ES2655710T3 - Síntesis de éster o tioéster de adipato - Google Patents
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Abstract
Un método para preparar un éster de adipato o tioéster de adipato, que comprende convertir un éster de 2,3- deshidroadipato o tioéster de 2,3-deshidroadipato en el éster o tioéster de adipato en presencia de un biocatalizador.
Description
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Preparación de (éster o tioéster) de 2,3-deshidroadipato ("Reacción 3")
En una realización, se prepara (éster o tioéster) de 2,3-deshidroadipato (5-carboxi-2-pentenoato) a partir de (éster o tioéster) de 3-hidroxiadipato. Opcionalmente, el 2,3-deshidroadipato y el 3-hidroxiadipato se acoplan a una coenzima, ACP u otro grupo activante, como se indicó anteriormente.
En una realización de la invención, el (éster o tioéster) de 2,3-deshidroadipato se prepara convirtiendo (éster o tioéster) de 3-hidroxiadipato químicamente, p.ej. mediante deshidratación en un medio exento de agua en presencia, p.ej., de ácido sulfúrico.
El 2,3-deshidroadipato se puede preparar en particular a partir de 3-hidroxiadipato mediante el uso de al menos un biocatalizador.
Un biocatalizador preferido es un biocatalizador que es capaz de catalizar la deshidratación de un éster o tioéster de 3-hidroxiacilo hasta un éster de 2-enoilo o tioéster de 2-enoilo del mismo.
En una realización específica, el 2,3-deshidroadipato está presente en forma de su tioéster con coenzima A (más adelante en la presente memoria, el tioéster de 2,3-deshidroadipato y la coenzima A se denominarán 5-carboxi-2pentenoil-CoA).
En una realización específica, el biocatalizador cataliza la deshidratación de 3-hidroxiadipil-CoA hasta 5-carboxi-2pentenoil-CoA.
En particular, la reacción biocatalítica se puede llevar a cabo en presencia de un biocatalizador capaz de catalizar la deshidratación de un (tio)éster de 3-hidroxiacilo hasta un tioéster de 2,3-deshidroacilo.
Una enzima que tiene tal actividad catalítica se puede denominar, por lo tanto, (éster o tioéster) de 3-hidroxiacilo deshidratasa. Una enzima que tiene tal actividad catalítica hacia el tioéster 3-hidroxiacil-CoA se puede denominar, por lo tanto, 3-hidroxiacil-CoA deshidratasa. Preferiblemente, dicha 3-hidroxiacil-CoA deshidratasa es selectiva hacia el sustrato 3-hidroxiadipil-CoA.
Una enzima capaz de catalizar la deshidratación de (éster o tioéster) de 3-hidroxiacilo hasta un (éster o tioéster) de 2,3-deshidroacilo se puede seleccionar en particular del grupo de hidroliasas (E.C. 4.2.1), preferiblemente del grupo de enoil-CoA hidratasas (EC 4.2.1.17), 3-hidroxibutiril-CoA deshidratasas (EC 4.2.1.55) y enoil de cadena larga-CoA hidratasas (EC 4.2.1.74). La actividad de 3-hidroxiacil-CoA deshidratasa se ha descrito, por ejemplo, en el metabolismo de ácidos grasos, la síntesis de policétidos, o el metabolismo de butanoato, así como la degradación de compuestos aromáticos según la base de datos KEGG.
Un (éster o tioéster) de 3-hidroxiacilo deshidratasa puede ser una (éster o tioéster) de 3-hidroxiacilo deshidratasa de un organismo seleccionado del grupo de arqueas, bacterias, y eucariotas, por ejemplo del grupo de levaduras, hongos y mamíferos.
En particular, los microorganismos que son capaces de degradar un compuesto orgánico, como se identificó anteriormente (véase la "reacción 1"), en particular un compuesto aromático, un compuesto alicíclico o un ácido dicarboxílico, son fuentes preferidas de un biocatalizador que cataliza la preparación de (éster o tioéster) de 2,3deshidroadipato.
Los microorganismos capaces de degradar un compuesto aromático, un compuesto alicíclico o un ácido dicarboxílico incluyen Acinetobacter (en particular la cepa ADP1 del género Acinetobacter y A. calcoaceticus), Alicaligenes (en particular la cepa D2 de Alicaligenes), Aspergillus (en particular A. niger), Azoarcus (en particular A. evansii), Bacillus (en particular B. halodurans), Corynebacterium (en particular C. glutamicum y C. aurantiacum), E. coli, Flavobacterium, Neurospora (en particular N. crassa), Penicillium (en particular P. chrysogenum), Pseudomonas (en particular P. putida y P. fluorescens), Rhodopseudomonas (en particular R. palustris), Rhodococcus (en particular la cepa RHA1 del género Rhodococcus).
Un organismo preferido para proporcionar una enzima de EC 4.2.1.17, que actúa sobre 3-hidroxihexanoil-CoA, incluye un organismo seleccionado del grupo de mamíferos y microorganismos. Una enzima adecuada de EC
4.2.1.17 de un mamífero puede ser en particular de un mamífero seleccionado del grupo de Bos taurus, Homo sapiens, Rattus norvegicus, y Sus scrofa. Una enzima adecuada de EC 4.2.1.17 de un microorganismo puede ser en particular de un microorganismo seleccionado del grupo de Aeromonas (en particular A. caviae), Clostridium (en particular C. acetobutylicumi), Gossypium (en particular G. hirsutum), Rhodospirillum (en particular R. rubrumi), y Ralstonia (en particular Ralstonia eutropha).
También se prefieren los microorganismos capaces de realizar la biosíntesis (anaerobia) de ácidos grasos. Tales microorganismos incluyen Clostridia, en particular (C. acetobutylicum y C. kluyveri), Euglenozoa (en particular Euglena gracilis, Megasphera (en particular M. elsdenii), y Saccharomyces (en particular S. cerevisiae).
Una enzima adecuada puede comprender en particular una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ IDs 14, 27, 28, 30-41, 92, o un homólogo de la misma.
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Preparación de (éster o tioéster) de adipato a partir de (éster o tioéster) de 2,3-deshidroadipato ("Reacción 4")
En todas las realizaciones, se prepara (éster o tioéster) de adipato a partir de (éster o tioéster) de 2,3deshidroadipato. Se puede preparar (éster o tioéster) de adipato químicamente a partir de (éster o tioéster) de 2,3deshidroadipato, p.ej. mediante la hidrogenación selectiva del doble enlace C2-C3, o biocatalíticamente.
Normalmente, al 2,3-deshidroadipato se le proporciona un grupo activante, como se indicó anteriormente.
El (éster o tioéster) de adipato se prepara preferiblemente a partir de (éster o tioéster) de 2,3-deshidroadipato mediante el uso de al menos un biocatalizador, que cataliza la hidrogenación del doble enlace carbono-carbono del (éster o tioéster) de 5-carboxi-2-pentenoato.
En un método preferido de la invención, la preparación comprende una reacción biocatalítica en presencia de un biocatalizador capaz de catalizar la reducción de un (éster o tioéster) de cis o trans 2-enoilo hasta un (éster o tioéster) de acilo. El biocatalizador puede usar una diversidad de donantes de electrones, por ejemplo, un donante de electrones seleccionado del grupo de NADH, NADPH, FADH2 y ferredoxina reducida. Los electrones se pueden transferir directamente desde el donante de electrones hasta el biocatalizador, o, de manera alternativa, mediado en particular por la denominada flavoproteína de transferencia de electrones (ETF). Una enzima que tiene tal actividad catalítica se puede denominar, por lo tanto, (éster o tioéster) de 2-enoilo reductasa (ER). Una enzima que tiene tal actividad catalítica hacia el tioéster 2-enoil-CoA se puede denominar, por lo tanto, una 2-enoil-CoA reductasa. Preferiblemente, dicha 2-enoil-CoA reductasa es selectiva hacia el sustrato 2,3-deshidroadipil-CoA.
Una enzima capaz de catalizar la reducción de (éster o tioéster) de 2-enoilo se puede seleccionar en particular del grupo de oxidorreductasas (EC 1.3.1 y EC 1.3.99), preferiblemente del grupo de enoil-CoA reductasas EC 1.3.1.8, EC 1.3.1.38 y EC 1.3.1.44, del grupo de enoil-[proteína portadora de acilo] reductasas EC 1.3.1.9, EC 1.3.1.10 y EC 1.3.1.39, y del grupo de butiril-CoA deshidrogenasa (EC 1.3.99.2), acil-CoA deshidrogenasa (1.3.99.3) y acilo de cadena larga-CoA deshidrogenasa (EC 1.3.99.13). Se ha descrito la actividad de (éster o tioéster) de trans-2-enoilo reductasa, por ejemplo, en el metabolismo de ácidos grasos, la síntesis de policétidos, el metabolismo de butanoato y la biosíntesis mitocondrial de ácidos grasos según la base de datos KEGG.
Una (éster o tioéster) de 2-enoilo reductasa en principio se puede obtener o derivar de cualquier organismo. En particular, el organismo se puede seleccionar de bacterias, arqueas o eucariotas, tal como del grupo de levaduras, hongos, protistas, vegetales y animales (que incluyen seres humanos).
En una realización, el organismo se puede seleccionar de las siguientes bacterias: E. coli, Vibrio, Bacillus (en particular B. subtilis), Clostridia (en particular C. kluyveri, C. acetobutylicum, C. beijerinckii y C. perfringens), Streptomyces (en particular S. coelicolor y S. avermitilis), Pseudomonas (en particular P. putida y P. aeruginosa), Shewanella, Xanthomonas, Xylella, Yersinia, Treponema (en particular T. denticola), Aeromonas (en particular Aeromonas hydrophila), Microscilla (en particular Microscilla marina), Megasphera (en particular Megasphera elsdenii), Deinococcus (en particular Deinococcus radiourans), Yarrowia (en particular Y. lypolytica) y Eubacterium (en particular E. pyruvativorans).
En una realización, una (éster o tioéster) de 2-enoilo reductasa es de un organismo seleccionado del grupo de Euglenozoa, en particular Euglena gracilis.
En una realización, una (éster o tioéster) de 2-enoilo reductasa es de un organismo seleccionado del grupo de Saccharomyces (en particular S. cerevisiae), Kluyveromyces (en particular K. lactis), Schizosaccharomyces (en particular S. pombe), Candida (en particular C. tropicalis).
En una realización, un (éster o tioéster) de 2-enoilo reductasa es de un organismo seleccionado del grupo de Aspergillus (en particular A. niger y A. nidulans), y Penicillium (en particular P. chrysogenum).
En una realización, una (éster o tioéster) de 2-enoilo reductasa es de un organismo seleccionado del grupo de Arabidopsis (en particular A. thaliana).
En una realización, una (éster o tioéster) de 2-enoilo reductasa es de un organismo seleccionado del grupo de Homo sapiens, Rattus norvegicus, Bos Taurus, género Cavia, Caenorhabditis elegans, y Drosophila melanogaster.
Una enzima adecuada puede comprender en particular una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ IDs 42-67, 94, 96, 98, 100, 105, 107, 109, 111, 113, o un homólogo de la misma, en particular una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ IDs 60, 63, 96, 100 o un homólogo de la misma. Las secuencias de nucleótidos ejemplares que codifican una enzima adecuada para catalizar la "reacción 4" se representan mediante la (éster o tioéster) de 2-enoilo reductasa 93, 95, 97, 99, 104, 106, 108, 110 y 112.
En una realización ventajosa, además de la (éster o tioéster) de 2-enoilo reductasa, se usa una ETF, que puede ser beneficiosa para la actividad de dicha reductasa. Tal ETF se puede obtener o derivar de un organismo del cual se puede obtener o derivar una reductasa, como se identificó anteriormente. En particular, se puede obtener o derivar de un organismo del mismo género, más en particular de la misma especie, que la reductasa que se usa. Las ETFs
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específicas comprenden secuencias de aminoácidos representadas mediante SEQ IDs 102, 103, 115, 116. Las SEQ IDs 101 y 114 representan secuencias de nucleótidos que codifican una ETF específica. Normalmente, tales ETFs comprenden dos subunidades (etfA y etfB) codificadas mediante dos genes diferentes. Estos se usan juntos en general para producir la proteína ETF activa. P.ej., se podrían usar las combinaciones siguientes: La SEQ ID 102 con la SEQ ID 103, o la SEQ ID 116 con la SEQ ID 115. La persona experta será capaz de seleccionar otras combinaciones adecuadas de ETFs, conocidas en la técnica por sí mismas.
En una realización de la invención, un biocatalizador que no tiene por sí mismo una actividad deseada o especificidad hacia el sustrato se puede modificar mediante métodos conocidos en la técnica, p.ej. mediante diseño racional o evolución molecular para crear mutantes capaces de catalizar la conversión de (éster o tioéster) de 2,3deshidroadipato en (éster o tioéster) de adipato a una velocidad o selectividad deseable. Se prefieren los biocatalizadores que tienen actividad con derivados de 2-enoil-CoA con una longitud de cadena de 6, en particular los biocatalizadores de C. kluyveri, Bos taurus, Euglena gracilis, Cavia sp., S. cerevisiae, C. tropicalis, Homo sapiens, y E. pyruvativorans.
Preparación de ácido adípico ("Reacción 7")
De acuerdo con la invención, se puede usar un éster o tioéster de adipato para preparar ácido adípico mediante hidrólisis del enlace éster o tioéster. Esto se puede llevar a cabo químicamente, p.ej. mediante hidrólisis química en presencia de un ácido o base, o biocatalíticamente.
En un método preferido de la invención, la preparación comprende una reacción biocatalítica en presencia de un biocatalizador capaz de catalizar la hidrólisis de un (tio)éster de acilo.
Una enzima que tiene tal actividad catalítica, por lo tanto, se puede denominar (tio)éster de acilo hidrolasa. Una enzima que tiene tal actividad catalítica hacia el tioéster de acil-CoA se puede denominar, por lo tanto, acil-CoA hidrolasa. Preferiblemente, dicha acil-CoA hidrolasa es selectiva hacia el sustrato adipil-CoA.
Una enzima capaz de catalizar la hidrólisis de un (tio)éster de acilo se puede seleccionar en particular del grupo de hidrolasas (EC 3.1.2), preferiblemente del grupo de acil-CoA hidrolasa (EC 3.1.2.20), acetil-CoA hidrolasa (EC 3.1.2.1), acilo graso de cadena larga-CoA hidrolasa (EC 3.1.2.2), succinil-CoA hidrolasa (EC 3.1.2.3) y acil-[proteína portadora de acilo]-hidrolasa (EC 3.1.2.14).
El biocatalizador puede comprender una enzima que se origina de cualquier organismo, que incluye arqueas, bacterias o eucariotas.
En particular, el biocatalizador puede comprender una enzima de una bacteria seleccionada del grupo de E. coli, Brucella, (en particular Brucella melitensis), Agrobacterium (en particular A. tumefaciens), Xanthomonas, Sinorhizobium (en particular Sinorhizobium meliloti), Mesorhizobium (en particular Mesorhizobium loti), Vibrio, Streptomyces (en particular S. coelicolor y S. avermitilis), Rhodopseudomonas (en particular Rhodopseudomonas palustris), Xylella, Yersinia, Pseudomonas (en particular P. putida y P. aeruginosa), Shewanella, Shigella, Salmonella, Corynebacterium, Mycobacterium, Hyphomonas (en particular Hyphomonas neptunium) y Propionibacterium.
Se puede hallar un biocatalizador adecuado en particular en una levadura seleccionada del grupo de Saccharomyces (en particular Saccharomyces cerevisiae) y Kluyveromyces (en particular K. lactis).
Se puede hallar un biocatalizador adecuado en particular en un hongo seleccionado del grupo de Aspergillus (en particular A. niger, A. fumigatus y A. nidulans) y Penicillium (en particular P. chrysogenum).
En una realización adicional, el organismo se selecciona del grupo de Arabidopsis (en particular A. thaliana), Muridae (en particular Rattus norvegicus, Mus musculus), Bovidae (en particular Bos taurus, Ovis aries), Homo sapiens, y Caenorhabditis (en particular Caenorhabditis elegans).
En una realización de la invención, un biocatalizador que no tiene por sí mismo la actividad deseada o especificidad hacia el sustrato se puede modificar mediante métodos conocidos en la técnica, p.ej. mediante diseño racional o evolución molecular, para crear mutantes capaces de convertir de manera eficaz un éster o tioéster de adipato en adipato. Se prefiere un biocatalizador que tiene una actividad inicial con un derivado de acil-CoA de un ácido C4-C8, preferiblemente que incluye ácidos dicarboxílicos. Por ejemplo, se puede crear un mutante basándose en una acilCoA-tioesterasa de Mus musculus (p.ej. tal como se proporciona en SEQ ID 73).
En una realización específica de la invención, la preparación comprende una reacción biocatalítica en presencia de un biocatalizador capaz de catalizar la transferencia de un grupo activante, en particular un éster o tio-éster, más en particular CoA.
Una enzima que tiene tal actividad catalítica, por lo tanto, se puede denominar CoA transferasa. Preferiblemente, dicha CoA transferasa es selectiva hacia un ácido dicarboxílico-CoA como sustrato donante de CoA. Más preferiblemente, dicho ácido dicarboxílico-CoA es adipil-CoA. Preferiblemente, dicha CoA transferasa es selectiva
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Salmonella (en particular S. typhimurium). El organismo también se puede seleccionar de eucariotas, más en particular del grupo de Giardia (en particular G. lamblia), Entamoeba (en particular E. Histolytica), Mastigamoeba balamuthi, Chlamydomonas reinhardtii, Polytomella, Piromyces, Cryptosporidium, y Spironucleus barkhanus.
Una deshidrogenasa adecuada puede comprender en particular una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ IDs 74-81, 139-148, o un homólogo de la misma.
En una realización de la invención, un biocatalizador que no tiene por sí mismo la actividad deseada o especificidad hacia el sustrato se puede modificar mediante métodos conocidos en la técnica, p.ej. mediante diseño racional o evolución molecular, para crear mutantes capaces de convertir un éster o tioéster de adipato en 5-FVA. Se prefieren los biocatalizadores que tienen actividad acilante de aldehído deshidrogenasa con derivados de acil-CoA con una longitud de cadena de 4-8, que incluyen, pero sin limitación, biocatalizadores tales como succinato semialdehído deshidrogenasa (acetilante) de C. kluyveri (SEQ ID 74) o P. gingivalis (SEQ ID 75) y butilaldehído deshidrogenasa (acetilante) de C. acetobutilicum (SEQ ID 80, 81) o Propionibacterium freudenreichii (SEQ ID 79).
Preparación de 5-FVA a partir de ácido adípico ("Reacción 8")
De acuerdo con la invención, se puede usar ácido adípico para preparar 5-FVA, mediante la reducción de uno de los grupos de ácido carboxílico. Esto se puede llevar a cabo químicamente, p.ej. mediante reducción química selectiva, que incluye opcionalmente la protección de un grupo de ácido carboxílico, o biocatalíticamente. En un método preferido de la invención, la preparación comprende una reacción biocatalítica en presencia de un biocatalizador capaz de catalizar la reducción un ácido carboxílico. El biocatalizador puede usar NADH o NADPH como donante de electrones.
Una enzima que tiene tal actividad catalítica, por lo tanto, se puede denominar aldehído deshidrogenasa. Preferiblemente, dicha aldehído deshidrogenasa es selectiva hacia el sustrato de adipato.
Una enzima capaz de catalizar la reducción de un ácido carboxílico se puede seleccionar en particular del grupo de oxidorreductasas (EC 1.2.1), preferiblemente del grupo de aldehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.3, EC 1.2.1.4 y EC 1.2.1.5), malonato-semialdehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.15), succinato-semialdehído deshidrogenasa (EC
1.2.1.16 y EC 1.2.1.24); glutarato-semialdehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.20), aminoadipato semialdehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.31), adipato semialdehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.63), que también se puede denominar 6-oxohexanoato deshidrogenasa. La actividad de adipato semialdehído deshidrogenasa se ha descrito, por ejemplo, en la ruta de degradación de caprolactama en la base de datos KEGG. En particular, se puede usar una 6-oxohexanoato deshidrogenasa. Los ejemplos de 6-oxohexanoato deshidrogenasas son enzimas que comprenden una secuencia tal como se representa mediante SEQ ID 127, 128 o un homólogo de las mismas.
Una aldehído deshidrogenasa se puede obtener o derivar en principio de cualquier organismo. El organismo puede ser procariótico o eucariótico. En particular, el organismo se puede seleccionar de bacterias, arqueas, levaduras, hongos, protistas, vegetales y animales (que incluyen seres humanos).
En una realización, la bacteria se selecciona del grupo de Acinetobacter (en particular la cepa NCIMB9871 del género Acinetobacter), Ralstonia, Bordetella, Burkholderia, Methylobacterium, Xanthobacter, Sinorhizobium, Rhizobium, Nitrobacter, Brucella (en particular B. melitensis), Pseudomonas, Agrobacterium (en particular Agrobacterium tumefaciens), Bacillus, Listeria, Alcaligenes, Corynebacterium, y Flavobacterium.
En una realización, el organismo se selecciona del grupo de levaduras y hongos, en particular del grupo de Aspergillus (en particular A. niger y A. nidulans) y Penicillium (en particular P. chrysogenum)
En una realización, el organismo es un vegetal, en particular Arabidopsis, más en particular A. thaliana.
Preparación de 6-ACA ("Reacción 6")
En una realización de la invención, se usa 5-FVA para preparar 6-ACA.
En una realización, se obtiene 6-ACA mediante hidrogenación sobre PtO2 de ácido 6-oximocaproico, preparado mediante la reacción de 5-FVA e hidroxilamina. (véase, p.ej., F.O. Ayorinde, E.Y. Nana, P.D. Nicely, A.S. Woods,
E.O. Price, C.P. Nwaonicha J. Am. Oil Chem. Soc. 1997, 74, 531-538 para la síntesis del ácido 12aminododecanoico homólogo).
6-ACA se puede preparar con un rendimiento elevado mediante la aminación reductora de 5-FVA con amoniaco sobre un catalizador de hidrogenación, por ejemplo Ni sobre un soporte de SiO2/Al2O3, como se describió para el ácido 9-aminononanoico (ácido 9-aminopelargónico) y ácido 12-aminododecanoico (ácido 12-aminoláurico) en los documentos EP-A 628 535 o DE 4 322 065.
En una realización adicional, se prepara 6-ACA biocatalíticamente. En un método preferido, la preparación de 6-ACA a partir de 5-FVA comprende una reacción enzimática en presencia de una enzima capaz de catalizar una reacción de transaminación en presencia de un donante de amino, seleccionado del grupo de aminotransferasas (E.C. 2.6.1).
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En general, una aminotransferasa adecuada tiene actividad de 6-ACA 6-aminotransferasa, capaz de catalizar la conversión de 5-FVA en 6-ACA.
La aminotransferasa se puede seleccionar en particular de las aminotransferasas de un mamífero; Mercurialis, en particular Mercurialis perennis, más en particular brotes de Mercurialis perennis; Asplenium, más en particular Asplenium unilaterale o Asplenium septentrionale; Ceratonia, más en particular Ceratonia siliqua; Rhodobacter, en particular Rhodobacter sphaeroides, Staphylococcus, en particular Staphylococcus aureus; Vibrio, en particular Vibrio fluvialis; Pseudomonas, en particular Pseudomonas aeruginosa; Rhodopseusomonas; Bacillus, en particular Bacillus weihenstephanensis y Bacillus subtilis; Legionella; Nitrosomas; Neisseria; o levaduras, en particular Saccharomyces cerevisiae.
En caso de que la enzima sea de un mamífero, se puede originar en particular de riñón de mamífero, de hígado de mamífero, de corazón de mamífero o de cerebro de mamífero. Por ejemplo, una enzima adecuada se puede seleccionar del grupo de β-aminoisobutirato:α-cetoglutarato aminotransferasa de riñón de mamífero, en particular βaminoisobutirato:α-cetoglutarato aminotransferasa de riñón de cerdo; β-alanina aminotransferasa de hígado de mamífero, en particular β-alanina aminotransferasa de hígado de conejo; aspartato aminotransferasa de corazón de mamífero; en particular, aspartato aminotransferasa de corazón de cerdo; 4-amino-butirato aminotransferasa de hígado de mamífero, en particular 4-amino-butirato aminotransferasa de hígado de cerdo; 4-amino-butirato aminotransferasa de cerebro de mamífero, en particular 4-aminobutirato aminotransferasa de cerebro de ser humano, cerdo, o rata; α-cetoadipato-glutamato aminotransferasa de Neurospora, en particular αcetoadipato:glutamato aminotransferasa de Neurospora crassa; 4-amino-butirato aminotransferasa de E. coli, o αaminoadipato aminotransferasa de Thermus, en particular α-aminoadipato aminotransferasa de Thermus thermophilus, y 5-aminovalerato aminotransferasa de Clostridium, en particular de Clostridium aminovalericum. Se puede proporcionar una 2-aminoadipato aminotransferasa adecuada, p.ej., de Pyrobaculum islandicum.
En una realización específica, se usa una aminotransferasa que comprende una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID 82, SEQ ID 83, SEQ ID 84, SEQ ID 134, SEQ ID 136, SEQ 138, o un homólogo de cualquiera de estas secuencias. Las SEQ IDs 86 (tipo natural) y 88 (optimización de codones) representan la secuencia que codifica una enzima representada mediante la SEQ ID 82 (=87). Las SEQ IDs 89 (tipo natural) y 91 (optimización de codones) representan la secuencia que codifica una enzima representada mediante la SEQ ID 83 (=90). Las SEQ ID 133, SEQ ID 135, SEQ 137 representan secuencias codificantes para SEQ ID 134, SEQ ID 136, SEQ 138, respectivamente.
En particular, el donante de amino se puede seleccionar del grupo de amoniaco, iones amonio, aminas y aminoácidos. Las aminas adecuadas son aminas primarias y aminas secundarias. El aminoácido puede tener una configuración D o L. Los ejemplos de donantes de amino son alanina, glutamato, isopropilamina, 2-aminobutano, 2aminoheptano, fenilmetanamina, 1-fenil-1-aminoetano, glutamina, tirosina, fenilalanina, aspartato, βaminoisobutirato, β-alanina, 4-aminobutirato, y α-aminoadipato.
En una realización preferida adicional, el método para preparar 6-ACA comprende una reacción biocatalítica en presencia de una enzima capaz de catalizar una reacción de aminación reductora en presencia de una fuente de amoniaco, seleccionada del grupo de oxidorreductasas que actúan sobre el grupo CH-NH2 de los donantes (EC 1.4), en particular del grupo de aminoácido deshidrogenasas (E.C. 1.4.1). En general, una aminoácido deshidrogenasa adecuada tiene actividad de ácido 6-aminocaproico 6-deshidrogenasa, y cataliza la conversión de 5-FVA en 6-ACA,
o tiene actividad de α-aminopimelato 2-deshidrogenasa, y cataliza la conversión de AKP en AAP. En particular, una aminoácido deshidrogenasa adecuada se selecciona del grupo de diaminopimelato deshidrogenasas (EC 1.4.1.16), lisina 6-deshidrogenasas (EC 1.4.1.18), glutamato deshidrogenasas (EC 1.4.1.3; EC 1.4.1.4), y leucina deshidrogenasas (EC 1.4.1.9).
En una realización, una aminoácido deshidrogenasa se puede seleccionar de aminoácido deshidrogenasas clasificadas como glutamato deshidrogenasas que actúan con NAD o NADP como aceptores (EC 1.4.1.3), glutamato deshidrogenasas que actúan con NADP como aceptores (EC 1.4.1.4), leucina deshidrogenasas (EC 1.4.1.9), diaminopimelato deshidrogenasas (EC 1.4.1.16), y lisina 6-deshidrogenasas (EC 1.4.1.18).
Una aminoácido deshidrogenasa se puede originar en particular de un organismo seleccionado del grupo de Corynebacterium, en particular Corynebacterium glutamicum; Proteus, en particular Proteus vulgaris; Agrobacterium, en particular Agrobacterium tumefaciens; Geobacillus, en particular Geobacillus stearothermophilus; Acinetobacter, en particular la cepa ADP1 del género Acinetobacter; Ralstonia, en particular Ralstonia solanacearum; Salmonella, en particular Salmonella typhimurium; Saccharomyces, en particular Saccharomyces cerevisiae; Brevibacterium, en particular Brevibacterium flavum; y Bacillus, en particular Bacillus sphaericus, Bacillus cereus o Bacillus subtilis. Por ejemplo, una aminoácido deshidrogenasa adecuada se puede seleccionar de diaminopimelato deshidrogenasas de Bacillus, en particular Bacillus sphaericus; diaminopimelato deshidrogenasas del género Brevibacterium; diaminopimelato deshidrogenasas de Corynebacterium, en particular diaminopimelato deshidrogenasas de Corynebacterium glutamicum; diaminopimelato deshidrogenasas de Proteus, en particular diaminopimelato deshidrogenasa de Proteus vulgaris; lisina 6-deshidrogenasas de Agrobacterium, en particular Agrobacterium tumefaciens, lisina 6-deshidrogenasas de Geobacillus, en particular de Geobacillus stearothermophilus; glutamato deshidrogenasas que actúan con NADH o NADPH como cofactor (EC 1.4.1.3) de Acinetobacter, en particular
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glutamato deshidrogenasas de la cepa ADP1 del género Acinetobacter; glutamato deshidrogenasas (EC 1.4.1.3) de Ralstonia, en particular glutamato deshidrogenasas de Ralstonia solanacearum; glutamato deshidrogenasas que actúan con NADPH como cofactor (EC 1.4.1.4) de Salmonella, en particular glutamato deshidrogenasas de Salmonella typhimurium; glutamato deshidrogenasas (EC 1.4.1.4) de Saccharomyces, en particular glutamato deshidrogenasas de Saccharomyces cerevisiae; glutamato deshidrogenasas (EC 1.4.1.4) de Brevibacterium, en particular glutamato deshidrogenasas de Brevibacterium flavum; y leucina deshidrogenasas de Bacillus, en particular leucina deshidrogenasas de Bacillus cereus o Bacillus subtilis.
En una realización, el 6-ACA preparado en un método de la invención se usa para preparar caprolactama. Tal método comprende ciclar el ácido 6-aminocaproico, opcionalmente en presencia de un biocatalizador.
Las condiciones de reacción para cualquier etapa biocatalítica en el contexto de la presente invención se pueden elegir dependiendo de las condiciones conocidas para el biocatalizador, en particular la enzima, la información descrita en la presente memoria y opcionalmente cierta experimentación rutinaria.
En principio, el pH del medio de reacción usado se puede elegir dentro de límites amplios, con tal de que el biocatalizador sea activo en las condiciones de pH. Se pueden usar condiciones alcalinas, neutras o ácidas, dependiendo del biocatalizador y otros factores. En caso de que el método incluya el uso de un microorganismo, p.ej. para expresar una enzima que cataliza un método de la invención, el pH se selecciona de forma que el microorganismo sea capaz de llevar a cabo su función o funciones deseadas. El pH se puede elegir en particular dentro del intervalo de cuatro unidades de pH por debajo del pH neutro y dos unidades de pH por encima del pH neutro, es decir, entre pH 3 y pH 9 en caso de un sistema básicamente acuoso a 25 °C. Un sistema se considera acuoso si el agua es el único disolvente o el disolvente predominante (> 50% en peso, en particular > 90% en peso, basado en el líquido total), en el que, p.ej., se puede disolver una cantidad menor (< 50% en peso, en particular < 10% en peso, basada en el líquido total) de alcohol u otro disolvente (p.ej. como fuente de carbono) a tal concentración que los microorganismos que pueden estar presentes sigan siendo activos. En particular, en el caso de usar una levadura y/o un hongo, se pueden preferir condiciones ácidas, en particular el pH puede estar en el intervalo de pH 3 a pH 8, basado en un sistema básicamente acuoso a 25 °C. Si se desea, el pH se puede ajustar mediante el uso de un ácido y/o una base, o tamponarlo con una combinación adecuada de un ácido y una base.
En principio, las condiciones de incubación se pueden elegir dentro de límites amplios, con tal de que el biocatalizador muestre suficiente actividad y/o crecimiento. Esto incluye condiciones aerobias, microaerobias, con limitación de oxígeno y anaerobias.
Las condiciones anaerobias se definen en la presente memoria como condiciones sin oxígeno, o en las que el biocatalizador sustancialmente no consume oxígeno, en particular un microorganismo, y normalmente corresponden a un consumo de oxígeno menor de 5 mmol/l.h, en particular a un consumo de oxígeno menor de 2,5 mmol/l.h, o menor de 1 mmol/l.h.
Las condiciones aerobias son condiciones en las que hay disuelto en el medio un nivel suficiente de oxígeno para el crecimiento ilimitado, capaz de soportar una velocidad de consumo de oxígeno de al menos 10 mmol/l.h, más preferiblemente más de 20 mmol/l.h, aún más preferiblemente más de 50 mmol/l.h, y lo más preferiblemente más de 100 mmol/l.h.
Las condiciones con limitación de oxígeno se definen como condiciones en las que el consumo de oxígeno se limita mediante la transferencia de oxígeno del gas al líquido. El límite inferior para las condiciones con limitación de oxígeno se determina mediante el límite superior para las condiciones anaerobias, es decir, normalmente al menos 1 mmol/l.h, y en particular al menos 2,5 mmol/l.h, o al menos 5 mmol/l.h. El límite superior para las condiciones con limitación de oxígeno se determina mediante el límite inferior para las condiciones aerobias, es decir, menor de 100 mmol/l.h, menor de 50 mmol/l.h, menor de 20 mmol/l.h, o menor de 10 mmol/l.h.
Si las condiciones son aerobias, anaerobias o con limitación de oxígeno depende de las condiciones en las que se lleva a cabo el método, en particular por la cantidad y composición del flujo de gas de entrada, las propiedades reales de mezcla/transferencia de masa del equipo usado, el tipo de microorganismo usado y la densidad del microorganismo.
En principio, la temperatura usada no es crítica, con tal de que el biocatalizador, en particular la enzima, muestre una actividad sustancial. En general, la temperatura puede ser al menos 0 °C, en particular al menos 15 °C, más en particular al menos 20 °C. La temperatura máxima deseada depende del biocatalizador. En general, dicha temperatura máxima se conoce en la técnica, p.ej. se indica en una ficha técnica del producto en caso de un biocatalizador disponible comercialmente, o se puede determinar de manera rutinaria basándose en el conocimiento general habitual y la información descrita en la presente memoria. La temperatura es normalmente 90 °C o menos, preferiblemente 70 °C o menos, en particular 50 °C o menos, más en particular 40 °C o menos.
Además, los disolventes, reactivos adicionales y agentes auxiliares adicionales, p.ej. cofactores (por ejemplo cofactor FAD/FADH y/o NAD/NADH) se pueden elegir basándose en principios de reacción conocidos, para realizar
o acelerar una reacción específica, y/o se pueden tomar medidas para desplazar el equilibrio al lado deseado. En particular, si se lleva a cabo una reacción biocatalítica fuera de un organismo hospedador, se puede usar un medio
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de reacción que comprende un disolvente orgánico a una concentración elevada (p.ej. más del 50%, o más del 90% en peso), en caso de que se use una enzima que conserva una actividad suficiente en tal medio.
El (éster o tioéster) de succinato y (éster o tioéster) de acetato usados en un método de la invención se pueden obtener en principio de cualquier manera.
El succinato, p.ej., se forma de manera natural como intermedio del ciclo del ácido cítrico (ciclo de Krebs), o como producto final en el metabolismo celular. Así, se puede obtener de una fuente de carbono renovable mediante el uso de un biocatalizador adecuado. Los biocatalizadores, en particular microorganismos, se pueden usar para producir succinato a partir de una fuente adecuada de carbono. El microorganismo puede ser un procariota o un eucariota. El microorganismo puede ser recombinante o de tipo natural.
En un microorganismo recombinante, se puede alterar el metabolismo para incrementar el rendimiento y la productividad de succinato con una fuente adecuada de carbono. Se han descrito métodos para incrementar la producción de succinato en procariotas en Song y Lee, Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39: 352-361. También se puede producir succinato en un eucariota. Además y de manera alternativa, se puede aplicar una evolución adaptativa, tal como se describe en la solicitud de EE.UU. 2007/111294.
Se puede obtener éster o tioéster de succinato a partir de succinato de cualquier manera. En particular, se puede obtener éster o tioéster de succinato a partir de succinato mediante el uso de un biocatalizador. En particular, se puede obtener succinil-CoA a partir de succinato mediante el uso de un biocatalizador que comprende una enzima seleccionada del grupo de ácido-tiol ligasa (EC 6.2.1), preferiblemente del grupo de succinil-CoA sintasa (EC 6.2.1.4 y EC 6.2.1.5). Además o de manera alternativa, se puede obtener succinil-CoA a partir de succinato mediante el uso de un biocatalizador que comprende una enzima seleccionada del grupo de CoA transferasas (EC 2.8.3) tal como se especificó para la reacción 7.
También se puede obtener éster o tioéster de succinato a partir de moléculas distintas de succinato de cualquier manera. En particular, se puede obtener succinil-CoA a partir de 2-oxoglutarato mediante el uso de un biocatalizador que comprende un complejo de 2-oxoglutarato deshidrogenasa. El complejo de 2-oxoglutarato deshidrogenasa es un complejo multienzimático que participa en el ciclo TCA, conocido para los expertos en la técnica. Además o de manera alternativa, se puede obtener succinil-CoA a partir de 2-oxoglutarato mediante el uso de un biocatalizador que comprende una 2-oxoglutarato: ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.3).
El acetato es un intermedio natural o producto final en el metabolismo celular. Así, se puede obtener de una fuente de carbono renovable mediante el uso de un biocatalizador adecuado. Los biocatalizadores, en particular microorganismos, se pueden usar para producir succinato a partir de una fuente adecuada de carbono. El microorganismo puede ser un procariota o un eucariota. El microorganismo puede ser recombinante o de tipo natural.
Se puede obtener éster o tioéster de acetato a partir de acetato de cualquier manera. En particular, se puede obtener acetil-CoA a partir de acetato mediante el uso de un biocatalizador que comprende una enzima seleccionada del grupo de ácido-tiol ligasa (EC 6.2.1), preferiblemente acetil-CoA sintasa (EC 6.2.1.1 y EC 6.2.1.13). Además o de manera alternativa, se puede obtener acetil-CoA a partir de acetato mediante el uso de un biocatalizador que comprende una enzima seleccionada del grupo de CoA transferasas (EC 2.8.3) tal como se especificó para la reacción 7.
También se puede obtener éster o tioéster de acetato a partir de moléculas distintas de acetato de cualquier manera. En particular, se puede obtener acetil-CoA a partir de piruvato mediante el uso de un biocatalizador que comprende una enzima seleccionada del grupo de complejo de piruvato deshidrogenasa, piruvato deshidrogenasa (NADP+) (EC 1.2.1.51), piruvato formiato liasa (EC 2.3.1.54) o un biocatalizador o enzima que convierte de manera eficaz piruvato en acetil-CoA. El complejo de piruvato deshidrogenasa es un complejo multienzimático que convierte piruvato en acetil-CoA, conocido para los expertos en la técnica.
También se puede obtener acetil-CoA a partir de acetaldehído mediante el uso de un biocatalizador que comprende una enzima seleccionada del grupo de oxidorreductasas (EC 1:2.1), preferiblemente del grupo de aldehído deshidrogenasas (acetilante) (EC 1.2.1.10), acilo graso-CoA reductasas (EC 1.2.1.42), butanal deshidrogenasas (EC 1.2.1.57) y succinato semialdehído deshidrogenasas (acetilante) (como se describe en Sohling et al. 1996. J Bacteriol. 178: 871-880).
Cuando el biocatalizador es un eucariota, el suministro de acetil-CoA, preferiblemente en el compartimento citosólico de la célula hospedadora, se puede incrementar sobreexpresando genes homólogos y/o heterólogos que codifican enzimas que catalizan la conversión de una molécula precursora en acetil-CoA. La molécula precursora puede ser, por ejemplo, acetato, como se describe en Shiba et al., Metabolic Engineering, 2007, 9: 160-8.
En un método ventajoso de la invención, en particular un método para preparar 6-ACA, ácido adípico o un compuesto intermedio para 6-ACA o ácido adípico, se usa una biotransformación con células completas del sustrato para 6-ACA, ácido adípico o un intermedio de los mismos, que comprende el uso de un microorganismo en el que se producen una o más enzimas que catalizan cualquiera de las reacciones anteriores, y una fuente de carbono para el
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