CN102026960A - 从5-甲酰缬草酸制备6-氨基己酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用生物催化剂制备6-氨基己酸(下文也称作“6-ACA”)的方法。本发明还涉及通过环化这类6-ACA制备e-己内酰胺(下文称作“己内酰胺”)的方法。本发明还涉及可用于制备6-ACA或己内酰胺的宿主细胞、微生物或多核苷酸。
Description
本发明涉及制备6-氨基己酸(下文也称作“6-ACA”)的方法。本发明还涉及从6-ACA制备ε-己内酰胺(下文称作“己内酰胺”)的方法。本发明还涉及可用于制备6-ACA或己内酰胺的宿主细胞。
己内酰胺是一种内酰胺，其可以被用于生产聚酰胺，例如尼龙-6或尼龙-6，12(己内酰胺和十二内酰胺的共聚物)。由大量化学品制备己内酰胺的多种方式是本领域已知的，并且包括由环己酮、甲苯、苯酚、环己醇、苯或环己烷制备己内酰胺。这些中间产物化合物通常得自矿物油。考虑到使用更加可持续的技术来制备材料的日益增长的需要，期望提供一种方法，其中由能够从生物可再生来源获得的中间产物化合物或至少由使用生物化学方法被转化成己二酸或己内酰胺的中间产物来制备己内酰胺。另外，想要提供一种方法，所述方法比利用来自石油化学来源的大量化学品的传统化学工艺需要更少能源。
已知由6-ACA制备己内酰胺，例如如US-A 6,194,572中所述。如WO 2005/068643中所公开的，可以在存在具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶时，通过转化6-氨基己-2-稀酸(6-AHEA)来生物化学地制备6-ACA。可以例如生物化学地或通过纯化学合成，由赖氨酸制备6-AHEA。尽管可以通过WO 2005/068643中公开的方法，通过6-AHEA的还原制备6-ACA，但是本发明人发现在还原反应条件下，6-AHEA可自发并且基本不可逆地环化形成不想要的副产物，特别是β-高脯氨酸。所述环化可以是6-ACA生产中的瓶颈，并可导致产率的可观损失。
本发明的一个目的是提供用于制备6-ACA或己内酰胺(尤其可以被用于制备聚酰胺)或用于制备6-ACA或己内酰胺的中间产物化合物的新颖方法，所述方法可以作为已知方法的替代方式。
本发明的又一个目的是提供克服一种或多种上述缺点的新颖方法。
根据本发明可解决的一个或多个其他目的可根据下文的说明书得到。
目前发现可能从特定的起始化合物制备6-ACA，即已经发现可能制备6-氨基己酸(6-ACA)，其中6-氨基己酸从2-氧代-庚烷二酸(也己知为α-酮庚二酸，AKP)制备。具体地，所述制备可以在两个或更多个反应步骤中进行。例如，提供了一种方法，其中AKP首先被转化成5-甲酰戊酸(5-甲酰缬草酸，5-FVA)，所述5-FVA被转化成6-ACA。还提供了一种方法，其中AKP首先被转化成α-氨基庚二酸(AAP)。之后，APP被转化成6-ACA。
本发明人认识到原则上可能以完全化学(即不使用生物催化剂)的方式从AKP制备6-ACA。进行个体反应步骤的合适化学途径的例子在下文中给出。然而，本发明人还认识到可从AKP生物化学地制备6-ACA。
因此，本发明尤其涉及制备6-ACA的方法，其中所述6-ACA是使用至少一种生物催化剂从AKP制备的。
本发明还涉及一种方法，其中使用生物催化剂从5-甲酰基戊酸(5-甲酰基缬草酸，5-FVA)制备6-ACA。如上文所述，5-FVA可得自AKP。
在一个实施方案中，在本发明方法中制备的6-ACA被用于制备己内酰胺。这类方法包括任选地在存在生物催化剂时环化6-氨基-己酸。
在本文中提到羧酸或羧酸酯例如6-ACA、2-氨基庚烷二酸(α-氨基庚二酸，下文缩写为“APP”)、另一氨基酸、5-FVA或AKP时，这些术语旨在包括质子化的羧酸基(例如中性基团)、它们相应的羧酸酯(其共轭碱)及其盐。在本文中提到氨基酸例如6-ACA时，所述术语旨在包括两性离子形式(其中氨基被质子化且羧酸酯基是去质子化的形式)的氨基酸，其中氨基被质子化且羧基为中性形式的氨基酸，和其中氨基为中性形式且羧酸酯基是去质子化形式的氨基酸，以及它们的盐。
根据本发明，未注意到关于中间产物的不想要的环化的问题，其中形成6-ACA并任选地形成己内酰胺，导致产率的损失。
预期本发明的方法允许得到与WO 2005/68643中所述方法相当或甚至更好的产率。预期在利用活生物时，尤其是在要考虑生物的生长和维持的方法中，本发明的方法尤其是有利的。
还预期在本发明的一个实施方案中，可提高本发明方法中6-ACA的生产力(形成的g/1.h)。
除非另有说明，在本文中使用的术语“或者”被定义为“和/或”。
在本文中使用的术语“一个”(“a”或“an”)被定义为“至少一个”。
涉及单数名词(例如化合物、添加剂等)时，复数旨在被包括在内。
涉及存在立体异构体的化合物时，所述化合物可以是任何这类立体异构体或其组合。因此，涉及例如存在对映异构体的氨基酸时，氨基酸可以是L-对映异构体、D-对映异构体或其组合。存在天然立体异构体时，化合物优选地是立体异构体。
关于括号中的酶种类(EC)提到酶时，所述酶种类是以Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology(NC-IUBMB)提供的Enzyme Nomenclature为基础，将酶归类或可以归类在其中的种类，所述命名法可见http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/。(尚)未归类但是可以同样被归类在特定种类中的其他合适的酶旨在包括在内。
术语“同源物”在本文中尤其用于具有至少30％、优选地至少40％、更优选地至少60％、更优选地至少65％、更优选地至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少80％、尤其是至少85％、更尤其是至少90％、至少91％、92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的多核苷酸或多肽。术语同源物也旨在包括由于遗传密码子的简并性而与另一核酸序列不同并且编码相同多肽序列的核酸序列(多核苷酸序列)。
序列同一性或相似性在本文中被定义为两条或更多多肽序列或两条或更多核酸序列之间的相互关系，通过比较所述序列来测定。通常，序列同一性或相似性在序列全长上比较，但是也可以仅在彼此对齐的序列的一部分上比较。在本领域中，“同一性”或“相似性”也表示多肽序列或核酸序列之间之间的序列相关性程度，根据情况由这类序列之间的匹配来确定。测定同一性或相似性的优选方法被设计为在测试的序列之间给出最大匹配。在本发明的上下文中，测定两条序列之间同一性和相似性的一种优选的计算机程序方法包括BLASTP和BLASTN(Altschul，S.F.et al.，J.Mol.Biol.1990，215，403-410)，公众可以从NCBI和其他来源(BLAST Manual，Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894)获得。使用BLASTP进行多肽序列比较的优选参数为缺口开放10.0，缺口延伸0.5，Blosum 62矩阵。使用BLASTN进行核酸序列比较的优选参数为缺口开放10.0，缺口延伸0.5，DNA全矩阵(DNA同一性矩阵)。
根据本发明，使用生物催化剂，即所述方法中至少一个反应步骤由生物材料或来自生物来源的部分(例如来自生物来源的生物或生物分子)催化。生物催化剂可尤其包含一种或多种酶。生物催化剂可以以任何形式使用。在一个实施方案中，使用从天然环境中分离(从生产它们的生物中分离)的一种或多种酶，例如作为溶液、乳液、分散液、冻干细胞(悬浮液)、作为裂解物、或固定在支持物上。在一个实施方案中，一种或多种酶形成了活细胞的部分(如活的全细胞)。在一个实施方案中，一种或多种酶形成活生物的一部分(如活的完整细胞)。
酶可在细胞内发挥催化功能。酶还可能被分泌进所述细胞存在的培养基中。
活细胞可以是生长中的细胞、静止或休眠细胞(例如孢子)或稳定期细胞。还可能使用酶形成通透化(即使其对酶的底物或一种或多种酶的底物前体通透)的细胞的部分。
本发明方法中使用的生物催化剂原则上可以是任何生物，获得得自或来自任何生物。生物可以是真核生物或原核生物。具体地，所述生物可选自动物(包括人)、植物、细菌、古细菌、酵母和真菌。
在一个实施方案中，生物催化剂源自动物，尤其源自其部分，例如肝、胰、脑、肾、心或其他器官。动物可尤其选自哺乳动物的组，更尤其选自Leporidae、Muridae、Suidae和Bovidae的组。
合适的植物尤其包括选自下组的植物：Asplenium；Cucurbitaceae，尤其是Curcurbita，例如Curcurbita moschata(南瓜)或Cucumis；Mercurialis，例如Mercurialis perennis；Hydnocarpus；和Ceratonia。
合适的细菌可尤其选自下组：Vibrio、Pseudomonas、Bacillus、Corynebacterium、Brevibacterium、Enterococcus、Streptococcus、Klebsiella、Lactococcus、Lactobacillus、Clostridium、Escherichia、Thermus、Mycobacterium、Zymomonas、Proteus、Agrobacterium、Geobacillus、Acinetobacter、Ralstonia、Rhodobacter、Paracoccus、Novosphingobium、Nitrosomonas、Legionella、Neisseria、Rhodopseudomonas、Staphylococcus、Deinococcus和Salmonella。
合适的古细菌可尤其选自下组：Archaeoglobus、Aeropyrum、Halobacterium、Methanosarcina、Methanococcus、Thermoplasma、Pyrobaculum、Methanocaldococcus、Methanobacterium、Methanosphaera、Methanopyrus和Methanobrevibacter。
合适的真菌可尤其选自Rhizopus、Neurospora、Penicillium和Aspergillus的组。
合适的酵母可尤其选自Candida、Hansenula、Kluyveromyces和Saccharomyces的组。
本领域技术人员应当明白，在根据本发明的方法中可以利用具有合适活性的天然存在的生物催化剂(野生型)或天然存在的生物催化剂的突变体。可以通过本领域技术人员已知的生物学技术，例如分子进化或合理设计(rational design)改进天然存在的生物催化剂的特性。可例如通过使用本领域技术人员已知的诱变技术(随机诱变、定点诱变、定向进化、基因重组等)修饰下述生物的编码DNA来制造野生型生物催化剂的突变体，所述生物能够发挥生物催化剂的作用或者能够生产生物催化剂部分(如酶)。具体地，可以修饰DNA，使其编码与野生型酶差异至少一个氨基酸的酶，使其编码与野生型相比包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的酶，或者使得突变体组合两个或更多亲本酶的序列，或者影响合适的(宿主)细胞中藉此被修饰的DNA的表达。后者可以通过本领域技术人员已知的方法如密码子优化或密码子对优化来实现，例如基于WO 2008/000632中所述方法。
突变体生物催化剂可具有经改进的特性，例如关于一个或多个以下方面：底物选择性、活性、稳定性、溶剂耐受性、pH谱、温度谱、底物谱、对抑制的敏感性、辅因子利用和底物亲和力。可以通过应用例如合适的高通量筛选或选择方法，基于本领域技术人员已知的这类选择方法，来鉴定具有改进的特性的突变体。
提到来自具体来源的生物催化剂(尤其是酶)、来自第一生物但是实际上在(经遗传修饰的)第二生物中生产的重组生物催化剂(尤其是酶)时，特定地旨在包括来自所述第一生物的生物催化剂(尤其是酶)。
在本发明的一个优选的方法中，所述制备包含在存在下述生物催化剂时的生物催化(通常为酶促)反应，所述生物催化剂能够催化α-酮酸或氨基酸(例如包含至少一个羧基和至少一个氨基的化合物)的脱羧。具有催化活性的酶因此可以分别被称作α-酮酸脱羧酶或者氨基酸脱羧酶。
所述酸优选地为二酸，其中所述生物催化剂对与酮-基或氨基相邻的酸基具有选择性。
通常，合适的脱羧酶具有能够催化AKP转化成为5-FVA的α-酮庚二酸酯脱羧酶活性，或能够催化AAP转化成为6-ACA的α-氨基庚二酸酯脱羧酶活性。
能够使α-酮酸或氨基酸脱羧的酶可尤其选自下组：草酰乙酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.3)、二氨基庚二酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.20)、支链α-酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.72)、α-酮异戊酸酯脱羧酶、α-酮戊二酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.71)和丙酮酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.1)。
一种或多种其他合适的脱羧酶可选自下组：草酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.2)、乙酰乙酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.4)、缬氨酸脱羧酶/亮氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.14)、谷氨酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.15)、天冬氨酸1-脱羧酶(EC 4.1.1.11)、3-羟基谷氨酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.16)、鸟氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.17)、赖氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.18)、精氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.19)、2-氧代；戊二酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.71)和二氨基丁酸酯(EC 4.1.1.86)。
脱羧酶可尤其是选自以下组生物的脱羧酶：南瓜；黄瓜；酵母；真菌，例如Saccharomyces cerevisiae、Candida flareri、Hansenula sp.、Kluyveromyces marxianus、Rhizopus javanicus和Neurospora crassa；哺乳动物，尤其是来自哺乳动物脑；和细菌，如Escherichia coli、Lactococcus lactis、Mycobacterium tuberculosis、Pseudomonas sp.和Zymomonas mobilis。
丙酮酸酯脱羧酶可源自Saccharomyces cerevisiae或Zymomonas mobilis。具体地，可以使用来自Zymomonas mobilis的丙酮酸酯脱羧酶突变体I472A。
可以使用来自Escherichia coli(E.coli)的谷氨酸酯脱羧酶、二氨基庚二酸酯脱羧酶或天冬氨酸脱羧酶。
可以使用来自Neurospora crassa、Mycobacterium leprae、Clostridium perfringens、Lactobacillus brevis、Mycobacterium tuberculosis、Streptococcus或Lactococcus的谷氨酸酯脱羧酶。谷氨酸酯脱羧酶可来源的Lactococcus物种的例子尤其包括Lactococcus lactis，如Lactococcus lactis菌株B1157、Lactococcus lactis IFPL 730，更尤其是Lactococcus lactis var.maltigenes(先前称作Streptococcus lactis var.maltigenes)。
尤其可使用来自Pseudomonas的草酰乙酸酯脱羧酶。
可以使用来自Lactococcus lactis的支链α-酮酸脱羧酶。更尤其可以使用来自Lactococcus lactis的α-酮异戊酸酯脱羧酶。
尤其可以使用来自Mycobacterium tuberculosis的α-酮戊二酸酯脱羧酶。
在本发明的一个优选的方法中，6-ACA的制备包含在存在能够在存在氨基供体时催化转氨基反应的酶时的酶促反应，所述酶选自氨基转移酶(E.C.2.6.1)的组。
通常，合适的氨基转移酶具有能够催化5-FVA转化成6-ACA的6-氨基己酸6-氨基转移酶活性，或能够催化AKP转化成AAP的α-氨基庚二酸酯2-氨基转移酶活性。
氨基转移酶可尤其选自以下组：β-氨基异丁酸酯:酮戊二酸酯氨基转移酶、β-丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、4-氨基-丁酸酯氨基转移酶(EC 2.6.1.19)、L-赖氨酸6-氨基转移酶(EC 2.6.1.36)、2-氨基己二酸酯氨基转移酶(EC 2.6.1.39)、5-氨基戊酸酯氨基转移酶(EC 2.6.1.48)、2-氨基己酸酯氨基转移酶(EC 2.6.1.67)和赖氨酸:丙酮酸酯6-氨基转移酶(EC 2.6.1.71)。
在一个实施方案中，氨基转移酶可选自下组：丙氨酸氨基转移酶(EC 2.6.1.2)、亮氨酸氨基转移酶(EC 2.6.1.6)、丙氨酸-氧代-酸氨基转移酶(EC 2.6.1.12)、β-丙氨酸-丙酮酸酯氨基转移酶(EC 2.6.1.18)、(S)-3-氨基-2-甲酰基丙酸酯氨基转移酶(EC 2.6.1.22)、L，L-二氨基庚二酸酯氨基转移酶(EC 2.6.1.83)。
氨基转移酶可尤其选自来自以下的的氨基转移酶：哺乳动物；Mercurialis，尤其是Mercurialis perennis，更尤其是Mercurialis perennis的嫩芽(shoots)；Asplenium，更尤其是Asplenium unilaterale或Asplenium septentrionale；Ceratonia，更尤其是Ceratonia siliqua；Rhodobacter，尤其是Rhodobacter sphaeroides，Staphylococcus，尤其是Staphylococcus aureus；Vibrio，尤其是Vibrio fluvialis；Pseudomonas，尤其是Pseudomonas aeruginosa；Rhodopseusomonas；Bacillus，尤其是Bacillus weihenstephanensis和Bacillus subtilis；Legionella；Nitrosomas；Neisseria；或酵母，尤其是Saccharomyces cerevisiae。
当酶是哺乳动物的酶时，其尤其可源自哺乳动物肾，来自哺乳动物肝，来自哺乳动物心或来自哺乳动物脑。例如，合适的酶可选自下组：来自哺乳动物肾的β-氨基异丁酸酯:α-酮戊二酸酯氨基转移酶，尤其是来自猪肾的β-氨基异丁酸酯:α-酮戊二酸酯氨基转移酶；来自哺乳动物肝的β-丙氨酸氨基转移酶，尤其是来自兔肝的β-丙氨酸氨基转移酶；来自哺乳动物心的天冬氨酸氨基转移酶；尤其是来自猪心的天冬氨酸氨基转移酶；来自哺乳动物肝的4-氨基-丁酸酯氨基转移酶，尤其是来自猪肝的4-氨基-丁酸酯氨基转移酶；来自哺乳动物脑的4-氨基-丁酸酯氨基转移酶，尤其是来自人、猪或大鼠脑的4-氨基丁酸酯氨基转移酶；来自Neurospora的α-酮己二酸酯-谷氨酸酯氨基转移酶，尤其是来自Neurospora crass的α-酮己二酸酯:谷氨酸酯氨基转移酶；来自E.coli的4-氨基-丁酸酯氨基转移酶，或来自Thermus的α-氨基己二酸酯氨基转移酶，尤其是来自Thermus thermophilus的α-氨基己二酸酯氨基转移酶，和来自Clostridium、尤其是来自Clostridium aminovalericum的5-氨基戊酸酯氨基转移酶。一种合适的2-氨基己二酸酯氨基转移酶可例如由Pyrobaculum islandicum提供。
氨基供体尤其可选自氨、铵离子、胺和氨基酸的组。合适的胺是伯胺和仲胺。氨基酸可具有D-构型或L-构型。氨基供体的例子是丙氨酸、谷氨酸、异丙胺、2-氨基丁烷、2-氨基庚烷、苯甲胺、1-苯基-1-氨基乙烷、谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、β-氨基异丁酸酯、β-丙氨酸、4-氨基丁酸酯和α-氨基己二酸酯。
在又一个优选的实施方案中，制备6-ACA的方法包含在存在下述酶时的生物催化反应，所述酶能够在存在氨来源时催化还原性氨基化反应，所述酶选自作用于供体CH-NH2基团上的氧化还原酶(EC 1.4)的组，尤其是选自氨基酸脱氢酶(E.C.1.4.1)的组。通常，合适的氨基酸脱氢酶具有催化5-FVA转化成为6-ACA的6-氨基己酸6-脱氢酶活性，或者具有催化AKP转化成为AAP的α-氨基庚二酸酯2-脱氢酶活性。合适的氨基酸脱氢酶尤其选自二氨基庚二酸酯脱氢酶(EC 1.4.1.16)、赖氨酸6-脱氢酶(EC 1.4.1.18)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.3；EC 1.4.1.4)和亮氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.9)的组。
在一个实施方案中，氨基酸脱氢酶可选自被归类为以下的氨基酸脱氢酶：以NAD或NADP作为受体的谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.3)、以NADP作为受体(EC 1.4.1.4)的谷氨酸脱氢酶、亮氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.9)、二氨基庚二酸酯脱氢酶(EC 1.4.1.16)和赖氨酸6-脱氢酶(EC 1.4.1.18)。
氨基酸脱氢酶可尤其源自选自下组的生物：Corynebacterium，尤其是Corynebacterium glutamicum；Proteus，尤其是Proteus vulgaris；Agrobacterium，尤其是Agrobacterium tumefaciens；Geobacillus，尤其是Geobacillus stearothermophilus；Acinetobacter，尤其是Acinetobacter sp.ADP1；Ralstonia，尤其是Ralstonia solanacearum；Salmonella，尤其是Salmonella typhimurium；Saccharomyces，尤其是Saccharomyces cerevisiae；Brevibacterium，尤其是Brevibacterium flavum；和Bacillus，尤其是Bacillus sphaericus、Bacillus cereus或Bacillus subtilis。例如，合适的氨基酸脱氢酶可选自来自Bacillus，尤其是Bacillus sphaericus的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Brevibacterium sp.的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Corynebacterium的二氨基庚二酸酯脱氢酶，尤其是来自Corynebacterium glutamicum的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Proteus的二氨基庚二酸酯脱氢酶，尤其是来自Proteus vulgaris的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Agrobacterium、尤其是Agrobacterium tumefaciens的赖氨酸6-脱氢酶，来自Geobacillus、尤其是来自Geobacillus stearothermophilus的赖氨酸6-脱氢酶；来自Acinetobacter的以NADH或NADPH作为辅因子发挥作用的谷氨酸酯脱氢酶(EC 1.4.1.3)，尤其是来自Acinetobacter sp.ADP1的谷氨酸酯脱氢酶；来自Ralstonia的谷氨酸酯脱氢酶(EC 1.4.1.3)，尤其是来自Ralstonia solanacearum的谷氨酸酯脱氢酶；来自Salmonella的以NADPH作为辅因子发挥作用的，尤其是来自Salmonella typhimurium的谷氨酸酯脱氢酶；来自Saccharomyces的谷氨酸酯脱氢酶(EC 1.4.1.4)，尤其是来自Saccharomyces cerevisiae的谷氨酸酯脱氢酶；来自Brevibacterium的谷氨酸酯脱氢酶，尤其是来自Brevibacterium flavum的谷氨酸酯脱氢酶；和来自Bacillus的谷氨酸酯脱氢酶，尤其是来自Bacillus cereus或Bacillus subtilis的谷氨酸酯脱氢酶。
在一个特定的实施方案中，AKP在存在脱羧酶或催化这类转化的其他生物催化剂时，AKP被生物催化性转化成5-甲酰基戊酸酯(5-FVA)。根据本发明使用的脱羧酶可尤其选自来自Lactococcus lactis、Lactococcus lactis var.maltigenes或Lactococcus lactis subsp.cremoris的α-酮酸脱羧酶；来自Lactococcus lactis菌株B1157或Lactococcus lactis IFPL 730的支链α-酮酸脱羧酶；来自Saccharomyces cerevisiae、Candida flareri、Zymomonas mobilis、Hansenula sp.、Rhizopus javanicus、Neurospora crassa或Kluyveromyces marxianus的丙酮酸脱羧酶；来自Mycobacterium tuberculosis的α-酮戊二酸酯脱羧酶；来自E.coli、Lactobacillus brevis、Mycobacterium leprae、Neurospora crassa或Clostridium pefringens的谷氨酸酯脱羧酶；和来自E.coli的天冬氨酸脱羧酶。
具体地，发现来自Escherichia coli、Zymomonas mobilis、Saccharomyces cerevisiae、Mycobacterium tuberculosis、Pseudomonas species或Lactococcus lactis的脱羧酶适合催化AKP成为5-FVA的转化。更具体地，可以使用包含下述脱羧酶的生物催化剂，所述脱羧酶具有Sequence ID 31、Sequence ID 34、Sequence ID 37、Sequence ID 40、Sequence ID 43、Sequence ID 46所鉴定的氨基酸序列或其同源物。还预期这类脱羧酶可被用于从AAP制备6-ACA。
之后5-FVA被转化成6-ACA。这可以化学完成：可以在氢化催化剂(例如SiO2/Al2O3支持物上的Ni)上通过用氨还原性氨化5-FVA，以高产率制备6-ACA，如EP-A 628 535或DE 4 322 065中针对9-氨基壬酸(9-氨基正壬酸)和12-氨基正十二烷酸(12-氨基月桂酸)所述。
或者可以通过在PtO2上氢化6-oximocaproic acid获得6-ACA，所述6-oximocaproic acid通过5-FVA和羟胺的反应制备(同源的12-氨基正十二烷酸的合成见例如F.O.Ayorinde，E.Y.Nana，P.D.Nicely，A.S.Woods，E.O.Price，C.P.Nwaonicha J.Am.Oil Chem.Soc.1997，74，531-538)。
在一个实施方案中，5-FVA到6-ACA的转化在存在以下时生物催化地进行：(i)氨基供体和(ii)氨基转移酶、氨基酸脱氢酶或能够催化这类转化的另一生物催化剂。具体地，在这样的实施方案中，氨基转移酶可选自以下：来自Vibrio fluvialis、Pseudomonas aeruginosa、Bacillus subtilis、Bacillus weihenstephanensis或Escherichia coli的氨基转移酶组；来自猪肾的β-氨基异丁酸酯:α-酮戊二酸酯氨基转移酶；来自兔肝的β-丙氨酸氨基转移酶；来自Mercurialis perennis嫩芽的氨基转移酶；来自猪肝或来自人、大鼠或猪脑的4-氨基丁酸酯氨基转移酶；来自兔肝的β-丙氨酸氨基转移酶；和L-赖氨酸:α-酮谷氨酸酯-δ-氨基转移酶。在使用氨基酸脱氢酶时，这类氨基酸脱氢酶可尤其选自来自Agrobacterium tumefaciens或Geobacillus stearothermophilus的赖氨酸6-脱氢酶组。另一合适的氨基酸脱氢酶可选自来自Bacillus sphaericus、Brevibacterium sp.、Corynebacterium glutamicum或Proteus vulgaris的二氨基庚二酸酯脱氢酶的组；选自来自Acinetobacter sp.ADP1或Ralstonia solanacearum的以NADH或NADPH作为辅因子(EC 1.4.1.3)发挥作用的谷氨酸酯脱氢酶的组；选自来自Salmonella typhimurium的以NADPH作为辅因子(EC 1.4.1.4)发挥作用的谷氨酸酯脱氢酶的组；选自来自Saccharomyces cerevisiae或Brevibacterium flavum的谷氨酸酯脱氢酶(EC 1.4.1.4)的组；或选自来自Bacillus cereus或Bacillus subtilis的亮氨酸脱氢酶的组。
在一个特定的实施方案中，5-FVA成为6-ACA的转化由包含下述氨基转移酶的生物催化剂催化，所述氨基转移酶包含根据Sequence ID 2、Sequence ID 5、Sequence ID 8、Sequence ID 65、Sequence ID 67、Sequence ID 69的氨基酸序列或任何这些序列的同源物。
在一个特定的实施方案中，AKP被化学转化为5-FVA。2-酮羧酸成为相应醛的有效化学脱羧可以使用仲胺(例如吗啉)，在恒沸水去除同时损失CO2时，通过中间产物烯胺的形成来进行，例如基于Tetrahedron Lett.1982，23(4)，459-462中所述方法。中间产物末端烯胺随后被水解为相应的醛。之后可以在存在氨基转移酶时通过转氨基反应，或者通过氨基酸脱氢酶或能够催化这类转化的另一生物催化剂的酶促还原性氨基化，将5-FVA生物催化地转化为6-ACA。这类氨基转移酶或氨基酸脱氢酶可尤其选自上文描述5-FVA转化成为6-ACA时提到的生物催化剂。
或者，可以通过例如上文提到的化学方法将5-FVA转化成为6-ACA。
在一个特定的实施方案中，在存在以下时将AKP生物催化地转化为AAP：(i)氨基转移酶、氨基酸脱氢酶、或能够催化这类转化的另一生物催化剂，和(ii)氨基供体。根据本发明用于将AKP转化为AAP的这类氨基转移酶可尤其选自上文提到的氨基转移酶，更尤其选自来自猪心的天冬氨酸氨基转移酶的组；来自Neurospora crassa或酵母的α-酮己二酸酯:谷氨酸酯氨基转移酶；来自Mercurialis perennis嫩芽的氨基转移酶；来自E.coli的4-氨基丁酸酯氨基转移酶；来自Thermus thermophilus的α-氨基己二酸酯氨基转移酶；来自Asplenium septentrionale或Asplenium unilaterale的氨基转移酶；和来自Ceratonia siliqua的氨基转移酶。
在一个优选的实施方案中，用于将AKP转化为AAP的氨基转移酶选自来自Vibrio、Pseudomonas、Bacillus、Legionella、Nitrosomonas、Neisseria、Rhodobacter、Escherichia和Rhodopseudomonas的氨基转移酶的组。
具体地，发现来自下述生物的氨基转移酶适用于催化AKP成为AAP的转化，所述生物选自Bacillus subtilis、Rhodobacter sphaeroides、Legionella pneumophila、Nitrosomonas europaea、Neisseria gonorrhoeae、Pseudomonas syringae、Rhodopseudomonas palustris、Vibrio fluvialis、Escherichia coli和Pseudomonas aeruginosa的组。
在一个特定的实施方案中，为了将AKP转化成AAP使用下述氨基转移酶，所述氨基转移酶包含根据Sequence ID 2、Sequence ID 8、Sequence ID 12、Sequence ID 15、Sequence ID 17、Sequence ID 19、Sequence ID 21、Sequence ID 23、Sequence ID 25、Sequence ID 27、Sequence ID 29的氨基酸序列或任何这些序列的同源物。
在又一个实施方案中，制备AAP的方法包含存在下述酶时的生物催化反应，所述酶在存在氨来源时能够催化还原性氨基化反应，选自作用于CH-NH2组供体的氧化还原酶(EC 1.4)组，尤其选自氨基酸脱氢酶(E.C.1.4.1)的组。通常，合适的氨基酸脱氢酶具有α-氨基庚二酸酯-2-脱氢酶活性，催化AKP转化成为AAP。
具体地，合适的氨基酸脱氢酶可选自二氨基庚二酸酯脱氢酶(EC 1.4.1.16)、谷氨酸酯脱氢酶(EC 1.4.1.3；EC 1.4.1.4)和亮氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.9)的组。
在一个实施方案中，氨基酸脱氢酶选自被归类为以下的氨基酸脱氢酶：以NAD或NADP作为受体发挥作用的谷氨酸酯脱氢酶(EC 1.4.1.3)、以NADP作为受体发挥作用的谷氨酸酯脱氢酶(EC 1.4.1.4)、亮氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.9)和二氨基庚二酸酯脱氢酶(EC 1.4.1.16)。
氨基酸脱氢酶可尤其源自选自下组的生物：Corynebacterium，尤其是Corynebacterium glutamicum；Proteus，尤其是Proteus vulgaris；Agrobacterium，尤其是Agrobacterium tumefaciens；Geobacillus，尤其是Geobacillus stearothermophilus；Acinetobacter，尤其是Acinetobacter sp.ADP1；Ralstonia，尤其是Ralstonia solanacearum；Salmonella，尤其是Salmonella typhimurium；Saccharomyces，尤其是Saccharomyces cerevisiae；Brevibacterium，尤其是Brevibacterium flavum；和Bacillus，尤其是Bacillus sphaericus、Bacillus cereus或Bacillus subtilis。
例如，合适的氨基酸脱氢酶可选自来自Bacillus，尤其是Bacillus sphaericus的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Brevibacterium sp.的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Corynebacterium的二氨基庚二酸酯脱氢酶，尤其是来自Corynebacterium glutamicum的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Proteus的二氨基庚二酸酯脱氢酶，尤其是来自Proteus vulgaris的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Acinetobacter的以NADH或NADPH作为辅因子发挥作用的谷氨酸酯脱氢酶(EC 1.4.1.3)，尤其是来自Acinetobacter sp.ADP1的谷氨酸酯脱氢酶；来自Ralstonia的谷氨酸酯脱氢酶(EC 1.4.1.3)，尤其是来自Ralstonia solanacearum的谷氨酸酯脱氢酶；来自Salmonella的以NADPH作为辅因子发挥作用的谷氨酸酯脱氢酶(EC 1.4.1.4)，尤其是来自Salmonella typhimurium的谷氨酸酯脱氢酶；来自Saccharomyces的谷氨酸酯脱氢酶(EC 1.4.1.4)，尤其是来自Saccharomyces cerevisiae的谷氨酸酯脱氢酶；来自Brevibacterium的谷氨酸酯脱氢酶(EC 1.4.1.4)，尤其是来自Brevibacteriumflavum的谷氨酸酯脱氢酶；和来自Bacillus的亮氨酸脱氢酶，尤其是来自Bacillus cereus或Bacillus subtilis的亮氨酸脱氢酶。
另一合适的氨基酸脱氢酶可选自来自Agrobacterium tumefaciens或Geobacillus stearothermophilus的赖氨酸6-脱氢酶的组；或选自来自Bacillus cereus或Bacillus subtilis的亮氨酸脱氢酶的组。
在本发明方法中制备的AAP可进一步被用于制备6-ACA。本发明人认识到由AKP制备的AAP可以通过脱羧反应被转化成6-ACA。这可以例如在存在酮或醛催化剂时通过在高沸点溶剂中加热来化学地进行。例如，如M.Hashimoto，Y.Eda，Y.Osanai，T.Iwai and S.Aoki in Chem.Lett.1986，893-896所述，在150-160℃下含1-2 v/v％环己酮的环己醇中以良好的产率对氨基酸脱羧。类似的方法描述于Eur.Pat.Appl.1586553，2005 by Daiso，and by S.D.Brandt，D.Mansell，S.Freeman，I.A.Fleet，J.F.Alder J.Pharm.Biomed.Anal.2006，41，872-882中。
或者，可以在存在脱羧酶或催化这类脱羧的其他生物催化剂时，生物催化地进行AAP到6-ACA的脱羧。
脱羧酶可选自能够催化α-氨基酸脱羧的脱羧酶。能够使α-氨基酸脱羧的酶尤其可选自脱羧酶(E.C.4.1.1)的组，优选地选自丙酮酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.1)、二氨基庚二酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.20)、二氨基庚二酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.20)、支链α-酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.72)的组，所述支链α-酮酸脱羧酶包括α-酮异戊酸酯脱羧酶和α-酮戊二酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.71)。
一种或多种其他合适的脱羧酶可尤其选自下组：草酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.2)、草酰乙酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.3)、乙酰乙酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.4)、天冬氨酸1-脱羧酶(EC 4.1.1.11)、缬氨酸脱羧酶/亮氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.14)、谷氨酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.15)、3-羟基谷氨酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.16)、鸟氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.17)、赖氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.18)、精氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.19)、2-氧代戊二酸酯氧代戊二酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.71)和二氨基丁酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.86)。
脱羧酶可尤其是选自下组的生物的脱羧酶：南瓜，例如Curcurbita moschata；黄瓜；酵母；真菌，例如Saccharomyces cerevisiae、Candida flareri、Hansenula sp.、Kluyveromyces marxianus、Rhizopus javanicus和Neurospora crassa；哺乳动物，尤其是来自哺乳动物脑；和细菌如Escherichia coli、Lactococcus lactis、Mycobacterium tuberculosis、Pseudomonas sp.和Zymomonas mobilis。
丙酮酸酯脱羧酶可源自Saccharomyces cerevisiae或Zymomonas mobilis。具体地，可使用来自Zymomonas mobilis的丙酮酸酯脱羧酶突变体I472A。可尤其使用来自Pseudomonas的草酰乙酸酯脱羧酶。可以使用来自Escherichia coli(E.coli)的谷氨酸酯脱羧酶或天冬氨酸脱羧酶，或可使用来自Neurospora crassa、Mycobacterium leprae、Clostridium perfringens、Lactobacillus brevis、Mycobacterium tuberculosis、Streptococcus或Lactococcus的谷氨酸酯脱羧酶。可作为谷氨酸酯脱羧酶来源的Lactococcus物种的例子尤其包括Lactococcus lactis，如Lactococcus lactis菌株B1157、Lactococcus lactis IFPL730，更尤其包括Lactococcus lactis var.maltigenes(先前称作Streptococcus lactis var.maltigenes)。二氨基庚二酸酯脱羧酶可例如来自能够从二氨基庚二酸酯合成赖氨酸的生物。这类生物可尤其存在于细菌、古细菌和植物中。具体地，二氨基庚二酸酯脱羧酶可来自革兰氏阴性细菌，例如E.coli。可以使用来自Lactococcus lactis的支链α-酮酸脱羧酶。更具体地，可以使用来自Lactococcus lactis的α-酮酸脱羧酶和α-酮异戊酸脱羧酶。
可尤其使用来自Mycobacterium tuberculosis的α-酮戊二酸酯脱羧酶。本发明人发现，可使用来自Mycobacterium tuberculosis的α-酮戊二酸酯脱羧酶(Kgd)将AAP转化成6-ACA。具体地，本发明人发现包含SEQUENCE ID No.46中所示序列或其功能性类似物的这类脱羧酶可以能够催化从AAP形成6-ACA。
谷氨酸酯脱羧酶可尤其选自Curcurbita moschata、黄瓜、酵母或小牛脑；和二氨基庚二酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.20)。
二氨基庚二酸酯脱羧酶可例如来自能够从二氨基庚二酸酯合成赖氨酸的生物。这类生物可尤其存在于细菌、古细菌和植物中。
具体地，二氨基庚二酸酯脱羧酶可来自革兰氏阴性细菌，例如E.coli。
在一个特定的实施方案中，AKP被化学转化成AAP。AAP可以通过针对类似化合物所述的催化性Leuckart-Wallach反应，从2-氧代庚二酸制备。所述反应使用甲醇中的甲酸酯和作为均相催化剂的[RhCp*Cl2]2进行(M.Kitamura，D.Lee，S.Hayashi，S.Tanaka，M.Yoshimura J.Org.Chem.2002，67，8685-8687)。或者，可以如S.Ogo，K.Uehara and S.Fukuzumi in J.Am.Chem.Soc.2004，126，3020-3021所述，使用[IrIIICp*(bpy)H2O]SO4作为催化剂，用水性甲酸铵进行Leuckart-Wallach反应。还可能通过与(手性)苄胺反应并随后在Pd/C或Pd(OH)2/C上氢化中间产物，实现α-酮酸成为(对映异构体富集的)氨基酸的转化。参阅例如R.G.Hiskey，R.C.Northrop J.Am.Chem.Soc.1961，83，4798。
之后在存在脱羧酶或能够进行这类脱羧的另一生物催化剂时，将AAP生物催化地转化成6-ACA。这类脱羧酶可尤其选自上文针对AAP成为6-ACA的转化描述生物催化剂时所述的生物催化剂。
或者，可以通过例如上文所述的化学方法，进行AAP成为6-ACA的转化。
在一个特定的实施方案中，在存在脱羧酶或能够催化这类转化的其他生物催化剂时，AKP被生物催化地转化成5-FVA，并且5-FVA之后在存在氨基转移酶、氨基酸脱氢酶或能够催化这类转化的其他生物催化剂时被转化成6-ACA。适用于这些反应的脱羧酶可尤其选自上文描述AKP成为5-FVA的生物催化转化时提到的脱羧酶的组。用于转化5-FVA的合适的氨基转移酶或氨基酸脱氢酶可尤其选自上文描述5-FVA成为6-ACA的生物催化转化时描述的这些。
在一个特定的实施方案中，在存在氨基转移酶、氨基酸脱氢酶或能够催化这类转化的其他生物催化剂时，AKP被生物催化地转化成AAP，并且之后AAP在存在脱羧酶或能够催化这类转化的其他生物催化剂时被转化成6-ACA。
适用于这些反应的酶可尤其选自下组：上文描述AKP成为AAP的生物催化转化和AAP成为6-ACA的生物催化转化时分别描述的氨基转移酶、氨基酸脱氢酶和脱羧酶。
用于制备6-ACA的AKP原则上可以通过任何方式获得。例如，AKP可基于H.et al.Chem.Ber.1959，92，2492-2499所述方法获得。可以如下制备AKP：使用乙醇酸钠作为基质，用二乙基草酸酯烷基化环戊酮，将得到的产物在强酸(2 M HCl)中回流并例如通过从甲苯中结晶来回收产物。
还可能从天然来源，例如从产甲烷的Archaea，从Asplenium septentrionale，或从Hydnocarpus anthelminthica获得AKP。可例如从这种生物或其部分中，例如从Hydnocarpus anthelminthica种子中提取AKP。合适的提取方法可例如基于A.I.Virtanen and A.M.Berg in Acta Chemica Scandinavica 1954，6，1085-1086中所述方法，其中描述了使用70％乙醇从Asplenium中提取氨基酸和AKP。
在一个特定的实施方案中，在下述方法中制备AKP，所述方法包括将α-酮戊二酸(AKG)转化成α-酮己二酸(AKA)，并将α-酮己二酸转化成α-酮庚二酸。该反应可以由生物催化剂催化。AKG可例如以本领域本身已知的方式，从碳源例如碳水化合物生物催化地制备。
用于从AKG制备AKP的合适的生物催化剂可尤其选自催化下述反应的生物催化剂：α-酮戊二酸成为α-酮己二酸的C1-延长和/或α-酮己二酸成为α-酮庚二酸的C1-延长。
在一个特定的实施方案中，AKP的制备由包含以下的生物催化剂催化：
a.AksA酶或其同源物；
b.至少一种选自AksD酶、AksE酶、AksD酶同源物和AksE酶同源物的组的酶；和
c.AksF酶或其同源物。
一种或多种AksA、AksD、AksE、AksF酶或其同源物可存在于下述生物中，所述生物选自产甲烷古细菌的组，优选地选自Methanococcus、Methanocaldococcus、Methanosarcina、Methanothermobacter、Methanosphaera、Methanopyrus和Methanobrevibacter的组。
在一个特定的实施方案中，催化由α-酮戊二酸(AKG)制备AKP的生物催化剂包含催化α-酮戊二酸转化成α-酮己二酸的酶体系，其中所述酶体系形成赖氨酸生物合成的α-氨基己二酸酯通路的部分。术语“酶体系”在本文中尤其用于能够催化特定转化的单个酶或一组酶。
从AKG制备AKP包括具有已知或未知中间产物的一个或多个化学反应，例如AKG成为AKA的转化或AKA成为AKP的转化。这类体系可存在于细胞中，或从细胞中分离。酶体系可尤其来自下述生物，所述生物选自酵母、真菌、古细菌和细菌的组，尤其来自Penicillium、Cephalosporium、Paelicomyces、Trichophytum、Aspergillus、Phanerochaete、Emericella、Ustilago、Schizosaccharomyces、Saccharomyces、Candida、Yarrowia、Pichia、Kluyveromyces、Thermus、Deinococcus、Pyrococcus、Sulfolobus、Thermococcus、Methanococcus、Methanocaldococcus、Methanosphaera、Methanopyrus、Methanobrevibacter、Methanosarcina和Methanothermobacter的组。
在一个特定的实施方案中，催化从α-酮戊二酸制备AKP的生物催化剂包含催化α-酮戊二酸转化成α-酮己二酸的酶体系，其中所述酶体系的至少一种酶源自固氮细菌，所述固氮细菌选自蓝细菌、根瘤菌、γ-变形菌(proteobacteria)和放线菌(actinobacteria)的组，尤其选自Anabaena、Microcystis、Synechocystis、Rhizobium、Bradyrhizobium、Pseudomonas、Azotobacter、Klebsiella和Frankia的组。
这些Aks酶的同源物和编码这些酶的基因的例子在下文的表1A和1B中给出。
表1A
基因和蛋白质的参考文献可通过www.ncbi.nlm.nih.gov/找到(如2008年4月15日可获得的)
表1B
基因和蛋白质的参考文献可通过www.ncbi.nlm.nih.gov/找到(如2008年4月15日可获得的)
如果需要的话，根据本发明获得的6-ACA可以被环化形成己内酰胺，例如如US-A 6,194,572中所述。
本发明上下文中任何生物催化步骤的反应条件可根据生物催化剂、尤其是酶的已知条件，本文公开的信息和任选地一些常规实验来选择。
原则上，使用的反应培养基的pH可以在宽泛的界限内选择，制药生物催化剂在所述pH条件下有活性即可。可以使用碱性、中性或酸性条件，取决于生物催化剂和其他因素。当所述方法包括使用微生物(例如用于表达催化本发明方法的酶)时，选择pH使得所述微生物能够发挥其预期的一种或多种功能。在25℃下基本水性体系的情况下，尤其可在低于中性pH四个pH单位和高于中性pH两个pH单位的范围内选择pH，即在pH 3和pH9之间选择。如果水是唯一的溶剂或主要的溶剂(以总液体为基础＞50wt.％，尤其是＞90wt.％)，则系统被认为是水性的，其中例如小量(以总液体为基础＜50wt.％，尤其是＜10wt.％)的醇或另一种溶剂可以下述浓度溶解(例如作为碳源)，所述浓度使得可以存在的微生物保持活性。尤其是在使用酵母和/或真菌的情况下，可优选酸性条件，尤其是25℃下基于基本水性体系的pH可以在pH 3到pH 8的范围内。需要时可以使用酸和/或碱调节或者用合适的酸和碱的组合缓冲pH。
原则上，孵育条件可以在在广阔的界限内选择，只要生物催化剂显示足够的活性和/或生长即可。这包括需氧、微需氧、限氧和厌氧的条件。
厌氧条件在本文中被定义为下述条件：无任何氧，或其中生物催化剂(尤其是微生物)基本不消耗氧并且通常对应于少于5mmol/l.h的氧消耗，尤其是小于2.5mmol/l.h的氧消耗，或小于1mmol/l.h的氧消耗。
需氧条件是下述条件，其中对不受限制的生长而言足够水平的氧溶于培养基中，能够支持至少10mmol/l.h、更优选地多于20mmol/l.h、进一步更优选地多于50mmol/l.h、最优选地多于100mmol/l.h的氧消耗速率。
限氧条件被定义为下述条件：其中氧消耗由从气体转移至液体的氧限制。限氧条件的下限由厌氧条件的上限决定，即至少1mmol/l.h，尤其是至少2.5mmol/l.h，或至少5mmol/l.h。限氧条件的上限由需氧条件的下限决定，即少于100mmol/l.h、少于50mmol/l.h、少于20mmol/l.h或少于10mmol/l.h。
条件是需氧、厌氧还是限氧取决于所述方法进行的条件，尤其是进入气流的量和组成、使用的设备的实际混合/质量转移特性、使用的微生物的类型和微生物密度。
原则上，使用的温度不是关键性的，只要生物催化剂(尤其是酶)显示大量活性即可。通常，温度可以是至少0℃，尤其是至少15℃，更尤其是至少20℃。想要的最大温度取决于生物催化剂。通常这类最大温度是本领域已知的，例如在可商业获得的生物催化剂的情况下在产品数据表中指出，或者可以基于公知常识和本文公开的信息常规地测定。温度通常是90℃或更少，优选地是70℃或更少，尤其是50℃或更少，更尤其是40℃或更少。
具体地，如果生物催化反应在宿主生物外进行，则可以高浓度(例如大于50％，或大于90wt.％)使用包含有机溶剂的反应培养基，使得使用的酶在这样的培养基中保持足够的活性。
在一种有利的方法中，利用6-ACA的底物或用于形成6-ACA的中间产物(AKP、AAP或5-FVA)的全细胞生物转化制备6-ACA，包含下述微生物，其中生产一种或多种催化所述生物转化的生物催化剂(通常是一种或多种酶)，如选自下组的一种或多种生物催化剂：能够催化AKP转化成为APP的生物催化剂，能够催化AAP转化成为6-ACA的生物催化剂，能够催化AKP转化成为5-FVA的生物催化剂，和能够催化5-FVA转化成为6-ACA的生物催化剂。在一种优选的实施方案中，所述微生物能够生产脱羧酶和/或至少一种选自氨基酸脱氢酶和氨基转移酶的酶(能够催化上述反应步骤)和所述微生物的碳源。
碳源可尤其含有至少一种选自下组的化合物：一元醇、多元醇、羧酸、一氧化碳、脂肪酸、甘油酯，包括任何所述化合物的混合物。合适的一元醇包括甲醇和乙醇。合适的多元醇包括甘油和碳水化合物。合适的脂肪酸或甘油三酯可尤其以食用油的形式提供，优选地为植物来源。
尤其可以使用碳水化合物，因为通常碳水化合物可从生物可更新来源如农产品(优选地农业废料)中大量获得。优选地，使用选自下组的碳水化合物：葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、蔗二糖、淀粉、纤维素和半纤维素。尤其优选的是葡萄糖、包含葡萄糖的寡糖和包含葡萄糖的多糖。
可以使用本领域本身已知的分子生物学技术，构建包含用于在本发明方法中催化反应步骤的一种或多种生物催化剂(通常是一通或多种酶)的细胞，尤其是重组细胞。例如，如果要在重组细胞(其可以是异源体系)中生产一种或多种生物催化剂，则这类技术可以被用于提供下述载体(如重组载体)，所述载体包含一个或多个编码一种或多种所述生物催化剂的基因。可以使用一个或多个载体，每个载体包含一个或多个这类基因。这类载体可包含一个或多个调节元件，例如一个或多个启动子，所述启动子可与编码生物催化剂的基因可操作地连接。
在本文中使用时，术语“可操作地连接”是指功能性相互关系中多核苷酸元件(或编码序列或核酸序列)的一种连接。当核酸序列被置于与另一核酸序列的功能性相互关系之中时，所述核酸序列是“可操作地连接”的。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则所述启动子或增强子与所述编码序列可操作地连接。
在本文中使用时，术语“启动子”是指一种核酸片段，其功能是控制一个或多个基因的转录，根据转录的方向位于基因的转录起点上游，并且结构上由DNA-依赖性RNA聚合酶、转录起点和任何其它DNA序列的存在识别，所述任何其它DNA序列包括但不限于转录因子结合位点、阻抑因子和激活因子蛋白结合位点和本领域技术人员已知的直接或间接地作用以调节来自启动子的转录量的任何其它核苷酸序列。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。当用于指出给定的(重组的)核酸或多肽分子与给定的宿主生物或宿主细胞之间的相互关系时，术语“同源的”应当被理解为表示该核酸或多肽分子天然地由相同物种(优选地相同变种或菌株)的宿主细胞或生物生产。
可用于实现编码本发明方法中使用的酶、尤其是氨基转移酶、氨基酸脱氢酶或脱羧酶(如上文所述)的核酸序列表达的启动子对编码要表达的酶的核酸序列而言可以是天然的，或者可以对与之可操作地连接的核酸序列(编码序列)而言是异源的。优选地，启动子对宿主细胞而言是同源的，即内源的。
如果使用(对编码感兴趣的酶的核酸序列而言)异源启动子，则所述异源启动子优选地能够生产比编码序列的天然启动子更高稳态水平的包含所述编码序列的转录本(或者单位时间能够生产更多转录本分子，即mRNA分子)。本发明上下文中合适的启动子包括本领域技术人员公知的组成型和诱导型启动子以及经改造的启动子。
“强组成型启动子”是与天然宿主细胞相比引起mRNA以高频率起始的启动子。革兰氏阳性微生物中这类强组成型启动子的例子包括SP01-26、SP01-15、veg、pyc(丙酮酸羧化酶启动子)和amyE。
革兰氏阳性微生物中诱导型启动子的例子包括IPTG诱导型Pspac启动子，木糖诱导型PxylA启动子。
革兰氏阴性微生物中组成型和诱导型启动子的例子包括，但不限于tac、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara(PBAD)、SP6、λ-PR和λ-PL。
用于(丝状)真菌细胞的启动子是本领域已知的，并且可以是例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶gpdA启动子，蛋白酶启动子如pepA、pepB、pepC，葡糖淀粉酶glaA启动子，淀粉酶amyA、amyB启动子，过氧化氢酶catR或catA启动子，葡萄糖氧化酶goxC启动子，β-半乳糖苷酶lacA启动子，α-葡萄糖苷酶aglA启动子，翻译延伸因子tefA启动子，木聚糖酶启动子如xlnA、xlnB、xlnC、xlnD，纤维素酶启动子如eglA、eglB、cbhA，转录调节子的启动子如areA、creA、xlnR、pacC、prtT或另一启动子，并且可以在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)上找到其他。
在关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质的方面，使用术语“异源的”表示下述核酸或蛋白质，其不作为其存在的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的部分天然存在，或其存在于与其天然存在的细胞或位置基因组或DNA或RNA序列中的位点不同的地方。异源核酸或蛋白质对其被引入的细胞而言不是内源的，但是得自另一细胞或被合成或重组地生产。一般地(尽管并非必须)，这类核酸编码下述细胞通常不生产的蛋白质，所述DNA在所述细胞中被转录或表达。类似地，外源RNA编码下述蛋白质，所述蛋白质在存在所述外源RNA的细胞中通常不表达。异源核酸和蛋白质也可以被称作外来核酸或蛋白质。在本文中术语异源核酸或蛋白质包括本领域技术人员会识别为对于下述细胞是异源或外源的任何核酸或蛋白质，所述核酸或蛋白质在所述细胞中被表达。
根据本发明的方法可以在宿主生物中进行，所述宿主生物可以是新颖的。
因此，本发明还涉及包含一种或多种下述生物催化剂的宿主细胞，所述生物催化剂能够催化本发明方法中的至少一个反应步骤，尤其能够催化AKP、AAP或5-FVA到6-ACA的转化中的至少一个反应步骤。本发明还涉及下述新颖的载体，所述载体包含编码一种或多种能够催化本发明方法中至少一个反应步骤、尤其能够催化AKP到6-ACA的转化中至少一个反应步骤的酶的一个或多个基因，还涉及包含编码一种或多种下述酶的一个或多个基因的新颖的宿主细胞，所述酶能够催化本发明方法中的至少一个反应步骤，尤其能够催化AKP到6-ACA转化中的至少一个反应步骤(所述一个或多个基因可形成一个或多个载体的部分)。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的宿主细胞是包含下述核酸序列的重组细胞，所述核酸序列编码能够催化转氨基反应或还原性氨基化反应，从α-酮庚二酸形成α-氨基庚二酸的生物催化剂。所述序列可以是载体的部分，或者已被插入染色体DNA中。
具体地，根据本发明的宿主细胞或载体可包含至少一种核酸序列，尤其是至少两种核酸序列，所述核酸序列选自下组：编码具有α-酮庚二酸脱羧酶活性的酶的核酸序列，编码具有5-甲酰基戊酸酯氨基转移酶活性的酶的核酸序列，编码具有α-酮庚二酸氨基转移酶活性的酶的核酸，编码具有α-酮庚二酸脱氢酶活性的酶的核酸序列，和编码具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的酶的核酸序列。在这些序列中，典型地一种或多种，尤其是两种或更多是重组序列。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的宿主细胞(典型地是重组宿主细胞)或载体包含：编码至少一种具有α-酮庚二酸脱羧酶活性的生物催化剂的核酸序列，和/或至少一种选自下述序列的核酸序列，所述序列编码具有5-甲酰基戊酸酯氨基转移酶活性的生物催化剂。
在这样的实施方案中，编码具有α-酮庚二酸脱羧酶活性的酶的核酸序列可尤其包含根据Sequence ID 31、Sequence ID 34、Sequence ID 37、Sequence ID 40、Sequence ID 43或Sequence ID 46或这些序列任一同源物的核酸序列，和/或编码具有5-甲酰基戊酸酯氨基转移酶的酶的核酸序列可尤其包含根据Sequence ID 2、Sequence ID 5、Sequence ID 8、Sequence ID 65Sequence ID 67、Sequence ID 69或其同源物的氨基酸序列。一种或多种所述核酸序列可形成一个或多个重组载体的部分。
在又一个优选的实施方案中，载体或宿主细胞包含：编码具有α-酮庚二酸氨基转移酶活性的酶的核酸序列，和/或编码具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的酶的核酸序列。编码具有α-酮庚二酸氨基转移酶活性的酶的核酸序列尤其包含根据Sequence ID 2、Sequence ID 8、Sequence ID 12、Sequence ID 15、Sequence ID 17、Sequence ID 19、Sequence ID 21、Sequence ID 23、Sequence ID 25、Sequence ID 27、Sequence ID 29的氨基酸序列或其同源物。一种或多种所述核酸序列可形成一个或多个重组载体的部分。
在一个特定的优选的实施方案中，根据本发明的宿主细胞包含：编码具有α-氨基庚二酸酯2-脱氢酶活性的酶的核酸序列，和编码具有α-氨基庚二酸酯脱羧酶活性的酶的核酸序列。
在一个特定的优选的实施方案中，根据本发明的宿主细胞包含：编码具有6-氨基己酸6-脱氢酶活性的酶的核酸序列，和编码具有α-酮庚二酸脱羧酶活性的酶的核酸序列。
根据本发明的宿主细胞或载体的一个或多个合适的基因可尤其选自编码上文定义的酶的基因。
在一个特定的实施方案中，宿主细胞是包含至少一条下述核酸序列的重组细胞，所述核酸序列选自示于Sequence ID 1、Sequence ID 3、Sequence ID 4、Sequence ID 6、Sequence ID 7、Sequence ID 11、Sequence ID 13、Sequence ID 14、Sequence ID 16、Sequence ID 18、Sequence ID 20、Sequence ID 22、Sequence ID 24、Sequence ID 26、Sequence ID 28、Sequence ID 30、Sequence ID 32、Sequence ID 33、Sequence ID 35、Sequence ID 36、Sequence ID 38、Sequence ID 39、Sequence ID 41、Sequence ID 42、Sequence ID 44、Sequence ID 45、Sequence ID 47、Sequence ID 64、Sequence ID 66、Sequence ID 68任一的序列及其功能性类似物的组。
编码具有5-FVA氨基转移酶活性的酶的核酸序列可尤其是下述序列，所述序列选自Sequence ID 1、3、4、6、7、64、66、68任一所示序列以及任何这些序列的功能性类似物的组。
在本文中使用时，“功能性类似物”至少包括编码具有相同氨基酸序列的酶的其他序列，和编码这类酶同源物的其他序列。
编码具有AKP脱羧酶活性的酶的核酸序列可尤其是选自下述序列组的序列，所述序列由Sequence ID 30、32、33、35、36、38、39、41、42、44、45、47任一以及任何这些序列的功能性等同物表示。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞包含编码下述酶的核酸序列，所述酶能够催化AAP成为AKP的转化，根据Sequence ID No.：1、3、7、11、13、14、16、18、20、22、24、26、28或其功能性等同物，其可以是野生型或非野生型序列。
在一个特定的实施方案中，宿主细胞包含编码具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的生物催化剂的至少一种核酸序列，所述序列对所述宿主细胞而言可以是同源的或异源的。具体地，这类生物催化剂可选自脱羧酶(E.C.4.1.1)的组，更尤其选自谷氨酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.15)、二氨基庚二酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.20)、天冬氨酸1-脱羧酶(EC 4.1.1.11)、支链α-酮酸脱羧酶、α-酮异戊酸酯脱羧酶、α-酮戊二酸酯脱羧酶、丙酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.1)和草酰乙酸酯脱羧酶(E.C.4.1.1.3)的组。
在一个特定的实施方案中，宿主细胞包含一种或多种催化AKG形成AKP的酶(也见上文)。可以利用形成赖氨酸生物合成的α-氨基己二酸酯通路部分的酶体系。术语“酶体系”在本文中尤其用于能够催化特定转化的单个酶或一组酶。所述转化可包括具有已知或未知中间产物的一个或多个化学反应，例如AKG成为AKA的转化或AKA成为AKP的转化。这类体系可存在于细胞中，或从细胞中分离。已知氨基转移酶通常具有广泛的底物范围。存在时可期望降低宿主细胞中一种或多种这类酶的活性，使得AKA转化成为α-氨基己二酸酯(AAA)中的活性降低，同时保持其他氨基酸或细胞组分生物合成的相关催化功能。还优选下述宿主细胞，所述宿主细胞消灭了导致AKA转化成为不想要的副产物的任何其他酶活性。
在适用于利用全细胞生物转化工艺制备AAP的一个优选的宿主细胞中，编码了能够催化从α-酮戊二酸制备α-酮庚二酸中至少一个反应步骤的一种或多种生物催化剂。合适的生物催化剂例如在上文讨论AKP制备时被描述。
宿主细胞可例如选自细菌、酵母或真菌。具体地，宿主细胞可选自选自Aspergillus、Penicillium、Saccharomyces、Kluyveromyces、Pichia、Candida、Hansenula、Bacillus、Corynebacterium、Pseudomonas、Gluconobacter、Methanococcus、Methanobacterium、Methanocaldococcus和Methanosarcina和Escherichia组的属。本文中通常克隆和表达如上文所述的一种或多种编码核酸序列。
具体地，适用于合成6-ACA的宿主菌株和由此得到的宿主细胞可以选自Escherichia coli、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Corynebacterium glutamicum、Aspergillus niger、Penicillium chrysogenum、Saccharomyces cervisiae、Hansenula polymorpha、Candida albicans、Kluyveromyces lactis、Pichia stipitis、Pichia pastoris、Methanobacterium thermoautothrophicum ΔH、Methanococcus maripaludis、Methanococcus voltae、Methanosarcina acetivorans、Methanosarcina barkeri和Methanosarcina mazei宿主细胞的组。在一个优选的实施方案中，宿主细胞能够生产赖氨酸(作为前体)。
宿主细胞原则上可以是天然存在的生物，或者可以是经改造的生物。这样的生物可以使用本领域已知的突变筛选或代谢改造策略来改造。在一个特定的实施方案中，宿主细胞天然地包含(或者能够生产)一个或多个能够催化本发明方法中反应步骤的酶，如一种或多种选自下组的活性：能够催化本发明方法中反应步骤的脱羧酶、氨基转移酶和氨基酸脱氢酶。例如，E.coli可天然地能够生产催化本发明方法中转氨基反应的酶。还可能提供下述重组宿主细胞，所述细胞既具有编码能够催化本发明方法中反应步骤的氨基转移酶或氨基酸脱氢酶的重组基因，又具有编码能够催化本发明方法中反应步骤的脱羧酶基因的重组基因。
例如，宿主细胞可选自Corynebacterium属，尤其是C.glutamicum，肠细菌，尤其是Escherichia coli，Bacillus，尤其是B.subtilis和B.methanolicus，和Saccharomyces，尤其是S.cerevisiae。尤其合适的是已针对赖氨酸的工业生产开发的C.glutamicum或B.methanolicus菌株。
本发明还涉及一种微生物，其可以是分离自其天然环境的野生型微生物或是重组微生物，所述微生物包含下述DNA，所述DNA含有如选自Sequence ID 3、Sequence ID 6、Sequence ID 13、Sequence ID No.32、Sequence ID No.35、Sequence ID No.41、Sequence ID No.44、Sequence ID No.47的任何Sequence ID中所示的核酸序列及其功能性类似物。
如本文中所称的核苷酸序列的功能性类似物尤其是与核苷酸序列编码相同氨基酸序列或编码所述核苷酸序列的同源物的核苷酸序列。具体地，优选的功能性类似物是这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列在感兴趣的宿主细胞中与其之所以成为功能行类似物的相对应的核苷酸序列具有相似、相同或甚至更好的表达水平。
本发明还涉及包含以下的多核苷酸或载体：例如，选自Sequence ID 3、Sequence ID 6、Sequence ID 13、Sequence ID No.32、Sequence ID No.35、Sequence ID No.41、Sequence ID No.44、Sequence ID No.47的组的任何Sequence ID中示出的核酸序列及其非野生型功能性类似物。为了生产宿主细胞、特别是E.coli宿主细胞，或能够催化AKP以高产率转化成为6-ACA中的至少一个反应步骤的另一宿主细胞，这类多核苷酸或载体与相应的野生型基因相比是尤其有利的。
任选地，多核苷酸或载体包含编码适用于催化本发明方法中反应步骤的一种或多种其他生物催化剂、尤其是上文所述的这类一种或多种生物催化剂的一种或多种核酸序列。
本发明还涉及制备α-氨基庚二酸(AAP)的方法，包括将AKP转化成AAP，所述转化由生物催化剂催化。
对这样的方法而言，尤其可以使用如上文所述具有氨基转移酶活性或还原性氨基化活性的生物催化剂。
如上文所示，APP可在之后被用于制备6-ACA。或者，APP可以被原样使用，例如作为生物化学研究的化学品，或者作为pH-缓冲化学品，例如用于制备性或分析性分离技术如液相色谱或毛细管电泳中。
另外，在本发明方法中制备的APP还可被用于制备另一化合物，例如APP可以被转化成己内酰胺。如上文所述和下文实施例中展示。APP可以例如通过暴露于高温，被化学转化成己内酰胺。不受任何理论束缚，预期在该反应中6-ACA也可以作为短命的中间产物被形成。
接着，本发明将通过以下实施例阐述。
实施例
一般方法
分子和遗传技术
标准遗传和分子生物学技术是本领域普遍已知的，并且先前已被描述(Maniatis et al.1982“Molecular cloning：a laboratory manual”.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.；Miller 1972“Experiments in molecular genetics”，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor；Sambrook and Russell 2001″Molecular cloning：a laboratory manual”(3rd edition)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press；F.Ausubel et al，eds.，″Current protocols in molecular biology″，Green Publishing and Wiley Interscience，New York 1987)。
质粒和菌株
pBAD/Myc-His C得自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)。使用如WO2005/068643中所述构建的质粒pBAD/Myc-His-DEST进行蛋白质表达。所有克隆步骤和靶基因的表达使用E.coli TOP10(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。
培养基
E.coli的生长使用LB培养基(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/l NaCl)。补充抗生素(50μg/ml羧苄西林)来维持质粒。为了在pBAD/Myc-His-DEST衍生的质粒中PBAD启动子的控制下诱导基因表达，添加L-阿拉伯糖至0.2％(w/v)的终浓度。
质粒的鉴定
通过本领域普遍已知的遗传、生物化学和/或表型手段鉴定带有不同基因的质粒，如转化体对抗生素的抗性，转化体的PCR诊断性分析或质粒DNA的纯化，经纯化的质粒DNA的限制性分析或DNA序列分析。
用于5-FVA测定的HPLC-MS分析方法
通过选择性监测(SRM)-MS，测量m/z 129→83的跃迁来检测5-FVA。通过测量在约6分钟时洗脱的5-FVA峰的峰面积，计算5-FVA的浓度。通过使用外部标准流程进行校准。所有LC-MS实验在Agilent 1200LC系统上进行，所述Agilent 1200 LC系统由四元泵、自动取样机和柱温箱组成，与Agilent 6410 QQQ三重四极杆质谱仪(triple quadrupole MS)偶联。
LC条件：
柱：每个柱50 x 4.6mm Nucleosil C18，5μm(Machery & Nagel)，与250 x 4.6mm id.Prevail C18，5μm(Alltech)偶联
柱温度：室温
洗脱液：A：含0.1％甲酸的水
B：含0.1％甲酸的乙腈
梯度：时间(分钟) ％洗脱液B
0 10
6 50
6.1 10
11 10
流速：1.2ml/分钟，进入MS之前1∶3分流
注射体积：2μl
MS条件：
电离：负离子电喷射
来源条件：离子喷射电压：5kV
温度：350℃
碎裂电压(fragmentor voltage)和碰撞能量经优化
扫描模式：选择性反应模式：跃迁m/z 129→83
用于测定AAP的HPLC-MS
通过选择的离子监测(SIM)-MS，针对具有m/z 176的AAP测量质子化的分子，来检测AAP。通过测量样品中在2.7分钟滞留时间处洗脱的AAP峰的峰面积，来计算AAP的浓度。使用外标步骤进行校准。所有LC-MS实验在Agilent 1100 LC系统上进行，所述系统由四元泵、除气器、自动取样机和柱温箱组成，与API 2000三重四极杆MS(triple quadrupole MS)(Applied Biosystems)偶联。
LC条件如下：
柱：50 x 4Nucleosil C18，5μm(Machery & Nagel)+250 x 4.6 Prevail C18，5μm(Alltech)，均在室温(RT)下
洗脱液：A：超纯水中0.1％(v/v)的甲酸
B：乙腈(pa，Merck)中0.1％(v/v)甲酸
流速：1.2ml/分钟，进入MS之前1∶3分流
梯度：梯度在t＝0分钟时以90％(v/v)A开始，并且在6分钟内改变为50％(v/v)A。在6.1分钟时梯度改变为原始条件。
注射体积：2μl
MS条件：使用正离子电喷射进行电离
检测：处于m/z 176的SIM模式，停留时间100msec。
用于测定6-ACA的HPLC-MS分析
校准：
通过6-ACA的外部校准曲线进行校准(m/z 132→m/z 114，Rt 7.5分钟)。所有LC-MS实验在Agilent 1100上进行，所述Agilent 1100装有四元泵、除气器、自动取样机、柱温箱和单四极杆MS(Agilent，Waldbronn，德国)。LC-MS条件为：
柱： 50*4 Nucleosil(Mancherey-Nagel)+250 x 4.6 Prevail C18
(Alltech)，均在室温(RT)下
洗脱液： A＝超纯水中0.1(v/v)的甲酸
B＝乙腈(pa，Merck)
流速： 1.0ml/分钟，进入MS之前1∶3分流
梯度： 梯度在t＝0分钟时以100％(v/v)A开始，保持15分钟，并在
15分钟内改变至80％(v/v)B(t＝30分钟)。从30到31分
钟时，将梯度保持恒定在80％(v/v)B。
注射体积：5μl
MS检测： ESI(+)-MS
电喷射电离(ESI)在正扫描模式下使用以下条件运行；m/z 50-
500，50V碎裂电压，0.1m/z步长，350℃干燥气体温度，
10L N2/分钟干燥气体，50psig雾化器压强和2.5kV毛细管
电压。
靶基因的克隆
表达构建体的设计
对核糖体结合位点和起始密码子上游和终止密码子下游的所有基因添加attB位点，以便使用Gateway技术(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)进行克隆。
基因合成和质粒构建
根据DNA2.0的标准程序，从DNA2.0获得合成的基因并为了在E.coli中表达进行密码子优化。对分别编码V.fluvialis JS17 ω-氨基转移酶[SEQ ID No.2]和B.weihenstephanensis KBAB4氨基转移酶(ZP_01186960)[SEQ ID No.5]的氨基酸序列的，来自Vibrio fluvialis JS 17[SEQ ID No.1]和Bacillus weihenstephanensis KBAB4[SEQ ID No.4]的氨基转移酶基因进行密码子优化，并通过DNA合成获得得到的序列[SEQ ID No.3]和[SEQ ID No.6]。
还对分别编码V.fluvialis JS17 ω-氨基转移酶[SEQ ID No.3]、B.weihenstephanensis KBAB4氨基转移酶(ZP_01186960)[SEQ ID No.6]、Escherichia coli二氨基庚二酸酯脱羧酶LysA[SEQ ID No.31]、Saccharomyces cerevisiae丙酮酸酯脱羧酶Pdc[SEQ ID No.34]、Zymomonas mobilis丙酮酸酯脱羧酶PdcI472A[SEQ ID No.37]、Lactococcus lactis支链α酮酸脱羧酶KdcA[SEQ ID No.40]和α-酮异戊酸酯脱羧酶KivD[SEQ ID No.43]和Mycobacterium tuberculosisα-酮戊二酸酯脱羧酶Kgd[SEQ ID No.46]的氨基酸序列的，来自Escherichia coli[SEQ ID No.30]、Saccharomyces cerevisiae[SEQ ID No.33]、Zymomonas mobilis[SEQ ID No.36]、Lactococcus lactis[SEQ ID No.39]、[SEQ ID No.42]和Mycobacterium tuberculosis[SEQ ID No.45]的脱羧酶基因进行密码子优化，并通过DNA合成分别获得得到的序列[SEQ ID No.32]、[SEQ ID No.35]、[SEQ ID No.38]、[SEQ ID No.41]、[SEQ ID No.44]和[SEQ ID No.47]。
如制造商方案(www.invitrogen.com)中所述，使用Gateway技术(Invitrogen)，通过引入的attB位点和pDONR201(Invitrogen)作为进入载体，将基因构建体克隆进pBAD/Myc-His-DEST表达载体中。藉此分别获得了表达载体pBAD-Vfl_AT和pBAD-Bwe_AT。通过用相应的pBAD-表达载体转化化学感受态E.coli TOP10(Invitrogen)，获得相应的表达菌株。
通过PCR克隆
根据制造商的说明书使用PCR Supermix High Fidelity(Invitrogen)，使用下表中所列引物，通过PCR从基因组DNA中扩增编码生物催化剂的多个基因。
表2
通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)从凝胶中洗脱具有正确大小的PCR产物。如制造商方案中所述，使用Gateway技术(Invitrogen)，通过引入的attB位点和pDONR-zeo(Invitrogen)作为进入载体，将经纯化的PCR产物克隆进pBAD/Myc-His-DEST表达载体中。通过DNA测序验证通过PCR克隆的基因序列。藉此获得了表达载体pBAD-Pae-_gi9946143_AT、pBAD-Bsu_gi16078032_AT、pBAD-Bsu_gi16080075_AT、pBAD-Bsu_gi16077991_AT、pBAD-Rsp_AT、pBAD-Lpn_AT、pBAD-Neu_AT、pBAD-Ngo_AT、pBAD-Pae_gi9951299_AT、pBAD-Pae_gi9951072_AT、pBAD-Pae_gi9951630_AT和pBAD-Rpa_AT。通过用pBAD构建体转化化学感受态E.coli TOP10(Invitrogen)获得相应的表达菌株。
用于蛋白质表达的E.coli的培养
在装有含0.02％(w/v)L-阿拉伯糖的940μl培养基的96-深孔平板中进行小规模培养。通过用96-孔印模(Kühner，Birsfelden，瑞士)转移来自冷冻菌种培养物的细胞，进行接种。将平板于25℃下在轨道摇床(300rpm，5cm振幅)上孵育48小时。典型地达到2-4的OD620nm。
制备细胞裂解物
制备裂解缓冲液
裂解缓冲液含有以下成分：
表3
1M MOPS pH 7.5 5ml
DNAse I级别II(Roche) 10mg
溶菌酶 200mg
MgSO4.7H2O 123.2mg
二硫苏糖醇(DTT) 154.2mg
H2O(MilliQ) 平衡至100ml
在使用之前即刻新鲜制备所述溶液。
通过裂解制备无细胞提取物
通过离心收获来自小规模培养(见前一段)的细胞，弃去上清液。将离心期间形成的细胞沉淀物于-20℃下冷冻至少16下式，然后冰上融化。向每个孔中添加500μl新鲜制备的裂解缓冲液，并通过将平板剧烈振荡2-5分钟使细胞重悬。为了实现裂解，将平板在室温下孵育30分钟。为了去除细胞碎片，将平板在4℃和6000g下离心20分钟。将上清液转移至新鲜平板并置于冰上，直至再次使用。
通过超声处理制备无细胞提取物
通过离心收获来自中规模培养(见前一段)的细胞，弃去上清液。向0.5g湿细胞沉淀物中添加1ml磷酸钾缓冲液pH7，并通过剧烈振荡重悬细胞。为了实现裂解，将细胞超声处20分钟。为了去除细胞碎片，将裂解物在4℃和6000g下离心20分钟。将上清液转移至新鲜管中并于-20℃冷冻直至再次使用。
通过甲基5-甲酰基戊酸酯的化学水解制备5-甲酰基戊酸
如下通过甲基5-甲酰基戊酸酯的化学水解制备氨基转移酶反应的底物，即5-甲酰基戊酸：用NaOH将甲基5-甲酰基戊酸酯的10％(w/v)水溶液设置为pH 14.1。在20℃下孵育24小时后用HCl将pH设为7.1。
5-甲酰基戊酸转化为6-ACA的酶促反应
除非另有说明，制备在50mM磷酸钾缓冲液，pH 7.0中包含10mM5-甲酰戊酸、20mM外消旋α-甲基苄胺和200 μM5’-磷酸吡哆醛的反应混合物。向带孔平板的每个孔中分散100μl反应混合物。向每个孔中添加20μl无细胞提取物。将反应混合物在摇床上于37℃下孵育24小时。另外，在相同条件下孵育化学空白混合物(不含无细胞提取物)和生物空白(带有pBAD/Myc-His C的E.coli TOP10)。通过HPLC-MS分析样品。结果概括于下表中。
表4：在存在氨基转移酶时从5-FVA形成6-ACA
*方法的差异在于使用10μl无细胞提取物而不是20μl，5’-磷酸吡哆醛浓度是50μM而不是200μM，并且孔中的反应混合物体积为190μl而不是100μl
显示在存在氨基转移酶时从5-FVA形成6-ACA。
用于将AKP转化成5-甲酰基戊酸的酶促反应
在100mM磷酸钾缓冲液，pH 6.5中制备包含50mM AKP、5mM氯化镁、100μM吡哆醛5’-磷酸(针对LysA)或1mM硫胺二磷酸(针对所有其他酶)的反应混合物。将4ml反应混合物分散进反应管中。为了起始反应，向每个孔中添加1ml通过声处理获得的无细胞提取物。在商业草酰乙酸酯脱羧酶(Sigma-Aldrich产品编号04878)的情况下，使用50U。使用磁性搅拌棒，在37℃下将反应混合物孵育48小时。另外，在相同条件下孵育化学空白混合物(没有无细胞提取物)和生物空白(带有pBAD/Myc-His C的E.coli TOP10)。通过HPLC-MS分析来自反应期间不同时间点的样品。结果概括于下表中。
表5：在存在脱羧酶时从AKP形成5-FVA
n.d.：不可检出
已知在存在脱羧酶时从AKP形成5-FVA。
在存在重组脱羧酶时从AKP转化成6-ACA的酶促反应
在100mM磷酸钾缓冲液，pH 6.5中制备包含50mM AKP、5mM氯化镁、100μM吡哆醛5’-磷酸(针对LysA)或1mM硫胺二磷酸(针对所有其他酶)的反应混合物。将4ml反应混合物分散进反应管中。为了起始反应，向每个孔中添加1ml无细胞提取物。使用磁性搅拌棒，在37℃下将反应混合物孵育48小时。另外，在相同条件下孵育化学空白混合物(没有无细胞提取物)和生物空白(带有pBAD/Myc-His C的E.coli TOP10)。通过HPLC-MS分析来自反应期间不同时间点的样品。结果概括于下表中。
表6：存在脱羧酶时从AKP形成6-ACA
n.a.＝未分析
n.d.＝不可检出
显示存在脱羧酶时从AKP形成6-ACA。注意到E.coli含有天然的5-FVA氨基转移酶活性。
在存在重组脱羧酶和重组氨基转移酶时从AKP转化成6-ACA的酶促反应
在100mM磷酸钾缓冲液，pH 6.5中制备包含50mM AKP、5mM氯化镁、100μM吡哆醛5’-磷酸、1mM硫胺二磷酸和50mM外消旋α-甲基苄胺的反应混合物。将1.6ml反应混合物分散进反应管中。为了起始反应，向每个反应管中添加0.2ml含有脱羧酶的无细胞提取物和0.2ml含有氨基转移酶的无细胞提取物。使用磁性搅拌棒，在37℃下将反应混合物孵育48小时。另外，在相同条件下孵育化学空白混合物(没有无细胞提取物)和生物空白(带有pBAD/Myc-His C的E.coli TOP10)。通过HPLC-MS分析来自反应期间不同时间点的样品。结果概括于下表中。
表7：存在重组脱羧酶和重组氨基转移酶时从AKP形成6-ACA
AT＝氨基转移酶
DC＝脱羧酶
在化学空白和生物空白中，不可检出6-ACA。
另外，结果显示与其中宿主细胞仅具有重组脱羧酶(而无重组氨基转移酶)的实施例相比，成为6-ACA的转化被改进。
构建用于在S.cerevisiae中表达氨基转移酶和脱羧酶的质粒
根据制造商的说明书和使用特异性引物[SEQ ID No.76 & 77]，使用Phusion DNA聚合酶(Finnzymes)，通过PCR从pBAD-Vfl_AT[SEQ ID No.3]中扩增编码V.fluvialis JS17ω-氨基转移酶[SEQ ID No.2]的氨基酸序列的，来自Vibrio fluvialis JS17的氨基转移酶基因。
根据制造商的说明书和使用特异性引物[SEQ ID No.78 & 79]，使用Phusion DNA聚合酶(Finnzymes)，通过PCR从pBAD-Pae_AT中扩增编码P.aeruginosa氨基转移酶[SEQ ID No.8]的来自Pseudomonas aeruginosa[SEQ ID No.7]的氨基转移酶基因。
使用SpeI和BamHI限制性酶，将得到的PCR产物克隆进载体pAKP-41中，分别得到载体pAKP-79和pAKP-80，所述载体含有处于在S.cerevisiae gal10启动子和S.cerevisiae adh2终止子控制下的氨基转移酶基因。
根据制造商的说明书和使用特异性引物[SEQ ID No 80 & 81]，使用Phusion DNA聚合酶(Finnzymes)，通过PCR从pBAD-Pdc中扩增编码Saccharamyces cerevisiae丙酮酸酯脱羧酶Pdc[SEQ ID No.34]的来自Saccharamyces cerevisiae[SEQ ID No.33]的脱羧酶基因。
根据制造商的说明书和使用特异性引物[SEQ ID No 82 & 83]，使用Phusion DNA聚合酶(Finnzymes)，通过PCR从pBAD-KdcA中扩增编码Lactococcus lactis支链α-酮酸脱羧酶KdcA[SEQ ID No.40]的来自Lactococcus lactis[SEQ ID No.39]的脱羧酶基因。
使用AscI和BamHI限制性酶，将得到的PCR产物克隆进载体pAKP-44中，分别得到载体pAKP-81和pAKP-82，所述载体含有处于在S.cerevisiae gal2启动子和S.cerevisiae pma1终止子控制下的脱羧酶基因。
用SacI和XbaI限制性酶消化质粒pAKP-79和pAKP-80，并用SalI和XbaI限制性酶消化质粒pAKP-81和pAKP-82。将SacI/XbaI氨基转移酶片段与SalI/XbaI脱羧酶片段一起并入用SalI和SacI限制性酶消化的S.cerevisiae低拷贝附加体载体pRS414中。
获得得到的质粒：
pAKP-85：Pgal10-Pae_AT-Tadh2Pgal2-Pdc_DC-Tpma1
pAKP-86：Pgal10-Pae_AT-Tadh2Pgal2-KdcA_DC-Tpma1
pAKP-87：Pgal10-Vfl_AT-Tadh2Pgal2-Pdc_DC-Tpma1
pAKP-88：Pgal10-Vfl_AT-Tadh2Pgal2-KdcA_DC-Tpma1
S.cerevisiae的转化和培养
根据如Gietz and Woods(Gietz，R.D.and Woods，R.A.(2002))所述的方法，用1μg质粒DNA转化S.cerevisiae菌株CEN.PK113-3C。通过Liac/SS运载体DNA/PEG方法(Methods in Enzymology 350：87-96)转化酵母。将细胞涂布于琼脂平板上，所述琼脂平板含有无氨基酸的1x酵母氮基和2％葡萄糖。
在含有0.05％葡萄糖和4％半乳糖的Verduyn最小培养基中，将得到的菌株在30℃下需氧培养48小时。
制备无细胞提取物
向0.5克细胞沉淀物中添加1ml磷酸钾缓冲液(pH 7)。将该混合物添加至含有0.5g直径0.4-0.5mM玻璃珠的2ml eppendorf管中。用eppendorf摇床(IKA VIBRAX-VXR)将样品剧烈摇动20秒。将得到的无细胞提取物在14000rpm和4℃下离心5分钟。上清液被用于酶活性测定。
S.cerevisiae中存在共表达的脱羧酶和氨基转移酶时将AKP转化成6-ACA的酶促反应
在100mM磷酸钾缓冲液，pH 6.5中制备包含50mM AKP、5mM氯化镁、100μM吡哆醛5’-磷酸、1mM硫胺二磷酸和50mM外消旋α-甲基苄胺的反应混合物。将1.6ml反应混合物分散进反应管中。为了起始反应，向每个反应管中添加0.4ml含有脱羧酶和氨基转移酶的来自S.cerevisiae的无细胞提取物。使用磁性搅拌棒，在37℃下孵育反应混合物。另外，在相同条件下孵育化学空白混合物(没有无细胞提取物)和生物空白(S.cerevisiae)。通过HPLC-MS分析在孵育19小时后采取的样品。结果概括于下表中。
表8：使用微生物作为生物催化剂从AKP形成6-ACA
用于将α-酮庚二酸转化成α-氨基庚二酸的酶促反应
在50mM磷酸钾缓冲液，pH 7.0中制备包含10mM α-酮庚二酸、20mM L-丙氨酸和50μM吡哆醛5’-磷酸的反应混合物。将800μl反应混合物分散进孔平板的每个孔中。为了起始反应，向每个孔中添加200μl细胞裂解物。将反应混合物在摇床上于37℃下孵育24小时。另外，在相同条件下孵育化学空白混合物(没有无细胞提取物)和生物空白(带有pBAD/Myc-His C的E.coli TOP10)。通过HPLC-MS分析样品。结果概括于下表中。
表9：存在氨基转移酶时从AKP形成AAP
显示从AKP形成AAP由生物催化剂催化。
APP成为己内酰胺的化学转化
向21ml环己酮中1.5克D，L-2-氨基庚二酸的悬浮液中添加0.5ml环己烯酮。将混合物在油浴上回流加热20小时(约160℃)。冷却至室温后，倾析反应混合物，并在减压下蒸发澄清的溶液。通过1H-NMR和HPLC分析剩余的2克棕色油，并且含有0.8wt％己内酰胺和6wt％己内酰胺的环状寡聚体。
Claims (25)
1.用于制备6-氨基己酸的方法，其中所述6-氨基己酸是使用至少一种生物催化剂从α-酮庚二酸制备的。
2.用于制备6-氨基己酸的方法，其中所述6-氨基己酸是使用至少一种生物催化剂从5-甲酰基戊酸酯制备的。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述生物催化剂包含能够催化转氨基反应和/或还原性氨基化的酶。
4.根据权利要求3的方法，其中所述能够催化转氨基反应和/或还原性氨基化的酶选自氨基转移酶(E.C.2.6.1)和氨基酸脱氢酶(E.C.1.4.1)的组。
5.根据权利要求4的方法，其中所述氨基转移酶或氨基酸脱氢酶选自β-氨基异丁酸酯:α-酮戊二酸酯氨基转移酶、β-丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、4-氨基-丁酸酯氨基转移酶(EC 2.6.1.19)、L-赖氨酸6-氨基转移酶(EC 2.6.1.36)、2-氨基己二酸酯氨基转移酶(EC 2.6.1.39)、5-氨基戊酸酯氨基转移酶(EC 2.6.1.48)、2-氨基己酸酯氨基转移酶(EC 2.6.1.67)、赖氨酸:丙酮酸酯6-氨基转移酶(EC 2.6.1.71)和赖氨酸-6-脱氢酶(EC 1.4.1.18)的组。
6.根据权利要求3、4或5的方法，其中所述酶选自能够催化转氨基反应和/或还原性氨基化的下述酶的组，所述酶来自选自Vibrio；Pseudomonas；Bacillus；Mercurialis；Asplenium；Ceratonia；哺乳动物；Neurospora；Escherichia；Thermus；Saccharomyces；Brevibacterium；Corynebacterium；Proteus；Agrobacterium；Geobacillus；Acinetobacter；Ralstonia；Salmonella；Rhodobacter和Staphylococcus组的生物，尤其来自选自Bacillus subtilis、Bacillus weihenstephanensis、Rhodobacter sphaeroides、Staphylococcus aureus、Legionella pneumophila、Nitrosomonas europaea、Neisseria gonorrhoeae、Pseudomonas syringae、Rhodopseudomonas palustris、Vibrio fluvialis和Pseudomonas aeruginosa组的生物。
7.根据权利要求4-6中任一的方法，其中使用下述氨基转移酶，所述氨基转移酶包含根据Sequence ID 2、Sequence ID 5、Sequence ID 8、Sequence ID 12、Sequence ID 15、Sequence ID 17、Sequence ID 19、Sequence ID 21、Sequence ID 23、Sequence ID 25、Sequence ID 27、Sequence ID 29、Sequence ID 65、Sequence ID 67、Sequence ID 69的氨基酸序列或任何这些序列的同源物。
8.根据前述权利要求中任一的方法，其中所述生物催化剂包含能够催化α-酮酸或氨基酸脱羧的酶。
9.根据根据权利要求8的方法，其中能够催化脱羧的所述酶是脱羧酶(E.C.4.1.1)。
10.根据权利要求9的方法，其中所述脱羧酶选自谷氨酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.15)、二氨基庚二酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.20)、天冬氨酸1-脱羧酶(EC 4.1.1.11)、支链α-酮酸脱羧酶、α-酮异戊酸酯脱羧酶、α-酮酮戊二酸脱羧酶、丙酮酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.1)和草酰乙酸酯脱羧酶(E.C.4.1.1.3)的组。
11.根据权利要求8、9或10的方法，其中能够催化脱羧的所述酶是来自下述生物或其部分的酶，所述生物选自Cucurbitaceae；Saccharomyces；Candida；Hansenula；Kluyveromyces；Rhizopus；Neurospora；Zymomonas；Escherichia；Mycobacterium；Clostridium；Lactobacillus；Streptococcus；Pseudomonas和Lactococcus的组。
12.根据权利要求8-11中任一的方法，其中能够催化脱羧的所述酶包含根据Sequence ID 31、Sequence ID 34、Sequence ID 37、Sequence ID 40、Sequence ID 43或Sequence ID 46的氨基酸序列或任何这些序列的同源物。
13.根据前述权利要求任一的方法，其中在存在能够催化α-酮酸脱羧的生物催化剂时，α-酮庚二酸被生物催化性转化成5-甲酰基戊酸酯，在存在至少一种氨基供体和至少一种能够催化5-甲酰基戊酸酯的转氨基反应和/或还原性氨基化的生物催化剂时，5-甲酰基戊酸酯被生物催化性转化成6-氨基己酸。
14.根据前述权利要求任一的方法，其中在存在至少一种氨基供体和至少一种能够催化α-酮庚二酸的转氨基反应和/或还原性氨基化的生物催化剂时，α-酮庚二酸被生物催化性转化成α-氨基庚二酸，从而形成α-氨基庚二酸，并且在存在能够催化氨基酸脱羧的生物催化剂时α-氨基庚二酸被生物催化性转化成6-氨基己酸。
15.根据前述权利要求任一的方法，其中所述α-酮庚二酸得自天然来源。
16.用于制备己内酰胺的方法，所述方法包括：环化通过根据前述权利要求任一的方法制备的6-氨基己酸，从而形成己内酰胺。
17.重组宿主细胞，所述细胞包含编码具有α-酮庚二酸脱羧酶活性的酶的核酸序列，和/或编码具有5-甲酰基戊酸酯氨基转移酶活性的酶的核酸序列。
18.根据权利要求17的重组宿主细胞，所述细胞包含编码具有5-甲酰基戊酸酯氨基转移酶的酶的核酸序列，所述酶包含根据Sequence ID 2、Sequence ID 5、Sequence ID 8、Sequence ID 65、Sequence ID 67、Sequence ID 69的氨基酸序列或其同源物。
19.根据权利要求17或18的重组宿主细胞，所述细胞包含编码具有α-酮庚二酸脱羧酶活性的酶的核酸序列，所述酶包含根据Sequence ID 31、Sequence ID 34、Sequence ID 37、Sequence ID 40、Sequence ID 43或Sequence ID 46的氨基酸序列或任何这些序列的同源物。
20.重组宿主细胞，所述宿主细胞包含编码具有α-酮庚二酸氨基转移酶活性或α-酮庚二酸脱氢酶活性的酶的核酸序列，和/或编码具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的酶的核酸序列。
21.根据权利要求20的重组宿主细胞，其中所述生物催化剂包含编码下述氨基转移酶的核酸序列，所述氨基转移酶包含根据Sequence ID 2、Sequence ID 8、Sequence ID 12、Sequence ID 15、Sequence ID 17、Sequence ID 19、Sequence ID 21、Sequence ID 23、Sequence ID 25、Sequence ID 27、Sequence ID 29的氨基酸序列或其同源物。
22.根据权利要求17-21任一的重组宿主细胞，所述细胞包含编码一种或多种下述生物催化剂的一种或多种核酸序列，所述生物催化剂能够催化从α-酮戊二酸制备α-酮庚二酸中的至少一个反应步骤。
23.根据权利要求17-22中任一的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞选自Aspergillus、Penicillium、Saccharomyces、Kluyveromyces、Pichia、Candida、Hansenula、Bacillus、Corynebacterium和Escherichia的组。
24.根据权利要求17-23中任一的微生物，所述微生物包含选自下述序列组的核酸序列，所述序列由选自Sequence ID 1、Sequence ID 3、Sequence ID 4、Sequence ID 6、Sequence ID 7、Sequence ID 11、Sequence ID 13、Sequence ID 14、Sequence ID 16、Sequence ID 18、Sequence ID 20、Sequence ID 22、Sequence ID 24、Sequence ID 26、Sequence ID 28、Sequence ID 30、Sequence ID 32、Sequence ID 33、Sequence ID 35、Sequence ID 36、Sequence ID 38、Sequence ID 39、Sequence ID 41、Sequence ID 42、Sequence ID 44、Sequence ID 45、Sequence ID 47、Sequence ID 64、Sequence ID 66、Sequence ID 68及其功能性类似物的组的任何序列表示。
25.多核苷酸，其包含选自示于Sequence ID 3、Sequence ID 6、Sequence ID 13、Sequence ID 32、Sequence ID 35、Sequence ID 38、Sequence ID 41、Sequence ID 44、Sequence ID 47中的序列及其功能性类似物的组的核酸序列。
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