CN107636156A - 由8碳化合物生产6碳单体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了用于产生6‑羟基己酸的生化途径，其使用单加氧酶形成7‑羟基辛酸中间体，所述中间体可使用具有单加氧酶活性、仲醇脱氢酶活性或酯酶活性的多肽被转化为6‑羟基己酸。6‑羟基己酸可被酶促转化为己二酸、己内酰胺、6‑氨基己酸、六亚甲基二胺或1,6‑己二醇。本发明还描述了产生6‑羟基己酸以及己二酸、己内酰胺、6‑氨基己酸、六亚甲基二胺和1,6‑己二醇的重组宿主。

Description

由8碳化合物生产6碳单体的方法
相关申请的交叉引用
本发明要求于2014年11月26日提交的美国申请62/085,089的权益，其全部内容被引用于此作为参考。
技术领域
本发明提供用于生产6碳单体的非天然存在的方法。本发明提供了使用单加氧酶生物合成7-羟基辛酸，并且使用一种或多种具有醇脱氢酶活性的多肽、具有单加氧酶活性的多肽和具有酯酶活性的多肽，或使用表达一种或多种这样的酶的重组宿主细胞，将7-羟基辛酸酶促转化为6-羟基己酸。本发明还涉及使用一种或多种分离的酶如具有脱氢酶、还原酶、氨基水解酶、脱酰基酶、N-乙酰转移酶、单加氧酶和转氨酶活性的多肽，或使用表达一种或多种这样的酶的重组宿主细胞，将6-羟基己酸转化为己二酸、6-氨基己酸、六亚甲基二胺、己内酰胺和1,6-己二醇中的一种或多种的方法。
背景技术
尼龙是通常通过二胺与二羧酸的缩聚而合成的聚酰胺。类似地，尼龙也可以通过内酰胺的缩聚制备。普遍存在的尼龙是尼龙6,6，它是通过六亚甲基二胺(HMD)和己二酸的反应生成的。尼龙6可以通过己内酰胺的开环聚合制备。因此，己二酸、六亚甲基二胺和己内酰胺是尼龙生产中的重要中间体(Anton&Baird，Polyamides Fibers，Encyclopedia ofPolymer Science and Technology，2001)。
工业上，己二酸和己内酰胺是通过环己烷的空气氧化制备的。在一系列步骤中，环己烷的空气氧化产生环己酮(K)和环己醇(A)的混合物，其被称为KA油。KA油的硝酸氧化产生己二酸(Musser，Hexanedioic acid，Ullmann's Encyclopedia of IndustrialChemistry，2000)。己内酰胺通过环己酮的肟和随后的酸重排由环己酮生产(Fuchs，Kieczka和Moran，Caprolactam，Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry，2000)。
工业上，六亚甲基二胺(HMD)是通过将C6结构单元氢氰化为己二腈、随后氢化成HMD而制备的(Herzog和Smiley，Hexamethylenediamine，Ullmann's Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，2012)。
考虑到对石化原料的依赖，生物技术通过生物催化提供了一种替代方法。生物催化是使用生物催化剂，如酶，进行有机化合物的生物化学转化。
生物衍生原料和石油化学原料都是生物催化过程的可行起始材料。
发明内容
因此，在此背景下，显然需要一种生产己二酸、己内酰胺、6-氨基己酸、6-羟基己酸、六亚甲基二胺和1,6-己二醇中的一种或多种的可持续方法，其中该方法基于生物催化剂。
该文件至少部分地基于以下发现：可使用单加氧酶、仲醇脱氢酶和酯酶中的至少一种来构建生物化学途径，以将8碳化合物如辛酸转化为6-羟基己酸，其可以在一个或多个酶促步骤中被转化为己二酸、6-氨基己酸、六亚甲基二胺、己内酰胺或1,6-己二醇。辛酸例如可以使用硫酯酶由辛酰基-[acp]或辛酰基-CoA制备、使用醛脱氢酶从辛醛制备、或使用脱羧酶和醛脱氢酶从2-氧代壬酸制备。己二酸和己二酸盐、6-羟基己酸和6-羟基己酸盐以及6-氨基己酸和6-氨基己酸盐在本文中可互换使用，是指任何其中性或离子形式的化合物，包括其任何盐形式。本领域技术人员应理解，具体形式将取决于pH。
面对最优原则，出人意料地发现，可以组合合适的非天然途径、原料、宿主微生物、对宿主的生化网络的弱化策略和培养策略，以有效地产生作为C6结构单元的6-羟基己酸盐，或将6-羟基己酸盐转化成其它C6结构单元，例如己二酸、6-氨基己酸、六亚甲基二胺、己内酰胺或1,6-己二醇。
在一方面，本发明特征在于一种制备7-羟基辛酸的方法。该方法包括使用分类为EC.1.14.14.1的单加氧酶(例如与SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的单加氧酶)将辛酸酶促转化为7-羟基辛酸。该方法还可包括使用仲醇脱氢酶(例如与在SEQ ID NO:19中示出的氨基酸序列具有至少70％同一性的仲醇脱氢酶)、归类为EC1.14.13.-的单加氧酶(例如，与在SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中示出的氨基酸序列具有至少70％同一性的单加氧酶)和酯酶(例如，归类为EC 3.1.1.1或EC 3.1.1.3的酯酶，如与在SEQ ID NO:22中示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的酯酶)将7-羟基辛酸酶促转化为6-羟基己酸。辛酸可通过使用硫酯酶将辛酰基-[acp]或辛酰基-CoA转化为辛酸而制备。硫酯酶可与在SEQ ID NO:1、15、16或17中示出的氨基酸序列具有至少70％同一性。辛酸也可使用脱羧酶和醛脱氢酶由2-氧代壬酸制备。脱羧酶可与在SEQ ID NO:23中示出的氨基酸序列具有至少70％同一性。
本发明特征还在于用于生物合成6-羟基己酸的方法。该方法包括：使用硫酯酶(例如，与在SEQ ID NO:1、15、16或17中示出的氨基酸序列具有至少70％同一性的硫酯酶)和归类为EC 1.14.14.1的单加氧酶(例如，与在SEQ ID NO:18中示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的单加氧酶)从辛酰基-CoA或辛酰基-[acp]酶促合成7-羟基辛酸，以及使用仲醇脱氢酶(例如，与在SEQ ID NO:19中示出的氨基酸序列具有至少70％同一性的仲醇脱氢酶)、归类为EC 1.14.13.-的单加氧酶(例如，与在SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中示出的氨基酸序列具有至少70％同一性的单加氧酶)和酯酶(例如，归类为EC 3.1.1.1或EC3.1.1.3的酯酶，如与在SEQ ID NO:22中示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的酯酶)将7-羟基辛酸酶促转化为6-羟基己酸。
在另一方面，本发明的特征在于用于生物合成6-羟基己酸的方法，其包括使用脱羧酶(例如，与在SEQ ID NO:23中示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的脱羧酶)、醛脱氢酶和归类为EC 1.14.14.1的单加氧酶(例如，与在SEQ ID NO:18中示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的单加氧酶)由2-氧代壬酸酶促合成7-羟基辛酸，并使用仲醇脱氢酶(例如，与在SEQ ID NO:19中示出的氨基酸序列具有至少70％同一性的仲醇脱氢酶)、归类为EC 1.14.13.-的单加氧酶(例如，与在SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中示出的氨基酸序列具有至少70％同一性的单加氧酶)和酯酶(例如，归类为EC3.1.1.1或EC3.1.1.3的酯酶，如与在SEQ ID NO:22中示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的酯酶)将7-羟基辛酸酶促转化为6-羟基己酸。
任何所述方法可进一步包括在一个或多个步骤中将6-羟基己酸酶促转化为己二酸、6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇。
例如，可使用单加氧酶、伯醇脱氢酶、6-羟基己酸脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、6氧代己酸脱氢酶、5-氧代戊酸脱氢酶或醛脱氢酶中的一种或多种将6-羟基己酸转化为己二酸。
例如，可使用伯醇脱氢酶、6-羟基己酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶和ω-转氨酶(如，与SEQ ID NO.7–12中示出的任何氨基酸序列具有至少70％序列同一性的ω-转氨酶)中的一种或多种将6-羟基己酸转化为6-氨基己酸。可使用羧酸还原酶(如，与SEQ ID NO 2–6中示出的氨基酸序列之一具有至少70％序列同一性的羧酸还原酶)和ω-转氨酶(如，与SEQ ID NO.7–12中示出的任何氨基酸序列具有至少70％序列同一性的ω-转氨酶)中的一种或多种将6-氨基己酸转化为六亚甲基二胺。
例如，可使用伯醇脱氢酶、6-羟基己酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、ω-转氨酶(例如，与SEQ ID NO.7–12中示出的任何氨基酸序列具有至少70％序列同一性的ω-转氨酶)和酰胺水解酶中的一种或多种将6-羟基己酸转化为己内酰胺。
例如，可使用羧酸还原酶(如，与SEQ ID NO 2–6中示出的氨基酸序列之一具有至少70％序列同一性的羧酸还原酶)、ω-转氨酶(如，与SEQ ID NO.7–12中示出的任何氨基酸序列具有至少70％序列同一性的ω-转氨酶)、伯醇脱氢酶、N-乙酰转移酶和乙酰基腐胺脱酰基酶中的一种或多种将6-羟基己酸转化为六亚甲基二胺。
例如，使用羧酸还原酶和醇脱氢酶将6-羟基己酸转化为1,6-己二醇。
在本发明公开的任何方法中，己二酸可通过以下方法产生：使用(i)被归类于EC1.2.1.3的醛脱氢酶；(ii)5-氧代戊酸脱氢酶；(iii)被归类于EC1.2.1.63的6-氧代己酸脱氢酶，如由ChnE编码的那些；或被归类于EC 1.2.1.-的7-氧代庚酸脱氢酶(如，ThnG的基因产物)；或(iv)细胞色素P450家族中的单加氧酶，在己二酸半醛(也被称为6-氧代己酸)中形成第二末端官能团。
在本发明公开的任何方法中，可使用被归类于EC 2.61.18、EC 2.6.1.19、EC2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82中的ω-转氨酶通过在己二酸半醛中形成第二末端官能团来产生6-氨基己酸。
在本发明公开的任何方法中，可使用归类为EC 3.5.2.-的酰胺水解酶由6-氨基己酸产生己内酰胺。与己内酰胺相关的酰胺键由6-氨基己酸的末端羧基和末端氨基产生。
在本发明公开的任何方法中，可通过在以下化合物中形成第二末端官能团来制备六亚甲基二胺：(i)6-氨基己醛，使用被归类于EC.2.61.18、EC2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC2.6.1.48或EC 2.6.1.82中的ω-转氨酶；或(ii)N6-乙酰基-1,6-二氨基己烷，使用被归类于例如EC 3.5.1.17中的脱酰基酶。
在本发明公开的任何方法中，可通过在6-羟基己醛中形成第二末端官能团来制备1,6-己二醇，其中使用被归类于EC.1.1.1.-(如，1、2、21或184)中的醇脱氢酶，如由YMR318C、YqhD或CAA81612.1编码的那些。
在一些实施方案中，生物给料可为以下物质或可衍生自以下物质：单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩的酒糟可溶物或城市废物。
在一些实施方案中，非生物给料可为以下物质或可衍生自以下物质：天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸、来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物(NVR)或者碱洗废物流，或对苯二甲酸/异酞酸混合物废物流。
在一些实施方案中，宿主微生物对高浓度的一种或多种C6结构单元的耐受可以通过在选择环境中连续培养来改善。
在一些实施方案中，弱化或增强所述宿主微生物的生物化学网络，来(1)保证乙酰-CoA或丙二酰基-[acp]的细胞内可用度；(2)创造NADH或NADPH不平衡，其仅可通过形成一个或多个C6结构单元来平衡；(3)阻止通向并包括C6结构单元的中心代谢物、中心前体的降解；和(4)保证从细胞的高效流出。
在一些实施方案中，使用非周期性培养策略以实现厌氧、微需氧或需氧的培养条件。
在一些实施方案中，使用周期性培养策略在厌氧和需氧的培养条件之间转换。
在一些实施方案中，所述培养策略包括限制营养，如限制氮、磷酸盐或氧。
在一些实施方案中，通过单一类型的微生物(如含有一种或多种外源性核酸的重组宿主)使用非周期性或周期性的发酵策略产生一个或多个C6结构单元。
在一些实施方案中，通过共培养超过一种类型的微生物(如两种或更多种不同的重组宿主)来产生一个或多个C6结构单元，其中每种宿主含有特定的一组外源性核酸。
在一些实施方案中，可通过连续发酵来产生一个或多个C6结构单元，其中可将来自在先发酵的肉汤或浓缩物作为给料来源、中心代谢物或中心前体给料至一连串发酵；最终产生C6结构单元。
本发明特征还在于包含至少一种外源性核酸的重组宿主，所述外源性核酸编码：(i)被归类于EC 1.14.14.1的单加氧酶；(ii)硫酯酶，或脱羧酶和醛脱氢酶；(iii)仲醇脱氢酶；(iv)被归类于EC.1.14.13.-的单加氧酶；和(v)酯酶，所述宿主产生6-羟基己酸。被归类于EC 1.14.14.1的单加氧酶可与SEQ ID NO:18中示出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。硫酯酶可与SEQ ID NO:1、15、16或17中示出的氨基酸序列具有至少70％同一性。脱羧酶可与SEQ ID NO:23中示出的氨基酸序列具有至少70％同一性。被归类于EC 1.14.13.-的单加氧酶可与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中示出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。酯酶可与SEQ ID NO:22中示出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。仲醇脱氢酶可与SEQ ID NO:19中示出的氨基酸序列具有至少70％同一性。
所述产生6-羟基己酸的重组宿主可进一步包含以下外源性酶中的一种或多种：单加氧酶、伯醇脱氢酶、5-氧代戊酸脱氢酶、6-羟基己酸脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶或醛脱氢酶，所述宿主还产生己二酸。
所述产生6-羟基己酸的重组宿主还可包含以下外源性酶中的一种或多种：转氨酶、6-羟基己酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶和伯醇脱氢酶，所述宿主还产生6-氨基己酸。该宿主还可包含外源性酰胺水解酶，该宿主还产生己内酰胺。
所述产生6-羟基己酸的重组宿主还可包含以下外源性酶中的一种或多种：羧酸还原酶、ω-转氨酶、脱酰基酶、N-乙酰基转移酶或伯醇脱氢酶，所述宿主还产生六亚甲基二胺。
所述产生6-羟基己酸的重组宿主还可包含外源性羧酸还原酶和外源性伯醇脱氢酶，所述宿主还产生1,6-己二醇。
任何所述重组宿主可为原核生物，如选自以下菌属的原核生物：埃希氏菌属(Escherichia)；梭菌属(Clostridia)；棒状杆菌属(Corynebacteria)；贪铜菌属(Cupriavidus)；假单胞菌属(Pseudomonas)；代尔夫特菌属(Delftia)；芽胞杆菌属(Bacilluss)；乳酸杆菌属(Lactobacillus)；乳球菌属(Lactococcus)；和红球菌属(Rhodococcus)。例如，所述原核生物可选自大肠杆菌(Escherichia coli)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、食油假单胞菌(Pseudomonas oleavorans)、食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillis)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和马红球菌(Rhodococcus equi)。该原核生物还可为用于构建本发明所述的能够产生C6结构单元的重组宿主细胞的基因来源。
任何所述重组宿主可为真核生物，如选自以下菌属的真核生物：曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、耶罗维亚酵母属(Yarrowia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、Arxula和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)。例如，所述真核生物可选自黑曲霉(Aspergillus niger)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)、东方伊萨酵母(Issathenkia orientalis)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、Arxula adenoinivorans和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)。该真核生物还可为用于构建本发明所述的能够产生C6结构单元的重组宿主细胞的基因来源。
本发明所述的任意重组宿主进一步可以包括弱化一种或多种以下酶：聚羟基链烷酸合酶、乙酰-CoA硫酯酶、形成乙酸的磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、乳酸脱氢酶、甲基萘醌(menaquinol)-延胡索酸氧化还原酶、产生异丁醇的2-酮酸脱羧酶、形成乙醇的醇脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、丙酮酸脱羧酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、消耗NADH的转氢酶、NADH特异性的谷氨酸脱氢酶、NADH/NADPH利用型谷氨酸脱氢酶、庚二酰-CoA脱氢酶；接受C6结构单元和中心前体作为底物的酰基-CoA脱氢酶；丁酰-CoA脱氢酶；或己二酰-CoA合成酶。
本发明所述的任意重组宿主进一步可以过表达编码以下酶的一种或多种基因：乙酰-CoA合成酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶；转酮醇酶；吡啶核苷酸转氢酶；甘油醛-3P-脱氢酶；苹果酸酶；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；葡萄糖脱氢酶；果糖1,6二磷酸酶；L-丙氨酸脱氢酶；L-谷氨酸脱氢酶；甲酸脱氢酶；L-谷氨酰胺合酶；特异性5-羟基戊酸脱氢酶、特异性5-氧代戊酸脱氢酶；丙酸CoA-连接酶；二胺转运体、二羧酸转运体；和/或多药物转运体。
在一方面，本发明的特征在于产生生物衍生的6碳化合物的方法。所述用于产生生物衍生的6碳化合物的方法可包括在一定条件下和足够的时间内培养或生长本发明所述的重组宿主以产生生物衍生的6碳化合物，其中，任选地，所述生物衍生的6碳化合物选自己二酸、6-氨基己酸、六亚甲基二胺、己内酰胺或1,6-己二醇及其组合。
在一方面，本发明的特征在于组合物，其包含本发明所述的生物衍生的6碳化合物和除所述生物衍生的6碳化合物以外的化合物，其中所述生物衍生的6碳化合物选自己二酸、6-氨基己酸、六亚甲基二胺、己内酰胺或1,6-己二醇及其组合。例如，所述生物衍生的6碳化合物为宿主细胞或生物体的细胞部分。
本发明特征还在于生物基聚合物，其包含生物衍生的己二酸、6-氨基己酸、六亚甲基二胺、己内酰胺或1,6-己二醇及其组合。
本发明特征还在于生物基树脂，其包含生物衍生的己二酸、6-氨基己酸、六亚甲基二胺、己内酰胺或1,6-己二醇及其组合，以及通过使生物基树脂成型而获得的成型产品。
在另一方面，本发明的特征在于用于产生生物基聚合物的工艺，其包括使生物衍生的己二酸、6-氨基己酸、六亚甲基二胺、己内酰胺或1,6-己二醇与其自身或产生聚合物的反应中的其它化合物进行化学反应。
在另一方面，本发明的特征在于用于产生生物基树脂的工艺，其包括使生物衍生的己二酸、6-氨基己酸、六亚甲基二胺、己内酰胺或1,6-己二醇与其自身或产生树脂的反应中的其它化合物进行化学反应。
此外，本发明描述了生物化学网络，其包含具有单加氧酶、醇脱氢酶和酯酶活性的一种或多种多肽，以将8碳化合物如辛酸酶促转化为6-羟基己酸。
所述生物化学网络还可包含具有硫酯酶活性的多肽或具有醛脱氢酶活性的多肽或具有脱羧酶活性的多肽。
所述生物化学网络还可包含一种或多种具有单加氧酶、伯醇脱氢酶、6-羟基己酸脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶、5-氧代戊酸脱氢酶和/或醛脱氢酶的活性的多肽，以将6-羟基己酸酶促转化为己二酸。
所述生物化学网络还可包含一种或多种具有伯醇脱氢酶、6-羟基己酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶和/或ω-转氨酶(如，与SEQ ID NO.7–12中示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的ω-转氨酶)的活性的多肽，以将6-羟基己酸酶促转化为6-氨基己酸。
所述生物化学网络还可包含一种或多种具有以下酶活性的多肽：伯醇脱氢酶、6-羟基己酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、ω-转氨酶(例如，与SEQ IDNO.7–12中所示的任一氨基酸序列具有至少70％的序列同一性的ω-转氨酶)和/或酰胺水解酶，以将6-羟基己酸酶促转化为己内酰胺。
所述生物化学网络还可包含一种或多种具有羧酸还原酶(如，与SEQ ID NO 2–6中示出的氨基酸序列之一具有至少70％序列同一性的羧酸还原酶)、ω-转氨酶(如，与SEQ IDNO.7–12中示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的ω-转氨酶)、伯醇脱氢酶、N-乙酰转移酶和/或乙酰基腐胺脱酰基酶的活性的多肽，以将6-羟基己酸酶促转化为六亚甲基二胺。
所述生物化学网络还可包含一种或多种具有羧酸还原酶和/或醇脱氢酶的活性的多肽，以将6-羟基己酸酶促转化为1,6-己二醇。
在一方面，所述生物化学网络为非天然存在的生物化学网络，其包含图1至图5中的至少一种底物、至少一种编码具有图1至图5的至少一种酶的活性的多肽的外源性核酸和图1至图5中的至少一种产物。
在本发明的一个方面，描述了用于形成图1至图5的至少一种化合物的步骤。在本发明的一个方面，描述了用于形成图1至图5的至少一种化合物的手段。
在一方面，本发明的特征还在于生物衍生的产品、生物基产品或发酵衍生的产品，其中所述产品包含：i.组合物，其包含根据图1-5中任一个的至少一种生物衍生的、生物基的或发酵衍生的化合物或其任何组合；ii.生物衍生的、生物基的或发酵衍生的聚合物，其包含i中所述生物衍生的、生物基的或发酵衍生的组合物或化合物或其任何组合；iii.生物衍生的、生物基的或发酵衍生的树脂，其包含i中所述生物衍生的、生物基的或发酵衍生的化合物或生物衍生的、生物基的或发酵衍生的组合物或其任何组合或ii中所述生物衍生的、生物基的或发酵衍生的聚合物或其任何组合；iv.通过使ii中所述生物衍生的、生物基的或发酵衍生的聚合物或iii中所述生物衍生的、生物基的或发酵衍生的树脂或其任何组合成型而获得的成型物质；v.生物衍生的、生物基的或发酵衍生的制剂，其包含i中所述生物衍生的、生物基的或发酵衍生的组合物、i的生物衍生的、生物基的或发酵衍生的化合物、ii中所述生物衍生的、生物基的或发酵衍生的聚合物、iii中所述生物衍生的、生物基的或发酵衍生的树脂或iv中所述生物衍生的、生物基的或发酵衍生的成型物质或其任何组合；或vi.生物衍生的、生物基的或发酵衍生的半固体或非半固体的流，其包含i中所述生物衍生的、生物基的或发酵衍生的组合物、i中所述生物衍生的、生物基的或发酵衍生的化合物、ii中所述生物衍生的、生物基的或发酵衍生的聚合物、iii中所述生物衍生的、生物基的或发酵衍生的树脂、v中所述生物衍生的、生物基的或发酵衍生的制剂或iv中所述生物衍生的、生物基的或发酵衍生的成型物质或其任何组合。
在另一方面，本发明提供了核酸构建体或表达载体，其包含：(a)编码具有单加氧酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个指导所述多肽的产生的异源性控制序列，并且其中所述具有单加氧酶活性的多肽选自与SEQ ID NO:18的多肽具有至少70％序列同一性的多肽；(b)编码具有酯酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个指导所述多肽的产生的异源性控制序列，并且其中所述具有酯酶活性的多肽选自与SEQ ID NO:22的多肽具有至少70％序列同一性的多肽；(c)编码具有硫酯酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个指导所述多肽的产生的异源性控制序列，并且其中所述具有硫酯酶活性的多肽选自与SEQ IDNO:1、15、16或17的多肽具有至少70％序列同一性的多肽；或(d)编码具有脱羧酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个指导所述多肽的产生的异源性控制序列，并且其中所述具有脱羧酶活性的多肽选自与SEQ ID NO:23的多肽具有至少70％序列同一性的多肽；或(e)编码具有醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个指导所述多肽的产生的异源性控制序列，并且其中所述具有醇脱氢酶活性的多肽选自与SEQ ID NO:21的多肽具有至少70％序列同一性的多肽；或(f)编码具有ω-转氨酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个指导所述多肽的产生的异源性控制序列，并且其中所述具有ω-转氨酶活性的多肽选自与SEQ ID NO:7-12的多肽具有至少70％序列同一性的多肽；或(g)编码具有羧酸还原酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个指导所述多肽的产生的异源性控制序列，并且其中所述具有羧酸还原酶活性的多肽选自与SEQ ID NO:2–6或24的多肽具有至少70％序列同一性的多肽；或(h)编码具有以下酶的活性的多肽的多核苷酸：单加氧酶、伯醇脱氢酶、6-羟基己酸脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶、5-氧代戊酸脱氢酶、醛脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、羧酸还原酶、N-乙酰转移酶、乙酰基腐胺脱酰基酶或ω-转氨酶。本发明还提供了包含上述核酸构建体或表达载体的组合物。
本领域技术人员理解，当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子替换或与有机碱配位时，含有羧酸基团的化合物(包括但不限于有机单酸、羟基酸、氨基酸和二羧酸)形成或转化为其离子盐形式，所述金属离子如碱金属离子，碱土金属离子或铝离子。可接受的有机碱包括但不限于乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等。本发明的盐作为盐分离，或通过加入酸或用酸性离子交换树脂处理将pH降低到低于pKa而转化为游离酸。
本领域技术人员理解，例如通过向胺中加入酸性质子形成铵盐使含有胺基的化合物(包括但不限于有机胺、氨基酸和二胺)形成或转化成其离子盐形式，所述铵盐为与无机酸形成的，如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或为与有机酸形成的，所述有机酸包括但不限于乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等。可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等。将本发明的盐作为盐分离，或通过加入碱或用碱性离子交换树脂处理将pH升高至pKb以上而转化为游离胺。
本领域技术人员理解，通过以下方式，含有胺基和羧酸基团的化合物(包括但不限于氨基酸)形成或转化为其离子盐形式：1)与无机酸形成酸加成盐，所述无机酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或与有机酸形成酸加成盐，所述有机酸包括但不限于乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等。可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等；或2)母体化合物中存在的酸性质子被金属离子如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子置换或与有机碱配位。可接受的有机碱包括但不限于乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等。本发明的盐可作为盐分离，或者通过加入酸或用酸性离子交换树脂处理将pH降低至低于pKa而转化为游离酸。
除非另有定义，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本发明所述的相似或相当的方法和材料可用于实践本发明，但合适的方法和材料如下所述。本发明提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本发明。在冲突的情况下，以本说明书为准，包括定义。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。
在附图和下面的描述中阐述本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其它特征、对象和优点将通过说明书和附图以及权利要求书变得清楚。根据专利法的标准做法，权利要求中的词语“包括”可以由“基本上由...组成”或“由...组成”代替。
附图简述
图1为通向6-羟基己酸的示例性生化途径的示意图，其中使用辛酰基-[acp]、辛酰基-CoA或2-氧代壬酸作为中心代谢物。
图2为通向己二酸的示例性生化途径的示意图，其中使用6-羟基己酸作为中心前体。
图3为通向6-氨基己酸的示例性生化途径的示意图(其中使用6-羟基己酸作为中心前体)和由6-氨基己酸通向己内酰胺的生化途径的示意图。
图4为通向六亚甲基二胺的示例性生化途径的示意图，其中使用6-氨基己酸、6-羟基己酸、己二酸半醛或1,6-己二醇作为中心前体。
图5为通向1,6-己二醇的示例性生化途径的示意图，其中使用6-羟基己酸作为中心前体。
图6包含以下氨基酸序列：多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)硫酯酶(参见GenBank登记号AAO77182，SEQ ID NO:1)、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)羧酸还原酶(参见GenBank登记号ACC40567.1，SEQ ID NO:2)、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)羧酸还原酶(参见GenBank登记号ABK71854.1，SEQ ID NO:3)、Segniliparusrugosus羧酸还原酶(参见GenBank登记号EFV11917.1，SEQ ID NO:4)、脓肿分枝杆菌博氏亚种(Mycobacterium abscessus subsp.bolletii)羧酸还原酶(参见GenBank登记号EIV11143.1，SEQ ID NO:5)、Segniliparus rotundus羧酸还原酶(参见GenBank登记号ADG98140.1，SEQ ID NO:6)、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)ω-转氨酶(参见GenBank登记号AAQ59697.1，SEQ ID NO:7)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的ω-转氨酶(参见GenBank登记号AAG08191.1，SEQ ID NO:8)、丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)ω-转氨酶(参见GenBank登记号AAY39893.1，SEQ ID NO:9)、球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)ω-转氨酶(参见GenBank登记号ABA81135.1，SEQ ID NO:10)、大肠杆菌ω-转氨酶(参见GenBank登记号AAA57874.1，SEQ ID NO:11)、河流弧菌(Vibriofluvialis)ω-转氨酶(参见GenBank登记号AEA39183.1，SEQ ID NO:12)；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferase)(参见GenBank登记号CAA44858.1，SEQ ID NO:13)、诺卡氏菌属(Nocardia sp.)NRRL 5646磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(参见GenBank登记号ABI83656.1，SEQ ID NO:14)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)硫酯酶(参见GenBank登记号CCC78182.1，SEQ ID NO:15)、四联消化厌氧球菌(Anaerococcus tetradius)硫酯酶(参见GenBank登记号EEI82564.1，SEQID NO:16)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)硫酯酶(参见GenBank登记号ABG82470.1，SEQ ID NO:17)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)单加氧酶(参见GenBank登记号AAA87602.1，SEQ ID NO:18)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)醇脱氢酶(参见GenBank登记号ADD83022.1，SEQ ID NO:19)、戈登氏菌属(Gordonia sp.)TY-5丙酮单加氧酶(参见GenBank登记号BAF43791.1，SEQ ID NO:20)、迪茨氏菌属(Dietzia sp.)D单加氧酶(参见GenBank登记号AGY78320.1，SEQ ID NO:21)、荧光假单胞菌羧基酯酶(Genbank登记号AAB60168；SEQ ID NO:22)和鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)脱羧酶(参见GenBank登记号CAC48239.1，SEQ ID NO:23)。
图7的条形图总结了20分钟后在340nm吸光度的变化，其是仅含酶的对照(无底物)中NADPH的消耗量和羧酸还原酶的活性的量度。
图8为20分钟后在340nm吸光度的变化的条形图，其为相对于空载体对照，NADPH消耗量和羧酸还原酶将6-羟基己酸转化为6-羟基己醛的活性的量度。
图9为20分钟后在340nm吸光度的变化的条形图，其为相对于空载体对照，NADPH消耗量和羧酸还原酶将N6-乙酰基-6-氨基己酸转化为N6-乙酰基-6-氨基己醛的活性的量度。
图10为20分钟后在340nm吸光度的变化的条形图，其为相对于空载体对照，NADPH消耗量和羧酸还原酶将己二酸半醛转化为己二醛的活性的量度。
图11为总结了在4小时后丙酮酸向L-丙氨酸的转化百分比(mol/mol)的条形图，其为仅含酶的对照(无底物)的ω-转氨酶活性的量度。
图12为24小时后丙酮酸向L-丙氨酸的转化百分比(mol/mol)的条形图，其为相对于空载体对照，将6-氨基己酸转化为己二酸半醛的ω-转氨酶活性的量度。
图13为4小时后L-丙氨酸向丙酮酸的转化百分比(mol/mol)的条形图，其为相对于空载体对照，将己二酸半醛转化为6-氨基己酸的ω-转氨酶活性的量度。
图14为4小时后丙酮酸向L-丙氨酸的转化百分比(mol/mol)的条形图，其为相对于空载体对照，将六亚甲基二胺转化为6-氨基己醛的ω-转氨酶活性的量度。
图15为4小时后丙酮酸向L-丙氨酸的转化百分比(mol/mol)的条形图，其为相对于空载体对照，将N6-乙酰基-1,6-二氨基己烷转化为N6-乙酰基-6-氨基己醛的ω-转氨酶活性的量度。
图16为4小时后丙酮酸向L-丙氨酸的转化百分比(mol/mol)的条形图，其为相对于空载体对照，将6-氨基己醇转化为6-氧代己醇的ω-转氨酶活性的量度。
发明详述
一般而言，本申请提供酶、非天然途径、培养策略、给料、宿主微生物和对宿主的生物化学网络的弱化，以产生6-羟基己酸或己二酸、己内酰胺、6-氨基己酸、六亚甲基二胺或1,6-己二醇中的一种或多种，上述全部在这里被称为“C6结构单元”。如本发明所使用的，术语“中心前体”用于表示本发明所示的通向C6结构单元的合成的任意代谢途径中的任意代谢物。术语“中心代谢物”在本发明中用于表示在所有微生物中生产以支持生长的代谢产物。
本发明中描述的宿主微生物可以包含可以操作为使得可生成6-羟基己酸或一种或多种其它C6结构单元的内源途径。在一种内源途径中，宿主微生物天然表达催化途径内的反应的所有酶。含有工程化途径的宿主微生物不天然表达催化途径内的反应的所有酶，但是已经工程化改造为使得在宿主中表达途径内的所有酶。
如本发明中提及核酸(或蛋白质)和宿主使用的，术语“外源”指不像其在自然界中被发现一样存在于特定类型细胞中(并且不能从特定类型细胞获得)的核酸或由所述核酸编码的蛋白质。如此，非天然存在的核酸一旦在宿主中即视为对于宿主而言外源的。重要的是注意，非天然存在的核酸可含有在自然界中发现的核酸序列的核酸亚序列或片段，只要该核酸作为整体不存在于自然界中。例如，表达载体内含有基因组DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，如此一旦导入宿主中对于宿主细胞而言是外源的，因为该核酸分子作为整体(基因组DNA加载体DNA)不存在于自然界中。如此，作为整体不存在于自然界中的任何载体、自主复制的质粒或病毒(例如逆转录病毒、腺病毒、或疱疹病毒)视为非天然存在的核酸。由此得出结论通过PCR或限制内切性核酸酶处理产生的基因组DNA片段以及cDNA也视为非天然存在的核酸，因为它们作为未见于自然界的分开的分子存在。由此还得出结论任何以未见于自然界中的排布含有启动子序列和多肽编码序列(例如cDNA或基因组DNA)的任何核酸也是非天然存在的核酸。天然存在的核酸可以是对于特定宿主微生物而言外源的。例如，从酵母x的细胞分离的完整染色体一旦将该染色体导入酵母y的细胞中就酵母y细胞而言是外源核酸。
比较而言，如本发明中提及核酸(例如基因)(或蛋白质)和宿主使用的，术语“内源的”指就像其在自然界中被发现一样的确存在于特定宿主中(并且可以从特定宿主获得)的核酸(或蛋白质)。此外，“内源表达”核酸(或蛋白质)的细胞就像其在自然界中被发现时相同特定类型的宿主那样表达所述核酸(或蛋白质)。此外，“内源生成”核酸、蛋白质、或其它化合物的宿主就像其在自然界中被发现时相同特定类型的宿主那样生成所述核酸、蛋白质、或化合物。
例如，取决于所述宿主和由所述宿主生产的化合物，除了单加氧酶以外，所述宿主中可以表达一种或多种以下酶：酯酶、脱羧酶、硫酯酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶、5-氧代戊酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、ω-转氨酶、6-羟基己酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、羧酸还原酶、脱酰基酶、N-乙酰基转移酶或酰胺水解酶。重组宿主可以包括两种或更多种不同的外源性单加氧酶(例如，两种、三种或四种不同的单加氧酶)。在表达单加氧酶的重组宿主中，还可以表达电子转移链蛋白如氧化还原酶或铁氧化还原蛋白多肽。在表达羧酸还原酶的重组宿主中，还可以表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，因为其提高羧酸还原酶的活性。
例如，重组宿主可以包含硫酯酶并产生辛酸。
例如，重组宿主可包含与醛脱氢酶组合的脱羧酶并产生辛酸。
例如，重组宿主可包含一种或多种外源性单加氧酶并产生7-羟基辛酸，其可被转化为6-羟基己酸。该宿主还可包含外源性硫酯酶或外源性脱羧酶以及外源性醛脱氢酶。
例如，重组宿主可包含外源性单加氧酶和以下外源性酶中的一种或多种：酯酶、硫酯酶、脱羧酶、醛脱氢酶、仲醇脱氢酶和/或不同的单加氧酶，并产生6-羟基己酸。
例如，重组宿主可包含第一外源性单加氧酶、与第一外源性单加氧酶不同的第二外源性单加氧酶、外源性仲醇脱氢酶和外源性酯酶，并产生6-羟基己酸。例如，重组宿主可包含第一外源性单加氧酶、与第一外源性单加氧酶不同的第二外源性单加氧酶、硫酯酶、外源性仲醇脱氢酶和外源性酯酶，并产生6-羟基己酸。例如，重组宿主可包含第一外源性单加氧酶、与第一外源性单加氧酶不同的第二外源性单加氧酶、脱羧酶、醛脱氢酶、外源性仲醇脱氢酶和外源性酯酶，并产生6-羟基己酸。
例如，产生6-羟基己酸的重组宿主可包含以下外源性酶中的一种或多种：单加氧酶、醇脱氢酶、5-氧代戊酸脱氢酶、6-羟基己酸脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶或醛脱氢酶，并进一步产生己二酸。例如，产生6-羟基己酸的重组宿主可包含外源性单加氧酶并产生己二酸。例如，产生6-羟基己酸的重组宿主可包含外源性6-羟基己酸脱氢酶和醛脱氢酶并产生己二酸。例如，产生6-羟基己酸的重组宿主可包含外源性醇脱氢酶和以下外源性酶中的一种：5-氧代戊酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶或7-氧代庚酸脱氢酶，并产生己二酸。
例如，产生6-羟基己酸的重组宿主可包含以下外源性酶中的一种或多种：伯醇脱氢酶、6-羟基己酸脱氢酶或转氨酶，并进一步产生6-氨基己酸。例如，产生6-羟基己酸的重组宿主可包含外源性伯醇脱氢酶和外源性转氨酶并产生6-氨基己酸。例如，产生6-羟基己酸的重组宿主可包含外源性6-羟基己酸脱氢酶和外源性转氨酶并产生6-氨基己酸。任何这些宿主都可进一步包含外源性酰胺水解酶并进一步产生己内酰胺。
例如，产生6-羟基己酸的重组宿主可包含以下外源性酶中的一种或多种：羧酸还原酶、ω-转氨酶、脱酰基酶、N-乙酰基转移酶或伯醇脱氢酶，并产生六亚甲基二胺。例如，产生6-羟基己酸的重组宿主可包含外源性羧酸还原酶、外源性伯醇脱氢酶以及一种或多种外源性转氨酶(如，一种转氨酶或两种不同的转氨酶)，并产生六亚甲基二胺。例如，产生6-羟基己酸的重组宿主可包含外源性羧酸还原酶和一种或多种外源性转氨酶(如，一种转氨酶或两种不同的转氨酶)，并产生六亚甲基二胺。例如，产生6-羟基己酸的重组宿主可包含外源性伯醇脱氢酶、外源性羧酸还原酶和一种或多种外源性转氨酶(如，一种转氨酶或者两种或三种不同的转氨酶)，并产生六亚甲基二胺。例如，产生6-羟基己酸的重组宿主可包含外源性伯醇脱氢酶、外源性N-乙酰基转移酶、羧酸还原酶、脱酰基酶以及一种或多种外源性转氨酶(如，一种转氨酶或两种不同的转氨酶)，并产生六亚甲基二胺。
例如，产生6-羟基己酸的重组宿主可包含以下外源性酶中的一种或多种：羧酸还原酶和外源性伯醇脱氢酶，并进一步产生1,6-己二醇。
在工程化途径中，所述酶可以来自单个来源，即，来自于一个物种或属，或可以来自于多个来源，即，不同的物种或属。编码本发明所述的酶的核酸已经从多种生物鉴定，并在公共数据库例如GenBank或EMBL中容易获得。
如本发明所用，当提及特定酶(例如醇脱氢酶)时，是指具有特定酶活性的多肽(例如具有醇脱氢酶活性的多肽)。
本发明所述的可用于生产一种或多种C6结构单元的任意酶可以与对应野生型酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。应当理解所述序列同一性可以基于成熟的酶(例如移除了任意信号序列)，或基于未成熟酶(例如，包括任何信号序列)确定。还应当理解，最初的甲硫氨酸残基可以存在也可以不存在于本发明所述的任何酶序列上。
例如，本发明所述的硫酯酶可以与来自以下的硫酯酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)：多形拟杆菌(参见GenBank登记号AAO77182,SEQ ID NO:1)、植物乳杆菌(参见GenBank登记号CCC78182.1,SEQ ID NO:15)、四联消化厌氧球菌(参见GenBank登记号EEI82564.1,SEQ ID NO:16)或产气荚膜梭菌(参见GenBank登记号ABG82470.1,SEQ ID NO:17)。参见图6。
例如，本发明所述的羧酸还原酶可以与来自以下的羧酸还原酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)：海分枝杆菌(参见GenBank登记号ACC40567.1,SEQID NO:2)、耻垢分枝杆菌(参见GenBank登记号ABK71854.1,SEQ ID NO:3)、Segniliparusrugosus(参见GenBank登记号EFV11917.1,SEQ ID NO:4)、脓肿分枝杆菌博氏亚种(参见GenBank登记号EIV11143.1,SEQ ID NO:5)、或Segniliparus rotundus(参见GenBank登记号ADG98140.1,SEQ ID NO:6)。参见图6。
例如，本发明所述的ω-转氨酶可以与来自以下的ω-转氨酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)：紫色色杆菌(参见GenBank登记号AAQ59697.1,SEQID NO:7)、铜绿假单胞菌(参见GenBank登记号AAG08191.1,SEQ ID NO:8)、丁香假单胞菌(参见GenBank登记号AAY39893.1,SEQ ID NO:9)、球形红杆菌(参见GenBank登记号ABA81135.1,SEQ ID NO:10)、大肠杆菌(参见GenBank登记号AAA57874.1,SEQ ID NO:11)或河流弧菌(参见GenBank登记号AEA39183.1,SEQ ID NO:12)。这些ω-转氨酶中的一些为二胺ω-转氨酶。参见图6。
例如，本发明所述的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶可以与来自以下的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)：枯草芽孢杆菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(参见GenBank登记号CAA44858.1,SEQ ID NO:13)或诺卡氏菌属NRRL 5646磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(参见GenBank登记号ABI83656.1,SEQ ID NO:14)。参见图6。
例如，本发明所述的醇脱氢酶可以与来自以下的仲醇脱氢酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)：藤黄微球菌(Genbank登记号ADD83022.1；SEQ IDNO:19)。参见图6。
例如，本发明所述的单加氧酶可以与以下氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)：巨大芽孢杆菌单加氧酶(参见GenBank登记号AAA87602.1,SEQ ID NO:18)、戈登氏菌属TY-5丙酮单加氧酶(参见GenBank登记号BAF43791.1,SEQ ID NO:20)和迪茨氏菌属单加氧酶(参见GenBank登记号AGY78320.1,SEQ ID NO:21)。参见图6。
例如，本发明所述的酯酶可以与以下氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)：荧光假单胞菌羧基酯酶(Genbank登记号AAB60168；SEQ ID NO:22)。参见图6。
例如，本发明所述的脱羧酶可以与以下氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)：鼠伤寒沙门氏杆菌脱羧酶(Genbank登记号CAC48239.1；SEQ ID NO:23)。参见图6。
两个氨基酸序列之间的同一性(同源性)百分比可以如下确定。首先，使用来自单机版BLASTZ的BLAST 2Sequence(Bl2seq)程序比对氨基酸序列，所述单机版BLASTZ含有BLASTP 2.0.14版本。BLASTZ的这一单机版可以从Fish&Richardson的网站(例如www.fr.com/blast/)或者美国政府的National Center for Biotechnology Information网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上获得。解释如何使用Bl2seq程序的说明可以在BLASTZ随附的自述文件中找到。Bl2seq使用BLASTP算法进行两个氨基酸序列之间的比较。为了比较两个氨基酸序列，Bl2seq的选项如下设定：-i设置为含有待比较的第一个氨基酸序列的文件(例如C:\seq1.txt)；-j设置为含有待比较的第二个氨基酸序列的文件(例如C:\seq2.txt)；-p设置为blastp；-o设置为任意所需的文件名(例如C:\output.txt)；所有其它选项保留其默认设置。例如，以下命令可以用于生成含有两个氨基酸序列之间比较的输出文件：C:\Bl2seq–i c:\seq1.txt–j c:\seq2.txt–p blastp–o c:\output.txt。如果两个比较的序列共有同源性(同一性)，则指定的输出文件将呈现那些同源区域作为比对序列。如果两个比较序列不具有同源性(同一性)，则指定的输出文件将不呈现比对序列。除了使用blastn外，可以遵循类似的程序用于核酸序列。
一旦比对后，匹配的数量通过计数两个序列中都出现的相同氨基酸残基位置的数量来确定。百分比同一性(同源性)通过将匹配的数量除以多肽氨基酸序列全长的长度，接着将所得值乘以一百来确定。应当注意百分比同一性(同源性)值四舍五入到最近的十分位。例如，78.11、78.12、78.13和78.14舍到78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19入到78.2。还应当注意所述长度值总是整数。
应当理解若干核酸可以编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码子的简并是本领域公知的，即对于许多氨基酸，存在多于一种核苷酸三联体作为该氨基酸的密码子。例如，可以使用对于该物种适合的密码子偏好表修饰所给酶的编码序列中的密码子，来得到在特定物种(例如细菌或真菌)中的最优表达。
本发明所述的任意酶的功能片段也可以用于本申请的方法。术语“功能片段”在本发明中用于指代蛋白的肽片段，其具有相应成熟、全长、野生型蛋白的至少25％(例如至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、95％、98％、99％、100％；或甚至超过100％)的活性。所述功能片段通常可以是，但不总是由蛋白的连续区域组成，其中所述区域具有功能活性。
本申请还提供(i)用于本申请方法的酶的功能变体和(ii)上文所述功能片段的功能变体。酶和功能片段的功能变体可以含有相对于对应野生型序列的增加、缺失或取代。带有取代的酶通常具有不多于50个(例如不多于一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、12、15、20、25、30、35、40或50)氨基酸取代(例如保守取代)。这适用于本发明所述的任意酶和功能片段。保守取代是一个氨基酸对具有相似特性的另一个氨基酸的取代。保守取代包括下组中的取代：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。非极性疏水氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。上述极性、碱性或酸性组中一个成员被同组另一个成员的任意取代认为是保守取代。相比之下，非保守取代是一个氨基酸对具有不相似特性的另一个氨基酸的取代。
缺失变体可以缺少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸片段(由两个或更多氨基酸组成)或非连续的单个氨基酸。增加(增加变体)包括含有下述项的融合蛋白：(a)本发明所述的任意酶或其片段；和(b)内部或末端(C或N)不相关或异源的氨基酸序列。在此类融合蛋白的语境中，术语“异源氨基酸序列”指代除了(a)以外的氨基酸序列。异源性序列可以是，例如，用于重组蛋白纯化的序列(例如FLAG、多聚组氨酸(例如六聚组氨酸)、血细胞凝集素(HA)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、或麦芽糖结合蛋白(MBP))。异源性序列也可以是作为可检测标记物有用的蛋白，例如萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。在一些实施方案中，所述融合蛋白含有来自于另一个蛋白的信号序列。在某些宿主细胞中(例如酵母宿主细胞)，目标蛋白的表达和/或分泌可以通过使用异源性信号序列增加。在一些实施方案中，所述融合蛋白可以含有载体(例如KLH)(例如在引起免疫应答抗体产生中有用)或ER或高尔基体驻留信号。异源性序列可以具有不同的长度，并在一些情况下可以是比该异源性序列所附着的全长目标蛋白更长的序列。
工程化宿主可以天然不表达或表达一些(例如一种或更多、两种或更多、三种或更多、四种或更多、五种或更多、或六种或更多)本发明所述途径的酶。因此，工程化宿主中的途径可以包括所有外源性的酶，或可以包括内源性和外源性酶。也可以扰乱工程化宿主的内源性基因来阻止不需要的代谢产物的形成，或通过作用于中间物的其它酶阻止所述途径中该中间物的流失。工程化的宿主可称为重组宿主或重组宿主细胞。如本发明所述重组宿主可以包括编码以下一种或多种物质的核酸：单加氧酶、酯酶、脱氢酶、脱羧酶、还原酶、酰胺水解酶、硫酯酶、酰化酶、N-乙酰转移酶或转氨酶，如本发明所述。
另外，可以使用本发明所述的分离的酶，使用来自于作为所述酶的来源的宿主微生物的裂解物(例如细胞裂解物)，或使用来自于作为所述酶的来源的不同宿主微生物的多种裂解物，在体外进行C6结构单元的生产。
本发明所述的途径的反应可以在一种或多种宿主菌株中进行，所述宿主菌株：(a)天然表达一种或多种相关酶，(b)遗传工程化以表达一种或多种相关酶或(c)天然表达一种或多种相关酶并被遗传工程化以表达一种或多种相关酶。或者，相关酶可以从上述类型的宿主细胞中分离、纯化或提取，并以纯化或半纯化的形式使用。此外，这些提取物包括裂解物(例如细胞裂解物)，其可以用作相关酶的来源。在文献提供的方法中，所有步骤都可以在宿主细胞中进行、所有步骤都可以使用提取的酶进行、或一些步骤可以在细胞中进行且其他步骤可以使用提取的酶进行。
生成6-羟基己酸的酶
如图1中所示，6-羟基己酸可使用硫酯酶(如，酰基-ACP硫酯酶或酰基-CoA硫酯酶)、两种不同的单加氧酶、仲醇脱氢酶和酯酶由辛酰基-[acp]或辛酰基-CoA生物合成。
如图1中所示，6-羟基己酸可使用脱羧酶和醛脱氢酶、两种不同的单加氧酶、仲醇脱氢酶和酯酶由2-氧代壬酸生物合成。
被归类于EC.3.1.2.-并对C8链长具有特异性且对于水解C8ACP-活化的脂肪酸具有高特异性的硫酯酶可用于将辛酰基-[acp]转化为辛酸。例如，该硫酯酶可与SEQ ID NO:1、15、16或17中示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。参见图1和图6。
被归类于EC 3.1.2.-(例如EC 3.1.2.20)且对于水解中链至长链的酰基-CoA具有特异性的硫酯酶可用于将辛酰基-CoA转化为辛酸。例如，该硫酯酶可与SEQ ID NO:1、15、16或17中示出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。参见图1和图6。
被归类于EC.4.1.1.-(如，EC 4.1.1.43或EC 4.1.1.74)的脱羧酶可用于将2-氧代壬酸转化为辛醛。例如，脱羧酶可与SEQ ID NO:23中示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。参见图1和图6。
被归类于EC.1.2.1.-(如，EC 1.2.1.3、EC 1.2.1.4、EC 1.2.1.5或EC 1.2.1.48)的醛脱氢酶可用于将辛醛转化为辛酸。
被归类于EC.1.1.1.-(如EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.B3、EC 1.1.1.B4或EC1.1.1.80)的醇脱氢酶(如，仲醇脱氢酶)可用于将7-羟基辛酸转化为7-氧代-辛酸。例如，与SEQ IDNO:19中示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的仲醇脱氢酶。
被归类于EC.1.14.14.1的单加氧酶用于将辛酸转化为7-羟基辛酸。例如，可使用与SEQ ID NO:18中示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的单加氧酶。在一些实施方案中，可使用在SEQ ID NO:18中具有一个或多个(如，2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12个)以下突变的多肽：V78A,H138Y,T175I,V178I,A184V,H236Q,E252G,R255S,A290V,A295T,L353V或A82L。该变体对于生成(ω-1)羟基C8脂族碳化合物具有高度选择性(Peters等，J.Am.Chem.Soc.,2003,125,13442–13450；Fasan等，J.Mol.Biol.,2008,383,1069–1080)。
被归类于EC.1.14.13.-的单加氧酶可用于将7-氧代-辛酸转化为6-乙酰氧基己酸。例如，可使用与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的单加氧酶(Bisagni等，AMB Express,2014,4,23)。
被归类于EC.3.1.1.-的酯酶如被归类于EC.3.1.1.1的羧基酯酶或被归类于EC.3.1.1.6的乙酰基酯酶可用于将6-乙酰氧基己酸转化为6-羟基己酸。例如，酯酶可为来自唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderia gladioli)或荧光假单胞菌的estC(SEQ ID NO:22)的基因产物。参见图1和图6。
在己二酸的生物合成中生成末端羧基的酶
如图2中所示，导致产生己二酸的末端羧基使用醛脱氢酶、琥珀酸-半醛脱氢酶、5-氧代戊酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶或单加氧酶通过酶形成。
在一些实施方案中，导致合成己二酸的第二末端羧基可在己二酸半醛中通过被归类于EC.1.2.1.3的醛脱氢酶通过酶合成(Guerrillot&Vandecasteele,Eur.J.Biochem.,1977,81,185–192)。参见图2。
在一些实施方案中，导致合成己二酸的第二末端羧基在己二酸半醛中通过EC.1.2.1.-通过酶合成，所述脱氢酶如：例如被归类为EC 1.2.1.20的戊二酸半醛脱氢酶(如CpnE的基因产物)、例如被归类为EC 1.2.1.63的6-氧代己酸脱氢酶(如来自不动杆菌属(Acinetobacter sp.)的ChnE的基因产物)或7-氧代庚酸脱氢酶(如来自Sphingomonasmacrogolitabida的ThnG的基因产物)(Iwaki等，Appl.Environ.Microbiol.,1999,65(11),5158–5162；等，Appl.Environ.Microbiol.,2010,76(1),110-118))。参见图2。
在一些实施方案中，导致合成己二酸的第二末端羧基在己二酸半醛中通过细胞色素P450家族中的单加氧酶如CYP4F3B通过酶合成(参见，如，Sanders等，J.Lipid Research,2005,46(5):1001-1008；Sanders等，The FASEB Journal,2008,22(6):2064–2071)。参见图2。
在六亚甲基二胺或6-氨基己酸的生物合成中生成末端氨基的酶
如图3和图4中所示，末端氨基可使用ω-转氨酶或脱酰基酶通过酶合成。
在一些实施方案中，导致合成6-氨基己酸的末端氨基在己二酸半醛中通过酶合成，其中通过使用：例如被归类为EC 2.6.1.-(如EC 2.6.1.18、EC2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82)的ω-转氨酶，如获自紫色色杆菌(Genbank登记号AAQ59697.1，SEQ ID NO:7)、铜绿假单胞菌(Genbank登记号AAG08191.1，SEQ ID NO:8)、丁香假单胞菌(Genbank登记号AAY39893.1，SEQ ID NO:9)、球形红杆菌(Genbank登记号ABA81135.1，SEQ ID NO:10)、河流弧菌(Genbank登记号AEA39183.1，SEQ ID NO:12)、灰色链霉菌或Clostridium viride的那些。例如被归类为EC 2.6.1.29或EC2.6.1.82的ω-转氨酶中的一些为二胺ω-转氨酶(如，SEQ ID NO:11)。参见图3。
来自紫色色杆菌的可逆ω-转氨酶(Genbank登记号AAQ59697.1,SEQ ID NO:7)已经显示了接受6-氨基己酸作为氨基供体的类似活性，因此在己二酸半醛中形成第一末端氨基(Kaulmann等，Enzyme and Microbial Technology,2007,41,628–637)。
来自灰色链霉菌的可逆4-氨基丁酸:2-氧代戊二酸转氨酶已经显示了将6-氨基己酸转化为己二酸半醛的活性(Yonaha等，Eur.J.Biochem.,1985,146,101-106)。
来自Clostridium viride可逆的5-氨基戊酸转氨酶已经显示了将6-氨基己酸转化为己二酸半醛的活性(Barker等，J.Biol.Chem.,1987,262(19),8994–9003)。
在一些实施方案中，导致合成六亚甲基二胺的第二末端氨基在6-氨基己醛中通过酶合成，其通过：例如被归类为EC 2.6.1.29或例如被归类为EC2.6.1.82的二胺转氨酶，如来自大肠杆菌的YgjG的基因产物(Genbank登记号AAA57874.1,SEQ ID NO:11)。SEQ ID NO:7-10和12中示出的转氨酶也可用来产生六亚甲基二胺。参见图4。
ygjG的基因产物接受宽范围的二胺碳链长度的底物，如腐胺、尸胺和精脒(Samsonova等，BMC Microbiology,2003,3:2)。
来自大肠杆菌菌株B的二胺转氨酶已显示了对1,7-二氨基庚烷的活性(Kim,TheJournal of Chemistry,1964,239(3),783–786)。
在一些实施方案中，导致合成六亚甲基二胺的第二末端氨基在N6-乙酰基-1,6-二氨基己烷中通过酶合成，其通过例如被归类为EC 3.5.1.17的脱酰基酶，如酰基赖氨酸脱酰基酶。
在1,6-己二醇的生物合成中生成末端羟基的酶
如图5所示，末端羟基可使用醇脱氢酶通过酶合成。例如，导致合成1,6-己二醇的第二末端羟基可在6-羟基己醛中通过酶合成，其中使用被归类于EC.1.1.1.-(如，EC1.1.1.1、1.1.1.2、1.1.1.21或1.1.1.184)的醇脱氢酶，如YMR318C或YqhD的基因产物(Liu等，Microbiology,2009,155,2078–2085；Larroy等，2002,Biochem J.,361(Pt 1),163–172；Jarboe,2011,Appl.Microbiol.Biotechnol.,89(2),249-257)；或Genbank登记号为CAA81612.1的蛋白质。
生物化学途径
通向6-羟基己酸的途径
在一些实施方案中，由中心代谢物辛酰基-[acp]通过以下步骤合成6-羟基己酸：使用被归类于EC.3.1.2.-的硫酯酶(如，SEQ ID NO:1、22、23或24)将辛酰基-[acp]转化为辛酸；随后使用被归类于EC.1.14.14.1的单加氧酶(如，SEQ ID NO:18)将辛酸转化为7-羟基辛酸；随后使用被归类于EC.1.1.1.-(如EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.B3、EC 1.1.1.B4或EC1.1.1.80)的仲醇脱氢酶(如，SEQ ID NO:19)将7-羟基辛酸转化为7-氧代-辛酸；随后使用被归类于EC.1.14.13.-(如EC 1.14.13.-)的单加氧酶(如，SEQ ID NO:20或21)将7-氧代-辛酸转化为6-乙酰氧基己酸；随后使用被归类于EC.3.1.1.-(如EC 3.1.1.1或EC 3.1.1.3)的酯酶(如，SEQ ID NO:22)将6-乙酰氧基己酸转化为6-羟基己酸。参见图1。
在一些实施方案中，由中心代谢物辛酰基-CoA通过以下步骤合成6-羟基己酸：通过被归类于EC.3.1.2.-(如，EC 3.1.2.20)的硫酯酶将辛酰基-CoA转化为辛酸；随后如上所述将辛酸转化为6-羟基己酸。参见图1。
在一些实施方案中，由中心代谢物2-氧代壬酸通过以下步骤合成6-羟基己酸：通过例如被归类为EC 4.1.1.43或EC 4.1.1.74的脱羧酶将2-氧代壬酸转化为辛醛；随后通过例如被归类为EC 1.2.1.-(如，EC 1.2.1.3、EC 1.2.1.4、EC 1.2.1.5或EC 1.2.1.48)的醛脱氢酶将辛醛转化为辛酸；随后如上所述将辛酸转化为6-羟基己酸。参见图1。
使用6-羟基己酸作为中心前体通向己二酸的途径
在一些实施方案中，通过以下步骤由6-羟基己酸合成己二酸：将6-羟基己酸转化为己二酸半醛，其中使用：被归类于EC.1.1.1.-的醇脱氢酶，如YMR318C的基因产物(例如被归类为EC 1.1.1.2,参见GenBank登记号CAA90836.1)(Larroy等，2002,Biochem J.,361(Pt1),163–172)、cpnD的基因产物(Iwaki等，2002,Appl.Environ.Microbiol.,68(11):5671–5684)或gabD的基因产物(Lütke-Eversloh&Steinbüchel,1999,FEMS MicrobiologyLetters,181(1):63–71)；或例如被归类为EC 1.1.1.258的6-羟基己酸脱氢酶如ChnD的基因产物(Iwaki等，Appl.Environ.Microbiol.,1999,65(11):5158-5162)；随后将己二酸半醛转化为己二酸，其中使用：例如被归类为EC 1.2.1.-的脱氢酶，如7-氧代庚酸脱氢酶(如，ThnG的基因产物)、6-氧代己酸脱氢酶(如，ChnE的基因产物)、例如被归类为EC 1.2.1.20的戊二酸半醛脱氢酶、5-氧代戊酸脱氢酶如CpnE的基因产物或被归类于EC.1.2.1.3的醛脱氢酶。参见图2。由YMR318C编码的醇脱氢酶具有宽的底物特异性，包括氧化C6醇。
在一些实施方案中，由中心前体6-羟基己酸通过以下步骤合成己二酸：通过细胞色素P450将6-羟基己酸转化为己二酸半醛(Sanders等，J.Lipid Research,2005,46(5),1001-1008；Sanders等，The FASEB Journal,2008,22(6),2064–2071)；随后通过细胞色素P450家族中的单加氧酶如CYP4F3B将己二酸半醛转化为己二酸。参见图2。
使用6-羟基己酸作为中心前体通向6-氨基己酸和ε-己内酰胺的途径
在一些实施方案中，由中心前体6-羟基己酸通过以下步骤合成6-氨基己酸：将6-羟基己酸转化为己二酸半醛，其中使用：例如被归类为EC 1.1.1.2的醇脱氢酶如YMR318C的基因产物、例如被归类为EC 1.1.1.258的6-羟基己酸脱氢酶、例如被归类为EC 1.1.1.-的5-羟基戊酸脱氢酶如cpnD的基因产物或例如被归类为EC 1.1.1.-的4-羟基丁酸脱氢酶如gabD的基因产物；随后通过ω-转氨酶(EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC2.6.1.48或EC2.6.1.82，如SEQ ID NO:7-10或12中之一，见上)将己二酸半醛转化为6-氨基己酸。参见图3。
在一些实施方案中，由中心前体6-羟基己酸通过以下步骤合成ε-己内酰胺：将6-羟基己酸转化为己二酸半醛，其中使用：例如被归类为EC 1.1.1.2的醇脱氢酶如YMR318C的基因产物、例如被归类为EC 1.1.1.258的6-羟基己酸脱氢酶、例如被归类为EC 1.1.1.-的5-羟基戊酸脱氢酶如cpnD的基因产物或例如被归类为EC 1.1.1.-的4-羟基丁酸脱氢酶如gabD的基因产物；随后通过ω-转氨酶(EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC2.6.1.48或EC2.6.1.82)将己二酸半醛转化为6-氨基己酸；随后通过酰胺水解酶(EC3.5.2.-)将6-氨基己酸转化为ε-己内酰胺。参见图3。
在一些实施方案中，通过以上最后一个步骤(即通过使用酰胺水解酶如EC.3.5.2.-中的一种来转化)由中心前体6-氨基己酸合成ε-己内酰胺。参见图3。
使用6-氨基己酸、6-羟基己酸、己二酸半醛或1,6-己二醇作为中心前体通向六亚甲基二胺的途径
在一些实施方案中，通过以下步骤由中心前体6-氨基己酸合成六亚甲基二胺：将6-氨基己酸转化为6-氨基己醛，其中使用例如被归类为EC1.2.99.6的羧酸还原酶如car的基因产物结合磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强子(如，由来自枯草芽孢杆菌的基因sfp或来自诺卡氏菌属的基因npt编码)或来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的GriC和GriD的基因产物(Suzuki等，J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)；随后通过ω-转氨酶(如，EC2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.48、EC 2.6.1.82如SEQ ID NO:7-12)将6-氨基己醛转化为六亚甲基二胺。可获得来自以下的羧酸还原酶，例如，海分枝杆菌(Genbank登记号ACC40567.1，SEQ ID NO:2)、耻垢分枝杆菌(Genbank登记号ABK71854.1，SEQ ID NO:3)、Segniliparus rugosus(Genbank登记号EFV11917.1，SEQ ID NO:4)、马赛分枝杆菌(Mycobacterium massiliense)(Genbank登记号EIV11143.1，SEQ ID NO:5)、或Segniliparus rotundus(Genbank登记号ADG98140.1，SEQ ID NO:6)。参见图4。
由car的基因产物和增强子npt或sfp编码的羧酸还原酶具有宽的底物特异性，包括末端双官能团的C4和C5羧酸(Venkitasubramanian等，Enzyme and MicrobialTechnology,2008,42,130–137)。
在一些实施方案中，通过以下步骤由中心前体6-羟基己酸(其可如图1中所述产生)合成六亚甲基二胺：将6-羟基己酸转化为6-羟基己醛，其中使用例如被归类为EC1.2.99.6的羧酸还原酶如car的基因产物(见上)组合磷酸泛酰巯基乙胺转移增强子(如，由来自枯草芽孢杆菌的基因sfp或来自诺卡氏菌属的基因npt编码)或GriC&GriD的基因产物(Suzuki等，2007,见上)；随后通过例如被归类为EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82的ω-转氨酶如SEQ ID NOs:7-12(见上)将6-氨基己醛转化为6-氨基己醇；随后转化为7-氨基庚醛，通过例如被归类为EC 1.1.1.-(如，EC1.1.1.1、EC1.1.1.2、EC 1.1.1.21或EC 1.1.1.184)的醇脱氢酶如YMR318C或YqhD的基因产物(Liu等，Microbiology,2009,155,2078–2085；Larroy等，2002,Biochem J.,361(Pt 1),163–172；Jarboe,2011,Appl.Microbiol.Biotechnol.,89(2),249-257)或Genbank登记号为CAA81612.1的蛋白；随后转化为七亚甲基二胺，通过例如被归类为EC 2.6.1.18、EC2.6.1.19、EC2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82的ω-转氨酶如SEQ ID NO:7-12，见上。参见图4。
在一些实施方案中，通过以下步骤由中心前体6-氨基己酸合成六亚甲基二胺：将6-氨基己酸转化为N6-乙酰基-6-氨基己酸，通过例如被归类为EC 2.3.1.32的N-乙酰转移酶如赖氨酸N-乙酰转移酶；随后转化为N6-乙酰基-6-氨基己醛，通过例如被归类为EC1.2.99.6的羧酸还原酶如car的基因产物(见上,如，SEQ ID NO:4、5或6)组合磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强子(如，由来自枯草芽孢杆菌的基因sfp或来自诺卡氏菌属的基因npt编码)或GriC&GriD的基因产物；随后转化为N6-乙酰基-1,6-二氨基己烷，通过例如被归类为EC2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82的ω-转氨酶，如SEQ IDNO:7-12，见上；随后转化为七亚甲基二胺，通过例如被归类为EC 3.5.1.17的酰基赖氨酸脱酰基酶。参见图4。
在一些实施方案中，通过以下步骤由中心前体己二酸半醛合成六亚甲基二胺：将己二酸半醛转化为己二醛，通过例如被归类为EC 1.2.99.6的羧酸还原酶如car的基因产物(见上，如，SEQ ID NO:6)组合磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强子(如，由来自枯草芽孢杆菌的基因sfp或来自诺卡氏菌属的基因npt编码)或GriC&GriD的基因产物；随后转化为6-氨基己醛，通过例如被归类为EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC2.6.1.82的ω-转氨酶；随后转化为六亚甲基二胺，通过例如被归类为EC 2.6.1.18、EC2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82的ω-转氨酶如SEQ ID NO:7-12。参见图4。
在一些实施方案中，通过以下步骤由1,6-己二醇合成六亚甲基二胺：将1,6-己二醇转化为6-羟基己醛，使用例如被归类为EC 1.1.1.-(如，EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2、EC1.1.1.21或EC 1.1.1.184)的醇脱氢酶如YMR318C或YqhD的基因产物、或Genbank登记号为CAA81612.1的蛋白；随后转化为6-氨基己醇，通过例如被归类为EC 2.6.1.18、EC2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82的ω-转氨酶如SEQ ID NO:7-12；随后转化为6-氨基己醛，通过例如被归类为EC 1.1.1.-(如，EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2、EC1.1.1.21或EC1.1.1.184)的醇脱氢酶如YMR318C或YqhD的基因产物或Genbank登记号为CAA81612.1的蛋白；随后转化为六亚甲基二胺，通过例如被归类为EC2.6.1.18、EC2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82的ω-转氨酶如SEQ ID NO:7-12。参见图4。
使用6-羟基己酸作为中心前体通向1,6-己二醇的途径
在一些实施方案中，通过以下步骤由中心前体6-羟基己酸合成1,6-己二醇：将6-羟基己酸转化为6-羟基己醛，通过例如被归类为EC 1.2.99.6的羧酸还原酶如car的基因产物(见上，如，SEQ ID NO:2,3,4,5或6)组合磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强子(如，由来自枯草芽孢杆菌的基因sfp或来自诺卡氏菌属的基因npt编码)或来自灰色链霉菌的GriC和GriD的基因产物(Suzuki等，J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)；随后将6-羟基己醛转化为1,6-己二醇，通过醇脱氢酶(例如被归类为EC 1.1.1.-，如EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2、EC1.1.1.21或EC 1.1.1.184)，如YMR318C或YqhD(来自大肠杆菌，GenBank登记号AAA69178.1)的基因产物(参见，如，Liu等，Microbiology,2009,155,2078–2085；Larroy等，2002,Biochem J.,361(Pt 1),163–172；或Jarboe,2011,Appl.Microbiol.Biotechnol.,89(2),249-257)或Genbank登记号为CAA81612.1的蛋白(来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus))。参见图5。
培养策略
在一些实施方案中，使用厌氧、需氧或微需氧的培养条件在重组宿主中生物合成一个或多个C6结构单元。可使用非周期性或周期性培养策略以实现所需的培养条件。例如，可使用非周期性策略以实现厌氧、需氧或微需氧的培养条件。
在一些实施方案中，可使用周期性培养策略以在厌氧培养条件和需氧培养条件之间改变。
在一些实施方案中，所述培养策略需要营养限制，例如氮、磷酸盐或氧限制。
在一些实施方案中，可以采用使用例如陶瓷中空纤维膜的细胞保留策略来实现并维持在进料分批或连续发酵期间的高细胞密度。
在一些实施方案中，在一种或多种C6结构单元合成中对发酵进料的主要碳源可以源自生物或非生物给料。
在一些实施方案中，生物给料可以是或者可以源自单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩的酒糟可溶物或城市废物。
已经在几种微生物(诸如大肠杆菌、钩虫贪铜菌、食油假单胞菌、恶臭假单胞菌和解脂耶罗维亚酵母)中证明了源自生物柴油生产的粗制甘油的有效分解代谢(Lee等,Appl.Biochem.Biotechnol.,2012,166:1801–1813；Yang等,Biotechnology forBiofuels,2012,5:13；Meijnen等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,90:885-893)。
已经在几种生物体(诸如钩虫贪铜菌和恶臭假单胞菌)中在经由前体丙酰基-CoA合成3-羟基戊酸中证明了木质纤维素衍生的乙酰丙酸的有效分解代谢(Jaremko和Yu,2011,见上；Martin和Prather,J.Biotechnol.,2009,139,61–67)。
已经在几种微生物(诸如恶臭假单胞菌、钩虫贪铜菌)中证明了木质素衍生的芳香族化合物诸如苯甲酸类似物的有效分解代谢(Bugg等,Current Opinion inBiotechnology,2011,22,394–400；Pérez-Pantoja等,FEMS Microbiol.Rev.,2008,32,736–794)。
已经在几种微生物(包括解脂耶罗维亚酵母)中证明了农业废物(诸如橄榄磨坊废水)的有效利用(Papanikolaou等,Bioresour.Technol.,2008,99(7),2419-2428)。
已经对几种微生物(诸如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌和德氏乳杆菌和乳酸乳球菌)证明了可发酵糖类(诸如源自纤维素、半纤维素、甘蔗和甜菜糖蜜、木薯、玉米和其它农业来源的单糖和二糖)的有效利用(参见例如Hermann等,J.Biotechnol.,2003,104:155–172；Wee等,Food Technol.Biotechnol.,2006,44(2):163–172；Ohashi等,J.Bioscience andBioengineering,1999,87(5):647-654)。
已经对钩虫贪铜菌证明了源自多种农业木质纤维素来源的糠醛的有效利用(Li等,Biodegradation,2011,22:1215–1225)。
在一些实施方案中，非生物给料可以是或者可以源自天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸、来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物(NVR)或碱洗废物流、或对苯二甲酸/异酞酸混合物废物流。
已经对甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母证明了甲醇的有效分解代谢。
已经对克鲁佛梭菌证明了乙醇的有效分解代谢(Seedorf等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2008,105(6)2128-2133)。
已经对钩虫贪铜菌证明了CO2和H2(其可以源自天然气和其它化学和石油化学来源)的有效分解代谢(Prybylski等,Energy,Sustainability and Society,2012,2:11)。
已经对多种微生物(诸如杨氏梭菌和自产乙醇梭菌)证明了合成气的有效分解代谢(等,Applied and Environmental Microbiology,2011,77(15):5467–5475)。
已经对多种微生物(诸如食酸代尔夫特菌和钩虫贪铜菌)证明了来自环己烷过程的非挥发性残留物废物流的有效分解代谢(Ramsay等,Applied and EnvironmentalMicrobiology,1986,52(1):152–156)。
在一些实施方案中，宿主微生物是原核生物。例如，原核生物可以是来自以下的细菌：埃希氏菌属如大肠杆菌；梭菌属如杨氏梭菌、自产乙醇梭菌或者克鲁佛梭菌；棒状杆菌属如谷氨酸棒状杆菌；贪铜菌属如钩虫贪铜菌或者耐金属贪铜菌；假单胞菌属如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌或者食油假单胞菌；代尔夫特菌属如食酸代尔夫特菌；芽孢杆菌属如枯草芽胞杆菌；乳杆菌属如德氏乳杆菌；或者乳球菌属如乳酸乳球菌。此类原核生物也可以是构建能够生成一种或多种C7结构单元的本发明中描述的重组宿主细胞的基因来源。
在一些实施方案中，宿主微生物是真核生物。例如，真核生物可以是丝状真菌，例如来自曲霉属如黑曲霉的。或者，真核生物可以是酵母，例如来自酵母属如酿酒酵母；来自毕赤氏酵母属如巴斯德毕赤酵母；来自耶罗维亚酵母属如解脂耶罗维亚酵母；来自伊萨酵母属如东方伊萨酵母；来自德巴利酵母属如汉逊德巴利酵母；来自Arxula属如Arxulaadenoinivorans；或者来自克鲁维酵母菌属如乳酸克鲁维酵母。此类真核生物也可以是构建能够生成一种或多种C6结构单元的本发明中描述的重组宿主细胞的基因来源。
代谢工程
本发明文件提供方法，所述方法牵涉对所有上述途径描述的少于所有的步骤。这种方法可牵涉例如此类步骤中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或者更多个。在这种方法包含少于所有步骤的情况下，第一个且在一些实施方案中唯一的步骤可为所列步骤中的任何步骤。
此外，本发明中描述的重组宿主可以包括上述酶中的任何组合，使得所述步骤中的一个或者多个，例如此类步骤中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多个可以在重组宿主内实施。本发明文件提供所列出的和基因工程化以表达本发明文件中列举的任何酶的一种或者多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或者更多种)重组形式的任何属和种的宿主细胞。如此，例如，宿主细胞可含有外源核酸，其编码催化本发明中描述的任何途径的一个或者多个步骤的酶。
另外，本发明文件认识到，在酶已经被描述为接受CoA活化的底物的情况下，存在与[acp]结合底物相关的相似的酶活性，其不一定为相同的酶种类。
此外，本发明文件认识到，在酶已经被描述为接受底物的(R)-对映异构体的情况下，存在与底物的(S)-对映异构体相关的相似的酶活性，其不一定为相同的酶种类。
本发明文件还认识到，在已经显示酶接受特定辅因子如NADPH或者共底物如乙酰基-CoA的情况下，许多酶在催化特定酶活性中在接受大量不同辅因子或者共底物方面是泛宿主性的(promiscuous)。此外，本发明文件认识到，在酶对例如特定辅因子如NADH具有高特异性的情况下，对辅因子NADPH具有高特异性的具有相似或者相同活性的酶可为不同的酶种类。
在一些实施方案中，本发明中概述的途径中的酶是经由非直接或者合理酶设计方法的酶工程的结果，目的在于改善活性、改善特异性、降低反馈抑制、降低阻抑、改善酶溶解度、改变立体特异性，或者改变辅因子特异性。
在一些实施方案中，可以将本发明概述的途径中的酶经由附加型或者染色体整合方法基因给予(即，过表达)至所得的遗传修饰的生物体中。
在一些实施方案中，可以利用基因组级别(genome-scale)系统生物学技术如通量平衡分析来设计用于将碳流量引导至C6结构单元的基因组级别的弱化或者敲除策略。
弱化策略包括但不限于使用转座子、同源重组(双交叉方法)、诱变、酶抑制剂和RNAi干扰。
在一些实施方案中，可以利用通量组(fluxomic)、代谢物组(metabolomic)和转录物组(transcriptomal)数据来告知或者支持基因组级别的系统生物学技术，由此在将碳流量导向C6结构单元中设计基因组级别的弱化或者敲除策略。
在一些实施方案中，宿主微生物的对高浓度的C6结构单元的耐受性可以通过在选择性环境中的连续培养来改善。
在一些实施方案中，可以弱化或增强所述宿主微生物的内源性生物化学网络，来(1)保证乙酰-CoA或丙二酰-[acp]的细胞内可用度，(2)创造NADH或NADPH的不平衡，其仅可以通过一种或多种C6结构单元的形成来平衡，(3)阻止通向和包括一种或多种C6结构单元的中心代谢物、中心前体的降解，和/或(4)保证从细胞的高效流出。
在一些要求乙酰-CoA或丙二酰-[acp]的细胞内可用度用于C6结构单元的合成的实施方案中，可以在宿主生物体中弱化催化乙酰-CoA水解的内源性酶，例如短链长度硫酯酶。
在一些要求乙酰-CoA的细胞内可用度用于C6结构单元的合成的实施方案中，可以弱化产生乙酸的内源性磷酸转乙酰酶，例如pta(Shen等，Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9):2905–2915)。
在一些要求乙酰-CoA的细胞内可用度用于C6结构单元的合成的实施方案中，可以弱化乙酸合成途径中编码乙酸激酶的内源性基因，例如ack。
在一些要求乙酰-CoA和NADH的细胞内可用度用于C6结构单元的合成的实施方案中，可以弱化编码催化丙酮酸降解为乳酸的酶的内源性基因，例如由ldhA编码的乳酸脱氢酶(Shen等，2011,见上文)。
在一些要求乙酰-CoA和NADH的细胞内可用度用于C6结构单元的合成的实施方案中，可以弱化编码催化磷酸烯醇丙酮酸降解为琥珀酸的酶，例如甲基萘醌-延胡索酸氧化还原酶例如frdBC的基因(见Shen等，2011,见上文)。
在一些要求乙酰-CoA和NADH的细胞内可用度用于C6结构单元的合成的实施方案中，可以弱化编码催化乙酰-CoA降解为乙醇的酶的内源性基因，例如由adhE编码的醇脱氢酶(Shen等，2011,见上文)。
在一些实施方案中，在途径需要过量的NADH辅因子用于C6结构单元合成的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组甲酸脱氢酶基因(Shen等，2011,见上文)。
在一些实施方案中，在途径需要过量的NADH辅因子用于C7结构单元合成的情况下，可以弱化重组的消耗NADH的转氢酶。
在一些实施方案中，可以弱化编码催化丙酮酸降解为乙醇的酶的内源性基因，例如丙酮酸脱羧酶。
在一些实施方案中，可以弱化编码催化异丁醇的生成的酶的内源性基因，例如2-酮酸脱羧酶。
在一些要求乙酰-CoA的细胞内可用度用于C6结构单元的合成的实施方案中，可以在微生物中过表达重组乙酰-CoA合成酶，例如acs的基因产物(Satoh等，J.Bioscience andBioengineering,2003,95(4):335–341)。
在一些实施方案中，通过弱化内源性葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)，可以将碳通量导入戊糖磷酸循环中，来增加NADPH的供给。
在一些实施方案中，通过过表达6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和/或转酮醇酶，可以将碳通量重新导入戊糖磷酸循环中，来增加NADPH的供给(Lee等，2003,BiotechnologyProgress,19(5),1444–1449)。
在一些实施方案中，在C6结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达编码吡啶核苷酸转氢酶的基因例如UdhA(Brigham等，AdvancedBiofuels and Bioproducts,2012,Chapter 39,1065-1090)。
在一些实施方案中，在C6结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因，例如GapN(Brigham等，2012,见上文)。
在一些实施方案中，在C6结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组苹果酸酶基因，例如maeA或maeB(Brigham等，2012,见上文)。
在一些实施方案中，在C6结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因，例如zwf(Lim等，J.Bioscience and Bioengineering,2002,93(6),543-549)。
在一些实施方案中，在C6结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组果糖1,6-二磷酸酶基因，例如fbp(Becker等，J.Biotechnol.,2007,132:99-109)。
在一些实施方案中，在C6结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以弱化内源性磷酸丙糖异构酶(EC 5.3.1.1)。
在一些实施方案中，在C6结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组葡萄糖脱氢酶，例如gdh的基因产物(Satoh等，J.Bioscience and Bioengineering,2003,95(4):335–341)。
在一些实施方案中，可以弱化促进NADPH转化为NADH的内源性酶，例如可通过归类于EC 1.4.1.2(NADH特异性)和EC 1.4.1.4(NADPH特异性)下的谷氨酸脱氢酶的相互转化产生的NADH生成循环。
在一些实施方案中，可以弱化使用NADH和NADPH两者作为辅因子的内源性谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.3)。
在一些实施方案中，可通过仅表达细胞溶质结构域而不表达将P450锚向内质网的N-末端区，来使膜结合的细胞色素P450如CYP4F3B溶解(Scheller等人，J.Biol.Chem.,1994,269(17):12779-12783)。
在一些实施方案中，可以通过与小的可溶蛋白例如麦芽糖结合蛋白一同表达为融合蛋白，来使烯酰-CoA还原酶溶解(Gloerich等，FEBS Letters,2006,580,2092–2096)。
在一些使用天然积累聚羟基链烷酸酯的宿主的实施方案中，在所述宿主菌株中可以弱化内源性聚合物合酶。
在一些实施方案中，可以在宿主中过表达L-丙氨酸脱氢酶，来从丙酮酸再生L-丙氨酸，作为ω-转氨酶反应的氨基供体。
在一些实施方案中，可以在宿主中过表达L-谷氨酸脱氢酶、L-谷氨酰胺合酶或L-谷氨酸合酶，来从2-氧代戊二酸再生L-谷氨酸，作为ω-转氨酶反应的氨基供体。
在一些实施方案中，可以弱化降解通向和包括C6结构单元的中心代谢物和中心前体的酶，例如归类于EC 1.3.8.62下的庚二酰-CoA脱氢酶；归类于例如EC 1.3.8.7、EC1.3.8.1或EC 1.3.99.-下的酰基-CoA脱氢酶；和/或归类于例如EC 1.3.8.6下的丁酰-CoA脱氢酶。
在一些实施方案中，可以弱化通过辅酶A酯化激活C6结构单元的内源性酶，例如归类于，例如EC 6.2.1.-下的CoA-连接酶(例如庚二酰-CoA合成酶)。
在一些实施方案中，C6结构单元穿过细胞膜流出到细胞外基质可以通过对细胞膜遗传工程化结构修饰，或增加与C6结构单元相关的任意转运体的活性来提高或放大。
在一些实施方案中，分类为例如EC 6.2.1.6中的特定戊二酸CoA连接酶可以在宿主生物体中过表达，以支持通过戊二酸的C5脂族化合物的副产物形成的降解。
在一些实施方案中，特定的5-羟基戊酸和5-氧代戊酸的脱氢酶可以在宿主生物体中过表达，以支持通过戊二酸的C5脂族化合物的副产物形成的降解。
在一些实施方案中，可以在宿主生物体中过表达丙酸CoA连接酶，以支持通过丙酰-CoA的C3脂族化合物的副产物形成的降解。
六亚甲基二胺的流出可以通过过表达广泛底物范围多药物转运体来提高或放大，例如来自枯草芽孢杆菌的Blt(Woolridge等，1997,J.Biol.Chem.,272(14):8864–8866)；来自大肠杆菌的AcrB和AcrD(Elkins&Nikaido,2002,J.Bacteriol.,184(23),6490–6499)或来自金黄色酿脓葡萄球菌的NorA(Ng等，1994,Antimicrob Agents Chemother,38(6),1345–1355)或来自枯草芽孢杆菌的Bmr(Neyfakh,1992,Antimicrob Agents Chemother,36(2),484–485)。
6-氨基己酸和庚二胺的流出可以通过过表达可溶性转运体来提高或放大，例如来自于谷氨酸棒状杆菌的lysE转运体(Bellmann等，2001,Microbiology,147,1765–1774)。
己二酸的流出可以通过过表达二羧酸转运体来提高或放大，例如来自于谷氨酸棒状杆菌的SucE转运体(Huhn等，Appl.Microbiol.&Biotech.,89(2),327–335)。
使用重组宿主生产C6结构单元
通常，可以通过提供宿主微生物并且用含有如上文描述的合适碳源的培养基培养提供的微生物生成一种或多种C6结构单元。一般地，培养基和/或培养条件可以使得微生物生长至足够的密度，并且有效生成C6结构单元。对于大规模生产工艺，可以使用任何方法，诸如那些在别处描述的(Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology,2ndEdition,Editors:A.L.Demain and J.E.Davies,ASM Press；and Principles ofFermentation Technology,P.F.Stanbury and A.Whitaker,Pergamon)。简言之，用特定的微生物接种含有合适培养基的大罐(例如，100加仑，200加仑，500加仑，或更大的罐)。在接种后，温育微生物以容许生成生物量。一旦达到期望的生物量，可以将含有微生物的培养液转移到第二个罐。此第二个罐可以是任何大小。例如，第二个罐可以比/与第一个罐大、小或相同大小。通常，第二个罐大于第一个，从而可以对来自第一个罐的培养液添加额外的培养基。另外，此第二个罐内的培养基可以与第一个罐中使用的培养基相同或不同。
一旦转移，可以温育微生物以容许生成C6结构单元。一旦生成，可以使用任何方法来分离C6结构单元。例如，可以经由吸附方法从发酵液选择性回收C6结构单元。在己二酸和6-氨基庚酸的情况中，所得的洗脱液可以经由蒸发进一步浓缩，经由蒸发和/或冷却结晶来结晶，并且经由离心回收晶体。在六亚甲基二胺和1,6-己二醇的情况中，可以采用蒸馏来实现期望的产物纯度。
本发明在以下实施例中进一步描述，所述实施例不限制权利要求书中描述的本发明范围。
实施例
实施例1
使用己二酸半醛作为底物并且形成6-氨基己酸的ω-转氨酶的酶活性
将编码His标签的核苷酸序列添加至分别编码SEQ ID NO:7、8、9、10和12的ω-转氨酶的来自紫色色杆菌、铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、球形红杆菌和河流弧菌的核酸序列(参见图6)，使得可以产生N-末端有HIS标签的ω-转氨酶。将每种所得的经修饰基因在T7启动子的控制下克隆入pET21a表达载体中，并且将每种表达载体转化入BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。于37℃在含有50mL LB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶培养物中在以230rpm摇动的情况中培养所得的重组大肠杆菌菌株。使用1mM IPTG于16℃诱导每种培养物过夜。
经由离心收获来自每种经诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每个团粒，并经由超声处理裂解。经由离心分开细胞碎片与上清液，并且立即在酶活性测定法中使用无细胞提取物。
在缓冲液中实施逆向(即6-氨基己酸至己二酸半醛)的酶活性测定法，所述缓冲液由终浓度50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)、10mM 6-氨基己酸、10mM丙酮酸和100μM吡哆(pyridoxyl)5’磷酸盐组成。通过添加ω-转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物到含有6-氨基己酸的测定缓冲液启动每个酶活性测定反应，并在以250rpm摇动的情况下于25℃温育24小时。经由RP-HPLC量化从丙酮酸形成L-丙氨酸。
每种没有6-氨基庚酸的仅酶对照表明丙酮酸至L-丙氨酸的低基线转化。参见图11。SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 12的基因产物接受6-氨基己酸作为底物，如相对于空载体对照确认的。参见图12。
对SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 12的转氨酶确认正向(即己二酸半醛至6-氨基己酸)的酶反应。在缓冲液中实施酶活性测定法，所述缓冲液由终浓度50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)、10mM己二酸半醛、10mM L-丙氨酸和100μM吡哆5’磷酸盐组成。通过添加ω-转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物到含有己二酸半醛的测定缓冲液启动每个酶活性测定反应，并在以250rpm摇动的情况下于25℃温育4小时。经由RP-HPLC量化丙酮酸的形成。
SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO12的基因产物接受己二酸半醛作为底物，如相对于空载体对照确认的。参见图13。确认ω-转氨酶活性的可逆性，证明了SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、和SEQ ID NO12的ω-转氨酶接受己二酸半醛作为底物，并且合成6-氨基己酸作为反应产物。
实施例2
羧酸还原酶使用6-羟基己酸作为底物并形成6-羟基己醛的酶活性
将编码His标签的核苷酸序列添加至分别编码SEQ ID NO:2-6的羧酸还原酶的来自海分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、Segniliparus rugosus、马赛分枝杆菌、和Segniliparus rotundus的核酸序列(参见图6)，使得可以生成N-末端有HIS标签的羧酸还原酶。将每种经修饰的基因与编码有His标签的来自枯草芽孢杆菌的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的sfp基因一起(两者都在T7启动子的控制下)克隆入pET Duet表达载体中。将每种表达载体与实施例3中的表达载体一起转化入BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。于37℃在含有50mL LB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶培养物中在以230rpm摇动的情况中培养所得的每种重组大肠杆菌菌株。使用自身诱导培养基于37℃诱导每种培养物过夜。
经由离心收获来自每种经诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每个团粒，并经由超声处理裂解。经由离心分开细胞碎片与上清液。使用Ni-亲和层析从上清液中纯化羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，以10倍稀释入50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)中，并经由超滤浓缩。
在缓冲液中一式三份实施酶活性测定法(即从6-羟基己酸至6-羟基己醛)，所述缓冲液由终浓度50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)、2mM 6-羟基己醛、10mM MgCl2、1mM ATP和1mMNADPH组成。通过添加纯化的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶或空载体对照至含有6-羟基己酸的测定缓冲液启动每个酶活性测定反应，然后于室温温育20分钟。通过于340nm的吸光度监测NADPH的消耗。每种没有6-羟基己酸的仅酶对照表明NADPH的低基线消耗。参见图7。
SEQ ID NO 2-6的基因产物(得到sfp的基因产物增强)接受6-羟基己酸作为底物，如相对于空载体对照确认的(参见图8)，并且合成6-羟基己醛。
实施例3
ω-转氨酶对于6-氨基己醇形成6-氧代己醇的酶活性
将编码N-末端His标签的核苷酸序列添加至分别编码SEQ ID NO:7-12的ω-转氨酶的紫色色杆菌、铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、球形红杆菌、大肠杆菌和河流弧菌核酸序列(参见图6)，使得可以产生N-末端有HIS标签的ω-转氨酶。将经修饰基因在T7启动子的控制下克隆入pET21a表达载体中。将每种表达载体转化入BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。于37℃在含有50mL LB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶培养物中在以230rpm摇动的情况中培养每种所得的重组大肠杆菌菌株。使用1mM IPTG于16℃诱导每种培养物过夜。
经由离心收获来自每种经诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每个团粒，并经由超声处理裂解。经由离心分开细胞碎片与上清液，并且立即在酶活性测定法中使用无细胞提取物。
在缓冲液中实施逆向(即6-氨基己醇至6-氧代己醇)的酶活性测定法，所述缓冲液由终浓度50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)、10mM 6-氨基己醇、10mM丙酮酸和100μM吡哆5’磷酸盐组成。通过添加ω-转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物到含有6-氨基己醇的测定缓冲液启动每个酶活性测定反应，并在以250rpm摇动的情况下于25℃温育4小时。经由RP-HPLC量化L-丙氨酸形成。
每种没有6-氨基己醇的仅酶对照具有丙酮酸至L-丙氨酸的低基线转化。参见图11。
SEQ ID NO 7-12的基因产物接受6-氨基己醇作为底物，如相对于空载体对照确认的(参见图16)，并且合成6-氧代己醇作为反应产物。鉴于ω-转氨酶活性的可逆性(参见实施例1)，可以推断SEQ ID 7-12的基因产物接受6-氧代己醇作为底物，并且形成6-氨基己醇。
实施例4
ω-转氨酶使用六亚甲基二胺作为底物并形成6-氨基己醛的酶活性
将编码N-末端His标签的核苷酸序列添加至分别编码SEQ ID NO:7–12的ω-转氨酶的紫色色杆菌、铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、球形红杆菌、大肠杆菌、和河流弧菌核酸序列(参见图6)，使得可以产生N-末端有HIS标签的ω-转氨酶。将经修饰基因在T7启动子的控制下克隆入pET21a表达载体中。将每种表达载体转化入BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。于37℃在含有50mL LB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶培养物中在以230rpm摇动的情况中培养每种所得的重组大肠杆菌菌株。使用1mM IPTG于16℃诱导每种培养物过夜。
经由离心收获来自每种经诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每个团粒，并经由超声处理裂解。经由离心分开细胞碎片与上清液，并且立即在酶活性测定法中使用无细胞提取物。
在缓冲液中实施逆向(即六亚甲基二胺至6-氨基己醛)的酶活性测定法，所述缓冲液由终浓度50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)、10mM七亚甲基二胺、10mM丙酮酸和100μM吡哆5’磷酸盐组成。通过添加ω-转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物到含有六亚甲基二胺的测定缓冲液启动每个酶活性测定反应，并在以250rpm摇动的情况下于25℃温育4小时。经由RP-HPLC量化L-丙氨酸形成。
每种没有六亚甲基二胺的仅酶对照具有丙酮酸至L-丙氨酸的低基线转化。参见图11。
SEQ ID NO 7–12的基因产物接受六亚甲基二胺作为底物，如相对于空载体对照确认的，并且合成6-氨基己醛作为反应产物。鉴于ω-转氨酶活性的可逆性(参见实施例1)，可以推断SEQ ID 7–12的基因产物接受6-氨基己醛作为底物，并且形成六亚甲基二胺。
实施例5
羧酸还原酶对于N6-乙酰基-6-氨基己酸形成N6-乙酰基-6-氨基己醛的酶活性
一式三份在缓冲液中测定用于将N6-乙酰基-6-氨基己酸转化成N6-乙酰基-6-氨基己醛的N末端有His标签的SEQ ID NO:4-6的每一羧酸还原酶的活性(参见实施例2，及图6)，所述缓冲液由终浓度50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)、2mM N6-乙酰基-6-氨基己酸、10mMMgCl2、1mM ATP、和1mM NADPH组成。通过添加纯化的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶或空载体对照至含有N6-乙酰基-6-氨基己酸的测定缓冲液启动测定法，然后于室温温育20分钟。通过于340nm的吸光度监测NADPH的消耗。每种没有N6-乙酰基-6-氨基己酸的仅酶对照表明NADPH的低基线消耗。参见图7。
SEQ ID NO 4-6的基因产物(其得到sfp的基因产物增强)接受N6-乙酰基-6-氨基己酸作为底物，如相对于空载体对照确认的(参见图9)，并且合成N6-乙酰基-6-氨基己醛。
实施例6
ω-转氨酶使用N6-乙酰基-1,6-二氨基己烷并形成N6-乙酰基-6-氨基己醛的酶活性
在缓冲液中测定用于将N6-乙酰基-1,6-二氨基己烷转化成N6-乙酰基-6-氨基己醛的N末端有His标签的SEQ ID NO:7-12的ω-转氨酶的活性(参见实施例4，及图6)，所述缓冲液由终浓度50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)、10mM N6-乙酰基-1,6-二氨基己烷、10mM丙酮酸和100μM吡哆5’磷酸盐组成。通过添加ω-转氨酶或空载体对照的无细胞提取物至含有N6-乙酰基-1,6-二氨基己烷的测定缓冲液启动每种酶活性测定反应，然后在以250rpm摇动的情况中于25℃温育4小时。经由RP-HPLC量化L-丙氨酸的形成。
每种没有N6-乙酰基-1,6-二氨基己烷的仅酶对照表明丙酮酸至L-丙氨酸的低基线转化。参见图11。
SEQ ID NO:7–12的基因产物接受N6-乙酰基-1,6-二氨基己烷作为底物，如相对于空载体对照确认的(参见图15)，并且合成N6-乙酰基-6-氨基己醛作为反应产物。
鉴于ω-转氨酶活性的可逆性(参见实施例1)，SEQ ID NO:7-12的基因产物接受N6-乙酰基-6-氨基己醛作为底物，形成N6-乙酰基-1,6-二氨基己烷。
实施例7
羧酸还原酶使用己二酸半醛作为底物并形成己二醛的酶活性
使用己二酸半醛作为底物测定N-末端有His标签的SEQ ID NO 6的羧酸还原酶(参见实施例2和图6)。一式三份在缓冲液中实施酶活性测定法，所述缓冲液由终浓度50mMHEPES缓冲液(pH＝7.5)、2mM己二酸半醛、10mM MgCl2、1mM ATP、和1mM NADPH组成。通过添加纯化的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶或空载体对照至含有己二酸半醛的测定缓冲液启动酶活性测定反应，然后于室温温育20分钟。通过于340nm的吸光度监测NADPH的消耗。没有己二酸半醛的仅酶对照表明NADPH的低基线消耗。参见图7。
SEQ ID NO 6的基因产物(其得到sfp的基因产物增强)接受己二酸半醛作为底物，如相对于空载体对照确认的(参见图10)，并且合成己二醛。
其它实施例
应理解的是，尽管协同发明的具体描述描述了本发明，但是前面的描述意图说明并且不限制发明的范围，发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和修改也在权利要求的范围内。
序列表
<110> 英威达技术有限责任公司
<120> 由8碳化合物生产6碳单体的方法
<130> 35643-0077WO1
<150> US 62/085,089
<151> 2014-11-26
<160> 23
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 247
<212> PRT
<213> 多形拟杆菌
<400> 1
Met Ser Glu Glu Asn Lys Ile Gly Thr Tyr Gln Phe Val Ala Glu Pro
1 5 10 15
Phe His Val Asp Phe Asn Gly Arg Leu Thr Met Gly Val Leu Gly Asn
20 25 30
His Leu Leu Asn Cys Ala Gly Phe His Ala Ser Asp Arg Gly Phe Gly
35 40 45
Ile Ala Thr Leu Asn Glu Asp Asn Tyr Thr Trp Val Leu Ser Arg Leu
50 55 60
Ala Ile Glu Leu Asp Glu Met Pro Tyr Gln Tyr Glu Lys Phe Ser Val
65 70 75 80
Gln Thr Trp Val Glu Asn Val Tyr Arg Leu Phe Thr Asp Arg Asn Phe
85 90 95
Ala Val Ile Asp Lys Asp Gly Lys Lys Ile Gly Tyr Ala Arg Ser Val
100 105 110
Trp Ala Met Ile Asn Leu Asn Thr Arg Lys Pro Ala Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Leu His Gly Gly Ser Ile Val Asp Tyr Ile Cys Asp Glu Pro Cys Pro
130 135 140
Ile Glu Lys Pro Ser Arg Ile Lys Val Thr Ser Asn Gln Pro Val Ala
145 150 155 160
Thr Leu Thr Ala Lys Tyr Ser Asp Ile Asp Ile Asn Gly His Val Asn
165 170 175
Ser Ile Arg Tyr Ile Glu His Ile Leu Asp Leu Phe Pro Ile Glu Leu
180 185 190
Tyr Gln Thr Lys Arg Ile Arg Arg Phe Glu Met Ala Tyr Val Ala Glu
195 200 205
Ser Tyr Phe Gly Asp Glu Leu Ser Phe Phe Cys Asp Glu Val Ser Glu
210 215 220
Asn Glu Phe His Val Glu Val Lys Lys Asn Gly Ser Glu Val Val Cys
225 230 235 240
Arg Ser Lys Val Ile Phe Glu
245
<210> 2
<211> 1174
<212> PRT
<213> 海分枝杆菌
<400> 2
Met Ser Pro Ile Thr Arg Glu Glu Arg Leu Glu Arg Arg Ile Gln Asp
1 5 10 15
Leu Tyr Ala Asn Asp Pro Gln Phe Ala Ala Ala Lys Pro Ala Thr Ala
20 25 30
Ile Thr Ala Ala Ile Glu Arg Pro Gly Leu Pro Leu Pro Gln Ile Ile
35 40 45
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50 55 60
Ser Val Glu Phe Val Thr Asp Ala Gly Thr Gly His Thr Thr Leu Arg
65 70 75 80
Leu Leu Pro His Phe Glu Thr Ile Ser Tyr Gly Glu Leu Trp Asp Arg
85 90 95
Ile Ser Ala Leu Ala Asp Val Leu Ser Thr Glu Gln Thr Val Lys Pro
100 105 110
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115 120 125
Ile Asp Met Thr Leu Ala Arg Leu Gly Ala Val Ala Val Pro Leu Gln
130 135 140
Thr Ser Ala Ala Ile Thr Gln Leu Gln Pro Ile Val Ala Glu Thr Gln
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Pro Thr Met Ile Ala Ala Ser Val Asp Ala Leu Ala Asp Ala Thr Glu
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180 185 190
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Phe Trp Arg Lys Arg Thr Trp Phe Glu Gly Gly Tyr Glu Pro Ser Ile
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Asp Leu Ser Thr Leu Phe Glu Asp Leu Ala Leu Val Arg Pro Thr Glu
325 330 335
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Ser Glu Val Asp Arg Arg Leu Val Asp Gly Ala Asp Arg Val Ala Leu
355 360 365
Glu Ala Gln Val Lys Ala Glu Ile Arg Asn Asp Val Leu Gly Gly Arg
370 375 380
Tyr Thr Ser Ala Leu Thr Gly Ser Ala Pro Ile Ser Asp Glu Met Lys
385 390 395 400
Ala Trp Val Glu Glu Leu Leu Asp Met His Leu Val Glu Gly Tyr Gly
405 410 415
Ser Thr Glu Ala Gly Met Ile Leu Ile Asp Gly Ala Ile Arg Arg Pro
420 425 430
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435 440 445
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485 490 495
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Arg Ala Tyr Leu Leu Ala Val Ile Val Pro Thr Gln Glu Ala Leu Asp
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Ala Val Pro Val Glu Glu Leu Lys Ala Arg Leu Gly Asp Ser Leu Gln
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Glu Val Ala Lys Ala Ala Gly Leu Gln Ser Tyr Glu Ile Pro Arg Asp
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Phe Ile Ile Glu Thr Thr Pro Trp Thr Leu Glu Asn Gly Leu Leu Thr
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Gly Ile Arg Lys Leu Ala Arg Pro Gln Leu Lys Lys His Tyr Gly Glu
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Leu Leu Glu Gln Ile Tyr Thr Asp Leu Ala His Gly Gln Ala Asp Glu
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Leu Arg Ser Leu Arg Gln Ser Gly Ala Asp Ala Pro Val Leu Val Thr
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Val Cys Arg Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Ser Ala Ser Asp Val
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Leu Ser Phe Thr Asn Leu Leu His Glu Ile Phe Asp Ile Glu Val Pro
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Val Gly Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Asp Leu Gln Ala Leu Ala Asp
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Ser Val His Gly Ala Ser Asn Gly Gln Val Thr Glu Val His Ala Gly
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<212> PRT
<213> 耻垢分枝杆菌
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<213> 脓肿分枝杆菌博氏亚种
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675 680 685
Gly Asp Ser Leu Ser Ala Leu Ser Phe Ser Asp Leu Leu Arg Asp Ile
690 695 700
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Leu Gly Gly Val Ala Lys Phe Val Asp Glu Gln Arg His Ser Gly Gly
725 730 735
Thr Arg Pro Thr Ala Glu Thr Val His Gly Ala Gly His Thr Glu Ile
740 745 750
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Ala Tyr Val Asp Pro Thr Thr Phe Asp Glu Glu Ser Asp Ile Arg Leu
930 935 940
Ile Ser Ala Val Arg Pro Ile Asp Asp Gly Tyr Ala Asn Gly Tyr Gly
945 950 955 960
Asn Ala Lys Trp Ala Gly Glu Val Leu Leu Arg Glu Ala His Asp Leu
965 970 975
Cys Gly Leu Pro Val Ala Val Phe Arg Ser Asp Met Ile Leu Ala His
980 985 990
Ser Arg Tyr Thr Gly Gln Leu Asn Val Pro Asp Gln Phe Thr Arg Leu
995 1000 1005
Ile Leu Ser Leu Ile Ala Thr Gly Ile Ala Pro Gly Ser Phe Tyr Gln
1010 1015 1020
Ala Gln Thr Thr Gly Glu Arg Pro Leu Ala His Tyr Asp Gly Leu Pro
1025 1030 1035 1040
Gly Asp Phe Thr Ala Glu Ala Ile Thr Thr Leu Gly Thr Gln Val Pro
1045 1050 1055
Glu Gly Ser Glu Gly Phe Val Thr Tyr Asp Cys Val Asn Pro His Ala
1060 1065 1070
Asp Gly Ile Ser Leu Asp Asn Phe Val Asp Trp Leu Ile Glu Ala Gly
1075 1080 1085
Tyr Pro Ile Ala Arg Ile Asp Asn Tyr Thr Glu Trp Phe Thr Arg Phe
1090 1095 1100
Asp Thr Ala Ile Arg Gly Leu Ser Glu Lys Gln Lys Gln His Ser Leu
1105 1110 1115 1120
Leu Pro Leu Leu His Ala Phe Glu Gln Pro Ser Ala Ala Glu Asn His
1125 1130 1135
Gly Val Val Pro Ala Lys Arg Phe Gln His Ala Val Gln Ala Ala Gly
1140 1145 1150
Ile Gly Pro Val Gly Gln Asp Gly Thr Thr Asp Ile Pro His Leu Ser
1155 1160 1165
Arg Arg Leu Ile Val Lys Tyr Ala Lys Asp Leu Glu Gln Leu Gly Leu
1170 1175 1180
Leu
1185
<210> 6
<211> 1186
<212> PRT
<213> Segniliparus rotundus
<400> 6
Met Thr Gln Ser His Thr Gln Gly Pro Gln Ala Ser Ala Ala His Ser
1 5 10 15
Arg Leu Ala Arg Arg Ala Ala Glu Leu Leu Ala Thr Asp Pro Gln Ala
20 25 30
Ala Ala Thr Leu Pro Asp Pro Glu Val Val Arg Gln Ala Thr Arg Pro
35 40 45
Gly Leu Arg Leu Ala Glu Arg Val Asp Ala Ile Leu Ser Gly Tyr Ala
50 55 60
Asp Arg Pro Ala Leu Gly Gln Arg Ser Phe Gln Thr Val Lys Asp Pro
65 70 75 80
Ile Thr Gly Arg Ser Ser Val Glu Leu Leu Pro Thr Phe Asp Thr Ile
85 90 95
Thr Tyr Arg Glu Leu Arg Glu Arg Ala Thr Ala Ile Ala Ser Asp Leu
100 105 110
Ala His His Pro Gln Ala Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Leu Ala Ser
115 120 125
Ile Gly Phe Ile Ser Val Asp Tyr Val Ala Ile Asp Ile Ala Gly Val
130 135 140
Phe Ala Gly Leu Thr Ala Val Pro Leu Gln Thr Gly Ala Thr Leu Ala
145 150 155 160
Thr Leu Thr Ala Ile Thr Ala Glu Thr Ala Pro Thr Leu Phe Ala Ala
165 170 175
Ser Ile Glu His Leu Pro Thr Ala Val Asp Ala Val Leu Ala Thr Pro
180 185 190
Ser Val Arg Arg Leu Leu Val Phe Asp Tyr Arg Ala Gly Ser Asp Glu
195 200 205
Asp Arg Glu Ala Val Glu Ala Ala Lys Arg Lys Ile Ala Asp Ala Gly
210 215 220
Ser Ser Val Leu Val Asp Val Leu Asp Glu Val Ile Ala Arg Gly Lys
225 230 235 240
Ser Ala Pro Lys Ala Pro Leu Pro Pro Ala Thr Asp Ala Gly Asp Asp
245 250 255
Ser Leu Ser Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Thr Pro Lys
260 265 270
Gly Ala Met Tyr Pro Glu Arg Asn Val Ala His Phe Trp Gly Gly Val
275 280 285
Trp Ala Ala Ala Phe Asp Glu Asp Ala Ala Pro Pro Val Pro Ala Ile
290 295 300
Asn Ile Thr Phe Leu Pro Leu Ser His Val Ala Ser Arg Leu Ser Leu
305 310 315 320
Met Pro Thr Leu Ala Arg Gly Gly Leu Met His Phe Val Ala Lys Ser
325 330 335
Asp Leu Ser Thr Leu Phe Glu Asp Leu Lys Leu Ala Arg Pro Thr Asn
340 345 350
Leu Phe Leu Val Pro Arg Val Val Glu Met Leu Tyr Gln His Tyr Gln
355 360 365
Ser Glu Leu Asp Arg Arg Gly Val Gln Asp Gly Thr Arg Glu Ala Glu
370 375 380
Ala Val Lys Asp Asp Leu Arg Thr Gly Leu Leu Gly Gly Arg Ile Leu
385 390 395 400
Thr Ala Gly Phe Gly Ser Ala Pro Leu Ser Ala Glu Leu Ala Gly Phe
405 410 415
Ile Glu Ser Leu Leu Gln Ile His Leu Val Asp Gly Tyr Gly Ser Thr
420 425 430
Glu Ala Gly Pro Val Trp Arg Asp Gly Tyr Leu Val Lys Pro Pro Val
435 440 445
Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Asp Val Pro Glu Leu Gly Tyr Phe Ser Thr
450 455 460
Asp Ser Pro His Pro Arg Gly Glu Leu Ala Ile Lys Thr Gln Thr Ile
465 470 475 480
Leu Pro Gly Tyr Tyr Lys Arg Pro Glu Thr Thr Ala Glu Val Phe Asp
485 490 495
Glu Asp Gly Phe Tyr Leu Thr Gly Asp Val Val Ala Gln Ile Gly Pro
500 505 510
Glu Gln Phe Ala Tyr Val Asp Arg Arg Lys Asn Val Leu Lys Leu Ser
515 520 525
Gln Gly Glu Phe Val Thr Leu Ala Lys Leu Glu Ala Ala Tyr Ser Ser
530 535 540
Ser Pro Leu Val Arg Gln Leu Phe Val Tyr Gly Ser Ser Glu Arg Ser
545 550 555 560
Tyr Leu Leu Ala Val Ile Val Pro Thr Pro Asp Ala Leu Lys Lys Phe
565 570 575
Gly Val Gly Glu Ala Ala Lys Ala Ala Leu Gly Glu Ser Leu Gln Lys
580 585 590
Ile Ala Arg Asp Glu Gly Leu Gln Ser Tyr Glu Val Pro Arg Asp Phe
595 600 605
Ile Ile Glu Thr Asp Pro Phe Thr Val Glu Asn Gly Leu Leu Ser Asp
610 615 620
Ala Arg Lys Ser Leu Arg Pro Lys Leu Lys Glu His Tyr Gly Glu Arg
625 630 635 640
Leu Glu Ala Met Tyr Lys Glu Leu Ala Asp Gly Gln Ala Asn Glu Leu
645 650 655
Arg Asp Ile Arg Arg Gly Val Gln Gln Arg Pro Thr Leu Glu Thr Val
660 665 670
Arg Arg Ala Ala Ala Ala Met Leu Gly Ala Ser Ala Ala Glu Ile Lys
675 680 685
Pro Asp Ala His Phe Thr Asp Leu Gly Gly Asp Ser Leu Ser Ala Leu
690 695 700
Thr Phe Ser Asn Phe Leu His Asp Leu Phe Glu Val Asp Val Pro Val
705 710 715 720
Gly Val Ile Val Ser Ala Ala Asn Thr Leu Gly Ser Val Ala Glu His
725 730 735
Ile Asp Ala Gln Leu Ala Gly Gly Arg Ala Arg Pro Thr Phe Ala Thr
740 745 750
Val His Gly Lys Gly Ser Thr Thr Ile Lys Ala Ser Asp Leu Thr Leu
755 760 765
Asp Lys Phe Ile Asp Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys His Leu Pro
770 775 780
Lys Pro Ala Asp Pro Pro Arg Thr Val Leu Leu Thr Gly Ala Asn Gly
785 790 795 800
Trp Leu Gly Arg Phe Leu Ala Leu Glu Trp Leu Glu Arg Leu Ala Pro
805 810 815
Ala Gly Gly Lys Leu Ile Thr Ile Val Arg Gly Lys Asp Ala Ala Gln
820 825 830
Ala Lys Ala Arg Leu Asp Ala Ala Tyr Glu Ser Gly Asp Pro Lys Leu
835 840 845
Ala Gly His Tyr Gln Asp Leu Ala Ala Thr Thr Leu Glu Val Leu Ala
850 855 860
Gly Asp Phe Ser Glu Pro Arg Leu Gly Leu Asp Glu Ala Thr Trp Asn
865 870 875 880
Arg Leu Ala Asp Glu Val Asp Phe Ile Ser His Pro Gly Ala Leu Val
885 890 895
Asn His Val Leu Pro Tyr Asn Gln Leu Phe Gly Pro Asn Val Ala Gly
900 905 910
Val Ala Glu Ile Ile Lys Leu Ala Ile Thr Thr Arg Ile Lys Pro Val
915 920 925
Thr Tyr Leu Ser Thr Val Ala Val Ala Ala Gly Val Glu Pro Ser Ala
930 935 940
Leu Asp Glu Asp Gly Asp Ile Arg Thr Val Ser Ala Glu Arg Ser Val
945 950 955 960
Asp Glu Gly Tyr Ala Asn Gly Tyr Gly Asn Ser Lys Trp Gly Gly Glu
965 970 975
Val Leu Leu Arg Glu Ala His Asp Arg Thr Gly Leu Pro Val Arg Val
980 985 990
Phe Arg Ser Asp Met Ile Leu Ala His Gln Lys Tyr Thr Gly Gln Val
995 1000 1005
Asn Ala Thr Asp Gln Phe Thr Arg Leu Val Gln Ser Leu Leu Ala Thr
1010 1015 1020
Gly Leu Ala Pro Lys Ser Phe Tyr Glu Leu Asp Ala Gln Gly Asn Arg
1025 1030 1035 1040
Gln Arg Ala His Tyr Asp Gly Ile Pro Val Asp Phe Thr Ala Glu Ser
1045 1050 1055
Ile Thr Thr Leu Gly Gly Asp Gly Leu Glu Gly Tyr Arg Ser Tyr Asn
1060 1065 1070
Val Phe Asn Pro His Arg Asp Gly Val Gly Leu Asp Glu Phe Val Asp
1075 1080 1085
Trp Leu Ile Glu Ala Gly His Pro Ile Thr Arg Ile Asp Asp Tyr Asp
1090 1095 1100
Gln Trp Leu Ser Arg Phe Glu Thr Ser Leu Arg Gly Leu Pro Glu Ser
1105 1110 1115 1120
Lys Arg Gln Ala Ser Val Leu Pro Leu Leu His Ala Phe Ala Arg Pro
1125 1130 1135
Gly Pro Ala Val Asp Gly Ser Pro Phe Arg Asn Thr Val Phe Arg Thr
1140 1145 1150
Asp Val Gln Lys Ala Lys Ile Gly Ala Glu His Asp Ile Pro His Leu
1155 1160 1165
Gly Lys Ala Leu Val Leu Lys Tyr Ala Asp Asp Ile Lys Gln Leu Gly
1170 1175 1180
Leu Leu
1185
<210> 7
<211> 459
<212> PRT
<213> 紫色色杆菌
<400> 7
Met Gln Lys Gln Arg Thr Thr Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala
1 5 10 15
His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly
20 25 30
Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser Glu
35 40 45
Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val
50 55 60
Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu
65 70 75 80
Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr Thr His Pro Ala Val
85 90 95
Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp
100 105 110
Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile
115 120 125
Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys
130 135 140
Thr Leu Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Ile Gly Gly
145 150 155 160
Ala Ser Leu Gly Gly Met Lys Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu Pro
165 170 175
Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly
180 185 190
Lys Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Val Ala Ala Arg Trp Leu
195 200 205
Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val
210 215 220
Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Ala Thr
225 230 235 240
Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu
245 250 255
Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe
260 265 270
Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys
275 280 285
Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys
290 295 300
Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe
305 310 315 320
Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val
325 330 335
Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile
340 345 350
Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu
355 360 365
His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Val Gln Ala Phe Thr Leu
370 375 380
Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile
385 390 395 400
Gly Thr Leu Cys Arg Asp Ile Phe Phe Arg Asn Asn Leu Ile Met Arg
405 410 415
Ala Cys Gly Asp His Ile Val Ser Ala Pro Pro Leu Val Met Thr Arg
420 425 430
Ala Glu Val Asp Glu Met Leu Ala Val Ala Glu Arg Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Phe Glu Gln Thr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Ala
450 455
<210> 8
<211> 468
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌
<400> 8
Met Asn Ala Arg Leu His Ala Thr Ser Pro Leu Gly Asp Ala Asp Leu
1 5 10 15
Val Arg Ala Asp Gln Ala His Tyr Met His Gly Tyr His Val Phe Asp
20 25 30
Asp His Arg Val Asn Gly Ser Leu Asn Ile Ala Ala Gly Asp Gly Ala
35 40 45
Tyr Ile Tyr Asp Thr Ala Gly Asn Arg Tyr Leu Asp Ala Val Gly Gly
50 55 60
Met Trp Cys Thr Asn Ile Gly Leu Gly Arg Glu Glu Met Ala Arg Thr
65 70 75 80
Val Ala Glu Gln Thr Arg Leu Leu Ala Tyr Ser Asn Pro Phe Cys Asp
85 90 95
Met Ala Asn Pro Arg Ala Ile Glu Leu Cys Arg Lys Leu Ala Glu Leu
100 105 110
Ala Pro Gly Asp Leu Asp His Val Phe Leu Thr Thr Gly Gly Ser Thr
115 120 125
Ala Val Asp Thr Ala Ile Arg Leu Met His Tyr Tyr Gln Asn Cys Arg
130 135 140
Gly Lys Arg Ala Lys Lys His Val Ile Thr Arg Ile Asn Ala Tyr His
145 150 155 160
Gly Ser Thr Phe Leu Gly Met Ser Leu Gly Gly Lys Ser Ala Asp Arg
165 170 175
Pro Ala Glu Phe Asp Phe Leu Asp Glu Arg Ile His His Leu Ala Cys
180 185 190
Pro Tyr Tyr Tyr Arg Ala Pro Glu Gly Leu Gly Glu Ala Glu Phe Leu
195 200 205
Asp Gly Leu Val Asp Glu Phe Glu Arg Lys Ile Leu Glu Leu Gly Ala
210 215 220
Asp Arg Val Gly Ala Phe Ile Ser Glu Pro Val Phe Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Val Ile Val Pro Pro Ala Gly Tyr His Arg Arg Met Trp Glu Leu Cys
245 250 255
Gln Arg Tyr Asp Val Leu Tyr Ile Ser Asp Glu Val Val Thr Ser Phe
260 265 270
Gly Arg Leu Gly His Phe Phe Ala Ser Gln Ala Val Phe Gly Val Gln
275 280 285
Pro Asp Ile Ile Leu Thr Ala Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Gln Pro
290 295 300
Leu Gly Ala Cys Ile Phe Ser Arg Arg Ile Trp Glu Val Ile Ala Glu
305 310 315 320
Pro Asp Lys Gly Arg Cys Phe Ser His Gly Phe Thr Tyr Ser Gly His
325 330 335
Pro Val Ala Cys Ala Ala Ala Leu Lys Asn Ile Glu Ile Ile Glu Arg
340 345 350
Glu Gly Leu Leu Ala His Ala Asp Glu Val Gly Arg Tyr Phe Glu Glu
355 360 365
Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asp Leu Pro Ile Val Gly Asp Val Arg Gly
370 375 380
Met Arg Phe Met Ala Cys Val Glu Phe Val Ala Asp Lys Ala Ser Lys
385 390 395 400
Ala Leu Phe Pro Glu Ser Leu Asn Ile Gly Glu Trp Val His Leu Arg
405 410 415
Ala Gln Lys Arg Gly Leu Leu Val Arg Pro Ile Val His Leu Asn Val
420 425 430
Met Ser Pro Pro Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Val Asp Thr Val Val
435 440 445
Arg Val Leu Arg Glu Ser Ile Glu Glu Thr Val Glu Asp Leu Val Arg
450 455 460
Ala Gly His Arg
465
<210> 9
<211> 454
<212> PRT
<213> 丁香假单胞菌
<400> 9
Met Ser Ala Asn Asn Pro Gln Thr Leu Glu Trp Gln Ala Leu Ser Ser
1 5 10 15
Glu His His Leu Ala Pro Phe Ser Asp Tyr Lys Gln Leu Lys Glu Lys
20 25 30
Gly Pro Arg Ile Ile Thr Arg Ala Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser
35 40 45
Glu Gly Asn Lys Ile Leu Asp Gly Met Ser Gly Leu Trp Cys Val Ala
50 55 60
Ile Gly Tyr Gly Arg Glu Glu Leu Ala Asp Ala Ala Ser Lys Gln Met
65 70 75 80
Arg Glu Leu Pro Tyr Tyr Asn Leu Phe Phe Gln Thr Ala His Pro Pro
85 90 95
Val Leu Glu Leu Ala Lys Ala Ile Ser Asp Ile Ala Pro Glu Gly Met
100 105 110
Asn His Val Phe Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glu Gly Asn Asp Thr Met
115 120 125
Leu Arg Met Val Arg His Tyr Trp Ala Leu Lys Gly Gln Pro Asn Lys
130 135 140
Lys Thr Ile Ile Ser Arg Val Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Val Ala
145 150 155 160
Gly Ala Ser Leu Gly Gly Met Thr Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu
165 170 175
Pro Ile Pro Gly Val Val His Ile Pro Gln Pro Tyr Trp Phe Gly Glu
180 185 190
Gly Gly Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Ile Trp Ala Ala Glu Gln
195 200 205
Leu Glu Lys Lys Ile Leu Glu Leu Gly Val Glu Asn Val Gly Ala Phe
210 215 220
Ile Ala Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Asp
225 230 235 240
Ser Tyr Trp Pro Lys Ile Lys Glu Ile Leu Ser Arg Tyr Asp Ile Leu
245 250 255
Phe Ala Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Ser Glu Trp
260 265 270
Phe Gly Ser Asp Phe Tyr Gly Leu Arg Pro Asp Met Met Thr Ile Ala
275 280 285
Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Val Pro Met Gly Gly Leu Ile Val Arg
290 295 300
Asp Glu Ile Val Ala Val Leu Asn Glu Gly Gly Asp Phe Asn His Gly
305 310 315 320
Phe Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu Glu Asn
325 330 335
Ile Arg Ile Leu Arg Glu Glu Lys Ile Val Glu Arg Val Arg Ser Glu
340 345 350
Thr Ala Pro Tyr Leu Gln Lys Arg Leu Arg Glu Leu Ser Asp His Pro
355 360 365
Leu Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly Leu Leu Gly Ala Ile Glu Leu
370 375 380
Val Lys Asp Lys Thr Thr Arg Glu Arg Tyr Thr Asp Lys Gly Ala Gly
385 390 395 400
Met Ile Cys Arg Thr Phe Cys Phe Asp Asn Gly Leu Ile Met Arg Ala
405 410 415
Val Gly Asp Thr Met Ile Ile Ala Pro Pro Leu Val Ile Ser Phe Ala
420 425 430
Gln Ile Asp Glu Leu Val Glu Lys Ala Arg Thr Cys Leu Asp Leu Thr
435 440 445
Leu Ala Val Leu Gln Gly
450
<210> 10
<211> 467
<212> PRT
<213> 球形红杆菌
<400> 10
Met Thr Arg Asn Asp Ala Thr Asn Ala Ala Gly Ala Val Gly Ala Ala
1 5 10 15
Met Arg Asp His Ile Leu Leu Pro Ala Gln Glu Met Ala Lys Leu Gly
20 25 30
Lys Ser Ala Gln Pro Val Leu Thr His Ala Glu Gly Ile Tyr Val His
35 40 45
Thr Glu Asp Gly Arg Arg Leu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Met Trp Cys
50 55 60
Ala Gln Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Ile Val Asp Ala Met Ala His
65 70 75 80
Gln Ala Met Val Leu Pro Tyr Ala Ser Pro Trp Tyr Met Ala Thr Ser
85 90 95
Pro Ala Ala Arg Leu Ala Glu Lys Ile Ala Thr Leu Thr Pro Gly Asp
100 105 110
Leu Asn Arg Ile Phe Phe Thr Thr Gly Gly Ser Thr Ala Val Asp Ser
115 120 125
Ala Leu Arg Phe Ser Glu Phe Tyr Asn Asn Val Leu Gly Arg Pro Gln
130 135 140
Lys Lys Arg Ile Ile Val Arg Tyr Asp Gly Tyr His Gly Ser Thr Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ala Ala Cys Thr Gly Arg Thr Gly Asn Trp Pro Asn Phe Asp
165 170 175
Ile Ala Gln Asp Arg Ile Ser Phe Leu Ser Ser Pro Asn Pro Arg His
180 185 190
Ala Gly Asn Arg Ser Gln Glu Ala Phe Leu Asp Asp Leu Val Gln Glu
195 200 205
Phe Glu Asp Arg Ile Glu Ser Leu Gly Pro Asp Thr Ile Ala Ala Phe
210 215 220
Leu Ala Glu Pro Ile Leu Ala Ser Gly Gly Val Ile Ile Pro Pro Ala
225 230 235 240
Gly Tyr His Ala Arg Phe Lys Ala Ile Cys Glu Lys His Asp Ile Leu
245 250 255
Tyr Ile Ser Asp Glu Val Val Thr Gly Phe Gly Arg Cys Gly Glu Trp
260 265 270
Phe Ala Ser Glu Lys Val Phe Gly Val Val Pro Asp Ile Ile Thr Phe
275 280 285
Ala Lys Gly Val Thr Ser Gly Tyr Val Pro Leu Gly Gly Leu Ala Ile
290 295 300
Ser Glu Ala Val Leu Ala Arg Ile Ser Gly Glu Asn Ala Lys Gly Ser
305 310 315 320
Trp Phe Thr Asn Gly Tyr Thr Tyr Ser Asn Gln Pro Val Ala Cys Ala
325 330 335
Ala Ala Leu Ala Asn Ile Glu Leu Met Glu Arg Glu Gly Ile Val Asp
340 345 350
Gln Ala Arg Glu Met Ala Asp Tyr Phe Ala Ala Ala Leu Ala Ser Leu
355 360 365
Arg Asp Leu Pro Gly Val Ala Glu Thr Arg Ser Val Gly Leu Val Gly
370 375 380
Cys Val Gln Cys Leu Leu Asp Pro Thr Arg Ala Asp Gly Thr Ala Glu
385 390 395 400
Asp Lys Ala Phe Thr Leu Lys Ile Asp Glu Arg Cys Phe Glu Leu Gly
405 410 415
Leu Ile Val Arg Pro Leu Gly Asp Leu Cys Val Ile Ser Pro Pro Leu
420 425 430
Ile Ile Ser Arg Ala Gln Ile Asp Glu Met Val Ala Ile Met Arg Gln
435 440 445
Ala Ile Thr Glu Val Ser Ala Ala His Gly Leu Thr Ala Lys Glu Pro
450 455 460
Ala Ala Val
465
<210> 11
<211> 459
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 11
Met Asn Arg Leu Pro Ser Ser Ala Ser Ala Leu Ala Cys Ser Ala His
1 5 10 15
Ala Leu Asn Leu Ile Glu Lys Arg Thr Leu Asp His Glu Glu Met Lys
20 25 30
Ala Leu Asn Arg Glu Val Ile Glu Tyr Phe Lys Glu His Val Asn Pro
35 40 45
Gly Phe Leu Glu Tyr Arg Lys Ser Val Thr Ala Gly Gly Asp Tyr Gly
50 55 60
Ala Val Glu Trp Gln Ala Gly Ser Leu Asn Thr Leu Val Asp Thr Gln
65 70 75 80
Gly Gln Glu Phe Ile Asp Cys Leu Gly Gly Phe Gly Ile Phe Asn Val
85 90 95
Gly His Arg Asn Pro Val Val Val Ser Ala Val Gln Asn Gln Leu Ala
100 105 110
Lys Gln Pro Leu His Ser Gln Glu Leu Leu Asp Pro Leu Arg Ala Met
115 120 125
Leu Ala Lys Thr Leu Ala Ala Leu Thr Pro Gly Lys Leu Lys Tyr Ser
130 135 140
Phe Phe Cys Asn Ser Gly Thr Glu Ser Val Glu Ala Ala Leu Lys Leu
145 150 155 160
Ala Lys Ala Tyr Gln Ser Pro Arg Gly Lys Phe Thr Phe Ile Ala Thr
165 170 175
Ser Gly Ala Phe His Gly Lys Ser Leu Gly Ala Leu Ser Ala Thr Ala
180 185 190
Lys Ser Thr Phe Arg Lys Pro Phe Met Pro Leu Leu Pro Gly Phe Arg
195 200 205
His Val Pro Phe Gly Asn Ile Glu Ala Met Arg Thr Ala Leu Asn Glu
210 215 220
Cys Lys Lys Thr Gly Asp Asp Val Ala Ala Val Ile Leu Glu Pro Ile
225 230 235 240
Gln Gly Glu Gly Gly Val Ile Leu Pro Pro Pro Gly Tyr Leu Thr Ala
245 250 255
Val Arg Lys Leu Cys Asp Glu Phe Gly Ala Leu Met Ile Leu Asp Glu
260 265 270
Val Gln Thr Gly Met Gly Arg Thr Gly Lys Met Phe Ala Cys Glu His
275 280 285
Glu Asn Val Gln Pro Asp Ile Leu Cys Leu Ala Lys Ala Leu Gly Gly
290 295 300
Gly Val Met Pro Ile Gly Ala Thr Ile Ala Thr Glu Glu Val Phe Ser
305 310 315 320
Val Leu Phe Asp Asn Pro Phe Leu His Thr Thr Thr Phe Gly Gly Asn
325 330 335
Pro Leu Ala Cys Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ile Asn Val Leu Leu Glu
340 345 350
Gln Asn Leu Pro Ala Gln Ala Glu Gln Lys Gly Asp Met Leu Leu Asp
355 360 365
Gly Phe Arg Gln Leu Ala Arg Glu Tyr Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala
370 375 380
Arg Gly Lys Gly Met Leu Met Ala Ile Glu Phe Val Asp Asn Glu Ile
385 390 395 400
Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Glu Met Phe Arg Gln Arg Val Leu Val Ala
405 410 415
Gly Thr Leu Asn Asn Ala Lys Thr Ile Arg Ile Glu Pro Pro Leu Thr
420 425 430
Leu Thr Ile Glu Gln Cys Glu Leu Val Ile Lys Ala Ala Arg Lys Ala
435 440 445
Leu Ala Ala Met Arg Val Ser Val Glu Glu Ala
450 455
<210> 12
<211> 453
<212> PRT
<213> 河流弧菌
<400> 12
Met Asn Lys Pro Gln Ser Trp Glu Ala Arg Ala Glu Thr Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Gly Phe Thr Asp Met Pro Ser Leu His Gln Arg Gly Thr Val Val
20 25 30
Val Thr His Gly Glu Gly Pro Tyr Ile Val Asp Val Asn Gly Arg Arg
35 40 45
Tyr Leu Asp Ala Asn Ser Gly Leu Trp Asn Met Val Ala Gly Phe Asp
50 55 60
His Lys Gly Leu Ile Asp Ala Ala Lys Ala Gln Tyr Glu Arg Phe Pro
65 70 75 80
Gly Tyr His Ala Phe Phe Gly Arg Met Ser Asp Gln Thr Val Met Leu
85 90 95
Ser Glu Lys Leu Val Glu Val Ser Pro Phe Asp Ser Gly Arg Val Phe
100 105 110
Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Met Val Lys Met Leu
115 120 125
Trp Phe Leu His Ala Ala Glu Gly Lys Pro Gln Lys Arg Lys Ile Leu
130 135 140
Thr Arg Trp Asn Ala Tyr His Gly Val Thr Ala Val Ser Ala Ser Met
145 150 155 160
Thr Gly Lys Pro Tyr Asn Ser Val Phe Gly Leu Pro Leu Pro Gly Phe
165 170 175
Val His Leu Thr Cys Pro His Tyr Trp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Glu
180 185 190
Thr Glu Glu Gln Phe Val Ala Arg Leu Ala Arg Glu Leu Glu Glu Thr
195 200 205
Ile Gln Arg Glu Gly Ala Asp Thr Ile Ala Gly Phe Phe Ala Glu Pro
210 215 220
Val Met Gly Ala Gly Gly Val Ile Pro Pro Ala Lys Gly Tyr Phe Gln
225 230 235 240
Ala Ile Leu Pro Ile Leu Arg Lys Tyr Asp Ile Pro Val Ile Ser Asp
245 250 255
Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Thr Trp Gly Cys Val
260 265 270
Thr Tyr Asp Phe Thr Pro Asp Ala Ile Ile Ser Ser Lys Asn Leu Thr
275 280 285
Ala Gly Phe Phe Pro Met Gly Ala Val Ile Leu Gly Pro Glu Leu Ser
290 295 300
Lys Arg Leu Glu Thr Ala Ile Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro His Gly
305 310 315 320
Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Gly Cys Ala Ile Ala Leu Lys Ala
325 330 335
Ile Asp Val Val Met Asn Glu Gly Leu Ala Glu Asn Val Arg Arg Leu
340 345 350
Ala Pro Arg Phe Glu Glu Arg Leu Lys His Ile Ala Glu Arg Pro Asn
355 360 365
Ile Gly Glu Tyr Arg Gly Ile Gly Phe Met Trp Ala Leu Glu Ala Val
370 375 380
Lys Asp Lys Ala Ser Lys Thr Pro Phe Asp Gly Asn Leu Ser Val Ser
385 390 395 400
Glu Arg Ile Ala Asn Thr Cys Thr Asp Leu Gly Leu Ile Cys Arg Pro
405 410 415
Leu Gly Gln Ser Val Val Leu Cys Pro Pro Phe Ile Leu Thr Glu Ala
420 425 430
Gln Met Asp Glu Met Phe Asp Lys Leu Glu Lys Ala Leu Asp Lys Val
435 440 445
Phe Ala Glu Val Ala
450
<210> 13
<211> 224
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 13
Met Lys Ile Tyr Gly Ile Tyr Met Asp Arg Pro Leu Ser Gln Glu Glu
1 5 10 15
Asn Glu Arg Phe Met Ser Phe Ile Ser Pro Glu Lys Arg Glu Lys Cys
20 25 30
Arg Arg Phe Tyr His Lys Glu Asp Ala His Arg Thr Leu Leu Gly Asp
35 40 45
Val Leu Val Arg Ser Val Ile Ser Arg Gln Tyr Gln Leu Asp Lys Ser
50 55 60
Asp Ile Arg Phe Ser Thr Gln Glu Tyr Gly Lys Pro Cys Ile Pro Asp
65 70 75 80
Leu Pro Asp Ala His Phe Asn Ile Ser His Ser Gly Arg Trp Val Ile
85 90 95
Cys Ala Phe Asp Ser Gln Pro Ile Gly Ile Asp Ile Glu Lys Thr Lys
100 105 110
Pro Ile Ser Leu Glu Ile Ala Lys Arg Phe Phe Ser Lys Thr Glu Tyr
115 120 125
Ser Asp Leu Leu Ala Lys Asp Lys Asp Glu Gln Thr Asp Tyr Phe Tyr
130 135 140
His Leu Trp Ser Met Lys Glu Ser Phe Ile Lys Gln Glu Gly Lys Gly
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Leu Asp Ser Phe Ser Val Arg Leu His Gln Asp Gly
165 170 175
Gln Val Ser Ile Glu Leu Pro Asp Ser His Ser Pro Cys Tyr Ile Lys
180 185 190
Thr Tyr Glu Val Asp Pro Gly Tyr Lys Met Ala Val Cys Ala Ala His
195 200 205
Pro Asp Phe Pro Glu Asp Ile Thr Met Val Ser Tyr Glu Glu Leu Leu
210 215 220
<210> 14
<211> 222
<212> PRT
<213> 诺卡氏菌属NRRL 5646
<400> 14
Met Ile Glu Thr Ile Leu Pro Ala Gly Val Glu Ser Ala Glu Leu Leu
1 5 10 15
Glu Tyr Pro Glu Asp Leu Lys Ala His Pro Ala Glu Glu His Leu Ile
20 25 30
Ala Lys Ser Val Glu Lys Arg Arg Arg Asp Phe Ile Gly Ala Arg His
35 40 45
Cys Ala Arg Leu Ala Leu Ala Glu Leu Gly Glu Pro Pro Val Ala Ile
50 55 60
Gly Lys Gly Glu Arg Gly Ala Pro Ile Trp Pro Arg Gly Val Val Gly
65 70 75 80
Ser Leu Thr His Cys Asp Gly Tyr Arg Ala Ala Ala Val Ala His Lys
85 90 95
Met Arg Phe Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Glu Pro His Ala Thr Leu
100 105 110
Pro Glu Gly Val Leu Asp Ser Val Ser Leu Pro Pro Glu Arg Glu Trp
115 120 125
Leu Lys Thr Thr Asp Ser Ala Leu His Leu Asp Arg Leu Leu Phe Cys
130 135 140
Ala Lys Glu Ala Thr Tyr Lys Ala Trp Trp Pro Leu Thr Ala Arg Trp
145 150 155 160
Leu Gly Phe Glu Glu Ala His Ile Thr Phe Glu Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Ala Asp Ser Gly Asn Gly Thr Phe His Ser Glu Leu Leu Val Pro Gly
180 185 190
Gln Thr Asn Asp Gly Gly Thr Pro Leu Leu Ser Phe Asp Gly Arg Trp
195 200 205
Leu Ile Ala Asp Gly Phe Ile Leu Thr Ala Ile Ala Tyr Ala
210 215 220
<210> 15
<211> 261
<212> PRT
<213> 植物乳杆菌
<400> 15
Met Ala Thr Leu Gly Ala Asn Ala Ser Leu Tyr Ser Glu Gln His Arg
1 5 10 15
Ile Thr Tyr Tyr Glu Cys Asp Arg Thr Gly Arg Ala Thr Leu Thr Thr
20 25 30
Leu Ile Asp Ile Ala Val Leu Ala Ser Glu Asp Gln Ser Asp Ala Leu
35 40 45
Gly Leu Thr Thr Glu Met Val Gln Ser His Gly Val Gly Trp Val Val
50 55 60
Thr Gln Tyr Ala Ile Asp Ile Thr Arg Met Pro Arg Gln Asp Glu Val
65 70 75 80
Val Thr Ile Ala Val Arg Gly Ser Ala Tyr Asn Pro Tyr Phe Ala Tyr
85 90 95
Arg Glu Phe Trp Ile Arg Asp Ala Asp Gly Gln Gln Leu Ala Tyr Ile
100 105 110
Thr Ser Ile Trp Val Met Met Ser Gln Thr Thr Arg Arg Ile Val Lys
115 120 125
Ile Leu Pro Glu Leu Val Ala Pro Tyr Gln Ser Glu Val Val Lys Arg
130 135 140
Ile Pro Arg Leu Pro Arg Pro Ile Ser Phe Glu Ala Thr Asp Thr Thr
145 150 155 160
Ile Thr Lys Pro Tyr His Val Arg Phe Phe Asp Ile Asp Pro Asn Arg
165 170 175
His Val Asn Asn Ala His Tyr Phe Asp Trp Leu Val Asp Thr Leu Pro
180 185 190
Ala Thr Phe Leu Leu Gln His Asp Leu Val His Val Asp Val Arg Tyr
195 200 205
Glu Asn Glu Val Lys Tyr Gly Gln Thr Val Thr Ala His Ala Asn Ile
210 215 220
Leu Pro Ser Glu Val Ala Asp Gln Val Thr Thr Ser His Leu Ile Glu
225 230 235 240
Val Asp Asp Glu Lys Cys Cys Glu Val Thr Ile Gln Trp Arg Thr Leu
245 250 255
Pro Glu Pro Ile Gln
260
<210> 16
<211> 231
<212> PRT
<213> 四联消化厌氧球菌
<400> 16
Met Lys Phe Lys Lys Lys Phe Lys Ile Gly Arg Met His Val Asp Pro
1 5 10 15
Phe Asn Tyr Ile Ser Met Arg Tyr Leu Val Ala Leu Met Asn Glu Val
20 25 30
Ala Phe Asp Gln Ala Glu Ile Leu Glu Lys Asp Ile Asp Met Lys Asn
35 40 45
Leu Arg Trp Ile Ile Tyr Ser Trp Asp Ile Gln Ile Glu Asn Asn Ile
50 55 60
Arg Leu Gly Glu Glu Ile Glu Ile Thr Thr Ile Pro Thr His Met Asp
65 70 75 80
Lys Phe Tyr Ala Tyr Arg Asp Phe Ile Val Glu Ser Arg Gly Asn Ile
85 90 95
Leu Ala Arg Ala Lys Ala Thr Phe Leu Leu Met Asp Ile Thr Arg Leu
100 105 110
Arg Pro Ile Lys Ile Pro Gln Asn Leu Ser Leu Ala Tyr Gly Lys Glu
115 120 125
Asn Pro Ile Phe Asp Ile Tyr Asp Met Glu Ile Arg Asn Asp Leu Ala
130 135 140
Phe Ile Arg Asp Ile Gln Leu Arg Arg Ala Asp Leu Asp Asn Asn Phe
145 150 155 160
His Ile Asn Asn Ala Val Tyr Phe Asp Leu Ile Lys Glu Thr Val Asp
165 170 175
Ile Tyr Asp Lys Asp Ile Ser Tyr Ile Lys Leu Ile Tyr Arg Asn Glu
180 185 190
Ile Arg Asp Lys Lys Gln Ile Gln Ala Phe Ala Arg Arg Glu Asp Lys
195 200 205
Ser Ile Asp Phe Ala Leu Arg Gly Glu Asp Gly Arg Asp Tyr Cys Leu
210 215 220
Gly Lys Ile Lys Thr Asn Val
225 230
<210> 17
<211> 246
<212> PRT
<213> 产气荚膜梭菌
<400> 17
Met Gly Lys Ala Tyr Glu Lys Val Tyr Glu Val Thr Tyr Gly Glu Thr
1 5 10 15
Asp Gly Arg Lys Asp Cys Arg Ile Thr Ser Met Met Asn Phe Phe Ser
20 25 30
Asp Cys Cys Leu Ser Gln Glu Glu Lys Asn Ser Met Asn Tyr Ala Asp
35 40 45
Asn Ser Ser Glu Thr Thr Trp Val Phe Phe Asp Tyr Glu Ile Ile Val
50 55 60
Asn Arg Tyr Pro Arg Tyr Arg Glu Lys Ile Lys Val Lys Thr Tyr Val
65 70 75 80
Glu Ser Ile Arg Lys Phe Tyr Ser Asn Arg Val Phe Glu Ala Tyr Asp
85 90 95
Met Asp Gly Ala Leu Val Ala Arg Ala Asp Val Leu Ala Phe Leu Ile
100 105 110
Asn Lys Lys Thr Arg Arg Pro Ala Arg Ile Ser Asp Glu Glu Tyr Glu
115 120 125
Ile His Gly Leu Ser Lys Glu Ser Ser Lys Leu Leu Arg Lys Lys Leu
130 135 140
Asn Phe Glu Lys Phe Asp Lys Glu Asp Leu Glu Met Asn Phe His Ile
145 150 155 160
Arg Tyr Leu Asp Ile Asp Leu Asn Met His Val Ser Asn Ile Lys Tyr
165 170 175
Val Glu Trp Ile Leu Glu Thr Val Pro Val Asp Ile Val Leu Asn Tyr
180 185 190
Lys Met Lys Lys Ile Lys Ile Lys Phe Glu Lys Glu Ile Thr Tyr Gly
195 200 205
His Asn Val Ile Ile Lys Ser Lys Ile Ile Lys Gly Glu Asp Glu Val
210 215 220
Lys Val Leu His Lys Val Glu Asn Glu Glu Gly Glu Ser Ile Thr Leu
225 230 235 240
Ala Glu Thr Tyr Trp Tyr
245
<210> 18
<211> 1049
<212> PRT
<213> 巨大芽孢杆菌
<400> 18
Met Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asn Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys
20 25 30
Ile Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg
35 40 45
Val Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp
50 55 60
Glu Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg
65 70 75 80
Asp Phe Ala Gly Asp Gly Leu Phe Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn
85 90 95
Trp Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala
100 105 110
Met Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val
115 120 125
Gln Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu
130 135 140
Asp Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn
145 150 155 160
Tyr Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr
165 170 175
Ser Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala
180 185 190
Asn Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu
195 200 205
Asp Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg
210 215 220
Lys Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn
225 230 235 240
Gly Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg
245 250 255
Tyr Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly
260 265 270
Leu Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu
275 280 285
Gln Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro
290 295 300
Ser Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn
305 310 315 320
Glu Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala
325 330 335
Lys Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp
340 345 350
Glu Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp
355 360 365
Gly Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser
370 375 380
Ala Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala
385 390 395 400
Cys Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly
405 410 415
Met Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu
420 425 430
Asp Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys
435 440 445
Ala Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr
450 455 460
Glu Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn
465 470 475 480
Thr Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly
485 490 495
Thr Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro
500 505 510
Gln Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly
515 520 525
Ala Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn
530 535 540
Ala Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val
545 550 555 560
Lys Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala
565 570 575
Thr Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala
580 585 590
Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp
595 600 605
Asp Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp
610 615 620
Val Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys
625 630 635 640
Ser Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu
645 650 655
Ala Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu
660 665 670
Leu Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu
675 680 685
Leu Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile
690 695 700
Pro Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly
705 710 715 720
Leu Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu
725 730 735
Ala His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln
740 745 750
Tyr Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met
755 760 765
Ala Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu
770 775 780
Leu Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr
785 790 795 800
Met Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser
805 810 815
Glu Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile
820 825 830
Ser Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser
835 840 845
Val Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile
850 855 860
Ala Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys
865 870 875 880
Phe Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu
885 890 895
Thr Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg
900 905 910
Gly Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu
915 920 925
Gly Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr
930 935 940
Leu Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr
945 950 955 960
Leu His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val
965 970 975
Gln His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp
980 985 990
Gln Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly Asp Gly Ser Gln Met Ala Pro
995 1000 1005
Ala Val Glu Ala Thr Leu Met Lys Ser Tyr Ala Asp Val His Gln Val
1010 1015 1020
Ser Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp Leu Gln Gln Leu Glu Glu Lys Gly
1025 1030 1035 1040
Arg Tyr Ala Lys Asp Val Trp Ala Gly
1045
<210> 19
<211> 310
<212> PRT
<213> 藤黄微球菌
<400> 19
Met Ser Glu Phe Thr Arg Phe Glu Gln Val Thr Val Leu Gly Thr Gly
1 5 10 15
Val Leu Gly Ser Gln Ile Ile Met Gln Ala Ala Tyr His Gly Lys Lys
20 25 30
Val Met Ala Tyr Asp Ala Val Pro Ala Ala Leu Glu Asn Leu Asp Lys
35 40 45
Arg Trp Ala Trp Ile Arg Gln Gly Tyr Glu Ala Asp Leu Gly Glu Gly
50 55 60
Tyr Asp Ala Ala Arg Phe Asp Glu Ala Ile Ala Arg Ile Thr Pro Thr
65 70 75 80
Ser Asp Leu Ala Glu Ala Val Ala Asp Ala Asp Ile Val Ile Glu Ala
85 90 95
Val Pro Glu Asn Leu Glu Leu Lys Arg Lys Val Trp Ala Gln Val Gly
100 105 110
Glu Leu Ala Pro Ala Thr Thr Leu Phe Ala Thr Asn Thr Ser Ser Leu
115 120 125
Leu Pro Ser Asp Phe Ala Asp Ala Ser Gly His Pro Glu Arg Phe Leu
130 135 140
Ala Leu His Tyr Ala Asn Arg Ile Trp Ala Gln Asn Thr Ala Glu Val
145 150 155 160
Met Gly Thr Ala Ala Thr Ser Pro Glu Ala Val Ala Gly Ala Leu Gln
165 170 175
Phe Ala Glu Glu Thr Gly Met Val Pro Val His Val Arg Lys Glu Ile
180 185 190
Pro Gly Tyr Phe Leu Asn Ser Leu Leu Ile Pro Trp Leu Gln Ala Gly
195 200 205
Ser Lys Leu Tyr Met His Gly Val Gly Asn Pro Ala Asp Ile Asp Arg
210 215 220
Thr Trp Arg Val Ala Thr Gly Asn Glu Arg Gly Pro Phe Gln Thr Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Val Gly Phe His Val Ala Ala Asn Val Ser Arg Asn Thr Gly
245 250 255
Val Asp Trp Gln Leu Gly Phe Ala Glu Met Leu Glu Lys Ser Ile Ala
260 265 270
Glu Gly His Ser Gly Val Ala Asp Gly Gln Gly Phe Tyr Arg Tyr Gly
275 280 285
Pro Asp Gly Glu Asn Leu Gly Pro Val Glu Asp Trp Asn Leu Gly Asp
290 295 300
Lys Asp Thr Pro Leu Gly
305 310
<210> 20
<211> 533
<212> PRT
<213> 戈登氏菌属TY-5
<400> 20
Met Ser Thr Thr Thr Leu Asp Ala Ala Val Ile Gly Thr Gly Val Ala
1 5 10 15
Gly Leu Tyr Glu Leu His Met Leu Arg Glu Gln Gly Leu Glu Val Arg
20 25 30
Ala Tyr Asp Lys Ala Ser Gly Val Gly Gly Thr Trp Tyr Trp Asn Arg
35 40 45
Tyr Pro Gly Ala Arg Phe Asp Ser Glu Ala Tyr Ile Tyr Gln Tyr Leu
50 55 60
Phe Asp Glu Asp Leu Tyr Lys Gly Trp Ser Trp Ser Gln Arg Phe Pro
65 70 75 80
Gly Gln Glu Glu Ile Glu Arg Trp Leu Asn Tyr Val Ala Asp Ser Leu
85 90 95
Asp Leu Arg Arg Asp Ile Ser Leu Glu Thr Glu Ile Thr Ser Ala Val
100 105 110
Phe Asp Glu Asp Arg Asn Arg Trp Thr Leu Thr Thr Ala Asp Gly Asp
115 120 125
Thr Ile Asp Ala Gln Phe Leu Ile Thr Cys Cys Gly Met Leu Ser Ala
130 135 140
Pro Met Lys Asp Leu Phe Pro Gly Gln Ser Asp Phe Gly Gly Gln Leu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Arg Trp Pro Lys Glu Gly Ile Asp Phe Ala Gly Lys
165 170 175
Arg Val Gly Val Ile Gly Asn Gly Ala Thr Gly Ile Gln Val Ile Gln
180 185 190
Ser Ile Ala Ala Asp Val Asp Glu Leu Lys Val Phe Ile Arg Thr Pro
195 200 205
Gln Tyr Ala Leu Pro Met Lys Asn Pro Ser Tyr Gly Pro Asp Glu Val
210 215 220
Ala Trp Tyr Lys Ser Arg Phe Gly Glu Leu Lys Asp Thr Leu Pro His
225 230 235 240
Thr Phe Thr Gly Phe Glu Tyr Asp Phe Thr Asp Ala Trp Glu Asp Leu
245 250 255
Thr Pro Glu Gln Arg Arg Ala Arg Leu Glu Asp Asp Tyr Glu Asn Gly
260 265 270
Ser Leu Lys Leu Trp Leu Ala Ser Phe Ala Glu Ile Phe Ser Asp Glu
275 280 285
Gln Val Ser Glu Glu Val Ser Glu Phe Val Arg Glu Lys Met Arg Ala
290 295 300
Arg Leu Val Asp Pro Glu Leu Cys Asp Leu Leu Ile Pro Ser Asp Tyr
305 310 315 320
Gly Phe Gly Thr His Arg Val Pro Leu Glu Thr Asn Tyr Leu Glu Val
325 330 335
Tyr His Arg Asp Asn Val Thr Ala Val Leu Val Arg Asp Asn Pro Ile
340 345 350
Thr Arg Ile Arg Glu Asn Gly Ile Glu Leu Ala Asp Gly Thr Val His
355 360 365
Glu Leu Asp Val Ile Ile Met Ala Thr Gly Phe Asp Ala Gly Thr Gly
370 375 380
Ala Leu Thr Arg Ile Asp Ile Arg Gly Arg Asp Gly Arg Thr Leu Ala
385 390 395 400
Asp Asp Trp Ser Arg Asp Ile Arg Thr Thr Met Gly Leu Met Val His
405 410 415
Gly Tyr Pro Asn Met Leu Thr Thr Ala Val Pro Leu Ala Pro Ser Ala
420 425 430
Ala Leu Cys Asn Met Thr Thr Cys Leu Gln Gln Gln Thr Glu Trp Ile
435 440 445
Ser Glu Ala Ile Arg His Leu Arg Ala Thr Gly Lys Thr Val Ile Glu
450 455 460
Pro Thr Ala Glu Gly Glu Glu Ala Trp Val Ala His His Asp Glu Leu
465 470 475 480
Ala Asp Ala Asn Leu Ile Ser Lys Thr Asn Ser Trp Tyr Val Gly Ser
485 490 495
Asn Val Pro Gly Lys Pro Arg Arg Val Leu Ser Tyr Val Gly Gly Val
500 505 510
Gly Ala Tyr Arg Asp Ala Thr Leu Glu Ala Ala Ala Ala Gly Tyr Lys
515 520 525
Gly Phe Ala Leu Ser
530
<210> 21
<211> 612
<212> PRT
<213> 迪茨氏菌属D5
<400> 21
Met Pro Phe Thr Leu Pro Glu Ser Lys Ile Ala Ile Asp Ile Asp Phe
1 5 10 15
Asp Pro Asp His Leu Arg Gln Arg Phe Glu Ala Asp Lys Gln Ala Arg
20 25 30
Glu Arg Lys Asp Gln Leu Ala Gln Phe Gln Gly Leu Asp Asp Val Leu
35 40 45
Glu Val Asp Asp Ser Asp Pro Phe Ser Glu Pro Ile Thr Arg Glu Pro
50 55 60
Val Thr Glu Glu Leu Asp Ala Leu Val Leu Gly Gly Gly Phe Gly Gly
65 70 75 80
Leu Thr Ala Gly Ala Tyr Leu Thr Gln Asn Gly Val Glu Asn Phe Arg
85 90 95
Leu Val Glu Tyr Gly Gly Asp Phe Gly Gly Thr Trp Tyr Trp Asn Arg
100 105 110
Tyr Pro Gly Val Gln Cys Asp Ile Glu Ser His Ile Tyr Met Pro Leu
115 120 125
Leu Glu Glu Thr Gly Tyr Val Pro Ser Gln Arg Tyr Ala Asp Gly Ser
130 135 140
Glu Ile Phe Glu His Ala Gln Arg Ile Gly Arg His Tyr Gly Leu Tyr
145 150 155 160
Asp Arg Thr Tyr Phe Gln Thr Arg Ala Thr His Ala Arg Trp Asp Glu
165 170 175
Gln Ile Gln Arg Trp Glu Val Thr Thr Asp Arg Gly Asp Arg Phe Val
180 185 190
Thr Arg Val Leu Leu Arg Ser Asn Gly Ala Leu Thr Lys Pro Gln Leu
195 200 205
Pro Lys Val Pro Gly Ile Gly Asp Phe Glu Gly Lys Ile Phe His Thr
210 215 220
Ser Arg Trp Asp Tyr Gly Tyr Thr Gly Gly Ser Ala Ala Gly Asp Leu
225 230 235 240
Ala His Leu Arg Asp Lys Arg Val Ala Val Val Gly Thr Gly Ala Thr
245 250 255
Gly Val Gln Val Val Pro Tyr Leu Ala Gln Asp Ala Lys Glu Leu Val
260 265 270
Val Val Gln Arg Thr Pro Ser Val Val Gln Pro Arg Asn Asn Arg Lys
275 280 285
Thr Asp Pro Glu Trp Val Ala Ser Leu Thr Pro Gly Trp Gln Tyr Glu
290 295 300
Arg His Asp Asn Phe Asn Gly Ile Ile Ser Gly His Glu Val Glu Gly
305 310 315 320
Asn Leu Val Asp Asp Gly Trp Thr His Leu Phe Pro Glu Leu Thr Gly
325 330 335
Gln His Leu Val Asp Val Pro Val Gly Glu Leu Pro Glu Gly Asp Gln
340 345 350
Ala Leu Val Ala Glu Leu Ala Asp Met Asn Leu Leu Met Ser Ala His
355 360 365
Ala Arg Val Asp Ser Ile Val Thr Asp Pro Ala Thr Ala Asp Gly Leu
370 375 380
Lys Pro Trp Phe Gly Tyr Met Cys Lys Arg Pro Cys Phe Asn Asp Glu
385 390 395 400
Tyr Leu Glu Ala Phe Asn Arg Pro Asn Val Thr Leu Ala Ala Ser Pro
405 410 415
Ala Gly Ile Asp Gly Ile Thr Ser Ser Gly Ile Val Val Ala Gly Thr
420 425 430
His Tyr Glu Val Asp Cys Ile Ile Phe Ala Thr Gly Phe Glu Thr Gly
435 440 445
Ser Gly Pro Ala Gly Ile Tyr Gly Tyr Asp Val Ile Gly Arg Glu Gly
450 455 460
His Ser Met Gln Glu Tyr Phe Ser Glu Gly Ala Arg Thr Phe His Gly
465 470 475 480
Phe Phe Thr His Gly Phe Pro Asn Phe Val Glu Leu Gly Met Ser Gln
485 490 495
Thr Ala Tyr Tyr Val Asn Phe Val Tyr Met Leu Asp Arg Lys Ala Arg
500 505 510
His Ala Ala Arg Leu Val Arg His Leu Leu Asp Ser Gly Ile Gly Thr
515 520 525
Phe Glu Pro Thr Ala Glu Ala Glu Ala Asp Trp Val Ala Glu Val Arg
530 535 540
Arg Ser Asn Glu Pro Arg Glu Ala Tyr Trp Gly Ala Cys Thr Pro Gly
545 550 555 560
Tyr Tyr Asn Gly Gln Gly Glu Val Ser Lys Ala Val Phe Arg Asp Val
565 570 575
Tyr Asn Ser Ser Glu Ile Asp Phe Trp Asn Met Ile Glu Ala Trp Trp
580 585 590
Asn Ser Gly Arg Phe Glu Gly Leu Val Phe Glu Pro Ala Arg Asp Ala
595 600 605
Val Pro Val Ala
610
<210> 22
<211> 272
<212> PRT
<213> 荧光假单胞菌
<400> 22
Met Ser Thr Phe Val Ala Lys Asp Gly Thr Gln Ile Tyr Phe Lys Asp
1 5 10 15
Trp Gly Ser Gly Lys Pro Val Leu Phe Ser His Gly Trp Leu Leu Asp
20 25 30
Ala Asp Met Trp Glu Tyr Gln Met Glu Tyr Leu Ser Ser Arg Gly Tyr
35 40 45
Arg Thr Ile Ala Phe Asp Arg Arg Gly Phe Gly Arg Ser Asp Gln Pro
50 55 60
Trp Thr Gly Asn Asp Tyr Asp Thr Phe Ala Asp Asp Ile Ala Gln Leu
65 70 75 80
Ile Glu His Leu Asp Leu Lys Glu Val Thr Leu Val Gly Phe Ser Met
85 90 95
Gly Gly Gly Asp Val Ala Arg Tyr Ile Ala Arg His Gly Ser Ala Arg
100 105 110
Val Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ala Val Thr Pro Leu Phe Gly Gln
115 120 125
Lys Pro Asp Tyr Pro Gln Gly Val Pro Leu Asp Val Phe Ala Arg Phe
130 135 140
Lys Thr Glu Leu Leu Lys Asp Arg Ala Gln Phe Ile Ser Asp Phe Asn
145 150 155 160
Ala Pro Phe Tyr Gly Ile Asn Lys Gly Gln Val Val Ser Gln Gly Val
165 170 175
Gln Thr Gln Thr Leu Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Thr
180 185 190
Val Asp Cys Val Thr Ala Phe Ala Glu Thr Asp Phe Arg Pro Asp Met
195 200 205
Ala Lys Ile Asp Val Pro Thr Leu Val Ile His Gly Asp Gly Asp Gln
210 215 220
Ile Val Pro Phe Glu Thr Thr Gly Lys Val Ala Ala Glu Leu Ile Lys
225 230 235 240
Gly Ala Glu Leu Lys Val Tyr Lys Asp Ala Pro His Gly Phe Ala Val
245 250 255
Thr His Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Leu Ala Phe Leu Lys Arg
260 265 270
<210> 23
<211> 550
<212> PRT
<213> 鼠伤寒沙门氏杆菌
<400> 23
Met Gln Asn Pro Tyr Thr Val Ala Asp Tyr Leu Leu Asp Arg Leu Ala
1 5 10 15
Gly Cys Gly Ile Gly His Leu Phe Gly Val Pro Gly Asp Tyr Asn Leu
20 25 30
Gln Phe Leu Asp His Val Ile Asp His Pro Thr Leu Arg Trp Val Gly
35 40 45
Cys Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg
50 55 60
Met Ser Gly Ala Gly Ala Leu Leu Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu
65 70 75 80
Ser Ala Ile Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu Tyr Val Pro Val
85 90 95
Leu His Ile Val Gly Ala Pro Cys Ser Ala Ala Gln Gln Arg Gly Glu
100 105 110
Leu Met His His Thr Leu Gly Asp Gly Asp Phe Arg His Phe Tyr Arg
115 120 125
Met Ser Gln Ala Ile Ser Ala Ala Ser Ala Ile Leu Asp Glu Gln Asn
130 135 140
Ala Cys Phe Glu Ile Asp Arg Val Leu Gly Glu Met Leu Ala Ala Arg
145 150 155 160
Arg Pro Gly Tyr Ile Met Leu Pro Ala Asp Val Ala Lys Lys Thr Ala
165 170 175
Ile Pro Pro Thr Gln Ala Leu Ala Leu Pro Val His Glu Ala Gln Ser
180 185 190
Gly Val Glu Thr Ala Phe Arg Tyr His Ala Arg Gln Cys Leu Met Asn
195 200 205
Ser Arg Arg Ile Ala Leu Leu Ala Asp Phe Leu Ala Gly Arg Phe Gly
210 215 220
Leu Arg Pro Leu Leu Gln Arg Trp Met Ala Glu Thr Pro Ile Ala His
225 230 235 240
Ala Thr Leu Leu Met Gly Lys Gly Leu Phe Asp Glu Gln His Pro Asn
245 250 255
Phe Val Gly Thr Tyr Ser Ala Gly Ala Ser Ser Lys Glu Val Arg Gln
260 265 270
Ala Ile Glu Asp Ala Asp Arg Val Ile Cys Val Gly Thr Arg Phe Val
275 280 285
Asp Thr Leu Thr Ala Gly Phe Thr Gln Gln Leu Pro Ala Glu Arg Thr
290 295 300
Leu Glu Ile Gln Pro Tyr Ala Ser Arg Ile Gly Glu Thr Trp Phe Asn
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
Leu Gln Pro Leu Trp Gly Ser Ile Gly Tyr Ser Leu Pro Ala Ala Phe
405 410 415
Gly Ala Gln Thr Ala Cys Pro Asp Arg Arg Val Ile Leu Ile Ile Gly
420 425 430
Asp Gly Ala Ala Gln Leu Thr Ile Gln Glu Met Gly Ser Met Leu Arg
435 440 445
Asp Gly Gln Ala Pro Val Ile Leu Leu Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr
450 455 460
Val Glu Arg Ala Ile His Gly Ala Ala Gln Arg Tyr Asn Asp Ile Ala
465 470 475 480
Ser Trp Asn Trp Thr Gln Ile Pro Pro Ala Leu Asn Ala Ala Gln Gln
485 490 495
Ala Glu Cys Trp Arg Val Thr Gln Ala Ile Gln Leu Ala Glu Val Leu
500 505 510
Glu Arg Leu Ala Arg Pro Gln Arg Leu Ser Phe Ile Glu Val Met Leu
515 520 525
Pro Lys Ala Asp Leu Pro Glu Leu Leu Arg Thr Val Thr Arg Ala Leu
530 535 540
Glu Ala Arg Asn Gly Gly
545 550

Claims (63)

1.产生7-羟基辛酸的方法，所述方法包括使用被归类于EC.1.14.14.1的单加氧酶将辛酸酶促转化为7-羟基辛酸。
2.权利要求1的方法，其中所述被归类于EC.1.14.14.1的单加氧酶与SEQ ID NO:18中示出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
3.权利要求1或2的方法，还包括使用仲醇脱氢酶、被归类于EC.1.14.13.-的单加氧酶，和酯酶将7-羟基辛酸酶促转化为6-羟基己酸。
4.权利要求3的方法，其中所述酯酶被归类于EC.3.1.1.1或EC 3.1.1.3。
5.权利要求3的方法，其中所述酯酶与SEQ ID NO:22中示出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中辛酸通过以下方法产生：使用硫酯酶将辛酰基-[acp]或辛酰基-CoA转化为辛酸。
7.权利要求6的方法，其中所述硫酯酶与SEQ ID NO:1、15、16或17中示出的氨基酸序列具有至少70％的同一性。
8.权利要求1-5中任一项的方法，其中使用脱羧酶和醛脱氢酶由2-氧代壬酸产生辛酸。
9.权利要求8的方法，其中所述脱羧酶与SEQ ID NO:23中示出的氨基酸序列具有至少70％的同一性。
10.权利要求3-9中任一项的方法，其中所述醇脱氢酶与SEQ ID NO:19中示出的氨基酸序列具有至少70％的同一性。
11.权利要求3-10中任一项的方法，其中所述被归类于EC.1.14.13.-的单加氧酶与SEQID NO:20或SEQ ID NO:21中示出的氨基酸序列具有至少70％的同一性。
12.用于生物合成6-羟基己酸的方法，所述方法包括使用硫酯酶和被归类于EC.1.14.14.1的单加氧酶由辛酰基-CoA或辛酰基-[acp]酶促合成7-羟基辛酸，以及使用仲醇脱氢酶、被归类于EC.1.14.13.-的单加氧酶和酯酶将7-羟基辛酸酶促转化为6-羟基己酸。
13.用于生物合成6-羟基己酸的方法，所述方法包括使用脱羧酶、醛脱氢酶和被归类于EC.1.14.14.1的单加氧酶由2-氧代壬酸酶促合成7-羟基辛酸，以及使用仲醇脱氢酶、被归类于EC.1.14.13.-的单加氧酶和酯酶将7-羟基辛酸酶促转化为6-羟基己酸。
14.权利要求12或13的方法，其中所述被归类于EC.1.14.14.1的单加氧酶与SEQ IDNO:18中示出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
15.权利要求12或14的方法，其中所述硫酯酶与SEQ ID NO:1、15、16或17中示出的氨基酸序列具有至少70％的同一性。
16.权利要求12-15中任一项的方法，其中所述酯酶与SEQ ID NO:22中示出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
17.权利要求12-16中任一项的方法，其中所述被归类于EC.1.14.13.-的单加氧酶与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中示出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
18.权利要求12-17中任一项的方法，其中所述仲醇脱氢酶与SEQ ID NO:19中示出的氨基酸序列具有至少70％的同一性。
19.权利要求13-18中任一项的方法，其中所述脱羧酶与SEQ ID NO:23中示出的氨基酸序列具有至少70％的同一性。
20.权利要求12-19中任一项的方法，所述方法还包括在一个或多个步骤中将6-羟基己酸酶促转化为己二酸、6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇。
21.权利要求20的方法，其中使用单加氧酶、伯醇脱氢酶、6-羟基己酸脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶、5-氧代戊酸脱氢酶或醛脱氢酶中的一种或多种将6-羟基己酸转化为己二酸。
22.权利要求20的方法，其中使用伯醇脱氢酶、6-羟基己酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶和ω-转氨酶中的一种或多种将6-羟基己酸转化为6-氨基己酸。
23.权利要求22的方法，还包括使用羧酸还原酶和ω-转氨酶中的一种或多种将6-氨基己酸转化为六亚甲基二胺。
24.权利要求20的方法，其中使用伯醇脱氢酶、6-羟基己酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、ω-转氨酶和酰胺水解酶中的一种或多种将6-羟基己酸转化为己内酰胺。
25.权利要求20的方法，其中使用羧酸还原酶、ω-转氨酶、伯醇脱氢酶、N-乙酰转移酶和乙酰基腐胺脱酰基酶中的一种或多种将6-羟基己酸转化为六亚甲基二胺。
26.权利要求22-25中任一项的方法，其中所述ω-转氨酶与SEQ ID NO.7–12中示出的任一氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
27.权利要求20的方法，其中使用羧酸还原酶和醇脱氢酶将6-羟基己酸转化为1,6-己二醇。
28.权利要求20-22中任一项的方法，其中所述羧酸还原酶与SEQ ID NO.2–6中示出的任一氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
29.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法在重组宿主中进行。
30.权利要求29的方法，其中所述宿主经历非周期性培养策略以实现需氧、厌氧或微需氧的培养条件。
31.权利要求29的方法，其中使用周期性培养策略以在厌氧和需氧的培养条件之间转换。
32.权利要求29-31中任一项的方法，其中所述宿主在营养限制的条件下培养。
33.权利要求29-32中任一项的方法，其中所述宿主使用陶瓷中空纤维膜保留。
34.权利要求29-33中任一项的方法，其中对发酵进料的主要碳源衍生自生物给料。
35.权利要求34的方法，其中所述生物给料是以下物质，或衍生自以下物质：单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸、甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩的酒糟可溶物或城市废物。
36.权利要求29-33中任一项的方法，其中对发酵进料的主要碳源衍生自非生物给料。
37.权利要求36的方法，其中所述非生物给料是以下物质，或衍生自以下物质：天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸、来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物(NVR)碱洗废物流，或对苯二甲酸/异酞酸混合物废物流。
38.权利要求29-37中任一项的方法，其中所述宿主是原核生物。
39.权利要求38的方法，其中所述原核生物来自以下菌属，其选自埃希氏菌属；梭菌属；棒状杆菌属；贪铜菌属；假单胞菌属；代尔夫特菌属；芽胞杆菌属；乳酸杆菌属；乳球菌属；和红球菌属。
40.权利要求39的方法，其中所述原核生物选自大肠杆菌、杨氏梭菌、自产乙醇梭菌、克氏梭菌、谷氨酸棒状杆菌、钩虫贪铜菌、耐金属贪铜菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、食油假单胞菌、食酸代尔夫特菌、枯草芽胞杆菌、德氏乳杆菌、乳酸乳球菌和马红球菌。
41.权利要求29-37中任一项的方法，其中所述宿主为真核生物。
42.权利要求41的方法，其中所述真核生物来自以下菌属，其选自曲霉属、酵母属、毕赤氏酵母属、耶罗维亚酵母属、伊萨酵母属、德巴利酵母属、Arxula和克鲁维酵母属。
43.权利要求42的方法，其中所述真核生物选自黑曲霉、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、解脂耶罗维亚酵母、东方伊萨酵母、汉逊德巴利酵母、Arxula adenoinivorans和乳酸克鲁维酵母。
44.权利要求29-43中任一项的方法，其中所述宿主对高浓度C6结构单元的耐受通过在选择环境中连续培养改善。
45.权利要求29-44中任一项的方法，其中所述宿主包括弱化一种或多种以下酶：聚羟基链烷酸合酶、乙酰-CoA硫酯酶、形成乙酸的磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、乳酸脱氢酶、甲基萘醌-延胡索酸氧化还原酶、产生异丁醇的2-酮酸脱羧酶、形成乙醇的醇脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、丙酮酸脱羧酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、消耗NADH的转氢酶、NADH特异性的谷氨酸脱氢酶、NADH/NADPH利用型谷氨酸脱氢酶、庚二酰-CoA脱氢酶；接受C6结构单元和中心前体作为底物的酰基-CoA脱氢酶；丁酰-CoA脱氢酶；或己二酰-CoA合成酶。
46.权利要求29-45中任一项的方法，其中所述宿主过表达编码以下酶的一种或多种基因：乙酰-CoA合成酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶；转酮醇酶；吡啶核苷酸转氢酶；甘油醛-3P-脱氢酶；苹果酸酶；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；葡萄糖脱氢酶；果糖1,6二磷酸酶；L-丙氨酸脱氢酶；L-谷氨酸脱氢酶；甲酸脱氢酶；L-谷氨酰胺合成酶；特异性戊二酸CoA-连接酶；特异性5-羟基戊酸脱氢酶、特异性5-氧代戊酸脱氢酶；丙酸CoA-连接酶；二胺转运体、二羧酸转运体；和/或多药物转运体。
47.重组宿主，其包含至少一种编码以下物质的外源性核酸：(i)被归类于EC.1.14.14.1的单加氧酶；(ii)硫酯酶，或脱羧酶和醛脱氢酶；(iii)仲醇脱氢酶；(iv)被归类于EC.1.14.13.-的单加氧酶；和(v)酯酶，所述宿主产生6-羟基己酸。
48.权利要求47的重组宿主，其中所述被归类于EC.1.14.14.1的单加氧酶与SEQ IDNO:18中示出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
49.权利要求47或48的重组宿主，所述宿主包含所述硫酯酶，所述硫酯酶与SEQ ID NO:1、15、16或17中示出的氨基酸序列具有至少70％同一性。
50.权利要求47或48的重组宿主，所述宿主包含所述脱羧酶和所述醛脱氢酶，所述脱羧酶与SEQ ID NO:23中示出的氨基酸序列具有至少70％同一性。
51.权利要求47-50中任一项的重组宿主，其中所述被归类于EC.1.14.13.-的单加氧酶与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中示出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
52.权利要求47-51中任一项的重组宿主，其中所述酯酶与SEQ ID NO:22中示出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
53.权利要求47-52中任一项的重组宿主，其中所述仲醇脱氢酶与SEQ ID NO:19中示出的氨基酸序列具有至少70％的同一性。
54.权利要求47-53中任一项的重组宿主，所述宿主还包含一种或多种以下外源性酶：单加氧酶、醇脱氢酶、5-氧代戊酸脱氢酶、6-羟基己酸脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶或醛脱氢酶，所述宿主还产生己二酸。
55.权利要求47-53中任一项的重组宿主，所述宿主还包含一种或多种以下外源性酶：转氨酶、6-羟基己酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶和伯醇脱氢酶，所述宿主还产生6-氨基己酸。
56.权利要求55的重组宿主，所述宿主还包含外源性酰胺水解酶，所述宿主还产生己内酰胺。
57.权利要求47-53中任一项的重组宿主，所述宿主还包含一种或多种以下外源性酶：羧酸还原酶、ω-转氨酶、脱酰基酶、N-乙酰基转移酶或伯醇脱氢酶，所述宿主还产生六亚甲基二胺。
58.权利要求47-53中任一项的重组宿主，所述宿主还包含外源性羧酸还原酶和外源性伯醇脱氢酶，所述宿主还产生1,6-己二醇。
59.生物衍生的产品、生物基产品或发酵衍生的产品，其中所述产品包含：
i.组合物，其含有权利要求1-44中任一项、或图1-5中任一幅所述的至少一种生物衍生的、生物基的或发酵衍生的化合物或其任何组合；
ii.生物衍生的、生物基的或发酵衍生的聚合物，其包含i.中的生物衍生的、生物基的或发酵衍生的组合物或化合物或其任何组合；
iii.生物衍生的、生物基的或发酵衍生的树脂，其包含i.中的生物衍生的、生物基的或发酵衍生的化合物或生物衍生的、生物基的或发酵衍生的组合物或其任何组合、或ii.中的生物衍生的、生物基的或发酵衍生的聚合物或其任何组合；
iv.成型的物质，其通过使ii.中的生物衍生的、生物基的或发酵衍生的聚合物或iii.中的生物衍生的、生物基的或发酵衍生的树脂或其任何组合成型而获得；
v.生物衍生的、生物基的或发酵衍生的制剂，其包含i.中的生物衍生的、生物基的或发酵衍生的组合物、i.中的生物衍生的、生物基的或发酵衍生的化合物、ii.中的生物衍生的、生物基的或发酵衍生的聚合物、iii.中的生物衍生的、生物基的或发酵衍生的树脂、或iv.中的生物衍生的、生物基的或发酵衍生的成型物质或其任何组合；或
vi.生物衍生的、生物基的或发酵衍生的半固体或非半固体的流，其包含i.中的生物衍生的、生物基的或发酵衍生的组合物、i.中的生物衍生的、生物基的或发酵衍生的化合物、ii.中的生物衍生的、生物基的或发酵衍生的聚合物、iii.中的生物衍生的、生物基的或发酵衍生的树脂、v.中的生物衍生的、生物基的或发酵衍生的制剂，或iv.中的生物衍生的、生物基的或发酵衍生的成型物质或其任何组合。
60.非天然存在的生物体，其包含至少一种外源性核酸，所述外源性核酸编码至少一种多肽，所述多肽具有在图1至5中任一幅图中所示的至少一种酶的活性。
61.非天然存在的生物化学网络，其包含一种或多种具有单加氧酶、仲醇脱氢酶和酯酶A的多肽。
62.核酸构建体或表达载体，其包含
(a)多核苷酸，其编码具有单加氧酶活性的多肽，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个指导所述多肽的产生的异源性控制序列，并且其中所述具有单加氧酶活性的多肽选自：(a)与SEQ ID NO:18的多肽具有至少70％序列同一性的多肽；
(b)多核苷酸，其编码具有酯酶活性的多肽，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个指导所述多肽的产生的异源性控制序列，并且其中所述具有酯酶活性的多肽选自：(a)与SEQ ID NO:22的多肽具有至少70％序列同一性的多肽；
(c)多核苷酸，其编码具有硫酯酶活性的多肽，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个指导所述多肽的产生的异源性控制序列，并且其中所述具有硫酯酶活性的多肽选自：(a)与SEQ ID NO:1、15、16或17的多肽具有至少70％序列同一性的多肽；或
(d)多核苷酸，其编码具有脱羧酶活性的多肽，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个指导所述多肽的产生的异源性控制序列，并且其中所述具有脱羧酶活性的多肽选自：(a)与SEQ ID NO:23的多肽具有至少70％序列同一性的多肽；或
(e)多核苷酸，其编码具有醇脱氢酶活性的多肽，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个指导所述多肽的产生的异源性控制序列，且其中所述具有醇脱氢酶活性的多肽选自：(a)与SEQ ID NO:21的多肽具有至少70％序列同一性的多肽；或
(f)多核苷酸，其编码具有ω-转氨酶活性的多肽，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个指导所述多肽的产生的异源性控制序列，并且其中所述具有ω-转氨酶活性的多肽选自：(a)与SEQ ID NO:7-12的多肽具有至少70％序列同一性的多肽；或
(g)多核苷酸，其编码具有羧酸还原酶活性的多肽，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个指导所述多肽的产生的异源性控制序列，并且其中所述具有羧酸还原酶活性的多肽选自：(a)与SEQ ID NO:2–6或24的多肽具有至少70％序列同一性的多肽；或
(h)多核苷酸，其编码具有单加氧酶、伯醇脱氢酶、6-羟基己酸脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶、5-氧代戊酸脱氢酶、醛脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、羧酸还原酶、N-乙酰转移酶、乙酰基腐胺脱酰基酶或ω-转氨酶活性的多肽。
63.一种组合物，其包含权利要求62的核酸构建体或表达载体。
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