EA019163B1 - ПОЛУЧЕНИЕ 6-АМИНОКАПРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ α-КЕТОПИМЕЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ - Google Patents

Abstract

Это изобретение относится к способу получения 6-аминокапроновой кислоты (далее называемой здесь "6-АСА") с использованием биокатализатора. Кроме того, это изобретение относится к способу получения ε-капролактама (далее называемого здесь "капролактамом") циклизацией такой 6-АСА. Кроме того, это изобретение относится к клетке-хозяину, микроорганизму или полинуклеотиду, которые могут быть использованы в получении 6-АСА или капролактама.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Это изобретение относится к способу получения 6-аминокапроновой кислоты (далее называемой 6-АСА). Это изобретение относится также к способу получения ε-капролактама (далее называемого капролактамом) из 6-АСА. Кроме того, это изобретение относится к клетке-хозяину, которая может быть использована в получении 6-АСА или капролактама.

Сведения о предшествующем уровне техники

Капролактам является лактамом, который может быть использован для получения полиамида, например найлона-6 или найлона-6,12 (сополимера капролактама и лауролактама). Различные способы получения капролактама из химикалиев органического синтеза известны в данной области и включают в себя получение капролактама из циклогексанона, толуола, фенола, циклогексанола, бензола или циклогексана. Эти промежуточные соединения получают обычно из минерального масла. Ввиду растущей потребности получения материалов с использованием более длительно поддерживаемой технологии было бы желательным обеспечение способа, в котором капролактам получают из промежуточного соединения, которое может быть получено из биологически возобновляемого источника или по меньшей мере из одного промежуточного соединения, которое превращается в капролактам при помощи биохимического способа. Кроме того, было бы желательным обеспечение способа, который требует меньше энергии, чем общепринятые химические процессы, использующие органические химикалии из нефтехимического источника.

Известно получение капролактама из 6-АСА, например, как описано в И8-А 6194572. Как описано в \УО 2005/068643, 6-АСА может быть получена биохимически превращением 6-аминогекс-2-еновой кислоты (6-АНЕА) в присутствии фермента, имеющего α,β-еноатредуктазную активность. Эта 6-АНЕА может быть получена из лизина, например, биохимически или чистым химическим синтезом. Хотя получение 6-АСА через восстановление 6-АНЕА осуществимо способами, описанными в \УО 2005/068643, авторы изобретения обнаружили, что - при условиях реакции восстановления - 6-АНЕА может самопроизвольно и, по существу, необратимо циклизоваться с образованием нежелательного побочного продукта, в особенности β-гомопролина. Эта циклизация может быть узким местом в получении 6-АСА и может приводить к значительной потере выхода.

Целью этого изобретения является обеспечение нового способа получения 6-АСА или капролактама, который может быть, ш1ет аба, использован для получения полиамида или промежуточного соединения для получения 6-АСА или капролактама, который может служить в качестве альтернативы известным способам.

Следующей целью является обеспечение нового способа, который мог бы преодолеть один или несколько упомянутых выше недостатков.

Одна или несколько дополнительных задач, которые могут быть решены в соответствии с этим изобретением, будут вытекать из приведенного ниже описания.

В настоящее время была обнаружена возможность получения 6-АСА из конкретного исходного соединения, а именно была обнаружена возможность получения 6-аминокапроновой кислоты (6-АСА), причем эту 6-аминокапроновую кислоту получают из 2-оксогептандиовой кислоты, также известной как α-кетопимелиновая кислота (АКР). В частности, обеспечен способ, в котором АКР сначала превращается в 5-формилпентаноат (5-формилвалериановую кислоту, 5-ЕУА), который превращается в 6-АСА. Кроме того, обеспечен способ, в котором АКР сначала превращается в альфа-аминопимелиновую кислоту (ААР). После этого ААР превращается в 6-АСА.

Авторы этого изобретения ясно понимают, что, в принципе, можно получать 6-АСА из АКР полностью химическим (т.е. без применения биокатализатора) образом. Примеры подходящих химических способов проведения отдельных реакционных стадий приводятся здесь ниже. Однако авторы изобретения понимают также, что можно получать 6-АСА биохимически из АКР.

Сущность изобретения

Таким образом, данное изобретение относится, в частности, к способу получения 6-АСА, в котором 6-АСА получают из АКР с использованием по меньшей мере одного биокатализатора.

Кроме того, это изобретение относится к способу, в котором 6-АСА получают из 5формилпентаноата (5-формилвалериановой кислоты, 5-ЕУА) с использованием биокатализатора. Как указано выше, 5-ЕУА может быть получен из АКР.

В одном варианте осуществления 6-АСА, полученную в способе этого изобретения, используют для получения капролактама. Такой способ предусматривает циклизацию 6-аминокапроновой кислоты, необязательно в присутствии биокатализатора.

При ссылке здесь на карбоновые кислоты или карбоксилаты, например 6-АСА, 2аминогептандиовую кислоту (α-аминопимелиновую кислоту, сокращаемую здесь далее как ААР), другую аминокислоту, 5-ЕУА или АКР, имеется в виду, что эти термины включают в себя протонированную группу карбоновой кислоты (т.е. нейтральную группу), их соответствующий карбоксилат (их конъюгированные основания), а также их соли. При ссылке здесь на аминокислоты, например 6-АСА, имеется в виду, что этот термин включает в себя аминокислоты в их цвиттерионной форме (в которой аминогруппа

- 1 019163 находится в протонированной, а карбоксилатная группа находится в депротонированной форме), аминокислоту, в которой аминогруппа является протонированной, а карбоксильная группа находится в ее нейтральной форме, и аминокислоту, в которой аминогруппа находится в ее нейтральной форме, а карбоксилатная группа находится в депротонированной форме, а также их соли.

Согласно этому изобретению в отношении нежелательной циклизации промежуточного продукта при образовании 6-АСА и необязательно капролактама не были замечены никакие проблемы, приводящие к потере выхода.

Представляется, что способ этого изобретения позволит получать сравнимый или даже лучший выход, чем способ, описанный в νθ 2005/68643. Представляется, что способ этого изобретения может быть, в частности, предпочтительным при использовании живого организма - в частности, в способе, в котором рассматривается выращивание и поддержание этого организма.

Кроме того, представляется, что в одном варианте осуществления этого изобретения может быть улучшен выход образованного 6-АСА (в г/л-ч) в способе этого изобретения.

Термин или определен в данном контексте как и/или, если нет другого указания.

Неопределенный артикль а или ап в данном контексте обозначает по меньшей мере один, если нет другого указания.

При ссылке на имя существительное (например, соединение, добавка и т.д.) в единственном числе, имеется в виду, что включено и множественное число.

При ссылке на соединение, которое имеет стереоизомеры, это соединение может быть любым из таких стереоизомеров или их комбинацией. Таким образом, при ссылке, например, на аминокислоту, которая имеет энантиомеры, эта аминокислота может быть Ь-энантиомером, Ό-энантиомером или их комбинацией. В случае существования природных стереоизомеров, это соединение является предпочтительно природным стереоизомером.

При упоминании фермента со ссылкой на класс фермента (ЕС) между скобками, этот класс фермента является классом, в котором этот фермент классифицирован или может быть классифицирован, на основе номенклатуры ферментов, предложенной Комитетом по номенклатуре Международного союза биохимии и молекулярной биологии (ΝΟ-ΐυΒΜΒ), причем номенклатура может быть найдена в 1и1р://\у\у\у.с11ст.щпи1.ас.ик/ц.|ЬтЬ/спхутс/. Предполагается, что включены также другие подходящие ферменты, которые (еще) не были классифицированы в указанном классе, но могут быть классифицированы как таковые.

Термин гомолог используется в данном контексте, в частности, для полинуклеотидов или полипептидов, имеющих идентичность по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, в частности по меньшей мере 85%, более конкретно по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99%. Имеется в виду, что термин гомолог включает в себя также последовательности нуклеиновых кислот (полинуклеотидные последовательности), которые отличаются от другой последовательности нуклеиновой кислоты вследствие вырожденности генетического кода и кодируют одну и ту же полипептидную последовательность.

Идентичность или сходство последовательностей определено здесь как родство между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более последовательностями, определяемое сравнением этих последовательностей. Обычно, идентичности или сходства последовательностей сравнивают на протяжении полной длины этих последовательностей, однако, иногда они могут также сравниваться только для части последовательностей, сопоставленных друг с другом. В данной области, идентичность или сходство означает также степень родства последовательностей между полипептидными последовательностями или последовательностями нуклеиновых кислот, в зависимости от обстоятельств, определяемую по совпадению между такими последовательностями. Предпочтительные способы для определения идентичности или сходства созданы для получения наивысшего совпадения между тестируемыми последовательностями. В контексте этого изобретения предпочтительный способ компьютерной программы для определения идентичности и сходства между двумя последовательностями включает в себя ВЬАЗТР и ΒΕΑ8ΤΝ (А118сйи1, 8.Е. е! а1., 1. Μοί. ΒίοΙ. 1990, 215, 403-410, доступный публично из ΝΟΒΙ и других источников (ΒΕΑ8Τ Мапиа1, Л115сНи1. 8., е! а1., ΝΟΒΙ ΝΕΜ ΝΙΗ Βеΐйе8άа, ΜΌ 20894). Предпочтительными параметрами для сравнения полипептидных последовательностей с использованием ΒΕΑ8ΤΡ являются открытие бреши 10,0, удлинение бреши 0,5, матрица Β1θ5ΐ.ιιη 62. Предпочтительными параметрами для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот с использованием ΒΕΑ8ΤΝ являются открытие бреши 10,0, удлинение бреши 0,5, полная матрица ДНК (матрица идентичности ДНК).

Согласно этому изобретению используется биокатализатор, т.е. по меньшей мере одна стадия реакции в этом способе катализируется биологическим материалом или молекулярной частицей, происходящей из биологического источника, например организма, или биомолекулы, происходящей из него. Этот

- 2 019163 биокатализатор может, в частности, содержать один или несколько ферментов. Биокатализатор может быть использован в любой форме. В одном варианте осуществления используют один или несколько ферментов, выделенных из природного окружения (выделенных из организма, в котором он был продуцирован), например, в виде раствора, эмульсии, дисперсии, (суспензии) лиофилизированных клеток, в виде лизата, или иммобилизованных на носителе. В одном варианте осуществления один или несколько ферментов образуют часть живого организма (например, живые целые клетки).

Эти ферменты могут выполнять каталитическую функцию в этой клетке. Возможно также, что этот фермент может секретироваться в среду, в которой присутствуют эти клетки.

Живые клетки могут быть растущими клетками, покоящимися клетками или клетками в фазе Со (например, спорами) или клетками в стационарной фазе. Можно также использовать ферментобразующую часть клетки с увеличенной проницаемостью (т.е. клетки, проницаемость которой увеличена субстратом для этого фермента или предшественником субстрата этого фермента или этих ферментов).

Биокатализатором, используемым в способе этого изобретения, может быть, в принципе, любой организм, или биокатализатор может быть получен из любого организма. Этот организм может быть эукариотическим или прокариотическим. В частности, этот организм может быть выбран из животных (в том числе человека), растений, бактерий, архебактерий, дрожжей и грибов.

В одном варианте осуществления биокатализатор происходит из животного, в частности из его части: например, поджелудочной железы, головного мозга, почки, сердца или другого органа. Это животное может быть, в частности, выбрано из группы, состоящей из млекопитающих, более конкретно, выбрано из группы Ьеропбае, Мипбае и Воу1бае.

Подходящие растения включают в себя, в частности, растения, выбранные из группы, состоящей из Лкр1ешит; СисигЬйасеае, в частности СигсигЬйа, например СигсигЬйа токсП-Иа (тыква), или СиеитЕ; МегсипаШ. например МегсштаНк регептак; Нубпосагрик и Сега!ои1а.

Подходящие бактерии могут быть выбраны, в частности, из группы У1Ьгю, Ркеиботопак, ВасШик, СогупеЬас!егшт, Вгеу1Ьас!егшт, Еп1егососсик, 8!гер!ососсик, К1еЬк1е11а, Ьас!ососсик, Ьас!оЬасШик, С1окРтбшт, ЕксйепсШа, Тйегтик, МусоЬас!егшт, 2утотопак, Рго!еик, ЛдгоЬас!егшт, СеоЬасШик, ЛстеЮЬас!ег, К.а1к!оша, ВйобоЬас!ег, Рагасоссик, ПоуокрЫпдоЬшт, Ыйгокотоиак, Еедюпе11а, №1ккепа, Вйоборкеиботопак, 8!арйу1ососсик, Эетососсик и 8а1топе11а.

Подходящие архебактерии могут быть выбраны, в частности, из группы Лгсйаеод1оЬик, Легоругит, На1оЬас!егшт, МеШапокагсша, Ме!йапососсик, Тйегтор1акта, РугоЬаси1ит, Ме!йапоса1бососсик, Ме!йапоЬас!егшт, МеШапокрйаега, Ме!йапоругик и Ме!йапоЬгеу1Ьас!ег.

Подходящие грибы могут быть выбраны, в частности, из группы ВЫ/орик, Ыеигокрога, РешсШшт и ЛкрегдШик.

Подходящие дрожжи могут быть выбраны, в частности, из группы Сапб1ба, Напкепи1а, К1иууеготусек и 8ассйаготусек.

Квалифицированному в данной области специалисту будет ясно, что в способе этого изобретения может применяться природный биокатализатор (дикого типа) или мутант природного биокатализатора. Свойства природного биокатализатора могут быть улучшены биологическими способами, известными квалифицированному в данной области специалисту, такими как, например, молекулярная эволюция или рациональное конструирование. Мутанты биокатализаторов дикого типа могут быть, например, изготовлены модификацией кодирующей ДНК организма, способной действовать в качестве биокатализатора или способной продуцировать биокаталитическую частицу (такую как фермент), с использованием способов мутагенеза, известных квалифицированному в данной области специалисту (случайного мутагенеза, сайт-направленного мутагенеза, направленной эволюции, рекомбинации генов и т.д.). В частности, эта ДНК может быть модифицирована таким образом, что она кодирует фермент, который отличается по меньшей мере одной аминокислотой от фермента дикого типа, так что она кодирует фермент, который содержит одну или несколько аминокислотных замен, делеций и/или инсерций в сравнении с диким типом, или таким образом, что эти мутанты объединяют последовательности двух или более исходных ферментов, или осуществлением экспрессии модифицированной таким образом ДНК в подходящей клетке-(хозяине). Последнее может достигаться способами, известными квалифицированному в данной области специалисту, такими как оптимизация кодонов или оптимизация пар кодонов, например, на основе способа, описанного в \УО 2008/000632.

Мутантный биокатализатор может иметь улучшенные свойства, например, в отношении одного или нескольких из следующих аспектов: селективности в отношении субстрата, активности, стабильности, устойчивости к растворителю, профиля рН, температурного профиля, субстратного профиля, чувствительности к ингибированию, использования кофакторов и субстратной аффинности. Мутанты с улучшенными профилями могут быть идентифицированы применением, например, способов высокопроизводительного скрининга или отбора на основе таких способов, известных квалифицированному в данной области специалисту.

При ссылке на биокатализатор, в частности фермент, из конкретного источника, рекомбинантные биокатализаторы, в частности ферменты, происходящие из первого организма, но фактически продуцируемые в (генетически модифицированном) втором организме, имеется конкретно в виду, что они вклю

- 3 019163 чают в себя биокатализаторы, в частности ферменты, из этого первого организма.

В предпочтительном способе этого изобретения это получение предусматривает биокаталитическую (обычно ферментативную) реакцию в присутствии биокатализатора, способного катализировать декарбоксилирование α-кетокислоты или аминокислоты (т.е. соединения, содержащего по меньшей мере одну группу карбоновой кислоты и по меньшей мере одну аминогруппу). Таким образом, фермент, имеющий такую каталитическую активность, может называться декарбоксилазой α-кетокислот, соответственно, декарбоксилазой аминокислот.

Указанная кислота является предпочтительно дикислотой, причем указанный биокатализатор является селективным в отношении группы кислоты, ближайшей к кето- или аминогруппе.

Обычно, подходящая декарбоксилаза имеет α-кетопимелат-декарбоксилазную активность, способную катализировать превращение АКР в 5-ЕУА, или аминопимелатдекарбоксилазную активность, способную катализировать превращение ААР в 6-АСА.

Фермент, способный декарбоксилировать α-кетокислоту или аминокислоту, может быть выбран, в частности, из группы декарбоксилаз (ЕС 4.1.1.3), предпочтительно из группы оксалоацетатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.3), диаминопимелатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.20), декарбоксилаз α-кетокислот с разветвленной цепью (ЕС 4.1.1.72), α-кетоизовалератдекарбоксилаз, α-кетоглутаратдекарбокилаз (ЕС 4.1.1.71) и пируватдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.1).

Одна или несколько подходящих декарбоксилаз могут быть выбраны из группы оксалатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.2), ацетоацетатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.4), глутаматдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.4), валиндекарбоксилаз/лейциндеарбоксилаз (ЕС 4.1.1.14), глутаматдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.15), аспартат-1декарбоксилаз (ЕС 4.1.1.11), 3-гидроксиглутаматдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.16), орнитиндекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.17), лизиндекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.18), аргининдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.19), 2оксоглутаратдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.71) и диаминобутиратдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.86).

Декарбоксилаза может быть, в частности, декарбоксилазой организма, выбранного из группы тыкв; огурцов; дрожжей; грибов, например 8ассйаготусев сегеу1в1ае, Сапб1ба Пагегк Нап5еппи1а ер., К1иууеготусев татапив, РШхорив ίηνηπίουβ и Ыеиговрога сгавва; млекопитающих, в частности, головного мозга млекопитающих и бактерий, таких как ЕвсйебсЫа сой, МусоЬасШбит 1иЬегси1ов1в, Рвеиботопав вр. и 2утотопав тоЬШв.

Пируватдекарбоксилаза может происходить из 8ассйаготусев сегеу1в1ае или 2утотопав тоЬШв. В частности, может быть использован мутант Ι472Α из 2утотопав тоЬШв.

Могут быть использованы глутаматдекарбоксилаза, диаминопимелатдекарбоксилаза или аспартатдекарбоксилаза из ЕвсйебсЫа сой (Е. сой).

Могут быть использованы глутаматдекарбоксилаза из Ыеиговрога сгавва, МусоЬасШбит 1ергае, С1овйгбшт рег£г1пдеи5, Ьас1оЬасШив Ьгеу1в, МусоЬасШгшт ШЬегсиШв1в, 81гер1ососсив или ЬасШсоссив. Примеры видов ЬасШсоссив, из которых может происходить глутаматдекарбоксилаза, включают в себя, в частности, ЬасШсоссив 1асйв, такой как штамм ЬасШсоссив 1асйв В1157, ЬасШсоссив 1асйв 1ЕРЬ730, более конкретно ЬасШсоссив 1асйв гаг. шаШдепев (ранее называемый 81герШсоссив 1асйв гаг. таШдепев).

В частности, может быть использована оксалоацетатдекарбоксилаза из Рвеиботопав.

Может быть использована декарбоксилаза альфа-кетокислот с разветвленной цепью из ЬасШсоссив 1асйв. Более конкретно, может быть использована альфа-кетоизовалератдекарбоксилаза из ЬасШсоссив 1асйв.

В частности, может быть использована альфа-кетоглутаратдекарбоксилаза из МусоЬасШгшт ШЬегси1ов1в.

В предпочтительном способе этого изобретения, получение 6-АСА предусматривает ферментативную реакцию в присутствии фермента, способного катализировать реакцию переаминирования в присутствии донора аминогруппы, выбранного из группы аминотрансфераз (ЕС 2.6.1).

Обычно, подходящая аминотрансфераза имеет активность аминотрансферазы 6-аминокапроновой кислоты, способную катализировать превращение 5-ЕУА в 6-АСА, или а-аминопимелат-2аминотрансферазную активность, способную катализировать превращение АКР в ААР.

Эта аминотрансфераза может, в частности, быть выбрана из группы в-аминоизобутират:акетоглутарат-аминотрансфераз, β-аланин-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.19), Ь-лизин-6-аминотрансферазы (ЕС 2.6.1.36), 2-аминоадипат-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.39), 5-аминовалерат-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.48), 2-аминогексаноат-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.67) и лизин:пируват-6-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.71).

В одном варианте осуществления аминотрансфераза может быть выбрана из группы аланинаминотрансфераз (ЕС 2.6.1.2), лейцин-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.6), аланин-оксокислотааминотрансфераз (ЕС 2.6.1.12), β-аланин-пируват-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.18), (8)-3-амино-2метилпропионат-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.22), Ь,Ь-диаминопимелат-аминотрансферазы (ЕС 2.6.1.83).

Аминотрансфераза может быть, в частности, выбрана из аминотрансфераз из млекопитающего; МегсшгаИв, в частности Мегсшгайв ре^еии^в, более конкретно из побегов Мегсшгайв регепшв; Авр1ешит, более конкретно Авр1ешит иш1а1ега1е или Авр1ешит верШп1гюпа1е; СегаШша, более конкретно СегаШша

- 4 019163 кШциа; ЯйобоЬас1ег, более конкретно Р1юбоЬас1ег крйаегоШек, 81арйу1ососсик, более конкретно 81арйу1ососсик аигеик; У1Ьпо, более конкретно УШпо ίΐυνίηΐίκ; Ркеиботопак, более конкретно Ркеиботопак аегищпока; ЯНоборкеикотопак; ВасШик, более конкретно ВасШик ^еШепк1ерйапепк1к и ВасШик киЫШк; Ьедюпе11а; Ыйтокотак; №ккепа; или дрожжей, в частности, 8ассйатотусек сегеу1к1ае.

В случае, когда этот фермент является ферментом млекопитающего, он может, в частности, происходить из почки млекопитающего, из печени млекопитающего, из сердца млекопитающего или из головного мозга млекопитающего. Например, подходящий фермент может быть выбран из группы βаминоизобутират:а-кетоглутарат-аминотрансферазы из почки млекопитающего, в частности, βаминоизобутират:а-кетоглутарат-аминотрансферазы из почки свиньи; β-аланин-аминотрансферазы из печени млекопитающего, в частности β-аланин-аминотрансферазы из печени кролика; аспартатаминотрансфераз из сердца млекопитающего; в частности аспартат-аминотрансферазы из сердца свиньи; 4-аминобутират-аминотрансферазы из печени свиньи; 4-аминобутират-аминотрансферазы из головного мозга млекопитающего, в частности 4-аминобутират-аминотрансферазы из головного мозга человека, свиньи или крысы; α-кетоадипат-глутамин-аминотрансферазы из Ыеигокрога, в частности αкетоадипат:глутамат-аминотрансферазы из Ыеигокрота сгокка; 4-аминобутират-аминотрансферазы из Е. сой или α-аминоадипат-аминотрансферазы из ТНегтпк. в частности, а-аминоадипат-аминотрансферазы из ТНегтпк ШетторНПик, и 5-аминовалерат-аминотрансферазы из С1ок1пбшт, в частности, из С1ок1пШит атШоуа1епсит. Подходящая 3-аминоадипат-аминотрансфераза может быть, например, обеспечена РугоЬаси1ит 1к1апб1сит.

В частности, донор аминогруппы может быть выбран из группы, состоящей из аммиака, ионов аммония, аминов и аминокислот. Подходящие амины является первичными аминами и вторичными аминами. Аминокислота может иметь Ό- или Ь-конфигурацию. Примерами доноров аминогруппы являются аланин, глутамат, изопропиламин, 2-аминобутан, 2-аминогептан, фенилметанамин, 1-фенил-1аминоэтан, глутамин, тирозин, фенилаланин, аспартат, β-аминоизобутан, β-аланин, 4-аминобутират и αаминоадипат.

В следующем предпочтительном варианте осуществления, способ получения 6-АСА предусматривает биокаталитическую реакцию в присутствии фермента, способного катализировать реакцию восстановительного аминирования в присутствии источника аммиака, выбранного из группы, состоящей из оксидоредуктаз, действующих на СН-НН₂-группу доноров (ЕС 1.4), в частности, из группы дегидрогеназ аминокислот (ЕС 1.4.1). Обычно, подходящая дегидрогеназа аминокислот имеет активность дегидрогеназы 6-аминокапроновой кислоты, катализирующую превращение 5-ЕУА в 6-АСА, или имеет αаминопимелат-2-дегидрогеназную активность, катализирующую превращение АКР в ААР. В частности, подходящая аминокислота-дегидрогеназа может быть выбрана из группы, состоящей из диаминопимелатдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.16), лизин-6-дегидрогеназ (ЕС 1.4.1.18), глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.3; ЕС

1.4.1.4) и лейциндегидрогеназ (ЕС 1.4.1.9).

В одном варианте осуществления дегидрогеназ аминокислот может быть выбрана из дегидрогеназ аминокислот, классифицированных как глутаматдегидрогеназы, действующие с НАД или НАДФ в качестве акцептора (ЕС 1.4.1.3), глутаматдегидрогеназ, действующих с НАДФ в качестве акцептора (ЕС

1.4.1.4) , лейциндегидрогеназ (ЕС 1.4.1.9), диаминопимелатдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.16) и лизин-6дегидрогеназ (ЕС 1.4.1.18).

Дегидрогеназа аминокислот может, в частности, происходить из организма, выбранного из группы, состоящей из СогупеЬаЫепит, в частности СогупеЬаЫепит д1и1ат1сит; Рго1еик, в частности Рто1еик уи1даг1к; АдтоЬаЫепит, в частности АдгоЬаЫепит ЫтеГааепк; СеоЬасШик, в частности СеоЬасШик к1еатоШегторЫ1ик; Асте1оЬас1ег, в частности Асте1оЬас1ег кр. АЭР1; Яа1к1оша, в частности Яа1к1оп1а ко1апасеагит; 8а1топе11а, в частности, 8а1топе11а 1ур1птипит; 8ассНаготусек, в частности 8ассНаготусек сегеу1к1ае; ВтеуШаЫепит, в частности ВгеуШаЫепит Даулт; и ВасШик, в частности ВасШик крйаепсик, ВасШик сегеик или ВасШик киЫШк. Например, подходящая дегидрогеназа аминокислот может быть выбрана из диаминопимелатдегидрогеназ из ВасШик, в частности ВасШик крйаепсик; диаминопимелатдегидрогеназ из Вгеу1Ьас1епит кр.; диаминопимелатдегидрогеназ из СогупеЬаЫепит, в частности диаминопимелатдегидрогеназ из СогупеЬаЫепит д1и1ат1сит; диаминопимелатдегидрогеназ из Рто1еик, в частности диаминопимелатдегидрогеназы из Рто1еик ул1дапк; лизин-6-дегидрогеназ из АдтоЬаЫепит, в частности, АдтоЬаЫепит ШтеГаЫепк, лизин-6-дегидрогеназ из СеоЬасШик, в частности из СеоЬасШик к1еагоШегторЫ1ик; глутаматдегидрогеназ, действующих с НАДН или НАДФН в качестве кофактора (ЕС 1.4.1.3), из Асте1оЬаЫет, в частности глутаматдегидрогеназ из Асте1оЬаЫет кр. АЭР1; глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.3) из Яа1к1оша, в частности глутаматдегидрогеназ из Яа1к1оша ко1апасеагит; глутаматдегидрогеназ, действующих с НАДФН в качестве кофактора (ЕС 1.4.1.4), из 8а1топе11а, в частности глутаматдегидрогеназ из 8а1топе11а 1ур1птипит; глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.4) из 8ассйатотусек, в частности глутаматдегидрогеназ из 8ассйатотусек сегеу1к1ае; глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.4) из Втеу1Ьас1епит, в частности глутаматдегидрогеназ из ВгеуШаЫепит Пауит; и лейциндегидрогеназ из ВасШик, в частности лейциндегидрогеназ из ВасШик сегеик или ВасШик киЫШк.

В одном конкретном варианте осуществления АКР биокаталитически превращают в 5

- 5 019163 формилпентаноат (5-РУА) в присутствии декарбоксилазы или другого биокатализатора, катализирующего такое превращение. Декарбоксилаза, используемая в соответствии этим изобретением, может быть, в частности, выбрана из группы декарбоксилаз α-кетокислот из Ьас1ососсиз ΙαοΙίδ. Ьас1ососсиз 1асйз уаг. таШдепез или Ьас1ососсиз 1асйз зиЬзр. сгетопз; декарбоксилаз α-кетокислот с разветвленной цепью из штамма Ьас1ососсиз 1асйз В1157 или Ьас1ососсиз 1асйз 1РРБ730; пируватдекарбоксилаз из 8ассйаготусез ссгсуыас, Сапб1ба Нагей, 2утотопаз тоЬШз, Напзепи1а зр., РЫхориз Тамашси^ Ыеигозрога сгазза или К1цууеготусез татапиз; α-кетоглутаратдекарбоксилаз из МусоЬасЮгшт 1иЬегси1оз1з; глутаматдекарбоксилаз из Е. сой, ЬасЮЬасШиз Ьгеу1з, МусоЬасЫшт 1ергае, Ыеигозрога сгазза или С1оз1йбшт регГппдепз; и аспартатдекарбоксилаз из Е. сой.

В частности, было обнаружено, что декарбоксилаза из ЕзсйейсЫа сой, 2утотопаз тоЬШз, 8ассйаготусез сегеу131ае, МусоЬасЮгшт 1иЬегси1оз1з, Рзеиботопаз зресюз или Ьас1оЬасШиз 1асйз пригодна для катализа превращения АКР в 5-РУА. Более конкретно, может быть использован биокатализатор, содержащий декарбоксилазу, имеющую аминокислотную последовательность, идентифицированную как 81 У) ГО N0: 31, 81Т) ГО N0: 34, 81Т) ГО N0: 37, 81 У) ГО N0: 40, 81 У) ГО N0: 43, 81 У) ГО N0: 46, или ее гомолог. Предполагается также, что такая декарбоксилаза может быть использована для получения 6АСА из ААР.

После этого 5-РУА превращают в 6-АСА. Это может выполняться химически: 6-АСА может быть получена с высоким выходом восстановительным аминированием 5-РУА аммиаком над катализатором гидрирования, например, N1 на носителе 810₂/А1₂0₃, как описано для 9-аминононановой кислоты (9аминопеларгоновой кислоты) и 12-аминододекановой кислоты (12-аминолауриновой кислоты) в ЕР-А 628535 или ЭЕ 4322065.

Альтернативно, 6-АСА может быть получена гидрированием над Р10₂ 6-оксимокапроновой кислоты, полученной реакцией 5-РУА и гидроксиламина (см., например, Р.0. Ауогшбе, Е.У. Мша, РГО. №се1у, А.8. ^ообз, Е.0. Рисе, С.Р. Н\\аошс11а I. Ат. 011 Сйет. 8ос. 1997, 74, 531-538 для синтеза гомологичной 12-аминододекановой кислоты).

В одном варианте осуществления превращение 5-РУА в 6-АСА выполняют биокаталитически в присутствии (ΐ) донора аминогруппы и (ίί) аминотрансферазы, дегидрогеназы аминокислот или другого биокатализатора, способного катализировать такое превращение. В частности, в таком варианте осуществления аминотрансфераза может быть выбрана из группы, состоящей из аминотрансфераз из У1Ьйо Г1иу1айз, Рзеиботопаз аегидшоза, ВасШиз зиЫШз, ВасШиз тее1йепз1ерйапепз1з или ЕзсйейсЫа сой; βаминоизобутират: α-кетоглутарат-аминотрансферазы из почки свиньи; β-аланин-аминотрансферазы из печени кролика; аминотрансферазы из побегов из Мегсийайз регептаз; 4-аминобутиратаминотрансферазы из печени свиньи или из головного мозга человека, крысы или свиньи; β-аланинаминотрансферазы из печени кролика и в-лизин:а-кетоглутарат-е-аминотрансферазы. В случае использования дегидрогеназы аминокислот, такая дегидрогеназа аминокислот может быть выбрана, в частности, из группы лизин-6-дегидрогеназ из АдгоЬасЮпит иппеГасюпз или СеоЬасШиз з1еаго1йегторййиз. Другая подходящая дегидрогеназа аминокислот может быть выбрана из группы диаминопимелатдегидрогеназ из ВасШиз зрйаейсиз, Вгеу1Ьас1ейит зр., СогупеЬас1епит Дшатюит или Рго1еиз уи1дайз; из группы глутаматдегидрогеназ, действующих с НАДН или НАДФН в качестве кофактора (ЕС 1.4.1.3), из Асше1оЬас1ег зр. АЭР1 или Ра1з1оша зо1апасеагиш; из группы глутаматдегидрогеназ, действующих с НАЭРН в качестве кофактора (ЕС 1.4.1.4), из 8а1топе11а [урЫтийшп; из группы глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.4) из 8асс11аготусез сегеу1з1ае или Вгеу|Ьас1епшп йауит; или из группы лейциндегидрогеназ из ВасШиз сегеиз или ВасШиз зиЬййз.

В одном конкретном варианте осуществления превращение 5-РУА в 6-АСА катализируется биокатализатором, содержащим аминотрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность в соответствии с 81 У) ГО N0:2, 81 У) ГО N0:5, 81 У) ГО N0:8, 81 У) ГО N0:65, 81 У) ГО N0:67, 81 У) ГО N0:69, или гомолог любой из этих последовательностей.

В одном конкретном варианте осуществления, АКР химически превращают в 5-РУА. Эффективное химическое декарбоксилирование 2-кетокарбоновой кислоты в соответствующий альдегид может выполняться образованием промежуточного енамина с использованием вторичного амина, например, морфолина, при азеотропном удалении воды и одновременной потере СО₂, например, на основе способа, описанного в ТеЫайебгоп Ьей. 1982, 23(4), 459-462. После этого 5-РУА может быть биокаталитически превращен в 6-АСА переаминированием в присутствии аминотрансферазы или ферментативным восстановительным аминированием дегидрогеназой аминокислот или другим биокатализатором, способным катализировать такое превращение. Такие аминотрансфераза или дегидрогеназа аминокислот могут быть, в частности, выбраны из биокатализаторов, упомянутых выше при описании превращения 5-РУА в 6-АСА.

Альтернативно, превращение 5-РУА в 6-АСА может выполняться химическим способом, как упоминалось выше.

В одном конкретном варианте осуществления АКР биокаталитически превращают в ААР в присутствии (ί) аминотрансферазы, аминодегидрогеназы или другого биокатализатора, способного катализиро

- 6 019163 вать такое превращение, и (ίί) донора аминогруппы. Такая аминотрансфераза, используемая в соответствии с этим изобретением для превращения АКР в ААР, может быть выбрана, в частности, из аминотрансфераз из сердца свиньи; а-кетоадипат:глутамат-аминотрансфераз из Ыеигокрога сгакка или дрожжей; аминотрансферазы из побегов из Мегсийайк регептак; 4-аминобутират-аминотрансфераз из Е. сой; α-аминоадипат-аминотрансфераз из Акр1епшт кер1еп1лопа1е или Акр1епшт ип11а(ега1е и аминотрансфераз из СегаЮша кИкща.

В предпочтительном варианте осуществления аминотрансфераза для превращения АКР в ААР выбрана из группы аминотрансфераз из УФло, Ркеиботопак, ВасШик, Бещопе11а. №1ккейа, КйобоЬас1ег, ЕксйейсЫа и ВЬоборкеиботопак.

В частности, было обнаружено, что аминотрансферазы из организма, выбранного из группы Васй1ик киЬй11к, КйобоЬас1ег крйаего1бек, Бещопе11а рпеиторййа, Шгокотопак еигораеа, №ккела допоггйоеае, Ркеиботопак кугшдае, ВЬоборкеиботопак ра1ик1г15, УФло йиу1айк, ЕксйейсЫа сой и Ркеиботопак аегищпока, пригодны для превращения АКР в ААР.

В одном конкретном варианте осуществления, для превращения АКР в АРР используют аминотрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 8, 8ЕО ГО N0: 12, 8Ер ГО N0: 15, 8ЕО ГО N0: 17, 8ЕО ГО N0: 19, 8ЕО ГО N0: 21, 8ЕО ГО N0: 23, 8Е0 ГО N0: 25, 8Е0 ГО N0: 27, 8Е0 ГО N0: 29 или гомолог любой из этих последовательностей.

В следующем варианте осуществления способ получения ААР предусматривает биокаталитическую реакцию в присутствии фермента, способного катализировать реакцию восстановительного аминирования, в присутствии источника аммиака, выбранного из группы оксидоредуктаз, действующих на СНИН₂-группу доноров (ЕС 1.4), в частности, из группы дегидрогеназ аминокислот (ЕС 1.4.1). Обычно подходящая дегидрогеназа аминокислот имеет а-аминопимелат-2-дегидрогеназную активность, катализирующую превращение АКР в АРР.

В частности, подходящая дегидрогеназа аминокислот может быть выбрана из группы диаминопимелатдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.16), глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.3; ЕС 1.4.1.4) и лейциндегидрогеназ (ЕС 1.4.1.9).

В одном варианте осуществления дегидрогеназа аминокислот выбрана из дегидрогеназ аминокислот, классифицируемых как глутаматдегидрогеназы, действующие с НАД или НАДФ в качестве акцептора (ЕС 1.4.1.3), глутаматдегидрогеназ, действующих с НАДФ в качестве акцептора (ЕС 1.4.1.4), лейциндегидрогеназ (ЕС 1.4.1.9) и диаминопимелатдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.16).

Дегидрогеназа аминокислот может, в частности, происходить из организма, выбранного из группы СогуиеЬас1егшт, в частности, СогуиеЬас1егшт дЫатюит; Рго1еик, в частности Рго1еик уи1дапк; АдгоЬас1егшт, в частности АдгоЬас1егшт ШтеГааепк; СеоЬасШик, в частности СеоЬасШик к1еагоШегторЫ1ик; Асте1оЬас1ег, в частности Асше1оЬас1ег кр. АЭР1; Ва1к1оша, в частности Ва1к1оша ко1апасеагит; 8а1топе11а, в частности 8а1топе11а 1урЫтигшт; 8ассйаготусек, в частности 8ассйаготусек сегеу1К1ае; Вгеу1Ьас1егшт, в частности Вгеу1Ьас1егшт йауит и ВасШик, в частности ВасШик крйаейсик, ВасШик сегеик или ВасШик киЫШк.

Например, подходящая дегидрогеназа аминокислот может быть выбрана из диаминопимелатдегидрогеназ из ВасШик, в частности ВасШик крНелсик; диаминопимелатдегидрогеназ из Вгеу1Ьас1егшт кр.; диаминопимелатдегидрогеназ из СогупеЬаСегшт, в частности диаминопимелатдегидрогеназ из СогупеЬас1егшт д1и1ат1сит; диаминопимелатдегидрогеназ из Рго1еик, в частности диаминопимелатдегидрогеназ из Рго1еик уи1дайк; глутаматдегидрогеназ, действующих с НАДН или НАДФН в качестве кофактора (ЕС 1.4.1.3), из Асше1оЬас1ег, в частности глутаматдегидрогеназ из Асше1оЬас1ег кр. АЭР1; глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.3) из Ва1к1оша, в частности глутаматдегидрогеназ из Ва1к1оша ко1апасеагит; глутаматдегидрогеназ, действующих с НАДФН в качестве кофактора (ЕС 1.4.1.4) из 8а1топе11а, в частности глутаматдегидрогеназ из 8а1топе11а 1урЫтигшт; глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.4) из 8ассйаготусек, в частности глутаматдегидрогеназ из 8ассйаготусек сегеуыае; глутаматдегидрогеназ (ЕС 1.4.1.4) из Вгеу1Ьас1егшт, в частности глутаматдегидрогеназ из Вгеу1Ьас1егшт йауит; и лейциндегидрогеназ из ВасШик, в частности лейциндегидрогеназ из ВасШик сегеик или ВасШик киЫШк.

Другая подходящая дегидрогеназа аминокислот может быть выбрана из группы лизин-6дегидрогеназ из АдгоЬас1егшт ШтеГаСепк или СеоЬасШик к!еагоШегторЫ1ик; или из группы лейциндегидрогеназ из ВасШик сегеик или ВасШик киЬННк.

ААР, полученная в способе этого изобретения, может быть далее использована для получения 6АСА. Авторы изобретения понимали, что ААР, полученная из АКР, может быть превращена в 6-АСА реакцией декарбоксилирования. Она может выполняться химически, например нагреванием в растворителе с высокой температурой кипения в присутствии кетонного или альдегидного катализатора. Например, аминокислоты декарбоксилируются с хорошими выходами в циклогексаноле при 150-160°С с 1-2% (о/о) циклогексеноном, как описано М. НакЫтоФ, Υ. Еба, Υ. 0капа1 Т. Ι\νηί апб 8. Аок1 ш С1ет. Бей. 1986, 893-896. Сходные способы описаны в Европейской заявке на патент 1586553, 2005, БаБо и 8.Ό. Вгапб! Ό. Мапке11 8. Егеетап Б. А. Е1ее1, 1. Е. А1бег 1. РНагт. Вютеб. Апа1. 2006, 41, 872-882. (14-15).

Альтернативно, декарбоксилирование ААР в 6-АСА может выполняться биокаталитически в при

- 7 019163 сутствии декарбоксилазы или другого биокатализатора, катализирующего это декарбоксилирование.

Эта декарбоксилаза может быть выбрана из декарбоксилаз, способных катализировать декарбоксилирование α-аминокислоты. Фермент, способный декарбоксилировать альфа-аминокислоту, может быть выбран, например, из группы декарбоксилаз (ЕС 4.1.1), предпочтительно из группы пируватдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.1), диаминопимелатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.20), декарбоксилаз альфа-кетокислот с разветвленной цепью (ЕС 4.1.1.72), которые включают в себя альфа-кетоизовалератдекарбоксилазы и альфакетоглутаратдекарбоксилазы (ЕС 4.1.1.71).

Одна или несколько других подходящих декарбоксилаз могут быть, в частности, выбраны из группы оксалатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.2), оксалоацетатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.3), ацетоацетатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.4), аспартат-1-декарбоксилаз (ЕС 4.1.1.11), валиндекарбоксилаз/лейциндекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.14), глутаматдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.15), 3-гидроксиглутаматдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.16), орнитиндекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.17), лизиндекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.18), аргининдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.19), 2оксоглутаратдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.71) и диаминобутиратдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.86).

Декарбоксилаза может быть, в частности, декарбоксилазой организма, выбранного из группы тыкв, например, СиеигЬйа тозсйа)а; огурцов; дрожжей; грибов, например, 8ассйаготусс5 ссгсгыас. Саик1ка Пагсгг Нап8сппи1а зр., К1иуусготуссз татаииз, Ρΐιίζορι.15 )ауашси5 и Ысигокрога сгазза; млекопитающих, в частности, головного мозга млекопитающих; и бактерий, таких как ЕзсйсйсЫа сой, МусоЬас!сгшт ЩЬсгси1оз13, Рзсикотоиаз зр. и 2утотоиаз тоЬШз.

Пируватдекарбоксилаза может происходить из 8ассйаготуссз ссгсу131ас или 2утотоиаз тоЬШз. В частности, может быть использован мутант Ι472Α из 2утотоиаз тоЬШз. Может быть, в частности, использована оксалоацетатдекарбоксилаза из Рзсикотоиаз. Могут быть использованы глутаматдекарбоксилаза или аспартатдекарбоксилаза из ЕзсйсйсШа сой (Е. сой) или может быть использована глутаматдекарбоксилаза из Ысигокрога сгазза, МусоЬасШгшт 1сргас, ОоЧпкшт рсгЕпидсиз, Ьас!оЬасШиз Ьгсу1з, МусоЬасШгшт ШЬсгси1оз1з, 81гср1ососсиз или ЬасШсоссиз. Примеры видов ЬасШсоссиз, из которых может происходить глутаматдекарбоксилаза, включают в себя, в частности, Ьас!ососсиз 1ас118, такой как штамм Ьас!ососсиз 1асйз В1157, Ьас!ососсиз 1асйз 1ЕРБ730, более конкретно Ьас!ососсиз 1асйз уаг. таШдсисз (ранее называемый 8йср!ососсиз 1асйз уаг. таШдсисз). Диаминопимелатдекарбоксилаза может, например, происходить из организма, способного синтезировать лизин из диаминопимелата. Такой организм может быть, в частности, обнаружен среди бактерий, архебактерий и растений. В частности, диаминопимелатдекарбоксилаза может происходить из грамотрицательной бактерии, например, Е. сой. Могут быть использованы декарбоксилазы α-кетокислот с разветвленной цепью из Ьас!ососсиз 1ас118. Более конкретно, могут быть использованы декарбоксилазы α-кетокислот с разветвленной цепью и альфакетоизовалератдеарбоксилазы из ЬасШсоссиз 1асйз.

Может быть, в частности, использована альфа-кетоглутаратдекарбоксилаза из МусоЬас!сгшт )иЬсгси1оз18. Авторы этого изобретения обнаружили, что альфа-кетоглутаратдекарбоксилаза (Кдк) из МусоЬас!сгшт )иЬсгси1оз1з может быть использована для превращения ААР в 6-АСА. В частности, авторы изобретения обнаружили, что такая декарбоксилаза, содержащая последовательность, показанную в 8ЕО ΙΌ N0:46, или ее функциональный аналог, могут быть способны катализировать образование 6-АСА из ААР.

Глутаматдекарбоксилаза может быть, в частности, выбрана из декарбоксилаз СисигЬйа тозсйа!а; огурца; дрожжей или головного мозга теленка; и диаминопимелатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.20).

Диаминопимелатдекарбоксилаза может быть, например, декарбоксилазой из организма, способного синтезировать лизин из диаминопимелата. Такой организм может быть, в частности, найден среди бактерий, архебактерий и растений.

В частности, диаминопимелатдекарбоксилаза может быть декарбоксилазой из грамотрицательной бактерии, например Е. сой.

В одном конкретном варианте осуществления АКР химически превращают в ААР. ААР может быть получена из 2-оксопимелиновой кислоты каталитической реакцией Лейкарта-Валлаха, как описано для сходных соединений. Эту реакцию выполняют с формиатом аммония в метаноле и [КйСр-С1₂]₂ в качестве гомогенного катализатора (М. Кйатига, ЭШсс, 8. Науазйц 8. Таиака, М. Уозй1тига 1. Огд. Сйст. 2002, 67, 8685-8687). Альтернативно, реакция Лейкарта-Валлаха может выполняться с водным формиатом аммония с использованием [1г¹¹¹Ср*(Ьги)Н₂О]8О₄ в качестве катализатора, как описано 8. Одо, К. Исйага аик 8. Ειιίχιιζιιιηί в 1. Ат. Сйст. 8ос. 2004, 126, 3020-3021. Превращение α-кетокислот в (энантиомерно обогащенные) аминокислоты возможно также реакцией с (хиральными) бензиламинами и последующим гидрированием промежуточного имина над Рк/С или Рк(ОН)₂/С. См., например, Р.С. Н1зксу, КС. копйгор 1. Ат. Сй)т. 8ос. 1961, 83, 4798.

После этого ААР биокаталитически превращают в 6-АСА, в присутствии декарбоксилазы или другого биокатализатора, способного выполнять такое декарбоксилирование. Такая декарбоксилаза может быть, в частности, выбрана из биокатализаторов, которые упоминаются выше при описании биокатализаторов для превращения ААР в 6-АСА.

Альтернативно, превращение ААР в 6-АСА может выполняться химическим способом, например,

- 8 019163 упоминаемым выше.

В одном конкретном варианте осуществления АКР биокаталитически превращают в 5-ЕУА в присутствии декарбоксилазы или другого биокатализатора, способного катализировать такое превращение, и после этого 5-ЕУА превращают в 6-АСА в присутствии аминотрансферазы, дегидрогеназы аминокислот или другого биокатализатора, способного катализировать такое превращение. Декарбоксилазы, подходящие для этих реакций, могут быть, в частности, выбраны из группы декарбоксилаз, упомянутых выше при описании бикаталитического превращения АКР в 6-АСА. Подходящие аминотрансфераза или дегидрогеназа аминокислот для превращения 5-ЕУА могут быть, в частности, выбраны из аминотрансфераз или дегидрогеназ, упомянутых выше при описании биокаталитического превращения 5-ЕУА в 6АСА.

В одном конкретном варианте осуществления АКР биокаталитически превращают в ААР в присутствии аминотрансферазы, дегидрогеназы аминокислот и другого биокатализатора, способного катализировать такое превращение, и после этого ААР превращают в 6-АСА в присутствии декарбоксилазы или другого биокатализатора, способного катализировать такое превращение.

Ферменты, подходящие для таких реакций, могут быть, в частности, выбраны из группы аминотрансфераз, дегидрогеназ аминокислот и декарбоксилаз, которые были описаны выше при описании биокаталитического превращения АКР в ААР и биокаталитического превращения ААР в 6-АСА соответственно.

АКР, используемая для получения 6-АСА, может быть, в принципе, получена любым способом. Например, АКР может быть получена на основе способа, описанного Н. 1адег с1 а1., Скет. Вег. 1959, 92, 2492-2499. АКР может быть получена алкилированием циклопентанона диэтилоксалатом с использованием этоксида натрия в качестве основания, нагреванием полученного продукта при температуре дефлегмации в сильной кислоте (2 М НС1) и извлечением этого продукта, например, кристаллизацией из толуола.

АКР можно также получить из природного источника, например, из метаногенных Агскаеа, из Азр1еи1ит зер1еп1г1опа1е или из Нубпосагриз аШМттйса. Подходящий способ экстракции может быть, например, основан на способе, описанном А.1. Уй1апеп апб А.М. Вегд в Ас1а Скет1са 8сапбшау1са 1954, 6. 1085-1086, где описана экстракция аминокислот и АКР из Азр1ешит с использованием 70% этанола.

В одном конкретном варианте осуществления АКР получают в способе, предусматривающем превращение альфа-кетоглутаровой кислоты (АКС) в альфа-кетоадипиновую кислоту (АКА) и превращение альфа-кетоадипиновой кислоты в альфа-кетопимелиновую кислоту. Эта реакция может катализироваться биокатализатором. АКС может быть, например, получена биокаталитически из углеродного источника, такого как углевод, способом, известным рег зе в данной области.

Подходящий биокатализатор для получения АКР из АКС может быть выбран, в частности, из биокатализаторов, катализирующих С1-удлинение альфа-кетоглутаровой кислоты в альфа-кетоадипиновую кислоту и/или С1-удлинение альфа-кетоадипиновой кислоты в альфа-кетопимелиновую кислоту.

В одном конкретном варианте осуществления получение АКР катализируют биокатализатором, содержащим:

a) фермент АкзА или его гомолог;

b) по меньшей мере один фермент, выбранный из группы ферментов АкзЭ. ферментов АкзЕ, гомологов ферментов АкзЭ и гомологов ферментов АкзЕ; и

c) фермент АкзЕ или его гомолог.

Один или несколько ферментов АкзА, АкзЭ, АкзЕ, АкзЕ или их гомологов могут быть обнаружены в организме, выбранном из группы метаногенных архебактерий, предпочтительно выбранных из группы Ме^пососсиз, МеШапосаШососсиз, Ме^позагсша, Ме^поШегтоЬаЛег, МеШапозрИаега, МеШапоругиз и Ме111апоЬгеу|Ьас1ег.

В одном конкретном варианте осуществления биокатализатор, катализирующий получение АКР из альфа-кетоглутаровой кислоты (АКС), содержит систему ферментов, катализирующих превращение альфа-кетоглутаровой кислоты в альфа-кетоадипиновую кислоту, где указанная система ферментов образует часть альфа-аминоадипатного пути для биосинтеза лизина. Термин система ферментов используется здесь, в частности, для единственного фермента или группы ферментов, посредством которых может катализироваться конкретное превращение.

Получение АКР из АКС может предусматривать одну или несколько биокаталитических реакций с известными или неизвестными промежуточными продуктами, например превращение АКС в АСА или превращение АКА в АКР. Такая система может присутствовать в клетке или может быть выделена из клетки. Эта система ферментов может, в частности, происходить из организма, выбранного из группы дрожжей, грибов, архебактерий и бактерий, в частности из группы РешсШшт, Серйа1озрогшт, Раейсотусез, ТпсйорИуШт, АзрегдШиз, Рйаие^осйаеΐе, Етепсе11а, ИзШадо, ЗсЫ/озассйаготусез, 8ассйаготусез, 8и11о1оЬиз, ТИегтососсиз, МеШапососсиз, МеШапосаИососсиз, МеШапозрИаега, МеШапоругиз, МеШапоЬгеу1Ьас!ег и Ме111апо111егтоЬас1ег.

В одном конкретном варианте осуществления биокатализатор, катализирующий получение АКР из альфа-кетоглутаровой кислоты, содержит систему ферментов, катализирующих превращение альфа

- 9 019163 кетоглутаровой кислоты в альфа-кетоадипиновую кислоту, где по меньшей мере один из ферментов этой системы ферментов происходит из азотфиксирующих бактерий, выбранных из группы цианобактерий, ризобий, γ-протеобактерий и актинобактерий, в частности, из группы ЛпаЬаепа, Мкгосувйв, §уиесйосув118, ШпхоЬшт. Вгабуг1пхоЬшт. Рвеибошоиав, ЛхогоЬас1ег. К1еЬв1е11а и Ргапйа.

Примеры гомологов этих ферментов Лкв и генов, кодирующих эти ферменты, приведены в табл. 1А и 1В на следующих страницах.

Таблица 1А

Название фермента	Организм	Ген	Белок
АкаА	МеЖапосаМососсиз /агталки	М30503	ΝΡ 247479
	Ме(капо1кег!кокае1ег ЖегтоаиСо1гор1сит ΔΗ	МТН1630	ΝΡ 276742
	Ме(капососсиз ηιατίραίικϋδ 82	ММР0153	ΝΡ 987273
	Ме&апососсиз тапраккИз С5	МтагС5 1522	ΥΡ 001098033
	МеЖапосассил тапра1и41$ С7	МтагС7 1153	ΥΡ 001330370
	Ме1капозркаега з/асПтапае 1>8М 3091	Мар 0199	ΥΡ 447259
	МеЖакоругиз капЛеп А V19	МК1209	ΝΡ 614492
	МеЖапоЬгеыкас/ег зтИки АТСС35061	Мат 0722	ΥΡ 001273295
	МеОгапососсиз ναηηΐεΐϋ 8В	Мсхап 1158	ΥΡ 001323668
	Ме(капасассиз аеоНсиз Марка! 3	Маео 0994	ΥΡ 001325184
АкаЦ	Ме/капоеаМоеоесиз }аппазки	мл 003	ΝΡ 247997
	МеЖапоЖегтоЪа&ег ЖегтоаиРМгор^сит ΔΗ	МТН1386	ΝΡ 276502
	Ме1капососсиз тапра1исИ$ 82	Мтр1480	ΝΡ 988600
	МеЖапасоссиз тап'ра/иФ'з С5	МтагС5 0098	ΥΡ 001096630
	МеГкапососсиз тапраккНз С7	МтагС7 0724	ΥΡ 001329942
	Ме!капозркаега МаЛтапае О8М 3091	Мар 1486	ΥΡ 448499
	Ме/капоругиз кана/еп Αν 19	МК1440	ΝΡ 614723
	А1е/капакгвУ1Ьас1ег $тЦкц АТСС35061	Мат 0723	ΥΡ 001273296
	Ме1капосассиз иапте!и 8В	Мсхап 0789	ΥΡ 001323307
	МеЛапососсиз аеоИсиз Лапка! 3	Маео 0311	ΥΡ 001324511

Ссылки на ген и белок могут быть найдены через \\л\лс.псЫшкдо\7 (доступный на 15 апреля 2008 г.)

Таблица 1В

Название фермента	Организм	Ген	Белок
АкаЕ	МеЖапосаМососсиз ^апяазкИ	МЛ271	ΝΡ 248267
	Ме(капо1кегтоЬас1ег 1кегтоаи1о1гор1сипг ΔΗ	МТН1387	ΝΡ 276503
	Ме(каиососсиз тапра1исНз В2	ММРО381	ΝΡ 987501
	Ммкапососсцз таг1ра1ис0з С5	МтагСЗ 1257	ΥΡ 001097769
	Ме/капососсиз тапра1иФз С7	МтагС7 1379	ΥΡ 001330593
	Ме&агюзркаега мадтапае ЦВМ 3091	Мар 1485	ΥΡ 448498
	Ме1капоруги$ кап&ег1 Αν 19	МК0781	ΝΡ 614065
	Ме(капоЬгеуЦ>ас1ег $тИЪИ АТСС35061	Мат 0847	ΥΡ 001273420
	Ме1капососсиз гаптеШ 8В	Меуап 1368	ΥΡ 001323877
	Мегкапосоесиз аеоНсиз Иапка1 3	Маео 0652	ΥΡ 001324848
АкаГ	МеЖапосаМососсиз }аппазкц	МЛ 596	ΝΡ 248605
	Ме1капо1кегтоЬас1ег 1кегтоаиЮ1гор1сит ΔΗ	МТН184	ΝΡ 275327
	Ме1капосоеси$ тапраккИз 82	ММР0880	ΝΡ988000
	Ме1капососсиз таНракк&з С5	МтагС5 0688	ΥΡ001097214
	Ме!капососси$ таг1ра1искз С7	МтатС7 0128	ΥΡ 001329349
	Мегкагюзркаега Масктапае О8М 309]	Мар 0674	ΥΡ 447715
	Ме1капоругиз катНеН Αν 19	МК0782	ΝΡ 614066
	Ме^капоЬгеугЬааег зтИкИ АТСС35061	Мат 0373	ΥΡ001272946
	Ме1капососсиз ναηηΐείϋ 8В	Мехгш 0040	ΥΡ 001322567
	Ме1капососси5 аеоНсиз Капка! 3	Маео 1484	ΥΡ 001325672

Ссылки на ген и белок могут быть найдены через \\л\лс.псЫ.шкдоу/ (доступный на 15 апреля 2008 г.)

Если желательно, 6-АСА, полученная в соответствии с этим изобретением, может быть циклизована с образованием капролактама, например, как описано в И8-А 5194572.

Условия реакции для любой биокаталитической стадии в контексте данного изобретения могут быть выбраны в зависимости от известных условий для этого биокатализатора, в частности фермента, описанной здесь информации и необязательно некоторого рутинного экспериментирования.

В принципе, рН используемой реакционной среды может быть выбран в широких пределах, пока этот биокатализатор является активным при этих условиях рН. Могут быть использованы щелочные, нейтральные или кислые условия, в зависимости от этого биокатализатора и других факторов. В случае, когда этот способ включает в себя применение микроорганизма, например для экспрессии фермента, катализирующего способ этого изобретения, рН выбирают таким образом, что этот микроорганизм способен выполнять предполагаемую для него функцию или предполагаемые для него функции. В частности, рН может быть выбран в диапазоне четырех рН-единиц ниже нейтрального рН и двух рН-единиц выше нейтрального рН, т.е. между рН 3 и рН 9, в случае, по существу, водной системы при 25°С. Система считается водной, если вода является единственным растворителем или преобладающим растворителем (>50 мас.%, в частности, >90 мас.% в расчете на все жидкости), в котором, например, может быть растворено минорное количество спирта или другого растворителя (<50 мас.%, в частности, <10 мас.% в

- 10 019163 расчете на все жидкости) (например, в виде источника углерода) в такой концентрации, что микроорганизмы, которые могут присутствовать, остаются активными. В частности, в случае использования дрожжей и/или гриба, могут быть предпочтительными кислые условия, в частности рН может находиться в диапазоне рН 3 - рН 8, на основе, по существу, водной системы при 25°С. Если желательно, рН может корректироваться с использованием кислоты и/или основания или может быть забуферен подходящей комбинацией кислоты и основания.

В принципе, условия инкубирования могут быть выбраны в широких пределах, пока биокатализатор обнаруживает достаточную активность и/или достаточный рост. Это включает в себя аэробные, микроаэробные условия, условия с ограниченным кислородом и анаэробные условия.

Анаэробные условия определяются здесь как условия без какого-либо количества кислорода или условия, в которых кислород, по существу, не потребляется биокатализатором, в частности микроорганизмом, и обычно соответствуют потреблению кислорода менее 2,5 ммоль/л-ч или менее 1 ммоль/л-ч.

Аэробные условия являются условиями, в которых в среде растворен уровень кислорода, достаточный для неограниченного роста, способный поддерживать скорость потребления кислорода, по меньшей мере, 10 ммоль/л-ч, более предпочтительно более 20 ммоль/л-ч, даже более предпочтительно более 50 ммоль/л.ч и наиболее предпочтительно более 100 ммоль/л.ч.

Условия с ограниченным кислородом определяются здесь как условия, в которых потребление кислорода ограничивается переносом кислорода из газа в жидкость. Нижний предел для условий с ограниченным кислородом определяется верхним пределом для анаэробных условий, т.е. обычно по меньшей мере 1 ммоль/л-ч и, в частности, по меньшей мере 2,5 ммоль/л-ч или по меньшей мере 5 ммоль/л-ч. Верхний предел для условий с ограниченным кислородом определяется нижним пределом для аэробных условий, т.е. менее 100 ммоль/л-ч, менее 50 ммоль/л-ч, менее 20 ммоль/л-ч или менее 10 ммоль/л-ч.

Являются ли условия аэробными, анаэробными или условиями с ограниченным кислородом, зависит от условий, при которых проводится этот способ, в частности количества и состава входящего потока газа, фактических свойств смешивания/переноса массы используемого оборудования, типа используемого микроорганизма и плотности микроорганизма.

Используемая температура, в принципе, не является критической, пока биокатализатор, в частности фермент, обнаруживает существенную активность. Обычно эта температура может быть по меньшей мере 0°С, в частности по меньшей мере 15°С, более конкретно по меньшей мере 20°С. Желаемая максимальная температура зависит от биокатализатора. Обычно такая максимальная температура известна в данной области, например, указана в техническом описании продукта в случае коммерчески доступного биокатализатора, или она может быть определена рутинным образом на основе обычных общих знаний и описанной здесь информации. Эта температура равна обычно 90°С или менее, предпочтительно 70°С или менее, в частности 50°С или менее, более конкретно 40°С или менее. В частности, если биокаталитическую реакцию выполняют вне организма-хозяина, реакционная среда, содержащая органический растворитель, может использоваться в высокой концентрации (например, большей чем 50% или большей чем 90 масс.%), в случае использования фермента, который сохраняет достаточную активность в такой среде.

В предпочтительном способе 6-АСА получают с использованием биопревращения целыми клетками субстрата для 6-АСА или промежуточного продукта для образования 6-АСА (АКР, ААР или 5-ЕУА), содержащего микроорганизм, в котором продуцируются один или несколько биокатализаторов (обычно один или несколько ферментов), катализирующих это биопревращение, таких как один или несколько биокатализаторов, выбранных из группы биокатализаторов, способных катализировать превращение АКР в ААР, биокатализаторов, способных катализировать превращение ААР в 6-АСА, биокатализаторов, способных катализировать превращение АКР в 5-ЕУА, и биокатализаторов, способных катализировать превращение 5-ЕУА в 6-АСА. В предпочтительном варианте осуществления этот микроорганизм способен продуцировать декарбоксилазу, и/или продуцируется по меньшей мере один фермент, выбранный из дегидрогеназ аминокислот и аминотрансфераз, способный катализировать стадию реакции, описанную выше, и источник углерода для этого микроорганизма.

В частности, этот источник углерода содержит по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы одноатомных спиртов, многоатомных спиртов, карбоновых кислот, диоксида углерода, жирных кислот, глицеридов, в том числе смесей, содержащих любое из указанных соединений. Подходящие одноатомные спирты включают в себя метанол и этанол. Подходящие полиолы включают в себя глицерин и углеводы. Подходящие жирные кислоты или глицериды могут быть обеспечены, в частности, в форме съедобного масла, предпочтительно растительного происхождения.

В частности, может быть использован углевод, так как обычно углеводы могут быть получены в больших количествах из биологически возобновляемого источника, такого как сельскохозяйственный продукт, предпочтительно отходы сельскохозяйственного продукта. Предпочтительно используют углевод, выбранный из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, сахарозы, лактозы, сахарозы, крахмала, целлюлозы и гемицеллюлозы. Особенно предпочтительными являются глюкоза, олигосахариды, содержащие глюкозу, и полисахариды, содержащие глюкозу.

Клетка, в частности рекомбинантая клетка, содержащая один или несколько биокатализаторов

- 11 019163 (обычно один или несколько ферментов) для катализа стадии реакции в способе этого изобретения, может быть сконструирована с использованием молекулярно-биологических способов, которые рег §е известны в данной области. Например, если один или несколько биокатализаторов должны продуцироваться в рекомбинантной клетке (которая может быть гетерологичной системой), такие способы могут быть использованы для обеспечения вектора (такого как рекомбинантный вектор), который содержит один или несколько генов, кодирующих один или несколько указанных биокатализаторов. Могут использоваться один или несколько векторов, каждый из которых содержит один или несколько таких генов. Такой вектор может содержать один или несколько регуляторных элементов, например один или несколько промоторов, которые могут быть функционально связаны с геном, кодирующим биокатализатор.

В данном контексте, термин функционально связанные относится к связыванию полинуклеотидных элементов (или кодирующих последовательностей или последовательностей нуклеиновых кислот) в функциональной взаимосвязи. Последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана, когда она помещена в функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию этой кодирующей последовательности.

В данном контексте термин промотор относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который функционирует для регуляции транскрипции одного или нескольких генов, расположенных слева (выше) относительно направления транскрипции от сайта инициации транскрипции этого гена, и структурно идентифицируется по присутствию сайта связывания для ДНК-зависимой РНК-полимеразы, сайтов инициации транскрипции и любых других ДНК-последовательностей, включающих в себя, но не ограничивающихся ими, сайты связывания факторов транскрипции, сайты связывания репрессорного и активаторного белков и любые другие последовательности нуклеотидов, известные квалифицированному в данной области специалисту, для прямого или опосредованного действия для регуляции величины транскрипции от этого промотора. Конститутивным промотором является промотор, который является активным при большинстве условий окружающей среды и развития. Индуцируемым промотором является промотор, который является активным при регуляции окружающей средой или развитием. Термин гомологичный при использовании его для указания родства между определенной (рекомбинантной) молекулой нуклеиновой кислоты или полипептида и определенным организмом-хозяином или определенной клеткой-хозяином обозначает, что в природе эта молекула нуклеиновой кислоты или полипептида продуцируется клеткой-хозяином или организмом того же самого вида, предпочтительно того же самого сорта или штамма.

Промотор, который мог бы использоваться для получения экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих фермент для применения в способе этого изобретения, в частности, аминотрансферазу, дегидрогеназу аминокислот или декарбоксилазу, такой как описано здесь выше, может быть природным для последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, который должен быть экспрессирован, или может быть гетерологичным относительно последовательности нуклеиновой кислоты (кодирующей последовательности), с которой он функционально связан. Предпочтительно этот промотор является гомологичным, т.е. эндогенным для этой клетки-хозяина.

Если используют гетерологичный промотор (относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес фермент), этот гетерологичный промотор предпочтительно способен продуцировать более высокий уровень стационарного состояния транскрипта, содержащего эту кодирующую последовательность (или способен продуцировать больше молекул транскрипта, т.е. мРНК-молекул, на единицу времени), чем промотор, который является природным для этой кодирующей последовательности. Подходящие промоторы в этом контексте включают в себя как конститутивные, так и индуцируемые природные промоторы, а также сконструированные промоторы, которые хорошо известны квалифицированному в данной области специалисту.

Сильный конститутивный промотор является промотором, который заставляет мРНК инициироваться при высокой частоте в сравнении с нативной клеткой-хозяином. Примеры таких сильных конститутивных промоторов в грамположительных микроорганизмах включают в себя 8ΡΘ1-26, 8ΡΘ1-15, уед. рус (промотор пируваткарбоксилазы) и атуЕ.

Примеры индуцируемых промоторов в грамположительных микроорганизмах включают в себя ΙΚΡΟ-индуцируемый промотор Р8РАС, индуцируемый ксилозой промотор Рху1А.

Примеры конститутивных и индуцируемых промоторов в грамотрицательных микроорганизмах включают в себя, но не ограничиваются ими, 1ас, 1е1, 1гр-1е1, 1рр, 1ас, 1рр-1ас, 1ас1ц, Т7, Т5, Т3, да1, 1тс, ага ^(Рнли)· 8^{р6, λ-Ρ}ι< ^и /-^-рь

Промоторы для клеток (мицелиальных) грибов известны в данной области и могут быть, например, промоторами дрбА глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, промоторами протеаз, такими как рерА, рерВ, рерС, промоторами д1аА глюкоамилазы, промоторами атуА, атуВ амилазы, промоторами са1Р или са1А каталазы, промотором дохС глюкозооксидазы, промотором 1асА бета-галактозидазы, промотором ад1А альфа-глюкозидазы, промотором 1еГА фактора элонгации трансляции, промоторами ксиланаз, такими как х1пА, х1пВ, х1пС, х1иЭ, промоторами целлюлозы, такими как ед1А, ед1В, сЬйА, промоторами регуляторов транскрипции, такими как айА, сгеА, х1пВ, расС, рйТ или другим промотором, и могут быть найдены

- 12 019163 среди других промоторов в \УсЬ-сайте Νί’ΒΙ (1и1р://\у\у\у.псЫ.п11п.ш11.доу/сп1гсх/).

Термин гетерологичный при применении в отношении нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) или белка относится к нуклеиновой кислоте или белку, которые не встречаются природно в виде части организма, клетки, генома или последовательности ДНК или РНК, в котором они присутствуют, или которые обнаруживаются в клетке или местоположении или местоположениях в геноме или последовательности ДНК или РНК, которые отличаются от тех, в которых он обнаруживается в природе. Гетерологичные нуклеиновые кислоты или белки не являются эндогенными в отношении клетки, в которую их вводят, но были получены из другой клетки или были получены синтетически или рекомбинантно. Обычно, хотя и не обязательно, такие нуклеиновые кислоты кодируют белки, которые в норме не продуцируются клеткой, в которой эта ДНК транскрибируется или экспрессируется. Подобным образом, экзогенная РНК кодирует белки, не экспрессируемые в норме в клетке, в которой присутствует эта экзогенная РНК. Гетерологичные нуклеиновые кислоты и белки могут также называться чужеродными нуклеиновыми кислотами или белками. Любая нуклеиновая кислота или любой белок, которые квалифицированный в данной области специалист мог бы признать как гетерологичные или чужеродные для клетки, в которой они экспрессируются, включены в термин гетерологичные нуклеиновая кислота или белок.

Способ по этому изобретению может проводиться в организме-хозяине, который может быть новым.

Таким образом, это изобретение относится также к клетке-хозяину, содержащей один или несколько биокатализаторов, способных катализировать по меньшей мере одну стадию реакции в способе этого изобретения, в частности, способных катализировать по меньшей мере одну стадию реакции в превращении АКР, ААР или 5-ЕУА в 6-АСА. Это изобретение относится также к новому вектору, содержащему один или несколько генов, кодирующих один или несколько ферментов, способных катализировать, по меньшей мере одну стадию реакции в превращении АКР в 6-АСА, и к новой клетке-хозяину, содержащей один или несколько генов, кодирующих один или несколько ферментов, способных катализировать по меньшей мере одну стадию реакции в способе этого изобретения, в частности способных катализировать по меньшей мере одну стадию реакции в превращении АКР в 6-АСА (причем эти один или несколько генов могут образовывать часть одного или нескольких векторов).

В одном конкретном варианте осуществления, клеткой-хозяином по данному изобретению является рекомбинантная клетка, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую биокатализатор, способный катализировать реакцию переаминирования или реакцию восстановительного аминирования с образованием альфа-аминопимелиновой кислоты из альфа-кетопимелиновой кислоты. Указанная последовательность может быть частью вектора или может быть инсертирована в хромосомную ДНК.

В частности, клетка-хозяин или вектор по этому изобретению могут содержать по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, в частности, по меньшей мере две последовательности нуклеиновых кислот, выбранные из группы последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих фермент с активностью декарбоксилазы α-кетопимелиновой кислоты, последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих фермент с 5-формилпентаноат-аминотрансферазной активностью, последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих фермент с активностью аминотрансферазы αкетопимелиновой кислоты, последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих активность декарбоксилазы α-аминопимелиновой кислоты. Из этих последовательностей, обычно одна или несколько, в частности две или более, последовательностей являются рекомбинантными последовательностями.

В предпочтительном варианте осуществления клетка-хозяин, обычно рекомбинантная клеткахозяин или вектор по этому изобретению содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один биокатализатор, имеющий активность декарбоксилазы αкетопимелиновой кислоты, и/или по меньшей мере одна последовательность нуклеиновой кислоты выбрана из последовательностей, кодирующих биокатализатор с 5-формилпентаноат-аминотрансферазной активностью.

В таком варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент с активностью декарбоксилазы α-кетопимелиновой кислоты, может, в частности, кодировать аминокислотную последовательность, соответствующую 8ЕО ΙΌ N0:31, 8Е0 ΙΌ N0:34, 8Е0 ΙΌ N0:37, 8Е0 ΙΌ N0:40, 8Е0 ΙΌ N0:43 или 8Е0 ΙΌ N0:46, или гомолог любой из этих последовательностей, и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент 5-формилпентоат-аминотрансферазу, может, в частности, кодировать аминокислотную последовательность, соответствующую 8Е0 ΙΌ N0:2, 8Е0 ΙΌ N0:5, 8Е0 ΙΌ N0:8, 8Е0 ΙΌ N0:65, 8Е0 ΙΌ N0:67, 8Е0 ΙΌ N0:69, или их гомолог. Одна или несколько из указанных последовательностей нуклеиновых кислот могут образовывать часть одного или нескольких рекомбинантных векторов.

В следующем предпочтительном варианте осуществления вектор или клетка-хозяин содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с активностью аминотрансферазы αкетопимелиновой кислоты, и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с активностью декарбоксилазы α-аминопимелиновой кислоты. Последовательность нуклеиновой кислоты,

- 13 019163 кодирующая фермент с активностью аминотрансферазы α-кетопимелиновой кислоты, может, в частности, кодировать аминокислотную последовательность, соответствующую ΞΕΟ ΙΌ N0: 2, ΞΕΟ ΙΌ N0: 8, ΞΕΟ ΙΌ N0: 12, ΞΕΟ ΙΌ N0: 15, ΞΕΟ ΙΌ N0: 17, ΞΕΟ ΙΌ N0: 19, ΞΕΟ ΙΌ N0: 21, ΞΕΟ ΙΌ N0: 23, ΞΕΟ ΙΌ N0: 25, ΞΕΟ ΙΌ N0: 27, ΞΕΟ ΙΌ N0: 29, или их гомолог. Одна или несколько из указанных последовательностей нуклеиновых кислот могут образовывать часть одного или нескольких рекомбинантных векторов.

В одном конкретном предпочтительном варианте осуществления клетка-хозяин по этому изобретению содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с а-аминопимелат-2дегидрогеназной активностью, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с αаминопимелатдекарбоксилазной активностью.

В одном конкретном предпочтительном варианте осуществления клетка-хозяин по этому изобретению содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с 6-аминокапроновая кислота-6-дегидрогеназной активностью, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с α-кетопимелиновая кислота-декарбоксилазной активностью.

Один или несколько подходящих генов клетки-хозяина или векторов по данному изобретению могут быть, в частности, выбраны из генов, кодирующих фермент, упомянутый здесь выше.

В одном конкретном варианте осуществления эта клетка-хозяин является рекомбинантной клеткой, содержащей по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы последовательностей, идентифицированных в любой из ΞΕΟ ΙΌ N0: 1, ΞΕΟ ΙΌ N0: 3, ΞΕΟ ΙΌ N0: 4, ΞΕΟ ΙΌ N0: 6, ΞΕΟ ΙΌ N0: 7, ΞΕΟ ΙΌ N0: 11, ΞΕΟ ΙΌ N0: 13, ΞΕΟ ΙΌ N0: 14, ΞΕΟ ΙΌ N0: 16, ΞΕΟ ΙΌ N0: 18,

ΞΕΟ ΙΌ N0: 20, ΞΕΟ ΙΌ N0: 22, ΞΕΟ ΙΌ N0: 24, ΞΕΟ ΙΌ N0: 26, ΞΕΟ ΙΌ N0: 28, ΞΕΟ ΙΌ N0: 30, ΞΕΟ ΙΌ

N0: 32, ΞΕΟ ΙΌ N0: 33, ΞΕΟ ΙΌ N0: 35, ΞΕΟ ΙΌ N0: 36, ΞΕΟ ΙΌ N0: 38, ΞΕΟ ΙΌ N0: 39, ΞΕΟ ΙΌ N0: 41,

ΞΕΟ ΙΌ N0: 42, ΞΕΟ ΙΌ N0: 44, ΞΕΟ ΙΌ N0: 45, ΞΕΟ ΙΌ N0: 47, ΞΕΟ ΙΌ N0: 64, ΞΕΟ ΙΌ N0: 66, ΞΕΟ ΙΌ

N0: 68, и их функциональных аналогов.

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент с 5-ЕУА-аминотрансферазной активностью, может быть, в частности, последовательностью, выбранной из группы последовательностей, представленных любой из ΞΕΟ ΙΌ N0: 1, 3, 4, 6, 7, 64, 66, 68, и функциональных аналогов любой из этих последовательностей.

В данном контексте термин функциональные аналоги включает в себя, по меньшей мере, другие последовательности, кодирующие фермент, имеющий ту же самую аминокислотную последовательность, и другие последовательности, кодирующие гомолог такого фермента.

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент с АКР-декарбоксилазной активностью, может быть, в частности, последовательностью, выбранной из группы последовательностей, представленных любой из ΞΕΟ ΙΌ N0: 30, 32, 33, 35, 36, 38, 39, 41, 42, 44, 45, 47, и функциональных аналогов любой из этих последовательностей.

В предпочтительном варианте осуществления клетка-хозяин содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент, способный катализировать превращение ААР в АКР, соответствующую ΞΕΟ ΙΌ N0: 1, 3, 7, 11, 13, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, или ее функциональный аналог, который может быть последовательностью дикого типа или может не быть последовательностью дикого типа.

В одном конкретном варианте осуществления клетка-хозяин содержит по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую биокатализатор, имеющий активность декарбоксилазы альфа-аминопимелиновой кислоты, который может быть гомологичным или гетерологичным относительно этой клетки-хозяина. В частности, такой биокатализатор может быть выбран из группы декарбоксилаз (ЕС 4.1.1), более конкретно из группы глутаматдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.15), диаминопимелатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.20), аспартат-1-декарбоксилаз (ЕС 4.1.1.11), декарбоксилаз альфакетокислоты с разветвленной цепью, альфа-кетовалератдекарбоксилаз, альфакетоглутаратдекарбоксилаз, пируватдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.1) и оксалоацетатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.3).

В одном конкретном варианте осуществления клетка-хозяин содержит один или несколько ферментов, катализирующих образование АКР из АКС (см. также выше). Может быть изготовлена система ферментов, образующая часть альфа-аминоадипатного пути для биосинтеза лизина. Термин система ферментов используется здесь, в частности, для единственного фермента или группы ферментов, посредством которых может катализироваться конкретное превращение. Указанное превращение может предусматривать одну или несколько химических реакций с известными или неизвестными промежуточными продуктами, например превращение АКС в АКА или превращение АКА в АКР. Такая система может присутствовать в клетке или может быть выделена из клетки. Известно, что аминотрансферазы часто имеют широкий диапазон субстратов. Если эта система присутствует, может быть желательным уменьшение активности одного или нескольких таких ферментов в клетке-хозяине, так что активность в превращении АКА в альфа-аминоадипат (ААА) уменьшается при сохранении каталитических функций в отношении биосинтеза других аминокислот или клеточных компонентов. Предпочтительной также является клетка-хозяин, лишенная любой другой ферментативной активности, приводящей к превращению АКА в нежелательный побочный продукт.

- 14 019163

В одной предпочтительной клетке-хозяине, подходящей для получения ААР, использующего процесс биопревращения целых клеток, кодируются один или несколько биокатализаторов, способных катализировать по меньшей мере одну стадию реакции в получении альфа-кетопимелиновой кислоты из альфа-кетоглутаровой кислоты. Подходящими биокатализаторами являются, например, биокатализаторы, описанные выше при обсуждении получения АКР.

Клетка-хозяин может быть, выбрана, например, из бактерий, дрожжей или грибов. В частности, клетка-хозяин может быть выбрана из родов, выбранных из группы АкрегдШик, РешсШшт, 8ассЬаготусек, К1иууеготусе§, Р1сЫа, Сапб1ба, Нап8епи1а, ВасШик, СогупеЬас!егшт, Ркеиботопак, С1исопоЬас1ег, Мебитососсик, Ме111апоЬас1епит, Ме!капоса1бососсик и Мейапокагсша и ЕкскепсШа. Здесь были клонированы и экспрессированы обычно одна или несколько последовательностей нуклеиновых кислот, как описано выше.

В частности, штамм-хозяин и, следовательно, клетка-хозяин, подходящие для биохимического синтеза 6-АСА, могут быть выбраны из группы клеток-хозяев ЕкскебсШа со11, ВасШик киЫШк, ВасШик ату1о1|циеГас1еп8, СогупеЬас!егшт д1и1ат1сит, АкрегдШик п1дег, РешсШшт сНгукодепшп, 8асскаготусек сегУ1к1ае, Напкепи1а ро1утогрЬа, Сапб1ба а1Ь1сапк, К1иууеготусек 1асбк, Р1сЫа кбрШк, РШЫа ракЮпк, МейапоЬас!егшт ШегтоаШоШгорШсит ΔΗ, МеШапососсик тапра1иб1к, МеШапососсик уо11ае, МеШапокагсша асебуогапк, Мейапокагапа Ьагкеп и Мейапокагсша тахег В предпочтительном варианте осуществления эта клетка-хозяин способна продуцировать лизин (в качестве предшественника).

Клетка-хозяин может быть, в принципе, природным организмом или может быть сконструированным генной инженерией организмом. Такой организм может быть сконструирован с использованием скрининга мутаций или стратегиями метаболического конструирования, известными в данной области. В одном конкретном варианте осуществления эта клетка-хозяин природно содержит (или способна продуцировать) один или несколько ферментов, подходящих для катализа стадии реакции в способе этого изобретения, таких как одна или несколько активностей, выбранных из группы декарбоксилаз, аминотрансфераз и дегидрогеназ аминокислот, способных катализировать стадию реакции в способе этого изобретения. Например, Е. со11 может быть природно-способной продуцировать фермент, катализирующий переаминирование в способе этого изобретения. Можно обеспечить также рекомбинантную клетку-хозяина как рекомбинантным геном, кодирующим аминотрансферазу или дегидрогеназу аминокислот, способные катализировать стадию реакции в способе этого изобретения, так и рекомбинантным геном, кодирующим ген декарбоксилазы, способной катализировать стадию реакции в способе этого изобретения.

Например, клетка-хозяин может быть выбрана из рода СогуиеЬас!егшш, в частности СогуиеЬас!егшш дШаткит, кишечных бактерий, в частности 8ассЬаготусек, в частности 8. сегеуыае. Особенно подходящими являются штаммы С. д^аткит или В. шеΐЬаио1^сик, которые были разработаны для промышленного производства лизина.

Далее, это изобретение относится к микроорганизму, который может быть микроорганизмом дикого типа, выделенным из его природного окружения, или рекомбинантным микроорганизмом, содержащим ДНК, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, идентифицированную в любой из 8ЕС) ГО N0, выбранной из группы 8ЕО ГО N0: 3, 8ЕО ГО N0: 6, 8ЕО ГО N0: 13, 8ЕО ГО N0: 32, 8ЕО ГО N0: 35, 8Е0 ГО N0: 41, 8Е0 ГО N0: 44, 8Е0 ГО N0: 47, и их функциональных аналогов.

Функциональные аналоги нуклеотидной последовательности, в данном контексте, являются, в частности, нуклеотидными последовательностями, кодирующими ту же самую аминокислотную последовательность, что и эта нуклеотидная последовательность, или гомологом этой нуклеотидной последовательности. В частности, предпочтительными функциональными аналогами является нуклеотидная последовательность, имеющая сходный, тот же самый или лучший уровень экспрессии в представляющей интерес клетке-хозяине, в сравнении с нуклеотидной последовательностью, называемой ее функциональным аналогом.

Кроме того, это изобретение относится к полинуклеотиду или вектору, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, идентифицированную в 8Е0 ГО N0, выбранной из группы 8Е0 ГО N0: 3, 8 ЕС) ГО N0: 6, 8ЕС) ГО N0: 13, 8ЕС) ГО N0: 32, 8ЕС) ГО N0: 35, 8ЕС) ГО N0: 41, 8ЕС) ГО N0: 44, 8ЕС) ГО N0: 47, и их функциональных аналогов не дикого типа. Такой полинуклеотид или вектор является особенно полезным для обеспечения клетки-хозяина, в частности клетки-хозяина Е. со11, или другой клеткихозяина, которая способна катализировать по меньшей мере одну стадию реакции в превращении АКР в 6-АСА с высоким выходом в сравнении с соответствующим геном дикого типа.

Необязательно, этот полинуклеотид или вектор содержит одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько биокатализаторов, подходящих для катализа стадии реакции в способе по этому изобретению, в частности, такие один или несколько биокатализаторов, приведенные выше.

Кроме того, это изобретение относится к способу получения альфа-аминопимелиновой кислоты (ААР), предусматривающему превращение АКР в ААР, причем это превращение катализируется биокатализатором.

Для такого способа может, в частности, использоваться биокатализатор, имеющий аминотрансферазную активность или активность восстановительного аминирования, как описано выше.

- 15 019163

Как указано выше, ААР может быть, следовательно, использована для получения 6-АСА. Альтернативно, ААР может быть использована как таковая, например, в качестве химикалия для биохимического исследования или в качестве соединения рН-буфера, например, для применения в препаративном или аналитическом способе разделения, таком как жидкостная хроматография или капиллярный электрофорез.

Кроме того, ААР, полученная способом этого изобретения, может дополнительно использоваться в получении другого соединения, например, ААР может быть превращена в капролактам. Как описано выше и иллюстрировано в примере ниже, ААР может быть химически превращена в капролактам, например, подверганием высокой температуре. Не связывая себя теорией, авторы изобретения предполагают, что также и в этой реакции 6-АСА может быть образована в виде короткоживущего промежуточного продукта.

Далее это изобретение будет иллюстрировано следующими примерами.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Примеры Общие способы

Молекулярные и генетические способы

Стандартные генетические способы и способы молекулярной биологии обычно известны в данной области и были описаны ранее (Машабк с1 а1. 1982 Мо1еси1аг с1ошпд: а 1аЬога1огу тапиа1. Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу, Со1б 8ргшд НагЬог, Ν.Υ.; МШег 1972 ЕхрептепЦ ίη то1еси1аг депеВск, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу, Со1б 8ргшд НагЬог; 8атЬгоок апб Кикке11 2001 Мо1еси1аг с1ошпд: а 1аЬога1огу тапиа1 (3гб ебйюп), Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаФгу, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк; Е. АикиЬе1 е1 а1, ебк., Сиггеп1 ргоЮсо1к ш то1еси1аг Ью1оду, Сгееп РиЬйкЫпд апб \УПеу 1п1егкаепсе, Νο\ν Υо^к 1987).

Плазмиды и штаммы рВАЭ/Мук-Н1к С получали из 1пуйгодеп (Саг1кЬаб, СА, И8А). Плазмиду рВАЭ/Мус-Н1к-ПЕ8Т, сконструированную, как описано в \УО 2005/068643, использовали для экспрессии белка. Е. сой ТОР10 (1пу|1годеп, Саг1кЬаб, СА, И8А) использовали для всех процедур клонирования и для экспрессии геновмишеней.

Среды

ЬВ-среду (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л №1С1) использовали для выращивания Е. сой. Антибиотики (50 мкг/мл карбенициллин) добавляли для поддержания плазмид. Для индукции экспрессии генов под контролем промотора Р_ВА0 В произведенных из рВАО/Мус-Н1к-ЭЕ8Т плазмидах, добавляли Ь-арабинозу до конечной концентрации 0,2% (м/о).

Идентификация плазмид

Плазмиды, несущие различные гены, идентифицировали генетическими, биохимическими и/или фенотипическими способами, обычно известными в данной области, такими как устойчивость трансформантов к антибиотикам, рестрикционный анализ очищенной плазмидной ДНК или анализ последовательности ДНК.

Анализ ВЭЖХ-МС для определения 5-ЕУА

5-ЕУА детектировали селективным мониторингом реакции (8КМ)-МС, измеряя переход т/ζ 129 83. Концентрации для 5-ЕУА рассчитывали измерением максимальной площади пика 5-ЕУА, элюирующегося при приблизительно 6 мин. Калибровку выполняли с использованием процедуры наружного стандарта. Все ЖХ-МС-эксперименты выполняли на системе АдПеп1 1200 ЖХ, состоящей из насоса для нагнетания четырех компонентных смесей, автоматического пробоотборника и термостата для колонок, соединенных с Адбеп1 6410 000 1г1р1е с.|иабгиро1е М8.

Условия жидкостной хроматографии (ЖХ):

Колонка: 50 х 4,6 мм №.1с1еокб С18, 5 мкм (Масйегу & №де1) на колонку, соединенную с колонкой 250 х 4,6 мм вн. диам. Ргеуай С18, 5 мкм (А111ес11)

Температура колонок: комнатная температура

Элюент: А: вода, содержащая 0,1% муравьиную кислоту

В: ацетонитрил, содержащий 0,1% муравьиную кислоту

Градиент: время (мин) % элюента В

010

650

6,110

1110

Скорость потока: 1,2 мл/мин, перед вхождением в МС поток разделяется 1:3

Объем инжекции: 2 мкл

Условия масс-спектрометрии (МС):

Ионизация: электрораспыление отрицательных ионов условия источника: напряжение электрораспыления: 5 кВ

- 16 019163 температура: 350°С оптимизированные напряжение фрагментирующего устройства и энергия соударений

Режим сканирования: режим селективной реакции: переход т/ζ 129 83

Анализ ВЭЖХ-МС для определения ААР

ААР детектировали селективным мониторингом ионов (8ΙΜ)-Μ0, измеряя протонированную молекулу для ААР с т/ζ 176. Концентрации для ААР рассчитывали измерением максимальной площади пика ААР, элюирующегося при времени удерживания 2,7 мин в этих пробах. Калибровку выполняли с использованием процедуры наружных стандартов. Все ЖХ-МС-эксперименты выполняли на системе Адйеп! 1100 ЖХ, состоящей из насоса для нагнетания четырех компонентных смесей, аппарата для дегазации, автоматического пробоотборника и термостата для колонок, соединенных с ΑΡΙ 2000 1г1р1е сщабгиро1е Μ8 (Аррйеб Β^ο8уйет8).

Условия ЖХ были следующими:

Колонка: 50*4 №с1ео41 С18, 5 мкм (Μα^ι^-Να^1) + 250 х 4,6 Ргеуай С18, 5 мкм (А111есН), обе при комнатной температуре (КТ)

Элюент: А = 0,1% (о/о) муравьиная кислота в сверхчистой воде

В = 0,1% (о/о) муравьиная кислота в ацетонитриле (ра, Μе^ск)

Скорость потока: 1,2 мл/мин, перед вхождением в МС этот поток разделяли 1:3

Градиент: Градиент начинался при !=0 мин с 90% (о/о) А и изменялся в пределах 6 мин до 50% (о/о) А. При 6,1 мин этот градиент изменяли до первоначального состояния.

Объем инжекции: 2 мкл

Условия МС: Для ионизации использовали электрораспыление положительных ионов

Детектирование: в режиме 8ΙΜ на т/ζ 176, с интервалом времени 100 мс.

Анализ ВЭЖХ-МС для определения 6-АСА

Калибровка:

Калибровку выполняли при помощи наружной калибровочной линии 6-АСА (т/ζ 132 т/ζ 114, К! 7,5 мин). Все ЖХ-МС-эксперименты выполняли на АдПеп! 1100, снабженном насосом для нагнетания четырех компонентных смесей, аппаратом для дегазации, автоматическим пробоотборником и термостатом для колонок и 51пд1е-с.|иаПгиро1е Μ8 (АдПеп!, να1Π0Γοηη, Оегшапу). Условия ЖХ-МС были следующие:

Колонка: 50*4 №с1ео41 С18, 5 мкм (Μасйе^еу-Nаде1) + 250 х 4,6 РгеуаП С18, 5 мкм (А11!есй), обе при комнатной температуре (КТ)

Элюент: А = 0,1% (о/о) муравьиная кислота в сверхчистой воде

В = 0,1% (о/о) муравьиная кислота в ацетонитриле (ра, Μе^ск)

Скорость потока: 1,0 мл/мин, перед вхождением в МС этот поток разделяли 1:3

Градиент: Градиент начинался при !=0 мин с 100% (о/о) А, оставаясь таким же в течение 15 мин, и изменялся в пределах 15 мин до 80% (о/о) В. (!=30 мин). От 30 до 31 мин градиент выдерживали при постоянных 80% (о/о) В.

Объем инжекции: 5 мкл

Детектирование МС: Е51(+)-МС

Электрораспылительную ионизацию (Ε8Ι) проводили в положительном режиме сканирования со следующими условиями: т/ζ 50-500, устройство для фрагментации 50 В, размер ступени т/ζ 0,1, температура газа для сушки 350°С, газ для сушки 10 л ^/мин, давление распылителя 50 фунт/квадр.дюйм (50 х 6894, 757 Па) и напряжение капилляров 2,5 кВ.

Клонирование генов-мишеней

Конструирование экспрессионных конструкций

Сайты а!® добавляли ко всем генам слева от сайта связывания рибосом и инициирующего (стартового) кодона и справа от терминирующего кодона для облегчения клонирования с использованием технологии Са1е\уау Дпуйгодеп, СагкЬаб, СА, υ8Α).

Синтез генов и конструирование плазмид

Синтетические гены получали из ОНА2,0 и оптимизировали в отношении кодонов для экспрессии в Е. сой в соответствии со стандартными процедурами ОНА2,0. Гены аминотрансферазы из У1Ь1то Пиу1а118 1817 [8Εφ ΙΌ №. 1] и Βτα11ιΐ5 \\'ей1еп51ер11апеп515 ΚΒΑΒ4 [8Εφ ΙΌ №. 4], кодирующие аминокислотные последовательности ω-аминотрансферазы V. Πι.ινίη1ί5 1817 [8Εφ ΙΌ №. 2] и аминотрансферазы В. \\οίйепйерйаиепык ΚΒΑΒ4 (ΖΡ_01186960) [8Εφ ΙΌ №. 5], соответственно, оптимизировали в отношении кодонов и полученные последовательности [8Εφ ΙΌ №. 3] и [8Εφ ΙΌ №. 6] получали синтезом ДНК.

Гены декарбоксилазы из Н5с11епс1па сой [8Εφ ΙΌ №. 30], 8ассйагошусе5 сегеуШае [8Εφ ΙΌ №. 33], Ζутοтοиа8 тоЫШ [8Εφ ΙΌ №. 36], Ьас!ососси8 1асЙ8 [8Εφ ΙΌ №. 39], [8Εφ ΙΌ №. 42] и ΜусοЬас!е^^ит Ц|Ьегси1о515 [8Εφ ΙΌ №. 45], кодирующие аминокислотные последовательности ω-аминотрансферазы V. Πιινίη1ί5 1817 |8ΕΟ ΙΌ №. 3], аминотрансферазы В. \\'еП1еп51ер11апеп515 ΚΒΑΒ4 (ΖΡ01186960) [8Εφ ΙΌ №. 6], диаминопимелатдекарбоксилазы ЬукА Н5с11епс1па сой [8Εφ ΙΌ №. 31], пируватдекарбоксилазы РПс 8ассйагошусе5 сегеуШае [8Εφ ΙΌ №. 34], пируватдекарбоксилазы РПсР472А Ζутοтοиа8 тоЫШ [8Εφ ΙΌ

- 17 019163

Νο. 37], декарбоксилазы альфа-кетокислоты с разветвленной цепью КбсЛ |5ЕЦ Ш Νο. 40] и альфакетовалератдекарбоксилазы КЕБ Ьас1ососси§ 1асй§ |ЗЕЦ Ш Νο. 43] и альфа-кетовалератдекарбоксилазы Кдб МусоЬас1спит (иЬсгсЫоЛ |5ЕЦ Ш Νο. 46], соответственно, оптимизировали в отношении кодонов и полученные последовательности |5ЕЦ Ш Νο. 32], |5ЕЦ Ш Νο. 35], |5ЕЦ Ш Νο. 38], |5ЕЦ Ш Νο. 41], |5ЕЦ Ш Νο. 44] и |5ЕЦ Ш Νο. 47] получали синтезом ДНК соответственно.

Эти конструкции генов клонировали в экспрессирующие векторы рВАБ/АМус-НЦ-БЕ^Т с использованием технологии Са1е\тау (Ιηνίίτο^η) с использованием введенных сайтов аНВ и ρΌΘΝΚ201 (Ιηνί1годсп) в качестве вводимого (еп1гу) вектора, как описано в протоколах изготовителя (\ν\ν\ν.ίηνίΙΐΌ^2η^οιη). Таким путем получали экспрессирующие векторы рВАБ-УЕЦАТ и рВАБ-Вте_АТ соответственно. Соответствующие экспрессионные штаммы получали трансформацией химически компетентной Е. юН ТОР10 (Ιηνίίτο^η) соответствующими рВАБ-экспрессирующими векторами.

Клонирование при помощи ПЦР

Различные гены, кодирующие биокатализатор, амплифицировали из геномной ДНК с использованием РСК 8ирегт1х Н1дй Е1бе1йу (Ιηνίίτο^η) в соответствии с описаниями изготовителя с использованием праймеров перечисленных в следующей таблице.

Таблица 2

Источник гена	8Еф Ю ΝΟ: гена	8ЕБ ГО ΝΟ: фермента	8Е(2 ГО ΝΟ: праймера
Рзеидотопаз аегифпоза	7	8	9 и 10
РзеиДотопаз аеги&поза	26	27	60 и 61
Рзеидотоназ аеги^пюза	66	67	72 и 73
Рзеи^отопаз аеги&поза	68	69	74 и 75
ВасгНиз зиЬНИз	14	15	48 и 49
ВасШиз зиЬННз	16	17	50 и 51
ВасШиз зиЬПНз	64	65	70 и 71
Яко(1оЬас1ег хркаего^ез	18	19	52 и 53
Ье^юпеИа рпешпорЫНа	20	21	54 и 55
ИИгозота! еигораеа	22	23	56 и 57
Иейзепа яопоггкоеае	24	25	58 и 59
КкоВорзеиВотопаз ра!из1пз	28	29	62 и 63

ПЦР-реакции анализировали электрофорезом в агарозном геле и продукты ПЦР правильного размера элюировали из этого геля с использованием набора для очистки О^сциск (^адем, НПбещ Сегтану). Очищенные продукты ПЦР клонировали в экспрессирующие векторы рВАБ/Мус-НЦ-БЕ8Т с использованием технологии Са1е\\^гау (Ιηνίίτο^η) с применением введенных сайтов аНВ и ρ^ОNК-ζеο (Ιηνίίτο^η) в качестве егИгу-вектора. как описано в протоколах изготовителя. Последовательность генов, клонируемых при помощи ПЦР, подтверждали секвенированием ДНК. Таким путем были получены экспрессирующие векторы ρВА^-Рае-_д^9946143_ЛТ, рВАБ-В5и_д116078032_АТ, рВАБВ8и_ё116080075_АТ, рВАБ-Вки_§116077991__АТ, рВАБ-К8р__АТ, рВАБ-Ьр^АТ, рВАВ-Хеи_АТ, рВАБΝ^ο^Έ рВАБ-Рае_”19951299_АТ, рВАБ-Рае_”19951072_АТ, рВАБ-Рае_”19951630_АТ и рВАБКра_АТ. Соответствующие экспрессионные штаммы получали трансформацией химически компетентной Е. юН ТОР10 (Ιηνίίτο^η) соответствующими конструкциями рВАБ.

Выращивание Е. сой для экспрессии белка

Выращивание в малом масштабе проводили в 96-луночных планшетах с глубокими лунками с 940 мкл среды, содержащей 0,02% (м/о) Ь-арабинозу. Инокуляцию выполняли перенесением клеток из замороженных исходных культур в 96-луночную матрицу (Кикйпег, ВиЛеНеи, ЕлуЦхегктб). Планшеты инкубировали на орбитальном шейкере (300 об/мин, амплитуда 5 см) при 25°С в течение 48 ч. Обычно дости^галась ОБ620нм ^2-4.

Приготовление лизатов клеток Приготовление лизисного буфера

Лизисный буфер содержал следующие ингредиенты:

- 18 019163

Таблица 3

1М МОРЯ рН 7,5	5 мл
ДНКаза I категории II (КосЬе)	10 мг
Лизоцим	200 мг
Мя8О4.7Н2О	123,2 мг
дитиотреитол (ДТТ)	154,2 мг
Н2О (МП НО)	Остальное до 100 мл

Этот раствор готовили непосредственно перед применением.

Приготовление бесклеточного экстракта при помощи лизиса

Клетки из выращивания малого масштаба (см. предыдущий абзац) собирали центрифугированием и супернатант выбрасывали. Осадки клеток, образованные во время центрифугирования, замораживали при -20°С в течение по меньшей мере 16 ч и затем оттаивали на льду. 500 мкл свежеприготовленного лизисного буфера добавляли в каждую лунку и клетки ресуспендировали сильным перемешиванием этого планшета на вортексе в течение 2-5 мин. Для достижения лизиса планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Для удаления остатков клеток планшет центрифугировали при 4°С и 6000 д в течение 20 мин. Супернатант переносили в свежий планшет и хранили на льду до дальнейшего использования.

Получение бесклеточного экстракта обработкой ультразвуком

Клетки из выращивания в средних масштабах (см. предыдущий абзац) собирали центрифугированием и супернатант выбрасывали. 1 мл калий-фосфатного буфера рН 7 добавляли к 0,5 г сырого осадка клеток и клетки ресуспендировали сильным перемешиванием на вортексе. Для достижения лизиса эти клетки обрабатывали ультразвуком в течение 20 мин. Для удаления остатков клеток эти лизаты центрифугировали при 4°С и 6000 д в течение 20 мин. Супернатант переносили в свежую пробирку и замораживали при -20°С до дальнейшего использования.

Получение 5-формилпентановой кислоты химическим гидролизом метил-5-формилпентаноата

Субстрат для аминотрансферазной реакции, т.е. 5-формилпентановую кислоту, получали химическим гидролизом метил-5-формилпентаноата следующим образом: 10% (м/о) раствор метил-5формилпентаноата в воде доводили до рН 14,1 при помощи ЫаОН. После 24 ч инкубации при 20°С рН доводили до 7,1 при помощи НС1.

Ферментативные реакции для превращения 5-формилпентановой кислоты в 6-АСА

Если нет других указаний, готовили реакционную смесь, содержащую 10 мМ 5формилпентановоую кислоту, 20 мМ рацемический α-метилбензиламин и 200 мкМ пиридоксаль-5'фосфат, в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,0. 100 мкл этой реакционной смеси наливали в каждую лунку планшетов с лунками. Для инициирования этой реакции, добавляли 20 мкл бесклеточных экстрактов, в каждую из лунок. Реакционные смеси инкубировали на шейкере при 37°С в течение 24 ч. Кроме того, химическую смесь в качестве контрольной пробы (слепого опыта) (без бесклеточного экстракта) и биологическую контрольную пробу (Е. сой ТОР10 с рВАО/Мус-Ηίδ С) инкубировали при тех же самых условиях. Пробы анализировали с использованием ВЭЖХ-МС. Результаты суммированы в следующей таблице.

Таблица 4. Образование 6-АСА из 5-ЕУА в присутствии аминотрансфераз

Биокатализатор	Концентрация 6-АСА [мг/кг]
Е. АТ	43*
£ сой ТОР ΙΟ/ρΒΑϋ-Рое АТ	930
Е. соПЛОРШрЪЬВ-Рае АТ	25*
Е. соН ΤΟΡΙΟ/ρΒΑΌ-Ви’е АТ	24*
£. сой ТОРЮ/рВАО-В^и р 16077991 АТ	288
£ сой ТОР 10/ρΒΑϋ-Ραβ Ф9951072 АТ	1087
£. сой ΤΟΡΙΟ/ρΒΑϋ-Ροο £19951630 АТ	92
£. сой ТОРЮ ννίΐΗ рВАО/Л/ус-Нш С (биологический контроль)	0,6
Ничего (химический контроль)	η.ά.

η.ά.: не детектируется *способ отличается тем, что использовали 10 мкл бесклеточного экстракта вместо 20 мкл, концентрация пиридоксаль-5'-фосфата была 50 мкМ вместо 200 мкМ и объем реакционной смеси в этих лунках был 190 мкл вместо 100 мкл.

Показано, что 6-АСА образуется из 5-ЕУА в присутствии аминотрансферазы.

Ферментативные реакции для превращения АКР в 5-формилпентановую кислоту

Готовили реакционную смесь, содержащую 50 мМ АКР, 5 мМ хлорид магния, 100 мкМ пиридоксаль-5'-фосфат (для ЬукА) или 1 мМ тиаминдифосфат (для всех других ферментов) в 100 мМ калийфосфатном буфере, рН 6,5. 4 мл этой реакционной смеси наливали в реакционный сосуд. Для запуска

- 19 019163 реакции, добавляли 1 мл бесклеточных экстрактов, полученных обработкой ультразвуком, в каждую из лунок. В случае коммерческой оксалоацетатдекарбоксилазы (81дта-А1бг1сй ргобиск питЬег 04878), использовали 50 Е. Реакционные смеси инкубировали с магнитной мешалкой при 37°С в течение 48 ч. Кроме того, при тех же самых условиях инкубировали смесь химической контрольной пробы (без бесклеточного экстракта) и биологическую контрольную пробу (Е. со11 Т0Р10 с рВАЭ/Мус-Н15 С). Пробы из различных временных точек во время этой реакции анализировали при помощи ВЭЖХ-МС. Результаты суммированы в следующей таблице.

Таблица 5. Образование 5-ЕУА из АКР в присутствии декарбоксилаз

Биокатализаторы	Концентрация 5-ЕУА [мг/кг]
3 ч	18 ч	48 ч
Е. со/УТОРЮ/рВАО-ЕузА	150	590	720
Е. соДТОРЮ/рВАО-Рбс	1600	1700	1300
Е. со//ТОР10/рВАП-Рбс1472Д.	2000	2000	1600
Е. соИ ТОРЮ/рВАО-КбсА	3300	2300	2200
Е. со/гТОРЮ/рВАО-Κινϋ	820	1400	1500
Оксалоацетат-декарбоксилаза	п.б.	6	10
Е. соИ ТОР 10 с рВАВ/ЛАс-Н1к С (биологический контроль)	п.б.	п.б.	п.б.
Ничего (химический контроль)	п.б.	п.б.	п.б.

п.б.: не детектируется

Показано, что 5-ЕУА образуется из АКР в присутствии декарбоксилазы.

Ферментативные реакции для превращения АКР в 6-АСА в присутствии декарбоксилазы

Готовили реакционную смесь, содержащую 50 мМ АКР, 5 мМ хлорид магния, 100 мкМ пиридоксаль-5'-фосфат (для ЬукА) или 1 мМ тиаминдифосфат (для всех других ферментов) в 100 мМ калийфосфатном буфере, рН 6,5. 4 мл этой реакционной смеси наливали в реакционный сосуд. Для запуска реакции, добавляли 1 мл бесклеточных экстрактов в каждую из лунок. Реакционные смеси инкубировали с магнитной мешалкой при 37°С в течение 48 ч. Кроме того, при тех же самых условиях инкубировали смесь химической контрольной пробы (без бесклеточного экстракта) и биологическую контрольную пробу (Е. сой Т0Р10 с рВАЭ/Мус-Н15 С). Пробы из различных временных точек во время этой реакции анализировали при помощи ВЭЖХ-МС. Результаты суммированы в следующей таблице.

Таблица 6. Образование 6-АСА из АКР в присутствии декарбоксилаз

Биокатализаторы	Концентрация 6-АСА [мг/кг]
Зч	18ч	48 ч
Е. соИ ТОРЮ/рВАО-Ьу5А	п.а.	0,01	0
Е. соН ТОР 10/рВ АО-РЖ	0,1	0,3	п.а.
Е. со//ТОР10/рВАО-Рбс1472А	0,03	0,1	0.2
Е. со/г ΤΟΡΙΟ/ρΒΑϋ-КЖА	0,04	0,1	0.3
Е. соН ΤΟΡΙΟ/ρΒΑΟ-ΚινΟ	п.а.	0,3	0.6
Е. соИ ТОРЮ с рВАО/Л/ус-Ηίε	п я	п Я	п Я
С (биологический контроль)
Ничего (химический контроль)	η.ά.	η.ά.	η.ά.

п.а. = не анализировали п.б. = не детектируется

Показано, что 6-АСА образуется из АКР в присутствии декарбоксилазы. Предполагается, что эта Е. со11 содержала природную 5-ЕУА-аминотрансферазную активность.

Ферментативные реакции для превращения АКР в 6-АСА в присутствии рекомбинантной декарбоксилазы и рекомбинантной аминотрансферазы

Готовили реакционную смесь, содержащую 50 мМ АКР, 5 мМ хлорид магния, 100 мкМ пиридоксаль-5'-фосфат, 1 мМ тиаминдифосфат и 50 мМ рацемический α-метилбензиламин в 100 мМ калийфосфатном буфере, рН 6,5. 1,6 мл этой реакционной смеси наливали в реакционный сосуд. Для запуска реакции, добавляли 0,2 мл содержащего декарбоксилазу бесклеточного экстракта, в каждый из реакционных сосудов. Реакционные смеси инкубировали с магнитной мешалкой при 37°С в течение 48 ч. Кроме того, при тех же самых условиях инкубировали смесь химической контрольной пробы (без бесклеточного экстракта) и биологическую контрольную пробу (Е. сой Т0Р10 с рВАЭ/Мус-Н15 С). Пробы из различных временных точек во время этой реакции анализировали при помощи ВЭЖХ-МС. Результаты суммированы в следующей таблице.

- 20 019163

Таблица 7. Образование 6-АСА из АКР в присутствии рекомбинантной декарбоксилазы и рекомбинантной аминотрансферазы

	Концентрация 6-АСА [мг/кг] после 48 часов
АТ ос	Е. соП ТОРЮ/ рВАО-УЛ-АТ	Е. соН ТОР 10/ рВАО-Вте-АТ	Е. соП ТОРЮ/ рВАЕΡΑΕ_§ί9946143 А Т
Е. соП ТОРЮ/ рВАО-РТ	183,4	248,9	117,9
Е. соП ТОРЮ/ рВЛО-Р<1с1472Л	458,5	471,6	170,3
Е. соП ТОРЮ/ рВАО-КбсА	497,8	497,8	275,1
Е. соП ТОРЮ/ ρΒΑΟ-ΚϊνΟ	510,9	510,9	314,4

АТ= аминотрансфераза

ОС=декарбоксилаза

В химическом контроле и в биологическом контроле 6-АСА была недетектируемой.

Кроме того, эти результаты показывают, что в сравнении с примером, в котором использовали клетку-хозяин только с рекомбинантной декарбоксилазой (и без рекомбинантой аминотрансферазы), превращение в 6-АСА улучшалось.

Конструирование плазмид для экспрессии аминотрансфераз и декарбоксилаз в 8. еегеуЫае

Ген аминотрансферазы из У1Ьгю Лцу1а11з 1817, кодирующий аминокислотную последовательность ε-аминотрансферазы У. Лцу1а11з 1817 [8Еф ГО Ыо. 2], амплифицировали при помощи ПЦР из рВАЭУГ1_АТ [8Еф ГО Ыо. 3] с использованием ДНК-полимеразы РЬизюп (Ттпхутез) в соответствии с описаниями изготовителей и с использованием специфических праймеров [8Еф ГО Ыо. 76 и 77].

Ген аминотрансферазы из Рзеиботопаз аегидтоза [8Еф ГО Ыо. 7], кодирующий аминотрансферазу Р. аегидшоза [8Еф ГО Ыо. 8], амплифицировали из рВАЭ-Рае_АТ при помощи ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Р1шзюп (Ттпхутез) в соответствии с описаниями изготовителей и с использованием специфических праймеров [8Еф ГО Ыо. 78 и 79].

Полученные продукты ПЦР клонировали в вектор рАКР-41 с использованием рестрикционных ферментов 8ре1 и ВатН1 с получением векторов рАКР-79 и рАКР-80 соответственно, которые теперь содержат ген аминотрансферазы под контролем промотора да110 8. сегеу1з1ае и терминатора абЬ2 8. сегеУ1з1ае.

Ген декарбоксилазы из 8ассЬагатусез сегеу1з1ае [8Еф ГО Ыо. 33], кодирующий пируватдекарбоксилазу Рбс 8ассЬагатусез сегеу1з1ае [8Еф ГО Ыо. 34], амплифицировали из рВАЭ-Рбс с использованием ДНК-полимеразы РЬизюп (Ттпхутез) в соответствии с описаниями изготовителей и с использованием специфических праймеров [8Еф ГО Ыо. 80 и 81].

Ген декарбоксилазы из ЬасЮсосспз 1асйз [8Еф ГО Ыо. 39], кодирующий декарбоксилазу КбсА кетокислот с разветвленной цепью ЬасЮсосспз 1асйз [8Еф ГО Ыо. 40], амплифицировали из рВАЭ-КбсА с использованием ДНК-полимеразы РЬизюп (Е^ииζутез) в соответствии с описаниями изготовителей и с использованием специфических праймеров [8Еф ГО Ыо. 82 и 83].

Полученные продукты ПЦР клонировали в вектор рАКР-44 с использованием рестрикционных ферментов Азс1 и ВатН1 с получением векторов рАКР-81 и рАКР-82 соответственно, которые теперь содержат ген декарбоксилазы под контролем промотора да12 8. сегеу1з1ае и терминатора рта1 8. сегеУ1з1ае.

Плазмиды рАКР-79 и рАКР-80 расщепляли рестрикционными ферментами 8ас1 и ХЬа1 и плазмиды рАКР-81 и рАКР-82 расщепляли рестрикционными ферментами 8а11 и ХЬа1. 8ас1/ХЬа1-фрагмент аминоферазы соединяли с 8а11/ХЬа1-фрагментом декарбоксилазы в низкокопийный эписомный вектор рК8414

8. сегеу1з1ае, который расщепляли рестрикционными ферментами 8а11 и 8ас1.

Получали следующие плазмиды:

рАКР-85: Р§а110-Рае_АТ-ТабЬ2 Р§а12-Рбс_ОС-Трта1 рАКР-86: Р§а110-Рае_АТ-ТабЬ2 Р§а12-КбсА_ОС-Трта1 рАКР-87: Реа110-УЯ_АТ-ТабЬ2 Рй.а12-Р<1с_ОС-1рта1 рАКР-88: Р§а110-\ТЦАТ-ТабЬ2 Р,5а12-Кс1сА_ОС-Трта1 Трансформация и выращивание 8. еегеуЫае

Штамм 8. сегеу1з1ае СЕЫ.РК113-3С трансформировали 1 мкг плазмидной ДНК согласно способу, описанному С1е1/ и ХУообз (С|е1х, КТО. апб ХУообз, К.А. (2002). ТгапзГоппабоп оГ уеаз! Ьу Не Ыас/88 сагпег ОЫА/РЕС те1Ьоб. Ме!Ьобз ш Епхуто1оду 350: 87-96). Клетки высевали на чашки с агаром с 1х азотистым основанием дрожжей без аминокислот и 2% глюкозы.

- 21 019163

Полученные штаммы выращивали аэробно при 30°С в течение 48 ч в минимальной среде Уегбиуп, содержащей 0,05% глюкозу и 4% галактозу.

Получение бесклеточного экстракта мл калий-фосфатного буфера (рН 7) добавляли к 0,5 г осадка клеток. Эту смесь добавляли в пробирку Эппендорфа на 2 мл, которая содержала 0,5 г стеклянных гранул (бусин) с диаметром 0,4-0,5 мм. Пробы сильно встряхивали с использованием шейкера Эппендорфа (ΙΚΑ У1ВКАХ-УХК.) в течение 20 с. Полученный бесклеточный экстракт центрифугировали в течение 5 мин 14000 об./мин и 4°С. Этот супернатант использовали для анализов активности ферментов.

Ферментативные реакции для превращения АКР в 6-АСА в присутствии декарбоксилазы и аминотрансферазы, коэкспрессируемых в 8. еегеуЫае

Готовили реакционную смесь, содержащую 50 мМ АКР, 5 мМ хлорид магния, 100 мкМ пиридоксаль-5'-фосфат, 1 мМ тиаминдифосфат и 50 мМ рацемический α-метилбензиламин в 100 мМ калийфосфатном буфере, рН 6,5. 1,6 мл этой реакционной смеси наливали в реакционный сосуд. Для запуска реакции, добавляли 0,4 мл бесклеточного экстракта из 8. сегеу1в1ае, содержащего декарбоксилазу и аминотрансферазу, в каждый из реакционных сосудов. Реакционные смеси инкубировали с магнитной мешалкой при 37°С. Кроме того, при тех же самых условиях инкубировали смесь химической контрольной пробы (без бесклеточного экстракта) и биологическую контрольную пробу (8. сегеу1в1ае). Пробы, взятые после 19 ч инкубирования, анализировали при помощи ВЭЖХ-МС. Результаты суммированы в следующей таблице.

Таблица 8. Образование 6-АСА из АКР с использованием микроорганизма в качестве биокатализатора

Биокатализатор	Концентрация 6-АС А [мг/кг]
5, сегетшае рАКР-85	63
А. сегеуйгае рАКР-86	226
5. сегеуй1ае рАКР-87	1072
А сегеу&ае рАКР-88	4783
А. сегеушае (биологический контроль)	3,9
Ничего (химический контроль)	1,3

Ферментативные реакции для превращения α-кетопимелиновой кислоты в α-аминопимелиновую кислоту

Готовили реакционную смесь, содержащую 10 мМ α-кетопимелиновую кислоту, 20 мМ Ь-аланин и 50 мкМ пиридоксаль-5'фосфат в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,0. 800 мкл реакционной смеси наливали в каждую лунку многолуночных планшетов. Для запуска реакции, добавляли 200 мкл лизатов клеток в каждую из этих лунок. Реакционные смеси инкубировали на шейкере при 37°С в течение 24 ч. Кроме того, при тех же самых условиях инкубировали смесь химической контрольной пробы (без бесклеточного экстракта) и биологическую контрольную пробу (Е. сой ТОР10 с рВАЭ/Мус-Шв С). Пробы анализировали при помощи ВЭЖХ-МС. Результаты суммированы в следующей таблице.

Таблица 9. Образование ААР из АКР в присутствии аминотрансфераз

Биокатализаторы	Концентрация ААР [мг/кг] (после 24 ч)
Е. со/ί ΤΟΡΙΟ/ρΒΑϋ-^ АТ	3,7
Е. соП ТОР 10/ρΒΑϋ-Λψ АТ	15,8
Е. οο/ίΤΟΡΙΟ/ρΒΑϋ-βϊκ 16078032 АТ	И,2
Е. соН ΙΌΡΙΟ/ρΒΑΒ-Αΐρ АТ	9,8
Е. %П6080075 АТ	4,6
Е. οοΛ'ΤΟΡ10/ρΒΑϋ-2> АТ	5,4
Е. οο/ίΤΟΡΙΟ/ρΒΑϋ-Уеи АТ	7,7
Е. οο/ζΤΟΡΙΟ/ρΒΑϋ-Удо АТ	5,1
ТОР 10/ρΒΑϋ-Ρίκ §19951299 АТ	5,6
Е. со/ί ΤΟΡΙΟ/ρΒΑϋ-Ρρβ АТ	5,4
Е. соН ТОРЮ τνΐώ ρΒΑΟ/Μν-Ηίί. С (биологический контроль)	1,4
Ничего (химический контроль)	0

Показано, что образование ААР из АКР катализируется биокатализатором.

Химическое превращение ААР в капролактам

К суспензии 1,5 г Ό,Ε-2-аминопимелиновой кислоты в 21 мл циклогексанона добавляли 0,4 мл циклогексенона. Эту смесь нагревали на масляной бане в течение 20 ч при дефлегмации (приблизительно 160°С). После охлаждения до комнатной температуры эту реакционную смесь декантировали и прозрачный раствор упаривали при пониженном давлении. Оставшиеся 2 г коричневатого масла анализировали при помощи 'Н-ЯМР и ВЭЖХ, и они содержали 0,8 мас.% капролактама и 6 мас.% циклических олигомеров капролактама.

Claims (22)

1. Способ получения 6-аминокапроновой кислоты, в котором:

(ί) α-кетопимелиновую кислоту превращают в 5-формилпентаноат и (ίί) 5-формилпентаноат превращают в 6-аминокапроновую кислоту, где по меньшей мере одна реакция катализируется биокатализатором, где биокатализатор для стадии (ί) включает фермент, способный катализировать декарбоксилирование α-кетопимелиновой кислоты или аминокислоты, и биокатализатор для стадии (ίί) включает фермент, способный катализировать переаминирование и/или восстановительное аминирование.

2. Способ по п.1, в котором фермент, способный катализировать переаминирование и/или восстановительное аминирование, выбирают из группы аминотрансфераз (Е.С. 2.6.1) и дегидрогеназ аминокислот (Е.С.1.4.1).

3. Способ по п.2, в котором аминотрансферазу или дегидрогеназу аминокислот выбирают из группы в-аминоизобутират:а-кетоглутарат-аминотрансфераз, β-аланин-аминотрансфераз, аспартатаминотрансфераз, 4-аминобутират-аминотрансфераз, (ЕС 2.6.1.19), Ь-лизин-6-аминотрансферазы (ЕС 2.6.1.36), 2-аминоадипат-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.39), 5-аминовалерат-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.48), 2-аминогексонат-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.67), лизин:пируват-6-аминотрансфераз (ЕС 2.6.1.71) и лизин-6-дегидрогеназ (ЕС 1.4.1.18).

4. Способ по п.2 или 3, в котором фермент выбирают из группы ферментов, способных катализировать переаминирование и/или восстановительное аминирование из организма, выбранного из группы УШгю; Ркеиботопак; ВасШик; МегсштаПк; Акр1ешит; Сега!оша; млекопитающих; Иеигокрога; ЕксЕепсШа; ТНегтик; ЗассНаготусек; Вгеу1Ьас!егшт; СогупеЬас!егшт; Рго!еик; АдгоЬас!егшт; СеоЬасШик; АстеЮЬас1ег; Ва1к1оша; 8а1топе11а; ВНобоЬасЮг и З!арйу1ососсик, в частности из организма, выбранного из группы ВасШик киЫШк, ВасШик тее1йепк!ерйаиеп81к, ВНобоЬасЮг крйаего1бек, З1арНу1ососсик аигеик, Бедюпе11а рпеиторЫ1а, Ийгокотопак еигораеа, №ккепа допоггЕоеае, Ркеиботопак кугтдае, ВНоборкеиботопак ра1ик!пк, УШгю ПтТ-Шк и Ркеиботопак аегидтока.

5. Способ по любому из пп.2-4, в котором используют аминотрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, соответствующую 8Е0 ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 5, 8Е0 ГО N0: 8, 8Е0 ГО N0: 12, ЗЕО ГО N0: 15, ЗЕО ГО N0: 17, ЗЕО ГО N0: 19, ЗЕО ГО N0: 21, ЗЕО ГО N0: 23, ЗЕО ГО N0: 25, ЗЕО ГО N0: 27, ЗЕО ГО N0: 29, ЗЕО ГО N0: 65, ЗЕО ГО N0: 67, ЗЕО ГО N0: 69, или гомолог любой из этих последовательностей.

6. Способ по п.1, в котором ферментом, способным катализировать декарбоксилирование, является декарбоксилаза (ЕС 4.1.1).

7. Способ по п.6, где декарбоксилазу выбирают из группы глутаматдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.15), диаминопимелатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.20), аспартат-1-декарбоксилаз (ЕС 4.1.1.11), декарбоксилаз αкетокислот с разветвленной цепью, α-кетоизовалератдекарбоксилаз, α-кетоглутаратдекарбоксилаз, пируватдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.1) и оксалоацетаткарбоксилаз (ЕС 4.1.1.3).

8. Способ по п.6 или 7, в котором фермент, способный катализировать декарбоксилирование, является ферментом из организма или его части, выбранных из группы СисигЬйасеае; ЗассНаготусек; Сапб1ба; Напкепи1а; К1иууеготусек; ВЫ/орик; №игокрога; 2утотопак; ЕксНепсЫа; МусоЬасЮгтт; С1ок1г1б1ит; БасЮЬасШик; ЗИерЮсоссик; Ркеиботопак и БасЮсоссик.

9. Способ по любому из пп.6-8, в котором фермент, способный катализировать декарбоксилирование, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую ЗБО ГО N0: 31, ЗЕО ГО N0: 34, ЗЕО ГО N0: 37, ЗЕО ГО N0: 40, ЗЕО ГО N0: 43 или ЗЕО ГО N0: 46, или гомолог любой из этих последовательностей.

10. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором α-кетопимелиновую кислоту биокаталитически превращают в 5-формилпентаноат в присутствии биокатализатора, способного катализировать декарбоксилирование α-кетокислоты, и 5-формилпентаноат биокаталитически превращают в 6аминокапроновую кислоту в присутствии по меньшей мере одного донора аминогруппы и по меньшей мере одного биокатализатора, способного катализировать переаминирование и/или восстановительное аминирование 5-формилпентаноата.

11. Способ получения 6-аминокапроновой кислоты, в котором α-кетопимелиновую кислоту биокаталитически превращают в α-аминопимелиновую кислоту в присутствии по меньшей мере одного донора аминогруппы и по меньшей мере одного биокатализатора, способного катализировать переаминирование и/или восстановительное аминирование α-кетопимелиновой кислоты с образованием посредством этого α-аминопимелиновой кислоты, и α-аминопимелиновую кислоту биокаталитически превращают в 6-аминокапроновую кислоту в присутствии биокатализатора, способного катализировать декарбоксилирование аминокислоты.

12. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором α-кетопимелиновая кислота получена из природного источника.

13. Способ получения капролактама, предусматривающий циклизацию 6-аминокапроновой кисло

- 23 019163 ты, полученной способом по любому из предыдущих пунктов, с образованием посредством этого капролактама.

14. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с активностью декарбоксилазы α-кетопимелиновой кислоты, и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с 5-формилпентаноат-аминотрансферазной активностью.

15. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.14, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с 5-формилпентаноат-аминотрансферазной активностью, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую ΞΕΟ ΙΌ N0: 2, ΞΕΟ ΙΌ N0: 5, ΞΕΟ ΙΌ N0: 8, ΞΕΟ ΙΌ N0: 65, ΞΕΟ ΙΌ N0: 67, ΞΕΟ ΙΌ N0: 69, или ее гомолог.

16. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.14 или 15, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с активностью декарбоксилазы α-кетопимелиновой кислоты, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую ΞΕΟ ΙΌ N0: 31, ΞΕΟ ΙΌ N0: 34, ΞΕΟ ΙΌ N0: 37, ΞΕΟ ΙΌ N0: 40, ΞΕΟ ΙΌ N0: 43 или ΞΕΟ ΙΌ N0: 46, или гомолог любой из этих последовательностей.

17. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с активностью аминотрансферазы α-кетопимелиновой кислоты или активность дегидрогеназы α-кетопимелиновой кислоты, и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент с активностью декарбоксилазы α-аминопимелиновой кислоты.

18. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.17, в которой этот биокатализатор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминотрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, соответствующую ΞΕΟ ΙΌ N0: 2, ΞΕΟ ΙΌ N0: 8, ΞεΟ ΙΌ N0: 12, ΞΕΟ ΙΌ N0: 15, ΞΕΟ ΙΌ N0: 17, ΞΕΟ ΙΌ N0: 19, ΞΕΟ ΙΌ N0: 21, ΞΕΟ ΙΌ N0: 23, ΞΕΟ ΙΌ N0: 25, ΞΕΟ ΙΌ N0: 27, ΞΕΟ ΙΌ N0: 29, или ее гомолог.

19. Рекомбинантная клетка-хозяин по любому из пп.14-18, содержащая одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих один или более биокатализаторов, способных катализировать по меньшей мере одну стадию реакции в получении альфа-кетопимелиновой кислоты из альфакетоглутаровой кислоты.

20. Рекомбинантная клетка-хозяин по любому из пп.14-19, где эта клетка-хозяин выбрана из группы АкрегдШик, РешсШшт, ΞηοοΙιηΐΌιηνοοδ. К1иуусготусс5. ΡίοΗία. Саий1йа, Нап8епи1а, ВасШик, СогупеЬас1егшт и ЕксЕепсЫа.

21. Рекомбинантная клетка-хозяин по любому из пп.14-20, содержащая ДНК, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы последовательностей, представленных любой последовательностью, выбранной из группы ΞΕΟ ΙΌ N0: 1, ΞΕΟ ΙΌ N0: 3, ΞΕΟ ΙΌ N0: 4, ΞΕΟ ΙΌ N0: 6, ΞΕΟ ΙΌ N0: 7, ΞΕΟ ΙΌ N0: 11, ΞΕΟ ΙΌ N0: 13, ΞΕΟ ΙΌ N0: 14, ΞΕΟ ΙΌ N0: 16, ΞΕΟ ΙΌ N0: 18, ΞΕΟ ΙΌ N0: 20, ΞΕΟ ΙΌ N0: 22, ΞΕΟ ΙΌ N0: 24, ΞΕΟ ΙΌ N0: 26, ΞΕΟ ΙΌ N0: 28, ΞΕΟ ΙΌ N0: 30, ΞΕΟ ΙΌ N0: 32, ΞΕΟ ΙΌ N0: 33, ΞΕΟ ΙΌ N0: 35, ΞΕΟ ΙΌ N0: 36, ΞΕΟ ΙΌ N0: 38, ΞΕΟ ΙΌ N0: 39, ΞΕΟ ΙΌ N0: 41, ΞΕΟ ΙΌ N0: 42, ΞΕΟ ΙΌ N0: 44, ΞΕΟ ΙΌ N0: 45, ΞΕΟ ΙΌ N0: 47, ΞΕΟ ΙΌ N0: 64, ΞΕΟ ΙΌ N0: 66, ΞΕΟ ΙΌ N0: 68, и их функциональных аналогов.

22. Полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы последовательностей, идентифицированных в ΞΕΟ ΙΌ N0: 3, ΞΕΟ ΙΌ N0: 6, ΞΕΟ ΙΌ N0: 13, ΞΕΟ ΙΌ N0: 32, ΞΕΟ ΙΌ N0: 35, ΞΕΟ ΙΌ N0: 38, ΞΕΟ ΙΌ N0: 41, ΞΕΟ ΙΌ N0: 44, ΞΕΟ ΙΌ N0: 47, и их функциональных аналогов.