saccharibacter)、尼阿氏桿菌屬(Neoasaia)、粒桿菌屬(Granulibacter)、梭菌屬(特別為乙酸梭菌(C.aceticum)、熱乙酸梭菌(C.thermoaceticum)、自動趨熱乙酸梭菌(C.thermoautotrophicum)、甲酸乙酸梭菌(C.formicoaceticum)、克魯維梭菌、丙酸梭菌(C.propionicum))、巨球菌屬(特別為艾氏巨球菌)、醋酸桿菌屬(Acetobacterium)(特別為伍氏醋酸桿菌(A.woodii)及威爾氏醋酸桿菌(A.wieringae))、乳桿菌屬(特別為平坦乳桿菌(L.plantarum)、短乳桿菌(L.brevum))、雙叉桿菌屬(Bifidobacterium)(特別為比菲德雙叉桿菌(B.bifidum))及白色念珠菌屬(Leuconostoc)。

本發明進一步係關於新穎多胜肽及關於編碼此等多胜肽之核苷酸序列。特別，本發明進一步係關於包含根據序列ID 57,68-72,79,85及其同系物中之任一者之胺基酸序列之一種多胜肽。特別本發明進一步係關於一種包含根據序列ID 57,68-72,79,85及其同系物中之任一者之胺基酸序列之一種多胜肽之編碼多核苷酸。

其次將藉下列實例舉例說明本發明。

實例 實例1：概略方法 分子與遺傳技術

標準遺傳及分子生物學技術為技藝界概略已知且已經如前文說明(Maniatis等人1982「分子轉殖：實驗室手冊」。冷港實驗室，冷泉港紐約；Miller 1972「分子遺傳學實驗」，冷泉港實驗室，冷泉港；Sambrook及Russell 2001「分子轉殖：實驗室手冊」(第三版)，冷泉港實驗室，冷泉港實驗室出版社；F.Ausubel等人編輯「分子生物學之流行方案」，格林出版及威利科技公司，紐約1987年)。

質體及種系

pBAD/Mc-His C及pET21d分別係得自英微基因公司(Invitrogen)(美國加州卡士貝德)及EMD生科公司(EMD Biosciences)(德國旦史塔特)。pF113(pJF119EH之衍生物(Fürste,J.P.,W.Pansegrau,R.Frank,H.Blocker,P.Scholz,M.Bagdasarian及E.Lanka.1986於多宿主範圍tacP表現載體中殖體RP4引子酶區之分子選殖，基因48：131)其含有位於位置515及5176之兩個notI位置，以tac啟動基因作為編號的起點)、pACYC-tac(Krämer,M.(2000).Untersuchungen zum Einfluss erhöhter Bereitstellung von Erythrose-4-

Phosphat und Phosphosenolpyurvat auf den Kohlenstofffluss in den Aromatenbiosyntheseweg von Escherichia coli.Berichte des Forschungszentrums Jülich,3824.ISSN 0944-2952(博士論文，魯索道夫大學)及pMS470(Balzer,D.；Ziegelin,G.；Pansegrau,W.；Kruft,V.；Lanka,E.核酸研究1992,20(8),1851-1858)已經說明如前。大腸桿菌TOP10(英微基因公司，美國加州卡士貝德)用於全部選殖程序。大腸桿菌種系Top10(英微基因公司，美國加州卡士貝德)，Rv308(ATCC31608)、Rv308△araB及BL21 A1(英微基因公司，美國加州卡士貝德)用於蛋白質表現。

全部載體藉插入一共通鏈接子調整來允許有相同的選殖策略。調整方案及一般選殖方案顯示於第2圖。培養基

2xTY培養基(16克/升胰蛋白蔴、10克/升酵母萃取物、5克/升NaCl)用於大腸桿菌之生長。補充抗生素(100微克/毫升安比西林(ampicillin))來維持質體。用於誘導基因表現，使用阿拉伯糖(用於pBAD衍生物)、IPTG(用於pMS470及pF113衍生物)，及阿拉伯糖與IPTG之組合物(用於大腸桿菌BL21-A1中之pET21d衍生物)，終濃度分別係於0.005-0.2%(阿拉伯糖)及0.1-0.5mM(IPTG)。

質體之識別

攜帶不同基因之質體係藉技藝界一般已知之遺傳學、生物化學及/或表現型手段識別，諸如轉形株對抗生素之抗性、轉形株之PCR診斷分析或質體DNA之純化、已純化之質體DNA之限剪分析或DNA序列分析。

用於CoA衍生物之測定之HPLC-MS分析方法

己二醯-CoA及6-羧-2,3-烯己醯-CoA濃度係藉由LC-MS測定。使用亞吉冷(Agilent)SB-C18 2.1*50毫米管柱進行分離，使用以750毫克/升乙酸辛銨緩衝之乙腈/水(pH=7.5)作為動相。流速為300微升/分鐘，以梯度(開始：70%水，3分鐘後降至58%，階段式改變至45%，進一步於1.5分鐘後降至20%，接著再度平衡管柱，藉此方式中操作時間為7分鐘)進行洗提。以電噴灑游離模式使用LTQ歐畢特普(orbitap)由m/z 765-900掃描。己二醯-CoA及6-羧-2,3-烯己醯-CoA分別於2.25分鐘及2.5分鐘洗提。藉觀察所需化合物之準確質子化分子(己二醯-CoA；894,15123-894,16017，6-梭-2,3-烯己醯-CoA：892.13437-892.14329)，該方法之選擇性加強。為了測定濃度，進行以合成方式製備之化合物之標準曲線來計算個別離子之響應因數。用來計算未知樣本中之濃度。

己二酸之檢測及定量係如Kippenberge,M.；Winterhalter,R.；Moortgat,G.K.Anal.Bioanal.Chem.2008,392(7-8),1459-1470所述。

實例2：6-羧-2,3-烯己醯-CoA還原酶活性之測定 表現組成體

推定的6-羧-2,3-烯己醯-CoA還原酶係選自於資料庫(表1)。

編碼所選定蛋白質之目標基因係經密碼子對最佳化(使用WO08000632所述方法)且以合成方式組成(晶尼亞特公司(Geneart)，德國瑞京斯伯格)。於最佳化前，由胺基酸序列中移出標靶基因(例如分泌信號或過氧體/粒線體標靶序列)。此標靶序列可藉技藝界已知之生物資訊學工具識別，諸如述於Emanuelsson等人2007。自然方案2：953-971。於最佳化程序中，避開內部限剪位置，於起點及終點導入共通限剪位置來允許根據第2圖所示之策略而選殖。此等修改可能導致個別蛋白質序列之小量變化，預期不會以任何方式變更個別蛋白質之性質。各個ORF前方有一個同位核糖體結合位置及先導序列來驅動於pF113、pMS470及pET21d之轉譯。於pBAD中，轉譯起始信號係由載體提供。標靶基因‘Adi4’、‘Adi5’、‘Adi8’及‘Adi9’係選殖入有及無讀取至由鏈接子序列所提供之C端His-標籤之全部四個質體。

於大腸桿菌之蛋白質表現

起始培養係以每孔200微升培養基於96孔板生長隔夜。40-160微升移轉至含4毫升培養基之24深孔孔板。用於於大腸桿菌TOP10或大腸桿菌Rv308△araB之pBAD組成體，此培養基直接含有用於誘導之0.005%阿拉伯糖。孔板於25℃於軌道振搖器(英弗斯(Infors)，550rpm)上培養。於4-6小時後，加入誘導基(0.5mM IPTG用於於大腸桿菌Rv308、大腸桿菌BL21或大腸桿菌TOP10中之pF113及pMS470；0.5mM IPTG及0.2%阿拉伯糖用於大腸桿菌BL21A1中之pET21d)，孔板又培養4-48小時至藉離心收穫細胞。

無細胞萃取物之製備及His-標籤之純化

藉離心收獲得之小規模生長(參考前一段)之細胞及拋棄上清液。離心期間所形成之細胞丸粒於-20℃至少冷凍16小時然後於冰上解凍。2毫升新製備的溶解緩衝液(50mM磷酸鉀pH7.5，0.1毫克/毫升DNAse I(羅氏公司(Roche)，Almere,NL)，2毫克/毫升溶菌酶，0.5mM MgSO₄，1mM二硫蘇糖醇及蛋白酶抑制劑(完全迷你不含EDTA錠，羅氏公司，Almere,NL，根據製造商的規定使用))添加至各孔，藉激烈渦旋孔板2-5分鐘將細胞再懸浮。為了達成溶解，孔板於室溫培養30分鐘。為了移除細胞殘骸，孔板於4℃及6000g離心20分鐘。上清液移至一片新孔板且維持於冰上直到進一步使用。用於加His-標籤之蛋白質之純化，His馬堤徹普(Multitrap)HP過濾板(GE健康照護生科公司(GE Helthcare bioscience AB)，瑞典烏普沙拉)係根據製造商的指示使用。

酶基質之合成

酶基質(J.R.Stern,A.del Campillo,J.Biol.Chem.,1956,985.A.K.Das,M.D.Uhler,A.K.Hajra,J.Biol.Chem.,2000,24333.H.Oku,N.Futamori,K.Masuda,Y.Shimabukuro,T.Omine,H.Iwasaki,Biosc.Biotech.Biochem.,2003,2107.Elvidge等人，J.Chem.Soc.,1953,1793.F.Liu,H-Y.Zha,Z-J.Yao,J.Org.Chem.,2003,6679-6684)及期望之生物化學反應產物(WO2004/106347)係根據已公開的程序藉辛控(Syncom)(Groningen,NL)合成。

酶催化烯醯-CoA檢定分析

製備反應混合物，包含50mM鉀緩衝液(pH7.5)，各0.7mM NADH及NADPH，及約20μM酶基質6-羧2,3-烯己醯-CoA。190微升反應混合物配送入96孔孔板之各孔。由攜帶空白載體之個別種系製備10微升無細胞萃取物之相同方式用於對照反應。為了開始反應，10微升無細胞萃取物或已純化蛋白質添加至各孔。反應混合物於室溫(20-25℃)培養15分鐘至24小時，線上監視於340奈米之紫外光吸收。結束時，藉添加等量甲醇終止反應及離心樣本。上清液移至新的孔板，且於-80℃儲存至藉HPLC-Ms進一步分析。發現己二醯-CoA如表1所示。

實例3：藉非同源微生物製造己二酸 己二酸生物合成徑路之組成

設計由第3圖所示酶催化活性所組成之一合成徑路。編碼此等活性之酶識別於資料庫。編碼此等酶之標靶基因經過密碼子對最佳化且以合成方式組成(晶尼亞特公司，德國瑞京斯伯格)。於最佳化程序中，移除內部限剪位置、非期望的標靶序列(例如分泌信號或過氧體標靶序列)，於起點及終點導入限剪位置來允許於根據第4圖之表現載體內組裝徑路。此等改性可導致蛋白質序列的微小變化，但預期絕不會變更個別蛋白質之性質。各ORF前方有一同位核糖體結合位置及先導序列來驅動轉譯。

用於反應1、2及3，使用adi21+22+23或 adi26+27+28之組合。用於反應7，使用adi29、adi30或adi24+25之組合。用於反應4，使用帶有adi8、adi6、adi13+12之adi1-20。

己二酸產生性大腸桿菌種系之組成

為了組成己二酸產生性大腸桿菌種系，完整己二酸徑路編碼之質體轉形入適當宿主種系用於表現已選殖之基因。含有完整徑路之pMS470組成體轉形入大腸桿菌BL21、TOP10及Rv308。pBAD/Myc-His C轉形入大腸桿菌TOP10及Rv308△araB。於pF113或pACYC-tac中之組成體以可相容的pF113、pACYC-tac或pMS470組成體共同轉形讓最終種系含有完整己二酸路徑。此等質體共同轉形至大腸桿菌TOP10、BL21及Rv308。

己二酸之製造

為了製造己二酸，起始培養係於含200微升培養基之96孔孔板於30℃生長隔夜。50微升轉移至含4毫升培養基之一片新的24孔孔板及於25℃生長4-6小時，然後加入可誘導己二酸徑路表現之誘導劑。於25℃又培養12小時-72小時。孔板經離心，樣本準備供LC-MS分析之用。上清液與甲醇以1：1混合而沉澱蛋白質然後直接分析。得自細胞之代謝產物藉將丸粒再懸浮於1毫升乙醇萃取。細胞懸浮液移至有螺旋帽的試管內，於沸水浴中加熱3分鐘。離心後，上清液移至一根新的試管，於加速蒸發器(speed-vac)中蒸發。乾樣本再懸浮於100微升動相內隨後進行分析。

實例4：由己二醯-CoA製備5-FVA 用於5-FVA之測定之HPLC-MS分析方法

藉選擇性反應監視(SRM)-MS，測量變遷m/z 129→83檢測5-FVA。經由測量於約6分鐘洗提之5-FVA峰之峰面積，計算5-FVA之濃度。使用外部標準程序進行校準。全部LC-MS實驗皆係於亞吉冷1200LC系統進行，該系統包含第四級幫浦、自動取樣器及管柱烤爐耦合亞吉冷6410 QQQ三重四元MS。

LC條件：管柱：50×4.6毫米(紐克希爾(Nucleosil)C18，5微米(馬吉利及那杰(Machery & Nagel))前置管柱耦合至250×4.6毫米內徑普威爾(Prevail)C18，5微米(亞鐵克(Altech))

管柱溫度：室溫

洗提劑：A：含0.1%甲酸之水

流速：1.2毫升/分鐘進入MS之前流以1：3分裂

注入體積：2微升

MS條件：離子化：負離子電噴灑

來源條件：離子噴灑電壓：5kV

溫度：350℃

分段器電壓及碰撞能最佳化

掃描模式：選擇反應模式：變遷m/z 129→83

表現組成體

選出推定的己二醯-CoA還原酶(SeqID 74、75、77、79、80、139-148)。使用pBAD/Myc-His C及pET21d以先前於實例2所述相同方式設計及製備表現組成體。

蛋白質表現、萃取及純化

全部步驟皆如實例2所述進行

酶催化己二醯-CoA還原酶檢定分析

製備反應混合物，包含50mM鉀緩衝液(pH7.5)，各0.7mM NADH及NADPH及10μm-10mM之酶基質己二醯-CoA。190微升反應混合物配送入96孔孔板之各孔。己二醯 -CoA係如實例2所述製備。為了開始反應，10微升無細胞萃取物或已純化蛋白質添加至各孔。由攜帶空白載體之種系以相同方式製備之10微升無細胞萃取物用於對照反應。反應混合物於室溫(20-25℃)培養15分鐘-24小時伴以線上監視340奈米之紫外光吸收。結束時，藉加入等量甲醇終止反應，樣本經離心。上清液移至新鮮孔板，於-80℃儲存至藉HPLC-MS檢測5-FVA為止。5-FVA之測量驗證所選的酶具有己二醯-CoA還原酶活性。

實例5：由5-FVA製備6-ACA 用於6-ACA之測定之HPLC-MS分析

校準：校準係藉6-ACA之外部校準線進行(m/z 132→m/z 114，室溫7.5分鐘)。全部LC-MS實驗皆係於亞吉冷1100進行，該設備裝配有第四級幫浦、除氣器、自動取樣器、管柱烤爐及單一四元MS(亞吉冷，德國瓦崩)。LC-MS條件為：管柱：50*4紐克希爾(馬吉利及那杰)+250×4.6普威爾C18(亞鐵克)，皆係於室溫(RT)

洗提劑：A=0.1(v/v)甲酸於超純水

B=乙腈(pa，默克公司(Merck))

流速：1.0毫升/分鐘，進入MS前液流以1：3分裂

梯度：於t=0分鐘始於100%(v/v)A，維持15分鐘，於15分鐘內改成80%(v/v)B(t=30分鐘)。由30分鐘至31分鐘，梯度維持恆定於80%(v/v)B。

注入體積：5微升

MS檢測：ESI(+)-MS

電噴灑離子化(ESI)係以正掃描模式使用下列條件進行：m/z 50-500，50V分段器，0.1m/z梯階大小350℃乾燥氣體溫度，10升氮氣/分鐘乾燥氣體，50psig霧化器壓力及2.5kV毛細電壓。

標靶基因之選殖 表現組成體之設計

attB位置添加至核糖體結合位置及起始密碼子上游及起始密碼子下游的全部基因來協助使用Gatway技術(英微基因公司，美國加州卡斯貝德)選殖。

基因合成及質體之組成

合成基因係得自DNA2.0，密碼子根據DNA2.0之標準程序最佳化用於大腸桿菌表現。分別編碼河流弧菌JS17ω-轉胺酶[SEQ ID No.82]及韋氏芽胞桿菌KBAB4轉胺酶(ZP_01186960)[SEQ ID No.83]之得自河流弧菌JS17[SEQ ID No.86]及韋氏芽胞桿菌KBAB4[SEQ ID No.89]之轉胺酶基因分別經密碼子最佳化，所得序列[SEQ ID No.88]及[SEQ ID No.91]係藉DNA合成而獲得。

被提供以該等基因之細胞於後文分別稱作為大腸桿菌TOP10/pBAD-Vfl_AT及大腸桿菌TOP10/pBAD-Bwe_AT。

藉PCR選殖

根據製造商規格，使用高度可靠度PCR超混合機 (PCR Supermix High Fidelity)(英微基因公司)藉PCR由基因體DNA擴增多種編碼生物催化劑之基因。

PCR反應係藉瓊脂糖凝膠電泳分析，使用快爾魁克(QIAquick)PCR純化套件組(快爾晶公司(Qiagen)，德國希爾登)由凝膠洗提出具正確尺寸的PCR產物。如製造商方案所述，使用Gateway技術(英微基因公司)透過所導入之attB位置及pDONR-zeo(英微基因公司)作為進入載體，將已純化之PCR產物選殖入pBAD/Myc-Hs-DEST表現載體。藉DNA定序證實藉PCR選殖之基因序列。藉此方式獲得表現載體，pBAD-Bsu_gi16077991_AT(包含序列ID 133表示之基因，編碼序列ID 134表示之胜肽)、pBAD-Pae_gi9946143_AT(使用如序列ID 130及131識別之引子)、pBAD-Pae_gi9951072_AT(包含序列ID 135表示之基因，編碼序列ID 136表示之胜肽)、pBAD-Pae_gi9951630_AT(包含序列ID 137表示之基因，編碼序列ID 138表示之胜肽)。藉以pBAD組成體轉形化學上勝任的大腸桿菌TOP10(英微基因公司)獲得相對應之表現種系。

用於將5-甲醯戊酸轉化成6-ACA之酶催化反應

除非另行規定，否則製備反應混合物包含10mM 5-甲醯戊酸，20mM外消旋α甲基嶋基胺及200μM吡哆醛5’-磷酸於50mM磷酸鉀緩衝液，pH 7.0。100微升反應混合物配送入孔板之各孔。為了引發反應添加20微升無細胞萃取物至各孔。反應混合物於振搖器上於37℃振搖24小時。此外，化學空白組混合物(不含無細胞萃取物)及生物空白組(含pBAD/Myc-His C之大腸桿菌TOP10)於相同條件下培養。藉HPLC-MS分析樣本。結果摘述於下表。

*方法不同之處在於使用10微升無細胞萃取物而非20微升，吡哆醛-5’-磷酸濃度為50μM而非200μM及孔內之反應混合物體積為190微升而非100微升

顯示於轉胺酶存在下由5-FVA形成6-ACA，及大腸桿菌可催化此項形成反應。

<110> DSM智慧財產有限公司WU,Liang Trefzer,Axel Christoph De Wildeman,Stefaan Marie Andre Berg,Marco Alexander

<120> Adipate(ester or thioester)synthesis

<130> P84199PC00

<150> EP 08152595.8

<151> 2008-11-03

<160> 148

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 419

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 1

<210> 2

<211> 418

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 2

<210> 3

<211> 418

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 3

<210> 4

<211> 413

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 4

<210> 5

<211> 401

<212> PRT

<213> Acinetobacter sp.

<400> 5

<210> 6

<211> 393

<212> PRT

<213> Clostridium kluyveri

<400> 6

<210> 7

<211> 391

<212> PRT

<213> Clostridium kluyveri

<400> 7

<210> 8

<211> 391

<212> PRT

<213> Clostridium kluyveri

<400> 8

<210> 9

<211> 408

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 9

<210> 10

<211> 401

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 10

<210> 11

<211> 400

<212> PRT

<213> Pseudomonas putida

<400> 11

<210> 12

<211> 394

<212> PRT

<213> Ralstonia eutropha

<400> 12

<210> 13

<211> 406

<212> PRT

<213> Rhodococcus sp.

<400> 13

<210> 14

<211> 327

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 14

<210> 15

<211> 901

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 15

<210> 16

<211> 319

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 16

<210> 17

<211> 335

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 17

<210> 18

<211> 505

<212> PRT

<213> Acinetobacter sp.

<400> 18

<210> 19

<211> 282

<212> PRT

<213> Clostridium kluyveri

<400> 19

<210> 20

<211> 319

<212> PRT

<213> Clostridium kluyveri

<400> 20

<210> 21

<211> 475

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 21

<210> 22

<211> 320

<212> PRT

<213> Euglena gracilis

<400> 22

<210> 23

<211> 505

<212> PRT

<213> Pseudomonas putida

<400> 23

<210> 24

<211> 246

<212> PRT

<213> Ralstonia eutropha

<400> 24

<210> 25

<211> 284

<212> PRT

<213> Rhodococcus sp.

<400> 25

<210> 26

<211> 699

<212> PRT

<213> Rhodopseudomonas palustris

<400> 26

<210> 27

<211> 278

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 27

<210> 28

<211> 244

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 28

<210> 29

<211> 300

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 29

<210> 30

<211> 327

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 30

<210> 31

<211> 901

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 31

<210> 32

<211> 293

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 32

<210> 33

<211> 261

<212> PRT

<213> Acinetobacter sp.

<400> 33

<210> 34

<211> 136

<212> PRT

<213> Aeromonas salmonicida

<400> 34

<210> 35

<211> 259

<212> PRT

<213> Clostridium kluyveri

<400> 35

<210> 36

<211> 257

<212> PRT

<213> Clostridium kluyveri

<400> 36

<210> 37

<211> 255

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 37

<210> 38

<211> 257

<212> PRT

<213> Pseudomonas putida

<400> 38

<210> 39

<211> 263

<212> PRT

<213> Pseudomonas putida

<400> 39

<210> 40

<211> 699

<212> PRT

<213> Rhodopseudomonas palustris

<400> 40

<210> 41

<211> 242

<212> PRT

<213> Rhodococcus sp.

<400> 41

<210> 42

<211> 689

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 42

<210> 43

<211> 425

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 43

<210> 44

<211> 605

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 44

<210> 45

<211> 425

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 45

<210> 46

<211> 633

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 46

<210> 47

<211> 695

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 47

<210> 48

<211> 542

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 48

<210> 49

<211> 438

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 49

<210> 50

<211> 453

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 50

<210> 51

<211> 441

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 51

<210> 52

<211> 439

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 52

<210> 53

<211> 446

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 53

<210> 54

<211> 513

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 54

<210> 55

<211> 436

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 55

<210> 56

<211> 429

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 56

<210> 57

<211> 405

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 57

<210> 58

<211> 373

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 58

<210> 59

<211> 302

<212> PRT

<213> Cavia sp.

<400> 59

<210> 60

<211> 386

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 60

<210> 61

<211> 379

<212> PRT

<213> Clostridium kluyveri

<400> 61

<210> 62

<211> 562

<212> PRT

<213> Clostridium kluyveri

<400> 62

<210> 63

<211> 539

<212> PRT

<213> Euglena gracilis

<400> 63

<210> 64

<211> 303

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 64

<210> 65

<211> 303

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 65

<210> 66

<211> 373

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 66

<210> 67

<211> 380

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 67

<210> 68

<211> 365

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 68

<210> 69

<211> 525

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 69

<210> 70

<211> 253

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 70

<210> 71

<211> 462

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 71

<210> 72

<211> 357

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 72

<210> 73

<211> 320

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 73

<210> 74

<211> 472

<212> PRT

<213> Clostridium kluyveri

<400> 74

<210> 75

<211> 451

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 75

<210> 76

<211> 876

<212> PRT

<213> Clostridium kluyveri

<400> 76

<210> 77

<211> 491

<212> PRT

<213> Clostridium kluyveri

<400> 77

<210> 78

<211> 491

<212> PRT

<213> Clostridium kluyveri

<400> 78

<210> 79

<211> 469

<212> PRT

<213> Propionibacterium freudenreichi

<400> 79

<210> 80

<211> 858

<212> PRT

<213> Clostridium acetobutylicum

<400> 80

<210> 81

<211> 862

<212> PRT

<213> Clostridium acetobutylicum

<400> 81

<210> 82

<211> 453

<212> PRT

<213> Vibrio fluvialis

<400> 82

<210> 83

<211> 449

<212> PRT

<213> Bacillus weihenstephanensis

<400> 83

<210> 84

<211> 456

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 84

<210> 85

<211> 538

<212> PRT

<213> 產黃青黴

<400> 88

<210> 86

<211> 1362

<212> DNA

<213> vibrio fluvialis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1362)

<400> 56

<210> 87

<211> 453

<212> PRT

<213> vibrio fluvialis

<400> 87

<210> 88

<211> 1362

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Vibrio fluvialis JS17 omega-aminotransferase codon optimised gene

<400> 88

<210> 89

<211> 1350

<212> DNA

<213> Bacillus weihenstephanensis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1350)

<400> 89

<210> 90

<211> 449

<212> PRT

<213> Bacillus weihenstephanensis

<400> 90

<210> 91

<211> 1350

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> B.weihenstephanensis KBAB4 aminotransferase codon-optimised gene

<400> 91

<210> 92

<211> 255

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae；Hydroxyacyl-thioester dehydratase type 2,mitochondrial(P38790)

<400> 92

<210> 93

<211> 860

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Microscilla marina ATCC 23134 Peroxisomal trans-2-enoyl-CoA reductase；EC=1.3.1.38(A1ZFB1)

<400> 93

<210> 94

<211> 273

<212> PRT

<213> Microscilla marina ATCC 23134 Peroxisomal trans-2-enoyl-CoA reductase；EC=1.3.1.38(A1ZFB1)

<400> 94

<210> 95

<211> 1241

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Clostridium beijerinckii(strain ATCC 51743/NCIMB 8052),Putative reductase Cbei_2086；EC=1.3.1(A6LV73)

<400> 95

<210> 96

<211> 400

<212> PRT

<213> Clostridium beijerinckii(strain ATCC 51743/NCIMB 8052),Putative reductase Cbei_2086；EC=1.3.1(A6LV73)

<400> 96

<210> 97

<211> 1238

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Aeromonas hydrophila subsp.hydrophila(strain ATCC 7966/NCIB 9240),Trans-2-enoyl-CoA reductase；EC=1.3.1.44(A0KLI7)

<400> 97

<210> 98

<211> 399

<212> PRT

<213> Aeromonas hydrophila subsp；hydrophila(strain ATCC 7966/NCIB 9240),Trans-2-enoyl-CoA reductase；EC=1.3.1.44(A0KLI7)

<400> 98

<210> 99

<211> 1142

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Yarrowia lipolytica,Probable trans-2-enoyl-CoA reductase,mitochondrial；EC=1.3.1.38,(Q6CBE4)

<400> 99

<210> 100

<211> 367

<212> PRT

<213> Yarrowia lipolytica,Probable trans-2-enoyl-CoA reductase,mitochondrial；EC=1.3.1.38,(Q6CBE4)

<400> 100

<210> 101

<211> 1856

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Clostridium kluyveri(strain ATCC 8527/DSM 555/NCIMB10680)

(A5N5C9)

<400> 101

<210> 102

<211> 334

<212> PRT

<213> Clostridium kluyveri(strain ATCC 8527/DSM 555/NCIMB 10680)(A5N5C9)

<400> 102

<210> 103

<211> 259

<212> PRT

<213> Clostridium kluyveri(strain ATCC 8527/DSM555/NCIMB 10680)(A5N5D0)

<400> 103

<210> 104

<211> 1196

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Megasphaera elsdenii,Acyl-CoA dehydrogenase,short-chain specific；EC=1.3.99.2(Q06319)

<400> 104

<210> 105

<211> 385

<212> PRT

<213> Megasphaera elsdenii,Acyl-CoA dehydrogenase,short-chain specific；EC=1.3.99.2(Q06319)

<400> 105

<210> 106

<211> 1421

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Acinetobacter sp.(strain ADP1),Acyl-CoA dehydrogenase；EC=1.3.99(Q937T2)

<400> 106

<210> 107

<211> 223

<212> PRT

<213> Acinetobacter sp.(strain ADP1),Acyl-CoA dehydrogenase；EC=1.3.99(Q937T2)

<400> 107

<210> 108

<211> 1190

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Deinococcus radiodurans,Acyl-CoA dehydrogenase(Q9RVV0)

<400> 108

<210> 109

<211> 383

<212> PRT

<213> Deinococcus radiodurans,Acyl-CoA dehydrogenase(Q9RVV0)

<400> 109

<210> 110

<211> 1202

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Arabidopsis thaliana,Isovaleryl-CoA dehydrogenase,mitochondrial；Short=IVD；EC=1.3.99.10

<400> 110

<210> 111

<211> 387

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana,Isovaleryl-CoA dehydrogenase,mitochondrial；Short=IVD；EC=1.3.99.10

<400> 111

<210> 112

<211> 1232

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Homo sapiens,Glutaryl-CoA dehydrogenase,mitochondrial；Short=GCD；EC=1.3.99.7(Q92947)

<400> 112

<210> 113

<211> 397

<212> PRT

<213> Homo sapiens,Glutaryl-CoA dehydrogenase,mitochondrial；Short=GCD；EC=1.3.99.7(Q92947)

<400> 113

<210> 114

<211> 1784

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Homo sapiens,Electron transfer flavoprotein subunit alpha,mitochondrial(P13804)

<400> 114

<210> 115

<211> 314

<212> PRT

<213> Homo sapiens,Electron transfer flavoprotein subunit alpha,mitochondrial(P13804)

<400> 115

<210> 116

<211> 255

<212> PRT

<213> Homo sapiens,Electron transfer flavoprotein subunit beta(P38117)

<400> 116

<210> 117

<211> 316

<212> PRT

<213> Homo sapiens Acyl-coenzyme A thioesterase 8,EC=3.1.2.27(O14734)

<400> 117

<210> 118

<211> 931

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Hyphomonas neptunium Acyl-CoA thioesterase(Q0BZ30)

<400> 118

<210> 119

<211> 294

<212> PRT

<213> Hyphomonas neptunium Acyl-CoA thioesterase(Q0BZ30)

<400> 119

<210> 120

<211> 1421

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Acinetobacter sp.(strain ADP1),Acyl-CoA-transferase subunit A

(EC=2.8.3.6)(Q937T0)

<400> 120

<210> 121

<211> 223

<212> PRT

<213> Acinetobacter sp.(strain ADP1),Acyl-CoA-transferase subunit A(EC=2.8.3.6)(Q937T0)

<400> 121

<210> 122

<211> 224

<212> PRT

<213> Acinetobacter sp.(strainADP1)Acyl-CoA-transferase subunit B(EC 2.8.3.6)(Q937S9)

<400> 122

<210> 123

<211> 437

<212> PRT

<213> Clostridium kluyveri(strain ATCC 8527)acetate CoA-transferase activity(A5N390)

<400> 123

<210> 124

<211> 538

<212> PRT

<213> Clostridium kluyveri(strain ATCC 8527)Succinyl-CoA：coenzyme A transferase(P38946)

<400> 124

<210> 125

<211> 232

<212> PRT

<213> Pseudomonas fluorescens(strain Pf-5/ATCC BAA-477)3-oxoacid CoA-transferase subunit A family enzyme(Q4KEA3)

<400> 125

<210> 126

<211> 219

<212> PRT

<213> Pseudomonas fluorescens(strain Pf-5/ATCC BAA-477)3-oxoacid CoA-transferase subunit B family enzyme(Q4KEA4)

<400> 126

<210> 127

<211> 477

<212> PRT

<213> Acinetobacter sp.NCIMB9871 6-oxohexanoate dehydrogenase(Q9R2F4)

<400> 127

<210> 128

<211> 473

<212> PRT

<213> Brucella melitensis 6-oxohexanoate dehydrogenase(Q8YDF1)

<400> 128

<210> 129

<211> 1371

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Pseudomonas aeruginosa(gi 9946143)

<400> 129

<210> 130

<211> 456

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa(gi 9946143)

<400> 130

<210> 131

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 131

<210> 132

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 132

<210> 133

<211> 1353

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Bacillus subtilis aminotransferase gene(gi16077991)

<400> 133

<210> 134

<211> 450

<212> PRT

<213> amino acid sequence of B.subtilis aminotransferase

(gi16077991)

<400> 134

<210> 135

<211> 1407

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Pseudomonas aeruginosa aminotransferase gene(seq ID gi9951072)

<400> 135

<210> 136

<211> 468

<212> PRT

<213> amino acid sequence of Pseudomonas aeruginosa aminotransferase(seq ID gi9951072)

<400> 136

<210> 137

<211> 1335

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Pseudomonas aeruginosa aminotransferase gene(seq ID

gi9951630)

<400> 137

<210> 138

<211> 444

<212> PRT

<213> amino acid sequence of Pseudomonas aeruginosa aminotransferase(seq ID gi9951630)

<400> 138

<210> 139

<211> 467

<212> PRT

<213> Escherichia coli(strain K12)Ethanolamine utilization protein eutE(P77445)

<400> 139

<210> 140

<211> 532

<212> PRT

<213> Clostridium tetani Alcohol dehydrogenase(Q894U3)

<400> 140

<210> 141

<211> 297

<212> PRT

<213> Burkholderia thailandensis(strain E264/ATCC 700388)Acetaldehyde dehydrogenase(Q2T7T0)

<400> 141

<210> 142

<211> 316

<212> PRT

<213> Pseudomonas putida Acylating aldehyde dehydrogenase(Q9EVJ2)

<400> 142

<210> 143

<211> 539

<212> PRT

<213> Burkholderia mallei Acetaldehyde dehydrogenase(Acetylating)(A5XRR2)

<400> 143

<210> 144

<211> 464

<212> PRT

<213> Salmonella typhimurium Propanediol utilization CoA-dependent propionaldehyde dehydrogenase(Q9XDN1)

<400> 144

<210> 145

<211> 315

<212> PRT

<213> Rhodococcus sp.(strain RHA1)Acetaldehyde dehydrogenase(Q0SJD4)

<400> 145

<210> 146

<211> 468

<212> PRT

<213> Clostridium beijerinckii Coenzyme A acylating aldehyde dehydrogenase(Q9X681)

<400> 146

<210> 147

<211> 475

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis serovar israelensis Alcohol dehydrogenase/Acetaldehyde dehydrogenase(Acetylating)(Q3EZP1)

<400> 147

<210> 148

<211> 467

<212> PRT

<213> marine gamma proteobacterium Aldehyde dehydrogenase(NAD)family protein(B7RWJ8)

<400> 148

Claims

一種用於製備己二酸酯或己二酸硫酯之方法，包含於一能夠催化2,3-烯酸部分或2-烯醯部分之碳-碳雙鍵還原的生物催化劑存在下，將2,3-去氫己二酸酯或2,3-去氫己二酸硫酯轉化成己二酸酯或己二酸硫酯，其中2,3-去氫己二酸酯或2,3-去氫己二酸硫酯係經由轉化3-羥己二酸酯或3-羥己二酸硫酯製備。
如請求項1之方法，其中該生物催化劑包含選自於由作用於施體之HC-CH基團的氧化還原酶(EC 1.3.1.或1.3.99)所組成之組群中之酶。
如請求項1或2之方法，該生物催化劑包含一酶，該酶選自於由烯醯-CoA還原酶(EC 1.3.1.8、EC 1.3.1.38及EC 1.3.1.44)所組成之組群；由烯醯-[醯-載劑-蛋白]還原酶EC 1.3.1.9、EC 1.3.1.10及EC 1.3.1.39所組成之組群；及由丁醯-CoA去氫酶(EC 1.3.99.2)、醯-CoA去氫酶(1.3.99.3)及長鏈醯-CoA去氫酶(EC 1.3.99.13)所組成之組群。
如請求項1至3中任一項之方法，該生物催化劑包含選自於由下列所組成之組群中之一有機體之酶：埃希氏菌屬(Escherichia)、弧菌屬(Vibrio)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、鏈絲菌屬(Streptomycetes)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、許旺氏菌屬(Shewanella)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、木質菌屬(Xylella)、耶氏菌屬 (Yersinia)、密螺旋體屬(Treponema)、真桿菌屬(Eubacterium)、微顫菌屬(Microscilla)、產氣單胞菌屬(Aeromonas)、巨球菌屬(Megasphaera)、不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)、迪諾球菌屬(Deinococcus)、雅羅氏菌屬(Yarrowia)、眼蟲門(Euglenozoa)、酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、麴菌屬(Aspergillus)、青黴屬(Penicillium)、擬南芥屬(Arabidopsis)、人(Homo sapiens)、褐鼠(Rattus norvegicus)、歐洲牛(Bos taurus)、天竺鼠種屬(Cavia sp.)、麗紋扁形蟲(Caenorhabditis elegans)及黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)。
如請求項4之方法，該生物催化劑包含選自於由下列所組成之組群中之一有機體之酶：大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(B.subtilis)、克魯維梭菌(C.kluyveri)、乙醯丁酸梭菌(C.acetobutylicum)、產氣莢膜梭菌(C.perfringens)、天藍色鏈絲菌(S.coelicolor)、阿維氏鏈絲菌(S.avermitilis)、普氏假單胞菌(P.putida)、綠膿桿菌(P.aeruginosa)、齒密螺旋體(T.denticola)、嗜丙酮酸真桿菌(E.pyruvativorans)、海洋微顫菌(Microscilla marina)、嗜水產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、艾氏巨球菌(M.elsdenii)、輻射狀迪諾球菌(D.radiodurans)、分解脂肪雅羅氏菌(Yarrowia lypolytica)、薄眼蟲(Euglena gracilis)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、乳酸克魯維酵母(K.lactis)、龐貝裂殖酵母(S.pombe)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)、黑麴菌(A.niger)、巢麴菌(A.nidulans)、產黃青黴(P.chrysogenum)及阿拉伯芥(A.thaliana)。
如請求項1至5中任一項之方法，其中該3-羥己二酸酯或硫酯係於一能夠催化3-羥醯酯或3-羥醯硫酯去水成為2-烯醯酯或硫酯之生物催化劑存在下，藉生物催化而轉化。
如請求項6之方法，其中該能夠催化3-羥醯酯或3-羥醯硫酯去水成為2-烯醯酯或硫酯之生物催化劑包含一選自於由脫水酶(hydrolyase)(EC 4.2.1)所組成之組群的酶。
如請求項6之方法，其中該能夠催化3-羥醯酯或3-羥醯硫酯去水成為2-烯醯酯或硫酯之生物催化劑包含一選自於由烯醯-CoA水合酶(hydratase)(EC 4.2.1.17)、3-羥丁醯-CoA去水酶(EC 4.2.1.55)及長鏈-烯醯-CoA水合酶(EC 4.2.1.74)所組成之組群中之酶。
如請求項6至8中任一項之方法，其中該生物催化劑包含選自於由下列所組成之組群中之一有機體之一酶：不動桿菌屬(Acinetobacter)、產鹼桿菌屬(Alicaligenes)、麴菌屬(Aspergillus)、脫氮菌屬(Arzoarcus)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、大腸桿菌(E.coli)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、紅黴屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅球菌屬 (Rodococcus)、產氣單胞菌屬(Aeromonas)、梭菌屬(Clostridium)、棉菌屬(Gossypium)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)、拉斯東氏菌屬(Ralstonia)、眼蟲門(Euglenozoa)、巨球菌屬(Megasphaera)、酵母屬(Saccharomyces)及哺乳動物。
如請求項9之方法，其中該生物催化劑包含選自於由下列所組成之組群中之一有機體之一酶：不動桿菌種系ADP1、乙酸鈣不動桿菌(A.calcoaceticus)、產鹼桿菌D2、黑麴菌(A.niger)、衣凡氏脫氮菌(A.evansii)、嗜鹽芽胞桿菌(B.halodurans)、麩胺酸棒桿菌(C.glutamicum)、金橙黃棒桿菌(C.aurantiacum)、粗糙紅黴(N.crassa)、產黃青黴(P.chrysogenum)、普氏假單胞菌(P.putida)、螢光假單胞菌(P.fluorescens)、沼澤紅假單胞菌(R.palustris)、紅球菌種系RHA1、天竺產氣單胞菌(A.caviae)、乙醯丁酸梭菌(C.acetobutylicum)、克魯維梭菌(C.kluyveri)、美洲棉菌(G.hirsutum)、深紅紅螺菌(R.rubrumi)、營養拉斯東氏菌(R.eutropha)、薄眼蟲(Euglena gracilis)、艾氏巨球菌(M.elsdenii)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、歐洲牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)、褐鼠(Rattus norvegicus)及歐洲豬(Sus scrofa)。
一種用於製備己二酸酯或己二酸硫酯之方法，包含於一能夠催化2,3-烯酸部分或2-烯醯部分之碳-碳雙鍵還原的生物催化劑存在下，將2,3-去氫己二酸酯或2,3-去氫己二酸硫酯轉化成己二酸酯或己二酸硫酯，其中2,3-去氫己二酸酯或2,3-去氫己二酸硫酯係於一能夠催化3-羥醯酯或3-羥醯硫酯去水成為2-烯醯酯或硫酯之生物催化劑存在下，經由生物催化地轉化3-羥己二酸酯或3-羥己二酸硫酯而被製備；且其中該3-羥己二酸酯或硫酯係經由轉化3-酮己二酸酯或3-酮己二酸硫酯而製備。
如請求項11之方法，其中該能夠催化2,3-烯酸部分或2-烯醯部分之碳-碳雙鍵還原的生物催化劑是選自於作用於施體之HC-CH基團的氧化還原酶(EC 1.3.1.或1.3.99)所組成之組群。
如請求項11或12之方法，其中該能夠催化2,3-烯酸部分或2-烯醯部分之碳-碳雙鍵還原的生物催化劑是選自於由烯醯-CoA還原酶(EC 1.3.1.8、EC 1.3.1.38及EC 1.3.1.44)所組成之組群；由烯醯-[醯-載劑-蛋白]還原酶EC 1.3.1.9、EC 1.3.1.10及EC 1.3.1.39所組成之組群；及由丁醯-CoA去氫酶(EC 1.3.99.2)、醯-CoA去氫酶(1.3.99.3)及長鏈醯-CoA去氫酶(EC 1.3.99.13)所組成之組群。
如請求項11至13項中任一項之方法，其中，該生物催化劑包含選自於由下列所組成之組群中之一有機體之酶：埃希氏菌屬(Escherichia)、弧菌屬(Vibrio)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、鏈絲菌屬(Streptomycetes)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、許旺氏菌屬(Shewanella)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、木質菌屬(Xylella)、耶氏菌屬(Yersinia)、密螺旋體屬(Treponema)、真桿菌屬(Eubacterium)、微顫菌屬(Microscilla)、產氣單胞菌屬(Aeromonas)、巨球菌屬(Megasphaera)、不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)、迪諾球菌屬(Deinococcus)、雅羅氏菌屬(Yarrowia)、眼蟲門(Euglenozoa)、酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、麴菌屬(Aspergillus)、青黴屬(Penicillium)、擬南芥屬(Arabidopsis)、人(Homo sapiens)、褐鼠(Rattus norvegicus)、歐洲牛(Bos taurus)、天竺鼠種屬(Cavia sp.)、麗紋扁形蟲(Caenorhabditis elegans)及黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)。
如請求項14之方法，其中該生物催化劑包含選自於由下列所組成之組群中之一有機體之酶：大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(B.subtilis)、克魯維梭菌(C.kluyveri)、乙醯丁酸梭菌(C.acetobutylicum)、產氣莢膜梭菌(C.perfringens)、天藍色鏈絲菌(S.coelicolor)、阿維氏鏈絲菌(S.avermitilis)、普氏假單胞菌(P.putida)、綠膿桿菌(P.aeruginosa)、齒密螺旋體(T.denticola)、嗜丙酮酸真桿菌(E.pyruvativorans)、海洋微顫菌(Microscilla marina)、嗜水產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、艾氏巨球菌(M.elsdenii)、輻射狀迪諾球菌(D.radiodurans)、分解脂肪雅羅氏菌(Yarrowia lypolytica)、薄眼蟲(Euglena gracilis)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、乳酸克魯維酵母(K.lactis)、龐貝裂殖酵母(S.pombe)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)、黑麴菌(A.niger)、巢麴菌(A.nidulans)、產黃青黴(P.chrysogenum)及阿拉伯芥(A.thaliana)。
如請求項11至15中任一項之方法，其中該3-羥己二酸酯或硫酯係於一能夠催化3-羥醯酯或3-羥醯硫酯去水成為2-烯醯酯或硫酯之生物催化劑存在下，藉生物催化而轉化。
如請求項16之方法，其中該能夠催化3-羥醯酯或3-羥醯硫酯去水成為2-烯醯酯或硫酯之生物催化劑包含一選自於由脫水酶(hydrolyase)(EC 4.2.1)所組成之組群的酶。
如請求項16之方法，其中該能夠催化3-羥醯酯或3-羥醯硫酯去水成為2-烯醯酯或硫酯之生物催化劑包含一選自於由烯醯-CoA水合酶(hydratase)(EC 4.2.1.17)、3-羥丁醯-CoA去水酶(EC 4.2.1.55)及長鏈-烯醯-CoA水合酶(EC 4.2.1.74)所組成之組群中之酶。
如請求項16至18中任一項之方法，其中該能夠催化3-羥醯酯或3-羥醯硫酯去水成為2-烯醯酯或硫酯之生物催化劑包含選自於由下列所組成之組群中之一有機體之一酶：不動桿菌屬(Acinetobacter)、產鹼桿菌屬(Alicaligenes)、麴菌屬(Aspergillus)、脫氮菌屬(Arzoarcus)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、大腸桿菌(E.coli)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、紅黴屬(Neurospora)、青黴屬 (Penicillium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅球菌屬(Rodococcus)、產氣單胞菌屬(Aeromonas)、梭菌屬(Clostridium)、棉菌屬(Gossypium)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)、拉斯東氏菌屬(Ralstonia)、眼蟲門(Euglenozoa)、巨球菌屬(Megasphaera)、酵母屬(Saccharomyces)及哺乳動物。
如請求項19之方法，其中該能夠催化3-羥醯酯或3-羥醯硫酯去水成為2-烯醯酯或硫酯之生物催化劑包含選自於由下列所組成之組群中之一有機體之一酶：不動桿菌種系ADP1、乙酸鈣不動桿菌(A.calcoaceticus)、產鹼桿菌D2、黑麴菌(A.niger)、衣凡氏脫氮菌(A.evansii)、嗜鹽芽胞桿菌(B.halodurans)、麩胺酸棒桿菌(C.glutamicum)、金橙黃棒桿菌(C.aurantiacum)、粗糙紅黴(N.crassa)、產黃青黴(P.chrysogenum)、普氏假單胞菌(P.putida)、螢光假單胞菌(P.fluorescens)、沼澤紅假單胞菌(R.palustris)、紅球菌種系RHA1、天竺產氣單胞菌(A.caviae)、乙醯丁酸梭菌(C.acetobutylicum)、克魯維梭菌(C.kluyveri)、美洲棉菌(G.hirsutum)、深紅紅螺菌(R.rubrumi)、營養拉斯東氏菌(R.eutropha)、薄眼蟲(Euglena gracilis)、艾氏巨球菌(M.elsdenii)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、歐洲牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)、褐鼠(Rattus norvegicus)及歐洲豬(Sus scrofa)。
如請求項11至20中任一項之方法，包含於一生物催化劑存在下轉化該3-酮己二酸酯或3-酮己二酸硫酯，該生物催化劑能夠催化羰基還原成醇基或能夠催化3-酮醯酯或3-酮醯硫酯還原成相對應之3-羥醯酯或硫酯。
如請求項21之方法，其中該生物催化劑係選自於由去氫酶(E.C.1.1.1)所組成之組群。
如請求項21之方法，其中該生物催化劑係選自於由3-羥醯-CoA去氫酶(EC 1.1.1.35及EC 1.1.1.36)、3-羥丁醯-CoA去氫酶(EC 1.1.1.157)、3-羥庚二醯-CoA去氫酶(EC 1.1.1.259)及長鏈3-羥醯-CoA去氫酶(EC 1.1.1.211)所組成之組群。
如請求項21至23中任一項之方法，其中該生物催化劑包含選自於由下列所組成之組群中之一有機體之一酶：不動桿菌屬(Acinetobacter)、產鹼桿菌屬(Alcaligenes)、脫氮菌屬(Arzoarcus)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、博德氏菌屬(Bordetella)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、迪諾球菌屬(Deinococcus)、大腸桿菌(E.coli)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、克雷白氏菌屬(Klebsiella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅球菌屬(Rodococcus)、麴菌屬(Aspergillus)、紅黴屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、酵母屬(Saccharomyces)、歐洲牛(Bos taurus)、褐鼠(Rattus norvegicus)、歐洲豬(Sus scrofa)、人(Homo sapiens)、梭菌屬(Clostridium)、眼蟲門(Euglenozoa)、巨球菌屬(Megasphaera)、拉斯東氏菌屬(Ralstonia)及菌膠團(Zoogloea)。
如請求項21至23中任一項之方法，其中該生物催化劑包含選自於由下列所組成之組群中之一有機體之一酶：不動桿菌種系ADP1、乙酸鈣不動桿菌(A.calcoaceticus)、產鹼桿菌種系D2、營養產鹼桿菌(A.eutrophus)、衣凡氏脫氮菌(A.evansii)、嗜鹽芽胞桿菌(B.halodurans)、百日咳桿菌(B.pertussis)、B.pseudomallei、B.xenovorans、麩胺酸棒桿菌(C.glutamicum)、金橙黃棒桿菌(C.aurantiacum)、有效棒桿菌(C.efficiens)、輻射狀迪諾球菌(D.radiodurans)、肺炎桿菌(K.pneumonia)、普氏假單胞菌(P.putida)、螢光假單胞菌(P.fluorescens)、沼澤紅假單胞菌(R.palustris)、產紅紅球菌(R.erythropolis)、乳白紅球菌(R.opacus)、紅球菌種系RHA1、黑麴菌(A.niger)、粗糙紅黴(N.crassa)、產黃青黴(P.chrysogenum)、乙醯丁酸梭菌(C.acetobutylicum)、克魯維梭菌(C.kluyveri)、薄眼蟲(Euglena gracilis)、艾氏巨球菌(M.elsdenii)、營養拉斯東氏菌(R.eutropha)及分枝菌膠團(Zoogloea ramigera)。
如請求項11至25項中任一項之方法，其中該3-酮己二酸酯或3-酮己二酸硫酯係經由丁二酸酯或丁二酸硫酯與乙酸酯或乙酸硫酯反應製備。
如請求項26之方法，包含於一生物催化劑存在下，藉生物催化讓丁二酸酯或硫酯與乙酸酯或硫酯反應。
如請求項27之方法，其中該生物催化劑包含一種能夠轉移乙醯基之酶，該酶選自於由轉醯酶(E.C.2.3.1)所組成之組群。
如請求項27之方法，其中該生物催化劑包含一選自於由乙醯-CoA：乙醯-CoA C-乙醯轉移酶(EC 2.3.1.9)、醯-CoA：乙醯-CoA C-轉醯酶(EC 2.3.1.16)及丁二醯-CoA：乙醯-CoA C-丁二醯轉移酶(EC 2.3.1.174)所組成之組群中的醯基轉移酶。
如請求項27至29中任一項之方法，其中該生物催化劑包含選自於由下列所組成之組群中之一有機體之酶：不動桿菌屬(Acinetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、產鹼桿菌屬(Alcaligenes)、關節桿菌屬(Arthrobacter)、脫氮菌屬(Arzoarcus)、固氮單胞菌屬(Azomonas)、固氮桿菌屬(Azotobacter)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、拜葉林克氏菌屬(Beijerinckia)、緩根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、梭菌屬(Clostridium)、冠單胞菌屬(Comamonas)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、大腸桿菌(E.coli)、腸桿菌屬(Enterobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、巨球菌屬(Megasphaera)、諾卡氏菌屬(Norcadia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、拉斯東氏菌屬(Ralstonia)、根瘤菌屬(Rhizobium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅球菌屬(Rodococcus)、麴菌屬(Aspergillus)、眼蟲門(Euglenozoa)、紅黴屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、紅酵母屬(Rhodotorula)、酵母屬(Saccharomyces)及毛孢黴屬(Trichosporon)。
如請求項30之方法，其中該生物催化劑包含選自於由下列所組成之組群中之一有機體之酶：不動桿菌屬種系ADP1、乙酸鈣不動桿菌(A.calcoaceticus)、根瘤土壤桿菌(A.tumefaciens)、產鹼桿菌種系D2、營養產鹼桿菌(A.eutrophus)、衣凡氏脫氮菌(A.evansii)、嗜鹽芽胞桿菌(B.halodurans)、克魯維梭菌(C.kluyveri)、麩胺酸棒桿菌(C.glutamicum)、金橙黃棒桿菌(C.aurantiacum)、艾氏巨球菌(M.elsdenii)、普氏假單胞菌(P.putida)、綠膿桿菌(P.aeruginosa)、假單胞菌種屬種系B13、營養拉斯東氏菌(R.eutropha)、沼澤紅假單胞菌(R.palustris)、產紅紅球菌(R.erythropolis)、乳白紅球菌(R.opacus)、紅球菌種屬種系RHA1、黑麴菌(A.niger)、薄眼蟲(Euglena gracilis)、粗糙紅黴(N.crassa)、產黃青黴(P.chrysogenum)及表皮毛孢黴(T.cutaneum)。
如請求項1至31中任一項之方法，其中該等酯中之任一者係選自於由生物活性基團所組成之組群，特別係選自於由輔酶A、磷酸泛醯巰乙胺其可結合至醯基或胜肽基載劑蛋白、N-乙醯-半胱胺、甲基-硫-乙醇酸、甲基-巰-丙酸、乙基-巰-丙酸、甲基-巰-丁酸、甲基-巰-丁酸及巰丙酸所組成之組群。
一種用於製備己二酸之方法，包含於如請求項1至32中任一項之方法中製備己二酸酯或己二酸硫酯以及水解由請求項1至32中任一項之方法中所得的該己二酸酯或己二酸硫酯。
如請求項33之方法，其中該水解係藉一生物催化劑催化。
如請求項34之方法，其中該生物催化劑包含選自於由水解酶(hydrolase)(EC 3.1.2)所組成之組群之一酶。
一種用於製備己二酸之方法，包含於如請求項1至32中任一項之方法中製備己二酸酯或己二酸硫酯以及轉移於如請求項1至32中任一項之方法所得之己二酸酯或己二酸硫酯之活性基，其中該活性基之轉移係藉一生物催化劑催化。
如請求項36之用於製備己二酸之方法，其中該生物催化劑包含一催化含硫基團轉移之酶(EC 2.8)。
如請求項37之方法，其中該酶係選自於由CoA轉移酶(EC 2.8.3)所組成之組群。
一種用於製備5-甲醯戊酸之方法，包含於請求項1至32中任一項之方法中製備己二酸酯或者己二酸硫酯或於如申請專利範圍第33至38項中任一項之方法中製備己二酸，以及將該己二酸酯、己二酸硫酯或己二酸轉化成5-甲醯戊酸。
如請求項39之方法，其中該轉化成5-甲醯戊酸係藉生物催化劑催化。
如請求項40之方法，其中該生物催化劑包含選自於由氧化還原酶(EC 1.2.1)所組成之組群中之一酶。
如請求項41之方法，其中該酶係選自於由下列所組成之組群：醛去氫酶(EC 1.2.1.3、EC 1.2.1.4及EC 1.2.1.5)、丙二酸半醛去氫酶(EC 1.2.1.15)、丁二酸半醛去氫酶(EC 1.2.1.16及EC 1.2.1.24)；麩胺酸半醛去氫酶(EC 1.2.1.20)、胺己二酸半醛去氫酶(EC 1.2.1.31)、己二酸半醛去氫酶(EC 1.2.1.63)所組成之組群；或係選自於由醛去氫酶(乙醯化)(EC 1.2.1.10)、脂肪醯-CoA還原酶(EC 1.2.1.42)、長鏈脂肪醯-CoA還原酶(EC 1.2.1.50)、丁醛去氫酶(EC 1.2.1.57)及丁二酸半醛去氫酶(乙醯化)。
一種用於製備6-胺己酸之方法，包含於如請求項39至42中任一項之方法中製備5-甲醯戊酸，以及將該5-甲醯戊酸轉化成6-胺己酸。
如請求項43之方法，其中該轉化係藉一生物催化劑催化。
如請求項44之方法，其中該生物催化劑能夠催化轉胺化及/或還原胺化，且包含一選自於由轉胺酶(EC 2.6.1)及胺基酸去氫酶(EC 1.4.1)所組成之組群中之酶。
如請求項44之方法，其中該酶係選自於由下列所組成之組群：β-胺異丁酸：α-酮戊二酸轉胺酶、β-丙胺酸轉胺酶、天冬酸轉胺酶、4-胺-丁酸轉胺酶(EC 2.6.19)、L-離胺酸6-轉胺酶(EC 2.6.1.36)、2-胺己二酸轉胺酶(EC 2.6.1.39)、5-胺戊酸轉胺酶(EC 2.6.1.48)、2-胺己酸轉胺酶(EC 2.6.1.67)、離胺酸：丙酮酸6-轉胺酶(EC 2.6.1.71)、及離胺酸-6-去氫酶(EC 1.4.1.18)。
如請求項46之方法，其中該生物催化劑包含得自一有機體之酶，該有機體係選自於由弧菌屬(Vibrio)；假單胞菌屬(Pseudomonas)；芽胞桿菌屬(Bacillus)；山靛屬(Mercurialis)；鐵齒蕨屬(Asplenium)；佳樂樹屬(Ceratonia)；哺乳動物；紅黴屬(Neurospora)；埃希氏菌屬(Escherichia)；棲熱菌屬(Thermus)；酵母屬(Saccharomyces)；短桿菌屬(Brevibacterium)；棒桿菌屬(Corynebacterium)；變形菌屬(Proteus)；土壤桿菌屬(Agrobacterium)；地桿菌屬(Geobacillus)；不動桿菌屬(Acinetobacter)；拉斯東氏菌屬(Ralstonia)及沙門氏菌屬(Salmonella)所組成之組群。
一種用於製備己內醯胺之方法，包含於如請求項43至47項中任一項之方法中製備6-胺己酸，及環化該6-胺己酸，藉此形成己內醯胺。
一種用於製備己二酸酯或己二酸硫酯之發酵方法，包含進行一如請求項1至32中任一項之方法，且包含令具有生物催化劑之細胞與一可發酵碳源接觸，其中該碳源含有將被轉化成欲製備之化合物之該等化合物中之任一者，或其中該等細胞製備將被轉化成欲由該碳源所製備之化合物之該化合物。