JP5276986B2 - 四炭素アルコールの発酵性生産 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条に基づき、２００５年１０月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／７３０２９０号明細書からの優先権を主張する。
本発明は、工業微生物学分野およびアルコールの生成に関する。より具体的には、組換え微生物の工業発酵を通じてイソブタノールが生成される。
ブタノールは重要な工業化学物質であり、燃料添加剤として、プラスチック工業における原材料化学物質として、および食物および香料工業における食物等級抽出剤として有用である。毎年、１００〜１２０億ポンドのブタノールが石油化学的手段によって生産され、この汎用化学物質に対する需要は増大すると思われる。
オキソ合成法、一酸化炭素の触媒的水素付加（非特許文献１）、およびメタノールとｎ−プロパノールとのゲルベ縮合（非特許文献２）などのイソブタノールの化学合成法が知られている。これらの方法は石油化学物質に由来する出発原料を使用し、一般に高価であり環境を損なう。植物由来原料からのイソブタノール生成は、温室効果ガス排出を最小化して当該技術分野における進歩に相当する。
イソブタノールは、酵母発酵の副産物として生物学的に生成される。これは「フーゼル油」の構成要素であり、この真菌群によってアミノ酸の不完全な代謝の結果として形成される。イソブタノールは具体的には、Ｌ−バリンの異化作用から生成される。Ｌ−バリンのアミン基を窒素源として収集した後に得られるα−ケト酸は、いわゆるエールリッヒ経路の酵素によって脱炭酸されてイソブタノールに還元される（非特許文献３）。飲料発酵中に達成されるフーゼル油および／またはその構成要素の収率は、典型的に低い。例えばビール発酵中に生成するイソブタノール濃度は、百万分の１６未満と報告されている（非特許文献４）。発酵への外来性Ｌ−バリンの添加は、（非特許文献３）で述べられるようにイソブタノール収率を増大させ、発酵中に濃度２０ｇ／ＬのＬ−バリンを提供することで、３ｇ／Ｌのイソブタノール収率が得られると報告されている。しかし原材料としてのバリンの使用は、工業規模でのイソブタノール生産にはけた違いの費用がかかる。糖からの直接のイソブタノールの生合成は経済的に実行可能であり、当該技術分野における進歩に相当する。イソブタノールを生成するようにデザインされた組換え微生物は、報告されていない。
「ウルマンの工業化学百科事典（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第６版、第５巻、７１６〜７１９頁、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ａｎｄ Ｃｏ．、ワインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）、ドイツ、２００３年 カルリーニ（Ｃａｒｌｉｎｉ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ａ：Ｃｈｅｍ．２２０：２１５〜２２０頁、２００４年 ディキンソン（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４０）：２５７５２〜２５７５６頁、１９９８年 ガルシア（Ｇａｒｃｉａ）ら、Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：３０３〜３０９頁、１９９４年
したがって単一産物としてのイソブタノールを生成するための、環境的に責任を持てる、対費用効果の高い方法に対する必要性が存在する。本発明は、イソブタノール生合成経路を発現する組換え微生物産生宿主の提供を通じて、この必要性に対処する。
本発明は、改変されたイソブタノール生合成経路を有する組換え微生物を提供する。改変された微生物をイソブタノールの商業的生成のために使用してもよい。したがって一実施例で、本発明は、
ｉ）ピルビン酸からアセト乳酸へ（経路ステップａ）、
ｉｉ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸へ（経路ステップｂ）、
ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へ（経路ステップｃ）、
ｉｖ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへ（経路ステップｄ）、および
ｖ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへ（経路ステップｅ）
よりなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのＤＮＡ分子を含んでなる組換え微生物宿主細胞を提供し、少なくとも１つのＤＮＡ分子は前記微生物宿主細胞に対して異種であり、前記微生物宿主細胞はイソブタノールを生成する。
別の実施態様では、本発明は、
ｉ）ピルビン酸からアセト乳酸へ（経路ステップａ）、
ｉｉ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸へ（経路ステップｂ）、
ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へ（経路ステップｃ）、
ｉｖ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡへ（経路ステップｆ）、
ｖ）イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへ（経路ステップｇ）、および
ｖｉ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへ（経路ステップｅ）
よりなる群から選択される基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含んでなる組換え微生物宿主細胞を提供し、
少なくとも１つのＤＮＡ分子は前記微生物宿主細胞に対して異種であり、前記微生物宿主細胞はイソブタノールを生成する。
別の実施態様では、本発明は、
ｉ）ピルビン酸からアセト乳酸へ（経路ステップａ）、
ｉｉ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸へ（経路ステップｂ）、
ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へ（経路ステップｃ）、
ｉｖ）α−ケトイソ吉草酸からバリンへ（経路ステップｈ）、
ｖ）バリンからイソブチルアミンへ（経路ステップｉ）、
ｖｉ）イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへ（経路ステップｊ）、および
ｖｉｉ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへ（経路ステップｅ）
よりなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのＤＮＡ分子を含んでなる組換え微生物宿主細胞を提供し、
少なくとも１つのＤＮＡ分子は前記微生物宿主細胞に対して異種であり、前記微生物宿主細胞はイソブタノールを生成する。
別の実施態様では、本発明は、
１）ｉ）ピルビン酸からアセト乳酸へ（経路ステップａ）、
ｉｉ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸へ（経路ステップｂ）、
ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へ（経路ステップｃ）、
ｉｖ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへ（経路ステップｄ）、および
ｖ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへ（経路ステップｅ）
よりなる群から選択される基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードして、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含んでなる組換え微生物宿主細胞を提供するステップと、
２）イソブタノールが生成される条件下において発酵培地中で（ｉ）の宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップと
を含んでなり、少なくとも１つのＤＮＡ分子が前記微生物宿主細胞に対して異種である、イソブタノールの製造方法を提供する。
別の実施態様では、本発明は、
１）ｉ）ピルビン酸からアセト乳酸へ（経路ステップａ）、
ｉｉ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸へ（経路ステップｂ）、
ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へ（経路ステップｃ）、
ｉｖ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡへ（経路ステップｆ）、
ｖ）イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへ（経路ステップｇ）、および
ｖｉ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへ（経路ステップｅ）
よりなる群から選択される基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含んでなる組換え微生物宿主細胞を提供するステップと、
２）イソブタノールが生成される条件下において発酵培地中で（ｉ）の宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップと
を含んでなり、少なくとも１つのＤＮＡ分子が前記微生物宿主細胞に対して異種である、イソブタノールの製造方法を提供する。
別の実施態様で、本発明は、
１）ｉ）ピルビン酸からアセト乳酸へ（経路ステップａ）、
ｉｉ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸へ（経路ステップｂ）、
ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へ（経路ステップｃ）、
ｉｖ）α−ケトイソ吉草酸からバリンへ（経路ステップｈ）、
ｖ）バリンからイソブチルアミンへ（経路ステップｉ）、
ｖｉ）イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへ（経路ステップｊ）、および
ｖｉｉ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへ（経路ステップｅ）
よりなる群から選択される基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含んでなる組換え微生物宿主細胞を提供するステップと、
２）イソブタノールが生成される条件下において発酵培地中で（ｉ）の宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップと
を含んでなり、少なくとも１つのＤＮＡ分子が前記微生物宿主細胞に対して異種である、イソブタノールの製造方法を提供する。
代案の実施態様では、本発明は、本発明の方法によって生成されるイソブタノールを含有する発酵酵培地を提供する。
配列説明
本願明細書の一部を形成する次の詳細な説明および添付の配列説明によって、本発明をより完全に理解できるであろう。
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号およびフォーマットは、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
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配列番号１１〜３８、４０〜６９、７２〜７５、８５〜１３８、１４４、１４５、１４７〜１５７、１５９〜１７６は、ここで述べられる実施例で使用されるオリゴヌクレオチドクローニング、スクリーニングまたは配列決定プライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３９は、実施例１６で述べられるｃｓｃＢＫＡ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列である。
配列番号７０は、実施例１３で述べられるグルコースイソメラーゼプロモーター１．６ＧＩのヌクレオチド配列である。
配列番号７１は、実施例１３で述べられる１．５ＧＩプロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号７６は、実施例１７で述べられるＧＰＤプロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号７７は、実施例１７で述べられるＣＹＣ１ターミネーターのヌクレオチド配列である。
配列番号７９は、実施例１７で述べられるＦＢＡプロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号８１は、実施例１７で述べられるＡＤＨ１プロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号８２は、実施例１７で述べられるＡＤＨ１ターミネーターのヌクレオチド配列である。
配列番号８４は、実施例１７で述べられるＧＰＭプロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号１３９は、スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）のアミノ酸配列である。
配列番号１４０は、Ｄ〜フルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）のアミノ酸配列である。
配列番号１４１は、スクロースパーミアーゼ（ＣｓｃＢ）のアミノ酸配列である。
配列番号１４２は、実施例２０で述べられるプラスミドｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｓｐａｃのヌクレオチド配列である。
配列番号１４３は、実施例２０で述べられるプラスミドｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｇｒｏＥのヌクレオチド配列である。
配列番号１４６は、実施例２０で述べられるｐＦＰ９８８Ｄｓｓベクター断片のヌクレオチド配列である。
配列番号１７７は、実施例２１で述べられるｐＦＰ９８８組み込みベクターのヌクレオチド配列である。
配列番号２６７は、実施例２１で述べられるプラスミドｐＣ１９４のヌクレオチド配列である。
本発明は、組換え微生物を使用したイソブタノール生成方法に関する。本発明は、いくつかの商業的および工業的ニーズを満たす。ブタノールは多様な用途がある重要な汎用工業化学物質であり、燃料または燃料添加剤としてのその可能性は特に顕著である。四炭素のみのアルコールでありながら、ブタノールはガソリンに類するエネルギー含量を有してあらゆる化石燃料と混合できる。ブタノールを標準内燃機関内で燃焼させるとＣＯ２のみが生じ、微量または皆無のＳＯＸまたはＮＯＸしか生じないないので、それは燃料または燃料添加剤として好まれている。さらにブタノールは、今までのところ最も好ましい燃料添加剤であるエタノールよりも腐食性が低い。
生物燃料または燃料添加剤としてのその有用性に加えて、ブタノールは、新興の燃料電池産業における水素流通問題に影響を及ぼす可能性を有する。今日の燃料電池は、水素輸送および流通に関連した安全性への懸念に悩まされている。ブタノールはその水素含量を容易に改善でき、既存の給油所を通じて、燃料電池または車両のいずれかのために必要な純度で流通させることができる。
最後に本発明は、植物由来炭素源からイソブタノールを生成し、ブタノール生成のための標準石油化学法に関連する環境への悪影響を回避する。
次の定義および略語が、特許請求の範囲および明細書の解釈のために使用される。
「発明」または「本発明」という用語は、ここでの用法では非限定的用語であり、特定の発明のいかなる単一実施態様を指すことも意図されず、明細書および特許請求の範囲で述べられるような全ての可能な実施態様を包含する。
「イソブタノール生合成経路」という用語は、イソブタノールを生成する酵素経路を指す。
「アセト乳酸シンターゼ」および「アセト乳酸合成酵素」という用語は、ここで同義的に使用され、ピルビン酸からアセト乳酸およびＣＯ２への変換を触媒する酵素を指す。好ましいアセト乳酸シンターゼは、ＥＣ番号２．２．１．６９（「酵素命名法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９２年）で知られている。これらの酵素は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号ＣＡＢ１５６１８（配列番号１７８）、Ｚ９９１２２（配列番号７８）、ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））アミノ酸配列、ＮＣＢＩヌクレオチド配列、それぞれ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ジェンバンク番号ＡＡＡ２５０７９（配列番号２）、Ｍ７３８４２（配列番号１））、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ジェンバンク番号ＡＡＡ２５１６１（配列番号１８０）、Ｌ１６９７５（配列番号１７９））をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの供給源から入手できる。
「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ」および「アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ」という用語は、ここで同義的に使用され、電子供与体としてＮＡＤＰＨ（還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を使用して、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への変換を触媒する酵素を指す。好ましいアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼはＥＣ番号１．１．１．８６で知られ、配列は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号ＮＰ_４１８２２２（配列番号４）、ＮＣ_０００９１３（配列番号３））、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク番号ＮＰ_０１３４５９（配列番号１８１）、ＮＣ_００１１４４（配列番号８０））、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ジェンバンク番号ＣＡＦ３０２１０（配列番号１８３）、ＢＸ９５７２２０（配列番号１８２））、およびバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ジェンバンク番号ＣＡＢ１４７８９（配列番号１８５）、Ｚ９９１１８（配列番号１８４））をはじめとするが、これに限定されるものではないありとあらゆる微生物から入手できる。
「アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ」という用語は、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への変換を触媒する酵素を指す。好ましいアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼは、ＥＣ番号４．２．１．９で知られている。これらの酵素は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号ＹＰ_０２６２４８（配列番号６）、ＮＣ_０００９１３（配列番号５））、Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク番号ＮＰ_０１２５５０（配列番号１８６）、ＮＣ_００１１４２（配列番号８３））、Ｍ．マリパルディス（ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ジェンバンク番号ＣＡＦ２９８７４（配列番号１８８）、ＢＸ９５７２１９（配列番号１８７））、および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号ＣＡＢ１４１０５（配列番号１９０）、Ｚ９９１１５（配列番号１８９））をはじめとするが、これに限定されるものではない、ありとあらゆる微生物から入手できる。
「分枝α−ケト酸脱炭酸酵素」という用語は、α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドおよびＣＯ２への変換を触媒する酵素を指す。好ましい分枝α−ケト酸脱炭酸酵素はＥＣ番号４．１．１．７２で知られ、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ジェンバンク番号ＡＡＳ４９１６６（配列番号１９３）、ＡＹ５４８７６０（配列番号１９２）；ＣＡＧ３４２２６（配列番号８）、ＡＪ７４６３６４（配列番号１９１）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ジェンバンク番号ＮＰ_４６１３４６（配列番号１９５）、ＮＣ_００３１９７（配列番号１９４））、およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号ＮＰ_１４９１８９（配列番号１９７）、ＮＣ_００１９８８（配列番号１９６））をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの供給源から入手できる。
「分枝アルコールデヒドロゲナーゼ」という用語は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒する酵素を指す。好ましい分枝アルコールデヒドロゲナーゼはＥＣ番号１．１．１．２６５で知られているが、その他のアルコールデヒドロゲナーゼに分類されてもよい（具体的にはＥＣ１．１．１．１または１．１．１．２）。これらの酵素は電子供与体として、ＮＡＤＨ（還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）および／またはＮＡＤＰＨを利用し、Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク番号ＮＰ_０１０６５６（配列番号１９９）、ＮＣ_００１１３６（配列番号１９８）；ＮＰ_０１４０５１（配列番号２０１）ＮＣ_００１１４５（配列番号２００））、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号ＮＰ_４１７４８４（配列番号１０）、ＮＣ_０００９１３（配列番号９））、およびＣ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号ＮＰ_３４９８９２（配列番号２０３）、ＮＣ_００３０３０（配列番号２０２）；ＮＰ_３４９８９１（配列番号２０４）、ＮＣ_００３０３０（配列番号１５８））をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの供給源から入手できる。
「分枝ケト酸デヒドロゲナーゼ」という用語は、電子受容体としてＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を使用して、α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡ（イソブチリル−補酵素Ａ）への変換を触媒する酵素を指す。好ましい分枝ケト酸デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．４．４で知られている。これらの分枝ケト酸デヒドロゲナーゼは４つのサブユニットを含んでなり、全サブユニットからの配列は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号ＣＡＢ１４３３６（配列番号２０６）、Ｚ９９１１６（配列番号２０５）；ＣＡＢ１４３３５（配列番号２０８）、Ｚ９９１１６（配列番号２０７）；ＣＡＢ１４３３４（配列番号２１０）、Ｚ９９１１６（配列番号２０９）；およびＣＡＢ１４３３７（配列番号２１２）、Ｚ９９１１６（配列番号２１１））およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）（ジェンバンク番号ＡＡＡ６５６１４（配列番号２１４）、Ｍ５７６１３（配列番号２１３）；ＡＡＡ６５６１５（配列番号２１６）、Ｍ５７６１３（配列番号２１５）；ＡＡＡ６５６１７（配列番号２１８）、Ｍ５７６１３（配列番号２１７）；およびＡＡＡ６５６１８（配列番号２２０）、Ｍ５７６１３（配列番号２１９））をはじめとするが、これに限定されるものではない、ありとあらゆる微生物から入手できる。
「アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ」という用語は、電子供与体としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのどちらかを使用して、イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素を指す。好ましいアシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１．１０および１．２．１．５７で知られている。これらの酵素は、クロストリジウム・ベイジリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ジェンバンク番号ＡＡＤ３１８４１（配列番号２２２）、ＡＦ１５７３０６（配列番号２２１））、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号ＮＰ_１４９３２５（配列番号２２４）、ＮＣ_００１９８８（配列番号２２３）；ＮＰ_１４９１９９（配列番号２２６）、ＮＣ_００１９８８（配列番号２２５））、Ｐ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）（ジェンバンク番号ＡＡＡ８９１０６（配列番号２２８）、Ｕ１３２３２（配列番号２２７））、およびサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ジェンバンク番号ＹＰ_１４５４８６（配列番号２３０）、ＮＣ_００６４６１（配列番号２２９））をはじめとするが、これに限定されるものではない複数の供給源から入手できる。
「アミノ基転移酵素」という用語は、アミン供与体として、アラニンまたはグルタミン酸のどちらかを使用して、α−ケトイソ吉草酸からＬ−バリンへの変換を触媒する酵素を指す。好ましいアミノ基転移酵素は、ＥＣ番号２．６．１．４２および２．６．１．６６で知られている。これらの酵素はいくつかの供給源から入手できる。アラニン依存酵素の供給源の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号ＹＰ_０２６２３１（配列番号２３２）、ＮＣ_０００９１３（配列番号２３１））およびバシラス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ジェンバンク番号ＹＰ_０９３７４３（配列番号２３４）、ＮＣ_００６３２２（配列番号２３３））が挙げられるが、これに限定されるものではない。グルタミン酸依存酵素の供給源の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号ＹＰ_０２６２４７（配列番号２３６）、ＮＣ_０００９１３（配列番号２３５））、Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク番号ＮＰ_０１２６８２（配列番号２３８）、ＮＣ_００１１４２（配列番号２３７））およびメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号ＮＰ_２７６５４６（配列番号２４０）、ＮＣ_０００９１６（配列番号２３９））が挙げられるが、これに限定されるものではない。
「バリンデヒドロゲナーゼ」という用語は、電子供与体としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを使用し、アミン供与体としてアンモニアを使用して、α−ケトイソ吉草酸からＬ−バリンへの変換を触媒する酵素を指す。好ましいバリンデヒドロゲナーゼはＥＣ番号１．４．１．８および１．４．１．９で知られ、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ジェンバンク番号ＮＰ_６２８２７０（配列番号２４２）、ＮＣ_００３８８８（配列番号２４１））および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号ＣＡＢ１４３３９（配列番号２４４）、Ｚ９９１１６（配列番号２４３））をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの供給源から入手できる。
「バリン脱炭酸酵素」という用語は、Ｌ−バリンからイソブチルアミンおよびＣＯ２への変換を触媒する酵素を指す。好ましいバリン脱炭酸酵素はＥＣ番号４．１．１．１４で知られている。これらの酵素は、例えば、ストレプトミセス・ビリディファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）（ジェンバンク番号ＡＡＮ１０２４２（配列番号２４６）、ＡＹ１１６６４４（配列番号２４５））などのストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）に見られる。
「ωアミノ基転移酵素」という用語は、アミン供与体として適切なアミノ酸を使用して、イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素を指す。好ましいωアミノ基転移酵素はＥＣ番号２．６．１．１８で知られ、アルカリゲネス・デニトリフィカンス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）（ＡＡＰ９２６７２（配列番号２４８）、ＡＹ３３０２２０（配列番号２４７））、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ジェンバンク番号ＹＰ_２９４４７４（配列番号２５０）、ＮＣ_００７３４７（配列番号２４９））、シュワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）（ジェンバンク番号ＮＰ_７１９０４６（配列番号２５２）、ＮＣ_００４３４７（配列番号２５１））、およびＰ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）（ジェンバンク番号ＡＡＮ６６２２３（配列番号２５４）、ＡＥ０１６７７６（配列番号２５３））をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの供給源から入手できる。
「イソブチリル−ＣｏＡムターゼ」という用語は、ブチリル−ＣｏＡからイソブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素を指す。この酵素は補助因子として補酵素Ｂ１２を使用する。好ましいイソブチリル−ＣｏＡムターゼはＥＣ番号５．４．９９．１３で知られている。これらの酵素は、ストレプトミセス・シナモネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）（ジェンバンク番号ＡＡＣ０８７１３（配列番号２５６）、Ｕ６７６１２（配列番号２５５）；ＣＡＢ５９６３３（配列番号２５８）、ＡＪ２４６００５（配列番号２５７））、Ｓ．コエリカラー（ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ジェンバンク番号ＣＡＢ７０６４５（配列番号２６０）、ＡＬ９３９１２３（配列番号２５９）；ＣＡＢ９２６６３（配列番号２６２）、ＡＬ９３９１２１（配列番号２６１））、およびストレプトミセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号ＮＰ_８２４００８（配列番号２６４）、ＮＣ_００３１５５（配列番号２６３）；ＮＰ_８２４６３７（配列番号２６６）、ＮＣ_００３１５５（配列番号２６５））をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかのストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）に見られる。
「通性嫌気性菌」という用語は、好気性および嫌気性環境の双方において生育できる微生物を指す。
「炭素基質」または「発酵性炭素基質」という用語は、本発明の宿主生物によって代謝されることができる炭素源を指し、特に単糖類、オリゴ糖類、多糖類、および一炭素基質またはそれらの混合物よりなる群から選択される炭素源を指す。
「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質として発現されることができ、場合によりコード配列に先行し（５’非コード配列）および後続する（３’非コード配列）制御配列を含む核酸断片を指す。「天然遺伝子」とは、それ自体の制御配列と共に天然に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、天然には一緒に見られない調節およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する制御配列およびコード配列を含んでもよく、または同一供給源に由来するが、天然に見られるのとは異なる様式に配列された制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその自然な位置にある天然遺伝子を指す。「外来性遺伝子」または「異種遺伝子」とは、常態では宿主生物中に見られないが、遺伝子移入により宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換手順によってゲノム中に導入される遺伝子である。
ここでの用法では「コード配列」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」とは、コード配列上流（５’非コード配列）、その中、または下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、それは関連したコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響する。制御配列はプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造を含んでもよい。
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来してもよく、または天然に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントを含んでなってもよい。当業者は、異なる組織または細胞タイプにおいて、または異なる発生段階において、または異なる環境的または生理学的条件に応じて、異なるプロモーターが遺伝子の発現を指示してもよいことを理解する。ほとんどの場合にほとんどの細胞タイプで遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。
「作動的に結合する」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターはコード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動的に結合する（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節の下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンスオリエンテーションで制御配列に作動的に結合できる。
「発現」と言う用語は、ここでの用法では、発明の核酸断片から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもよい。
ここでの用法では「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす宿主生物への核酸断片の転移を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」生物と称される。
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常、環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの直鎖または環状の自律的に複製される配列、ゲノム一体化配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、それはその中で適切な３’非翻訳配列と共に、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる独自の構成に、いくつかのヌクレオチド配列が結合または組換えされるあらゆる供給源に由来する。「形質転換カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする要素を有する、特定のベクターを指す。
ここでの用法では「コドン縮重」という用語は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響することなく、ヌクレオチド配列の変更を可能にする遺伝コードにおける性質を指す。当業者は、任意のアミノ酸を特定化するためのヌクレオチドコドンの利用において、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を十分承知している。したがって宿主細胞中での改善された発現のために遺伝子を合成する場合、コドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるように、遺伝子をデザインすることが望ましい。
「コドン最適化」と言う用語は、様々な宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子のコーディング領域について言及する場合、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変することなく、宿主生物体の典型的なコドン使用を反映させる、遺伝子中のコドンまたは核酸分子のコーディング領域の改変を指す。
ここで使用される標準リコンビナントＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８９年（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ），Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ），Ｍ．Ｌ．およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ），Ｌ．Ｗ．、「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８４年；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版、１９８７年、で述べられている。
イソブタノール生合成経路
炭水化物利用微生物は、中心的代謝経路として、エムデン−マイヤーホフ−パーナス（ＥＭＰ）経路、エントナー−ドウドロフ経路、およびペントースリン酸回路を用いて、生育および維持のためのエネルギーおよび細胞前駆物質を提供する。これらの経路は共通して中間体グリセルアルデヒド−３−リン酸を有し、究極的にピルビン酸が直接に、またはＥＭＰ経路と組み合わさって形成される。引き続いてピルビン酸は多様な手段を通じて、アセチル−補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）に転換される。アセチル−ＣｏＡは、例えば脂肪酸、アミノ酸、および二次代謝産物を発生させる上で、重要な中間体の役割を果たす。ピルビン酸への糖変換反応の組み合わせは、エネルギー（例えばアデノシン−５’−三リン酸、ＡＴＰ）および還元等価物（例えば還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ＮＡＤＨ、および還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ＮＡＤＰＨ）を生じる。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨはそれらの酸化形態（それぞれＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋）に再生されなくてはならない。無機電子受容体（例えばＯ２、ＮＯ３ −、およびＳＯ４ ２−）の存在下で還元等価物を使用してエネルギープールが増強されてもよく、あるいは還元炭素副産物が形成されてもよい。
本発明は、図１に示すような４つの完全な反応経路を提供することで、組換え微生物による炭水化物源からのイソブタノールの生成を可能にする。経路の３つは、一連の酵素的ステップを通じたピルビン酸からイソブタノールへの変換を含んでなる。好ましいイソブタノール経路（図１のステップａ〜ｅ）は、
ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒される、ピルビン酸からアセト乳酸への、
ｂ）例えばアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼによって触媒される、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への、
ｃ）例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒される、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への、
ｄ）例えば分枝ケト酸脱炭酸酵素によって触媒される、α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの、および
ｅ）例えば分枝アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒される、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの
基質から産物への変換を含んでなる。
この経路には、バリン生合成（ピルビン酸からα−ケトイソ吉草酸）およびバリン異化作用（α−ケトイソ吉草酸からイソブタノール）の良好に特徴づけられた経路に関与することが知られている酵素が組み合わされる。多くのバリン生合成酵素は、イソロイシン生合成経路中で類似反応もまた触媒するので、遺伝子源を選択する上で基質特異性が主な検討材料である。この理由から、アセト乳酸シンターゼ酵素のための関心のある主要な遺伝子は、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（ａｌｓＳ）およびクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（ｂｕｄＢ）からのものである。これらの特定のアセト乳酸シンターゼは、これらの生物中でブタンジオール発酵に関与することが知られており、ピルビン酸に対してケト酪酸よりも大きい親和性を示す（ゴロップ（Ｇｏｌｌｏｐ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２（６）：３４４４〜３４４９頁、１９９０年；ホルツクロウ（Ｈｏｌｔｚｃｌａｗ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２１（３）：９１７〜９２２頁、１９７５年）。経路の第２および第３のステップは、それぞれアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼおよびデヒドラターゼによって触媒される。これらの酵素は、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（チャンドル（Ｃｈｕｎｄｕｒｕ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８（２）：４８６〜４９３頁、１９８９年；フリント（Ｆｌｉｎｔ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（２９）：１４７３２〜１４７４２頁、１９９３年）などのいくつかの供給源から特徴づけられている。好ましいイソブタノール経路の最後の２つのステップは、窒素源としてバリンを使用できる酵母で生じることが知られており、その過程でイソブタノールが分泌される。α−ケトイソ吉草酸は、例えばピルビン酸脱炭酸酵素などのいくつかのケト酸脱炭酸酵素によって、イソブチルアルデヒドに転換できる。ピルビン酸をイソブタノール生成からそらすのを防止するために、ピルビン酸に対する低下した親和力を有する脱炭酸酵素が所望される。これまでにこのような２つの酵素が、当該技術分野で既知である（スミット（Ｓｍｉｔ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１（１）：３０３〜３１１頁、２００５年；デラプラザ（ｄｅ ｌａ Ｐｌａｚａ）ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２３８（２）：３６７〜３７４頁、２００４年）。どちらの酵素もラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）株からのものであり、ケトイソ吉草酸に対してピルビン酸の５０〜２００倍の選択性を有する。最後に、いくつかのアルデヒド還元酵素が酵母中で同定されており、多くに重複する基質特異性がある。これらは、どちらも電子供与体としてＮＡＤＰＨを使用する、アルコールデヒドロゲナーゼＶＩ（ＡＤＨ６）およびＹｐｒ１ｐ（ラロイ（Ｌａｒｒｏｙ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６１（Ｐｔ１）：１６３〜１７２頁、２００２年；フォード（Ｆｏｒｄ）ら、Ｙｅａｓｔ１９（１２）：１０８７〜１０９６頁、２００２年）をはじめとするが、これに限定されるものではない分枝基質をアセトアルデヒドよりも好むことが知られている。分枝基質に対する活性があるＮＡＤＰＨ依存還元酵素ＹｑｈＤもまた、最近大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で同定されている（ズルツェンバッハー（Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２（２）：４８９〜５０２頁、２００４年）。
ピルビン酸からイソブタノールに転換するための別の経路は、
ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒される、ピルビン酸からアセト乳酸への、
ｂ）例えばアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼによって触媒される、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への、
ｃ）例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒される、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への、
ｆ）例えば分枝ケト酸デヒドロゲナーゼによって触媒される、α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡへの、
ｇ）例えばアシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒される、イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの、および
ｅ）例えば分枝アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒される、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの
基質から産物への変換を含んでなる（図１のステップａ、ｂ、ｃ、ｆ、ｇ、ｅ）。
この経路の最初の３つのステップ（ａ、ｂ、ｃ）は、上述のものと同じである。α−ケトイソ吉草酸は分枝ケト酸デヒドロゲナーゼの作用によってイソブチリル−ＣｏＡに転換される。酵母が窒素源としてバリンのみを使用できるのに対して、その他の多くの生物（真核生物および原核生物の双方）はバリンもまた炭素源として使用できる。これらの生物は、イソブチリル−ＣｏＡを発生させる分枝ケト酸デヒドロゲナーゼを有する（ソカッチ（Ｓｏｋａｔｃｈ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４８（２）：６４７〜６５２頁、１９８１年）。イソブチリル−ＣｏＡは、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼによってイソブチルアルデヒドに転換されてもよい。分枝基質に対するデヒドロゲナーゼ活性については、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）およびプロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で記述されているが、クローニングされてはいない（カザハヤ（Ｋａｚａｈａｙａ）ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：４３〜５５頁、１９７２年；ホソイ（Ｈｏｓｏｉ）ら、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５７：４１８〜４２７頁、１９７９年）。しかし直鎖アシル−ＣｏＡ（すなわちブチリル−ＣｏＡ）に対して機能することが知られているアシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼが、イソブチリル−ＣｏＡに作用することもまた可能である。次にイソブチルアルデヒドは第１の経路について上述したように、分枝アルコールデヒドロゲナーゼによってイソブタノールに転換される。
ピルビン酸をイソブタノールに転換するための別の経路は、
ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒される、ピルビン酸からアセト乳酸への、
ｂ）例えばアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼによって触媒される、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への、
ｃ）例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒される、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への、
ｈ）例えばバリンデヒドロゲナーゼまたはアミノ基転移酵素によって触媒される、α−ケトイソ吉草酸からバリンへの、
ｉ）例えばバリン脱炭酸酵素によって触媒される、バリンからイソブチルアミンへの、
ｊ）例えばωアミノ基転移酵素によって触媒される、イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの、および
ｅ）例えば分枝アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒される、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの
基質から産物への変換（図１のステップａ、ｂ、ｃ、ｈ、ｉ、ｊ、ｅ）を含んでなる。
この経路の最初の３つのステップ（ａ、ｂ、ｃ）は、上述のものと同じである。この経路はバリンデヒドロゲナーゼまたは適切なアミノ基転移酵素の添加を必要とする。バリン（および／またはロイシン）デヒドロゲナーゼは還元的アミノ化を触媒し、アンモニアを使用する。アンモニアのＫｍ値はミリモル濃度範囲にある（プリーストリー（Ｐｒｉｅｓｔｌｙ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２６１（３）：８５３〜８６１頁、１９８９年；バンキュラ（Ｖａｎｃｕｒａ）ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３４（１２）：３２１３〜３２１９頁、１９８８年；ツィンク（Ｚｉｎｋ）ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．９９：７２〜７７頁、１９６２年；セキモト（Ｓｅｋｉｍｏｔｏ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｊａｐａｎ）１１６（１）：１７６〜１８２頁、１９９４年）。アミノ基転移酵素は、アミノ供与体として典型的にグルタミン酸またはアラニンのどちらかを使用し、いくつかの生物から特徴づけられている（リー−ペン（Ｌｅｅ−Ｐｅｎｇ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３９（２）：３３９〜３４５頁、１９７９年；ベルグ（Ｂｅｒｇ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５５（３）：１００９〜１０１４頁、１９８３年）。アミン基を除去する場合、このステップからのピルビン酸生成は後の経路におけるピルビン酸消費と連結できるので、アラニン特異的酵素が望ましいかもしれない（下記参照）。次のステップは、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）中のバラニマイシン生合成で生じる反応である、バリンの脱カルボキシル化である（ガーグ（Ｇａｒｇ）ら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６（２）：５０５〜５１７頁、２００２年）。得られたイソブチルアミンを例えばω−アミノ転移酵素ファミリーの酵素によって、ピリドキサール５’−ホスフェート依存反応中でイソブチルアルデヒドに転換してもよい。ビブリオ・フルビアス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）からのこのような酵素は、イソブチルアミンに対する活性を実証した（シン（Ｓｈｉｎ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６５（２）：２０６〜２１１頁、１９９９年）。アルカリゲネス・デニトリフィカンス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）からの別のω−アミノ転移酵素はクローンされており、ブチルアミンに対するいくらかの活性を有する（ヤン（Ｙｕｎ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０（４）：２５２９〜２５３４頁、２００４年）。この方向では、これらの酵素はアミノ受容体としてピルビン酸を使用し、アラニンを生じる。上述のように経路の早い時期にピルビン酸生成アミノ基転移酵素を使用して、ピルビン酸プールに対する悪影響を相殺してもよい。次に第１の経路について上述したように、イソブチルアルデヒドを分枝アルコールデヒドロゲナーゼによってイソブタノールに転換する。
第４のイソブタノール生合成経路は、図１のステップｋ、ｇ、ｅで示される基質から産物への変換を含んでなる。いくつかの生物は、ブチリル−ＣｏＡ中間体を通じてブチレートおよび／またはブタノールを生成することが知られている（デューラー（Ｄｕｅｒｒｅ）ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１７（３）：２５１〜２６２頁、１９９５年；アバッド−アンダロウシ（Ａｂｂａｄ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４２（５）：１１４９〜１１５８頁、１９９６年）。ブチリル−ＣｏＡをイソブチリル−ＣｏＡ転換できるムターゼの添加によって、これらの生物中でイソブタノール生成を改変してもよい（図１のステップｋ）。補酵素Ｂ１２依存酵素であるイソブチリル−ＣｏＡムターゼの双方のサブユニットの遺伝子が、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ）からクローンされている（ラトナチレケ（Ｒａｔｎａｔｉｌｌｅｋｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（４４）：３１６７９〜３１６８５頁、１９９９年）。イソブチリル−ＣｏＡはイソブチルアルデヒドに転換され（図１のステップｇ）、それがイソブタノールに転換される（図１のステップｅ）。
このようにして、ピルビン酸からイソブタノールへの複数の組換え経路を提供する上で、個々の変換ステップを満足させるいくつかの選択があり、当業者は公的に入手可能な配列を利用して妥当な経路を構築できる。当該技術分野で既知でありイソブタノール生合成経路構築で有用な、代表的ないくつかの遺伝子一覧を下の表２に列挙する。
Figure 0005276986
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イソブタノール生成のための微生物宿主
イソブタノール生成のための微生物宿主は、細菌、ラン藻、糸状菌類、および酵母から選択されてもよい。イソブタノール生成のために使用される微生物宿主は、ブタノール毒性によって収率が制限されないように、好ましくはイソブタノールに耐性である。イソブタノールの高力価レベルで代謝的に活性の微生物については、当該技術分野で周知ではない。溶剤起源クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）からブタノール耐性突然変異体が単離さているが、その他の潜在的に有用な細菌株のブタノール耐性に関する情報はほとんどない。細菌におけるアルコール耐性の比較に関する研究のほとんどは、ブタノールがエタノールよりも毒性が高いことを示唆する（デ・カバルホ（ｄｅ Ｃａｖａｌｈｏ）ら、Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．６４：２１５〜２２頁、２００４年；およびカベリッツ（Ｋａｂｅｌｉｔｚ）ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２２０：２２３〜２２７頁、２００３年）。トーマス（Ｔｏｍａｓ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２００６〜２０１８頁、２００４年、はクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）中での発酵における１−ブタノールの収率が、１−ブタノール毒性によって制限されるかもしれないことを報告する。クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に対する１−ブタノールの主要効果は、膜機能の崩壊である（ヘルマン（Ｈｅｒｍａｎｎ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５０：１２３８〜１２４３頁、１９８５年）。
イソブタノール生成のために選択される微生物宿主は、好ましくはイソブタノールに耐性であり、炭水化物をイソブタノールに転換できなくてはならない。適切な微生物宿主選択のための判定基準としては、以下が挙げられる。イソブタノールに対する内因的耐性、高率のグルコース使用、遺伝子操作のための遺伝的ツールの利用可能性、および安定した染色体の改変を発生させる能力。
イソブタノールに耐性の適切な宿主株は、株の内因的耐性に基づいたスクリーニングによって同定してもよい。イソブタノールに対する微生物の内因的耐性は、最少培地中で生育させた際に、生育速度の５０％阻害（ＩＣ５０）を引き起こすイソブタノールの濃度を判定することで測定してもよい。ＩＣ５０値は、当該技術分野で既知の方法を使用して判定してもよい。例えば様々な量のイソブタノールの存在下で関心のある微生物を生育させ、６００ナノメートルにおける光学濃度を測定することで生育速度をモニターしてもよい。生育曲線の対数部分から倍加時間を計算して、生育速度の尺度として使用してもよい。生育の５０％阻害を生じるイソブタノールの濃度は、イソブタノール濃度に対する％生育阻害のグラフから判定してもよい。好ましくは宿主株は、イソブタノールに対して約０．５％を超えるＩＣ５０を有するべきである。
イソブタノール生成のための微生物宿主はまた、グルコースも高率で利用するべきである。ほとんどの微生物は炭水化物を利用できる。しかし特定の環境的微生物は炭水化物を高い効率で利用できないので、適切な宿主ではない。
宿主を遺伝的に変性する能力は、あらゆる組換え微生物の生成に必須である。遺伝子移入技術の様式は、電気穿孔、接合、形質導入または自然形質転換であってもよい。広範な宿主接合性プラスミドおよび薬剤抵抗性マーカーが利用できる。クローニングベクターは、宿主中で機能できる抗生物質抵抗性マーカーの性質に基づいて、宿主生物に合わせて調整される。
微生物宿主はまた、炭素流動について競合する経路を不活性化するために、様々な遺伝子を削除することで操作しなくてはならない。これは、不活性化を指示するトランスポゾンまたは染色体組み込みベクターのいずれかを利用できる必要がある。さらに内因的イソブタノール耐性を改善する突然変異が得られるように、産生宿主は化学的突然変異誘発を容易に受け入れるべきである。
上述の判定基準に基づいて、イソブタノール生成のための適切な微生物宿主としては、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の一員が挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましい宿主としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バチラス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、パエニバシラス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
産生宿主の構築
発酵性炭素基質からイソブタノールへの変換のための酵素的経路をコードする必要な遺伝子を含有する組換え生物は、当該技術分野で周知の技術を使用して構築してもよい。本発明では、例えばアセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、分枝α−ケト酸脱炭酸酵素、および分枝アルコールデヒドロゲナーゼなどの本発明のイソブタノール生合成経路の酵素をコードする遺伝子を上述のように様々な供給源から単離してもよい。
細菌ゲノムから所望の遺伝子を得る方法は、分子生物学の当該分野で一般的であり、周知である。例えば遺伝子配列が既知であれば、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なゲノムのライブラリーを作り出し、所望の遺伝子配列に相補的なプローブでスクリーンしてもよい。ひとたび配列が単離されると、ポリメラーゼ連鎖反応などの標準プライマー誘導増幅方法（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を使用してＤＮＡを増幅し、適切なベクターを使用した形質転換に適した量のＤＮＡを得てもよい。異種の宿主中での発現のためのコドン最適化ツールは、容易に入手できる。コドン最適化のためのいくつかのツールは、宿主生物のＧＣ含量に基づいて利用できる。いくつかの例示的な微生物宿主のＧＣ含量を表３に示す。
Figure 0005276986
ひとたび妥当な経路遺伝子を同定および単離したら、それらを当該技術分野で周知の手段によって適切な発現宿主に形質転換してもよい。多様な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは一般的であり、ウィスコンシン州マディソンのエピセンター（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、カリフォルニア州ラホヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））、およびマサチューセッツ州ベヴァリーのニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレーテッド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））などの会社から市販される。典型的にベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、および自律複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始制御を内部に持つ遺伝子の５’領域、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含んでなる。どちらの制御領域も形質転換宿主細胞に相同的な遺伝子に由来してもよいが、このような制御領域はまた、産生宿主として選択された特定の種に天然でない遺伝子に由来してもよいものと理解される。
所望の宿主細胞において関連する経路コード領域の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数多く、当業者にはなじみが深い。ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、ＣＵＰ１、ＦＢＡ、ＧＰＤ、およびＧＰＭ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）中での発現に有用）；ＡＯＸ１（ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）中での発現に有用）；およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）中での発現に有用）；ａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび様々なファージプロモーター（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチラス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、およびパエニバシラス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）中での発現に有用）；ｎｉｓＡ（グラム陽性細菌での発現に有用、アイヘンバウム（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（８）：２７６３〜２７６９頁、１９９８年）；および合成Ｐ１１プロモーター（ラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）中での発現に有用、ラッド（Ｒｕｄ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５２：１０１１〜１０１９頁、２００６年）をはじめとするが、これに限定されるものではない、これらの遺伝的要素を駆動できるあらゆるプロモーターが事実上、本発明に適する。
終結制御領域は、好ましい宿主から産生する様々な遺伝子に由来してもよい。場合により終結部位は不必要であってもよいが、含まれれば最も好ましい。
特定のベクターは広範な宿主細菌中で複製することができ、接合によって転移できる。ｐＲＫ４０４、および３つの関連ベクターｐＲＫ４３７、ｐＲＫ４４２、およびｐＲＫ４４２（Ｈ）の完全な注釈付き配列が入手できる。これらの誘導体は、グラム陰性細菌中の遺伝的操作のための有益なツールであることが証明されている（スコット（Ｓｃｏｔｔ）ら、Ｐｌａｓｍｉｄ ５０（１）：７４〜７９頁、２００３年）。広宿主範囲Ｉｎｃ Ｐ４プラスミドＲＳＦ１０１０のいくつかのプラスミド誘導体もまた、グラム陰性細菌中で機能できるプロモーターと共に入手できる。プラスミドｐＡＹＣ３６およびｐＡＹＣ３７は、複数クローニング部位と共に活性プロモーターを有し、グラム陰性細菌中での異種遺伝子の発現を可能にする。
染色体の遺伝子置換ツールもまた、広く入手できる。例えば広宿主範囲レプリコンｐＷＶ１０１の熱感受性変異型が改質されてプラスミドｐＶＥ６００２が構築されており、これは一連のグラム陽性細菌中に遺伝子置換をもたらすのに使用できる（モーガン（Ｍａｇｕｉｎ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４（１７）：５６３３〜５６３８頁、１９９２年）。さらに生体外トランスポゾームを利用して、エピセンター（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）（登録商標）などの商業的供給源からの多様なゲノム中にランダム突然変異を作り出せる。
様々な好ましい微生物宿主中でのイソブタノール生合成経路の発現については、下でより詳細に述べる。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のイソブタノール生合成経路の発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換に有用なベクターまたはカセットは一般的であり、上に列挙した会社から市販される。例えば実施例６および７で述べられるように、イソブタノール生合成経路の遺伝子を様々な供給源から単離して、変性ｐＵＣ１９ベクター中にクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＭ５２２に形質転換してもよい。
ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）中でのイソブタノール生合成経路の発現
ｐＲｈＢＲ１７およびｐＤＡ７１をはじめとするがこれに限定されるものではない、一連の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルベクターが、Ｒ．エリスロポリス（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）中での発現のために利用できる（コスチクカ（Ｋｏｓｔｉｃｈｋａ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６２：６１〜６８頁、２００３年）。さらにＲ．エリスロポリス（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）中での異種の遺伝子発現のために、一連のプロモーターが利用できる（例えばナカシマ（Ｎａｋａｓｈｉｍａ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：５５５７〜５５６８頁、２００４年；およびタオ（Ｔａｏ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５年、ＤＯＩ１０．１００７／ｓ００２５３−００５−００６４を参照されたい）。タオ（Ｔａｏ）ら（前出）およびブランズ（Ｂｒａｎｓ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：２０２９〜２０３６、２０００年、で述べられる方法を使用して、Ｒ．エリスロポリス（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）中の染色体遺伝子の標的を定めた遺伝子中断を作り出してもよい。
上述のようにイソブタノール生成に必要な異種の遺伝子は、最初にｐＤＡ７１またはｐＲｈＢＲ７１中でクローニングして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換してもよい。次にコスチクカ（Ｋｏｓｔｉｃｈｋａ）ら（前出）が述べるように、電気穿孔によってベクターをＲ．エリスロポリス（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）に形質転換してもよい。組換え体はグルコースを含有する合成培地中で生育させてもよく、当該技術分野で既知の方法を使用したイソブタノール生成がそれに続く。
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中でのイソブタノール生合成経路の発現
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中での遺伝子発現および突然変異作成の方法もまた、当該技術分野で周知である。例えば実施例８で述べられるように、イソブタノール生合成経路の遺伝子を様々な供給源から単離し、変性ｐＵＣ１９ベクター中にクローニングして枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０に形質転換してもよい。さらに実施例２０で述べられるように、イソブタノール生合成経路の５つの遺伝子を発現のために２つのオペロンに分割できる。経路の３つの遺伝子（ｂｕｂＢ、ｉｌｖＤ、およびｋｉｖＤ）は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０の染色体に組み込まれた（ペイン（Ｐａｙｎｅ）およびジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：２２７８〜２２８２頁、１９９１年）。残る２つの遺伝子（ｉｌｖＣおよびｂｄｈＢ）は、発現ベクター中にクローニングされ、組み込まれたイソブタノール遺伝子を保有するバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株に形質転換された。
Ｂ．リチェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）におけるイソブタノール生合成経路の発現
プロトプラスト形質転換または電気穿孔のどちらかによって、Ｂ．リチェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を形質転換するのに、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中で複製されるプラスミドおよびシャトルベクターのほとんどが使用できる。イソブタノール生成に必要な遺伝子をプラスミドは、ｐＢＥ２０またはｐＢＥ６０誘導体中でクローニングしてもよい（ナガラージャン（Ｎａｇａｒａｊａｎ）ら、Ｇｅｎｅ １１４：１２１〜１２６頁、１９９２年）。Ｂ．リチェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を形質転換する方法は当該技術分野で既知である（例えばフレミング（Ｆｌｅｍｉｎｇ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６１（１１）：３７７５〜３７８０頁、１９９５年、を参照されたい）。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中での発現のために構築されたプラスミドは、Ｂ．リチェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に形質転換されて、イソブタノールを生成する組換え微生物宿主を生じてもよい。
パエニバシラス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）中でのイソブタノール生合成経路の発現
上述のように枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中での発現のためにプラスミドを構築し、プロトプラスト形質転換によってパエニバシラス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）に形質転換し、イソブタノールを生成する組換え微生物宿主を生成してもよい。
アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）（（ラルストニア・ユートロファス（ラルストニア・ユートロファス（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ））中でのイソブタノール生合成経路の発現
アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）中での遺伝子発現および突然変異発生の方法は、当該技術分野で既知である（例えばタガビ（Ｔａｇｈａｖｉ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６０（１０）：３５８５〜３５９１頁、１９９４年、を参照されたい）。イソブタノール生合成経路のための遺伝子を上述の広宿主範囲ベクターのいずれかの中でクローニングし、電気穿孔してイソブタノールを生成する組換え体を発生させてもよい。アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）中のポリ（ヒドロキシブチレート）経路については詳細に記述され、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）ゲノムを変性する多様な遺伝的技術が知られており、イソブタノール生合成経路を操作するためにこれらのツールが応用できる。
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）中でのイソブタノール生合成経路の発現
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）中での遺伝子発現のための方法は、当該技術分野で既知である（例えば参照によって本明細書に援用するベン−バサット（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ）らに付与された米国特許第６，５８６，２２９号明細書を参照されたい）。ブタノール経路遺伝子をｐＰＣＵ１８中に挿入してもよく、このライゲーションしたＤＮＡをエレクトロコンピテントなシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＤＯＴ−Ｔ１Ｃ５ａＡＲ１細胞中に電気穿孔して、イソブタノールを生じる組換え体を発生させてもよい。
サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中でのイソブタノール生合成経路の発現
サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での遺伝子発現のための方法は、当該技術分野で既知である（例えばクリスティン・ガスリー（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｇｕｔｈｒｉｅ）およびジェラルドＲ．フィンク（Ｇｅｒａｌｄ Ｒ．Ｆｉｎｋ）編、「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、第１９４巻、「酵母の遺伝学と分子および細胞生物学ガイド（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（パートＡ）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、２００４年、を参照されたい）。酵母中での遺伝子発現は、典型的にプロモーターとそれに続く関心のある遺伝子、および転写ターミネーターを必要とする。イソブタノール生合成経路をコードする遺伝子のための発現カセットを構築する上で、構成的プロモーターＦＢＡ、ＧＰＤ、ＡＤＨ１およびＧＰＭ、および誘導性プロモーターＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ１ｔ、ＣＹＣ１、およびＡＤＨ１をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの酵母プロモーターを使用できる。例えば適切な転写ターミネーターとしては、ＦＢＡｔ、ＧＰＤｔ、ＧＰＭｔ、ＥＲＧ１０ｔ、およびＧＡＬ１ｔが挙げられるが、これに限定されるものではない。イソブタノール生合成経路の適切なプロモーター、転写ターミネーター、および遺伝子は、実施例１７で述べられるように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクター中にクローニングしてもよい。
ラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）中でのイソブタノール生合成経路の発現
乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属は乳酸桿菌科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌａｌｅｓ）に属し、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の形質転換で使用される多くのプラスミドおよびベクターを乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）のために使用してもよい。適切なベクターの非限定的例としては、ｐＡＭβ１およびその誘導体（ルノー（Ｒｅｎａｕｌｔ）ら、Ｇｅｎｅ １８３：１７５〜１８２頁、１９９６年、およびオサリバン（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら、Ｇｅｎｅ １３７：２２７〜２３１、１９９３年）；ｐＭＢＢ１およびｐＨＷ８００、ｐＭＢＢ１誘導体（ワイコフ（Ｗｙｃｋｏｆｆ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：１４８１〜１４８６頁、１９９６年）；ｐＭＧ１、接合性プラスミド（タニモト（Ｔａｎｉｍｏｔｏ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５８００〜５８０４頁、２００２年）；ｐＮＺ９５２０（クレールベゼム（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５８１〜４５８４頁、１９９７年）；ｐＡＭ４０１（フジモト（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：１２６２〜１２６７頁、２００１年）；およびｐＡＴ３９２（アーサー（Ａｒｔｈｕｒ）ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８：１８９９〜１９０３頁、１９９４年）が挙げられる。ラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）からのいくつかのプラスミドもまた報告されている（例えばバンクラーネンブルクＲ、ゴーリックＮ、ボンジャースＲ、レールＲＪ、デボスＷＭ、シーゼンＲＪ、クレールベゼムＭ．（ｖａｎ Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇ Ｒ、Ｇｏｌｉｃ Ｎ、Ｂｏｎｇｅｒｓ Ｒ、Ｌｅｅｒ ＲＪ、ｄｅ Ｖｏｓ ＷＭ、Ｓｉｅｚｅｎ ＲＪ、Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ Ｍ）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．；７１（３）：１２２３〜１２３０頁、２００５年３月）。例えばラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）中でのイソブタノール生合成経路の発現については、実施例２１で述べられる。
エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、およびエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）中におけるイソブタノール生合成経路の発現
腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属は乳酸菌科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）に属し、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の形質転換において使用される多くのプラスミドおよびベクターが、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）のために使用できる。適切なベクターの非限定的例としては、ｐＡＭβ１およびその誘導体（ルノー（Ｒｅｎａｕｌｔ）ら、Ｇｅｎｅ １８３：１７５〜１８２頁、１９９６年、およびオサリバン（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら、Ｇｅｎｅ １３７：２２７〜２３１、１９９３年）；ｐＭＢＢ１およびｐＨＷ８００、ｐＭＢＢ１誘導体（ワイコフ（Ｗｙｃｋｏｆｆ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：１４８１〜１４８６頁、１９９６年）；ｐＭＧ１、接合性プラスミド（タニモト（Ｔａｎｉｍｏｔｏ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５８００〜５８０４頁、２００２年）；ｐＮＺ９５２０（クレールベゼム（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５８１〜４５８４頁、１９９７年）；ｐＡＭ４０１（フジモト（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：１２６２〜１２６７頁、２００１年）；およびｐＡＴ３９２（アーサー（Ａｒｔｈｕｒ）ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８：１８９９〜１９０３頁、１９９４年）が挙げられる。ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）からのｎｉｓＡ遺伝子を使用したＥ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）のための発現ベクターもまた使用してもよい（アイヘンバウム（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：２７６３〜２７６９頁、１９９８年。さらにＥ．フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ）染色体中での遺伝子置換のためのベクターを使用してもよい（ナラパレディ（Ｎａｌｌａａｐａｒｅｄｄｙ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２：３３４〜３４５頁、２００６年）。例えばエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）中でのイソブタノール生合成経路の発現については、実施例２２で述べられる。
発酵培地
本発明における発酵培地は、適切な炭素基質を含有しなくてはならない。適切な基質としては、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、乳糖またはスクロースなどのオリゴ糖類、デンプンまたはセルロースなどの多糖類、またはそれらの混合物、および乳清透過液、コーンスティープリーカー、甜菜モラセス、および大麦の麦芽などの再生可能原材料からの未精製混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに炭素基質は、重要な生化学的中間体への代謝転換が実証されている二酸化炭素、またはメタノールなどの一炭素基質であってもよい。メチロトローフ生物体はまた、一または二炭素基質に加えて、代謝活性のためにメチルアミン、グルコサミン、および多様なアミノ酸などのいくつかのその他の炭素含有化合物を利用することが知られている。例えばメチロトローフ酵母菌は、メチルアミンからの炭素を利用してトレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（マレル，Ｊ．コリン（Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ）、ケリー，ドンＰ．（Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ Ｐ．）編、第７回国際シンポジウム、ベリオン（Ｂｅｌｌｉｏｎ）ら、「Ｃ１化合物上における微生物の生育（Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」、４１５〜３２頁、１９９３年、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔによる出版、Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に様々なカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種がアラニンまたはオレイン酸を代謝する（サルター（Ｓｕｌｔｅｒ）ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５〜４８９頁、１９９０年）。したがって本発明で用いられる炭素源は多種多様な炭素含有基質を包含してもよく、生物体の選択によってのみ制限されることが考察される。
前述の全ての炭素基質およびそれらの混合物は、本発明で適切であることが考察されるが、好ましい炭素基質はグルコース、フルクトース、およびスクロースである。
適切な炭素源に加えて、発酵培地は、適切な無機物、塩、補助因子、緩衝液、および培養の生育とイソブタノール生成に必要な酵素的経路の促進に適した、当業者に既知のその他の構成要素を含有しなくてはならない。
培養条件
典型的に細胞は、約２５℃〜約４０℃の範囲の温度で適切な培地中で生育させる。本発明における適切な増殖培地は、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）ブロス、サブローデキストロース（ＳＤ）ブロスまたは酵母培地（ＹＭ）ブロスなどの一般的で商業的に調製された培地である。その他の合成（ｄｅｆｉｎｅｄ）または合成（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）増殖培地もまた使用してもよく、特定の微生物生育に適した培地は、微生物学または発酵科学当業者に知られている。例えば環式アデノシン２’：３’−一リン酸などの、異化産物抑制を直接または間接的に調節することが知られている作用物質の使用もまた、発酵培地中に組み込んでもよい。
発酵に適したｐＨ範囲はｐＨ５．０〜ｐＨ９．０の間であり、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が初期条件として好ましい。
発酵は好気性または嫌気性条件下で実施してもよく、嫌気性または微好気条件が好ましい。
発酵培地中に生成するイソブタノールの量は、例えば高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）などの当該技術分野で既知であるいくつかの方法を使用して判定できる。
工業的バッチおよび連続発酵
本法はバッチ発酵法を用いる。古典的なバッチ発酵は閉鎖システムであり、そこでは培養液の組成が発酵の初めに設定され、発酵中に人為的変化を受けない。したがって発酵開始時に培養液に所望の生物体または生物体群を接種して、システムには何も添加せずに発酵を生じさせる。しかし典型的には「バッチ」発酵は、炭素源の添加に関してバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの因子の調節が試みられることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物および生物体量組成は、発酵を停止させる時点まで常に変化する。バッチ培養内で細胞は、静的な遅滞期から高い対数増殖期へ、そして最後に成長率が減退または停止する静止期へ調節される。処置を施さない場合、静止期にある細胞はやがて死滅する。一般に対数期にある細胞が、最終生成物または中間体の生成の大部分を担う。
標準バッチシステムのバリエーションが、流加バッチシステムである。流加バッチ発酵プロセスも本発明において適切であり、発酵の進行と共に基材がステップ的に添加されること以外は、典型的なバッチシステムを含んでなる。流加バッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があって、培地中に限定量の基材を有することが望ましい場合に有用である。流加バッチシステム中の実際の基材濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ２などの排ガス分圧などの測定可能因子の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加バッチ発酵は当該技術分野で一般的で周知であり、実例は参照によってここに援用するトマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）、バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．１９８９年；またはデシュパンデ，ムカンドＶ（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７頁、１９９２年、にある。
本発明はバッチ様式で実施されるが、方法は連続発酵法に適応できることが考察される。連続発酵は開放系であり、合成発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加されて、同時に処理のために当量の熟成培地が除去される。連続発酵は、一般に細胞が主として対数生育期にある一定の高密度に培養を維持する。
連続発酵は、細胞生育または最終産物濃度に影響する１つの要因またはいくつもの要因を調節できるようにする。例えば一方法は炭素源または窒素などの制限的栄養物質のレベルを定率に維持して、その他の全パラメーターを加減できるようにする。その他のシステムでは、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、生育に影響するいくつかの要素を連続的に改変できる。連続システムは定常状態生育条件を維持することを目指すので、培地が抜き取られることによる細胞損失は、発酵中の細胞生育速度に対して均衡を保たなくてはならない。連続発酵法のために栄養素および成長因子を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化する技術については工業微生物学の当該技術分野で周知であり、多様な方法が前出のブロック（Ｂｒｏｃｋ）で詳述されている。
バッチ、流加または連続法のいずれかを使用して本発明を実施してもよく、あらゆる既知の発酵様式が適切であることが考察される。さらにホールセル触媒として基質上に細胞を固定化し、イソブタノール生成のための発酵条件に置いてもよいことが考察される。
発酵培地からのイソブタノール単離法
生物生産されたイソブタノールは、当該技術分野で既知の方法を使用して、発酵培地から単離してもよい。例えば遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって、固形物を発酵培地から除去してもよい。次に蒸留、液体−液体抽出、または膜ベースの分離などの方法を使用して、上述のように固形物を除去するように処理された発酵培地からイソブタノールを単離してもよい。イソブタノールは水と低沸点の共沸混合物を形成するので、蒸留は、混合物がその共沸性組成物になるまで分離するためにのみ使用できる。蒸留を別の分離方法と組み合わせて使用して、共沸混合物周辺での分離を得てもよい。イソブタノールを単離し精製するために組み合わせて使用してもよい方法としては、デカンテーション、液体−液体抽出、吸着、および膜ベースの技術が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらにイソブタノールは、共留剤を使用した共沸蒸留を使用して単離してもよい（例えばドハーティ（Ｄｏｈｅｒｔｙ）およびマロン（Ｍａｌｏｎｅ）、「蒸留システムの概念設計（Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１年、を参照されたい）。
イソブタノール−水混合物は不均一共沸混合物を形成するので、デカンテーションと組み合わせた蒸留を使用して、イソブタノールを単離し精製してもよい。この方法では、イソブタノール含有発酵ブロスを共沸組成物近くまで蒸留する。次に共沸性混合物を濃縮し、デカンテーションによってイソブタノールを発酵培地から分離する。デカントした水相を還流として第１の蒸留カラムに戻してもよい。第２の蒸留カラム中での蒸留によって、イソブタノールに富む有機相をさらに精製してもよい。
イソブタノールはまた、蒸留と組み合わせた液体−液体抽出を使用して発酵培地から単離してもよい。この方法では、適切な溶剤での液体−液体抽出を使用して、イソブタノールが発酵ブロスから抽出される。次にイソブタノール含有有機相を蒸留して、イソブタノールを溶剤から分離する。
発酵培地からイソブタノールを単離するために、吸着と組み合わせた蒸留もまた使用してよい。この方法では、イソブタノール含有発酵ブロスを共沸組成物近くに蒸留し、次に分子ふるいなどの吸着材の使用によって残留水を除去する（アデン（Ａｄｅｎ）ら、「トウモロコシまぐさのための並流希釈酸前加水分解および酵素的加水分解を使用したリグノセルロース生物由来資源からのエタノール加工設計および経済学（Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ Ｂｉｏｍａｓｓ ｔｏ Ｅｔｈａｎｏｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｉｌｕｔｅ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｃｏｒｎ Ｓｔｏｖｅｒ）」、ＮＲＥＬ報告／ＴＰ−５１０−３２４３８、国立再生可能エネルギー研究所、２００２年６月）。
さらに浸透気化法と組み合わせた蒸留を使用して、発酵培地からイソブタノールを単離、精製してもよい。この方法では、イソブタノール含有発酵ブロスを共沸性組成物近くまで蒸留し、次に親水性膜を通じた浸透気化法によって水を除去する（グオ（Ｇｕｏ）ら、Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．２４５、１９９〜２１０頁、２００４年）。
続く実施例で本発明をさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しながら、例証のためにのみ提供されるものとする。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の必須の特徴を見極められ、その精神と範囲を逸脱することなく、様々な用途および条件に適合するように本発明の様々な変更および修正ができる。
一般法
実施例で使用される標準リコンビナントＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８９年、（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））；およびＴ．Ｊ．シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）、およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）、「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、１９８４年；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版、１９８７年、で述べられている。
細菌培養の維持および生育に適した材料および方法は、当該技術分野で周知である。以下の実施例で使用するのに適した技術については、次で述べられる。フィリップ・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、米国微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９９４年；またはトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）、「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ、１９８９年。細菌細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬および材料は、特に断りのない限りウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、メリーランド州スパークスのＢＤダイアグノスティックス・システムズ（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ））、メリーランド州ロックビルのライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ））、またはミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から得た。
微生物の株は、特に断りのない限りバージニア州マナッサスの米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）から得た。
以下の実施例で使用するオリゴヌクレオチドプライマーを表４に示す。全てのオリゴヌクレオチドプライマーは、テキサス州ザ・ウッドランズのシグマジェノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ））によって合成される。
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培養液中のイソブタノール濃度を判定する方法
培養液中のイソブタノール濃度は、当該技術分野で既知であるいくつかの方法によって判定できる。例えばどちらもマサチューセッツ州ミルフォードのウォーターズ、コーポレーション（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ））から購入される、ショウデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）ＳＨ−Ｇガードカラム付きショウデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）ＳＨ−１０１１カラムと共に、屈折率（ＲＩ）検出を利用した特定の高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法。クロマトグラフィーの分離は、流速０．５ｍＬ／分の移動相として０．０１ＭＨ２ＳＯ４を使用してカラム温度５０℃で達成した。イソブタノールは、使用した条件下で４６．６分間の滞留時間を有した。代案としては、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）方法が利用できる。例えばデラウェア州ウィルミントンのアジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））からのＨＰ−イノワックス（ＩＮＮＯＷａｘ）カラム（内径３０ｍ×０．５３ｍｍ、フィルム厚１μｍ）と共に水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を利用する特定のＧＣ法。キャリアガスは、一定の上部圧力下、１５０℃における測定で流速４．５ｍＬ／分のヘリウムであり、注入器スプリットは２００℃で１：２５であり、オーブン温度は４５℃で１分間、１０℃／分で４５から２２０℃、および２２０℃で５分間であり、ＦＩＤ検出を２６ｍＬ／分のヘリウム補給ガスと共に２４０℃で用いた。イソブタノールの滞留時間は４．５分間であった。
略語の意味は次のとおり。「ｓ」は秒間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｐｓｉ」は平方インチあたりポンドを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「μＭ」はミクロモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学濃度を意味し、「ＯＤ６００」は波長６００ｎｍで測定される光学濃度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は、重力定数を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／容積％を意味し、「％ｖ／ｖ」は容積／容積％を意味し、「ＩＰＴＧ」はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノイシドを意味し、「ＲＢＳ」はリボソーム結合部位を意味し、「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィーを意味し、「ＧＣ」はガスクロマトグラフィーを意味する。「モル濃度選択性」という用語は消費された１モルの糖基質あたり生成した産物のモル数であり、％で報告される。
実施例１
アセト乳酸シンターゼのクローニングおよび発現
本実施例の目的は、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からｂｕｄＢ遺伝子をクローンし、それを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−ＡＩ中で発現することであった。ＰＣＲを使用して、ｂｕｄＢ遺伝子を肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ２５９５５株ゲノムＤＮＡから増幅し、１．８ｋｂｐの生成物を得た。
ミネソタ州ミネアポリスのジェントラ・システムズ・インコーポレーテッド（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））からのジェントラ・ピュアジーン（Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ）キット（カタログ番号Ｄ−５０００Ａ）を使用して、ゲノムＤＮＡを調製した。それぞれ配列番号１１および１２で示されるプライマーＮ８０およびＮ８１（表２参照）を使用して、ＰＣＲによって、ｂｕｄＢ遺伝子を肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ゲノムＤＮＡから増幅した。その他のＰＣＲ増幅試薬は、例えばマサチューセッツ州ベヴァリーのニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレーテッド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））からのフィンザイムス・フュージョン（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｐｈｕｓｉｏｎ）TM高性能ＰＣＲマスターキット（カタログ番号Ｆ−５３１）などの製造業者のキット中で提供され、製造業者のプロトコルに従って使用した。カリフォルニア州フォスター・シティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのＤＮＡサーモサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ９７００内で増幅を実施した。
発現研究のために、カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）クローニング技術を使用した。エントリーベクターｐＥＮＴＲＳＤＤ−ＴＯＰＯは定方向性クローニングを可能にし、関心のある遺伝子のためのシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列を提供した。目的ベクターｐＤＥＳＴ１４は、タグのない遺伝子の発現のためにＴ７プロモーターを使用した。順方向プライマーには翻訳開始コドンに隣接する４つの塩基（ＣＡＣＣ）が組み込まれて、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＥＮＴＲＳＤＤ−ＴＯＰＯ中への定方向性クローニングを可能にし、プラスミドｐＥＮＴＲＳＤＤ−ＴＯＰＯｂｕｄＢを発生させた。製造業者の推奨に従って、ｐＥＮＴＲコンストラクトをインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換して播種した。形質転換体を一晩生育させ、製造業者の推奨に従ってカリフォルニア州バレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））からのキアプレップ（ＱＩＡｐｒｅｐ）スピン・ミニプレップキット（カタログ番号２７１０６）を使用して、プラスミドＤＮＡを調製した。クローンを配列決定し、遺伝子が正しい方向挿入されたことを確認して配列を確認した。この遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列、および酵素の予測されたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２で示される。
発現クローンを作り出すために、遺伝子組換えによってｂｕｄＢ遺伝子をｐＤＥＳＴ１４ベクター中に転移して、ｐＤＥＳＴ１４ｂｕｄＢを発生させた。ｐＤＥＳＴ１４ｂｕｄＢベクターをインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−ＡＩ細胞に形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地に接種して、一晩生育させた。一晩培養物のアリコートを使用して、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加した５０ｍＬのＬＢに接種した。培養を振盪しながら、ＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまで３７℃でインキュベートした。培養を２つの２５ｍＬ培養物に分割し、フラスコの１つにアラビノースを添加して最終濃度を０．２％ｗ／ｖにした。負の対照フラスコはアラビノースで誘導しなかった。フラスコを振盪しながら３７℃で４時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって収集し、細胞ペレットを５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中に再懸濁した。細胞を超音波処理によって、またはフレンチ・プレッシャー・セル（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）を通過させることで破壊した。ホールセル溶解産物を遠心分離すると、上清または無細胞抽出物およびペレットまたは不溶性画分が生じた。各画分のアリコート（ホールセル溶解産物、無細胞抽出物、および不溶性画分）をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＳＤＳ（ＭＥＳ）ローディング緩衝液中に再懸濁し、８５℃で１０分間加熱してＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのニューページ（ＮｕＰＡＧＥ）４〜１２％ビス−トリスゲル、カタログ番号ＮＰ０３２２Ｂｏｘ）を行った。核酸配列から推定されたような約６０ｋＤａの予想された分子量のタンパク質が誘導培養中に存在したが、非誘導対照中には存在しなかった。
バウエル（Ｂａｕｅｒｌｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９２（１）：１４２〜１４９頁、１９６４年、で述べられる方法を使用して、無細胞抽出物中のアセト乳酸シンターゼ活性を測定する。
実施例２（予測的）
アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼのクローニングおよび発現
本予測的実施例の目的は、どのようにｉｌｖＣ遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２からクローンし、それを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−ＡＩ中で発現するかについて述べることである。ｉｌｖＣ遺伝子はＰＣＲを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡから増幅する。
ｉｌｖＣ遺伝子は、実施例１で述べられるｂｕｄＢ遺伝子と同じ様式でクローンし、発現する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのゲノムＤＮＡは、ミネソタ州ミネアポリスのジェントラ・システムズ・インコーポレーテッド（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））からのジェントラ・ピュアジーン（Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ）キット（カタログ番号Ｄ−５０００Ａ）を使用して調製する。それぞれ配列番号１３および１４で示されるプライマーＮ１００およびＮ１０１（表２参照）を使用して、ＰＣＲによってｉｌｖＣ遺伝子を増幅し、１．５ｋｂｐの生成物を作り出す。順方向プライマーには翻訳開始コドンに隣接する４つの塩基（ＣＣＡＣ）が組み込まれ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ中への定方向性クローニングを可能にして、プラスミドｐＥＮＴＲＳＤＤ−ＴＯＰＯｉｌｖＣを発生させる。クローンを配列決定して遺伝子が正しく挿入されたことを確認し、配列を確認する。この遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列および予測された酵素のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３および配列番号４で示される。
発現クローンを作り出すために、遺伝子組換えによってｉｌｖＣ遺伝子をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＤＥＳＴ１４ベクターに移動させ、ｐＤＥＳＴ１４ｉｌｖＣを発生させる。ｐＤＥＳＴ１４ｉｌｖＣベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−ＡＩ細胞に形質転換し、アラビノース添加によってＴ７プロモーターからの発現を誘導する。核酸配列から推定される約５４ｋＤａの予期された分子量のタンパク質が誘導培養中に存在するが、非誘導対照中には存在しない。
無細胞抽出物中のアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性は、アルフィン（Ａｒｆｉｎ）およびアンバーガー（Ｕｍｂａｒｇｅｒ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４（５）：１１１８〜１１２７頁、１９６９年）で述べられる方法を使用して測定される。
実施例３（予測的）
アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼのクローニングおよび発現
本予測的実施例の目的は、どのようにｉｌｖＤ遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２からクローンし、それを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−ＡＩ中で発現するかについて述べることである。ｉｌｖＤ遺伝子は、ＰＣＲを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡから増幅する。
ｉｌｖＤ遺伝子は、実施例１で述べられるｂｕｄＢ遺伝子と同じ様式でクローンし、発現する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのゲノムＤＮＡは、ミネソタ州ミネアポリスのジェントラ・システムズ・インコーポレーテッド（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））からのジェントラ・ピュアジーン（Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ）キット（カタログ番号Ｄ−５０００Ａ）を使用して調製する。それぞれ配列番号１５および１６で示されるプライマーＮ１０２およびＮ１０３（表２参照）を使用して、ＰＣＲによってｉｌｖＤ遺伝子を増幅し、１．９ｋｂｐの生成物を作り出す。順方向プライマーには翻訳開始コドンに隣接する４つの塩基（ＣＣＡＣ）が組み込まれ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ中への定方向性クローニングを可能にして、プラスミドｐＥＮＴＲＳＤＤ−ＴＯＰＯｉｌｖＤを発生させる。クローンを配列決定して遺伝子が正しく挿入されたことを確認し、配列を確認する。この遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列および予測された酵素のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５および配列番号６で示される。
発現クローンを作り出すために、遺伝子組換えによってｉｌｖＤ遺伝子をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＤＥＳＴ１４ベクターに移動させ、ｐＤＥＳＴ１４ｉｌｖＤを発生させる。ｐＤＥＳＴ１４ｉｌｖＤベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−ＡＩ細胞に形質転換し、アラビノース添加によってＴ７プロモーターからの発現を誘導する。核酸配列から推定される約６６ｋＤａの予期された分子量のタンパク質が誘導培養中に存在するが、非誘導対照中には存在しない。
無細胞抽出物中のアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性は、フリント（Ｆｌｉｎｔ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（２０）：１４７３２〜１４７４２頁、１９９３年、で述べられる方法を使用して測定される。
実施例４（予測的）
分枝ケト酸脱炭酸酵素のクローニングおよび発現
本予測的実施例の目的は、どのようにｋｉｖＤ遺伝子をラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）からクローンし、それを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−ＡＩ中で発現するかについて述べることである。
Ｌ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）からの分枝ケト酸脱炭酸酵素（ｋｉｖＤ）をコードするＤＮＡ配列をニュージャージー州ピスカタウェイのジェンスクリプト（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））から得る。得られた配列を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の双方中での発現のためにコドン最適化し、ｐＵＣ５７中にクローニングしてｐＵＣ５７−ｋｉｖＤを形成する。コドン最適化されたこの遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列および予測された酵素のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７および配列番号８で示される。
発現クローンを作り出すために、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を利用して、ｐＵＣ５７−ｋｉｖＤからの１．７ｋｂｐのｋｉｖＤ断片をウィスコンシン州マディソンのノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのベクターｐＥＴ−３ａ中にクローニングする。これによって発現クローンｐＥＴ−３ａ−ｋｉｖＤを作り出す。ｐＥＴ−３ａ−ｋｉｖＤベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−ＡＩ細胞に形質転換し、Ｔ７プロモーターからの発現をアラビノース添加によって誘導する。核酸配列から推定される約６１ｋＤａの予期された分子量のタンパク質が誘導培養中に存在するが、非誘導対照中には存在しない。
無細胞抽出物中の分枝ケト酸脱炭酸酵素活性は、スミット（Ｓｍｉｔ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４：３９６〜４０２頁、２００３年、で述べられる方法を使用して測定される。
実施例５（予測的）
分枝アルコールデヒドロゲナーゼのクローニングおよび発現
本予測的実施例の目的は、どのように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２からのｙｑｈＤ遺伝子をクローニングし、それを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−ＡＩ中で発現するかについて述べることである。ｙｑｈＤ遺伝子は、ＰＣＲを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡから増幅する。
ｙｑｈＤ遺伝子は、実施例１で述べられるｂｕｄＢ遺伝子と同じ様式でクローンし、発現する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのゲノムＤＮＡは、ミネソタ州ミネアポリスのジェントラ・システムズ・インコーポレーテッド（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））からのジェントラ・ピュアジーン（Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ）キット（カタログ番号Ｄ−５０００Ａ）を使用して調製する。それぞれ配列番号１７および１８で示されるプライマーＮ１０４およびＮ１０５（表２参照）を使用して、ＰＣＲによってｙｑｈＤ遺伝子を増幅し、１．２ｋｂｐの生成物を作り出す。順方向プライマーには翻訳開始コドンに隣接する４つの塩基（ＣＣＡＣ）が組み込まれ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ中への定方向性クローニングを可能にし、プラスミドｐＥＮＴＲＳＤＤ−ＴＯＰＯｙｑｈＤを発生させる。クローンを配列決定して、遺伝子が正しく挿入されたことを確認し、配列を確認する。この遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列および予測された酵素のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号９および配列番号１０で示される。
発現クローンを作り出すために、遺伝子組換えによってｙｑｈＤ遺伝子をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＤＥＳＴ１４ベクターに移動し、ｐＤＥＳＴ１４ｙｑｈＤを発生させる。ｐＤＥＳＴ１４ｉｌｖＤベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−ＡＩ細胞に形質転換して、Ｔ７プロモーターからの発現をアラビノース添加によって誘導する。核酸配列から推定される約４２ｋＤａの予期された分子量のタンパク質が誘導培養中に存在するが、非誘導対照中には存在しない。
無細胞抽出物中の分枝アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、ズルツェンバッハー（Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２（２）：４８９〜５０２頁、２００４年、で述べられる方法を使用して測定される。
実施例６（予測的）
イソブタノール生合成経路中の遺伝子のための形質転換ベクターの構築
本予測的実施例の目的は、どのようにイソブタノール生合成経路中の５つのステップをコードする遺伝子を含んでなる形質転換ベクターを構築するかについて述べることである。全ての遺伝子は、単一プロモーターの制御下にある単一オペロンに入れる。後のクローニングのための制限部位を組み込んだプライマーと、最適化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リボソーム結合部位（ＡＡＡＧＧＡＧＧ）を含有する順方向プライマーとで、個々の遺伝子をＰＣＲによって増幅し、そのＰＣＲ産物をｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター中にＴＯＰＯクローニングして、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換する。プラスミドＤＮＡをＴＯＰＯクローンから調製し、遺伝子配列を確認する。マサチューセッツ州ベヴァリーのニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））からの制限酵素およびＴ４ＤＮＡリガーゼを製造業者の推奨に従って使用する。クローニング実験のために、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのキアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キットを使用して、制限酵素断片をゲル精製する。配列確認後、クローニングプラットフォームとして変性ｐＵＣ１９ベクター中に、遺伝子をサブクローニングする。ｐＵＣ１９ベクターはＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｐＩ消化によって変性し、ｐＵＣ１９ｄＨＳを作り出す。ＭＣＳ（複数クローニング部位）に隣接するｌａｃプロモーターを消化除去して、ベクター中のオペロン転写を防止する。
それぞれ配列番号１９および２０で示されるプライマー対Ｎ１１０およびＮ１１１（表２参照）を使用して、ＰＣＲによって、ｂｕｄＢ遺伝子を肺炎桿菌（Ｋ，ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ２５９５５ゲノムＤＮＡから増幅し、１．８ｋｂｐの生成物を作り出す。順方向プライマーにはＳｐｈＩおよびＡｆｌＩＩ制限部位およびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）が組み込まれる。逆方向プライマーにはＰａｃＩおよびＮｓｉＩ制限部位が組み込まれる。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングして、ｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｂｕｄＢを作り出す。プラスミドＤＮＡをＴＯＰＯクローンから調製し、遺伝子配列を確認する。
それぞれ配列番号２１および２２で示されるプライマー対Ｎ１１２およびＮ１１３（表２参照）を使用して、ＰＣＲによって、ｉｌｖＣ遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ゲノムＤＮＡから増幅し、１．５ｋｂｐの生成物を作り出す。順方向プライマーにはＳａｌＩおよびＮｈｅＩ制限部位およびＲＢＳが組み込まれる。逆方向プライマーにはＸｂａＩ制限部位が組み込まれる。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングして、ｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｉｌｖＣを作り出す。プラスミドＤＮＡをＴＯＰＯクローンから調製し、遺伝子配列を確認する。
それぞれ配列番号２３および２４で示されるプライマー対Ｎ１１４およびＮ１１５（表２参照）を使用して、ＰＣＲによって、ｉｌｖＤ遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ゲノムＤＮＡから増幅し、１．９ｋｂｐの生成物を作り出す。順方向プライマーにはＸｂａＩ制限部位およびＲＢＳが組み込まれる。逆方向プライマーにはＢａｍＨＩ制限部位が組み込まれる。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングして、ｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｉｌｖＤを作り出す。プラスミドＤＮＡをＴＯＰＯクローンから調製し、遺伝子配列を確認する。
それぞれ配列番号２５および２６で示されるプライマー対Ｎ１１６およびＮ１１７（表２参照）を使用して、ＰＣＲによって、ｋｉｖＤ遺伝子をｐＵＣ５７−ｋｉｖＤ（実施例４で述べられる）から増幅し、１．７ｂｐの生成物を作り出す。順方向プライマーにはＢａｍＨＩ制限部位およびＲＢＳが組み込まれる。逆方向プライマーにはＳａＣＩ制限部位が組み込まれる。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングして、ｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｋｉｖＤを作り出す。プラスミドＤＮＡをＴＯＰＯクローンから調製して、遺伝子配列を確認する。
それぞれ配列番号２７および２８で示されるプライマー対Ｎ１１８およびＮ１１９（表２参照）を使用して、ＰＣＲによって、ｙｑｈＤ遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ゲノムＤＮＡから増幅し、１．２ｋｂｐの生成物を作り出す。順方向プライマーにはＳａＣＩ制限部位が組み込まれる。逆方向プライマーにはＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位が組み込まれる。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングして、ｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｙｑｈＤを作り出す。プラスミドＤＮＡをＴＯＰＯクローンから調製して、遺伝子配列を確認する。
イソブタノール経路オペロンを構築するために、ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩでｙｑｈＤ遺伝子をｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｙｑｈＤから切除して、１．２ｋｂｐの断片を放出する。これをあらかじめＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたｐＵＣ１９ｄＨＳとライゲートする。得られたクローン、ｐＵＣ１９ｄＨＳ−ｙｑｈＤを制限酵素消化によって確認する。次にＳａｌＩおよびＸｂａＩでｉｌｖＣ遺伝子をｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｉｌｖＣから切除して、１．５ｋｂｐの断片を放出する。これをあらかじめＳａｌＩおよびＸｂａＩで消化されたｐＵＣ１９ｄＨＳ−ｙｑｈＤとライゲートする。得られたクローン、ｐＵＣ１９ｄＨＳ−ｉｌｖＣ−ｙｑｈＤを制限酵素消化によって確認する。次にＳｐｈＩおよびＮｓｉＩでｂｕｄＢ遺伝子をｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｂｕｄＢから切除し、１．８ｋｂｐの断片を放出する。ｐＵＣ１９ｄＨＳ−ｉｌｖＣ−ｙｑｈＤをＳｐｈＩおよびＰｓｔＩで消化し、ＳｐｈＩ／ＮｓｉＩｂｕｄＢ断片（ＮｓｉＩおよびＰｓｔＩは適合性末端を発生させる）とライゲートし、ｐＵＣ１９ｄＨＳ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｙｑｈＤを形成する。ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで、ｉｌｖＤ遺伝子を含有する１．９ｋｂｐの断片をｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｉｌｖＤから切除し、これらの同一酵素で消化されたｐＵＣ１９ｄＨＳ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｙｑｈＤとライゲートし、ｐＵＣ１９ｄＨＳ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｙｑｈＤを形成する。最後にＢａｍＨＩおよびＳａＣＩ でｋｉｖＤをｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｋｉｖＤから切除し、１．７ｋｂｐの断片を放出する。この断片をあらかじめＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化されたｐＵＣ１９ｄＨＳ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｙｑｈＤとライゲートし、ｐＵＣ１９ｄＨＳ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｙｑｈＤを形成する。
ｐＵＣ１９ｄＨＳ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｙｑｈＤベクターをＡｆｌＩＩおよびＳｐｅＩで消化し、８．２ｋｂｐのオペロン断片を放出し、それを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）シャトルベクターであるｐＢｅｎＡＳ中にクローニングする。プラスミドｐＢｅｎＡＳは、ｐＢＥ９３ベクターの変性によって作り出され、それはナガラージャン（Ｎａｇａｒａｊａｎ）らの国際公開第９３／２４６３１号パンフレットの実施例４で述べられる。ｐＢｅｎＡＳを作るために、ｐＢＥ９３のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化で、バシラス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）中性タンパク質分解酵素プロモーター（ＮＰＲ）、シグナル配列、およびｐｈｏＡ遺伝子を除去する。それぞれ配列番号２９および３０で示されるプライマーＢｅｎＮＦおよびＢｅｎＡＳＲによって、ＮＰＲプロモーターをｐＢＥ９３からＰＣＲ増幅する。プライマーＢｅｎＡＳＲには、プロモーター下流のＡｆｌＩＩ、ＳｐｅＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩ部位が組み込まれる。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、断片をベクター中の対応する部位にクローニングしてｐＢｅｎＡＳを作り出す。オペロン断片をｐＢｅｎＡＳ中のＡｆｌＩＩおよびＳｐｅＩ部位にサブクローニングして、ｐＢｅｎ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｙｑｈＤを作り出す。
実施例７（予測的）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のイソブタノール生合成経路の発現
本予測的実施例の目的は、どのようにイソブタノール生合成経路を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現するかについて述べることである。
実施例６で述べられるようにして構築されたプラスミドｐＢｅｎ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｙｑｈＤを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＭ５２２（ＡＴＣＣ番号４７０００）に形質転換して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＭ５２２／ｐＢｅｎ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｙｑｈＤ株を得て、オペロン中の遺伝子発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、酵素アッセイ、およびウエスタンブロット分析によってモニターする。ウエスタンブロットでは、テキサス州ザ・ウッドランズのシグマジェノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ））からの合成ペプチドに対する抗体を生じさせる。
５０ｍＬの培地を含有する２５０ｍＬ振盪フラスコに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＮＭ５２２／ｐＢｅｎ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｙｑｈＤを接種し、２５０ｒｐｍおよび３５℃で振盪する。培地は、グルコース（５ｇ／Ｌ）、ＭＯＰＳ（０．０５Ｍ）、硫酸アンモニウム（０．０１Ｍ）、リン酸２水素カリウム（０．００５Ｍ）、Ｓ１０金属ミックス（１％（ｖ／ｖ））酵母抽出物（０．１％（ｗ／ｖ））、カザミノ酸（０．１％（ｗ／ｖ））、チアミン（０．１ｍｇ／Ｌ）、プロリン（０．０５ｍｇ／Ｌ）、およびビオチン（０．００２ｍｇ／Ｌ）から構成され、ＫＯＨでｐＨ７．０に滴定する。Ｓ１０金属ミックスは、ＭｇＣｌ２（２００ｍＭ）、ＣａＣｌ２（７０ｍＭ）、ＭｎＣｌ２（５ｍＭ）、ＦｅＣｌ３（０．１ｍＭ）、ＺｎＣｌ２（０．１ｍＭ）、チアミン塩酸塩（０．２ｍＭ）、ＣｕＳＯ４（１７２μＭ）、ＣｏＣｌ２（２５３μＭ）、およびＮａ２ＭｏＯ４（２４２μＭ）を含有する。１８時間後、例えば上の一般法セクションで述べられるような当該技術分野で周知の方法を使用して、イソブタノールをＨＰＬＣまたはＧＣ分析によって検出する。
実施例８（予測的）
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中のイソブタノール生合成経路の発現
本予測的実施例の目的は、どのようにイソブタノール生合成経路を枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中で発現するかについて述べることである。実施例７で述べられるのと同じアプローチを使用する。
実施例６で述べられるようにして構築されるプラスミドｐＢｅｎ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｙｑｈＤを使用する。このプラスミドを枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：２２７８−２２８２（１９９１））に形質転換して、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０／ｐＢｅｎ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｙｑｈＤ株を得て、実施例７で述べるようにして各オペロン中の遺伝子発現をモニターする。
５０ｍＬの培地を含有する２５０ｍＬ振盪フラスコに、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０／ｐＢｅｎ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｙｑｈＤ株を接種し、２５０ｒｐｍおよび３５℃で１８時間振盪する。培地はデキストロース（５ｇ／Ｌ）、ＭＯＰＳ（０．０５Ｍ）、グルタミン酸（０．０２Ｍ）、硫酸アンモニウム（０．０１Ｍ）、リン酸２水素カリウム緩衝液（０．００５Ｍ）、Ｓ１０金属ミックス（実施例１１で述べられるような、１％（ｖ／ｖ））、酵母抽出物（０．１％（ｗ／ｖ））、カザミノ酸（０．１％（ｗ／ｖ））、トリプトファン（５０ｍｇ／Ｌ）、メチオニン（５０ｍｇ／Ｌ）、およびリジン（５０ｍｇ／Ｌ）から構成され、ＫＯＨでｐＨ７．０に滴定する。１８時間後、例えば上の一般法セクションで述べられるような当該技術分野で周知である方法を使用して、イソブタノールをＨＰＬＣまたはＧＣ分析によって検出する。
実施例９
アセト乳酸シンターゼのクローニングおよび発現
別のアセト乳酸シンターゼ発現クローンを作り出すために、ｂｕｄＢ遺伝子をベクターｐＴｒｃ９９Ａ中にクローニングした。プライマー（それぞれ配列番号３１および３２で示されるＮ１１０．２およびＮ１１１．２）を使用して、ｂｕｄＢ遺伝子を最初にｐＥＮＴＲＳＤＤ−ＴＯＰＯｂｕｄＢ（実施例１で述べられる）から増幅し、それによって５’末端にＳａｃＩ、ＳｐｅＩおよびＭｆｅＩ部位が、３’末端にＢｂｖＣＩ、ＡｆｌＩＩ、およびＢａｍＨＩ部位が導入された。得られた１．７５ｋｂｐのＰＣＲ産物をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＣＲ４−Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ中にクローニングし、ＤＮＡ配列を確認した（それぞれ配列番号４０〜４７で示される配列決定プライマーＮ１３０ＳｅｑＦ１〜Ｆ４およびＲ１〜Ｒ４を使用して）。次にＳａｃＩおよびＢａｍＨＩを使用して、ｂｕｄＢ遺伝子をこのベクターから切除し、ｐＴｒｃ９９Ａ（アマン（Ａｍａｎｎ）ら、Ｇｅｎｅ ６９（２）：３０１〜３１５頁、１９８８年）中にクローニングして、ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢを発生させた。ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したＬＢ培地に接種して、３７℃で一晩生育させた。一晩培養物のアリコートを使用して、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加した５０ｍＬのＬＢ培地に接種した。ＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまで、培養を振盪しながら３７℃でインキュベートした。次に０．４ｍＭのＩＰＴＧの添加によって、ＴｒｃプロモーターからのｂｕｄＢｍの発現を誘導した。ＩＰＴＧで誘導しない負の対照フラスコもまた調製した。フラスコを振盪しながら３７℃で４時間インキュベートした。実施例１で述べられるようにして、無細胞抽出物を調製した。
実施例１で述べられるようにして、無細胞抽出物中のアセト乳酸シンターゼ活性を測定した。ＩＰＴＧでの誘導の３時間後、８単位／ｍｇのアセト乳酸シンターゼ活性が検出された。ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドのみを保有する対照株は、０．０３単位／ｍｇのアセト乳酸シンターゼ活性を示した。
実施例１０
アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼのクローニングおよび発現
本実施例の目的は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２からｉｌｖＣ遺伝子をクローニングし、それを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０中で発現することであった。ＰＣＲを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＦＭ５（ＡＴＣＣ５３９１１）ゲノムＤＮＡからｉｌｖＣ遺伝子を増幅した。
上の実施例２でｉｌｖＣのクローニングおよび発現について述べたのと同じ様式で、ｉｌｖＣ遺伝子をクローンし発現した。プライマーＮ１１２．２およびＮ１１３．２（それぞれ配列番号３３および３４）を使用して、ＰＣＲを使用し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５ゲノムからｉｌｖＣを増幅した。プライマーは、ＳａｃＩおよびＡｆｌＩＩＩ部位、およびｉｌｖＣの５’末端の最適ＲＢＳ、および３’末端のＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、およびＢａｍＨＩ部位を作り出した。製造業者インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコルに従って１．５ｋｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングして、ｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ：：ｉｌｖＣを発生させた。配列決定プライマー（それぞれ配列番号４８〜５３で示されるＮ１３１ＳｅｑＦ１−Ｆ３、およびＮ１３１ＳｅｑＲ１−Ｒ３）を使用して、ＰＣＲ産物の配列を確認した。発現クローンを作り出すために、ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩを使用してｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ：：ｉｌｖＣからｉｌｖＣ遺伝子を切除し、ｐＴｒｃ９９Ａ中にクローニングした。ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｉｌｖＣベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、実施例９で述べられるようにしてＩＰＴＧの添加によって、Ｔｒｃプロモーターからの発現を誘導した。実施例１で述べられるようにして、無細胞抽出物を調製した。
実施例２で述べられるようにして、無細胞抽出物中のアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性を測定した。ＩＰＴＧによる誘導の３時間後、０．０２６単位／ｍｇのアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性が検出された。ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドのみを保有する対照株は、０．００１単位／ｍｇ未満のアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性を示した。
実施例１１
アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼのクローニングおよび発現
本実施例の目的は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２からｉｌｖＤ遺伝子をクローニングして、それを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０中で発現することであった。ＰＣＲを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＦＭ５（ＡＴＣＣ５３９１１）ゲノムＤＮＡからｉｌｖＤ遺伝子を増幅した。
実施例１０で述べたｉｌｖＣ遺伝子と同じ様式で、ｉｌｖＤ遺伝子をクローンし発現した。プライマーＮ１１４．２およびＮ１１５．２（それぞれ配列番号３５および３６）を使用して、ＰＣＲを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５ゲノムからｉｌｖＤを増幅した。プライマーは、ＳａｃＩおよびＮｈｅＩ部位、およびｉｌｖＤの５’末端の最適ＲＢＳ、および３’末端のＢｓｕ３６Ｉ、ＰａｃＩおよびＢａｍＨＩ部位を作り出した。製造業者インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコルに従って１．９ｋｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングし、ｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ：：ｉｌｖＤを発生させた。ＰＣＲ産物の配列を確認した（それぞれ配列番号５４〜６１で示される配列決定プライマーＮ１３２ＳｅｑＦ１−Ｆ４およびＮ１３２ＳｅｑＲ１−Ｒ４）。発現クローンを作り出すために、ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩを使用して、ｉｌｖＤ遺伝子をプラスミドｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ：：ｉｌｖＤから切除し、ｐＴｒｃ９９Ａ中にクローニングした。ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｉｌｖＤベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、実施例９で述べられるようにしてＴｒｃプロモーターからの発現をＩＰＴＧの添加によって誘導した。実施例１で述べられるようにして、無細胞抽出物を調製した。
実施例３で述べられるようにして、無細胞抽出物中のアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を測定した。ＩＰＴＧによる誘導の３時間後、４６単位／ｍｇのアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性が測定された。ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドのみを保有する対照株は、検出可能なアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を示さなかった。
実施例１２
分枝ケト酸脱炭酸酵素のクローニングおよび発現
本実施例の目的は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）からｋｉｖＤ遺伝子をクローニングし、それを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＴＯＰ１０中で発現することであった。
上の実施例１０でｉｌｖＣについて述べられるのと同じ様式で、ｋｉｖＤ遺伝子をクローンし発現した。プライマーＮ１１６．２およびＮ１１７．２（それぞれ配列番号３７および３８）を使用して、ＰＣＲを使用して、プラスミドｐＵＣ５７−ｋｉｖＤ（上の実施例４参照）からｋｉｖＤを増幅した。プライマーはＳａｃＩおよびＰａｃＩ部位、およびｋｉｖＤの５’末端の最適ＲＢＳ、および３’末端のＰｃｉＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＢａｍＨＩ部位を作り出した。製造業者インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコルに従って、１．７ｋｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングし、ｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ：：ｋｉｖＤを発生させた。プライマーＮ１３３ＳｅｑＦ１−Ｆ４およびＮ１３３ＳｅｑＲ１−Ｒ４（それぞれ配列番号６２〜６９で示される）を使用して、ＰＣＲ産物の配列を確認した。発現クローンを作り出すために、ｋｉｖＤ遺伝子をＳａｃＩおよびＢａｍＨＩを使用してプラスミドｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ：：ｋｉｖＤから切除し、ｐＴｒｃ９９Ａ中にクローニングした。ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｋｉｖＤベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、実施例９で述べられるようにして、Ｔｒｃプロモーターからの発現をＩＰＴＧの添加によって誘導した。実施例１で述べられるようにして、無細胞抽出物を調製した。
アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）からのパーパルド（Ｐｕｒｐａｌｄ）（登録商標）試薬（カタログ番号１６２８９２）を使用して、アルデヒド反応生成物を検出および定量化したこと以外は、実施例４で述べられるようにして、無細胞抽出物中の分枝ケト酸脱炭酸酵素活性を測定した。ＩＰＴＧによる誘導の３時間後、３．７単位／ｍｇを超える分枝ケト酸脱炭酸酵素活性が検出された。ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドのみを保有する対照株は、検出可能な分枝ケト酸脱炭酸酵素活性を示さなかった。
実施例１３
分枝アルコールデヒドロゲナーゼの発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼとして同定される天然遺伝子（ｙｑｈＤ）を含有する（米国特許第６，５１４，７３３号明細書）。ＹｑｈＤタンパク質は、推定上のＮＡＤＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼであるクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）からのＡｄｈＢ（ａｄｈＢによってコードされる）と４０％同一性を有する。λレッド技術（ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：６６４０頁、２０００年）を使用して、ｙｑｈＤ遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ １．６ｙｑｈＤ：：Ｃｍ株（国際公開第２００４／０３３６４６号パンフレット）中のグルコースイソメラーゼプロモーター１．６ＧＩ（配列番号７０）の変異型の構成的な発現下に置いた。抗生物質マーカーが除去できるように、ＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴカセットはＭＧ１６５５ １．６ｙｑｈＤ：：Ｃｍを含有する。同様に天然プロモーターを１．５ＧＩ プロモーター（国際公開第２００３／０８９６２１号パンフレット）（配列番号７１）によって置換してＭＧ１６５５ １．５ＧＩ−ｙｑｈＤ：：Ｃｍ株を作り出し、したがってＭＧ１６５５ １．６ｙｑｈＤ：：Ｃｍの１．６ＧＩプロモーターを１．５ＧＩプロモーターで置換する。
ＭＧ１６５５ １．５ＧＩ−ｙｑｈＤ：：Ｃｍ株をＬＢ培地中で対数中期に生育させ、実施例１で述べられるようにして無細胞抽出物を調製した。この株は、ｐＨ７．５および３５℃における３４０ｎｍでの吸光度の低下を追跡して細胞抽出物をアッセイすると、ＮＡＤＰＨ依存イソブチルアルデヒド還元酵素活性を有することが分かった。
１．５ＧＩ−ｙｑｈＤ：：Ｃｍを含有する第２の発現株を発生させるために、ＭＧ１６５５ １．５ＧＩｙｑｈＤ：：ＣｍからＰ１溶解産物を調製し、形質導入によってカセットをインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＢＬ２１（ＤＥ３）に転移して、ＢＬ２１（ＤＥ３）１．５ＧＩ−ｙｑｈＤ：：Ｃｍを作り出した。
実施例１４
イソブタノール生合成経路中の最初の４遺伝子のための形質転換ベクターの構築
本実施例の目的は、イソブタノール生合成経路中の最初の４遺伝子（すなわちｂｕｄＢ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、およびｋｉｖＤ）を含んでなる形質転換ベクターを構築することである。
形質転換ベクターを構築するために、初めにＡｆｌＩＩおよびＢａｍＨＩでの消化によってｐＴｒｃ９９Ａ：：ｉｌｖＣ（実施例１０で述べられる）からｉｌｖＣ遺伝子を得て、ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ（実施例９で述べられる）中にクローニングし、それをＡｆｌＩＩおよびＢａｍＨＩで消化してプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣを生成した。次にＮｈｅＩおよびＰａＣＩ（ｉｌｖＤ）、およびＰａｃＩおよびＢａｍＨＩ（ｋｉｖＤ）での消化によって、ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｉｌｖＤ（実施例１１で述べられる）およびｐＴｒｃ９９Ａ：：ｋｉｖＤ（実施例１２で述べられる）から、それぞれｉｌｖＤおよびｋｉｖＤ遺伝子を得た。これらの遺伝子を三元ライゲーションによって、初めにＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ中に導入した。ＰＣＲスクリーニングおよび制限酵素消化によって、最終プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ中の全４遺伝子の存在を確認した。
実施例１５
グルコースで生育させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のイソブタノール生合成経路の発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）イソブタノール産生株を作り出すために、ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ（実施例１４で述べられる）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ １．５ＧＩｙｑｈＤ：：Ｃｍおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）１．５ＧＩｙｑｈＤ：：Ｃｍ（実施例１３で述べられる）に形質転換した。形質転換体を初めに、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するＬＢ培地中で生育させた。これらの培養からの細胞を使用して、それぞれ高低酸素条件に相当する５０または１７０ｍＬのＴＭ３ａ／グルコース培地（適切な抗生物質を添加した）を含有する振盪フラスコ（総容積およそ１７５ｍＬ）に接種した。ＴＭ３ａ／グルコース培地は（１Ｌあたり）、グルコース（１０ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ）、クエン酸一水和物（２．０ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．０ｇ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２．０ｇ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（０．２ｇ）、クエン酸第二鉄アンモニウム（０．３３ｇ）、チアミン・ＨＣｌ（１．０ｍｇ）、酵母抽出物（０．５０ｇ）、および１０ｍＬの微量元素溶液を含有した。ｐＨをＮＨ４ＯＨで６．８に調節した。微量元素溶液は、クエン酸・Ｈ２Ｏ（４．０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ（３．０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（１．０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．１０ｇ／Ｌ）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．１０ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．１０ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．０１０ｇ／Ｌ）、Ｈ３ＢＯ３（０．０１０ｇ／Ｌ）、およびＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．０１０ｇ／Ｌ）を含有した。
≦０．０１単位の開始ＯＤ６００でフラスコを接種し、３００ｒｐｍで振盪しながら３４℃でインキュベートした。５０ｍＬの培地を含有するフラスコを０．２μｍのフィルターキャップで閉じ、１５０ｍＬの培地を含有するフラスコを密封キャップで閉じた。細胞が≧０．４単位のＯＤ６００に達したら、ＩＰＴＧを０．０４ｍＭの最終濃度に添加した。誘導のおよそ１８時間後、一般法セクションで述べられるように、ＨＰＬＣ（屈折率（ＲＩ）検出付き）（ニューヨーク州の昭和電工アメリカ・インコーポレーテッド（Ｓｈｏｗａ Ｄｅｎｋｏ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．（ＮＹ））からのショーデックス・シュガー（Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ）ＳＨ１０１１カラム）、およびカリフォルニア州パロアルトのバリアン・インコーポレーテッド（Ｖａｒｉａｎ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））からの炎光イオン化検出（ＦＩＤ）付きＧＣ（バリアン（Ｖａｒｉａｎ）ＣＰ−ＷＡＸ５８（ＦＦＡＰ）ＣＢ、０．２５ｍｍ×０．２μｍ×２５ｍ）によって、ブロスのアリコートをイソブタノール含量について分析した。イソブタノールは、ｐＴｒｃ９９Ａベクターのみを保有する対照株中には検出されなかった（結果示さず）。ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤを保有する株によって産生されるイソブタノールのモル濃度選択性および力価を表５に示す。低酸素条件下で生育させた培養中で、顕著により高いイソブタノール力価が得られた。
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実施例１６
スクロースで生育させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のイソブタノール生合成経路の発現
実施例１５で述べられる株はスクロースで生育できなかったので、追加的プラスミドを構築してイソブタノール生成のためにスクロースの使用を可能にした。配列番号３９で示されるスクロース使用遺伝子クラスターｃｓｃＢＫＡをＡＴＣＣ株１３２８１に由来するスクロース使用大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ゲノムＤＮＡから単離した。スクロース使用遺伝子（ｃｓｃＡ、ｃｓｃＫ、およびｃｓｃＢ）は、配列番号１３９で示されるスクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）、配列番号１４０で示されるＤ−フルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）、および配列番号１４１で示されるスクロースパーミアーゼ（ＣｓｃＢ）をコードする。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のそれらの天然プロモーターから３つの遺伝子ｃｓｃＢＫＡが構成的に発現されるように、スクロース特異的リプレッサー遺伝子ｃｓｃＲは含まれなかった。
スクロース使用大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株からのゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで完全に消化した。約４ｋｂｐの平均サイズを有する断片をアガロースゲルから単離し、イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）からのプラスミドｐＬｉｔｍｕｓ２８にライゲートしてＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのウルトラコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０Ｆ’細胞に形質転換した。１％スクロースおよびアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するマッコンキー寒天プレート上に形質転換体を画線培養し、紫色コロニーの外観についてスクリーンした。プラスミドＤＮＡを紫色形質転換体から単離し、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＭ１３ 順方向プライマーおよび逆方向プライマー、およびＳｃｒ１〜４（それぞれ７２〜７５の配列番号で示される）で配列決定した。ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、およびｃｓｃＡ（ｃｓｃＢＫＡ）遺伝子を含有するプラスミドは、消化されたｐＳｃｒ１であった。
イソブタノール経路プラスミド（実施例１４）と適合性のスクロース使用プラスミドを作り出すために、ｐＳｃｒ１からのオペロンをドイツ国ゲッティンゲンのモビテック（ＭｏＢｉｔｅｃ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））からのｐＢＨＲ１中にサブクローニングした。ｐＳｃｒ１のＸｈｏＩでの消化によって（平滑末端を生じさせるクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素でのインキュベーションがそれに続く）、次にＡｇｅＩでの消化によって、ｃｓｃＢＫＡ遺伝子を単離した。得られた４．２ｋｂｐの断片をＮａｅＩおよびＡｇｅＩで消化してｐＢＨＲ１中にライゲートし、９．３ｋｂｐのプラスミドｐＢＨＲ１：：ｃｓｃＢＫＡをもたらした。
電気穿孔によって、スクロースプラスミドｐＢＨＲ１：：ｃｓｃＢＫＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）１．５ｙｑｈＤ／ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ １．５ｙｑｈＤ／ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ（実施例１５で述べられる）に形質転換した。形質転換体を初めに、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ培地上で選択し、次にマッコンキースクロース（１％）プレート上でスクリーンして、スクロースオペロンの機能性発現を確認した。イソブタノールの生成のために、グルコースの代わりに１％スクロースを含有するＴＭ３ａ最小合成培地（実施例１５で述べられる）中で株を生育させ、サンプルを誘導の１４時間後に採取したこと以外は、実施例１５で述べられるようにして、イソブタノール生成量について培養液を分析した。ここでもイソブタノールは、ｐＴｒｃ９９Ａベクターのみを保有する対照株では検出されなかった（結果示さず）。ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤを保有するＭＧ１６５５ １．５ｙｑｈＤによって産生されたイソブタノールのモル濃度選択性および力価を表６に示す。類似のＢＬ２１（ＤＥ３）株と同様の結果が得られた。
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実施例１７
サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のイソブタノール経路遺伝子の発現
イソブタノール経路遺伝子を発現するために、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、いくつかの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクターを構築した。ＰＣＲアプローチ（ユ（Ｙｕ）ら、Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．４１：９７３〜９８１頁、２００４年）を使用して、遺伝子と酵母プロモーターおよびターミネーターとを融合させた。具体的にはＧＰＤプロモーター（配列番号７６）およびＣＹＣ１ターミネーター（配列番号７７）を枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（配列番号７８）からのａｌｓＳ遺伝子に縮合し、ＦＢＡプロモーター（配列番号７９）およびＣＹＣ１ターミネーターをＳ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＩＬＶ５（配列番号８０）遺伝子に縮合し、ＡＤＨ１プロモーター（配列番号８１）およびＡＤＨ１ターミネーター（配列番号８２）をＳ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＩＬＶ３遺伝子（配列番号８３）に縮合し、ＧＰＭプロモーター（配列番号８４）およびＡＤＨ１ターミネーターをラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）からのｋｉｖＤ遺伝子（配列番号７）に縮合した。表７で示されるプライマーは、プロモーター／遺伝子／ターミネーター生成物をｐＲＳ４００シリーズ（クリスチャンソン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ）ら、Ｇｅｎｅ １１０：１１９〜１２２頁、１９９２年）からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクター中にクローニングするため、そしてコンストラクト間でプロモーターを交換するための制限部位を含むようにデザインされた。ＩＬＶ５およびＩＬＶ３の５’末端のためのプライマー（それぞれ配列番号９５および１０７で示されるＮ１３８およびＮ１５５）は新しい開始コドンを生じて、これらの酵素のミトコンドリアターゲティングを排除した。
縮合した全ＰＣＲ産物を初めにインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＴＯＰＯクローニング反応によってｐＣＲ４−Ｂｌｕｎｔ中にクローニングし、配列を確認した（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＭ１３ 順方向プライマーおよび逆方向プライマーおよび表７で提供される配列決定プライマーを使用した）。２つの追加的プロモーター（ＣＵＰ１およびＧＡＬ１）をＴＯＰＯ反応によってｐＣＲ４−Ｂｌｕｎｔ中にクローニングし、配列決定によって確認した。プライマー配列を表７に示す。構築されたプラスミドを表８に記述する。プラスミドをサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４３（ＡＴＣＣ２０１３９０）またはＹＪＲ１４８ｗ（ＡＴＣＣ４０３６９３９）のどちらかに形質転換して、実施例１〜４および実施例９〜１２で述べられる酵素アッセイを使用して、酵素特異的活性を評価した。酵素活性の判定のために、発現プラスミドの選択に必要な、あらゆる代謝産物を欠く合成完全培地（「酵母遺伝学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、２０１〜２０２頁、２００５年）中で、ＯＤ６００が１．０になるまで培養を生育させ、遠心分離によって収集し（４℃において２６００×ｇで８分間）、緩衝液で洗浄し、再度遠心分離して−８０℃で凍結した。細胞を解凍し、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁して最終容積を２ｍＬにして、次に１．２ｇのガラスビーズ（０．５ｍｍサイズ）でビーズビーターを使用して破壊した。各サンプルを高速で合計３分間処理した（撹拌１分毎に氷上でインキュベーションした）。遠心分離（４℃に２０，０００×ｇで１０分間）によって、抽出物から細胞残骸を除去した。
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実施例１８
組換えサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるイソブタノール生成
プラスミドｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ＩＬＶ３およびｐＨＲ８１：：ＦＢＡ−ＩＬＶ５＋ＧＰＭ−ｋｉｖＤ（実施例１７で述べられる）をサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＪＲ１４８ｗに形質転換して、ＹＪＲ１４８ｗ／ｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ＩＬＶ３／ｐＨＲ８１：：ＦＢＡ−ＩＬＶ５＋ＧＰＭ−ｋｉｖＤ株を生成した。ベクターｐＲＳ４２３およびｐＨＲ８１（実施例１７で述べられる）をサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＪＲ１４８ｗ（ＹＪＲ１４８ｗ／ｐＲＳ４２３／ｐＨＲ８１株）中に形質転換して、対照株を調製した。２％グルコースまたはスクロースのどちらかを含有するが、ウラシルおよびヒスチジンを欠いて、プラスミドの維持を確実にする、標準Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）合成完全培地（「酵母遺伝学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、２０１〜２０２頁、２００５年）上で、株を維持した。
イソブタノール生成のために、細胞をウラシル、ヒスチジンおよびロイシンを欠く合成完全培地に移動した。培地からのロイシンの除去は、ｌｅｕ２−ｄアレルの不良転写に起因する、ｐＨＲ８１ベースのプラスミドのコピー数増大をトリガーすることを意図した（エアハルト（Ｅｒｈａｒｔ）およびホーレンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５６：６２５〜６３５頁、１９８３年）。ニュージャージー州エディソンのニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ））からのイノバ（Ｉｎｎｏｖａ）４０００恒温器内で、５０ｍＬの培地を含有する１７５ｍＬ容量フラスコ内で、好気性培養を３０℃および２００ｒｐｍで生育させた。６０ｍＬの血清バイアルに４５ｍＬの培地を添加し、接種後に圧着キャップで密封して３０℃に保ち、低酸素培養を調製した。必要に応じて、試料採取および誘導物質の添加のために無菌シリンジを使用した。接種のおよそ２４時間後、誘導物質ＣｕＳＯ４を０．０３ｍＭの最終濃度で添加した。ＣｕＳＯ４添加なしの各株の対照培養もまた調製した。実施例１５で上述したように、ＣｕＳＯ４添加の１８または１９時間および３５時間後に、ＧＣおよびＨＰＬＣの双方によって、培養上清をイソブタノール含量について分析した。グルコースで生育させたＳ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＪＲ１４８ｗ／ｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ＩＬＶ３／ｐＨＲ８１：：ＦＢＡ−ＩＬＶ５＋ＧＰＭ−ｋｉｖＤの結果を表９に示す。表９で示される結果では、好気性培養からのサンプルを３５時間で採取し、低酸素培養からのサンプルを１９時間で採取してＨＰＬＣで測定した。
スクロースで生育させたＳ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＪＲ１４８ｗ／ｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ＩＬＶ３／ｐＨＲ８１：：ＦＢＡ−ＩＬＶ５＋ＧＰＭ−ｋｉｖＤの結果を表１０に示す。この表の結果は１８時間で採取し、ＨＰＬＣで測定したサンプルによって得られた。
Figure 0005276986
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結果は好気性および低酸素条件双方の下、グルコースまたはスクロースで生育させた場合、ＹＪＲ１４８ｗ／ｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ＩＬＶ３／ｐＨＲ８１：：ＦＢＡ−ＩＬＶ５＋ＧＰＭ−ｋｉｖＤ株が一貫して、対照株よりも高いレベルのイソブタノールを生成することを示唆した。
実施例１９
組換えサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるイソブタノール生成
プラスミドｓｐＲＳ４２５：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ＩＬＶ３およびｐＲＳ４２６：：ＧＡＬ１−ＩＬＶ５＋ＧＰＭ−ｋｉｖＤ（実施例１７で述べられる）をサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＪＲ１４８ｗに形質転換して、ＹＪＲ１４８ｗ／ｐＲＳ４２５：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ＩＬＶ３／ｐＲＳ４２６：：ＧＡＬ１−ＩＬＶ５＋ＧＰＭ−ｋｉｖＤ株を生成した。ベクターｐＲＳ４２５およびｐＲＳ４２６（実施例１７で述べられる）をサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＪＲ１４８ｗ（ＹＪＲ１４８ｗ／ｐＲＳ４２５／ｐＲＳ４２６株）中に形質転換して、対照株を調製した。実施例１８で述べられるようにして、株を合成完全培地上で維持した。
イソブタノール生成のために、細胞を２％ガラクトースおよび１％ラフィノースを含有し、ウラシルおよびロイシンを欠く合成完全培地に移動する。実施例１８で述べられるようにして、好気性および低酸素培養を調製した。接種のおよそ１２時間後、誘導物質ＣｕＳＯ４を０．５ｍＭの最終濃度にまで添加した。ＣｕＳＯ４添加なしの各株の対照培養もまた調製した。実施例１８で述べられるようにして、ＨＰＬＣによるイソブタノール判定のために、ＣｕＳＯ４添加の２３時間後に培養上清をサンプル採取した。結果を表１１に示す。観察された、残留炭素源の定量化に関連した大幅に異なる最終光学的濃度の理由から、（モル濃度選択性の代わりに）ＯＤ６００単位あたりのイソブタノール濃度を表に提供して、イソブタノール生合成経路遺伝子を含有する株と対照との比較を可能にする。
Figure 0005276986
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結果は一般に、好気性および低酸素条件の双方で、対照株と比べて、光学濃度単位あたりより高いレベルのイソブタノールが、ＹＪＲ１４８ｗ／ｐＲＳ４２５：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ＩＬＶ３／ｐＲＳ４２６：：ＧＡＬ１−ＩＬＶ５＋ＧＰＭ−ｋｉｖＤ株によって生成されることを示唆する。
実施例２０
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中のイソブタノール生合成経路の発現
本実施例の目的は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中でイソブタノール生合成経路を発現することである。イソブタノール経路の５つの遺伝子（図１の経路ステップ（ａ）から（ｅ））を発現のために２つのオペロンに分割した。それぞれアセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、および分枝ケト酸脱炭酸酵素をコードする３つの遺伝子ｂｕｄＢ、ｉｌｖＤ、およびｋｉｖＤを枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０の染色体に組み込んだ（ペイン（Ｐａｙｎｅ）およびジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：２２７８〜２２８２頁、１９９１年）。それぞれアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼおよびブタノールデヒドロゲナーゼをコードする２つの遺伝子ｉｌｖＣおよびｂｄｈＢを発現ベクター中にクローニングして、組み込まれたイソブタノール遺伝子を保有するバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株に形質転換した。
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０の染色体への３つの遺伝子、ｂｕｄＢ、ｉｌｖＤ、およびｋｉｖＤの組み込み
３つの遺伝子、ｂｕｄＢ（配列番号１）、ｉｌｖＤ（配列番号５）、およびｋｉｖＤ（配列番号７）の染色体組み込みのために、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）組み込みベクターｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｓｐａｃおよびｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｇｒｏＥを使用した。どちらのプラスミドもｐＢＲ３２２からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）レプリコンと、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の選択のためのアンピシリン抗生物質マーカーと、相同的組換えによってベクターおよび介在配列の組み込みを指示するバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体中のｓａｃＢ遺伝子に対する２つの相同性セクションとを含有する。ｓａｃＢ相同性領域の間は、ｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｓｐａｃ上のｓｐａｃプロモーター（ＰｇｒｏＥ）、またはｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｇｒｏＥ上のｇｒｏＥＬプロモーター（ＰｇｒｏＥ）、およびバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の選択可能なマーカー、エリスロマイシンである。プロモーター領域はまた、ｌａＣＩ リプレッサータンパク質による発現調節のためにｌａｃＯ配列も含有する。ｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｓｐａｃ（６，３４１ｂｐ）およびｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｇｒｏＥ（６，２２１ｂｐ）の配列は、それぞれ配列番号１４２および配列番号１４３で示される。
プラスミドｐＴｒｃ９９ａｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤからｉｌｖＣ遺伝子を消去して、３つの遺伝子ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤのカセットを構築した。プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤの構築については実施例１４で述べられる。プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤをＡｆｌＩＩおよびＮｈｅＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で処理して平滑末端を作り、得られたｐＴｒｃ９９ａベクター、ｂｕｄＢ、ｉｌｖＤ、およびｋｉｖＤを含有する９．４ｋｂｐの断片をゲル精製した。９．４ｋｂｐのベクター断片を自己ライゲートして、ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤを作り出し、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。制限酵素マッピングによって、ｐＴｒｃ９９ａｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤのクローンをｉｌｖＣ遺伝子欠失について確認した。得られたプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤをＳａｃＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で処理して平滑末端を作った。次にプラスミドをＢａｍＨＩで消化し、得られた５，２９７ｂｐのｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ断片をゲル精製した。５，２９７ｂｐのｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ断片を組み込みベクターｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｓｐａｃのＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ部位中にライゲートした。ライゲーション混合物をＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。プライマーＴ−ｂｕｄＢ（ＢａｍＨＩ）（配列番号１４４）およびＢ−ｋｉｖＤ（ＢａｍＨＩ）（配列番号１４５）での５．３ｋｂｐのｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ断片のＰＣＲ増幅によって、形質転換体をスクリーンした。正しいクローンをｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｓｐａｃ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤと命名した。
プラスミドｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｓｐａｃ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体から調製し、ドイル（Ｄｏｙｌｅ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：９５７頁、１９８０年、で述べられるようにして調製された枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０コンピテント細胞に形質転換した。コンピテント細胞を遠心分離によって収集し、細胞ペレットを少量の上清に再懸濁した。１容積のコンピテント細胞あたり、２容積のＳＰＩＩ−ＥＧＴＡ培地（Ｐ．Ｇｅｒｈａｒｄｔら編、「一般および分子細菌学方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」米国微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ、１９９４年）を添加した。アリコート（０．３ｍＬ）の細胞を試験管に分配し、次に２〜３μｇのプラスミドｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｓｐａｃ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤを試験管に添加した。試験管を振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートした後、０．１ｍＬの１０％酵母抽出物を各試験管に添加して、それらをさらに６０分間インキュベートした。二重寒天オーバーレイ法を使用して、選択のために形質転換体をエリスロマイシン（１．０μｇ／ｍＬ）含有ＬＢプレート上で生育させた（一般および分子細菌学方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、前出）。ＰＣＲ増幅によって、Ｎ１３０ＳｅｑＦ１（配列番号４０）およびＮ１３０ＳｅｑＲ１（配列番号４４）プライマーでｂｕｄＢについて、Ｎ１３３ＳｅｑＦ１（配列番号６２）およびＮ１３３ＳｅｑＲ１（配列番号６６）でｋｉｖＤについて、形質転換体をスクリーンしした。陽性組み込み体は、予期された１．７ｋｂｐのｂｕｄＢおよび１．７ｋｂｐのｋｉｖＤ ＰＣＲ産物を示した。２つの陽性組み込み体を同定し、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０ΔｓａｃＢ：：Ｐｓｐａｃ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ＃２−３−２および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０ΔｓａｃＢ：：Ｐｓｐａｃ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ＃６−１２−７と命名した。
組み込み体枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０ΔｓａｃＢ：：Ｐｓｐａｃ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ＃２−３−２および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０ΔｓａｃＢ：：Ｐｓｐａｃ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ＃６−１２−７の酵素活性のアッセイは、ＢｕｄＢ、ＩｌｖＤおよび、ＫｉｖＤの活性が、プロモーター（Ｐｓｐａｃ）制御下で低いことを示唆した。機能性酵素の発現を改善するために、ＰｓｐａｃプロモーターをプラスミドｐＨＴ０１からのＰｇｒｏＥプロモーター（ドイツ国ゲッティンゲンのモビテック（ＭｏＢｉｔｅｃ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））によって置換した。
ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩでの制限酵素消化によって、配列番号１４６で示される６，０３９ｂｐのｐＦＰ９８８Ｄｓｓベクター断片を無関係のプラスミドから切除して、ゲル精製した。プライマーＴ−ｇｒｏＥ（ＸｈｏＩ）（配列番号１４７）およびＢ−ｇｒｏＥＬ（ＳｐｅＩ，ＢａｍＨ１）（配列番号１４８）で、ＰｇｒｏＥプロモーターをプラスミドｐＨＴ０１からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、６，０３９ｂｐのｐＦＰ９８８Ｄｓｓベクター断片とライゲートし、ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。プライマーＴ−ｇｒｏＥ（ＸｈｏＩ）およびＢ−ｇｒｏＥＬ（ＳｐｅＩ，ＢａｍＨ１）で、形質転換体をＰＣＲ増幅によってスクリーンした。陽性クローンは予期された１７４ｂｐＰｇｒｏＥＰＣＲ産物を示し、ｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｇｒｏＥと命名した。プラスミドｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｇｒｏＥはまた、ＤＮＡ配列によっても確認した。
プラスミドｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｓｐａｃ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤをＳｐｅＩおよびＰｍｅＩで消化し、得られた５，３１３ｂｐのｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ断片をゲル精製した。ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ断片をｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｇｒｏＥのＳｐｅＩおよびＰｍｅＩ部位にライゲートし、ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。プライマーＴ−ｇｒｏＥＬ（配列番号１４９）およびＮ１１１（配列番号２０）で、ＰＣＲ増幅によって、陽性クローンを１，６９０ｂｐのＰＣＲ産物についてスクリーンした。陽性クローンをｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｇｒｏＥ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤと命名した。
プラスミドｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｇｒｏＥ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体から調製し、上述のように枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０コンピテント細胞に形質転換した。ＰＣＲ増幅によって、プライマーＮ１３０ＳｅｑＦ１（配列番号４０）およびＮ１３０ＳｅｑＲ１（配列番号４４）でｂｕｄＢについて、Ｎ１３３ＳｅｑＦ１（配列番号６２）およびＮ１３３ＳｅｑＲ１（配列番号６６）でｋｉｖＤについて形質転換体をスクリーンした。陽性組み込み体は、予期された１．７ｋｂｐのｂｕｄＢおよび１．７ｋｂｐのｋｉｖＤＰＣＲ産物を示した。２つの陽性組み込み体を単離して、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０ΔｓａｃＢ：：ＰｇｒｏＥ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ＃１−７および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０ΔｓａｃＢ：：ＰｇｒｏＥ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ＃８−１６と命名した。
ｉｌｖＣおよびｂｄｈＢ遺伝子のプラスミド発現
残る２つのイソブタノール遺伝子ｉｌｖＣおよびｂｄｈＢをプラスミドから発現した。ｌａｃＯ配列含有ＰｇｒｏＥプロモーターからｉｌｖＣ遺伝子が発現するように、モビテック（ＭｏＢｉｔｅｃ）からのバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターであるプラスミドｐＨＴ０１を使用して、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのｉｌｖＣ遺伝子とＰｇｒｏＥプロモーターとを融合させた。プライマーＴ−ｉｌｖＣＢ．ｓ．（ＢａｍＨＩ）（配列番号１５０）およびＢ−ｉｌｖＣＢ．ｓ．（ＳｐｅＩ ＢａｍＨＩ）（配列番号１５１）で、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＲ１５１（ＡＴＣＣ３３６７７）ゲノムＤＮＡから、配列番号１８６で示されるｉｌｖＣ遺伝子をＰＣＲ増幅した。１，０６７ｂｐのｉｌｖＣＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、ｐＨＴ０１のＢａｍＨＩ部位にライゲートした。ライゲーション混合物をＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。プライマーＴ−ｇｒｏＥＬおよびＢ−ｉｌｖＢ．ｓ．（ＳｐｅＩＢａｍＨＩ）で、増幅ＰＣＲによって、陽性クローンを１，１８８ｂｐＰＣＲ産物についてスクリーンした。陽性クローンをｐＨＴ０１−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ）と命名した。ＰｇｒｏＥ−ｉｌｖＣ縮合断片のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして、プラスミドｐＨＴ０１−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ）を使用した。
プラスミドｐＢＤ６４（ミントン（Ｍｉｎｔｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：１６５１頁、１９９０年）は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中での外来性遺伝子発現のためのかなり安定したベクターであり、ｒｅｐＢ遺伝子、および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中での選択のためのクロラムフェニコールおよびカナマイシン抵抗性遺伝子を含有する。ＰｇｒｏＥプロモーター制御下でのｉｌｖＣおよびｂｄｈＢの発現のために、このプラスミドを使用した。ＰｇｒｏＥ−ｉｌｖＣ、ｂｄｈＢおよびｌａＣＩリプレッサー遺伝子をプラスミドｐＢＤ６４中にクローニングするために、ワンステップアセンブリー法を使用した（ツゲ（Ｔｓｕｇｅ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：ｅ１３３頁、２００３年）。ＤｒａＩＩＩ配列（ＣＡＣＣＧＡＧＴＧ）を導入するプライマーＴ−ＢＤ６４（ＤｒａＩＩＩ）（配列番号１５２）、およびＤｒａＩＩＩ配列（ＣＡＣＣＴＧＧＴＧ）を導入するプライマーＢ−ＢＤ６４（ＤｒａＩＩＩ）（配列番号１５３）で、複製機能とカナマイシン抗生物質マーカーとを含有するｒｅｐＢ遺伝子を含有する、３，５８８ｂｐのｐＢＤ６４断片をｐＢＤ６４からＰＣＲ増幅した。ＤｒａＩＩＩ配列（ＣＡＣＣＡＧＧＴＧ）を導入するＴ−ｌａｃＩｑ（ＤｒａＩＩＩ）（配列番号１５４）、およびＤｒａＩＩＩ配列（ＣＡＣＧＧＧＧＴＧ）を導入するＢ−ｌａｃＩｑ（ＤｒａＩＩＩ）（配列番号１５５）で、１，３２７ｂｐのｌａＣＩリプレッサー遺伝子をｐＭＵＴＩＮ４（ヴァグネル（Ｖａｇｎｅｒ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４：３０９７〜３１０４頁、１９９８年）からＰＣＲ増幅した。ＤｒａＩＩＩ配列（ＣＡＣＣＣＣＧＴＧ）を導入するＴ−ｇｒｏＥ（ＤｒａＩＩＩ）（配列番号１５６）、およびＤｒａＩＩＩ配列（ＣＡＣＣＧＴＧＴＧ）を導入するＢ−Ｂ．ｓ．ｉｌｖＣ（ＤｒａＩＩＩ）（配列番号１５７）で、１，２２４ｂｐのＰｇｒｏＥ−ｉｌｖＣ縮合カセットをｐＨＴ０１−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ）からＰＣＲ増幅した。ＤｒａＩＩＩ配列（ＣＡＣＡＣＧＧＴＧ）を導入するプライマーＴ−ｂｄｈＢ（ＤｒａＩＩＩ）（配列番号１５９）、およびＤｒａＩＩＩ配列（ＣＡＣＴＣＧＧＴＧ）を導入するプライマーＢ−ｂｄｈＢ（ｒｒｎＢＴ１ＤｒａＩＩＩ）（配列番号１６０）で、１．２ｋｂｐのｂｄｈＢ遺伝子（配列番号１５８）をクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ８２４）ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＤｒａＩＩＩ認識配列の可変部中の３つの下線付き文字は、ｐＢＤ６４−ｌａｃＩ−ＰｇｒｏＥｉｌｖＣ−ｂｄｈＢの順で４つの断片をアセンブルするための特異的塩基対合のためにデザインされている。両端にＤｒａＩＩＩ部位がある各ＰＣＲ産物をＤｒａＩＩＩで別々に消化し、得られたＤｒａＩＩＩ断片３，５８８ｂｐのｐＢＤ６４、ｌａｃＩ、ＰｇｒｏＥｉｌｖＣ、およびｂｄｈＢをキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）からのキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）ゲル抽出キットを使用して、ゲル精製した。ライゲーションのために、総ＤＮＡ濃度３０〜５０μｇ／１００μＬで、各断片を等モル濃度で含有する混合物を調製した。次にライゲーション溶液を１６℃で一晩インキュベートした。ライゲーションは、高分子量のタンデム反復ＤＮＡを発生させた。ライゲートした長い線状ＤＮＡ混合物を上述のように調製されたコンピテント枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０に直接、形質転換した。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、円形ＤＮＡよりも長い反復線状ＤＮＡ形態を優先的に取り込んで、プラスミドを確立する。形質転換後、選択のために１０μｇ／ｍＬのカナマイシン含有ＬＢプレート上に培養を播種した。陽性組換えプラスミドをＤｒａＩＩＩ消化によってスクリーンし、３，５８８ｂｐ（ｐＢＤ６４）、１，３２７ｂｐ（ｌａｃＩ）、１，２２４ｂｐ（ＰｇｏｒＥ−ｉｌｖＣ）、および１，１９４ｂｐ（ｂｄｈＢ）の予期されたサイズの４つの断片を得た。陽性プラスミドをｐＢＤＰｇｒｏＥ−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ．）−ｂｄｈＢと命名した。
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０ΔｓａｃＢ：：ＰｇｒｏＥ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ／ｐＢＤＰｇｒｏＥ−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ．）−ｂｄｈＢによるグルコースまたはスクロースからのイソブタノール生成の実証
イソブタノール生合成経路の５つの遺伝子を発現する組換え枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を構築するために、２つの組み込み枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０ΔｓａｃＢ−ＰｇｒｏＥ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ＃１−７および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０ΔｓａｃＢ：：ＰｇｒｏＥ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ＃８−１６のコンピテント細胞を上述のように調製し、プラスミドｐＢＤＰｇｒｏＥ−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ．）−ｂｄｈＢで形質転換して、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０ΔｓａｃＢ：：ＰｇｒｏＥ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ＃１−７／ｐＢＤＰｇｒｏＥ−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ．）−ｂｄｈＢおよび枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０ΔｓａｃＢ：：ＰｇｒｏＥ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ＃８−１６／ｐＢＤＰｇｒｏＥ−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ．）−ｂｄｈＢを生じさせた。
２つの組換え株を１２５ｍＬフラスコ内のカナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含有する２５ｍＬまたは１００ｍＬのグルコース培地のどちらかに接種して、それぞれ高および低酸素条件をシミュレートし、２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で好気的に生育させた。培地は、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、５ｍＭのカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭのＭＯＰＳ／ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）、２０ｍＭのグルタミン酸／ＫＯＨ（ｐＨ７．０）、２％のＳ１０金属ミックス、１％のグルコース、０．０１％の酵母抽出物、０．０１％のカザミノ酸、および各５０μｇ／ｍＬのＬ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、およびＬ−リジンから構成された。Ｓ１０金属ミックスは、２００ｍＭのＭｇＣｌ２、７０ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＭｎＣｌ２、０．１ｍＭのＦｅＣｌ３、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、０．２ｍＭのチアミン塩酸塩、０．１７２ｍＭのＣｕＳＯ４、０．２５３ｍＭのＣｏＣｌ２、および０．２４２ｍＭのＮａ２ＭｏＯ４から構成された。１．０ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で、細胞を対数初期（およそ０．２のＯＤ６００）に誘導した。接種の２４時間後、一般法セクションで述べられるようにして、ブロスのアリコートを屈折率（ＲＩ）検出付きショーデックス・シュガー（Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ）ＳＨ１０１１カラム）でのＨＰＬＣによって、イソブタノール含量について分析した。ＨＰＬＣ結果を表１２に示す。
Figure 0005276986
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０ΔｓａｃＢ：：ＰｇｒｏＥ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ＃１−７／ｐＢＤＰｇｒｏＥ−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ．）−ｂｄｈＢ単離物はまた、本質的に上述のようにして、スクロースからのイソブタノール生成についても調べた。組換え株を１２５ｍＬフラスコ内のカナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含有する２５ｍＬまたは７５ｍＬのスクロース培地に接種して、高および中程度の酸素レベルをシミュレートし、２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で生育させた。グルコース（１０ｇ／Ｌ）が１０ｇ／Ｌのスクロースで置換されたこと以外は、スクロース培地はグルコース培地と同じであった。細胞は誘導せず、または１．０ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で対数初期期（およそ０．２のＯＤ６００）に誘導した。接種の２４時間後、一般法セクションで述べられるようにして、ブロスのアリコートを屈折率（ＲＩ）検出付きショーデックス・シュガー（Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ）ＳＨ１０１１カラム）でのＨＰＬＣによって、イソブタノール含量について分析した。ＨＰＬＣ結果を表１３に示す。
Figure 0005276986
実施例２１（予測的）
ラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）中のイソブタノール生合成経路の発現
本予測的実施例の目的は、どのようにラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）中でイソブタノール生合成経路を発現するかについて述べることである。５つの酵素活性をコードするイソブタノール経路の５つの遺伝子を発現のために２つのオペロンに分割する。ホルス（Ｈｏｌｓ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１４０１〜１４１３頁、１９９４年、で述べられる方法を使用して、相同的組換えによって、それぞれアセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、および分枝α−ケト酸脱炭酸酵素をコードする、ｂｕｄＢ、ｉｌｖＤ、およびｋｉｖＤ遺伝子をラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の染色体に組み込む。残る２つの遺伝子（それぞれアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼおよびブタノールデヒドロゲナーゼをコードするｉｌｖＣおよびｂｄｈＢ）を発現プラスミド中にクローニングして、組み込まれたイソブタノール遺伝子を保有する乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株に形質転換する。ラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）をディフコ・ラボラトリーズからのＭＲＳ培地中で３７℃で生育させ、モレイラ（Ｍｏｒｅｉｒａ）ら、ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１５頁、２００５年、で述べられるようにして、染色体ＤＮＡを単離する。
組み込み
相同的組換えによって、合成Ｐ１１プロモーターの制御下にあるｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ（（Ｒｕｄ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５２：１０１１〜１０１９頁、２００６年）をラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＴＣＣ ＢＡＡ−７９３（ＮＣＩＭＢ８８２６）の染色体中にｌｄｈＬ１遺伝子座で組み込む。ｌｄｈＬ組み込みターゲティングベクターを構築するために、ｌｄｈＬと相同性があるラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ジェンバンクＮＣ＿００４５６７）からのＤＮＡ断片をプライマーＬＤＨＥｃｏＲＶＦ（配列番号１６１）およびＬＤＨＡａｔＩＩＲ（配列番号１６２）でＰＣＲ増幅する。１９８６ｂｐのＰＣＲ断片をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングして、配列決定する。ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｌｄｈＬ１クローンをＥｃｏＲＶおよびＡａｔＩＩで消化して１９８２ｂｐのｌｄｈＬ１断片を放出し、それをゲル精製する。配列番号１７７で示される組み込みベクターｐＦＰ９８８をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ＤＮＡポリメラーゼで処理して末端を平滑化する。次に直線化プラスミドをＡａｔＩＩで消化し、２９３１ｂｐのベクター断片をゲル精製する。ＥｃｏＲＶ／ＡａｔＩＩｌｄｈＬ１断片をｐＦＰ９８８ベクター断片にライゲートして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換する。アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択し、コロニーＰＣＲによってスクリーンして、ｐＦＰ９８８−ｌｄｈＬの構築を確認する。
一体化ＤＮＡに選択可能なマーカーを付加するために、Ｃｍ遺伝子をそのプロモーターと共にｐＣ１９４（ジェンバンクＮＣ＿００２０１３，配列番号２６７）からプライマーＣｍＦ（配列番号１６３）およびＣｍＲ（配列番号１６４）でＰＣＲ増幅して、８３６ｂｐのＣＲ産物を増幅する。このＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換して、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−Ｃｍを作り出す。配列決定してＰＣＲによるエラーが導入されなかったことを確認した後、ＣｍカセットをｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−Ｃｍから８２８ｂｐのＭｌｕＩ／ＳｗａＩ断片として消化し、ゲル精製する。ｌｄｈＬ−相同性含有組み込みベクターｐＦＰ９８８−ｌｄｈＬをＭｌｕＩおよびＳｗａＩで消化し、４７４０ｂｐのベクター断片をゲル精製する。Ｃｍカセット断片をｐｐＦＰ９８８−ｌｄｈＬベクターにライゲートして、ｐＦＰ９８８−ＤｌｄｈＬ：：Ｃｍを作り出す。
最後に実施例２０で述べられるｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｓｐａｃ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤからのｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤカセットを変性して、アミラーゼプロモーターを合成Ｐ１１プロモーターで置換する。次にオペロン全体をｐＦＰ９８８−ＤｌｄｈＬ：：Ｃｍ中に移動させる。プライマーＰ１１Ｆ−ＳｔｕＩ（配列番号１６５）およびＰ１１Ｒ−ＳｐｅＩ（配列番号１６６）とのオリゴヌクレオチドアニーリングによって、Ｐ１１プロモーターを構築する。アニールされたオリゴヌクレオチドをカリフォルニア州サンディエゴのエンビ・テック（Ｅｍｂｉ Ｔｅｃ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））からの６％ウルトラＰＡＧＥゲル上でゲル精製する。アミラーゼプロモーターを含有するプラスミドｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｓｐａｃ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤをＳｔｕＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られた１０．９ｋｂｐのベクター断片をゲル精製する。単離されたＰ１１断片を消化されたｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｓｐａｃ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤにライゲートし、ｐＦＰ９８８−Ｐ１１−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤを作り出す。次にプラスミドｐＦＰ９８８−Ｐ１１−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤをＳｔｕＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られた５．４ｋｂｐのＰ１１−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ断片をゲル精製する。ｐＦＰ９８８−ＤｌｄｈＬ：：ＣｍをＨｐａＩよびＢａｍＨＩで消化し、５．５ｋｂｐのベクター断片を単離する。ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤオペロンを組み込みベクターｐＦＰ９８８−ＤｌｄｈＬ：：Ｃｍとライゲートして、ｐＦＰ９８８−ＤｌｄｈＬ−Ｐ１１−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ：：Ｃｍを作り出す。
外来性ｂｕｄＢ，ｉｌｖＤ、およびｋｉｖＤ遺伝子を含んでなるＬ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ΔｄｈＬ１：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ：：Ｃｍを形成するためのＬ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＢＡＡ−７９３中へのｐＦＰ９８８−ＤｌｄｈＬ−Ｐ１１−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ：：Ｃｍの組み込み
ニコロフ（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ），Ｊ．Ａ．編、「分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」より、第４７巻、アウクルスト（Ａｕｋｒｕｓｔ），Ｔ．Ｗ．ら、「微生物のための電気穿孔プロトコル（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ、２０１〜２０８頁、１９９５年、で述べられるようにして、Ｌ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のエレクトロコンピテント細胞を調製する。電気穿孔後、アウクルスト（Ａｕｋｒｕｓｔ）ら（前出）で述べられるようにして、細胞をＭＲＳＳＭ培地（０．５Ｍのスクロースおよび０．１ＭのＭｇＣｌ２で栄養強化されたＭＲＳ培地）中で撹拌せずに３７℃で２時間増殖させる。電気穿孔された細胞を選択のためにクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）含有ＭＲＳプレート上に播種して、３７℃でインキュベートする。形質転換体を最初にコロニーＰＣＲ増幅によってスクリーンして組み込みを確認し、次に最初の陽性クローンを一群のプライマーでのＰＣＲ増幅によって、より厳密にスクリーンする。
ｉｌｖＣおよびｂｄｈＢ遺伝子のプラスミド発現
Ｌ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ｌｄｈＬプロモーター（フェライン（Ｆｅｒａｉｎ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：５９６〜６０１頁、１９９４年）の制御下にあるプラスミドｐＴＲＫＨ３（オサリバン（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ＤＪおよびクラエンハマー（Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ）ＴＲ，Ｇｅｎｅ １３７：２２７〜２３１頁、１９９３年）から、残る２つのイソブタノール遺伝子を発現する。プライマーＰｌｄｈＬ Ｆ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１６７）およびＰｌｄｈＬ Ｒ−ＢａｍＨＩ（配列番号１６８）を使用して、Ｌ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＴＣＣＢＡＡ−７９３ゲノムからｌｄｈＬプロモーターをＰＣＲ増幅する。４１１ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングして、配列決定する。得られたプラスミドｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ＰｌｄｈＬをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＰｌｄｈＬ断片を放出する。
プラスミドｐＴＲＫＨ３をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化し、ゲル精製されたベクター断片と、ＰｌｄｈＬ断片と、ゲル精製されたバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）発現プラスミドｐＢＤＰｇｒｏＥ−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ．）−ｂｄｈＢからのｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ．）−ｂｄｈＢを含有する２．４ｋｂｐのＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩ断片（実施例２０）とを三元ライゲーションでライゲートする。ライゲーション混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トップ１０細胞に形質転換し、形質転換体をエリスロマイシン（１５０ｍｇ／Ｌ）を含有するミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの脳心臓浸出物（ＢＨＩ）プレート上で生育させる。形質転換体をＰＣＲによってスクリーンし、構築を確認する。上述のように電気穿孔によって、発現プラスミドｐＴＲＫＨ３−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ．）−ｂｄｈＢはＬ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ΔｌｄｈＬ１：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ：：Ｃｍに形質転換する。
エリスロマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を添加した５０ｍＬのＭＲＳ培地を含有する２５０ｍＬ振盪フラスコに、ｐＴＲＫＨ３−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ．）−ｂｄｈＢを含有するＬ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ΔｄｈＬ１：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ：：Ｃｍを接種して、３７℃で振盪せずに１８〜２４時間生育させた後、一般法セクションで述べられるようにしてＨＰＬＣまたはＧＣ分析により、イソブタノールを検出する。
実施例２２（予測的）
エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）中でのイソブタノール生合成経路の発現
この予測的実施例の目的は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）中でどのようにイソブタノール生合成経路を発現するかについて述べることである。本実施例においてイソブタノール生合成経路の発現のための宿主株として使用されるエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３株の完全なゲノム配列は、公開されている（ポールセン（Ｐａｕｌｓｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：２０７１〜２０７４頁、２００３年）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／グラム陽性シャトルベクターであるプラスミドｐＴＲＫＨ３（オサリバン（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ＤＪおよびクラエンハマー（Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ）ＴＲ，Ｇｅｎｅ １３７：２２７〜２３１頁、１９９３年）を１オペロン中のイソブタノール経路の５つの遺伝子（ｂｕｄＢ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、ｋｉｖＤ、ｂｄｈＢ）の発現のために使用する。ｐＴＲＫＨ３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドｐ１５Ａ複製基点、ｐＡＭβ１レプリコン、およびテトラサイクリンおよびエリスロマイシンに対する２つの抗生物質抵抗性選択マーカーを含有する。テトラサイクリン抵抗性は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのみ発現し、エリスロマイシン抵抗性は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびグラム陽性細菌の双方で発現する。プラスミドｐＡＭβ１誘導体はＥ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）中で複製できる（ポイヤー（Ｐｏｙａｒｔ）ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５６：１９３〜１９８頁、１９９７年）。エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）をはじめとする多様なグラム陽性細菌中でのナイシンによる遺伝子発現の効率的な制御のために使用される、誘導性ｎｉｓＡプロモーター（ＰｎｉｓＡ）（アイヘンバウム（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：２７６３〜２７６９頁、１９９８年）を使用して、イソブタノール生合成経路の酵素をコードする５つの所望の遺伝子の発現を制御する。
イソブタノール経路オペロン含有するプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ（実施例１４で述べられる）を変性して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｉｌｖＣ遺伝子（配列番号３）を枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｉｌｖＣ遺伝子（配列番号??）で置き換える。さらにクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）からのｂｄｈＢ遺伝子（配列番号１５８）をオペロン末端に付加する。初めにプライマーＦ−ｂｄｈＢ−ＡｖｒＩＩ（配列番号１６９）およびＲ−ｂｄｈＢ−ＢａｍＨＩ（配列番号１７０）を使用して、ｐＢＤＰｇｒｏＥ−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ．）−ｂｄｈＢ（実施例２０で述べられる）からのｂｄｈＢ遺伝子を増幅し、次にＴＯＰＯクローンして配列決定する。ＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩでの消化とそれに続くゲル精製によって、１１９４ｂｐのｂｄｈＢ断片を単離する。このｂｄｈＢ断片をあらかじめＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩで消化されたｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤとライゲートし、得られた断片をゲル精製する。電気穿孔によって、ライゲーション混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ寒天プレート上で３７℃での一晩の生育に続いて、形質転換体を選択する。次に形質転換体をコロニーＰＣＲによってスクリーンし、ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｂｄｈＢを含有する正しいクローンを確認する。
次にプライマーＦ−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ．）−ＡｆｌＩＩ（配列番号１７１）およびＲ−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ．）−ＮｏｔＩ（配列番号１７２）を使用して、ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ．）をｐＢＤＰｇｒｏＥ−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ．）−ｂｄｈＢ（実施例２０で述べられる）から増幅する。ＰＣＲ産物をＴＯＰＯクローンして配列決定する。ＡｆｌＩＩおよびＮｏｔＩでの消化とそれに続くゲル精製によって、１０５１ｂｐのｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ．）断片を単離する。この断片と、ＡｆｌＩＩおよびＮｏｔＩで切断して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｉｌｖＣを放出したｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｂｄｈＢとをライゲートする（ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ．）とのライゲーションに先だって１０．７ｋｂｐのベクターバンドをゲル精製する）。電気穿孔によってライゲーション混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ寒天プレート上における３７℃で一晩の生育に続いて、形質転換体を選択する。次に形質転換体をコロニーＰＣＲによってスクリーンし、ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ．）−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｂｄｈＢを含有する正しいクローンを確認する。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／グラム陽性シャトルベクターｐＴＲＫＨ３にプロモーターを提供するために、プライマーＦ−ＰｎｉｓＡ（ＨｉｎｄＩＩＩ）（配列番号１７３）およびＲ−ＰｎｉｓＡ（ＳｐｅＩＢａｍＨＩ）（配列番号１７４）で、ｎｉｓＡプロモーター（チャンドラパティ（Ｃｈａｎｄｒａｐａｔｉ）ら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６（２）：４６７〜４７７頁、２００２年）をラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、次にＴＯＰＯクローンする。配列決定後、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩでの消化とそれに続くゲル精製によって、２１３ｂｐのｎｉｓＡプロモーター断片を単離する。プラスミドｐＴＲＫＨ３をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ベクター断片をゲル精製する。直線化ｐＴＲＫＨ３をＰｎｉｓＡ断片とライゲートし、電気穿孔によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換する。エリスロマイシン（２５μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ寒天プレート上における３７℃での一晩の生育に続いて、形質転換体を選択する。次に形質転換体コロニーＰＣＲによってスクリーンし、ｐＴＲＫＨ３−ＰｎｉｓＡの正しいクローンを確認する。
プラスミドｐＴＲＫＨ３−ＰｎｉｓＡをＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ベクターをゲル精製する。上述のプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ）−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｂｄｈＢをＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、７．５ｋｂｐの断片をゲル精製する。７．５ｋｂｐのｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ）−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｂｄｈＢ断片を中にライゲートし、ＰＴＲＫＨ３−ＰｎｉｓＡベクター中にＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩ部位でライゲートする。電気穿孔によってライゲーション混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、エリスロマイシン（２５μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ寒天プレート上での３７℃での一晩の生育に続いて形質転換体を選択する。次に形質転換体をコロニーＰＣＲによってスクリーンする。得られたプラスミドをｐＴＲＫＨ３−ＰｎｉｓＡ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ）−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｂｄｈＢと命名する。このプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体から調製し、当該技術分野で既知の方法（ニコロフ（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ），Ｊ．Ａ．編、「分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」より、第４７巻、アウクルスト（Ａｕｋｒｕｓｔ），Ｔ．Ｗ．ら、「微生物のための電気穿孔プロトコル（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ、２１７〜２２６頁、１９９５年）を使用して、電気穿孔によってエレクトロコンピテントＥ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３細胞に形質転換し、Ｅ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３／ｐＴＲＫＨ３−ＰｎｉｓＡ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ）−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｂｄｈＢをもたらす。
ｎｉｓＡ調節遺伝子であるｎｉｓＲとｎｉｓＫ、ａｄｄ９スペクチノマイシン抵抗性遺伝子、およびｐＳＨ７１複製起点を含有する第２のプラスミドを電気穿孔によってＥ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３／ｐＴＲＫＨ３−ＰｎｉｓＡ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ）−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｂｄｈＢに形質転換する。ｐＳＨ７１複製起点含を有するプラスミドは、Ｅ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）中のｐＡＭβ１誘導体と適合性である（アイヘンバウム（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ）ら、前出）。エリスロマイシン（２５μｇ／ｍＬ）およびスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ寒天プレート上で３７℃で生育させて、二重薬剤抵抗性形質転換体を選択する。
酵母抽出物（０．２％）（フィシェッティ（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１：１３８４〜１４０１頁、１９８５年）、ナイシン（２０μｇ／ｍＬ）（アイヘンバウム（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ）ら、前出）、エリスロマイシン（２５μｇ／ｍＬ）、およびスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加した５０ｍＬのトッド−ヒューウィット・ブロスを含有する２５０ｍＬ振盪フラスコに、２つのプラスミド、すなわち発現プラスミド（ｐＴＲＫＨ３−ＰｎｉｓＡ−ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ（Ｂ．ｓ）−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｂｄｈＢ）および調節プラスミド（ｐＳＨ７１−ｎｉｓＲＫ）を保有する得られたＥ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３Ｂ株を接種する。フラスコを振盪せずに３７℃で１８〜２４時間インキュベートした後、一般法セクションで述べられるようにしてＨＰＬＣまたはＧＣ分析によりイソブタノール生成を測定する。
４つの異なるイソブタノール生合成経路を示す。「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」、「ｆ」、「ｇ」、「ｈ」、「ｉ」、「ｊ」、および「ｋ」と標識されたステップは、下で述べられる基質から産物への変換に相当する。

Claims (26)

  1. ｉ）ピルビン酸からアセト乳酸へ（経路ステップａ）、
    ii）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸へ（経路ステップｂ）、
    iii）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へ（経路ステップｃ）、および
    iv）α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへ（経路ステップｄ）
    の基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする、異種ＤＮＡ分子を含んでなる組換え微生物宿主細胞であって、前記微生物宿主細胞がイソブタノールを生成する組換え微生物宿主細胞において、
    ａ）ピルビン酸からアセト乳酸への基質から産物への変換を触媒するポリペプチドがアセト乳酸シンターゼであり、
    ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼであり、
    ｃ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼであり、そして
    ｄ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、分枝α−ケト酸脱炭酸酵素である、
    ことを特徴とする組換え微生物宿主細胞。
  2. ｉ）ピルビン酸からアセト乳酸へ（経路ステップａ）、
    ii）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸へ（経路ステップｂ）、
    iii）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へ（経路ステップｃ）、および
    iv）α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡへ（経路ステップｆ）、
    ｖ）イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへ（経路ステップｇ）
    の基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする、異種ＤＮＡ分子を含んでなる組換え微生物宿主細胞であって、前記微生物宿主細胞がイソブタノールを生成する組換え微生物宿主細胞において、
    ａ）ピルビン酸からアセト乳酸への基質から産物への変換を触媒するポリペプチドがアセト乳酸シンターゼであり、
    ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼであり、
    ｃ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼであり、
    ｄ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、分枝ケト酸デヒドロゲナーゼであり、そして
    ｅ）イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼである、
    ことを特徴とする組換え微生物宿主細胞。
  3. ｉ）ピルビン酸からアセト乳酸へ（経路ステップａ）、
    ii）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸へ（経路ステップｂ）、
    iii）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へ（経路ステップｃ）、
    iv）α−ケトイソ吉草酸からバリンへ（経路ステップｈ）、
    ｖ）バリンからイソブチルアミンへ（経路ステップｉ）、および
    vi）イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへ（経路ステップｊ）
    の基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする、異種ＤＮＡ分子を含んでなる組換え微生物宿主細胞であって、前記微生物宿主細胞がイソブタノールを生成する組換え微生物宿主細胞において、
    ａ）ピルビン酸からアセト乳酸への基質から産物への変換を触媒するポリペプチドがアセト乳酸シンターゼであり、
    ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼであり、
    ｃ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼであり、
    ｄ）α−ケトイソ吉草酸からバリンへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、アミノ基転移酵素であり、
    ｅ）バリンからイソブチルアミンへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、バリン脱炭酸酵素であり、そして
    ｆ）イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、ωアミノ基転移酵素である、
    ことを特徴とする組換え微生物宿主細胞。
  4. さらに、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から産物への変換（経路ステップｅ）を触媒するポリペプチドをコードする、異種ＤＮＡ分子を含んでなり、前記ポリペプチドが、分枝アルコールデヒドロゲナーゼである請求項１〜３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  5. 細胞が、細菌、シアノ細菌、糸状菌、および酵母よりなる群から選択される請求項１〜３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  6. 細胞が、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ピチア（
    Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される属の一員である請求項５に記載の宿主細胞。
  7. 細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バシラス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、パエニバシラス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）およびサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）よりなる群から選択される請求項６に記載の宿主細胞。
  8. アセト乳酸シンターゼが、配列番号２、配列番号１７８、および配列番号１８０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  9. アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼが、配列番号４３、配列番号１８１、配列番号１８３、および配列番号１８５よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  10. アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼが、配列番号６、配列番号１８６、配列番号１８８、および配列番号１９０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  11. 分枝アルコールデヒドロゲナーゼが、配列番号１０、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、および配列番号２０４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項４に記載の宿主細胞。
  12. 分枝α−ケト酸脱炭酸酵素が、配列番号８、配列番号１９３、配列番号１９５、および配列番号１９７よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１に記載の宿主細胞。
  13. 分枝ケト酸デヒドロゲナーゼが４つのサブユニットを含んでなり、前記サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２１０、配列番号２０８、配列番号２０６、および配列番号２１２よりなる群から選択される請求項２に記載の宿主細胞。
  14. アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、および配列番号２３０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項２に記載の宿主細胞。
  15. アミノ基転移酵素が、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、および配列番号２４０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項に３記載の宿主細胞。
  16. バリンデヒドロゲナーゼが、配列番号２４２および配列番号２４４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３に記載の宿主細胞。
  17. バリン脱炭酸酵素が配列番号２４６で示されるアミノ酸配列を有する請求項３に記載の宿主細胞。
  18. ωアミノ基転移酵素が、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、および配列番号２５４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３に記載の宿主細胞。
  19. 宿主細胞が通性嫌気性菌である請求項１〜３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  20. １）請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組換え微生物宿主細胞を提供するステップと、
    ２）イソブタノールが生成される条件下において発酵培地中で上記の宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップと
    を含む、イソブタノールの製造方法。
  21. 発酵性炭素基質が、単糖類、オリゴ糖類、および多糖類よりなる群から選択される請求項２０に記載の方法。
  22. 炭素基質が、グルコース、スクロース、およびフルクトースよりなる群から選択される請求項２０に記載の方法。
  23. それによってイソブタノールが生成される条件が嫌気性である請求項２０に記載の方法。
  24. それによってイソブタノールが生成される条件が微好気性である請求項２０に記載の方法。
  25. 宿主細胞を最少培地中で炭素基質に接触させる、請求項２０に記載の方法。
  26. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換え微生物宿主細胞を含むイソブタノール含有発酵培地。
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