TWI787575B

TWI787575B - 由α-酮庚二酸製備６-胺己酸之技術

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Publication number: TWI787575B
Application number: TW109101569A
Authority: TW
Inventors: 法蘭肯佩桌妮娜Ｃ雷瑪克斯; 馬汀休曼; 艾克索Ｃ崔夫瑟; 史蒂芬ＭＡ迪維爾德曼
Original assignee: 美商吉諾瑪蒂卡股份有限公司
Priority date: 2008-03-11
Filing date: 2009-03-11
Publication date: 2022-12-21
Also published as: US20140134681A1; WO2009113855A2; BRPI0908941A2; CN104178532B; US20110171699A1; EA201001445A1; TW200951103A; TW201613852A; MY156225A; TWI627153B; TWI701230B; US8673599B2; EP3666899A2; US20180100172A1; AU2009224089A1; US9663805B2; TW202041673A; TW202306945A; CN102026960B; EA019163B1

Abstract

本發明係關於一種使用生物催化劑製備6-胺己酸(後文也稱作為「6-ACA」)之方法。本發明進一步係關於一種經由環化此種6-ACA製備ε-己內醯胺(後文稱作為「己內醯胺」)之方法。本發明進一步係關於可用於6-ACA或己內醯胺之製備之宿主細胞、微生物、或多核苷酸。

Description

由α-酮庚二酸製備6-胺己酸之技術

發明領域

本發明係關於一種製備6-胺己酸(後文也稱作為「6-ACA」)之方法。本發明進一步係關於一種由6-ACA製備ε-己內醯胺(後文稱作為「己內醯胺」)之方法。本發明進一步係關於可用於6-ACA或己內醯胺之製備之宿主細胞。

發明背景

己內醯胺為可用於聚醯胺例如尼龍-6或尼龍-6,12(己內醯胺與月桂內醯胺之共聚物)之製造之內醯胺。技藝界已知多種由散裝化學品製備己內醯胺之方式，包括由環己酮、甲苯、酚、環己醇、苯或環己烷製備己內醯胺之方式。此等中間化合物通常係得自礦油。有鑑於對使用更加綠色的永續性技術製備材料之需求的成長，期望提供一種方法其中己內醯胺係由一種得自生物可再生來源之中間化合物製備，或己內醯胺至少係得自可使用生物化學方法而轉化成為己內醯胺之中間化合物。進一步期望提供一種比較習知利用得自石化來源的散裝化學品之化學方法需要更少能源之方法。

已知由6-ACA製備己內醯胺，例如如US-A 6,194,572所述。如揭示於WO 2005/068643，經由於具有α,β-烯酸還原酶活性之酶存在下，經由轉化6-胺己-2-烯酸(6-AHEA)可藉生物化學方式製備6-ACA。6-AHEA例如可以生物化學方式或藉純化學合成法而由離胺酸製備。雖然藉WO 2005/068643所揭示之方法透過6-AHEA之還原製備6-ACA為可行，但發明人發現於還原反應條件下，6-AHEA可能自發地且實質上不可逆地環化而形成非期望的副產物，值得注意者為β-高脯胺酸。此種環化作用可能成為6-ACA製造上的瓶頸，且可能導致產率上的顯著損耗。

發明概要

本發明之目的係提供一種用於製備6-ACA或己內醯胺之新穎方法，該方法可用於聚醯胺或6-ACA或己內醯胺製備上的中間物之製備，而可用作為已知方法之替代方法。

又一目的係提供一種可克服前述一項或多項缺點之新穎方法。

根據本發明可解決之一項或多項其它目的由後文說明獲得。

今日已知由特定起始物料製備6-ACA，換言之，發現可製備6-胺己酸(6-ACA)，其中6-胺己酸係由2-酮庚二酸也稱作為α-酮庚二酸(AKP)製備。特定言之，該方法可於兩個或多個反應步驟進行。例如提供一種方法，其中AKP 首先轉成5-甲醯戊酸酯(5-甲醯戊酸，5-FVA)，該5-FVA轉成6-ACA。進一步提供一種方法，其中AKP首先轉成α-胺庚二酸(AAP)。隨後AAP轉成6-ACA。

發明人瞭解原則上可以全然化學(換言之未使用生物催化劑)方式而由AKP製備6-ACA。進行個別反應步驟之適當化學方式之實例列舉如下。但發明人也瞭解可由AKP以生物化學方式製備6-ACA。

如此，本發明特別係關於一種用於製備6-ACA之方法，其中6-ACA係使用至少一種生物催化劑而由AKP製備。

本發明進一步係關於一種方法，其中6-ACA係使用生物催化劑而由5-甲醯戊酸酯(5-甲醯戊酸，5-FVA)製備。如前文指示，5-FVA可得自AKP。

於一個實施例中，於本發明方法所製備之6-ACA可用於製備己內醯胺。此種方法包含視需要可於生物催化劑存在下，環化6-胺己酸。

較佳實施例之詳細說明

於本文中述及羧酸或羧酸酯例如6-ACA、2-胺庚二酸(α-胺庚二酸，後文也縮寫為「AAP」)、其它胺基酸、5-FVA或AKP時，此等術語表示包括經質子化之羧酸基(亦即中性基)、其相對應之羧酸根(其軛合鹼)及其鹽。當於本文述及胺基酸例如6-ACA時，本術語表示包括呈其兩性離子形式之胺基酸(其中胺基係呈質子化形式及羧酸基係呈去質子化形式)、其中胺基經質子化及羧酸呈其中性形式之胺基酸、及其中胺基係呈其中性形式及羧酸基係呈去質子化形式之胺基酸及其鹽類。

根據本發明，當形成6-ACA及視需要可形成己內醯胺時並未發現任何導致產率損耗之中間產物的非期望的環化。

預期本發明方法允許比較WO 2005/68643所述方法獲得可相媲美的或甚至更佳的產率。預期本發明方法用於利用有機體，特別考慮有機體的生長及維持方法時特別有利。

進一步預期於本發明之實施例中，可改良本發明方法中之6-ACA的生產力(所形成之克/升．小時)。

如此處使用「或」一詞除非另行規定否則定義為「及/或」。

如此處使用「一」一詞除非另行規定否則定義為「至少一個」。

當以單數形述及一個名詞(例如一化合物、一添加劑等)時表示含括複數形。

當述及存在有立體異構物之化合物時，該化合物可為此種立體異構物中之任一者或其組合物。如此，當述及例如存在有對映異構物之胺基酸時，該胺基酸可為L-對映異構物、D-對映異構物或其組合物。於存在有天然立體異構物之情況下，該化合物較佳為天然立體異構物。

當述及一種酶而括出酶類別(EC)時，該酶類別為酶係基於或可基於由「國際生物化學及分子生物學協會命名委員會」(NC-IUBMB)所提供之「酶命名」歸類的類別，該命名可參考http：//www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/。意圖含括未曾(尚未)歸類於特定類別但可以此種方式歸類之其它適當酶。

「同系物」一詞用於此處特別係指具有至少30%，較佳至少40%，更佳至少60%，更佳至少65%，更佳至少70%，更佳至少75%，更佳至少80%，特佳至少85%，更特佳至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%序列相同度之多核苷酸或多胜肽。「同系物」一詞也表示包括由於遺傳密碼的簡併性而與另一種核苷酸序列不同但編碼相同多核苷酸序列之核苷酸序列(多核苷酸序列)。

序列相同度或類似度於此處定義為經由比較二序列判定兩個或多個多胜肽序列或兩個或多個核苷酸序列間之關係。通常序列相同度或類似度係比較序列的全長，但也可只比較彼此對齊校準的序列部分。業界中，「相同度」或「類似度」也表示由此等序列間之匹配情況判定的多胜肽序列或核苷酸序列(視情況而定)間之序列相關程度。較佳相同度或類似度之測定方法係設計來獲得所試驗之序列間的最大匹配。於本發明之內文中，特定二序列間之相同度與類似度之較佳電腦程式方法包括BLASTP及BLASTN (Altschul,S.F.等人，J.Mol.Biol.1990,215,403-410，公開得自NCBI及其它來源(BLAST手冊，Altschul,S.等人，NCBI NLM NIH馬里蘭州貝色拉，20894))。較佳使用BLASTP進行多胜肽序列比較之參數為間隙開口10.0，間隙延長0.5，Blosum 62矩陣。使用BLASTN進行核酸序列比較之較佳參數為間隙開口10.0，間隙延長0.5，DNA全矩陣(DNA相同度矩陣)。

根據本發明，使用生物催化劑，換言之該方法之一個反應步驟係藉得自生物來源例如有機體或衍生自有機體之生物分子所衍生之生物材料或生物部分所催化。生物催化劑特別包含一種或多種酶。生物催化劑可以任一種形式使用。於一個實施例中，使用例如呈溶液、乳液、分散液、凍乾細胞(之懸浮液)、溶解產物、或制動於撐體上而分離自天然環境(分離自已經製造該酶之有機體)之一種或多種酶。於一個實施例中，一種或多種酶形成活有機體(例如活全細胞)之一部分。

酶可於細胞內部進行催化功能。也可能酶可分泌入細胞存在於其中之該介質中。

活細胞可為生長中的細胞、休息靜止細胞或休眠細胞(例如孢子或稱芽胞)或處於穩定期的細胞。也可使用已通透化細胞(換言之，變成可通透酶的基質或酶的基質前驅物)之酶形成部分。

本發明方法所使用之生物催化劑主要為任一種有機體或可得自或衍生自任何有機體。有機體可為真核生物或原核生物。特別有機體可選自於動物(包括人類)、植物、細菌、古菌、酵母及真菌。

於一個實施例中，生物催化劑係源自於動物，特別源自於動物之一部分例如肝、胰、腦、腎、心或其它器官。動物特別可選自於由哺乳動物所組成的組群，更特別係選自於由兔科(Leporidae)、鼠科(Muridae)、豬科(Suidae)及牛科(Bovidae)所組成之組群。

適當植物特別包括選自於由鐵角蕨屬(Asplenium)；葫蘆科(Cucurbitaceae)特別為南瓜屬(Cucurbita)例如Cucurbita moschata(南瓜)、或甜瓜屬(Cucumis)；山靛屬(Mercurialis)例如多年生山靛(Mercurialis perennis)；大風子屬(Hydnocarpus)；及佳樂樹屬(Ceratonia)所組成之組群之植物。

適當細菌特別係選自於由弧菌屬(Vibrio)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、克雷白氏菌屬(Klebsiella)、乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、梭菌屬(Clostridium)、埃希氏菌屬(Escherichia)、棲熱菌屬(Thermus)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、發酵單胞菌屬(Zymomonas)、變形桿菌屬(Proteus)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、地桿菌屬(Geobacillus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、拉斯東氏菌屬(Ralstonia)、紅細菌屬(Rhodobacter)、副球菌屬 (Paracoccus)、新鞘菌屬(Novosphingobium)、亞硝酸菌屬(Nitrosomonas)、退伍軍人症桿菌屬(Legionella)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、迪諾氏球菌屬(Deinococcus)及沙門氏菌屬(Salmonella)所組成之組群。

適當古菌特別可選自於由古球菌屬(Archaeoglobus)、需氧古菌屬(Aeropyrum)、親鹽桿菌屬(Halobacterium)、甲烷八聯球菌屬(Methanosarcina)、甲烷球菌屬(Methanococcus)、熱原體屬(Thermoplasma)、熱桿菌屬(Pyrobaculum)、甲烷暖球菌屬(Methanocaldococcus)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)、甲烷球菌屬(Methanosphaera)、甲烷古菌屬(Methanopyrus)及甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)所組成之組群。

適當真菌特別係選自於由根黴屬(Rhizopus)、紅黴屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)及麴菌屬(Aspergillus)所組成之組群。

適當酵母特別係選自於由假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)及酵母屬(Saccharomyces)所組成之組群。

熟諳技藝人士顯然可利用具有適當活性之天然生物催化劑(野生型)或天然生物催化劑之突變株於根據本發明之方法。天然生物催化劑之性質可藉熟諳技藝人士已知之生物技術例如分子演化或理論設計而改良。野生型生物催化劑之突變株之製備方式例如可經由使用熟諳技藝人士已知之突變發生技術(隨機突變發生、位置導向突變發生、導向演化、基因重組等)修改可作為生物催化劑或可製造生物催化部分(諸如酶)之有機體之編碼DNA而製備。特定言之，DNA可經修改讓DNA編碼與野生型酶差異至少一個胺基酸之酶，因此可編碼比較野生型包含一個或多個胺基酸取代、刪除及/或插入之酶，或突變株組合兩種或多種親代酶序列，或經由影響如此經修改之DNA於適當(宿主)細胞的表現。後者可藉熟諳技藝人士已知方法達成，諸如密碼子最適化方法或密碼子對最適化方法，例如基於WO 2008/000632所述方法。

突變株生物催化劑就如下一種或多種面相而言可具有改良性質：對酶基質之選擇性、活性、安定性、溶劑耐受性、pH輪廓資料、溫度輪廓資料、酶基質輪廓資料、對抑制之易感性、輔因子利用性及酶基質親和力。經由應用基於熟諳技藝人士已知方法之例如適當高產出量篩選方法或選擇方法可識別具有改良性質之突變株。

當述及得自特定來源之生物催化劑特別為酶時，特別表示源自於第一有機體但實際上係於(經遺傳改性之)第二有機體製造之重組生物催化劑特別為酶含括作為得自該第一有機體之生物催化劑特別為酶。

於本發明之較佳方法中，製備包含於可催化α-酮酸或胺基酸(亦即包含至少一個羧酸基及至少一個胺基之化合物)之去羧化反應之生物催化劑存在下之生物催化(通常為酶催化)反應。具有此種催化活性之酶因而分別被稱為α-酮酸去羧酶或胺基酸去羧酶。

該酸較佳為二元酸，其中該生物催化劑對酮基或胺基旁的酸基具有選擇性。

大致上，適當去羧酶具有α-酮庚二酸去羧酶活性，可催化AKP轉成5-FVA；或具有α-胺庚二酸去羧酶活性，可催化AAP轉成6-ACA。

可將α-酮酸或胺基酸去羧化之酶特別係選自於去羧酶組群(EC 4.1.1)，較佳係選自於由草醯乙酸去羧酶(EC 4.1.1.3)、二胺庚二酸去羧酶(EC 4.1.1.20)、分支鏈α-酮酸去羧酶(EC 4.1.1.72)、α-酮異戊酸去羧酶、α-酮戊二酸去羧酶(EC 4.1.1.71)、及丙酮酸去羧酶(EC 4.1.1.1)所組成之組群。

一種或多種其它適當之去羧酶可選自於由草酸去羧酶(EC 4.1.1.2)、乙醯乙酸去羧酶(EC 4.1.1.4)、纈胺酸去羧酶/白胺酸去羧酶(EC 4.1.1.14)、麩胺酸去羧酶(EC 4.1.1.15)、天冬酸1-去羧酶(EC 4.1.1.11)、3-羥麩胺酸去羧酶(EC 4.1.1.16)、鳥胺酸去羧酶(EC 4.1.1.17)、離胺酸去羧酶(EC 4.1.1.18)、精胺酸去羧酶(EC 4.1.1.19)、2-酮戊二酸去羧酶(EC 4.1.1.71)、及二胺丁酸去羧酶(EC 4.1.1.86)所組成之組群。

去羧酶特別可為有機體之去羧酶，該有機體係選自於由南瓜；胡瓜；酵母；真菌例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、喇叭狀假絲酵母(Candida flareri)、漢遜酵母種屬(Hansenula sp.)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)、爪哇根黴(Rhizopus javanicus)、及粗糙紅黴(Neurospora crassa)；哺乳動物特別係得自哺乳動物腦及細菌諸如大腸桿菌(Escherichia coli)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、假單胞菌種屬(Pseudomonas sp.)及活動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)所組成之組群。

丙酮酸去羧酶可源自於釀酒酵母或活動發酵單胞菌。特別可使用得自活動發酵單胞菌之丙酮酸去羧酶突變株I472A。

可使用得自大腸桿菌(E.coli)之麩胺酸去羧酶、二胺庚二酸去羧酶或天冬酸去羧酶。

可使用得自粗糙紅黴、麻風桿菌(Mycobacterium leprae)、產氣梭菌(Clostridium perfringens)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、結核分枝桿菌、鏈球菌或乳球菌之麩胺酸去羧酶。可獲得麩胺酸去羧酶之乳球菌種屬之實例特別包括乳酸乳球菌諸如乳酸乳球菌種系B1157、乳酸乳球菌IFPL730，更特別為乳酸乳球菌變種麥芽基因(maltigenes)(前名乳酸鏈球菌變種麥芽基因(Streptococcus lactis var.maltigenes))。

特別可使用得自假單胞菌之草醯乙酸去羧酶。

可使用得自乳酸乳球菌之分支鏈α-酮酸去羧酶。更特別可使用得自乳酸乳球菌之α-酮異戊酸去羧酶。

特別可使用得自結核分枝桿菌之α-酮戊二酸去羧酶。

於本發明之較佳方法中6-ACA之製備包含於胺基施體存在下可催化轉胺反應且選自於轉胺酶(E.C.2.6.1)之組群之酶存在下進行酶催化反應。

大致上，適當轉胺酶具有6-胺己酸6-轉胺酶活性，可催化5-FVA之轉成6-ACA；或具有α-胺庚二酸2-轉胺酶活性，可催化AKP轉成AAP。

轉胺酶特別係選自於由β-胺異丁酸：α-酮戊二酸轉胺酶、β-丙胺酸轉胺酶、天冬酸轉胺酶、4-胺丁酸轉胺酶(EC 2.6.1.19)、L-離胺酸6-轉胺酶(EC 2.6.1.36)、2-胺己二酸轉胺酶(EC 2.6.1.39)、5-胺戊酸轉胺酶(EC 2.6.1.48)、2-胺己酸轉胺酶(EC 2.6.1.67)及離胺酸：丙酮酸6-轉胺酶(EC 2.6.1.71)所組成之組群。

於一個實施例中，轉胺酶可選自於由丙胺酸轉胺酶(EC 2.6.1.2)、白胺酸轉胺酶(EC 2.6.1.6)、丙胺酸-酮酸轉胺酶(EC 2.6.1.12)、β-丙胺酸-丙酮酸轉胺酶(EC 2.6.1.18)、(S)-3-胺-2-甲基丙酸轉胺酶(EC 2.6.1.22)、L,L-二胺庚二酸轉胺酶(EC 2.6.1.83)所組成之組群。

轉胺酶特別係選自於得自哺乳動物；山靛屬特別為多年生山靛，更特別為多年生山靛之嫩枝；鐵角蕨屬更特別為單側鐵角蕨(Asplenium unilaterale)或北方鐵角蕨(Asplenium septentrionale)；佳樂樹屬更特別為長莢佳樂樹(Ceratonia siliqua)；紅細菌屬特別為球狀紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)；葡萄球菌屬特別為金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；弧菌屬特別為河流弧菌(Vibrio fluvialis)；假單胞菌屬特別為綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)；紅假單胞菌屬；芽胞桿菌屬特別為韋氏芽胞桿菌(Bacillus weihenstephanensis)及枯草桿菌(Bacillus subtilis)；退伍軍人症桿菌屬；亞硝酸菌屬；奈瑟氏菌屬；或酵母特別為釀酒酵母之轉胺酶。

於酶屬於哺乳動物之酶時，可特別係源自於哺乳動物腎、哺乳動物肝、哺乳動物心或哺乳動物腦。例如適當酶可選自於得自哺乳動物腎之β-胺異丁酸：α-酮戊二酸轉胺酶特別為得自豬腎之β-胺異丁酸：α-酮戊二酸轉胺酶；得自哺乳動物肝之β-丙胺酸轉胺酶，特別為得自兔肝之β-丙胺酸轉胺酶；得自哺乳動物心之天冬酸轉胺酶，特別為得自豬心之天冬酸轉胺酶；得自哺乳動物肝之4-胺丁酸轉胺酶，特別為得自豬肝之4-胺丁酸轉胺酶；得自哺乳動物腦之4-胺丁酸轉胺酶，特別為得自人、豬或兔腦之4-胺丁酸轉胺酶；得自紅黴屬之α-酮己二酸-麩胺酸轉胺酶特別為得自粗糙紅黴之α-酮己二酸-麩胺酸轉胺酶；得自大腸桿菌之4-胺丁酸轉胺酶，或得自棲熱菌屬之α-胺己二酸轉胺酶，特別為得自嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)之α-胺己二酸轉胺酶，及得自梭菌之5-胺戊酸轉胺酶特別為得自胺戊酸梭菌(Clostridium aminovalericum)之5-胺戊酸轉胺酶所組成之組群。適當2-胺己二酸轉胺酶例如也可由島熱桿菌(Pyrobaculum islandicum)提供。

特定言之，胺基施體可選自於氨、銨離子、胺及胺基酸所組成之組群。適當胺為第一胺及第二胺。胺基酸可具有D-組態或L-組態。胺基施體之實例為丙胺酸、麩胺酸、異丙基胺、2-胺丁烷、2-胺庚烷、苯甲胺、1-苯基-1-胺乙烷、麩胺、酪胺酸、苯基丙胺酸、天冬酸、β-胺異丁酸、β-丙胺酸、4-胺丁酸、及α-胺己二酸。

於更佳實施例中，用於製備6-ACA之方法包含於氨源之存在下可催化還原胺化反應之酶選自於作用於施體之CH-NH₂基之氧化還原酶(EC 1.4)之組群，特別為選自於胺基酸去氫酶(E.C.1.4.1)之組群之酶存在下進行生物催化反應。大致上，適當胺基酸去氫酶具有6-胺基己酸6-去氫酶活性，可催化5-FVA轉成6-ACA；或具有α-胺庚二酸2-去氫酶活性，可催化AKP轉成AAP。特定言之，適當胺基酸去氫酶可選自於由二胺庚二酸去氫酶(EC 1.4.1.16)、離胺酸6-去氫酶(EC 1.4.1.18)、麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.3；EC 1.4.1.4)、及白胺酸去氫酶(EC 1.4.1.9)所組成之組群。

於一個實施例中，胺基酸去氫酶可選自於被歸類為以NAD或NADP作為受體發揮作用之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.3)、以NADP作為受體發揮作用之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.4)、白胺酸去氫酶(EC 1.4.1.9)、二胺庚二酸去氫酶(EC 1.4.1.16)、及離胺酸6-去氫酶(EC 1.4.1.18)之胺基酸去氫酶。

胺基酸去氫酶特別係源自於有機體，該有機體係選自於由下列所組成之組群：棒桿菌屬特別為麩胺酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)；變形桿菌屬特別為普通變形桿菌(Proteus vulgaris)；土壤桿菌屬特別為根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)；地桿菌屬特別為脂嗜熱地桿菌(Geobacillus stearothermophilus)；不動桿菌屬特別為不動桿菌種屬ADP1；拉斯東氏菌屬特別為茄形拉斯東氏菌(Ralstonia solanacearum)；沙門氏菌屬特別為傷寒桿菌(Salmonella typhimurium)；酵母屬特別為釀酒酵母；短桿菌屬特別為黃短桿菌(Brevibacterium flavum)；及芽胞桿菌屬特別為球狀芽胞桿菌(Bacillus sphaericus)、仙人掌芽胞桿菌(Bacillus cereus)及枯草桿菌(Bacillus subtilis)。例如適當胺基酸去氫酶可選自於得自芽胞桿菌屬特別為球狀芽胞桿菌之二胺庚二酸去氫酶；得自短桿菌種屬之二胺庚二酸去氫酶；得自棒桿菌屬之二胺庚二酸去氫酶，特別為得自麩胺酸棒桿菌之二胺庚二酸去氫酶；得自變形桿菌屬之二胺庚二酸去氫酶，特別為得自普通變形桿菌之二胺庚二酸去氫酶；得自土壤桿菌屬特別為根瘤土壤桿菌之離胺酸6-去氫酶；得自地桿菌屬特別為得自脂嗜熱地桿菌之離胺酸6-去氫酶；得自不動桿菌屬之以NADH或NADPH作為輔因子發揮作用之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.3)，特別為得自不動桿菌種屬ADP1之麩胺酸去氫酶；得自拉斯東氏菌屬之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.3)，特別為得自茄形拉斯東氏菌之麩胺酸去氫酶；得自沙門氏菌屬之以NADPH作為輔因子發揮作用之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.4)，特別為得自傷寒桿菌之麩胺酸去氫酶；得自酵母屬之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.4)，特別為得自釀酒酵母之麩胺酸去氫酶；得自短桿菌屬之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.4)，特別為得自黃短桿菌之麩胺酸去氫酶；及得自芽胞桿菌屬之白胺酸去氫酶，特別為得自仙人掌芽胞桿菌或枯草桿菌之白胺酸去氫酶。

於一個特定實施例中，於去羧酶或其它可催化此種轉化之生物催化劑存在下，AKP被生物催化轉化成為5-甲醯戊酸(5-FVA)。根據本發明使用之去羧酶特別係選自於由下列所組成之組群：得自乳酸乳桿菌、乳酸乳桿菌變種麥芽基因或乳酸乳桿菌亞種石狀(Lactococcus lactis subsp.cremoris)之α-酮酸去羧酶；得自乳酸乳桿菌種系B1157或乳酸乳桿菌IFPL730之分支鏈α-酮酸去羧酶；得自釀酒酵母、喇叭狀假絲酵母、活動發酵單胞菌、漢遜酵母種屬、爪哇根黴、粗糙紅黴、或馬克斯克魯維酵母之丙酮酸去羧酶；得自結核分枝桿菌之α-酮戊二酸去羧酶；得自大腸桿菌、短乳酸桿菌、麻風桿菌、粗糙紅黴或綠膿桿菌之麩胺酸去羧酶；及得自大腸桿菌之天冬酸去羧酶。

特別發現得自大腸桿菌、活動發酵單胞菌、釀酒酵母、結核分枝桿菌、假單胞菌種屬或乳酸乳桿菌之去羧酶適合用於催化AKP之轉成5-FVA。更特定言之，可使用具有以序列ID 31、序列ID 34、序列ID 37、序列ID 40、序列ID 43、序列ID 46或其同系物識別之胺基酸序列之去羧酶的生物催化劑。也預期此種去羧酶可用於由AAP製備6-ACA。

隨後5-FVA轉成6-ACA。可以化學方式進行：經由使用氫化催化劑例如鎳於SiO₂/Al₂O₃撐體，藉5-FVA與氨之還原胺化反應，可以高產率製備6-ACA，如EP-A 628 535或DE 4 322 065對9-胺壬酸(9-胺天竺葵酸)及12-胺十二烷酸(12-胺月桂酸)所述。另外，經由使用藉5-FVA與羥胺反應所製備之6-肟己酸，使用PtO₂氫化6-肟己酸可製備6-ACA(例如參考F.O.Ayorinde,E.Y.Nana,P.D.Nicely,A.S.Woods,E.O.Price,C.P.Nwaonicha J.Am.Oil Chem.Soc.1997,74,531-538有關同系12-胺十二烷酸之合成。

於一個實施例中，5-FVA轉成6-ACA之轉化係於(i)胺基施體及(ii)轉胺酶、胺基酸去氫酶或其它可催化此種轉化之生物催化劑存在下以生物催化方式進行。特定言之，於此種實施例中，轉胺酶可選自於由下列所組成之組群：得自河流弧菌、綠膿桿菌、枯草桿菌、韋氏芽胞桿菌或大腸桿菌之轉胺酶；得自豬腎之β-胺異丁酸：α-酮戊二酸轉胺酶；得自兔肝之β-丙胺酸轉胺酶；得自多年生山靛嫩枝之轉胺酶；得自豬肝或得自人、兔或豬腦之4-胺丁酸轉胺酶；得自兔肝之β-丙胺酸轉胺酶；及L-離胺酸：α-酮戊二酸-ε-轉胺酶。於使用胺基酸去氫酶之情況下，此種胺基酸去氫酶特別係選自於由得自根瘤土壤桿菌或脂嗜熱地桿菌之離胺酸6-去氫酶所組成之組群。其它適當胺基酸去氫酶可選自於由得自球狀芽胞桿菌、短桿菌種屬、麩胺酸棒桿菌、或普通變形桿菌之二胺庚二酸去氫酶所組成之組群；由得自不動桿菌種屬ADP1或茄形拉斯東氏菌之以NADH或NADPH作為輔因子發揮作用之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.3)所組成之組群；由得自傷寒桿菌之以NADPH作為輔因子作用之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.4)所組成之組群；由得自釀酒酵母或黃短桿菌之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.4)所組成之組群；或由得自仙人掌芽胞桿菌或枯草桿菌之白胺酸去氫酶所組成之組群。

於特定實施例中，藉包含以序列ID 2、序列ID 5、序列ID 8、序列ID 65、序列ID 67、序列ID 69或任何此等序列之同系物識別之胺基酸序列之轉胺酶的生物催化劑催化5-FVA轉成6-ACA。

於特定實施例中，AKP以化學方式轉成5-FVA。經由於共沸水移除且同時喪失二氧化碳下，使得第二胺例如

啉進行中間烯胺之形成，可進行2-酮羧酸有效被化學去羧化成為相對應之醛，該方法例如係基於四面體函件1982,23(4),459-462所述之方法。中間物端基烯醯胺隨後被水解成為相對應之醛。經由於轉胺酶存在下進行轉胺化反應，或經由藉胺基酸去氫酶或其它可催化此種轉化的生物催化劑以酶還原胺化，5-FVA隨後以生物催化方式轉成6-ACA。此種轉胺酶或胺基酸去氫酶特別可選自於前文當說明5-FVA轉成6-ACA時所述之生物催化劑。

另外，5-FVA轉成6-ACA可藉化學方法例如前文說明方法進行。

於特定實施例中，於(i)轉胺酶、胺基酸去氫酶、或其它可催化此種轉化之生物催化劑及(ii)胺基施體存在下，AKP被生物催化地轉成AAP。此種根據本發明用於將AKP轉成AAP之轉胺酶特別係選自於前文說明之轉胺酶更特別係選自於由下列所組成之組群：得自豬心之天冬酸轉胺酶；得自粗糙紅黴或酵母之α-酮己二酸：麩胺酸轉胺酶；得自多年生山靛嫩枝之轉胺酶；得自大腸桿菌之4-胺丁酸轉胺酶；得自嗜熱棲熱菌之α-胺己二酸轉胺酶；得自北方鐵角蕨或單側鐵角蕨之轉胺酶；及得自長莢佳樂樹之轉胺酶。

於較佳實施例中，用於將AKP轉成AAP之轉胺酶係選自於由得自弧菌屬、假單胞菌屬、芽胞桿菌屬、退伍軍人症桿菌屬、亞硝酸菌屬、奈瑟氏菌屬、紅桿菌屬、埃希氏菌屬及紅假單胞菌屬之轉胺酶所組成之組群。

特別發現得自選自於由下列所組成之組群之有機體之轉胺酶適合用於催化將AKP轉成AAP：枯草桿菌、球狀紅桿菌、嗜肺性退伍軍人症桿菌、歐洲亞硝酸菌、淋病奈瑟氏菌、環狀假單胞菌(Pseudomonas syringae)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、河流弧菌、大腸桿菌及綠膿桿菌。

於特定實施例中，為了將AKP轉成AAP，使用包含根據序列ID 2、序列ID 8、序列ID 12、序列ID 15、序列ID 17、序列ID 19、序列ID 21、序列ID 23、序列ID 25、序列ID 27、序列ID 29或此等序列中之任一者之同系物之胺基酸序列之轉胺酶。

於又一個實施例中，用於製備AAP之方法包含於氨源之存在下可催化還原胺化反應之酶選自於作用於施體之CH-NH₂基之氧化還原酶(EC 1.4)之組群，特別為選自於胺基酸去氫酶(E.C.1.4.1)之組群之酶存在下進行生物催化反應。大致上，適當胺基酸去氫酶具有α-胺庚二酸2-去氫酶活性，可催化AKP轉成AAP。

特別適當胺基酸去氫酶可選自於由二胺庚二酸去氫酶(EC 1.4.1.16)、麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.3；EC 1.4.1.4)及白胺酸去氫酶(EC 1.4.1.9)所組成之組群。

於一個實施例中，胺基酸去氫酶係選自於歸類為以NAD及NADP作為受體發揮作用之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.3)、以NADP作為受體發揮作用之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.4)、白胺酸去氫酶(EC 1.4.1.9)、及二胺庚二酸去氫酶(EC 1.4.1.16)之胺基酸去氫酶。

胺基酸去氫酶特別係源自於選自於由下列所組成之組群之有機體：棒桿菌屬特別為麩胺酸棒桿菌；變形桿菌屬特別為普通變形桿菌；土壤桿菌屬特別為根瘤土壤桿菌；地桿菌屬特別為脂嗜熱地桿菌；不動桿菌屬特別為不動桿菌種屬ADP1；拉斯東氏菌屬特別為茄形拉斯東氏菌；沙門氏菌屬特別為傷寒桿菌；酵母屬特別為釀酒酵母；短桿菌屬特別為黃短桿菌；及桿菌屬特別為球狀芽胞桿菌、仙人掌芽胞桿菌(Bacillus cereus)及枯草桿菌。

例如適當胺基酸去氫酶可選自於得自芽胞桿菌屬特別為球狀芽胞桿菌之二胺庚二酸去氫酶；得自短桿菌種屬之二胺庚二酸去氫酶；得自棒桿菌屬之二胺庚二酸去氫酶，特別為得自麩胺酸棒桿菌之二胺庚二酸去氫酶；得自變形桿菌屬之二胺庚二酸去氫酶，特別為得自普通變形桿菌之二胺庚二酸去氫酶；得自不動桿菌屬之以NADH或NADPH作為輔因子發揮作用之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.3)，特別為得自不動桿菌種屬ADP1之麩胺酸去氫酶；得自拉斯東氏菌屬之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.3)，特別為得自茄形拉斯東氏菌之麩胺酸去氫酶；得自沙門氏菌屬以NADPH作為輔因子發揮作用之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.4)，特別為得自傷寒桿菌之麩胺酸去氫酶；得自酵母屬之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.4)，特別為得自釀酒酵母之麩胺酸去氫酶；得自短桿菌屬之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.4)，特別為得自黃短桿菌之麩胺酸去氫酶；及得自芽胞桿菌屬之白胺酸去氫酶，特別為得自仙人掌芽胞桿菌或枯草桿菌之白胺酸去氫酶。

另一種適當胺基酸去氫酶可選自於由得自根瘤土壤桿菌或脂嗜熱地桿菌之離胺酸6-去氫酶所組成之組群；或由得自仙人掌芽胞桿菌或枯草桿菌之白胺酸去氫酶所組成之組群。

於本發明方法所製備之AAP進一步可用於6-ACA之製備。發明人已經實現由AKP所製成之AAP可藉去羧化反應而轉成6-ACA。此反應可以化學方式進行，例如經由於酮或醛催化劑存在下於高沸溶劑中加熱進行。例如，胺基酸係以良好產率於環己醇於150-160℃使用1-2v/v%環己烯酮去羧化，如M.Hashimoto,Y.Eda,Y.Osanai,T.Iwai及S.Aoki於Chem.Lett.1986,893-896所述。類似方法係說明於Daiso之Eur.Pat.Appl.1586553，及S.D.Brandt,D.Mansell,S.Freeman,I.A.Fleet,J.F.AlderJ.Pharm.Biomed.Anal.2006,41,872-882。

另外，AAP去羧化成為6-ACA可於去羧酶或其它催化此種去羧化之生物催化劑存在下以生物催化方式進行。

去羧酶可選自於可催化α-胺基酸之去羧化之去羧酶。可催化α-胺基酸之酶特別可選自於由去羧酶(E.C.4.1.1)之組群，較佳係選自於由丙酮酸去羧酶(EC 4.1.1.1)、二胺庚二酸去羧酶(EC 4.1.1.20)、二胺庚二酸去羧酶(EC 4.1.1.20)、分支鏈α-酮酸去羧酶(EC 4.1.1.72)其包括α-酮異戊酸去羧酶及α-酮戊二酸去羧酶(EC 4.1.1.71)所組成之組群。

一種或多種其它適當去羧酶特別可選自於由下列所組成之組群：草酸去羧酶(EC 4.1.1.2)、草醯乙酸去羧酶(EC 4.1.1.3)、乙醯乙酸去羧酶(EC 4.1.1.4)、天冬酸1-去羧酶(EC 4.1.1.11)、纈胺酸去羧酶/白胺酸去羧酶(EC 4.1.1.14)、麩胺酸去羧酶(EC 4.1.1.15)、3-羥麩胺酸去羧酶(EC 4.1.1.16)、鳥胺酸去羧酶(EC 4.1.1.17)、離胺酸去羧酶(EC 4.1.1.18)、精胺酸去羧酶(EC 4.1.1.19)、2-酮戊二酸去羧酶(EC 4.1.1.71)、及二胺丁酸去羧酶(EC 4.1.1.86)。

去羧酶特別為選自於下列所組成之組群之有機體之去羧酶：南瓜，例如南瓜；胡瓜；酵母；真菌例如釀酒酵母、喇叭狀假絲酵母、漢遜酵母種屬、馬克斯克魯維酵母、爪哇根黴、及粗糙紅黴；哺乳動物特別係得自哺乳動物腦及細菌諸如大腸桿菌、乳酸乳球菌、結核分枝桿菌、假單胞菌種屬及活動發酵單胞菌所組成之組群。

丙酮酸去羧酶可源自於釀酒酵母或活動發酵單胞菌。特別可使用得自活動發酵單胞菌之丙酮酸去羧酶突變株I472A。特別可使用得自假單胞菌之草醯乙酸去羧酶。可使用得自大腸桿菌(E.coli)之麩胺酸去羧酶、二胺庚二酸去羧酶或天冬酸去羧酶，或得自粗糙紅黴、麻風桿菌、產氣梭菌、短乳桿菌、結核分枝桿菌、鏈球菌或乳球菌之麩胺酸去羧酶。可獲得麩胺酸去羧酶之乳球菌種屬之實例特別包括乳酸乳球菌諸如乳酸乳球菌種系B1157、乳酸乳球菌IFPL730，更特別為乳酸乳球菌變種麥芽基因(前名乳酸鏈球菌變種麥芽基因)。二胺庚二酸去羧酶例如可得自可由二胺庚二酸合成離胺酸之有機體。此種有機體特別係得自細菌、古菌及植物。特別二胺庚二酸去羧酶可得自革蘭氏陰性菌例如大腸桿菌。可使用得自乳酸乳桿菌之分支鏈α-酮酸去羧酶。更特別，可使用得自乳酸乳桿菌之分支鏈α-酮酸去羧酶及α-酮異戊酸去羧酶。

特別可使用得自結核分枝桿菌之α-酮戊二酸去羧酶。發明人發現得自結核分枝桿菌之α-酮戊二酸去羧酶(Kgd)可用於將AAP轉成6-ACA。特別，發明人發現包含如序列ID 46號所示序列或其功能類似物之此種去羧酶可催化由AAP形成6-ACA。

麩胺去羧酶特別係選自於南瓜、胡瓜、酵母、或小牛腦；及二胺庚二酸去羧酶(EC 4.1.1.20)。

二胺庚二酸去羧酶例如可得自可由二胺庚二酸合成離胺酸之有機體。此種有機體特別係得自細菌、古菌及植物。

特別二胺庚二酸去羧酶可得自革蘭氏陰性菌例如大腸桿菌。

於特定實施例中，AKP藉化學方式轉成AAP。如對類似化合物所述，藉催化魯卡特-瓦拉(Leuckart-Wallach)反應，可由2-酮庚二酸製備AAP。本反應係使用甲酸銨於甲醇及[RhCp*Cl₂]₂作為均質催化劑進行(M.Kitamura,D.Lee,S.Hayashi,S.Tanaka,M.Yoshimura J.Org.Chem.2002,67,8685-8687)。另外，魯卡特-瓦拉反應可以水性甲酸銨使用[Ir^IIICp*(bpy)H₂O]SO₄作為催化劑，如S.Ogo,K.Uehara及S.Fukuzumi於J.Am.Chem.Soc.2004,126,3020-3021所述進行。α-酮酸轉換成為(對映異構物豐富的)胺基酸藉由與(對掌性)苄基胺反應以及隨後以Pd/C或Pd(OH)₂/C氫化中間物亞胺也可能達成。例如參考R.G.Hiskey,R.C.Northrop J.Am.Chem.Soc.1961,83,4798。

隨後於去羧酶或其它可進行此種去羧化反應之生物催化劑存在下，AAP以生物催化方式轉成6-ACA。此種去羧酶特別可選自於前文當描述用於將AAP轉成6-ACA之生物催化劑時所述之該等生物催化劑。

另外，AAP轉成6-ACA之轉化可藉化學方法例如前述方法進行。

於特定實施例中，於去羧酶或可催化此種轉化之其它生物催化劑存在下，AKP以生物催化方式轉成5-FVA；及隨後於轉胺酶、胺基酸去氫酶、或其它可催化此種轉化之生物催化劑存在下，5-FVA轉成6-ACA。適合用於此種反應之去羧酶特別係選自於前文描述AKP生物催化成為5-FVA時所述之去羧酶所組成之組群。用於轉化5-FVA之適當轉胺酶或胺基酸去氫酶特別可選自於前文於描述5-FVA生物催化轉化成為6-ACA之生物催化時所述者。

於特定實施例中，於轉胺酶、胺基酸去氫酶、或其它可催化此種轉化之生物催化劑存在下，AKP被生物催化轉成AAP；及隨後於去羧酶或其它可催化此種轉化之生物催化劑存在下，AAP被轉成6-ACA。

適合用於此種反應之酶特別係選自於前文當描述AKP轉成AAP之生物轉化及AAP轉成6-ACA之生物轉化時所述之轉胺酶、胺基酸去氫酶及去羧酶所組成之組群。

用於製備6-ACA之AKP原則上可以任一種方式獲得。例如AKP可基於H.Jäger等人，Chem.Ber.1959,92,2492-2499所述方法獲得。AKP之製備方式可經由使用乙氧化鈉作為鹼以草酸二乙酯烷化環戊酮，於強酸(2M鹽酸)中回流所得產物及例如藉由甲苯結晶而回收產物，製備AKP。

也可由天然來源例如由甲烷產生性古菌、由北方鐵角蕨、或由驅蟲大風子(Hydnocarpus anthelminthica)之AKP。AKP例如可萃取自此等有機體或其部分例如驅蟲大風子種子。適當萃取方法例如係基於A.I.Virtanen及A.M.Berg於Acta Chemica Scandinavica 1954,6,1085-1086所述方法，其中描述使用70%乙醇而由鐵角蕨萃取胺基酸及AKP。

於特定實施例中，AKP係於一種方法製備，包含將α-酮戊二酸(AKG)轉成α-酮己二酸(AKA)及將α-酮己二酸轉成α-酮庚二酸。本反應可藉生物催化劑催化。AKG例如可以技藝界已知方式，由碳源例如碳水化合物而以生物催化方式製備。

用於由AKG製備AKP之適當催化劑特別可選自於催化α-酮戊二酸之C₁-延長成為α-酮己二酸及/或α-酮己二酸之C₁-延長成為α-酮庚二酸之生物催化劑。

於特定實施例中，AKP之製備係藉生物催化劑催化，該生物催化劑包含

a.AksA酶或其同系物；

b.選自於由AksD酶、AksE酶、AksD酶同系物及AksE酶同系物所組成之組群之至少一種酶；及

c.AksF酶或其同系物。

AksA,AksD,AksE,AksF酶或其同系物中之一者或多者可得自選自於甲烷產生性古菌所組成之組群之有機體，較佳係選自於由甲烷球菌、甲烷暖球菌、甲烷八聯球菌、甲烷熱桿菌(Methanothermobacter)、甲烷球菌、甲烷古菌及甲烷短桿菌所組成之組群。

於特定實施例中，催化由α-酮戊二酸(AKG)製備AKP之生物催化劑包含催化α-酮戊二酸轉成α-酮己二酸之轉化之酶系，其中該酶係形成用於離胺酸生物合成之α-胺己二酸路徑之一部分。「酶系」一詞特別於此處用於指其可催化特定轉化的單一種酶或一組酶。

由AKG製備AKP包含使用已知或未知中間物之一種或多種生物催化反應例如AKG轉成AKA或AKA轉成AKP。此等系統可存在於細胞內部或可由細胞分離。酶系特別係得自選自於由酵母、真菌、古菌及細菌所組成之組群，特別係得自於由下列所組成之組群：青黴屬、頭孢子菌屬(Cephalosporium)、貝利菌屬(Paelicomyces)、髮癬菌屬(Trichophytum)、麴菌屬、白腐菌屬(Phanerochaete)、翅孢子菌屬(Emericella)、黑穗病菌屬(Ustilago)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、酵母屬、假絲酵母屬、雅羅酵母屬(Yarrowia)、畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬、棲熱菌屬、迪諾球菌屬、高溫球菌屬(Pyrococcus)、硫葉菌屬(Sulfolobus)、熱球菌屬(Thermococcus)、甲烷球菌屬、甲烷暖球菌屬、甲烷球菌屬、甲烷古菌屬、甲烷短桿菌屬、甲烷八聯球菌屬及甲烷熱桿菌屬。

於特定實施例中，催化由α-酮戊二酸製備AKP之生物催化劑包含催化α-酮戊二酸轉成α-酮己二酸之轉化之酶系，其中酶系中之酶中之至少一者係源自於選自於由藍藻、根瘤菌、γ-蛋白菌及放線桿菌所組成之組群之固氮菌，特別係選自於由念珠藻屬(Anabaena)、微胞藻屬(Microcystis)、群胞藻屬(Synechocystis)、根瘤菌屬(Rhizobium)、緩根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、假單胞菌屬、固氮菌屬(Azotobacter)、克雷白氏菌屬及法蘭克氏菌屬(Frankia)所組成之組群。

此等Aks酶之同系物及編碼此等酶之基因之實例列舉於以下二頁之表1A及表1B。

基因及蛋白質可參考www.ncbi.nlm.nih.gov/,(2008年4月15日取得)

基因及蛋白質可參考www.ncbi.nlm.nih.gov/,(2008年4月15日取得)

若有所需，根據本發明所得之6-ACA可經環化而形成己內醯胺，如US-A 6,194,572所述，其中環化6-胺己酸以形成己內醯胺是在過熱蒸氣的存在下，其中獲得包含己內醯胺及蒸氣的一氣體混合物，且該環化是在缺少催化劑下於介於250及400℃之間之溫度以及介於0.5及2MPa之間之壓力中進行。

於本發明之內文中用於任何生物催化步驟之反應條件可依據生物催化劑特別為酶已知條件、此處揭示之資訊及任選地若干例行實驗而選用。

原則上，所使用之反應介質之pH可選自寬廣限度，只要於pH條件下生物催化劑具有活性即可。依據生物催化劑及其它因素而定，可使用鹼性條件、中性條件及酸性條件。於該方法包括微生物之情況下，例如用於表現可催化本發明方法之酶，pH係選擇讓微生物可進行其期望的功能。於25℃主要為水性系統之情況下，pH特別可選自於低於中性pH四個pH單位至高於中性pH兩個pH單位之範圍，亦即選自於pH 3至pH 9。若水為唯一溶劑或主要溶劑(>50wt.%，特別>90wt.%，以總液體為基準)，則該系統被視為水性，其中小量醇或其它溶劑(<50wt.%，特別<10wt.%，以總液體為基準)可以可維持微生物活性存在的濃度而溶解(例如作為碳源)。特別於使用酵母及/或真菌之情況下，基於25℃大致為水性系統，以酸性條件為佳，特別pH於pH 3至pH 8之範圍。若有所需，可使用酸及/或鹼或使用酸與鹼之適當組合緩衝而調整pH。

原則上，培養條件可於寬廣範圍選用，只要生物催化劑顯示充分活性及/或生長即可。如此包括有氧、微有氧、氧限制及無氧條件。

無氧條件於此處定義為不含任何氧氣或實質上無任何氧被生物催化劑耗用之情況，特別為微生物，通常係相當於氧氣耗用量低於5毫莫耳/升．小時，特別為氧耗用量低於2.5毫莫耳/升．小時或低於1毫莫耳/升．小時。

有氧條件為其中供無限制生長之夠高氧濃度溶解於介質，可支援至少10毫莫耳/升．小時，更佳大於20毫莫耳/升．小時，又更佳大於50毫莫耳/升．小時，及最佳大於100毫莫耳/升．小時之氧耗用速率之條件。

氧限制條件定義為氧耗用量受到氧由氣體轉成液體所限制之條件。氧限制條件之下限係由無氧條件之上限決定，換言之，通常至少為1毫莫耳/升．小時，且特別至少2.5毫莫耳/升．小時或至少5毫莫耳/升．小時。氧限制條件之上限係由有氧條件之下限決定，亦即低於100毫莫耳/升．小時，低於50毫莫耳/升．小時，低於20毫莫耳/升．小時，或低於10毫莫耳/升．小時。

條件為有氧、無氧或氧限制，係依據進行該方法之條件決定，特別係由流入氣流之數量及組成、使用設備之實際混合/質量移轉性質、及所使用之微生物類別及微生物密度決定。

原則上，所使用之溫度並無特殊限制，只要生物催化劑特別為酶顯示實質活性即可。大致上溫度至少為0 ℃，特別至少為15℃，更特別至少為20℃。期望之最高溫度係依據生物催化劑決定。通常此種最高溫度為技藝界所已知，例如於市售生物催化劑之情況下指示於產品資料單中，或可基於普通常識及此處揭示之資訊而例行性地決定。溫度通常為90℃或以下，較佳為70℃或以下，特別為50℃或以下，更特別為40℃或以下。

特別若生物催化反應係於宿主有機體外側進行，則於使用於此種介質中保有足夠活性之酶時，可使用高濃度(例如大於50wt.%或大於90wt.%)之包含有機溶劑之反應介質。

於較佳方法中，使用6-ACA酶基質之全細胞生物轉換或用於形成6-ACA之中間物(AKP、AAP或5-FVA)製備6-ACA，包含其中製造可催化生物轉換之一種或多種生物催化劑(通常為一種或多種酶)之微生物，諸如選自於下列所組成之組群之一種或多種生物催化劑：可催化AKP轉成AAP之生物催化劑，可催化AAP轉成6-ACA之生物催化劑，可催化AKP轉成5-FVA之生物催化劑及可催化5-FVA轉成6-ACA之生物催化劑。於較佳實施例中，微生物可製造去羧酶及/或選自於胺基酸去氫酶及轉胺酶中之至少一種酶；可催化前述反應步驟，及用於微生物之碳源。

碳源特別含有選自於由一元醇、多元醇、羧酸、二氧化碳、脂肪酸、甘油酯，包括包含該等化合物中之任一者之混合物所組成之組群中之至少一種化合物。適當一元醇包括甲醇及乙醇。適當多元醇包括甘油及碳水化合物。適當脂肪酸或甘油酯特別係以食用油形式，較佳為植物來源形式提供。

特別可使用碳水化合物，原因在於通常碳水化合物係以大量得自生物可再生來源，諸如農產品較佳為農業廢料。較佳使用選自於由葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、甜菜糖、澱粉、纖維素及半纖維素所組成之組群之碳水化合物。特佳為葡萄糖、包含葡萄糖之寡醣及包含葡萄糖之多醣。

包含一種或多種用於本發明方法催化反應步驟之生物催化劑(通常為一種或多種酶)之細胞，特別為重組細胞，可使用技藝界已知之分子生物技術組成。例如若於重組細胞(可為非同質系統)製造一種或多種生物催化劑，則此種技術可用於提供包含編碼一種或多種生物催化劑之一種或多種基因之載體(諸如重組載體)。可使用各自包含一種或多種基因之一種或多種載體。此種載體包含以工作式鏈接至編碼生物催化劑之基因之一個或多個調節元件例如一個或多個啟動基因。

如此處使用，「工作式鏈接」一詞係指多核苷酸元件(或編碼序列或核酸序列)呈功能關係鏈接。核酸序列當與另一個核酸序列呈功能關係放置時為「工作式鏈接」。例如啟動基因或加強基因若影響編碼序列之轉錄，則係工作式鏈接至該編碼序列。

如此處使用，「啟動基因」一詞係指可發揮功能控制一個或多個基因之轉錄之核酸片段，位在相對於基因轉錄起始位置之轉錄方向的上游，且於結構上藉DNA相依性RNA聚合酶之結合位置、轉錄起始位置及任何其它DNA序列的存在加以識別，該等DNA序列包括但非限於轉錄因子結合位置、阻遏基因及活化基因蛋白質結合位置、及熟諳技藝人士已知可直接或間接作用於調節得自啟動基因之轉錄量之任何其它核苷酸序列。「組成性」啟動基因為於大部分環境條件及發育條件下具有活性之啟動基因。「誘導性」啟動基因為於環境調節或發育調節下具有活性之啟動基因。「同源」一詞當用於指示一給定的(重組)核酸或多胜肽分子與一給定的宿主有機體或宿主細胞之關係時，須瞭解表示於自然界該核酸或多胜肽分子係由同種且較佳為相同變種或相同種系之宿主細胞或宿主有機體所製造。

可用於達成編碼用於本發明方法之酶特別為轉胺酶、胺基酸去氫酶或去羧酶之核酸序列之表現的啟動基因，諸如前文說明，可為編碼欲表現之該酶之核酸序列所本有，或為其工作式鏈接之核酸序列(編碼序列)之非同源啟動基因。較佳，啟動基因為宿主細胞之同源性，亦即宿主細胞內生性。

若使用非同源啟動基因(相對於感興趣之酶之編碼核酸序列為非同源)，則非同源啟動基因較佳比較該編碼序列原有的啟動基因，可產生更高穩定濃度之包含編碼序列之轉錄本(或每單位時間可產生更多轉錄本分子，亦即mRNA分子)。於本內文中之此種啟動基因包括組成性天然啟動基因及誘導性天然啟動基因以及基因改造啟動基因，為熟諳技藝人士眾所周知。

「強力組成性啟動基因」為造成mRNA以比天然宿主細胞更高頻率起始之啟動基因。於革蘭氏陽性微生物內此種強力組成性啟動基因之實例包括SP01-26、SP01-15、veg、pyc(丙酮酸羧基酶啟動基因)、及amyE。

於革蘭氏陽性微生物中之誘導性啟動基因之實例包括IPTG誘導性Pspac啟動基因、木糖誘導性PxylA啟動基因。

革蘭氏陰性微生物中之組成性啟動基因及誘導性啟動基因之實例包括但非限於tac、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara(P_BAD)、SP6、λ-P_R、及λ-P_L。

(絲狀)真菌細胞之啟動基因為技藝界所已知，可為例如葡萄糖-6-磷酸去氫酶gpdA啟動基因、蛋白酶啟動基因諸如pepA、pepB、pepC、葡萄糖澱粉酶glaA啟動基因、澱粉酶amyA、amyB啟動基因、催化酶catR或catA啟動基因、葡萄糖氧化酶goxC啟動基因、β-半乳糖苷酶lacA啟動基因、α-葡萄糖苷酶aglA啟動基因、轉譯伸長因子tefA啟動基因、木聚糖酶啟動基因諸如xlnA、xlnB、xlnC、xlnD、纖維素酶啟動基因諸如eglA、eglB、cbhA、轉錄調節基因之啟動基因諸如areA、creA、xlnR、pacC、prtT、或其它啟動基因，可參考NCBI網站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)。

就核酸(DNA或RNA)或蛋白質使用時，「同源」一詞係指天然未出現作為有機體、細胞、基因體或其所存在之DNA或RNA序列之一部分之核酸或蛋白質；或指出現於細胞或出現於與天然出現不同的細胞或基因體位置或DNA或RNA序列之核酸或蛋白質。非同源核酸或蛋白質非為該核酸或蛋白質導入其中之該細胞所內生，反而係得自其它細胞或以合成製造或重組製造。大致上但非必要，此種核酸編碼由該DNA所轉錄或表現之細胞非天然製造的蛋白質。類似地外生RNA編碼該外生RNA存在於其中之該細胞非天然表現的蛋白質。非同源核酸及蛋白質也被稱作為外來核酸或蛋白質。熟諳技藝人士瞭解對表現細胞而言被識別為非同源或外來的任一種核酸或蛋白質於此處涵蓋於非同源核酸或蛋白質之術語。

根據本發明之方法可於宿主有機體進行，該宿主有機體可為新穎。

如此，本發明亦係關於包含一種或多種生物催化劑之宿主細胞，該生物催化劑可催化本發明方法中之至少一個反應步驟，特別可催化AKP、AAP或5-FVA轉成6-ACA之轉化中之至少一個反應步驟。本發明亦係關於包含編碼一種或多種酶之一種或多種基因之新穎載體，該等酶可催化本發明方法中之至少一個反應步驟，特別可催化AKP轉成6-ACA之轉化中之至少一個反應步驟；且本發明係關於包含編碼一種或多種酶之一種或多種基因之新穎宿主細胞，該酶可催化本發明方法中之至少一個反應步驟，特別可催化AKP轉成6-ACA之轉化中之至少一個反應步驟(該一種或多種基因可構成一種或多種載體之一部分)。

於一特定實施例中，根據本發明之宿主細胞為包含編碼一種生物催化劑之核酸序列之重組細胞，該生物催化劑可催化轉胺反應或還原胺化反應來由α-酮庚二酸形成α-胺庚二酸。此種序列可為載體之一部分，或可插入染色體DNA。

特別，根據本發明之宿主細胞或載體包含選自於由下列所組成之組群中之至少一個核酸序列，特別至少兩個核酸序列：編碼具有α-酮庚二酸去羧酶活性之酶之核酸序列、編碼具有5-甲醯戊酸轉胺酶活性之酶之核酸序列、編碼具有α-酮庚二酸轉胺酶活性之酶之核酸序列、編碼具有α-酮庚二酸去氫酶活性之酶之核酸序列、及編碼具有α-胺庚二酸去羧酶活性之酶之核酸序列。此種序列中，典型為一者或多者特別為兩者或多者屬於重組序列。

於較佳實施例中，根據本發明之宿主細胞典型為重組宿主細胞或載體包含編碼具有α-酮庚二酸去羧酶活性之至少一種生物催化劑之核酸序列，及/或選自於編碼具有5-甲醯戊酸轉胺酶活性之生物催化劑序列中之至少一種核酸序列。

於此種實施例中，編碼具有α-酮庚二酸去羧酶活性之酶之核酸序列特別包含根據序列ID 31、序列ID 34、序列ID 37、序列ID 40、序列ID 43或序列ID 46或任何此等序列之同系物之胺基酸序列；及/或編碼具有5-甲醯戊酸轉胺酶活性之酶之核酸序列特別包含根據序列ID 2、序列ID 5、序列ID 8、序列ID 65、序列ID 67、序列ID 69或其同系物之胺基酸序列。其中一種或多種核酸序列可構成一種或多種重組載體之一部分。

於又更佳實施例中，載體或宿主細胞包含編碼具有α-酮庚二酸轉胺酶活性之核酸序列及/或編碼具有α-胺庚二酸去羧酶活性之核酸序列。編碼具有α-酮庚二酸轉胺酶活性之核酸序列特別包含根據序列ID 2、序列ID 8、序列ID 12、序列ID 15、序列ID 17、序列ID 19、序列ID 21、序列ID 23、序列ID 25、序列ID 27、序列ID 29或其同系物之胺基酸序列。其中一種或多種核酸序列可形成一種或多種重組載體之一部分。

於一特佳實施例中，根據本發明之宿主細胞包含編碼具有α-胺庚二酸2-去氫酶活性之胺基酸序列及編碼具有α-胺庚二酸去羧酶活性之胺基酸序列。

於特佳實施例中，根據本發明之宿主細胞包含編碼具有6-胺己二酸6-去氫酶活性之酶之核酸序列及編碼具有α-酮庚二酸去羧酶活性之酶之核酸序列。

根據本發明之宿主細胞或載體之一種或多種適當基因特別係選自於前文說明之酶之編碼基因。

於特定實施例中，宿主細胞為包含選自於由下列所組成之組群中之至少一個核酸序列之重組細胞：以序列ID 1、序列ID 3、序列ID 4、序列ID 6、序列ID 7、序列ID 11、序列ID 13、序列ID 14、序列ID 16、序列ID 18、序列ID 20、序列ID 22、序列ID 24、序列ID 26、序列ID 28、序列ID 30、序列ID 32、序列ID 33、序列ID 35、序列ID 36、序列ID 38、序列ID 39、序列ID 41、序列ID 42、序列ID 44、序列ID 45、序列ID 47、序列ID 64、序列ID 66、序列ID 68及其功能類似物中之任一者識別之序列。

編碼具有5-FVA轉胺酶活性之酶之核酸序列特別為選自於由序列ID 1、3、4、6、7、64、66、68及任何此等序列之功能類似物中之任一者所表示之序列所組成之組群之一序列。

如此處使用，「功能類似物」一詞至少包括編碼具有相同胺基酸序列之酶之其它序列及編碼此等酶之同系物之其它序列。

編碼具有AKP去羧酶活性之酶之核酸序列特別為選自於由序列ID 30、32、33、35、36、38、39、41、42、44、45、47及任何此等序列之功能類似物中之任一者所表示之序列所組成之組群中之一序列。

於較佳實施例中，宿主細胞包含編碼可催化AAP轉成AKP之轉化作用之酶之核酸序列，該核酸序列係根據序列ID 1、3、7、11、13、14、16、18、20、22、24、26、28、或其功能類似物且可為野生型序列或非野生型序列。

於特定實施例中，宿主細胞包含編碼具有α-胺庚二酸去羧酶活性之生物催化劑之至少一個核酸序列，該序列對該宿主細胞可為同源或非同源。特別此種生物催化劑可選自於由去羧酶(E.C.4.1.1)所組成之組群，更特別係選自於由下列所組成之組群：麩胺酸去羧酶(EC 4.1.1.15)、二胺庚二酸去羧酶(EC 4.1.1.20)、天冬酸1-去羧酶(EC 4.1.1.11)、分支鏈α-酮酸去羧酶、α-酮異戊酸去羧酶、α-酮戊二酸去羧酶、丙酮酸去羧酶(EC 4.1.1.1)及草醯乙酸去羧酶(EC 4.1.1.3)。

於特定實施例中，宿主細胞包含催化由AKG(也參考上文)形成AKP之一種或多種酶。可使用構成離胺酸生物合成之α-胺己二酸路徑之一部分之一種酶系。「酶系」一詞用於此處特別係指單一酶或一組可催化特定轉化反應之酶。此種轉化包含具有已知中間物或未知中間物之一種或多種化學反應，例如AKG轉成AKA或AKA轉成AKP。此種系統可存在於細胞內部或與細胞分離。已知轉胺酶經常有寬廣酶基質範圍。若存在有酶基質時期望降低一種或多種此等酶於宿主細胞內之活性，使得AKA轉成α-胺己二酸(AAA)之轉化活性減低，同時維持其它胺基酸或細胞組分之生物合成之相關催化功能。此外，以不含任何其它酶催化活性將導致AKA轉成非期望副產物之宿主細胞為佳。

適合用於利用全細胞生物轉換法製備AAP之較佳宿主細胞中，編碼可催化由α-酮戊二酸製備α-酮庚二酸中之至少一個反應步驟之一種或多種生物催化劑。適當生物催化劑例如為於討論AKP之製備時所述者。

宿主細胞可選自細菌、酵母或真菌。特定言之，宿主細胞可選自於選自於由麴菌屬、青黴屬、酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、芽胞桿菌屬、棒桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄桿菌屬 (Gluconobacter)、甲烷球菌屬、甲烷桿菌屬、甲烷暖球菌屬及甲烷八聯球菌屬及埃希氏菌屬等菌屬所組成之組群。此處通常已經選殖且表現一種或多種如前文說明之編碼核酸序列。

特定言之，宿主細胞以及如此適合用於6-ACA之生化合成之宿主細胞可選自於由下列宿主細胞所組成之組群：大腸桿菌、枯草桿菌、分解澱粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、麩胺酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黑麴菌(Aspergillus niger)、產黃青黴(Penicillium chrysogenum)、釀酒酵母、多形性漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、白色念珠菌(Candida albicans)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、短柄畢赤酵母(Pichia stipitis)、巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)、自動趨熱甲烷芽胞桿菌(Methanobacterium thermoautothrophicum)△H、馬氏甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)、伏氏甲烷球菌(Methanococcus voltae)、阿氏甲烷球菌(Methanosarcina acetivorans)、巴氏甲烷八聯球菌(Methanosarcina barker)及梅氏甲烷八聯球菌(Methanosarcina mazei)等宿主細胞。於較佳實施例中，宿主細胞可製造離胺酸(呈前驅物)。

宿主細胞原則上為天然出現之有機體或可為經基因改造之有機體。此種有機體可使用技藝界已知之突變篩選策略或代謝基因改造策略進行基因改造。於特定實施例中，宿主細胞天然包含(或可製造)適合用於催化本發明方法中之反應步驟之一種或多種酶，諸如選自於由可催化本發明方法中之反應步驟之去羧酶、轉胺酶及胺基酸去氫酶所組成之組群中之一種或多種活性。舉例言之，大腸桿菌天然可製造可催化本發明方法中之轉胺化反應之酶。也可能提供一種重組宿主細胞其帶有兩種重組基因，一種重組基因編碼可催化本發明方法之一反應步驟之轉胺酶或胺基酸去氫酶，及一種重組基因編碼可催化本發明方法之反應步驟之去羧酶基因。

例如，宿主細胞可選自於棒桿菌屬特別為麩胺酸棒桿菌、腸細菌特別為大腸桿菌、芽胞桿菌屬特別為枯草桿菌及甲烷芽胞桿菌(B.methanolicus)、及酵母屬特別為釀酒酵母。特別適合者為已經發展用於工業上製造離胺酸之麩胺酸棒桿菌或甲烷芽胞桿菌。

本發明進一步係關於一種微生物，該微生物可為由天然環境所分離之野生型微生物或重組微生物，包含如選自於由序列ID No.3、序列ID No.6、序列ID No.13、序列ID No.32、序列ID No.35、序列ID No.41、序列ID No.44、序列ID No.47及其功能類似物所組成之組群之任一種序列ID識別的核酸序列之DNA。

如此處所述核苷酸序列之功能類似物特別為編碼與該核苷酸序列編碼相同胺基酸序列或編碼該核苷酸序列之同系物之該等核苷酸序列。特定言之，較佳功能類似物為具有與被稱作為其功能類似物之核苷酸序列於感興趣的宿主細胞內有類似的、相同的或更佳的表現程度之核苷酸序列。

本發明進一步係關於一種多核苷酸或載體包含以選自於由序列ID No.3、序列ID No.6、序列ID No.13、序列ID No.32、序列ID No.35、序列ID No.41、序列ID No.44、序列ID No.47及其非野生型功能類似物所組成之組群中之任一個序列ID識別之核酸序列。此種多核苷酸或載體比較相對應之野生型基因可更優異地提供宿主細胞，特別為大腸桿菌宿主細胞，或其它可以高產率催化AKP轉成6-ACA之轉化過程中之至少一個轉化步驟之其它宿主細胞。

任選地，多核苷酸或載體包含一個或多個核酸序列其編碼適合用於催化根據本發明方法中之反應步驟之一種或多種其它生物催化劑，特別為前文說明之此等催化劑中之一者或多者。

本發明進一步係關於一種用於製備α-胺庚二酸(AAP)之方法，包含將AKP轉成AAP，該轉化係藉生物催化劑催化。

用於此等方法，特別可使用如前文說明具有轉胺酶活性或還原胺化活性之生物催化劑。

如前文指示，隨後AAP可用於6-ACA之製備。另外，AAP可就此使用，例如用作為生物化學研究之化學品或用作為pH緩衝化合物，例如用於製備性分離技術或分析性分離技術諸如液相層析術或毛細電泳。

又復，於本發明方法所製備之AAP進一步可用於其它化合物之製備，例如AAP可轉成己內醯胺。如前文說明，基於如下實例中舉例說明，AAP可以化學方式例如暴露於高溫而轉成己內醯胺。不欲受理論所限，預期於本反應中，6-ACA可能形成為短命中間物。

其次將藉下列實例舉例說明本發明。

實例

概略方法

分子及遺傳技術

標準遺傳及分子生物學技術為技藝界概略已知且如前文說明(Maniatis等人，1982年，「分子選殖：實驗室手冊」，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；Miller 1972年「分子遺傳學實驗」，冷泉港實驗室，冷泉港；Sambrook及Russell 2001「分子選殖：實驗室手冊」(第3版)，冷泉港實驗室，冷泉港實驗室出版社；F.Ausubel等人編輯，「分子生物學之流行方案」，格林出版社及威利科技公司，紐約1987)。

質體及種系

pBAD/Myc-His C係得自茵維基因公司(Invitrogen)(美國加州卡斯貝)。如WO2005/068643所述組成之質體pBAD/Myc-His-DEST用於蛋白質表現。大腸桿菌TOP10(茵維基因公司，美國加州卡斯貝)用於全部選殖程序及用於標靶基因的表現。

培養基

LB培養基(10克/升胰蛋白腖，5克/升酵母萃取物，5克/升NaCl)用於大腸桿菌之生長。補充抗生素(50微克/毫升卡卞西林(carbenicillin))來維持質體。為了於 pBAD/Myc-His-DEST所衍生的質體中於P_BAD啟動基因之控制之下誘導基因表現，添加L-阿拉伯糖至0.2%(w/v)終濃度。

質體之識別

攜帶不同基因之質體係藉技藝界一般已知之遺傳學、生物化學、及/或表現型手段加以識別，諸如轉形株對抗生素之抗性、轉形株之PCR診斷分析或質體DNA之純化、已純化的質體DNA之限剪分析或DNA序列分析。

用於測定5-FVA之HPLC-MS分析方法

經由選擇性反應監視(SRM)-MS，測量變遷129→83而檢測5-FVA。經由測量約6分鐘洗提出之5-FVA峰之峰面積，計算5-FVA濃度。使用外部標準程序進行校準。全部LC-MS實驗皆係於艾吉蘭(Agilent)1200 LC系統進行，該系統包含第四級幫浦、自動取樣器及柱狀烤爐耦合艾吉蘭6410 QQQ三重四元MS。

LC條件：

管柱：50 x 4.6毫米紐奎席爾(Nucleosil)C18，5微米(麥肯利及那吉公司(Machery&Nagel))前置管柱耦合至250x4.6毫米內徑普維爾(Prevail)C18，5微米(艾爾科技公司(Alltech))。

管柱溫度：室溫

洗提劑：A：含0.1%甲酸之水

B：含0.1%甲酸之乙腈

梯度：

流速：1.2毫升/分鐘，於進入MS前流量以1：3分裂。

注入量：2微升

MS條件：

離子化：負離子電噴灑

來源條件：離子噴灑電壓：5kV

溫度：350℃

分段器電壓及碰撞能最佳化

掃描模式：選擇反應模式：變遷m/z 129→83

用於測定AAP之HPLC-MS分析

藉選定之離子監視(SIM)-MS，測量具有m/z 176之AAP之質子化分子而檢測AAP。經由測量於樣本中於2.7分鐘滯留時間洗提出之AAP峰之尖峰面積而計算AAP濃度。經由使用外部標準程序進行校準。全部LC-MS實驗皆係於由第四級幫浦、除氣器、自動取樣器及柱狀烤爐所組成之艾吉蘭1100 LC系統耦合API 2000三重四元MS(應用生物系統公司(Applied Biosystems))進行。

LC條件如下：

管柱：50*4紐奎席爾C18，5微米(麥肯利-那吉公司)+250x4.6普維爾C18，5微米(艾爾科技公司)，皆係於室溫(RT)。

洗提劑：A=0.1%(v/v)甲酸於超純水

B=0.1%(v/v)甲酸於乙腈(pa，默克公司(Merck))

流速：1.2毫升/分鐘，進入MS之前流量以1：3分裂。

梯度：梯度係於t=0分鐘以90%(v/v)A開始，6分鐘以內改成50%(v/v)A。於6.1分鐘時梯度改成原先條件。

注入量：2微升

MS條件：正離子電噴灑用於離子化。

檢測：SIM模式於m/z 176，滯留時間100毫秒。

用於測定6-ACA之HPLC-MS分析

校準：

藉6-ACA之外部校準線(m/z 132→m/z 114，室溫7.5分鐘)進行校準。全部LC-MS實驗皆係於艾吉蘭1100進行，該儀器裝配有第四級幫浦、除氣器、自動取樣器、柱狀烤爐、及單一四元MS(艾吉蘭，德國沃波恩)。LC-MS條件為：

管柱：50*4紐奎席爾(麥肯利-那吉公司)+250 x 4.6 普維爾C18(艾爾科技公司)，皆係於室溫(RT)。

洗提劑：A=0.1%(v/v)甲酸於超純水

B=乙腈(pa，默克公司)

流速：1.0毫升/分鐘，進入MS前流量以1：3分裂。

梯度：於t=0分鐘梯度始於100%(v/v)A，維持15分鐘，於15分鐘內改成80%(v/v)B(t=30分鐘)。由30至31分鐘，梯度維持恆定於80%(v/v)B。

注入量：5微升

MS檢測：ESI(+)-MS

電噴灑離子化(ESI)係於正掃描模式以下列條件進行：m/z 50-500、50V分段器、0.1m/z階梯大小、350℃乾燥氣體溫度、10升氮氣/分鐘乾燥氣體、50psig霧化器壓力及2.5毛細電壓。

標靶基因之選殖

表現組成體之設計

attB位置添加至核糖體結合位置及起始密碼子上游及起始密碼子下游之全部基因來協助使用嘉衛(Gateway)技術(茵維基因公司，美國加州卡斯貝)選殖。

質體之基因合成與組成

合成基因係得自經最佳化可用於根據DNA2.0之標準程序而於大腸桿菌表現之DNA2.0及密碼子。分別編碼河流弧菌JS17 ω-轉胺酶之胺基酸序列[SEQ ID No.2]及韋氏芽胞桿菌KBAB4轉胺酶之胺基酸序列(ZP_01186960)[SEQ ID No.5]之得自河流弧菌JS17[SEQ ID No.1]及韋氏芽胞桿菌KBAB4[SEQ ID No.4]之轉胺酶基因經過密碼子最佳化，所得序列[SEQ ID No.3]及[SEQ ID No.6]係藉DNA合成獲得。

分別編碼河流弧菌JS17 ω-轉胺酶之胺基酸序列[SEQ ID No.3]、韋氏芽胞桿菌KBAB4轉胺酶(ZP_01186960)[SEQ ID No.6]、大腸桿菌二胺庚二酸去羧酶LysA[SEQ ID No.31]、釀酒酵母丙酮酸去羧酶Pdc[SEQ ID No.34]、活動發酵單胞菌丙酮酸去羧酶Pdc1472A[SEQ ID No.37]、乳酸乳桿菌分支鏈α-酮酸去羧酶KdcA[SEQ ID No.40]及α-酮異戊酸去羧酶KivD[SEQ ID No.43]、及結核分枝桿菌α-酮戊二酸去羧酶Kgd之胺基酸序列[SEQ ID No.46]之得自大腸桿菌[SEQ ID No.30]、釀酒酵母[SEQ ID No.33]、活動發酵單胞菌[SEQ ID No.36]、乳酸乳桿菌[SEQ ID No.39]、[SEQ ID No.42]、及結核分枝桿菌[SEQ ID No.45]之去羧酶基因也經密碼子最佳化，所得序列[SEQ ID No.32]、[SEQ ID No.35]、[SEQ ID No.38]、[SEQ ID No.41]、[SEQ ID No.44]、及[SEQ ID No.47]分別係藉DNA合成獲得。

基因組成體如製造商方案(www.invitrogen.com)所述，透過所導入之attB位置及pDONR201(茵維基因公司)作為進入載體，使用嘉衛技術(茵維基因公司)選殖入pBAD/Myc-His-DEST表現載體。藉此分別獲得表現載體pBAD-Vfl_AT及pBAD-Bwe_AT。經由使用個別的pBAD表現載體轉形化學勝任大腸桿菌TOP10(茵維基因公司)，獲得相對應之表現種系。

藉PCR選殖

編碼生物催化劑之多種基因根據製造商的規格，使用下表所列舉之引子，使用PCR超混合機高可靠度(PCR Supermix High Fidelity)(茵維基因公司)，藉PCR而由基因體DNA擴增。

PCR反應係藉瓊脂糖凝膠電泳分析，具有正確尺寸之PCR產物係使用奎克(QIAquick)PCR純化套件組(奎金公司(Qiagen)，德國希爾登)而由凝膠洗提出。如製造商方案所述，透過所導入之attB位置及pDONR-zeo(茵維基因公司)作為進入載體，使用嘉衛技術(茵維基因公司)將已純化之PCR產物選殖入pBAD/Myc-His-DEST表現載體。藉PCR選殖之基因序列係藉DNA定序加以證實。藉此方式獲得表現載體pBAD-Pae_gi9946143_AT、pBAD-Bsu_gi16078032_AT、pBAD-Bsu_gi16080075_AT、pBAD-Bsu_gi16077991_AT、pBAD-Rsp_AT_pBAD-Lpn_AT、pBAD-Neu_AT、pBAD-Ngo_AT、pBAD-Pae_gi9951299_AT、pBAD-Pae_gi9951072_AT、pBAD-Pae_gi9951630_AT及pBAD-Rpa_AT。相對應之表現種系係藉以pBAD組成體轉形化學上勝任的大腸桿菌TOP10(茵維基因公司)獲得。

用於蛋白質表現之大腸桿菌之生長

小規模生長係於96深孔孔板使用含0.02%(w/v)L-阿拉伯糖之940微升培養基進行。藉將得自冷凍備用培養之細胞使用96孔衝壓機(庫那公司(Kühner)，瑞士博費登)轉移細胞進行接種。孔板於軌道振搖機(300rpm，5厘米振幅)於25℃培養48小時。典型達到OD_620nm為2-4。

細胞溶解物之製備

溶解緩衝液之製備

溶解緩衝液含有下列成分：

溶液係恰於使用前製備。

藉溶解製備不含細胞之萃取物

藉離心收穫得自小規模生長(參考前段)之細胞，拋棄上清液。離心期間所形成之細胞丸粒於-20℃至少冷凍16小時然後於冰上解凍。500微升剛製妥的溶解緩衝液添加至各孔，藉激烈渦旋孔板2-5分鐘而讓細胞再懸浮。為了達成細胞溶解，孔板於室溫培養30分鐘。為了去除細胞殘骸，孔板於4℃及6000g離心20分鐘。上清液移至新的孔板且維持於冰上直到進一步供使用。

藉音振處理製備不含細胞之萃取物

得自培養基規模生長之細胞(參考前段)藉離心收穫及拋棄上清液。1毫升磷酸鉀緩衝液pH 7添加至0.5克濕細胞丸粒，藉激烈渦旋再度懸浮細胞。為了達成細胞溶解，細胞經音振處理20分鐘。為了去除細胞殘骸，溶解產物於4℃及6000g離心20分鐘。上清液移至新試管內且於-20℃冷凍至進一步供使用。

藉5-甲醯戊酸甲酯之化學水解製備5-甲醯戊酸

經由5-甲醯戊酸甲酯之化學水解製備轉胺酶反應用之酶基質亦即5-甲醯戊酸如下：10%(w/v)5-甲醯戊酸甲酯於水溶液使用氫氧化鈉固定於pH 14.1。於20℃培養24小時後，使用鹽酸將pH固定於7.1。

5-甲醯戊酸轉成6-ACA之酶催化反應

除非另行規定，製備反應混合物包含10mM 5-甲醯戊酸，20mM外消旋α-甲基苄基胺，及200μM吡哆醛5’-磷酸於50mM磷酸鉀緩衝液，pH 7.0。100微升反應混合物配送至孔板之各孔。為了引發反應，20微升不含細胞之萃取物添加至各孔。反應混合物於37℃振搖器上培養24小時。此外，化學空白組混合物(不含無細胞之萃取物)及生物空白組(含pBAD/Myc-His C之大腸桿菌TOP10)於相同條件下培養。藉HPLC-MS分析樣本。結果摘述於下表。

n.d.：無法檢測

*該方法之差異在於使用10微升無細胞萃取物替代20微升，吡哆醛5’-磷酸濃度為50μM而非200μM及孔內反應混合物體積為190微升而非100微升。

顯示於轉胺酶存在下由5-FVA形成6-ACA。

AKP轉成5-甲醯戊酸之酶催化反應

製備反應混合物包含50mM AKP、5mM氯化鎂、100μM吡哆醛5’-磷酸(用於LysA)及1mM噻胺二磷酸(用於全部其它酶)於100mM磷酸鉀緩衝液、pH 6.5。4毫升反應混合物配送入反應容器。為了引發反應，添加1毫升藉音振處理所得之無細胞萃取物至各孔。於商用草醯乙酸去羧酶(西革瑪-亞利敘公司(Sigma-Aldrich)產品號碼04878)之情況下使用50單位。反應混合物使用磁力攪拌器於37℃培養48小時。此外，化學空白組混合物(不含無細胞萃取物)及生物空白組(含pBAD/Myc-His C之大腸桿菌TOP10)於相同條件下培養。反應期間得自不同時間點之樣本藉HPLC-MS分析。結果摘述於下表。

nd：無法檢測

顯示於去羧酶存在下由AKP形成5-FVA。

於重組去羧酶存在下將AKP轉成6-ACA之酶催化反應

製備反應混合物包含50mM AKP、5mM氯化鎂、100μM吡哆醛5’-磷酸(用於LysA)及1mM噻胺二磷酸(用於全部其它測試的生物催化劑)於100mM磷酸鉀緩衝液、pH 6.5。4毫升反應混合物配送入反應容器。為了引發反應，添加1毫升藉音振處理所得之無細胞萃取物至各孔。反應混合物使用磁力攪拌器於37℃培養48小時。此外，化學空白組混合物(不含無細胞萃取物)及生物空白組(含pBAD/Myc-His C之大腸桿菌TOP10)於相同條件下培養。反應期間得自不同時間點之樣本藉HPLC-MS分析。結果摘述於下表。

n.a.=未分析

n.d.=無法檢測

顯示於去羧酶存在下由AKP形成6-ACA。預期大腸桿菌含有天然5-FVA轉胺酶活性。

於重組去羧酶及重組轉胺酶存在下AKP轉成6-ACA之酶催化反應

製備反應混合物包含50mM AKP、5mM氯化鎂、100μM吡哆醛5’-磷酸、1mM噻胺二磷酸及50mM外消旋α-甲基苄基胺於100mM磷酸鉀緩衝液、pH 6.5。1.6毫升反應混合物配送入反應容器。為了引發反應，添加0.2毫升含無細胞萃取物之去羧酶及0.2毫升含無細胞萃取物之轉胺酶至各個反應容器。反應混合物以磁力攪拌器於37℃培養48小時。此外，化學空白組混合物(不含無細胞萃取物)及生物空白組(含pBAD/Myc-His C之大腸桿菌TOP10)於相同條件下培養。反應期間得自不同時間點之樣本藉HPLC-MS分析。結果摘述於下表。

AT=轉胺酶

DC=去羧酶

於化學空白組及生物空白組未檢測得任何6-ACA。

此外，結果顯示比較其中宿主細胞只含重組去羧酶(而未含重組轉胺酶)之實例，6-ACA之轉化率改良。

於釀酒酵母組成用於轉胺酶及去羧酶之表現之質體

根據製造商規格且使用特定引子[SEQ ID No.76及77]使用福遜(Phusion)DNA聚合酶(芬贊公司(Finnzymes))，藉PCR由pBAD-Vfl_AT[SEQ ID No.3]擴增得自河流弧菌JS17之編碼河流弧菌JS17 ω-轉胺酶之胺基酸序列[SEQ ID No.2]之轉胺酶基因。

根據製造商規格且使用特定引子[SEQ ID No.78及79]使用福遜DNA聚合酶(芬贊公司)，藉PCR由pBAD-Pae_AT擴增得自綠膿桿菌之編碼綠膿桿菌轉胺酶[SEQ ID No.8]之轉胺酶基因[SEQ ID No.7]。

所得PCR產物使用SpeI及BamHI限剪酶轉殖入載體pAKP-41，分別獲得pAKP-79及pAKP-80，今日含有於釀酒酵母gal10啟動基因及釀酒酵母adh2終結基因下的轉胺酶基因。

根據製造商規格且使用特定引子[SEQ ID No.80及81]使用福遜DNA聚合酶(芬贊公司)，藉PCR由pBAD-Pdc擴增得自釀酒酵母之編碼釀酒酵母丙酮酸去羧酶Pdc[SEQ ID No.34]之去羧酶基因[SEQ ID No.33]。

根據製造商規格且使用特定引子[SEQ ID No.82及83]使用福遜DNA聚合酶(芬贊公司)，藉PCR由pBAD-KdcA擴增得自乳酸乳桿菌之編碼乳酸乳桿菌分支鏈α-酮酸去羧酶KdcA[SEQ ID No.40]之去羧酶基因[SEQ ID No.39]。

所得PCR產物使用AscI及BamHI限剪酶轉殖入載體pAKP-44，分別獲得pAKP-81及pAKP-82，今日含有於釀酒酵母gal2啟動基因及釀酒酵母pma1終結基因下的轉胺酶基因。

質體pAKP-79及pAKP-80係以SacI及XbaI經限剪酶消化；質體pAKP-81及pAKP-82係以SalI及XbaI經限剪酶消化。SacI/XbaI轉胺酶片段與片段組合SalI/XbaI去羧酶片段成為釀酒酵母低複本游離基因載體pRS414，以SalI及SacI接受限剪酶消化。

所得質體為：

pAKP-85：Pgal10-Pae_AT-Tadh2 Pgal2-Pdc_DC-Tpma1

pAKP-86：Pgal10-Pae_AT-Tadh2 Pgal2-KdcA_DC-Tpma1

pAKP-87：Pgal10-Vfl_AT-Tadh2 Pgal2-Pdc_DC-Tpma1

pAKP-88：Pgal10-Vfl_AT-Tadh2 Pgal2-KdcA_DC-Tpma1

釀酒酵母之轉形及生長

釀酒酵母種系CEN.PK113-3C根據Gietz及Woods 所述方法(Gietz,R.D.及Woods,R.A.(2002))。酵母之轉形係藉Liac/SS載體DNA/PEG方法。酶學方法350：87-96)，以1微克質體DNA轉形。細胞接種於含1x酵母氮鹼基不含胺基酸及2%葡萄糖之瓊脂孔板。

所得種系於含0.05%葡萄糖及4%半乳糖之凡杜恩(Verduyn)最低培養基於30℃需氧生長48小時。

無細胞萃取物之製備

1毫升磷酸鉀緩衝液(pH 7)添加至0.5克細胞丸粒。此混合物添加至直徑0.4-0.5毫米含0.5克玻璃珠之2毫升衣本朵夫(eppendorf)試管內。樣本以衣本朵夫振搖器(IKA VIBRAX-VXR)激烈振搖20秒。所得無細胞萃取物於14000rpm及4℃離心5分鐘。上清液用於酶活性檢定分析。

於釀酒酵母於共同表現的去羧酶及轉胺酶存在下將AKP轉成6-ACA之酶催化反應

製備反應混合物，包含50mM AKP、5mM氯化鎂、100μM吡哆醛5’-磷酸、1mM噻胺二磷酸及50mM外消旋α-甲基苄基胺於100mM磷酸鉀緩衝液、pH 6.5。1.6毫升反應混合物配送入反應容器內。為了起始反應，加入含去羧酶及轉胺酶之得自釀酒酵母之無細胞萃取物0.4毫升至各個反應容器。反應混合物於37℃藉磁力攪拌器培養。此外，化學空白組混合物(不含無細胞萃取物)及生物空白組(釀酒酵母)於相同條件下培養。19小時培養後所得樣本藉HPLC-MS分析。結果摘述於下表。

表8：使用微生物作為生物催化劑由AKP形成6-ACA

α-酮庚二酸轉成α-胺庚二酸之酶催化反應

製備反應混合物，包含10mM α-酮庚二酸，20mM L-丙胺酸，及50μM吡哆醛5’-磷酸於50mM磷酸鉀緩衝液，pH 7.0。800微升反應混合物配送入孔板之各孔。為了起始反應，添加200微升細胞溶解物至各孔。反應混合物於37℃於振搖器上培養24小時。此外，化學空白組混合物(不含無細胞之萃取物)及生物空白組(含pBAD/Myc-His C之大腸桿菌TOP10)於相同條件下培養。樣本藉HPLC-MS分析。結果摘述於下表。

顯示由AKP形成AAP係藉生物催化劑催化。

AAP之化學轉化成己內醯胺

於1.5克D,L-2-胺庚二酸於21毫升環己酮之懸浮液內加入0.5毫升環己烯酮。混合物於由約回流加熱20小時(約160℃)。冷卻至室溫後，反應混合物經傾析，於減壓下蒸發去除澄清溶液。剩餘2克褐色油藉¹H-NMR及HPLC分析，含有0.8wt%己內醯胺及6wt%己內醯胺之環狀寡聚物。

<110> 吉諾瑪蒂卡股份有限公司(GENOMATICA,INC.)

<120> 由α-酮庚二酸製備6-胺己酸之技術

<140> TW 109101569

<141> 2009-03-11

<150> EP 08152584.2

<151> 2008-03-11

<160> 83

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1362

<212> DNA

<213> 河流弧菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1362)

<400> 1

<210> 2

<211> 453

<212> PRT

<213> 河流弧菌

<400> 2

<210> 3

<211> 1362

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 河流弧菌JS17 ω-轉胺苷密碼子最佳化基因

<400> 3

<210> 4

<211> 1350

<212> DNA

<213> 韋氏芽胞桿菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1350)

<400> 4

<210> 5

<211> 449

<212> PRT

<213> 韋氏芽胞桿菌

<400> 5

<210> 6

<211> 1350

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 韋氏芽胞桿菌KBAB4轉胺苷密碼子最佳化基因

<400> 6

<210> 7

<211> 1371

<212> DNA

<213> 綠膿桿菌(gi 9946143)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1371)

<400> 7

<210> 8

<211> 456

<212> PRT

<213> 綠膿桿菌(gi 9946143)

<400> 8

<210> 9

<211> 70

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 引子

<400> 9

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 引子

<400> 10

<210> 11

<211> 1365

<212> DNA

<213> 環狀假單胞菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1365)

<400> 11

<210> 12

<211> 454

<212> PRT

<213> 環狀假單胞菌

<400> 12

<210> 13

<211> 1365

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 環狀假單胞菌密碼子最佳化轉胺苷基因

<400> 13

<210> 14

<211> 849

<212> DNA

<213> 枯草桿菌(gi 16078032)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(849)

<400> 14

<210> 15

<211> 282

<212> PRT

<213> 枯草桿菌(gi 16078032)

<400> 15

<210> 16

<211> 1347

<212> DNA

<213> 枯草桿菌(gi 16080075)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1347)

<400> 16

<210> 17

<211> 448

<212> PRT

<213> 枯草桿菌(gi 16080075)

<400> 17

<210> 18

<211> 1467

<212> DNA

<213> 球狀紅桿菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1467)

<400> 18

<210> 19

<211> 488

<212> PRT

<213> 球狀紅桿菌

<400> 19

<210> 20

<211> 837

<212> DNA

<213> 嗜肺性退伍軍人症菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(837)

<400> 20

<210> 21

<211> 278

<212> PRT

<213> 嗜肺性退伍軍人症菌

<400> 21

<210> 22

<211> 861

<212> DNA

<213> 歐洲亞硝酸菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(861)

<400> 22

<210> 23

<211> 286

<212> PRT

<213> 歐洲亞硝酸菌

<400> 23

<210> 24

<211> 1293

<212> DNA

<213> 淋病奈瑟氏菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1293)

<400> 24

<210> 25

<211> 430

<212> PRT

<213> 淋病奈瑟氏菌

<400> 25

<210> 26

<211> 924

<212> DNA

<213> 綠膿桿菌(gi 9951299)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(924)

<400> 26

<210> 27

<211> 307

<212> PRT

<213> 綠膿桿菌(gi 9951299)

<400> 27

<210> 28

<211> 1407

<212> DNA

<213> 沼澤紅假單胞菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1407)

<400> 28

<210> 29

<211> 468

<212> PRT

<213> 沼澤紅假單胞菌

<400> 29

<210> 30

<211> 1263

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1263)

<400> 30

<210> 31

<211> 420

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 31

<210> 32

<211> 1265

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 大腸桿菌二胺庚二酸去羧苷LysA密碼子最佳化基因

<400> 32

<210> 33

<211> 1692

<212> DNA

<213> 釀酒酵母

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1692)

<400> 33

<210> 34

<211> 563

<212> PRT

<213> 釀酒酵母

<400> 34

<210> 35

<211> 1692

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 釀酒酵母丙酮酸去羧苷Pdc密碼子最佳化基因

<400> 35

<210> 36

<211> 1707

<212> DNA

<213> 活動發酵單胞菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1707)

<400> 36

<210> 37

<211> 568

<212> PRT

<213> 活動發酵單胞菌

<400> 37

<210> 38

<211> 1707

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 活動發酵單胞菌丙酮酸去羧苷PdcI472A密碼子最佳化基因

<400> 38

<210> 39

<211> 1644

<212> DNA

<213> 乳酸乳球菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1644)

<400> 39

<210> 40

<211> 547

<212> PRT

<213> 乳酸乳球菌

<400> 40

<210> 41

<211> 1644

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 乳酸乳球菌分支鏈α酮酸去羧苷KdcA密碼子最佳化基因

<400> 41

<210> 42

<211> 1647

<212> DNA

<213> 乳酸乳球菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1647)

<400> 42

<210> 43

<211> 548

<212> PRT

<213> 乳酸乳球菌

<400> 43

<210> 44

<211> 1647

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 乳酸乳球菌α酮異戊酸去羧苷KivD密碼子最佳化基因

<400> 44

<210> 45

<211> 3696

<212> DNA

<213> 結核分枝桿菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3696)

<400> 45

<210> 46

<211> 1231

<212> PRT

<213> 結核分枝桿菌

<400> 46

<210> 47

<211> 3696

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 結核分枝桿菌α酮戊二酸去羧苷KgD密碼子最佳化基因

<400> 47

<210> 48

<211> 74

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 用於枯草桿菌轉胺苷x之擴增之正錄引子

<400> 48

<210> 49

<211> 62

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 用於枯草桿菌轉胺苷x之擴增之反錄引子

<400> 49

<210> 50

<211> 82

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 用於枯草桿菌轉胺苷y之擴增之正錄引子

<400> 50

<210> 51

<211> 57

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 用於枯草桿菌轉胺苷y之擴增之反錄引子

<400> 51

<210> 52

<211> 64

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 用於球狀紅桿菌轉胺苷之擴增之正錄引子

<400> 52

<210> 53

<211> 51

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 用於球狀紅桿菌轉胺苷之擴增之反錄引子

<400> 53

<210> 54

<211> 78

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 用於嗜肺性退伍軍人症菌轉胺苷之擴增之正錄引子

<400> 54

<210> 55

<211> 67

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 用於嗜肺性退伍軍人症菌轉胺苷之擴增之反錄引子

<400> 55

<210> 56

<211> 76

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 用於歐洲亞硝酸菌轉胺苷之擴增之正錄引子

<400> 56

<210> 57

<211> 50

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 用於歐洲亞硝酸菌轉胺苷之擴增之反錄引子

<400> 57

<210> 58

<211> 79

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 用於淋病奈瑟氏菌轉胺苷之擴增之正錄引子

<400> 58

<210> 59

<211> 56

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 用於淋病奈瑟氏菌轉胺苷之擴增之反錄引子

<400> 59

<210> 60

<211> 66

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 用於綠膿桿菌轉胺苷之擴增之正錄引子

<400> 60

<210> 61

<211> 53

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 用於綠膿桿菌轉胺苷之擴增之反錄引子

<400> 61

<210> 62

<211> 67

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 用於沼澤紅假單胞菌轉胺苷之擴增之正錄引子

<400> 62

<210> 63

<211> 51

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 用於沼澤紅假單胞菌轉胺苷之擴增之反錄引子 aminotransferase

<400> 63

<210> 64

<211> 1353

<212> DNA

<213> 枯草桿菌轉胺苷基因(gi16077991)

<400> 64

<210> 65

<211> 450

<212> PRT

<213> 枯草桿菌轉胺苷(gi16077991)之胺基酸序列

<400> 65

<210> 66

<211> 1407

<212> DNA

<213> 綠膿桿菌轉胺苷基因(seq ID gi9951072)

<400> 66

<210> 67

<211> 468

<212> PRT

<213> 綠膿桿菌轉胺苷(seq ID gi9951072)之胺基酸序列

<400> 67

<210> 68

<211> 1335

<212> DNA

<213> 綠膿桿菌轉胺苷基因(seq ID gi9951630)

<400> 68

<210> 69

<211> 444

<212> PRT

<213> 綠膿桿菌轉胺苷(seq ID gi9951630)之胺基酸序列

<400> 69

<210> 70

<211> 71

<212> DNA

<213> 用於枯草桿菌轉胺苷(gi16077991)之擴增之正錄引子

<400> 70

<210> 71

<211> 65

<212> DNA

<213> 用於枯草桿菌轉胺苷(gi16077991)之擴增之反錄引子

<400> 71

<210> 72

<211> 66

<212> DNA

<213> 用於綠膿桿菌轉胺苷(gi9951072)之擴增之正錄引子

<400> 72

<210> 73

<211> 48

<212> DNA

<213> 用於綠膿桿菌轉胺苷(gi9951072)之擴增之反錄引子

<400> 73

<210> 74

<211> 69

<212> DNA

<213> 用於綠膿桿菌轉胺苷(gi9951630)之擴增之正錄引子

<400> 74

<210> 75

<211> 49

<212> DNA

<213> 用於綠膿桿菌轉胺苷(gi9951630)之擴增之反錄引子

<400> 75

<210> 76

<211> 57

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 正錄引子

<400> 76

<210> 77

<211> 32

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反錄引子

<400> 77

<210> 78

<211> 58

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 正錄引子

<400> 78

<210> 79

<211> 37

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反錄引子

<400> 79

<210> 80

<211> 57

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 正錄引子

<400> 80

<210> 81

<211> 35

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反錄引子

<400> 81

<210> 82

<211> 52

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 正錄引子

<400> 82

<210> 83

<211> 37

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反錄引子

<400> 83

3

105

Claims

一種重組宿主細胞，其包含編碼具有α-酮庚二酸去羧酶活性之酶的核酸序列及/或編碼具有5-甲醯戊酸轉胺酶活性之酶的核酸序列，其中該具有α-酮庚二酸去羧酶活性之酶是選自於去羧酶(EC 4.1.1)之群組，且其中該具有5-甲醯戊酸轉胺酶活性之酶是選自於轉胺酶(E.C.2.6.1)之群組。
如請求項1之重組宿主細胞，其中該具有5-甲醯戊酸轉胺酶活性之酶是選自於β-胺異丁酸：α-酮戊二酸轉胺酶、β-丙胺酸轉胺酶、天冬酸轉胺酶、4-胺丁酸轉胺酶(EC 2.6.1.19)、L-離胺酸6-轉胺酶(EC 2.6.1.36)、2-胺己二酸轉胺酶(EC 2.6.1.39)、5-胺戊酸轉胺酶(EC 2.6.1.48)、2-胺己酸轉胺酶(EC 2.6.1.67)、離胺酸：丙酮酸6-轉胺酶(EC 2.6.1.71)、丙胺酸轉胺酶(EC 2.6.1.2)、白胺酸轉胺酶(EC 2.6.1.6)、丙胺酸-酮酸轉胺酶(EC 2.6.1.12)、β-丙胺酸-丙酮酸轉胺酶(EC 2.6.1.18)、(S)-3-胺-2-甲基丙酸轉胺酶(EC 2.6.1.22)及L,L-二胺庚二酸轉胺酶(EC 2.6.1.83)之群組。
如請求項1之重組宿主細胞，其中該具有5-甲醯戊酸轉胺酶活性之酶包含根據序列ID 2、序列ID 5、序列ID 8、序列ID 65、序列ID 67、序列ID 69或其同系物的胺基酸序列。
如請求項1至3中任一項之重組宿主細胞，其中該具有α- 酮庚二酸去羧酶活性之酶是選自於草醯乙酸去羧酶(EC 4.1.1.3)、二胺庚二酸去羧酶(EC 4.1.1.20)、分支鏈α-酮酸去羧酶(EC 4.1.1.72)、α-酮異戊酸去羧酶、α-酮戊二酸去羧酶(EC 4.1.1.71)、丙酮酸去羧酶(EC 4.1.1.1)、草酸去羧酶(EC 4.1.1.2)、乙醯乙酸去羧酶(EC 4.1.1.4)、纈胺酸去羧酶/白胺酸去羧酶(EC 4.1.1.14)、麩胺酸去羧酶(EC 4.1.1.15)、天冬酸1-去羧酶(EC 4.1.1.11)、3-羥麩胺酸去羧酶(EC 4.1.1.16)、鳥胺酸去羧酶(EC 4.1.1.17)、離胺酸去羧酶(EC 4.1.1.18)、精胺酸去羧酶(EC 4.1.1.19)、2-酮戊二酸去羧酶(EC 4.1.1.71)及二胺丁酸去羧酶(EC 4.1.1.86)之群組。
如請求項1至3中任一項之重組宿主細胞，其中該具有α-酮庚二酸去羧酶活性之酶包含根據序列ID 31、序列ID 34、序列ID 37、序列ID 40、序列ID 43或序列ID 46或此等序列任一者之同系物的胺基酸序列。
一種有用於製備6-胺己酸的重組宿主細胞，其包含編碼具有α-酮庚二酸轉胺酶活性之酶或具有α-酮庚二酸去氫酶活性之酶的核酸序列及/或編碼具有α-胺庚二酸去羧酶活性之酶的核酸序列，其中該具有α-酮庚二酸轉胺酶活性之酶是選自轉胺酶(E.C.2.6.1)之群組，其中具有α-酮庚二酸去氫酶活性之酶是選自胺基酸去氫酶(EC 1.4.1)之群組，且其中具有α-胺庚二酸去羧酶活性之酶是選自去羧酶(EC 4.1.1)之群組。
如請求項6之重組宿主細胞，其中該具有α-酮庚二酸轉胺酶活性之酶是選自於β-胺異丁酸：α-酮戊二酸轉胺酶、β-丙胺酸轉胺酶、天冬酸轉胺酶、4-胺丁酸轉胺酶(EC 2.6.1.19)、L-離胺酸6-轉胺酶(EC 2.6.1.36)、2-胺己二酸轉胺酶(EC 2.6.1.39)、5-胺戊酸轉胺酶(EC 2.6.1.48)、2-胺己酸轉胺酶(EC 2.6.1.67)、離胺酸：丙酮酸6-轉胺酶(EC 2.6.1.71)、丙胺酸轉胺酶(EC 2.6.1.2)、白胺酸轉胺酶(EC 2.6.1.6)、丙胺酸-酮酸轉胺酶(EC 2.6.1.12)、β-丙胺酸-丙酮酸轉胺酶(EC 2.6.1.18)、(S)-3-胺-2-甲基丙酸轉胺酶(EC 2.6.1.22)及L,L-二胺庚二酸轉胺酶(EC 2.6.1.83)之群組。
如請求項6之重組宿主細胞，其中該具有α-酮庚二酸轉胺酶活性之酶包含根據序列ID 2、序列ID 8、序列ID 12、序列ID 15、序列ID 17、序列ID 19、序列ID 21、序列ID 23、序列ID 25、序列ID 27、序列ID 29或其同系物的胺基酸序列。
如請求項6之重組宿主細胞，其中該具有α-酮庚二酸去氫酶活性之酶是選自於二胺庚二酸去氫酶(EC 1.4.1.16)、麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.3；EC 1.4.1.4)、白胺酸去氫酶(EC 1.4.1.9)、以NAD或NADP作為受體發揮作用之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.3)、以NADP作為受體發揮作用之麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.4)、白胺酸去氫酶(EC 1.4.1.9)及二胺庚二酸去氫酶(EC 1.4.1.16)之群組。
如請求項6之重組宿主細胞，其中該具有α-胺庚二酸去羧酶活性之酶是選自於草醯乙酸去羧酶(EC 4.1.1.3)、二胺庚二酸去羧酶(EC 4.1.1.20)、分支鏈α-酮酸去羧酶(EC 4.1.1.72)、α-酮異戊酸去羧酶、α-酮戊二酸去羧酶(EC 4.1.1.71)、丙酮酸去羧酶(EC 4.1.1.1)、草酸去羧酶(EC 4.1.1.2)、乙醯乙酸去羧酶(EC 4.1.1.4)、纈胺酸去羧酶/白胺酸去羧酶(EC 4.1.1.14)、麩胺酸去羧酶(EC 4.1.1.15)、天冬酸1-去羧酶(EC 4.1.1.11)、3-羥麩胺酸去羧酶(EC 4.1.1.16)、鳥胺酸去羧酶(EC 4.1.1.17)、離胺酸去羧酶(EC 4.1.1.18)、精胺酸去羧酶(EC 4.1.1.19)、2-酮戊二酸去羧酶(EC 4.1.1.71)、及二胺丁酸去羧酶(EC 4.1.1.86)之群組。
如請求項1至3及6至10中任一項之重組宿主細胞，其進一步包含一或多個編碼一或多種酶的核酸序列，該一或多種酶能夠催化由α-酮戊二酸製備α-酮庚二酸中之至少一個反應步驟，其中該至少一個反應步驟包含α-酮戊二酸之C₁-延長成為α-酮己二酸。
如請求項4之重組宿主細胞，其進一步包含一或多個編碼一或多種酶的核酸序列，該一或多種酶能夠催化由α-酮戊二酸製備α-酮庚二酸中之至少一個反應步驟，其中該至少一個反應步驟包含α-酮戊二酸之C₁-延長成為α-酮己二酸。
如請求項5之重組宿主細胞，其進一步包含一或多個編碼一或多種酶的核酸序列，該一或多種酶能夠催化由α-酮戊二酸製備α-酮庚二酸中之至少一個反應步驟，其中該至少一個反應步驟包含α-酮戊二酸之C₁-延長成為α- 酮己二酸。
如請求項13之重組宿主細胞，其中能夠催化由α-酮戊二酸製備α-酮庚二酸中之至少一個反應步驟的該一或多種酶為AksA酶、AksD酶、AksE酶、AksF酶或其同系物。
如請求項14之重組宿主細胞，其中能夠催化由α-酮戊二酸製備α-酮庚二酸中之至少一個反應步驟的該一或多種酶是選自甲烷球菌屬(Methanococcus)、甲烷暖球菌屬(Methanocaldococcus)、甲烷八聯球菌屬(Methanosarcina)、甲烷熱桿菌屬(Methanothermobacter)、甲烷球菌屬(Methanosphaera)、甲烷古菌屬(Methanopyrus)及甲烷短桿菌(Methanobrevibacter)的甲烷產生性古菌。
如請求項1至3、6至10、及12至15中任一項之重組宿主細胞，其中該宿主細胞是選自麴菌屬(Aspergillus)、青黴屬(Penicillium)、酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)及埃希氏菌屬(Escherichia)之群組。
如請求項4之重組宿主細胞，其中該宿主細胞是選自麴菌屬、青黴屬、酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、芽胞桿菌屬、棒桿菌屬及埃希氏菌屬之群組。
如請求項5之重組宿主細胞，其中該宿主細胞是選自麴菌屬、青黴屬、酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、芽胞桿菌屬、棒桿菌屬及埃希氏菌屬之群組。
如請求項11之重組宿主細胞，其中該宿主細胞是選自麴菌屬、青黴屬、酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、芽胞桿菌屬、棒桿菌屬及埃希氏菌屬之群組。
如請求項1至3、6至10、12至15及17至19中任一項之重組宿主細胞，其包含含有一核酸序列的DNA，該核酸序列是選自由選自下列之群組的任何序列所表示之序列的群組：序列ID 1、序列ID 3、序列ID 4、序列ID 6、序列ID 7、序列ID 11、序列ID 13、序列ID 14、序列ID 16、序列ID 18、序列ID 20、序列ID 22、序列ID 24、序列ID 26、序列ID 28、序列ID 30、序列ID 32、序列ID 33、序列ID 35、序列ID 36、序列ID 38、序列ID 39、序列ID 41、序列ID 42、序列ID 44、序列ID 45、序列ID 47、序列ID 64、序列ID 66、序列ID 68及其等之功能類似物。
如請求項4之重組宿主細胞，其包含含有一核酸序列的DNA，該核酸序列是選自由選自下列之群組的任何序列所表示之序列的群組：序列ID 1、序列ID 3、序列ID 4、序列ID 6、序列ID 7、序列ID 11、序列ID 13、序列ID 14、序列ID 16、序列ID 18、序列ID 20、序列ID 22、序列ID 24、序列ID 26、序列ID 28、序列ID 30、序列ID 32、序列ID 33、序列ID 35、序列ID 36、序列ID 38、序列ID 39、序列ID 41、序列ID 42、序列ID 44、序列ID 45、序列ID 47、序列ID 64、序列ID 66、序列ID 68及其等之功能類似物。
如請求項5之重組宿主細胞，其包含含有一核酸序列的DNA，該核酸序列是選自由選自下列之群組的任何序列所表示之序列的群組：序列ID 1、序列ID 3、序列ID 4、序列ID 6、序列ID 7、序列ID 11、序列ID 13、序列ID 14、序列ID 16、序列ID 18、序列ID 20、序列ID 22、序列ID 24、序列ID 26、序列ID 28、序列ID 30、序列ID 32、序列ID 33、序列ID 35、序列ID 36、序列ID 38、序列ID 39、序列ID 41、序列ID 42、序列ID 44、序列ID 45、序列ID 47、序列ID 64、序列ID 66、序列ID 68及其等之功能類似物。
如請求項11之重組宿主細胞，其包含含有一核酸序列的DNA，該核酸序列是選自由選自下列之群組的任何序列所表示之序列的群組：序列ID 1、序列ID 3、序列ID 4、序列ID 6、序列ID 7、序列ID 11、序列ID 13、序列ID 14、序列ID 16、序列ID 18、序列ID 20、序列ID 22、序列ID 24、序列ID 26、序列ID 28、序列ID 30、序列ID 32、序列ID 33、序列ID 35、序列ID 36、序列ID 38、序列ID 39、序列ID 41、序列ID 42、序列ID 44、序列ID 45、序列ID 47、序列ID 64、序列ID 66、序列ID 68及其等之功能類似物。
如請求項16之重組宿主細胞，其包含含有一核酸序列的DNA，該核酸序列是選自由選自下列之群組的任何序列所表示之序列的群組：序列ID 1、序列ID 3、序列ID 4、序列ID 6、序列ID 7、序列ID 11、序列ID 13、序列ID 14、序列ID 16、序列ID 18、序列ID 20、序列ID 22、序列ID 24、序列ID 26、序列ID 28、序列ID 30、序列ID 32、序列ID 33、序列ID 35、序列ID 36、序列ID 38、序列ID 39、序列ID 41、序列ID 42、序列ID 44、序列ID 45、序列ID 47、序列ID 64、序列ID 66、序列ID 68及其等之功能類似物。