CN103097541A

CN103097541A - 从α-酮庚二酸制备6-氨基己酸

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Publication number: CN103097541A
Application number: CN2011800436871A
Authority: CN
Inventors: 斯特凡纳斯·克尼里斯·翰德里克斯·蒂尔科; 马丁·斯库尔曼; 埃克斯勒·克里斯多佛·特里弗泽; 彼托纳拉·凯瑟琳娜·拉伊马克斯-弗兰肯; 希尔德加德·汉纳·曼克
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2010-09-10
Filing date: 2011-08-26
Publication date: 2013-05-08
Also published as: BR112013005786A2; WO2012031911A2; TW201217535A; US20130237698A1; WO2012031911A3; EA201300325A1

Abstract

本发明涉及用于制备6-氨基己酸的方法，其包括使用至少一种包含具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的酶的生物催化剂，使α-氨基庚二酸脱羧。本发明还涉及用于由通过所述方法制备的6-氨基己酸制备己内酰胺的方法、涉及适用于根据本发明的方法的宿主细胞和编码可在本发明的方法中使用的脱羧酶的多核苷酸。

Description

从α-酮庚二酸制备6-氨基己酸

本发明涉及制备6-氨基己酸（下文也称作“6-ACA”）的方法。本发明还涉及从6-ACA制备ε-己内酰胺（下文称作“己内酰胺”）的方法。本发明还涉及可用于制备6-ACA或己内酰胺的宿主细胞。

己内酰胺是一种内酰胺，其可以被用于生产聚酰胺，例如尼龙-6或尼龙-6,12（己内酰胺和十二内酰胺的共聚物）。由大宗化学品制备己内酰胺的多种方式是本领域已知的，并且包括由环己酮、甲苯、苯酚、环己醇、苯或环己烷制备己内酰胺。这些中间产物化合物通常得自矿物油。考虑到使用更加可持续的技术来制备材料的日益增长的需要，期望提供一种方法，其中由能够从生物可再生来源获得的中间产物化合物或至少由使用生物化学方法被转化成己内酰胺的中间产物来制备己内酰胺。另外，想要提供一种方法，所述方法比利用来自石油化学来源的大宗化学品的传统化学工艺需要更少能源。

由6-ACA制备己内酰胺是已知的，例如如US-A6,194,572中所述。如WO2005/068643中所公开的，可以在存在具有α,β-烯酸酯还原酶活性的酶时，通过转化6-氨基己-2-烯酸（6-AHEA）来生物化学地制备6-ACA。可以例如通过生物化学方式或通过纯化学合成，由赖氨酸制备6-AHEA。尽管可以通过WO2005/068643中公开的方法，通过6-AHEA的还原制备6-ACA是可行的，但是本发明人发现在还原反应条件下，6-AHEA可自发并且基本不可逆地环化形成不想要的副产物，特别是β-高脯氨酸。所述环化可以形成6-ACA生产中的瓶颈，并可导致产率的可观损失。

WO2009/113855公开了用于制备6-ACA的新反应途径，即从α-酮庚二酸（AKP）经由中间产物5-甲酰戊酸（也称作5-甲酰缬草酸（5-formylvaleric acid），5-FVA）或经由中间产物α-氨基庚二酸(AAP)制备6-ACA。WO2009/113855还公开了下述生物催化剂，其能在由AKP制备6-ACA中催化反应步骤的至少一个。尽管WO2009/113855公开了产生6-ACA的有效的方法，但是期望增加生物催化产生的6-ACA的生产率，特别是在从AKP完全生物催化产生6-ACA的方法中。

本发明的一个目的是提供用于制备6-ACA或己内酰胺（尤其可以被用于制备聚酰胺的己内酰胺）或用于制备6-ACA或己内酰胺的中间产物化合物的新颖方法，所述方法可以作为已知方法的替代方式。

本发明的又一个目的是提供克服上文提到的现有技术中的一种或多种上述缺点的新颖方法。

根据本发明可解决的一个或多个其他目的可根据下文的说明书得到。

目前发现有可能使用具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的特定生物催化剂，由AAP制备6-ACA。因此，本发明涉及用于制备6-氨基己酸的方法，其包括使用包含具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的酶的至少一种生物催化剂，使α-氨基庚二酸脱羧，其中所述酶包含由SEQUENCE ID NO’s:2、5、8和11和所述序列的具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的同源物之任一表示的氨基酸序列。

在一种实施方式中，在本发明方法中制备的6-ACA用于制备己内酰胺。这类方法包括任选地在存在生物催化剂时环化6-氨基-己酸。

根据本发明，未发现关于中间产物的不想要的环化的问题，当形成6-ACA并任选地形成己内酰胺时，这些问题会导致产率的损失。

预期本发明的方法允许得到与WO2005/68643中所述方法相当或甚至更好的产率。预期在利用活生物时，尤其是在要考虑生物的生长和维持的方法中，本发明的方法尤其是有利的。

还预期在本发明的一种实施方式中，本发明方法中6-ACA的生产力（形成的g/l.h）被提高。

除非另有说明，在本文中使用的术语“或者”被定义为“和/或”。

除非另有说明，在本文中使用的术语“一”（“a”或“an”）被定义为“至少一个”。

涉及单数名词（例如化合物、添加剂等）时，复数旨在被包括在内。

本文中提到羧酸或羧酸酯例如6-ACA、AAP、另一氨基酸、或AKP时，这些术语旨在包括质子化的羧酸基（即中性基团）、它们相应的羧酸酯（其共轭碱）及其盐。在本文中提到氨基酸例如6-ACA时，所述术语旨在包括两性离子形式的氨基酸（其中氨基被质子化且羧酸酯基是去质子化的形式），其中氨基被质子化且羧基为中性形式的氨基酸，和其中氨基为中性形式且羧酸酯基是去质子化形式的氨基酸，以及它们的盐。

涉及存在立体异构体的化合物时，所述化合物可以是任何这类立体异构体或其组合。因此，涉及例如存在对映异构体的氨基酸时，氨基酸可以是L-对映异构体、D-对映异构体或其组合。存在天然立体异构体时，化合物优选地是天然立体异构体。

当涉及一个酶的在括号中的酶种类（EC）时，所述酶种类是以Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology(NC-IUBMB）提供的Enzyme Nomenclature为基础，将酶归类或可以归类在其中的种类，所述命名法可见http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/。（尚）未归类但是可以同样被归类在特定种类中的其他合适的酶旨在包括在内。

术语“同源物”在本文中尤其用于具有至少40%、更优选地至少60%、更优选地至少65%、更优选地至少70%、更优选地至少75%、更优选地至少80%、尤其是至少85%、更尤其是至少90%、至少91%、92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性的多核苷酸或多肽。

另外，同源物通常具有显著的序列相似性，通常多于30%的、尤其至少35%、优选地至少40%、更优选地至少60%、更优选地至少65%、更优选地至少70%、更优选地至少75%、更优选地至少80%、尤其至少85%、更尤其至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列相似性。

多肽或多核苷酸的同源物通常与其自身具有相同的期望的功能，例如编码各自能催化相同反应（典型地相同底物向相同化合物转化）或类似反应的相同肽。“类似反应”典型地是相同类型的反应，例如脱羧、转氨化、C1-延伸。因此，按照经验法则，同源物酶可归类在共有EC种类（x.y.z）的头三个数字的EC种类中，例如针对羧化酶的EC4.1.1。典型地，在类似反应中，作为用于与类似反应类似的反应的底物的相同种类（例如胺、羧酸、氨基酸）的底物被转化为作为与类似反应类似的反应的产物的相同种类的产物。类似反应尤其包括通过相同化学转化定义的反应，如通过相同KEGG RDM模式定义的，其中R-原子和D-原子描述化学转化（KEGG RDM patterns:Oh,M.et al.(2007)Systematic analysis ofenzyme-catalyzed reaction patterns and prediction of microbial biodegradationpathways.J.Chem.Inf.Model.,47,1702–1712)）。

术语同源物也旨在包括由于遗传密码子的简并性或实验偏性而与另一核酸序列不同并且编码相同多肽序列的核酸序列（多核苷酸序列）。

本文中术语“功能类似物”用于下述核酸序列，所述核酸序列不同于所述类似物为类似物的给定序列，但编码具有相同氨基酸序列的肽（蛋白、酶）或编码此类肽的同源物。尤其，优选的功能类似物是在感兴趣的宿主细胞中与称其为功能类似物的核苷酸序列相比具有类似的、相同的或更好的表达水平的核苷酸序列。在这方面，注意到，如技术人员所理解的，若期望肽（蛋白、酶）表达，更好的表达水平通常是更高的表达水平。但是，在特定实施方式中，更好表达水平可以是更低的表达水平，因为这在所述宿主细胞的代谢途径背景中可能是期望的。功能类似物可以是天然存在的序列，即野生型功能类似物，或遗传修饰的序列，即非野生型功能类似物。编码具体肽的密码子优化的序列通常是野生型序列的非野生型功能类似物，其被设计来实现期望的表达水平。

尤其，优选的功能类似物是在感兴趣的宿主细胞中与称其为功能类似物的核苷酸序列相比具有类似的、相同的或更好的表达水平的核苷酸序列。

序列同一性或类似性在本文中被定义为如通过比较序列测定的，两条或更多条多肽序列或两条或更多条核酸序列之间的关系。通常，序列同一性或相似性在序列全长上比较，但是也可以仅针对彼此比对的序列的一部分进行比较。在本领域中，“同一性”或“相似性”也表示多肽序列或核酸序列之间的序列相关性程度，根据情况由这类序列之间的匹配来确定。测定同一性或相似性的优选方法被设计为在测试的序列之间给出最大匹配。在本发明的上下文中，测定两条序列之间同一性和相似性的一种优选的计算机程序方法包括BLASTP和BLASTN（Altschul，S.F.et al.，J.Mol.Biol.1990，215，403-410），公众可以从NCBI和其他来源（BLASTManual，Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda，MD20894）获得。使用BLASTP进行多肽序列比较的优选参数为缺口开放10.0，缺口延伸0.5，Blosum62矩阵。使用BLASTN进行核酸序列比较的优选参数为缺口开放10.0，缺口延伸0.5，DNA全矩阵（DNA同一性矩阵）。

根据本发明，使用生物催化剂，即所述方法中至少一个反应步骤由生物材料或来自生物来源的部分（例如来自生物来源的生物或生物分子）催化。生物催化剂可尤其包含一种或多种酶。生物催化剂可以以任何形式使用。在一种实施方式中，使用从天然环境中分离（从生产它们的生物中分离）的一种或多种酶，例如作为溶液、乳液、分散液、冻干细胞（悬浮液）、作为裂解物、或固定在支持物上。在一种实施方式中，一种或多种酶形成了活细胞的部分（如活的全细胞）。

酶可在细胞内发挥催化功能。酶还可能被分泌进所述细胞存在的培养基中。

活细胞可以是生长中的细胞、静止或休眠细胞（例如孢子）或稳定期细胞。还可能使用酶形成通透化（即使其对酶的底物或一种或多种酶的底物前体通透）的细胞的部分。

本发明方法中使用的生物催化剂原则上可以是任何生物，获得自或来自任何生物。生物可以是真核生物或原核生物。具体地，所述生物可选自动物（包括人）、植物、细菌、古细菌、酵母和真菌。

在一种实施方式中，生物催化剂源自动物，尤其源自其部分，例如肝、胰、脑、肾、心或其他器官。动物可尤其选自哺乳动物的组，更尤其选自Leporidae、Muridae、Suidae和Bovidae的组。

合适的植物尤其包括选自下组的植物：Asplenium；Cucurbitaceae，尤其是Curcurbita，例如Curcurbita moschata（南瓜）或Cucumis；Mercurialis，例如Mercurialis perennis；Hydnocarpus；和Ceratonia。

合适的细菌可尤其选自下组：Vibrio、Pseudomonas、Bacillus、Corynebacterium、Brevibacterium、Enterococcus、Streptococcus、Klebsiella、Lactococcus、Lactobacillus、Clostridium、Escherichia、Thermus、Mycobacterium、Zymomonas、Proteus、Agrobacterium、Geobacillus、Acinetobacter、Ralstonia、Rhodobacter、Paracoccus、Novosphingobium、Nitrosomonas、Legionella、Neisseria、Rhodopseudomonas、Staphylococcus、Thermotoga、Deinococcus和Salmonella。

合适的古细菌可尤其选自下组：Archaeoglobus、Aeropyrum、Halobacterium、Methanosarcina、Methanococcus、Thermoplasma、Pyrobaculum、Methanocaldococcus、Methanobacterium、Methanosphaera、Methanopyrus和Methanobrevibacter。

合适的真菌可尤其选自Rhizopus、Neurospora、Penicillium和Aspergillus的组。

合适的酵母可尤其选自Candida、Hansenula、Kluyveromyces和Saccharomyces的组。

本领域技术人员应当明白，在根据本发明的方法中可以利用具有合适活性的天然存在的生物催化剂（野生型）或天然存在的生物催化剂的突变体。可以通过本领域技术人员已知的生物学技术，例如分子进化或合理设计改进天然存在的生物催化剂的特性。可例如通过使用本领域技术人员已知的诱变技术（随机诱变、定点诱变、定向进化、基因重组等）修饰下述生物的编码DNA来制造野生型生物催化剂的突变体，所述生物能够发挥生物催化剂的作用或者能够生产生物催化剂部分（如酶）。具体地，可以修饰DNA，使其编码与野生型酶差异至少一个氨基酸的酶，使其编码与野生型相比包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的酶，或者使得突变体组合两个或更多亲本酶的序列，或者影响合适的（宿主）细胞中藉此被修饰的DNA的表达。后者可以通过本领域技术人员已知的方法如密码子优化或密码子对优化来实现，例如基于WO2008/000632中所述方法。

突变体生物催化剂可具有经改进的特性，例如关于一个或多个以下方面：底物选择性、活性、稳定性、溶剂耐受性、pH谱、温度谱、底物谱、对抑制的敏感性、辅因子利用和底物亲和力。可以通过应用例如合适的高通量筛选或选择方法，基于本领域技术人员已知的这类选择方法，来鉴定具有改进的特性的突变体。

提到来自具体来源的生物催化剂（尤其是酶）时，来自第一生物但是实际上在（经遗传修饰的）第二生物中生产的重组生物催化剂（尤其是酶）也旨在包括在来自所述第一生物的生物催化剂（尤其是酶）内。

AAP可以以任何方式获得。在特定实施方式中，通过化学转化AKP获得AAP。另外，如针对类似化合物所描述的，可通过催化的Leuckart-Wallach反应由2-氧庚二酸制备AAP。该反应用在甲醇中的甲酸铵和[RhCp*Cl₂]₂作为均相催化剂来进行（M.Kitamura,D.Lee,S.Hayashi,S.Tanaka,M.Yoshimura J.Org.Chem.2002,67,8685-8687）。或者，如S.Ogo,K.Uehara and S.Fukuzumi in J.Am.Chem.Soc.2004,126,3020-3021所描述的，使用[Ir^IIICp*(bpy)H₂O]SO₄作为催化剂用水性甲酸铵来进行Leuckart-Wallach反应。通过与（手性）苄胺反应并随后在Pd/C或Pd(OH)₂/C上对中间产物亚胺进行氢化，α-酮酸转化为（对映异构富集的）氨基酸也是可能的。

在本发明的一个优选的方法中，6-ACA的制备包括在存在能够在存在氨基供体时催化转氨化反应的酶时的酶促反应，所述酶选自氨基转移酶（E.C.2.6.1）的组。

在一种特定的实施方式中，通过将AKP生物催化转化为AAP，来获得AAP，所述转化由氨基转移酶(E.C.2.6.1)、氨基酸脱氢酶、或能催化AKP向AAP转化的另一生物催化剂催化。通常，此类生物催化剂具有α-氨基庚二酸酯2-氨基转移酶活性或α-氨基庚二酸酯2-氨基脱氢酶活性。

氨基转移酶可尤其选自以下组：β-氨基异丁酸酯：α-酮戊二酸酯氨基转移酶、β-丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、4-氨基-丁酸酯氨基转移酶（EC2.6.1.19）、L-赖氨酸6-氨基转移酶（EC2.6.1.36）、2-氨基己二酸酯氨基转移酶（EC2.6.1.39）、5-氨基戊酸酯氨基转移酶（EC2.6.1.48）、2-氨基己酸酯氨基转移酶（EC2.6.1.67）和赖氨酸:丙酮酸酯6-氨基转移酶（EC2.6.1.71）。在一种实施方式中，氨基转移酶可选自下组：丙氨酸氨基转移酶（EC2.6.1.2）、亮氨酸氨基转移酶（EC2.6.1.6）、丙氨酸-氧代-酸氨基转移酶（EC2.6.1.12）、β-丙氨酸-丙酮酸酯氨基转移酶（EC2.6.1.18）、(S)-3-氨基-2-甲基丙酸酯氨基转移酶（EC2.6.1.22）、L,L-二氨基庚二酸酯氨基转移酶（EC2.6.1.83）。

氨基转移酶可尤其选自来自以下的的氨基转移酶：哺乳动物；Mercurialis，尤其是Mercurialis perennis，更尤其是Mercurialis perennis的嫩芽（shoots）；Asplenium，更尤其是Asplenium、unilaterale或Asplenium septentrionale；Ceratonia，更尤其是Ceratonia siliqua；Rhodobacter，尤其是Rhodobacter sphaeroides，Staphylococcus，尤其是Staphylococcus aureus；Vibrio，尤其是Vibrio fluvialis；Pseudomonas，尤其是Pseudomonas aeruginosa；Rhodopseusomonas；Bacillus，尤其是Bacillus weihenstephanensis和Bacillus subtilis；Legionella；Nitrosomas；Neisseria；或酵母，尤其是Saccharomyces cerevisiae。

当酶是哺乳动物的酶时，其尤其可源自哺乳动物肾，来自哺乳动物肝，来自哺乳动物心或来自哺乳动物脑。例如，合适的酶可选自下组：来自哺乳动物肾的β-氨基异丁酸酯:α-酮戊二酸酯氨基转移酶，尤其是来自猪肾的β-氨基异丁酸酯:α-酮戊二酸酯氨基转移酶；来自哺乳动物肝的β-丙氨酸氨基转移酶，尤其是来自兔肝的β-丙氨酸氨基转移酶；来自哺乳动物心的天冬氨酸氨基转移酶；尤其是来自猪心的天冬氨酸氨基转移酶；来自哺乳动物肝的4-氨基-丁酸酯氨基转移酶，尤其是来自猪肝的4-氨基-丁酸酯氨基转移酶；来自哺乳动物脑的4-氨基-丁酸酯氨基转移酶，尤其是来自人、猪或大鼠脑的4-氨基丁酸酯氨基转移酶。

在一种实施方式中，来自真菌、尤其来自Neurospora的α-酮己二酸酯-谷氨酸酯氨基转移酶，更尤其是来自Neurospora crassa的α-酮己二酸酯:谷氨酸酯氨基转移酶。

在一种实施方式中，氨基转移酶选自下述组：来自E.coli的4-氨基-丁酸酯氨基转移酶、来自Thermus的α-氨基己二酸酯氨基转移酶，尤其是来自Thermus thermophilus的α-氨基己二酸酯氨基转移酶，和来自Clostridium、尤其是来自Clostridium aminovalericum的5-氨基戊酸酯氨基转移酶。

一种合适的2-氨基己二酸酯氨基转移酶可例如由Pyrobaculumislandicum提供。

氨基供体尤其可选自氨、铵离子、胺和氨基酸的组。合适的胺是伯胺和仲胺。氨基酸可具有D-构型或L-构型。氨基供体的例子是丙氨酸、谷氨酸、异丙胺、2-氨基丁烷、2-氨基庚烷、苯甲胺、1-苯基-1-氨基乙烷、谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、β-氨基异丁酸酯、β-丙氨酸、4-氨基丁酸酯和α-氨基己二酸酯。

在又一个优选的实施方案中，制备6-ACA的方法包含在存在下述酶时的生物催化反应，所述酶能够在存在氨来源时催化还原性氨基化反应，所述酶选自作用于供体CH-NH₂基团上的氧化还原酶（EC1.4）的组，尤其是选自氨基酸脱氢酶（E.C.1.4.1）的组。通常，合适的氨基酸脱氢酶具有催化5-FVA转化成为6-ACA的6-氨基己酸6-脱氢酶活性，或者具有催化AKP转化成为AAP的α-氨基庚二酸酯2-脱氢酶活性。合适的氨基酸脱氢酶尤其选自二氨基庚二酸酯脱氢酶(EC1.4.1.16）、赖氨酸6-脱氢酶(EC1.4.1.18）、谷氨酸脱氢酶（EC1.4.1.3；EC1.4.1.4）和亮氨酸脱氢酶(EC1.4.1.9)的组。

在一种实施方式中，氨基酸脱氢酶选自被归类为以下的氨基酸脱氢酶：以NAD或NADP作为受体发挥作用的谷氨酸脱氢酶（EC1.4.1.3）、以NADP作为受体发挥作用的谷氨酸脱氢酶（EC1.4.1.4）、亮氨酸脱氢酶（EC1.4.1.9）、二氨基庚二酸酯脱氢酶（EC1.4.1.16）和赖氨酸6-脱氢酶（EC1.4.1.18）。

氨基酸脱氢酶可尤其源自选自下组的生物：Corynebacterium，尤其是Corynebacterium glutamicum；Proteus，尤其是Proteus vulgaris；Agrobacterium，尤其是Agrobacterium tumefaciens；Geobacillus，尤其是Geobacillus stearothermophilus；Acinetobacter，尤其是Acinetobacter sp.ADP1；Ralstonia，尤其是Ralstonia solanacearum；Salmonella，尤其是Salmonella typhimurium；Saccharomyces，尤其是Saccharomycescerevisiae；Brevibacterium，尤其是Brevibacterium flavum；和Bacillus，尤其是Bacillus sphaericus、Bacillus cereus或Bacillus subtilis。例如，合适的氨基酸脱氢酶可选自来自Bacillus，尤其是Bacillus sphaericus的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Brevibacterium sp.的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Corynebacterium的二氨基庚二酸酯脱氢酶，尤其是来自Corynebacteriumglutamicum的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Proteus的二氨基庚二酸酯脱氢酶，尤其是来自Proteus vulgaris的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Agrobacterium、尤其是Agrobacterium tumefaciens的赖氨酸6-脱氢酶，来自Geobacillus、尤其是来自Geobacillus stearothermophilus的赖氨酸6-脱氢酶；来自Acinetobacter的以NADH或NADPH作为辅因子发挥作用的谷氨酸酯脱氢酶（EC1.4.1.3），尤其是来自Acinetobacter sp.ADP1的谷氨酸酯脱氢酶；来自Ralstonia的谷氨酸酯脱氢酶（EC1.4.1.3），尤其是来自Ralstonia solanacearum的谷氨酸酯脱氢酶；来自Salmonella的以NADPH作为辅因子发挥作用的谷氨酸酯脱氢酶，尤其是来自Salmonellatyphimurium的谷氨酸酯脱氢酶；来自Saccharomyces的谷氨酸酯脱氢酶（EC1.4.1.4），尤其是来自Saccharomyces cerevisiae的谷氨酸酯脱氢酶；来自Brevibacterium的谷氨酸酯脱氢酶(EC1.4.1.4)，尤其是来自Brevibacterium flavum的谷氨酸酯脱氢酶；和来自Bacillus的亮氨酸脱氢酶，尤其是来自Bacillus cereus或Bacillus subtilis的亮氨酸脱氢酶。

在一种特定的实施方式中，用于AKP向AAP转化的氨基转移酶选自下述组：来自猪心的天冬氨酸氨基转移酶；来自Neurospora crassa或酵母的α-酮己二酸酯:谷氨酸酯氨基转移酶；来自Mercurialis perennis的嫩芽的氨基转移酶；来自E.coli的4-氨基丁酸酯氨基转移酶；来自Thermusthermophilus的α-氨基己二酸酯氨基转移酶；来自Asplenium septentrionale或Asplenium unilaterale的氨基转移酶；和来自Ceratonia siliqua的氨基转移酶。

在一种特定的实施方式中，用于AKP向AAP转化的氨基转移酶选自下述组：来自Vibrio,Pseudomonas、Bacillus、Legionella、Nitrosomonas、Neisseria、Rhodobacter、Escherichia和Rhodopseudomonas的氨基转移酶。

已发现尤其来自从下述组中选择的生物的氨基转移酶适于催化AKP向AAP转化：Bacillus subtilis、Rhodobacter sphaeroides、Legionellapneumophila、Nitrosomonas europaea、Neisseria gonorrhoeae、Pseudomonassyringae、Rhodopseudomonas palustris、Vibrio fluvialis、Escherichia coli和Pseudomonas aeruginosa。

在一种特别优选的实施方式中，就AKP向AAP转化而言，使用了下述氨基转移酶，所述氨基转移酶包含根据Sequence ID NO15、SequenceID NO18、Sequence ID NO21、Sequence ID NO23、Sequence ID NO26、Sequence ID NO28、Sequence ID NO30、Sequence ID NO32、Sequence IDNO34、Sequence ID NO36、Sequence ID NO38、Sequence ID NO40Sequence ID NO42、Sequence ID NO44、Sequence ID NO46的氨基酸或这些序列之任一的同源物。

在其他实施方式中，用于由AKP制备AAP的方法包括在存在下述酶时的生物催化反应，所述酶能够在存在氨来源时催化还原性氨基化反应，所述酶选自作用于供体CH-NH₂基团上的氧化还原酶（EC1.4）的组，尤其是选自氨基酸脱氢酶（E.C.1.4.1）的组。通常，合适的氨基酸脱氢酶具有催化AKP转化为AAP的α-氨基庚二酸酯2-脱氢酶活性。

合适的氨基酸脱氢酶尤其选自下述组：二氨基庚二酸酯脱氢酶(EC1.4.1.16)、谷氨酸酯脱氢酶(EC1.4.1.3;EC1.4.1.4)和亮氨酸脱氢酶(EC1.4.1.9)。

在一种实施方式中，氨基酸脱氢酶选自归类为下述类别的氨基酸脱氢酶：以NAD或NADP作为受体起作用的谷氨酸酯脱氢酶(EC1.4.1.3)、以NADP作为受体起作用的谷氨酸酯脱氢酶(EC1.4.1.4)、亮氨酸脱氢酶(EC1.4.1.9)和二氨基庚二酸酯脱氢酶(EC1.4.1.16)。

氨基酸脱氢酶可尤其源自从下述组中选择的生物：Corynebacterium，尤其是Corynebacterium glutamicum;Proteus，尤其是Proteus vulgaris；Agrobacterium，尤其是Agrobacterium tumefaciens；Geobacillus，尤其是Geobacillus stearothermophilus；Acinetobacter，尤其是Acinetobacter sp.ADP1；Ralstonia，尤其是Ralstonia solanacearum；Salmonella，尤其是Salmonella typhimurium；Saccharomyces，尤其是Saccharomycescerevisiae；Brevibacterium，尤其是Brevibacterium flavum；和Bacillus，尤其是Bacillus sphaericus、Bacillus cereus或Bacillus subtilis。

例如，合适的氨基酸脱氢酶可选自：来自Bacillus，尤其是来自Bacillus sphaericus的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Brevibacterium sp.的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Corynebacterium的二氨基庚二酸酯脱氢酶，尤其是来自Corynebacterium glutamicum的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Proteus的二氨基庚二酸酯脱氢酶，尤其是来自Proteus vulgaris的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Acinetobacter的以NADH或NADPH作为辅因子起作用的谷氨酸酯脱氢酶(EC1.4.1.3)，尤其是来自Acinetobacter sp.ADP1的谷氨酸酯脱氢酶；来自Ralstonia的谷氨酸酯脱氢酶(EC1.4.1.3)，尤其是来自Ralstonia solanacearum的谷氨酸酯脱氢酶；来自Salmonella的以NADPH作为辅因子(EC1.4.1.4)起作用的谷氨酸酯脱氢酶，尤其是来自Salmonella typhimurium的谷氨酸酯脱氢酶；来自Saccharomyces的谷氨酸酯脱氢酶(EC1.4.1.4)，尤其是来自Saccharomyces cerevisiae的谷氨酸酯脱氢酶；来自Brevibacterium的谷氨酸酯脱氢酶(EC1.4.1.4)，尤其是来自Brevibacterium flavum的谷氨酸酯脱氢酶；和来自Bacillus的亮氨酸脱氢酶，尤其是来自Bacillus cereus或Bacillus subtilis的亮氨酸脱氢酶。

另一合适的氨基酸脱氢酶可选自下述组：来自Agrobacteriumtumefaciens或Geobacillus stearothermophilus的赖氨酸6-脱氢酶；或选自下述组：来自Bacillus cereus或Bacillus subtilis的亮氨酸脱氢酶。

用于制备6-AAP的AKP原则上可以通过任何方式获得。例如，AKP可基于H.

et al.Chem.Ber.1959,92,2492-2499所述方法获得。可以如下制备AKP：使用乙醇酸钠作为碱，用二乙基草酸酯烷基化环戊酮，将得到的产物在强酸（2M HCl）中回流并例如通过从甲苯中结晶来回收产物。

还可能从天然来源，例如从产甲烷的Archaea，从Aspleniumseptentrionale，或从Hydnocarpus anthelminthica获得AKP。可例如从这种生物或其部分中，例如从Hydnocarpus anthelminthica种子中提取AKP。合适的提取方法可例如基于A.I.Virtanen and A.M.Berg in Acta ChemicaScandinavica1954,6,1085-1086中所述方法，其中描述了使用70%乙醇从Asplenium中提取氨基酸和AKP。

在一种特定的实施方式中，在下述方法中制备AKP，所述方法包括将α-酮戊二酸（AKG）转化成α-酮己二酸（AKA），并将α-酮己二酸转化成α-酮庚二酸。该反应可以由生物催化剂催化。AKG可例如以本领域本身已知的方式，从碳源例如碳水化合物生物催化地制备。

用于从AKG制备AKP的合适的生物催化剂可尤其选自催化下述反应的生物催化剂：α-酮戊二酸成为α-酮己二酸的C₁-延长和/或α-酮己二酸成为α-酮庚二酸的C₁-延长。

在一种特定的实施方式中，AKP的制备由包含以下的生物催化剂催化：

a.AksA酶或其同源物；

b.至少一种选自AksD酶、AksE酶、AksD酶同源物和AksE酶同源物的组的酶；和

c.AksF酶或其同源物。

优选地，催化剂包含选自AksD酶和其同源物的组的酶以及选自AksE酶和其同源物的组的酶二者。所述AksD酶或其同源物和所述AksE酶典型地形成异二聚体。

一种或多种AksA、AksD、AksE、AksF酶或其同源物可存在于下述生物中，所述生物选自产甲烷古细菌的组，优选地选自Methanococcus、Methanocaldococcus、Methanosarcina、Methanothermobacter、Methanosphaera、Methanopyrus和Methanobrevibacter的组。

在一种特定的实施方式中，催化由α-酮戊二酸（AKG）制备AKP的生物催化剂包含催化α-酮戊二酸转化成α-酮己二酸的酶体系，其中所述酶体系形成赖氨酸生物合成的α-氨基己二酸酯通路的部分。术语“酶体系”在本文中尤其用于能够催化特定转化的单个酶或一组酶。

从AKG制备AKP可包括具有已知或未知中间产物的一个或多个化学反应，例如AKG成为AKA的转化或AKA成为AKP的转化。这类体系可存在于细胞中，或从细胞中分离。酶体系可尤其来自下述生物，所述生物选自酵母、真菌、古细菌和细菌的组，尤其来自Penicillium、Cephalosporium、Paelicomyces、Trichophytum、Aspergillus、Phanerochaete、Emericella、Ustilago、Schizosaccharomyces、Saccharomyces、Candida、Yarrowia、Pichia、Kluyveromyces、Thermus、Deinococcus、Pyrococcus、Sulfolobus、Thermococcus、Methanococcus、Methanocaldococcus、Methanosphaera、Methanopyrus、Methanobrevibacter、Methanosarcina和Methanothermobacter的组。

在一种特定的实施方式中，催化从α-酮戊二酸制备AKP的生物催化剂包含催化α-酮戊二酸转化成α-酮己二酸的酶体系，其中所述酶体系的至少一种酶源自固氮细菌，所述固氮细菌选自蓝细菌、根瘤菌、γ-变形菌（proteobacteria）和放线菌（actinobacteria）的组，尤其选自Anabaena、Microcystis、Synechocystis、Rhizobium、Bradyrhizobium、Pseudomonas、Azotobacter、Klebsiella和Frankia的组。

这些Aks酶的同源物和编码这些酶的基因的例子在下文的表1A和1B中给出。

表1A

基因和蛋白质的参考资料可通过www.ncbi.nlm.nih.gov/找到（列出的标有﹡的基因/蛋白：2010年3月2日可获得的，对于其他的基因/蛋白：2008年4月15日可获得的）。

基因和蛋白质的参考资料可通过www.ncbi.nlm.nih.gov/找到（列出的标有﹡的基因/蛋白：如2010年3月2日可获得的，对于其他的基因/蛋白：如2008年4月15日可获得的）。

如果需要的话，在根据本发明的方法中获得的6-ACA可与生物催化剂分离。合适的分离方法可基于本领域中公知的方法。

如果需要的话，根据本发明方法获得的6-ACA可以被环化形成己内酰胺，例如如US-A6,194,572中所述。

本发明上下文中任何生物催化步骤的反应条件可根据生物催化剂（尤其是酶）的已知条件、本文公开的信息和任选地一些常规实验来选择。

原则上，使用的反应培养基的pH可以在宽泛的界限内选择，只要制药生物催化剂在所述pH条件下有活性即可。可以使用碱性、中性或酸性条件，取决于生物催化剂和其他因素。当所述方法包括使用微生物（例如用于表达催化本发明方法的酶）时，选择pH使得所述微生物能够发挥其预期的一种或多种功能。在25°C下基本水性体系的情况下，尤其可在低于中性pH四个pH单位和高于中性pH两个pH单位的范围内选择pH，即在pH3和pH9之间选择。如果水是唯一的溶剂或主要的溶剂（以总液体为基础>50wt.%，尤其是>90wt.%），则系统被认为是水性的，其中例如小量（以总液体为基础<50wt.%，尤其是<10wt.%）的醇或另一种溶剂可以下述浓度溶解（例如作为碳源），所述浓度使得可以存在的微生物保持活性。尤其是在使用酵母和/或真菌的情况下，可优选酸性条件，尤其是25℃下基于基本水性体系的pH可以在pH3到pH8的范围内。需要时可以使用酸和/或碱调节或者用合适的酸和碱的组合缓冲pH。

原则上，孵育条件可以在在广阔的界限内选择，只要生物催化剂显示足够的活性和/或生长即可。这包括需氧、微需氧、限氧和厌氧的条件。

厌氧条件在本文中被定义为下述条件：无任何氧，或其中生物催化剂（尤其是微生物）基本不消耗氧并且通常对应于少于5mmol/l.h的氧消耗，尤其是小于2.5mmol/l.h的氧消耗，或小于1mmol/l.h的氧消耗。

需氧条件是下述条件，其中对不受限制的生长而言足够水平的氧溶于培养基中，能够支持至少10mmol/l.h、更优选地多于20mmol/l.h、进一步更优选地多于50mmol/l.h、最优选地多于100mmol/l.h的氧消耗速率。

限氧条件被定义为下述条件：其中氧消耗由从气体转移至液体的氧限制。限氧条件的下限由厌氧条件的上限决定，即至少1mmol/l.h，尤其是至少2.5mmol/l.h，或至少5mmol/l.h。限氧条件的上限由需氧条件的下限决定，即少于100mmol/l.h、少于50mmol/l.h、少于20mmol/l.h或少于10mmol/l.h。

反应条件是需氧、厌氧还是限氧取决于所述方法进行的条件，尤其是进入气流的量和组成、使用的设备的实际混合/质量转移特性、使用的微生物的类型和微生物密度。

原则上，使用的温度不是关键性的，只要生物催化剂（尤其是酶）显示大量活性即可。通常，温度可以是至少0℃，尤其是至少15℃，更尤其是至少20℃。想要的最大温度取决于生物催化剂。通常这类最大温度是本领域已知的，例如在可商业获得的生物催化剂的情况下在产品数据表中指出，或者可以基于公知常识和本文公开的信息常规地测定。温度通常是90℃或更少，优选地是70℃或更少，尤其是50℃或更少，更尤其是40℃或更少。

具体地，如果生物催化反应在宿主生物外进行，则可以高浓度（例如大于50%，或大于90wt.%）使用包含有机溶剂的反应培养基，使得使用的酶在这样的培养基中保持足够的活性。

在一种有利的方法中，利用6-ACA的底物或用于形成6-ACA的中间产物（比如AKP或AAP）的全细胞生物转化制备6-ACA，所述方法包括使用下述微生物，其中生产一种或多种催化所述生物转化的生物催化剂（通常是一种或多种酶），如选自下组的一种或多种生物催化剂：能够催化AKP转化成为AAP的生物催化剂和能够催化AAP转化成为6-ACA的生物催化剂。在一种优选的实施方案中，所述微生物能够生产脱羧酶和/或至少一种选自氨基酸脱氢酶和氨基转移酶的酶（能够催化上述反应步骤）和所述微生物的碳源。

碳源可尤其含有至少一种选自下组的化合物：一元醇、多元醇、羧酸、一氧化碳、脂肪酸、甘油酯，包括任何所述化合物的混合物。合适的一元醇包括甲醇和乙醇。合适的多元醇包括甘油和碳水化合物。合适的脂肪酸或甘油三酯可尤其以食用油的形式提供，优选地为植物来源。

尤其可以使用碳水化合物，因为通常碳水化合物可从生物可更新来源如农产品（优选地农业废料）中大量获得。优选地，使用选自下组的碳水化合物：葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、蔗二糖、淀粉、纤维素和半纤维素。尤其优选的是葡萄糖、包含葡萄糖的寡糖和包含葡萄糖的多糖。

可以使用本领域本身已知的分子生物学技术，构建包含用于在本发明方法中催化反应步骤的一种或多种生物催化剂（通常是一通或多种酶）的细胞，尤其是重组细胞。例如，如果要在重组细胞（其可以是异源体系）中生产一种或多种生物催化剂，则这类技术可以被用于提供下述载体（如重组载体），所述载体包含一个或多个编码一种或多种所述生物催化剂的基因。可以使用一个或多个载体，每个载体包含一个或多个这类基因。这类载体可包含一个或多个调节元件，例如一个或多个启动子，所述启动子可与编码生物催化剂的基因可操作地连接。

在本文中使用时，术语“可操作地连接”是指功能性相互关系中多核苷酸元件（或编码序列或核酸序列）的一种连接。当核酸序列被置于与另一核酸序列的功能性相互关系之中时，所述核酸序列是“可操作地连接”的。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则所述启动子或增强子与所述编码序列可操作地连接。

在本文中使用时，术语“启动子”是指一种核酸片段，其功能是控制一个或多个基因的转录，根据转录的方向位于基因的转录起点上游，并且结构上由DNA-依赖性RNA聚合酶、转录起点和任何其它DNA序列的存在识别，所述任何其它DNA序列包括但不限于转录因子结合位点、阻抑因子和激活因子蛋白结合位点和本领域技术人员已知的直接或间接地作用以调节来自启动子的转录量的任何其它核苷酸序列。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。当用于指出给定的（重组的）核酸或多肽分子与给定的宿主生物或宿主细胞之间的相互关系时，术语“同源的”应当被理解为表示该核酸或多肽分子天然地由相同物种（优选地相同变种或菌株）的宿主细胞或生物生产。

可用于实现编码本发明方法中使用的酶、尤其是氨基转移酶、氨基酸脱氢酶或脱羧酶（如上文所述）的核酸序列表达的启动子对编码要表达的酶的核酸序列而言可以是天然的，或者可以对与之可操作地连接的核酸序列（编码序列）而言是异源的。优选地，启动子对宿主细胞而言是同源的，即内源的。

如果使用（对编码感兴趣的酶的核酸序列而言）异源启动子，则所述异源启动子优选地能够生产比编码序列的天然启动子更高稳态水平的包含所述编码序列的转录本（或者单位时间能够生产更多转录本分子，即mRNA分子）。本发明上下文中合适的启动子包括本领域技术人员公知的组成型和诱导型启动子以及经改造的启动子。

“强组成型启动子”是与天然宿主细胞相比引起mRNA以高频率起始的启动子。革兰氏阳性微生物中这类强组成型启动子的例子包括SP01-26、SP01-15、veg、pyc（丙酮酸羧化酶启动子）和amyE。

革兰氏阳性微生物中诱导型启动子的例子包括IPTG诱导型Pspac启动子，木糖诱导型PxylA启动子。

革兰氏阴性微生物中组成型和诱导型启动子的例子包括，但不限于tac、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara(P_BAD）、SP6、λ-P_R和λ-P_L。

用于（丝状）真菌细胞的启动子是本领域已知的，并且可以是例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶gpdA启动子，蛋白酶启动子如pepA、pepB、pepC，葡糖淀粉酶glaA启动子，淀粉酶amyA、amyB启动子，过氧化氢酶catR或catA启动子，葡萄糖氧化酶goxC启动子，β-半乳糖苷酶lacA启动子，α-葡萄糖苷酶aglA启动子，翻译延伸因子tefA启动子，木聚糖酶启动子如xlnA、xlnB、xlnC、xlnD，纤维素酶启动子如eglA、eglB、cbhA，转录调节子的启动子如areA、creA、xlnR、pacC、prtT或另一启动子，并且尤其可以在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)上找到。

在关于核酸（DNA或RNA）或蛋白质的方面，使用术语“异源的”表示下述核酸或蛋白质，其不作为其存在的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的部分天然存在，或其存在于与其天然存在的细胞或位置基因组或DNA或RNA序列中的位点不同的地方。异源核酸或蛋白质对其被引入的细胞而言不是内源的，但是得自另一细胞或被合成或重组地生产。一般地（尽管并非必须），这类核酸编码下述细胞通常不生产的蛋白质，所述DNA在所述细胞中被转录或表达。类似地，外源RNA编码下述蛋白质，所述蛋白质在存在所述外源RNA的细胞中通常不表达。异源核酸和蛋白质也可以被称作外来核酸或蛋白质。在本文中术语异源核酸或蛋白质包括本领域技术人员会识别为对于下述细胞是异源或外源的任何核酸或蛋白质，所述核酸或蛋白质在所述细胞中被表达。

根据本发明的方法可在新颖的宿主生物中进行。宿主生物是指包含编码异源酶的基因的重组细胞。

因此，本发明还涉及下述重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含编码具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的异源酶的基因，其中所述酶包含由SEQUENCE ID NO’s:2、5、8和11之任一表示的氨基酸序列或所述序列的同源物。基因可形成一个或多个载体的一部分。

本发明还涉及包含编码下述酶的一个或多个基因的新颖载体，所述酶具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性并包含由SEQUENCE ID NO’s:2、5、8和11之任一表示的氨基酸序列或所述序列的同源物。

核酸序列可尤其是对宿主细胞而言异源（即，在不同的生物中天然发现）的野生型序列或密码子优化的序列。合适的序列包括SEQUENCE IDNO’s:1、3、4、6、7、9和10和其功能类似物之任一。优选的序列包括根据SEQUENCE ID NO’s:3、6和9之任一的序列或在Escherichia宿主细胞（特别是E.coli）或感兴趣的另一宿主细胞中具有类似、相同或更好的表达水平的所述序列的功能类似物。

在一种特定的实施方式中，根据本发明的宿主细胞是还包含下述核酸序列的宿主细胞，所述核酸序列编码能够催化转氨化反应或还原性氨基化反应以从α-酮庚二酸形成α-氨基庚二酸的生物催化剂。所述序列可以是载体的一部分，或者已被插入到染色体DNA中。

在一种优选的实施方式中，宿主细胞包含下述核酸序列，所述核酸序列编码能催化AKP向AAP转化的酶，所述核酸序列根据Sequence ID No.:14、16、20、22、24、25、27、29、31、33、3537、39或其功能类似物，所述核酸序列可以是野生型或非野生型序列。

在一种特定的实施方式中，宿主细胞包含一种或多种催化AKG形成AKP的酶（也见上文）。可以利用形成赖氨酸生物合成的α-氨基己二酸酯通路部分的酶体系。术语“酶体系”在本文中尤其用于能够催化特定转化的单个酶或一组酶。所述转化可包括具有已知或未知中间产物的一个或多个化学反应，例如AKG成为AKA的转化或AKA成为AKP的转化。这类体系可存在于细胞中，或从细胞中分离。已知氨基转移酶通常具有广泛的底物范围。存在时可期望降低宿主细胞中一种或多种这类酶的活性，使得AKA转化成为α-氨基己二酸酯（AAA）中的活性降低，同时保持其他氨基酸或细胞组分生物合成的相关催化功能。还优选下述宿主细胞，所述宿主细胞消灭了导致AKA转化成为不想要的副产物的任何其他酶活性。

在适用于利用全细胞生物转化工艺制备AAP的一个优选的宿主细胞中，编码了能够催化从α-酮戊二酸制备α-酮庚二酸中至少一个反应步骤的一种或多种生物催化剂。合适的生物催化剂例如在上文讨论AKP制备时被描述。

宿主细胞可例如选自细菌、酵母或真菌。具体地，宿主细胞可选自选自Aspergillus、Penicillium、Saccharomyces、Kluyveromyces、Pichia、Candida、Hansenula、Bacillus、Corynebacterium、Pseudomonas、Gluconobacter、Methanococcus、Methanobacterium、Methanocaldococcus和Methanosarcina和Escherichia组的属。本文中通常克隆和表达如上文所述的一种或多种编码核酸序列。

具体地，适用于合成6-ACA的宿主菌株和由此得到的宿主细胞可以选自Escherichia coli、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Corynebacterium glutamicum、Aspergillus niger、Penicillium chrysogenum、Saccharomyces cervisiae、Hansenula polymorpha、Candida albicans、Kluyveromyces lactis、Pichia stipitis、Pichia pastoris、MethanobacteriumthermoautothrophicumΔH、Methanococcus maripaludis、Methanococcusvoltae、Methanosarcina acetivorans、Methanosarcina barkeri和Methanosarcina mazei宿主细胞的组。在一个优选的实施方案中，宿主细胞能够生产赖氨酸（作为前体）。

宿主细胞原则上可以是天然存在的生物，或者可以是经改造的生物。这样的生物可以使用本领域已知的突变筛选或代谢改造策略来改造。在一种特定的实施方式中，宿主细胞天然地包含（或者能够生产）一个或多个能够催化本发明方法中反应步骤的酶，如一种或多种选自下组的活性：能够催化本发明方法中反应步骤的脱羧酶、氨基转移酶和氨基酸脱氢酶。例如，E.coli可天然地能够生产催化本发明方法中转氨化反应的酶。还可能提供下述重组宿主细胞，所述细胞既具有编码能够催化本发明方法中反应步骤的氨基转移酶或氨基酸脱氢酶的重组基因，并具有编码能够催化本发明方法中反应步骤的脱羧酶基因的重组基因。

例如，宿主细胞可选自Corynebacterium属，尤其是C.glutamicum，肠细菌，尤其是Escherichia coli，Bacillus，尤其是B.subtilis和B.methanolicus，和Saccharomyces，尤其是S.cerevisiae。尤其合适的是已针对赖氨酸的工业生产开发的C.glutamicum或B.methanolicus菌株。

对这样的方法而言，尤其可以使用如上文所述具有氨基转移酶活性或还原性氨基化活性的生物催化剂。

另外，本发明涉及编码可根据本发明使用的酶的新颖多核苷酸。因此，本发明还涉及包含根据SEQUENCE ID NO’s:3、6和9之任一的序列的多核苷酸或在Escherichia宿主细胞中具有类似、相同或更好表达水平的所述多核苷酸的功能类似物。就本发明人所知，这些多核苷酸不天然存在。特别地，在它们天然存在的范围内，任何这些多核苷酸尤其被要求从其天然存在的任何生物中分离。

接着，本发明将通过以下实施例阐述。

实施例

一般方法

分子和遗传技术

标准遗传和分子生物学技术是本领域普遍已知的，并且先前已被描述（Maniatis et al.1982“Molecular cloning:a laboratory manual”.Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.；Miller1972“Experiments inmolecular genetics”，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor；Sambrook and Russell2001"Molecular cloning:a laboratory manual”(3rdedition），Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress；F.Ausubel et al，eds.，"Current protocols in molecular biology"，Green Publishing and Wiley Interscience，New York1987)。

质粒和菌株

pBAD/Myc-His C得自Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。使用如WO2005/068643中所述构建的质粒pBAD/Myc-His-DEST进行蛋白质表达。在pBAD-系统中，E.coli TOP10(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)用于所有克隆步骤和靶基因的表达。E.coli BL21(DE3)和pET-26b(+)得自Novagen(EMD/Merck,Nottingham,UK)。

培养基

E.coli的生长使用2XTY培养基（16g/l胰蛋白胨、10g/l酵母提取物、5g/l NaCl）。补充抗生素（100μg/ml羧苄西林、50μg/ml新霉素）来维持质粒。为了在pBAD/Myc-HisC衍生的质粒中PBAD启动子的控制下诱导基因表达，添加L-阿拉伯糖至0.2%(w/v)的终浓度。为了在pET-26b(+)衍生的质粒中T7-启动子的控制下诱导基因表达，添加IPTG至1mM的终浓度。

质粒的鉴定

通过本领域普遍已知的遗传、生物化学和/或表型手段鉴定带有不同基因的质粒，如转化体对抗生素的抗性，转化体的PCR诊断性分析或质粒DNA的纯化，经纯化的质粒DNA的限制性分析或DNA序列分析。

用于测定6-ACA的HPLC-MS分析

校准：

通过6-ACA的外部校准曲线进行校准（m/z132→m/z114，Rt7.5分钟）。所有LC-MS实验在Agilent1100上进行，所述Agilent1100装有四元泵、除气器、自动取样机、柱温箱和单四极杆MS（Agilent，Waldbronn，德国）。LC-MS条件为：

柱：50*4Nucleosil(Mancherey-Nagel)+250x4.6Prevail C18(Alltech)，均在室温（RT）下

洗脱液：A=超纯水中0.1(v/v)的甲酸

B=乙腈(pa，Merck)

流速：1.0ml/分钟，进入MS之前1:3分流

梯度：梯度在t=0分钟时以100%(v/v)A开始，保持15分钟，并在15分钟内改变至80%(v/v)B（t=30分钟）。从30到31分钟时，将梯度保持恒定在80%(v/v)B。

注射体积：5μl

MS检测：ESI(+)-MS

电喷射电离(ESI)在正扫描模式下使用以下条件运行；m/z50-500，50V碎裂电压，0.1m/z步长，350°C干燥气体温度，10LN₂/分钟干燥气体，50psig雾化器压强和2.5kV毛细管电压。

靶基因的克隆

表达构建体的设计

就在pBAD-DEST质粒中通过同源重组克隆靶基因而言，对核糖体结合位点和起始密码子上游和终止密码子下游的所有基因添加attB位点，以便使用Gateway技术（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）进行克隆。

实施例1AKP向AAP转化

该实施例取自WO2009/113855的实施例，特别是描述细胞构建的部分，所述WO2009/113855通过引用并入本文。

制备pH7.0的在50mM磷酸钾缓冲液中包含10mMα-酮庚二酸、20mM L-丙氨酸和50μM5’-磷酸吡哆醛的反应混合物。将800μl的反应混合物在有孔平板的每一孔中分散。为开始反应，将200μl的细胞裂解物添加至每一孔。将反应混合物在摇床上于37℃下孵育24小时。另外，在相同条件下孵育化学空白混合物（不含无细胞提取物）和生物空白（带有pBAD/Myc-His C的E.coli TOP10）。通过HPLC-MS分析样品。结果概括于下表中。

表1：存在氨基转移酶时由AKP形成AAP

这表明，由AKP形成AAP是通过生物催化剂催化的。

实施例2由AAP生物催化制备6-ACA

基因合成和质粒构建

根据DNA2.0的标准程序，从DNA2.0获得合成的基因并为了在E.coli中表达进行密码子优化。分别对编码T.maritima二氨基庚二酸酯脱羧酶Q9X1K5[SEQ ID No.2]的氨基酸序列的来自Thermotoga maritima的二氨基庚二酸酯脱羧酶基因[SEQ ID No.1]、编码C.谷氨酸二氨基庚二酸酯脱羧酶P09890[SEQ ID No.5]的氨基酸序列的来自Corynebacteriumglutamicum的二氨基庚二酸酯脱羧酶基因[SEQ ID No.4]和编码B.subtilis二氨基庚二酸酯脱羧酶P23630[SEQ ID No.8]的氨基酸序列来自Bacillussubtilis的二氨基庚二酸酯脱羧酶基因[SEQ ID No.7]进行密码子优化，并通过DNA合成获得得到的序列[SEQ ID No.3]、[SEQ ID No.6]和[SEQ IDNo.9]。如制造商方案（www.invitrogen.com）中所述，通过引入attB位点和pDONR201(Invitrogen)作为进入载体，使用Gateway技术(Invitrogen)，将基因构建体克隆进pBAD/Myc-His-DEST表达载体中。如制造商方案（www.invitrogen.com）中所述，通过引入attB位点和pDONR201(Invitrogen)作为进入载体，使用Gateway技术(Invitrogen)，将基因构建体克隆进pBAD/Myc-His-DEST表达载体中。藉此分别获得了表达载体pBAD-Tma_AAP-DC、pBAD-Cgl_AAP-DC和pBAD-Bsu_AAP-DC。分别用pBAD-表达载体转化化学感受态E.coli TOP10(Invitrogen)，获得相应的表达菌株。

通过PCR克隆

通过PCR，从P.putida DSM50026的基因组DNA中扩增来自Pseudomonas putida DSM50026的、编码P.putida二氨基庚二酸酯脱羧酶[SEQ ID No.11]的二氨基庚二酸酯脱羧酶基因[SEQ ID No.10]。遵循从革兰氏阴性菌中分离染色体DNA的QIAGEN Genomic DNA Handbook(QIAGEN,Hilden,德国)的一般方案，分离P.putida DSM50026的基因组DNA。根据制造商的方案，通过使用QIAGEN Genomic-tip500/G柱(QIAGEN,Hilden,德国)，纯化粗制制备物。根据制造商的说明书，使用PCR Supermix High Fidelity(Invitrogen)，其使用下述寡核苷酸：

正向引物[SEQ ID No.12]:

5’–gccatatgaa cgctttcaac taccgcga–3’

反向引物[SEQ ID No.13]:

5’–gcaagcttac tccggcagca ggctttcgc–3’

通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应，使用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）从凝胶中洗脱具有正确大小的PCR产物并用NdeI和HindIII消化。根据制造商的说明书，对消化的PCR产物进行凝胶纯化，并使用T4DNA连接酶(Invitrogen)，将PCR产物连接进已用NdeI和HindIII打开的pET26b(+)中。藉此获得表达载体pET26-DC-Pp1/8。通过DNA测序验证了基因序列。通过用pET26-DC-Pp1/8转化化学感受态的E.coli BL21(DE3)来获得相应的表达菌株。

用于蛋白质表达的E.coli的培养和无细胞提取物制备

接种含有50μg/ml抗生素的5ml2XTY预培养物并在轨道摇床上28°C下以180rpm过夜培养。在含有50–100ml2*TY和50μg/ml抗生素的Erlenmeyer瓶中接种来自这些预培养物的表达培养物，至起始细胞密度为OD₆₂₀=0.05。在轨道摇床上在28°C下以180rpm孵育这些培养物。在指数生长期中间（约0.6的OD₆₂₀），通过将0.02%(w/v)L-阿拉伯糖或1mM IPTG添加至培养瓶，诱导靶基因表达。诱导之后，在轨道摇床上在28°C下以180rpm继续过夜培养（约20h）。随后，通过在4°C下以5,000x g离心10min来收获细胞。丢弃上清液并将细胞再悬浮，称重。将细胞球团再悬浮在含有0.1mM PLP的湿重的两倍体积的冰冷50mM pH7.5KP_i缓冲液中。通过使用带有冰/丙酮浴冷却的Sonics(Meyrin/Satigny,瑞士)Vibra-Cell VCX130超声破碎器（输出100%,10s开/10s关,10min）对细胞悬浮液超声破碎，并在Eppendorf(Hamburg,德国)5415R离心机中以13,000x g在4°C下离心30min来获得无细胞提取物（CFEs）。将上清液（=CFEs）转移至新管并存储在冰上用于立即使用，或存储在-20°C下。

由AAP生物催化生产6-ACA

在0.25ml总体积中，在含有0.1mM PLP的0.1M磷酸钾缓冲液pH7.5的存在下，将包含分别来自T.maritima[SEQ ID No.2]、C.glutamicum[SEQ ID No.5]、B.subtilis[SEQ ID No.8]和P.putida[SEQ ID No.11]的过表达的二氨基庚二酸酯脱羧酶的0.1ml CFEs在28°C下用50mMα-氨基庚二酸(AAP)孵育并以560rpm摇动。20h和40h孵育时间后，通过添加0.75ml的1:1的乙腈/水混合物停止反应并离心（以5000x g，20min）。作为阴性对照，像包含过表达的二氨基庚二酸酯脱羧酶的CFEs一样，仅将缓冲液或包含来自B.subtilis的过表达的葡萄糖脱氢酶(GDH)的CFE进行孵育。如通常方法中所述的，通过HPLC-MS分析反应。结果在表2中给出。

表2：通过重组体二氨基庚二酸酯脱羧酶将AAP脱羧成为6-ACA

结果显示，来自T.maritima[SEQ ID No.2]、C.glutamicum[SEQ IDNo.5]、B.subtilis[SEQ ID No.8]和P.putida[SEQ ID No.11]的二氨基庚二酸酯脱羧酶能将AAP脱羧成为6-ACA，并因而也是合适的AAP脱羧酶。考虑到α-氨基庚二酸和二氨基庚二酸之间的相当大的结构差异，这是令人吃惊的。

并行地，在50mMα-氨基己二酸酯和α-氨基戊二酸酯(谷氨酸酯)的存在下，通过如上所述的孵育各自的CFE，研究来自T.maritima[SEQ ID No.2]、C.glutamicum[SEQ ID No.5]、B.subtilis[SEQ ID No.8]和P.putida[SEQ ID No.11]的AAP脱羧酶的底物特异性。使用了参照化合物α-氨基己二酸酯、5-氨基缬草酸、α-氨基戊二酸酯和4-氨基丁酸(Syncom,Groningen,荷兰)应用了如上所述的相同分析方法。作为阴性对照，像包含过表达的二氨基庚二酸酯脱羧酶一样，仅孵育缓冲液和包含来自B.subtilis的过表达的葡萄糖脱氢酶。在反应混合物中，检测不到α-氨基己二酸酯脱羧成为5-氨基缬草酸或α-氨基戊二酸酯脱羧成为4-氨基丁酸。这显示，与AAP的较短的类似物α-氨基己二酸酯和α-氨基戊二酸酯相比较，来自T.maritima、C.glutamicum、B.subtilis和P.putida的AAP脱羧酶对AAP脱羧成为6-ACA是高度选择性的生物催化剂。

实施例3：AAP化学转化为己内酰胺

向在21ml环己酮中的1.5克AAP的悬浮液中添加0.5ml环己烯酮。将混合物在油浴上回流加热20小时（约160°C）。冷却至室温后，倾析反应混合物，并在减压下蒸发澄清的溶液。通过¹H-NMR和HPLC分析剩余的2克褐色油，并且含有0.8wt%己内酰胺和6wt%己内酰胺的环状寡聚体。

实施例4：使用二氨基庚二酸酯脱羧酶体内生产6-ACA

在E.coli中的蛋白表达和代谢物生产

将分别编码T.maritima二氨基庚二酸酯脱羧酶[SEQ ID No.1]、C.glutamicum二氨基庚二酸酯脱羧酶[SEQ ID No.4]和B.subtilis二氨基庚二酸酯脱羧酶[SEQ ID No.7]的氨基酸序列的表达载体pBAD-Tma_AAP-DC、pBAD-Cgl_AAP-DC和pBAD-Bsu_AAP-DC（其描述见实施例2）与空pBAD载体一起转化进E.coli菌株BL-21(A1)。在有10ml2XTY培养基的管中过夜培养起始培养物。将200μl培养物转移至有20ml2XTY培养基的摇瓶中。将摇瓶在30°C和280rpm下的轨道摇床中孵育。4h后，以0.1mM的终浓度添加IPTG并在30°C和280rpm下将摇瓶孵育4h。通过离心收集来自20ml培养物的细胞并在于24孔平板中的有1%甘油和500mg/l AKP的4ml2xTY培养基中再悬浮。30°C和210rpm下孵育48h后，通过离心收集细胞，并将球团和上清液分离并存储在-20°C用于分析。

用于测定6-ACA和AAP的UPLC-MS/MS分析方法

Waters HSS T3柱1.8μm,100mmX2.1mm用于分离6-ACA和AAP，其用如在表3中描绘的梯度洗脱。

洗脱液A是有包含0.1%甲酸的LC/MS级的水，洗脱液B是包含0.1%甲酸的乙腈。流速为0.25ml/min并且柱温度以40°C保持恒定。

表3：用于分离6-ACA和AAP的梯度洗脱程序

时间(min)	0	5.0	5.5	10	10.5	15
							%A	100	85	20	20	100	100
%B	0	15	80	80	0	0

在使用多反应监测(MRM)的电喷射阳离子或阴离子模式（取决于将被分析的化合物）中使用Waters micromass Quattro micro API。离子源温度保持在130°C，而去溶剂化温度为350°C，流速为500L/hr。

对于6-ACA和AAP，用13eV将质子化的分子碎裂，导致H₂O、NH₃和CO损失的特定片段。

为了测定浓度，制做由合成制备的化合物的外标物的校准曲线，来计算各自离子的响应因子。这用来计算样品浓度。将样品在洗脱液A中适当稀释（2-10倍）以克服离子抑制和基体效应。

上清液分析

在UPLC-MS/MS分析之前用水将上清液稀释5倍。结果（表4）清楚地显示在所有分析的菌株中存在AAP，并且预料到AKP向AAP的转化由在E.coli中存在的天然氨基转移酶催化。结果还清楚地显示，在重组菌株中存在6-ACA，而这在未转化的BL21-A1菌株中不能被检测到。

表4：在E.coli中生产6-ACA和AAP

实施例5：具有AAP脱羧酶活性的四种同源物之间的同源性

方法

使用EMBOSS/needle进行同源性分析，所述EMBOSS/needle使用Needleman-Wunsch比对算法

对于所有的比较，使用了下述缺省设定：

#矩阵：EBLOSUM62

#缺口惩罚：10.0

#延伸惩罚：0.5

成对比较结果

已进行了所有4条序列的成对比较。同源性的%百分数在表5和6中示出。

表5：同源性%百分数同一性

表6：同源性%百分数类似性

实施例6：在AKP向AAP转化中涉及的酶的鉴定

用于蛋白表达的E.coli的培养

鉴定编码具有关于AKP向AAP转化的催化活性的酶的基因，其通过测试假定的酶的所述活性来实现。在装有含940μl基本培养基或940μlLB的96-深孔平板中进行这些基因被突变（即，所述基因被缺失）的E.coli菌株的小规模培养，所述E.coli菌株是如在E.coli KEIO突变体文库(Baba T,Ara T,et al.(2006),Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Mol Syst Bioldoi:10.1038/msb400050.)中鉴定的。通过用96-孔印模（Kühner,Birsfelden，瑞士）转移来自冷冻菌种培养物的细胞，进行接种。将平板于25°C下在轨道摇床（300rpm,5cm振幅）上孵育48小时。典型地达到2-4的OD_620nm。

制备细胞裂解物

制备裂解缓冲液

裂解缓冲液含有以下成分：

表7

1M MOPS pH7.5	5ml
		DNAse I级II(Roche)	10mg
细胞壁溶解酶	200mg
		MgSO4.7H2O	123.2mg
二硫苏糖醇(DTT)	154.2mg
		H2O(MilliQ)	平衡至100ml

所述溶液是在使用之前即刻新鲜制备的。

通过裂解制备无细胞提取物

通过离心收获来自小规模培养（见前一段）的细胞，弃去上清液。将离心期间形成的细胞球团于-20℃下冷冻至少16h，然后冰上融化。向每个孔中添加500μl新鲜制备的裂解缓冲液，并通过将平板剧烈振荡2-5分钟使细胞重悬。为了实现裂解，将平板在室温下孵育30分钟。为了去除细胞碎片，将平板在4°C和6000g下离心20分钟。将上清液转移至新鲜平板并置于冰上，直至再次使用。

用于体外将α-酮庚二酸转化为α-氨基庚二酸的酶促反应

制备在50mM磷酸钾缓冲液，pH7.5中包含50mMα-酮庚二酸、100mMα-甲基苄胺和0.1mM5’-磷酸吡哆醛的反应混合物。向带孔平板的每个孔中分散510μl反应混合物。向每个孔中添加490μl细胞裂解物，以开始反应。将反应混合物在摇床上于28℃下孵育24小时。另外，在相同条件下孵育化学空白混合物（不含无细胞提取物）和生物空白（带有pBAD/Myc-His C的E.coli TOP10）。如前面所述的通过HPLC-MS分析样品。结果概括于下表中。

表8：使用来自在基本培养基中培养的细胞的裂解物进行体外生产

基因和蛋白质的参考资料可通过www.ncbi.nlm.nih.gov/找到（如2010年9月3日可获得的）

表9：使用来自在LB培养基中培养的细胞的裂解物体外生产AAP

从表8和9中列出的结果中，清楚地看出，在野生型BW25113裂解物中存在的酶能将AKP转化为AAP。该活性在从敲除单个基因的突变体中制备的提取物中大大减少。

实施例7：在E.coli中AKP转化为AAP

E.coli培养

将如E.coli KEIO突变体文库鉴定的E.coli菌株在LB中过夜培养，在有10ml2XTY培养基的管中过夜培养。将200μl培养物转移至有20ml2xTY培养基的摇瓶中。将摇瓶在30°C和280rpm下的轨道摇床中孵育。4h后，通过离心收集来自20ml培养物的细胞并在有500mg/l AKP的4ml2x TY培养基中再悬浮，在30°C下210rpm下，在24孔平板中孵育24h。24小时后通过离心收集上清液并在-20°C下存储用于分析。

用于测定AAP的UPLC-MS/MS分析方法

Waters HSS T3柱1.8μm,100mmX2.1mm用于分离6-ACA和AAP，其用如在表10中描绘的梯度洗脱。洗脱液A是包含0.1%甲酸的LC/MS级的水，洗脱液B是包含0.1%甲酸的乙腈。流速为0.25ml/min并且柱温度以40°C保持恒定。

表10：用于分离6-ACA和AAP的梯度洗脱程序

时间(min)	0	5.0	5.5	10	10.5	15
							%A	100	85	20	20	100	100
%B	0	15	80	80	0	0

取决于将被分析的化合物，在电喷雾阳离子或阴离子模式中使用Waters micromass Quattro micro API，使用多反应监测(MRM)。离子源温度保持在130°C，而去溶剂化温度为350°C，流速为500L/hr。

对于AAP，用13eV将质子化的分子碎裂，导致H₂O、NH₃和CO损失的特定片段。

为了测定浓度，制做由合成制备的化合物的外标物的校准曲线，来计算对各自离子的响应因子。这用来计算样品浓度。将样品在洗脱液A中适当稀释（2-10倍）以克服离子抑制和基体效应。

上清液分析

在UPLC-MS/MS分析之前用水将上清液稀释5倍。结果（表11）显示在24小时孵育期间，野生型E.coli菌株BW25113中产生了130mg/lAAP。由单个基因缺失的E.coli菌株清楚地显示了减少的AAP生产，这表明在这些菌株中缺失的基因直接或间接地参与AKP向AAP的转化。

表11使用E.coli突变菌株的AKP向AAP的转化

因而，包含在表8、9或11中涉及的一种或多种这些蛋白或具有AKP氨基转移酶活性的其同源物的生物催化剂可有利地用在根据本发明的方法中。基于本领域中已知的技术或本文上面所述的内容，此类蛋白可以是过表达的。

Claims

1.用于制备6-氨基己酸的方法，其包括使用包含具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的酶的至少一种生物催化剂，使α-氨基庚二酸脱羧，其中所述酶包含选自由序列编号:2、5、8和11的之任一表示的序列和具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的所述序列的同源物的组的氨基酸序列。

2.根据权利要求1的方法，其中所述酶包含与序列编号:2、5、8和11之任一具有至少40%，优选地至少60%，尤其至少80%，更尤其至少90%序列同一性的同源物。

3.根据权利要求1或2的方法，其包括从α-酮庚二酸制备α-氨基庚二酸。

4.根据权利要求3的方法，其中，在存在氨基供体时，由生物催化剂催化α-氨基庚二酸的制备，所述生物催化剂具有使α-酮庚二酸转氨化或还原性氨基化的催化活性。

5.根据权利要求4的方法，其中所述生物催化剂包含具有使α-酮庚二酸转氨化或还原性氨基化的催化活性且选自氨基转移酶(E.C.2.6.1)和氨基酸脱氢酶(E.C.1.4.1)的组的酶。

6.根据权利要求5的方法，其中所述氨基转移酶或氨基酸脱氢酶选自下组：β-氨基异丁酸酯:α-酮戊二酸酯氨基转移酶、β-丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、4-氨基-丁酸酯氨基转移酶(EC2.6.1.19)、L-赖氨酸6-氨基转移酶(EC2.6.1.36)、2-氨基己二酸酯氨基转移酶(EC2.6.1.39)、5-氨基戊酸酯氨基转移酶(EC2.6.1.48)、2-氨基己酸酯氨基转移酶(EC2.6.1.67)、赖氨酸:丙酮酸酯-6-氨基转移酶(EC2.6.1.71)和赖氨酸-6-脱氢酶(EC1.4.1.18)。

7.要求3-6任一项的方法，其中使用了下述氨基转移酶，所述酶包含根据序列编号15、序列编号18、序列编号21、序列编号23、序列编号26、序列编号28、序列编号30、序列编号32、序列编号34、序列编号36、序列编号38、序列编号40、序列编号42、序列编号44、序列编号46的氨基酸序列、在说明书表8、9或11中提到的氨基转移酶、或这些序列之任一的同源物。

8.用于制备己内酰胺的方法，其包括对通过根据上述权利要求任一项的方法制备的6-氨基己酸环化，因此形成己内酰胺。

9.重组宿主细胞，其包含编码具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的异源酶的基因，其中所述酶包含由序列编号:2、5、8和11和所述序列的同源物之任一表示的氨基酸序列。

10.根据权利要求9的重组宿主细胞，其包含编码具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的酶的核酸序列，所述核酸序列包含根据序列编号:1、3、4、6、7、9和10和所述序列的功能类似物之任一的序列。

11.根据权利要求9或10的重组宿主细胞，其包含编码能催化转氨化反应或还原性氨基化的生物催化剂的核酸序列，借以由α-酮庚二酸形成α-氨基庚二酸。

12.根据权利要求11的重组宿主细胞，其中编码能催化转氨化反应或还原性氨基化反应的生物催化剂的核酸序列选自序列编号15、序列编号18、序列编号21、序列编号23、序列编号26、序列编号28、序列编号30、序列编号32、序列编号34、序列编号36、序列编号38、序列编号40序列编号42、序列编号44、序列编号46或这些序列之任一的同源物的组。

13.多核苷酸，其包含根据序列编号:3、6和9和在Escherichia宿主细胞中具有类似、相同或更好的表达水平的其功能类似物之任一的序列。