CN104718282A - 用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法 - Google Patents

用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及代谢工程微生物菌株，例如细菌菌株，其中存在提高的对丙二酰辅酶A的利用，以用于产生脂肪酸或脂肪酸衍生产物，其中该修饰的微生物通过依赖丙二酰辅酶A但不依赖丙二酰-ACP的机制产生脂肪酰辅酶A中间体。

Description

用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法
相关申请的交叉引用
本申请要求以下临时申请的优先权：2012年8月10日提交的美国申请61/682,127和2012年8月10日提交的美国申请61/682,138。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在美国能源部授予的DE-AR0000088的政府支持下进行的。政府在本发明中具有一定的权利。
技术领域
本发明涉及代谢工程微生物，例如细菌菌株，其中存在提高的对丙二酰辅酶A的利用，其通过依赖丙二酰辅酶A但不依赖丙二酰-ACP的代谢途径，用于产生脂肪酸或脂肪酸衍生产物。这些产物可以包括醛、醇、烷烃、烯烃和二酸以及由这些化学产物制成的其他下游产物。另外，可以进行遗传修饰以提供一种或多种化学产品。
援引并入
在此列出的所有申请、专利和出版物均通过全文引用和出于所有目的并入本文。
背景技术
随着越来越认同石油烃供给正在下降且其成本最终增加，对开发和改善用于生产化学品和燃料的工业微生物系统的兴趣增大。此类工业微生物系统可以完全或部分地代替石油烃在生产某些化学品中的应用。
众多化学品通过此类手段生产，范围从抗生素和抗疟疾药物产品到精细化学品再到燃料如乙醇。但是，仍然存在对修饰的微生物的商业需求，该微生物适于生产在化学产品的微生物生产途径中以丙二酰辅酶A作为底物的化学产品，例如但不限于各种脂肪酸和脂肪酸衍生产物。
发明内容
根据一个实施方案，本发明涉及生产包括但不限于脂肪酸、醇、醛、烷烃、烯烃或二酸的脂肪酸或脂肪酸衍生产物的方法，所述方法包括：i)将碳源与微生物细胞培养物合并以生产此脂肪酸或脂肪酸衍生产物，其中a)所述细胞培养物包含脂肪酸合酶的抑制剂，或所述微生物经过遗传修饰降低了该微生物的脂肪酸合酶途径中的酶活性；或者b)其中所述微生物经过遗传修饰提高了该微生物的依赖丙二酰辅酶A、不依赖丙二酰-ACP的脂肪酰辅酶A代谢途径(“MDMIFAA”)中的酶活性。该途径在本文中也称作依赖丙二酰辅酶A但不依赖丙二酰-ACP的脂肪酰辅酶A代谢途径。在微生物的依赖丙二酰辅酶A、不依赖丙二酰-ACP的脂肪酰辅酶A代谢途径中的这种提高可以通过包含乙酰乙酰辅酶A合酶、酮脂酰辅酶A合酶(或延长酶)、烯酰辅酶A还原酶、酮脂酰辅酶A还原酶和/或3-羟基酰基辅酶A脱水酶的基因或途径的活性或表达的提高结合乙酰乙酰辅酶A硫解酶的表达或活性的降低来实现。或者，在微生物的依赖丙二酰辅酶A、不依赖丙二酰-ACP的脂肪酰辅酶A代谢途径中提高的活性可以通过包含乙酰乙酰辅酶A合酶、酮脂酰辅酶A硫解酶、烯酰辅酶A还原酶、酮脂酰辅酶A还原酶和/或3-羟基酰基辅酶A脱水酶的基因或途径的表达的提高结合乙酰乙酰辅酶A硫解酶的表达或活性的降低来实现。在多个方面中，提供给微生物的碳源具有约1.0x 10-14或更高的碳-14：碳-12比。
根据本发明的碳源可以主要地是葡萄糖、蔗糖、果糖、右旋糖、乳糖、木糖、其他纤维素糖或其组合。或者，碳源是甘油。
在多种实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生产物的产量的增加是比在不包含本发明的遗传修饰和/或培养物系统特征的微生物中的产物产量高至少20％、至少50％、至少75％、至少100％或至少150％。
在某些实施方案中，细胞培养物包含脂肪酸合酶的抑制剂或者微生物经遗传修饰降低了该微生物的脂肪酸合酶途径中的酶活性。例如，脂肪酸合酶可以选自硫乳霉素、三氯生、浅蓝菌素、噻吩并二氮杂环己硼烷(thienodiazaborine)、异烟肼及其类似物。本发明包括这样的实施方案，其中细胞培养物包含遗传修饰的微生物。该遗传修饰的微生物可以针对某个性状而被修饰，该性状选自微生物的脂肪酸合酶途径中降低的酶活性，依赖丙二酰辅酶A、不依赖丙二酰-ACP的脂肪酰辅酶A代谢途径的一种或多种酶的提高的酶活性，微生物的脂肪酰辅酶A硫酯酶活性中提高的酶活性，微生物的乙酰乙酰辅酶A合酶活性中提高的酶活性，微生物的乙酰乙酰辅酶A硫解酶活性中降低的酶活性，微生物的乙酰辅酶A羧化酶途径中提高的酶活性，及其组合。例如，该遗传修饰的微生物可以经修饰降低了该微生物的脂肪酸合酶途径中的酶活性。或者，降低的酶活性是选自β-酮脂酰-ACP还原酶、3-羟基酰基-ACP脱水酶或烯酰-ACP还原酶的酶的酶活性的降低。在多个方面，通过引入异源核酸序列而发生微生物的脂肪酸合酶途径中的酶活性的降低，该异源核酸序列编码与编码脂肪酸合酶途径中的酶或其同源物的序列可操作地连接的诱导型启动子，或者该异源核酸序列编码具有降低的活性的脂肪酸合酶途径中的酶或其同源物。在多个方面，脂肪酸合酶途径中的酶或其同源物是具有温度敏感性β-酮脂酰-ACP或温度敏感性烯酰-ACP还原酶活性的多肽。在大肠杆菌中，这些温度敏感性突变基因可以包括fabIts(S241F)、fabBts(A329V)或fabDts(W257Q)。
在多种实施方案中，在微生物的依赖丙二酰辅酶A但不依赖丙二酰-ACP的脂肪酰辅酶A代谢途径中提高的酶活性可以通过包括泛酸激酶或丙酮酸脱氢酶在内的反馈抗性酶的表达增加而发生。在大肠杆菌中，这些反馈抗性突变基因可分别包括coaA(R106A)和lpd(E354K)。
在多种实施方案中，在微生物的依赖丙二酰辅酶A、不依赖丙二酰-ACP的脂肪酰辅酶A代谢途径中提高的酶活性可以通过包含乙酰乙酰辅酶A合酶、酮脂酰辅酶A硫解酶、烯酰辅酶A还原酶、酮脂酰辅酶A还原酶和3-羟基酰基辅酶A脱水酶的途径的表达增加而发生。烯酰辅酶A还原酶可以利用辅因子NADH或NADPH，或者利用NADPH和NADH两者。此外，酮脂酰辅酶A还原酶可以利用辅因子NADH或NADPH，或者利用NADPH和NADH两者。
在多种实施方案中，在微生物的依赖丙二酰辅酶A但不依赖丙二酰-ACP的脂肪酰辅酶A代谢途径中提高的酶活性可以通过包含乙酰乙酰辅酶A合酶、酮脂酰辅酶A合酶(或延长酶)、烯酰辅酶A还原酶、酮脂酰辅酶A还原酶和3-羟基酰基辅酶A脱水酶的途径的表达增加而发生。烯酰辅酶A还原酶可以利用辅因子NADH或NADPH，或者利用NADPH和NADH两者。此外，酮脂酰辅酶A还原酶可以利用辅因子NADH或NADPH，或者利用NADPH和NADH两者。
在多种实施方案中，通过微生物的依赖丙二酰辅酶A但不依赖丙二酰-ACP的脂肪酰辅酶A代谢途径生产脂肪酸或脂肪酸衍生产物的增加可以经由基因缺失、破坏或基因突变通过乙酰乙酰辅酶A硫解酶活性的降低而发生。
在多种实施方案中，通过微生物的依赖丙二酰辅酶A但不依赖丙二酰-ACP的脂肪酰辅酶A代谢途径生产脂肪酸或脂肪酸衍生产物的增加可以经由微生物tig基因的基因缺失、破坏或基因突变通过触发因子活性或参与细胞分裂的陪伴分子的活性降低而发生。
微生物的NADPH依赖性转氢酶途径中提高的酶活性可以通过引入编码多肽的异源核酸序列而发生，该多肽编码核苷酸转氢酶活性。
在多种实施方案中，通过微生物的依赖丙二酰辅酶A但不依赖丙二酰-ACP的脂肪酰辅酶A代谢途径生产脂肪酸或脂肪酸衍生产物的增加可以经由基因缺失、破坏或基因突变通过脂肪酸β-氧化活性的降低而发生，该脂肪酸β-氧化活性的降低包括但不限于脂肪酰辅酶A合成酶或连接酶活性的降低。
在多种实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物的产量的提高可以通过具有乙酰辅酶A羧化酶活性的酶的过表达而实现。
在多种实施方案中，通过引入编码具有氰酸酶(cyanase)和/或碳酸酐酶活性的多肽的异源核酸序列而发生胞内碳酸氢盐水平的提高。
在多种实施方案中，脂肪酸的产量的提高可以通过提高脂肪酰辅酶A硫酯酶活性的水平而发生。
在多种实施方案中，脂肪酸产物的链长特异性的提高可以通过提高链长特异性脂肪酰辅酶A硫酯酶活性的水平和降低脂肪酰辅酶A硫酯酶活性对不需要的脂肪酸链长的活性而发生。
在多种实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生产物的链长特异性的提高可以通过单独地或组合地提高链长特异性酮脂酰辅酶A硫解酶、烯酰辅酶A还原酶、酮脂酰辅酶A还原酶或3-羟基酰基辅酶A脱水酶活性的水平而发生。烯酰辅酶A还原酶可以利用辅因子NADH或NADPH，或者利用NADPH和NADH两者。此外，酮脂酰辅酶A还原酶可以利用辅因子NADH或NADPH，或者利用NADPH和NADH两者。
在多种实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生产物的链长特异性的提高可以通过单独地或组合地提高链长特异性酮脂酰辅酶A合酶(或延长酶)、烯酰辅酶A还原酶、酮脂酰辅酶A还原酶或3-羟基酰基辅酶A脱水酶活性的水平而发生。烯酰辅酶A还原酶可以利用辅因子NADH或NADPH，或者利用NADPH和NADH两者。此外，酮脂酰辅酶A还原酶可以利用辅因子NADH或NADPH，或者利用NADPH和NADH两者。
在多种实施方案中，脂肪酸生产的链长特异性的提高可以通过提高链长特异性脂肪酰辅酶A硫酯酶活性的水平和降低脂肪酰辅酶A硫酯酶活性对不需要的链长的活性而发生。
本发明的范围内包括遗传修饰的微生物，其中该微生物能够以选自大于0.05g/gDCW-hr、0.08g/gDCW-hr、大于0.1g/gDCW-hr、大于0.13g/gDCW-hr、大于0.15g/gDCW-hr、大于0.175g/gDCW-hr、大于0.2g/gDCW-hr、大于0.25g/gDCW-hr、大于0.3g/gDCW-hr、大于0.35g/gDCW-hr、大于0.4g/gDCW-hr、大于0.45g/gDCW-hr或大于0.5g/gDCW-hr的速率的比速率生产脂肪酸或脂肪酸衍生产物。
在多种实施方案中，本发明包括一种培养系统，其包含水性培养基中的碳源和根据本文任一权利要求的遗传修饰的微生物，其中所述遗传修饰的微生物以选自大于0.05gDCW/L、0.1gDCW/L、大于1gDCW/L、大于5gDCW/L、大于10gDCW/L、大于15gDCW/L或大于20gDCW/L的量存在，例如当水性培养基的体积选自大于5mL、大于100mL、大于0.5L、大于1L、大于2L、大于10L、大于250L、大于1000L、大于10,000L、大于50,000L、大于100,000L或大于200,000L时，以及例如当水性培养基的体积大于250L且包含在钢制容器内时。
不同地，此类培养系统的碳源选自右旋糖、蔗糖、戊糖、多元醇、己糖、己糖+戊糖，及其组合，水性培养基的pH小于7.5，例如以选自i)大于5mmol/L-hr的氧气且小于200mmol/L-hr的氧气；ii)大于5mmol/L-hr的氧气且小于100mmol/L-hr的氧气；iii)大于5mmol/L-hr的氧气且小于80mmol/L-hr的氧气；和iv)大于5mmol/L-hr的氧气且小于50mmol/L-hr的氧气的氧输送率，对该培养系统通气。
附图说明
本发明的新特征在权利要求书中具体阐述。通过参考对利用了本发明原理的说明性实施方案加以阐述的以下详述及附图，将会获得对本发明的特征和优点的更佳理解，在附图中：
图1描述了微生物的代谢途径，其与本发明的方面相关，更特别地与用于提高通过中间体丙二酰辅酶A的通量的遗传修饰相关。
图2描述了微生物的代谢途径，其与本发明的方面相关，更特别地与丁酰辅酶A和丁酰辅酶A衍生产物的生产相关。
图3A描述了微生物的代谢途径，其与本发明的方面相关，更特别地与脂肪酰辅酶A、脂肪酸和脂肪酸衍生产物的生产相关。
图3B描述了微生物的代谢途径，其与本发明的方面相关，更特别地与脂肪酰辅酶A、脂肪酸和脂肪酸衍生产物的生产相关。
图4描述了大肠杆菌中延长酶基因ELO1的活性。
图5描述了由本发明提供的代谢途径针对脂肪酸生物生产的实施方案。
图6描述了携带提高游离脂肪酸(FFA)生物生产活性的遗传修饰组合的微生物的实施方案。
表格也在本文中提供，并且是说明书的一部分。
具体实施方式
本发明涉及已用于发酵生产多种化学产品的多种生产方法和/或遗传修饰的微生物，涉及在容器中利用这些微生物群体制备此类化学产品的方法，以及涉及使用这些微生物和方法进行化学生产的系统。本发明的益处包括当此类微生物在发酵事件或循环期间生产化学产品时提高的比生产率。本发明提供了生产技术和/或遗传修饰的微生物，用以利用一种或多种调节从丙二酰辅酶A到脂肪酰分子的转化的手段生产目的化学产品，例如脂肪酸或脂肪酸衍生产物，其中该生产途径包含使用丙二酰辅酶A作为底物但不使用丙二酰-ACP作为底物的酶促转化步骤。调节丙二酰辅酶A向脂肪酰分子的转化的手段有效地平衡了向微生物生物质的碳流动和向化学产品的碳流动，并且令人吃惊地达到了提高的比生产率。特别地，脂肪酸或脂肪酸衍生产物以这样的方式来生产，该方式取决于微生物的依赖丙二酰辅酶A而不依赖丙二酰-ACP的脂肪酸生产途径，并结合对微生物的丙二酰-ACP依赖性脂肪酸合酶途径的抑制。微生物的依赖丙二酰辅酶A而不依赖丙二酰-ACP的脂肪酸生产途径包括两种途径中的一种。第一种选择包括包含乙酰乙酰辅酶A合酶、酮脂酰辅酶A硫解酶、烯酰辅酶A还原酶、酮脂酰辅酶A还原酶和3-羟基酰基辅酶A脱水酶的途径的表达增加以及任选地乙酰乙酰辅酶A硫解酶活性的活性降低。第二种选择包括包含乙酰乙酰辅酶A合酶、酮脂酰辅酶A合酶(或延长酶)、烯酰辅酶A还原酶、酮脂酰辅酶A还原酶和3-羟基酰基辅酶A脱水酶的途径的表达增加以及任选地乙酰乙酰辅酶A硫解酶活性的活性降低。这些途径用于生产胞内脂肪酰辅酶A产物。
微生物的胞内脂肪酰辅酶A产物可以进而转化为包括脂肪酸或脂肪酸衍生产物在内的化学产品，包括但不限于醇、醛、α烯烃和烷烃。
一种化学产品可以是从4到大于18个碳的任何链长的脂肪酸。这组化学产品包括：丁酸酯或丁酸、己酸酯或己酸、辛酸酯或辛酸、癸酸酯或癸酸、十二烷酸酯或十二烷酸、肉豆蔻酸酯或肉豆蔻酸、棕榈酸酯或棕榈酸、棕榈油酸酯或棕榈油酸、硬脂酸酯或硬脂酸、油酸酯或油酸。这些脂肪酸产品可以通过脂肪酰辅酶A硫酯酶的活性由脂肪酰辅酶A中间体生产。或者，这些脂肪酸可以通过脂肪酰辅酶A磷酸转移酶的协同活性由脂肪酰辅酶A中间体生产，其首先产生脂肪酰-磷酸酯，然后是脂肪酸激酶进行由脂肪酰-磷酸酯产生脂肪酸的作用。
另一种化学产品可以是从4到大于18个碳的任何链长的脂肪醛。这组化学产品包括：丁醛、己醛、辛醛、癸醛、辛醛、癸醛、十二醛、肉豆蔻醛、棕榈醛、棕榈油醛、硬脂醛和油醛。这些醛产品可以通过脂肪酰辅酶A还原酶或酰基辅酶A还原酶的活性由脂肪酰辅酶A中间体产生。制备脂肪酸的生产菌株还可以用于生产脂肪醛。
另一种化学产品可以是从4到大于18个碳的任何链长的脂肪醇。这组化学产品包括：丁醇、己醇、辛醇、癸醇、十二醇、C14脂肪醇、C16脂肪醇或C18脂肪醇。这些脂肪酸产品可以通过醛还原酶的活性由脂肪醛产生。通过表达编码将脂肪酰辅酶A或游离脂肪酸转化为脂肪醇的酶的基因，制备脂肪酸的生产菌株也可用于生产脂肪醇。这些酶的例子包括形成醇的酰基辅酶A还原酶(EC 1.2.1.-)，或长链脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.50)+醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)，或醛脱氢酶(EC1.2.1.-)与醇脱氢酶的组合。具有脂肪酰辅酶A还原酶活性的多肽由登录号为YP_047869的不动杆菌SP.ADP1的fabG基因提供。具有脂肪酰还原酶活性的多肽由登录号为BAC79425的家蚕(Bombyx mori)FAR-N_SDR_e基因提供。具有醛脱氢酶的多肽由登录号为YP_001125970的嗜热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2的ALDH基因提供。具有醇脱氢酶活性的多肽由登录号为AP_003562.1的大肠杆菌的yqhD基因提供。这些活性的另外来源是本领域已知的，并可以组合以产生用于生产脂肪醇的生产菌株。
另一种化学产品可以是从4到大于18个碳的任意链长的α烯烃。
另一种化学产品可以是从4到大于18个碳的任意链长的烷烃。
另一种化学产品可以是从4到大于18个碳的任意链长的二酸。这些脂肪酸产品可以通过本领域中已知的酶的Ω或末端氧化由脂肪酸产生。
它们中的任一种可以在本文中描述为所选化学产品或目的化学产品。另外，以上列表的任意分组，包括任意亚组，可以被认为是“所选化学产品”、“目的化学产品”等所指的。对于这些化学产品中的任一种，微生物可能固有地包含此类化学产品的生物合成途径，和/或可能需要添加一个或多个异源核酸序列，以提供或完成这样的生物合成途径，从而达到该化学产品的期望的生产。
如本文所述，本发明的各方面涉及包含从丙二酰辅酶A到目的化学产品的代谢途径的微生物细胞，例如上面描述的那些，并且也提供了调节丙二酰辅酶A向酰基ACP分子转化的手段。然后，当调节手段进行调节以降低这样的转化时，1)产生了和/或2)通过从丙二酰辅酶A到化学产品的代谢途径转化了按比例更大数量的丙二酰辅酶A分子。
遗传修饰的微生物群体的比生产率的意外提高可以通过以下方法和系统来实现，其中，除了微生物的依赖丙二酰辅酶A但不依赖丙二酰-ACP的脂肪酰辅酶A生产途径的活性提高外，该微生物还具有从丙二酰辅酶A到所选化学产品的微生物生产途径，以及微生物脂肪酸合酶系统的选定酶(更特别地，其丙二酰-ACP依赖性脂肪酸延长酶)的酶活性的降低。在多种实施方案中，也可以对包含这种微生物群体的生物反应器容器提供特定的补充物，以进一步改善该方法和系统。
在本文中对多种实施方案公开了其他另外的遗传修饰。
I.定义
除非上下文另外明确指出，在说明书和权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的指示物。因此，例如，提到“表达载体”时包括一个表达载体和多个表达载体，不管是相同的(例如相同操纵子)还是不同的；提到“微生物”时包括一种微生物和多种微生物；等等。
“降低的酶活性”、“降低酶活性”等旨在表明微生物细胞的酶或分离的酶展示的活性水平低于在相同种的可比较细胞中测量的水平或其天然酶的水平。即，在该酶的已知标准条件下，从指示的底物到指示的产物的酶促转化比在标准指定条件下由天然(未修饰的)酶的相同生化转化的酶活性低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。该术语也可以包括该酶活性的消除。具有降低的某种酶的酶活性的细胞可以使用任意本领域已知的方法鉴别。例如，可以使用酶活性试验来鉴别具有降低的酶活性的细胞。参见，例如Enzyme Nomenclature，AcademicPress，Inc.，New York 2007。
本文使用的术语“异源DNA”、“异源核酸序列”等是指其中下面至少一项为真的核酸序列：(a)核酸序列对于给定宿主微生物来说是外来的(即，不天然存在于其中)；(b)该序列可天然存在于给定宿主微生物中，但其数量反常(例如多于预期)；或(c)核酸序列包含两个或多个子序列，在自然界中未发现这些子序列彼此有此种联系。例如，关于情况(c)，重组产生的异源核酸序列将具有来自为了制备新功能核酸而排列的无关基因的两个或多个序列。
术语“异源”包括术语“外源”，后一个术语是本领域普遍使用的。对于异源核酸序列引入前的宿主微生物基因组，编码该酶的核酸序列是异源的(无论异源核酸序列是否引入到该基因组中)。
本文使用的术语“基因破坏”或其语法等同物(并且包括“破坏酶功能”、“酶功能的破坏”等)是指对微生物的遗传修饰，该遗传修饰致使编码的基因产物具有与未这样修饰的微生物细胞中的多肽活性或从中得到的多肽活性相比降低的多肽活性。遗传修饰可以是例如整个基因的缺失、转录或翻译所需的调节序列的缺失或其他修饰、得到截短的基因产物(例如酶)的基因部分的缺失，或通过降低所编码的基因产物的活性(包括达到不可检测的活性水平)的各种突变策略中的任一种。破坏可以广泛包括编码酶的核酸序列的全部或部分的缺失，并且还包括但不限于其他类型的遗传修饰，例如引入终止密码子、移码突变、引入或移除基因的一部分以及引入降解信号，这些遗传修饰影响mRNA转录水平和/或稳定性，并且改变编码酶的基因上游的启动子或阻遏物。
在各种语境中，基因破坏的意思是任何导致多肽活性降低的对DNA、由DNA编码的mRNA和对应的氨基酸序列的遗传修饰。可以使用许多不同的方法来制备具有降低的多肽活性的细胞。例如，使用常见的诱变或敲除技术，可以将细胞工程化为具有破坏的调节序列或多肽编码序列。参见，例如Methods in Yeast Genetics(1997版)，Adams等，Cold Spring Harbor Press(1998)。一种特别有用的基因破坏方法是完整基因缺失，因为这减少或消除了本发明的遗传修饰微生物中遗传回复的发生。因此，对产物是酶的基因的破坏由此破坏了酶功能。或者，反义技术可以用来降低特定多肽的活性。例如，细胞可以被工程化为包含编码阻止多肽翻译的反义分子的cDNA。此外，基因沉默可以用来降低特定多肽的活性。
本文使用的术语“反义分子”包括任何含有与内源多肽的编码链相对应的序列的核酸分子或核酸类似物(例如肽核酸)。反义分子也可以具有侧翼序列(例如调节序列)。因此，反义分子可以是核酶或反义寡核苷酸。
本文使用的核酶可以具有任意普通结构，包括但不限于发夹、锤头或斧头结构，只要该分子能切割RNA。
在此类用语中使用时，术语“降低”或“以降低”及其语法等同物包括此类转化的完全消除。
本文使用的生物生产可以是需氧的、微需氧的或厌氧的。
本文使用的措辞“足够同源”是指这样的蛋白质或其部分，当与在本申请中提供的氨基酸序列(包括SEQ ID No./序列表)中的氨基酸序列相比时，它们具有的氨基酸序列包括最小数目的相同或等同的氨基酸残基，使得该蛋白质或其部分能够实现各自的酶反应和/或其他功能。为了确定特定蛋白质或其部分是否足够同源，可以通过酶活性试验进行确定，例如本领域公知的那些。
对序列同一性和同源性的描述和方法是示例性的，并且认识到这些概念是本领域中充分了解的。此外应当理解，核酸序列可以变化，但仍然编码展示所需功能性的酶或其他多肽，并且此类变化也在本发明的范围内。
进一步地，对于核酸序列，“杂交”是指其中两条单链多核苷酸非共价地结合形成稳定的双链多核苷酸的过程。术语“杂交”也可以指三链杂交。得到的(通常为)双链多核苷酸是“杂合体”或“双链体”。“杂交条件”一般包括小于约1M，更通常小于约500mM和小于约200mM的盐浓度。杂交温度可以低到5℃，但是一般大于22℃，更典型地大于约30℃，并且常常超过约37℃。杂交通常在严格条件，即探针将与其靶标子序列杂交的条件下进行。严格条件是依赖于序列的，并且在不同情况下不同。对于具体的杂交，较长的片段可能需要较高的杂交温度。由于包括碱基组成和互补链的长度、有机溶剂的存在和碱基错配的程度在内的其他因素可能影响杂交的严格性，参数组合比任一个单独的绝对量度更重要。通常，严格条件选择为比具体序列在限定离子强度和pH下的Tm低约5℃。示例性的严格条件包括至少0.01M到不超过1M Na离子浓度(或其他盐)的盐浓度，pH 7.0到8.3，和至少25℃的温度。例如，5X SSPE(750mM NaCl，50mM磷酸钠，5mMEDTA，pH 7.4)和温度25-30℃的条件适合等位基因特异性探针杂交。关于严格条件，参见例如Sambrook和Russell和Anderson“NucleicAcid Hybridization”第1版，BIOS Scientific Publishers Limited(1999)，其特此并入以参考杂交方案。“特异性地与…杂交”或“与…特异性杂交”等表述是指当一个或多个特定核苷酸序列存在于复杂混合物(例如总细胞的)DNA或RNA中时，分子在严格条件下基本与或仅与该序列的结合、双链体形成或杂交。
短语“目的片段”的使用包括目的基因和任何其他核酸序列片段。用来获得目的片段的方法的一个实例是获得微生物的培养物，其中该微生物的基因组包含目的基因或核酸序列片段。
当在本文中，包括在权利要求书中，提及基因产物(即酶)的遗传修饰时，可以理解，该遗传修饰是通常编码所述基因产物(即酶)的核酸序列(例如或包括基因)的遗传修饰。
在一些实施方案中，截短的各多肽具有由编码各天然酶的核酸序列所编码的多肽全长的至少约90％，并且更加特别地具有由编码各天然酶的核酸序列所编码的多肽全长的至少95％。多肽具有与多肽的参考氨基酸序列至少例如95％“相同”的氨基酸序列是指，除了请求保护的多肽序列在多肽的参考氨基酸的每100个氨基酸中可以包含多达五个氨基酸改变以外，请求保护的多肽的氨基酸序列与该参考序列相同。换句话说，为获得具有与参考氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，参考序列中可达5％的氨基酸残基可以缺失或被另一种氨基酸取代，或参考序列中的许多氨基酸，可达总氨基酸残基的5％，可以插入到参考序列中。参考序列的这些改变可以发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或这些末端位置之间的任何地方，或者独立散布在参考序列的残基之间，或者散布在参考序列内的一个或多个叠连群中。在其他实施方案中，如本文别处所述，截短的程度可能更大。
物种和其他系统发生鉴别根据微生物学领域技术人员已知的分类进行。
当本文描述的方法和步骤指出某些事件以某种次序发生时，本领域普通技术人员会认识到，某些步骤的排序可以修改，并且这样的修改是根据本发明的变化方案进行的。此外，在可能时，某些步骤可以在平行过程中同时进行，以及相继进行。
本文提供的预言性实例是广泛示例性的，而绝非限制性的。
缩写的含义如下：从其使用可以清楚地看出，“C”是指摄氏或摄氏度，DCW是指细胞干重，“s”是指秒，“min”是指分钟，“h”、“hr”或“hrs”是指小时，“psi”是指磅/平方英寸，“nm”是指纳米，“d”是指天，“μL”或“uL”或“ul”是指微升，“mL”是指毫升，“L”是指升，“mm”是指毫米，“nm”是指纳米，“mM”是指毫摩尔浓度，“μM”或“uM”是指微摩尔浓度，“M”是指摩尔浓度，“mmol”是指毫摩尔，“μmol”或“uMol”是指微摩尔，“g”是指克，“μg”或“ug”是指微克，而“ng”是指纳克，“PCR”是指聚合酶链反应，“OD”是指光密度，“OD600”是指在600nm的光子波长处测量的光密度，“kDa”是指千道尔顿，“g”是指重力常数，“bp”是指碱基对，“kbp”是指千碱基对，“％w/v”是指重量/体积百分比，“％v/v”是指体积/体积百分比，“IPTG”是指异丙基-μ-D-硫代吡喃半乳糖苷，“RBS”是指核糖体结合位点，“rpm”是指每分钟的转数，“HPLC”是指高效液相色谱法，而“GC”是指气相色谱法。
II.生物生产方法
A.碳源
本发明中与具有脂肪酸或脂肪酸衍生产物生物合成途径的重组微生物一起使用的生物生产培养基必须包含适合预期代谢途径的碳源或底物。合适的底物可以包括但不限于单糖例如葡萄糖和果糖，寡糖例如乳糖或蔗糖，多糖例如淀粉或纤维素或其混合物，以及来自可再生原料的未纯化混合物例如干酪乳清渗透物、玉米浆、甜菜糖蜜和大麦芽。另外，碳底物也可以是单碳底物例如二氧化碳、一氧化碳或甲醇，已证明了它们向关键的生化中间体的代谢转化。另外，碳底物还可以是二氧化碳和氢或其组合，例如合成气。除了单碳和双碳底物以外，还已知甲基营养型微生物利用许多其他含碳化合物例如甲胺、葡糖胺和多种氨基酸进行代谢活动。
尽管预期所有上面提及的碳底物及其混合物在本发明中适合作为碳源，但常见的用作碳源的碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖，以及任意这些糖的混合物。其他合适的底物包括木糖、阿拉伯糖、其他基于纤维素的C-5糖、高果糖的玉米糖浆以及各种其他糖和糖混合物，如市售的那些。蔗糖可以由例如甘蔗、甜菜、木薯、香蕉或其他水果以及甜高粱等原料获得。葡萄糖和右旋糖可以通过包括诸如玉米、小麦、黑麦、大麦和燕麦等谷物在内的基于淀粉的原料的糖化而获得。另外，在一些实施方案中，碳源的全部或一部分可以是甘油。或者，可以不包括甘油作为添加的碳源。
在一个实施方案中，碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、右旋糖、乳糖、甘油及其混合物。不同地，碳源中这些组分的量可以是碳源的大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或更多、可达100％或基本为100％。
另外，已知甲基营养型微生物利用许多其他含碳化合物例如甲胺、葡糖胺和多种氨基酸进行代谢活动。例如，已知甲基营养型酵母利用来自甲胺的碳形成海藻糖或甘油(Bellion等，Microb.Growth C1Compd.(Int.Symp.)，7th(1993)，415-32。编者：Murrell，J.Collin；Kelly，Don P。出版商：Intercept，Andover，UK)。类似地，假丝酵母属(Candida)的各个种代谢丙氨酸或油酸(Sulter等，Arch.Microbiol.153:485-489(1990))。因此预期，在本发明实施方案中利用的碳源可以包含多种多样的含碳底物。
另外，可以通过预处理和糖化的工艺，由纤维素和木质纤维素生物质获得可发酵的糖，如在例如美国专利公开号2007/0031918A1中所述，其并入本文作为参考。生物质是指任意纤维素或木质纤维素材料，并且包括包含纤维素并且任选地进一步包含半纤维素、木质素、淀粉、寡糖和/或单糖的材料。生物质也可包含额外的组分，例如蛋白质和/或脂质。生物质可以源自单一来源，或者生物质可以包含源自超过一个来源的混合物；例如，生物质可以包含玉米芯和玉米秆的混合物，或草和叶子的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残留物、城市固体废物、工业固体废物、来自纸张制造的污泥、庭园废物、木材和林业废物。生物质的实例包括但不限于玉米粒、玉米芯、作物残留物例如玉米皮、玉米秆、草、小麦、小麦秆、大麦、大麦秆、干草、稻草、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆、由谷物磨碎获得的成分、树、树枝、根、叶、木屑、锯屑、灌木和矮树丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥。任意此类生物质可以用于生物生产方法或系统中，以提供碳源。将纤维素生物质分解成更可得到和利用的碳分子的混合物(包括糖)的各种方法包括：在浓酸或稀酸(例如，<1％的硫酸)的存在下加热；用氨处理；用离子盐处理；酶降解；以及这些的组合。这些方法通常在机械分离和磨碎以后进行，并且之后是适当的分离过程。
在多种实施方案中，向微生物提供范围广泛的任意糖，包括但不限于蔗糖、葡萄糖、木糖、纤维素或半纤维素，例如在包含反应器容器的工业系统中，在反应器容器中可以合并确定成分培养基(例如最低盐培养基(minimal salts media)，包括但不限于M9基本培养基、硫酸钾基本培养基、酵母合成基本培养基和许多其他培养基，或它们的变化形式)，提供一条或多条脂肪酸或脂肪酸衍生产物生物合成途径备选方案的微生物接种物，和碳源。碳源进入细胞，并且由熟知和常见的代谢途径分解代谢，以产生常见的代谢中间体，包括磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。(参见Molecular Biology of the Cell，第3版，B.Alberts等Garland Publishing，New York，1994，42-45、66-74页，在此引入以参考关于糖的基本代谢分解代谢途径的教导；Principles ofBiochemistry，第3版，D.L.Nelson&M.M.Cox，Worth Publishers，New York，2000，527-658页，在此引入以参考关于主要代谢途径的教导；和Biochemistry，第4版，L.Stryer，W.H.Freeman and Co.，New York，1995，463-650页，也在此引入以参考关于主要代谢途径的教导。)
可以根据多种方法，包括但不限于ASTM D6866或各种其他技术，将基于生物的碳与基于石油的碳区分开来。例如在基于生物的碳源中与在基于石油的碳源中，碳-14与碳-12的比率不同，在基于生物的碳源中发现更高的碳-14比率。在多种实施方案中，碳源不是基于石油的，或者不是主要基于石油的。在多种实施方案中，碳源是大于约50％不基于石油的、大于约60％不基于石油的、大于约70％不基于石油的、大于约80％不基于石油的、大于约90％不基于石油的或更多。在多种实施方案中，碳源具有约1.0x10-14或更高的碳-14/碳-12比率。
B.微生物
如本文描述和请求保护的特征可以在选自本文列表的微生物或者另一种合适的微生物中提供，该微生物也包含一条或多条天然的、引入的或增强的脂肪酸或脂肪酸衍生产物生物生产途径。因此，在一些实施方案中，微生物包含内源脂肪酸或脂肪酸衍生产物生产途径(在一些这样的实施方案中，该途径可以得到增强)，而在其他实施方案中，微生物不包含内源脂肪酸或脂肪酸衍生产物生产途径。
这些遗传修饰的微生物中有许多可以包含遗传修饰和/或其他系统改变，如在一个或多个本发明人的其他专利申请中和/或转让给本专利申请的所有者的其他专利申请中可能描述的。
实施例描述了对某些细菌和酵母微生物的具体修饰和评估。本发明的范围并非意在局限于这些物种，而是普遍适用于范围广泛的合适的微生物。一般地，用于本发明的微生物可以选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。
对于一些实施方案，最初为所选化学产品的生物生产而选择的微生物宿主也应当高速率地利用糖，包括葡萄糖。大部分微生物能够利用碳水化合物。但是，某些环境微生物不能高效率地利用碳水化合物，因此对于预期用葡萄糖或其他碳水化合物作为主要添加的碳源的此类实施方案，不是合适的宿主。
随着各个物种的基因组成为已知的，本发明可以轻易地应用于范围不断增加的合适的微生物。此外，考虑到基因测序的相对较低的费用，可以轻易地测定目的物种的基因序列，从而使本发明的方面的应用可更轻易地获得(基于对具有已知基因组序列的微生物应用遗传修饰的容易程度)。
更特别地，基于本文描述的各种标准，对于化学产品的生物生产来说合适的微生物宿主通常可以包括但不限于任意革兰氏阴性微生物，更具体地，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌或食羧寡养菌(Oligotropha carboxidovorans)，或假单胞菌属(Pseudomononas)的种；任意革兰氏阳性微生物，例如枯草芽孢杆菌、乳杆菌属(Lactobaccilus)的种或乳球菌属(Lactococcus)的种；酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)或树干毕赤酵母(Pichia stipites)；以及其他分组或微生物种。更特别地，用于脂肪酸或脂肪酸衍生产物的生物生产的合适的微生物宿主一般包括但不限于梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)和酵母属(Saccharomyces)各个属的成员。可能特别感兴趣的宿主包括：食羧寡养菌(例如OM5菌株)、大肠杆菌、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)(钩虫贪铜菌Cupriavidus necatar)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillusmacerans)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母。
更特别地，用于脂肪酸或脂肪酸衍生产物的生物生产的合适的微生物宿主一般包括但不限于梭菌属、发酵单胞菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱杆菌属、克雷伯氏菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒杆菌属、短杆菌属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属和酵母属各个属的成员。
可能特别感兴趣的宿主包括：食羧寡养菌(例如OM5T菌株)、大肠杆菌、真养产碱杆菌(钩虫贪铜菌)、地衣芽孢杆菌、浸麻类芽孢杆菌、红串红球菌、恶臭假单胞菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母。另外，这些种的任意已知菌株可以用作起始微生物，如可以是以下种中的任一种，包括其各菌株-Cupriavidus basilensis、Cupriavidus campinensis、吉拉迪贪铜菌(Cupriavidus gilardi)、Cupriavidus laharsis、耐金属贪铜菌(Cupriavidusmetallidurans)、Cupriavidus oxalaticus、罕见贪铜菌(Cupriaviduspauculus)、Cupriavidus pinatubonensis、Cupriavidus respiraculi和台湾贪铜菌(Cupriavidus taiwanensis)。
在一些实施方案中，重组微生物是革兰氏阴性菌。在一些实施方案中，重组微生物选自发酵单胞菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、产碱杆菌属和克雷伯氏菌属各个属。在一些实施方案中，重组微生物选自大肠杆菌、钩虫贪铜菌、食羧寡养菌和恶臭假单胞菌各个种。在一些实施方案中，重组微生物是大肠杆菌菌株。
在一些实施方案中，重组微生物是革兰氏阳性菌。在一些实施方案中，重组微生物选自梭菌属、沙门氏菌属、红球菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒杆菌属和短杆菌属各个属。在一些实施方案中，重组微生物选自地衣芽孢杆菌、浸麻类芽孢杆菌、红串红球菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌各个种。在特定实施方案中、重组微生物是枯草芽孢杆菌菌株。
在一些实施方案中，重组微生物是酵母。在一些实施方案中，重组微生物选自毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、克雷伯氏菌属、伊萨酵母属(Issatchenkia)和酵母属各个属。在特定实施方案中，重组微生物是酿酒酵母。
基于该公开内容，进一步应当理解，任一以上微生物可以用于生产脂肪酸或脂肪酸衍生产物以外的化学产品。
对宿主进行遗传修饰的能力对于任何重组微生物的生产来说是至关重要的。基因转移技术的模式可以是通过电穿孔、接合、转导或自然转化。范围广泛的宿主接合质粒和抗药性标记是可得到的。基于可以在宿主中起作用的抗生素抗性标记的性质，为该宿主微生物定制克隆载体。
C.培养基及培养条件
除了例如选自本文公开的类型之一的适当碳源以外，生物生产培养基还必须包含本领域技术人员已知的、适合培养物生长和促进本发明化学产品生物生产所必需的酶途径的合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液和其他成分。
本发明的另一方面涉及包含本发明的遗传修饰微生物和任选的补充物的培养基和培养条件。
细胞一般在约25℃到约40℃的温度下在适当的培养基中生长，而对于嗜热微生物来说可达70℃。本发明中合适的生长培养基是常见的商业制备的培养基，例如Luria Bertani(LB)液体培养基、Terrific液体培养基(TB)M9基本培养基、Sabouraud右旋糖(SD)液体培养基、酵母培养基(YM)液体培养基、(Ymin)酵母合成基本培养基，和如本文描述的基本培养基，例如M9基本培养基。也可以使用其他确定成分的或合成的生长培养基，并且用于特定微生物生长的合适的培养基是微生物学或生物生产科学领域的技术人员已知的。在多种实施方案中，可以开发和使用一种基本培养基，其不包含各种成分，或含有低添加水平的各种成分，例如小于10、5、2或1g/L的复合氮源，包括但不限于酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆粉、玉米浆或酪蛋白。这些基本培养基也可以含有有限补充的包括生物素、维生素B12和维生素B12衍生物、硫胺素、泛酸盐和其他维生素的维生素混合物。基本培养基也可以含有有限的含有小于28、17或2.5mM的磷酸盐、小于25或4mM的硫酸盐和小于130或50mM的总氮的简单无机营养物源。
在本发明实施方案中与遗传修饰的微生物一起使用的生物生产培养基必须包含适合预期代谢途径的碳底物。如本文前面所述，合适的碳底物包括一氧化碳、二氧化碳以及各种单体糖和寡聚糖。
用于生物生产的合适的pH范围在pH 3.0到pH 10.0之间，其中pH 6.0到pH 8.0是初始条件的典型pH范围。但是，特定实施方案的实际培养条件并非被这些pH范围所限制。
生物生产可以在搅拌或不搅拌的情况下在需氧、微需氧或厌氧条件下进行。
在生物生产培养基中生产的脂肪酸或脂肪酸衍生产物的量一般可以使用许多本领域已知的方法来测定，例如高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)或GC/质谱法(MS)。
D.反应器和系统
利用根据本发明的方法和/或组合物的发酵系统也在本发明的范围内。
如本文所述和/或提及的任何重组微生物都可以引入到工业生物生产系统中，在该系统中，在商业上可行的操作中，微生物将碳源转化成脂肪酸或脂肪酸衍生产物。生物生产系统包括将这样的重组微生物引入含有适合重组微生物生长的碳源底物和生物生产培养基的生物反应器容器中，并且将该生物生产系统保持在合适的温度范围(以及溶解氧浓度范围，如果反应是需氧或微需氧的话)内合适的时间，以获得一部分底物分子向所选化学产品的期望的转化。工业生物生产系统及其操作是化学工程和生物过程工程领域的技术人员所熟知的。
生物生产可以在搅拌或不搅拌的情况下在需氧、微需氧或厌氧条件下进行。达到需氧、微需氧和厌氧条件的培养操作和微生物群体是本领域已知的，并且可以监控包含营养培养基和此类微生物群体的液体培养物的溶解氧水平，以保持或证实所需的需氧、微需氧或厌氧条件。当使用合成气作为原料时，可以使用需氧、微需氧或厌氧条件。当使用糖时，可以在多种实施方案中实施厌氧、需氧或微需氧条件。
如本文描述和/或提及的任何重组微生物都可以引入到工业生物生产系统中，在该系统中，在商业上可行的操作中，微生物将碳源转化成所选化学产品。生物生产系统包括将这样的重组微生物引入含有适合重组微生物生长的碳源底物和生物生产培养基的生物反应器容器中，并且将该生物生产系统保持在合适的温度范围(以及溶解氧浓度范围，如果反应是需氧或微需氧的话)内合适的时间，以获得一部分底物分子向所选化学产品的期望的转化。
在多种实施方案中，例如在包含反应器容器的工业系统中，向微生物提供合成气成分或糖，在该反应器容器中可以合并有确定成分培养基(例如最低盐培养基，包括但不限于M9基本培养基、硫酸钾基本培养基、酵母合成基本培养基和许多其他培养基，或它们的变化形式)，提供本文教导的生物合成途径的实施方案的微生物接种物，和碳源。碳源进入细胞，并且由众所周知和常见的代谢途径分解代谢，产生常见的代谢中间体，包括磷酸烯醇丙酮酸(PEP)或乙酰辅酶A。(参见Molecular Biology of the Cell，第3版，B.Alberts等GarlandPublishing，New York，1994，42-45、66-74页，在此引入以参考关于糖的基本代谢分解代谢途径的教导；Principles of Biochemistry，第3版，D.L.Nelson&M.M.Cox，Worth Publishers，New York，2000，527-658页，在此引入以参考关于主要代谢途径的教导；和Biochemistry，第4版，L.Stryer，W.H.Freeman and Co.，New York，1995，463-650页，也在此引入以参考关于主要代谢途径的教导。)。
关于工业生物生产的类型，本发明的多种实施方案可以使用分批类型的工业生物反应器。经典的分批生物反应器系统被认为是“封闭的”，意思是培养基的组成在各生物生产事件开始时建立，而在基本到生物生产事件结束时为止的时间段内未进行人为改变和添加。因此，在生物生产事件开始时，用期望的一种或多种微生物接种培养基，并在不向系统内添加任何东西的情况下使生物生产发生。但是，一般来说，“分批”类型的生物生产事件对碳源的添加而言是分批的，并且经常尝试控制诸如pH和氧气浓度等因素。在分批系统中，系统的代谢物和生物质组成不断变化，直到生物生产事件停止时为止。在分批培养物内，细胞经历静态迟滞期到高速生长对数期，最后到生长速率降低或停滞的稳定期。如果不作处理，稳定期细胞最终将死亡。对数期细胞一般负责所需终产物或中间体的大量生产。
标准分批系统的一个变化形式是补料分批系统。补料分批生物生产过程也适合于本发明，并且包含典型的分批系统，但是随着生物生产的进行以增量添加包括底物在内的营养物。当分解代谢物阻遏倾向于抑制细胞代谢时以及期望在培养基中含有有限量的底物时，补料分批系统是有用的。补料分批系统中实际营养物浓度的测量可以直接测量，例如通过在不同时间的样品分析进行测量，或者基于诸如pH、溶解氧和废气如CO2的分压等可测量因素的变化进行估算。分批和补料分批方法是本领域中常见且熟知的，并且其实例可以在Thomas D.Brock的Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology，第二版(1989)Sinauer Associates,Inc.，Sunderland，Mass.，Deshpande，MukundV.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36:227，(1992)和BiochemicalEngineering Fundamentals，第2版，J.E.Bailey和D.F.Ollis，McGrawHill，New York，1986中找到，所述文献在此引入以参考对于生物生产的一般说明。
尽管本发明的实施方案可以用分批模式或补料分批模式来进行，但是预期本发明将能适应连续生物生产方法。连续生物生产被认为是一个“开放”系统，其中向生物反应器中连续添加确定成分的生物生产培养基，并且同时移出等量的条件培养基以供处理。连续生物生产一般将培养物保持在受控的密度范围内，此时细胞主要以对数期生长。两种类型的连续生物反应器操作包括恒化器，在其中将新鲜培养基补加到容器中，而同时等速移走容器内容物。这一方法的限制是细胞丧失和一般达不到高细胞密度。实际上，一般用补料分批工艺可以获得高得多的细胞密度。另一种连续生物反应器利用灌注培养，这与恒化器方法类似，不同之处是从容器中移走的物流经历分离技术，该分离技术将活细胞再循环回容器中。已表明这一类型的连续生物反应器操作比补料分批能得到显著更高的细胞密度，并且能够连续运行。连续生物生产对工业运行是特别有利的，因为它具有较短的与排干、清洁和为下一个生物生产事件准备设备相关的停工时间。此外，连续运行下游单元操作，例如蒸馏，一般比以分批模式运行它们更加经济。
连续生物生产允许调节影响细胞生长或终产物浓度的一个因素或任意数量的因素。例如，一种方法会将限制性营养物例如碳源或氮水平保持在固定比率，并让所有其他参数变化(moderate)。在其他系统中，可以连续改变影响生长的许多因素，而使根据培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。为连续生物生产过程调节营养物和生长因素的方法以及最大化产物形成速率的技术是工业微生物学领域熟知的，并且Brock(同上)详述了多种方法。
预期本发明的实施方案可以使用分批、补料分批或连续过程来实施，并且生物生产的任何已知模式都会是合适的。预期细胞可以固定在作为全细胞催化剂的惰性支架上，并经历适合化学产品生物生产的生物生产条件，或者在容器例如培养容器中在液体培养基中培养。因此，在此类过程和使用这些过程的生物生产系统中使用的实施方案包括本发明的遗传修饰的微生物群体、在包含用于该群体的营养物的培养基中包含该群体的培养系统，和制备所选化学产品的方法。
本发明的实施方案包括在生物生产系统中制备所选化学产品的方法，这些方法中的一些可以包括在这样的生物生产事件后获得脂肪酸或脂肪酸衍生产物。例如，制备脂肪酸或脂肪酸衍生产物的方法可以包括：向培养容器提供包含合适的营养物的培养基；向培养容器提供遗传修饰的微生物的接种物，该微生物包含本文描述的遗传修饰，使得该微生物由合成气和/或糖分子生产所选化学产品；和将培养容器保持在适合遗传修饰的微生物生产所选化学产品的条件下。
在本发明的范围内包括在生物生产方法和系统中(包括在用于生产所选化学产品的工业生物生产系统中)生产和利用重组微生物，该重组微生物经遗传工程修饰了一个或多个方面，该修饰有效地使化学产品生物生产比缺乏该一个或多个修饰的对照微生物至少提高20％。
在多种实施方案中，本发明涉及用于如本文所述生物生产化学产品的系统，所述系统包含：适合微生物细胞培养的发酵罐；将发酵罐的内容物排出到提取和/或分离容器中的管线；和适合从细胞培养废物中移取化学产品的提取和/或分离容器。在多种实施方案中，该系统包含一个或多个预发酵罐、蒸馏柱、离心容器、反萃取柱、混合容器，或其组合。
以下公开的资源并入本文以参考其中各自的教导，这些教导表明这些相关领域中的技术水平，并且根据需要支持教导了以下内容的公开内容：如何由糖源制备根据本发明生产的化学产品和使用其工业生物生产方法，以及可以用来使用任意本发明的重组微生物达到这种转化的工业系统(Biochemical Engineering Fundamentals，第2版，J.E.Bailey和D.F.Ollis，McGraw Hill，New York，1986，全书以所述目的引入，并且第9章533-657页特别用于参考生物反应器设计；UnitOperations of Chemical Engineering，第5版，W.L.McCabe等，McGrawHill，New York 1993，全书以所述目的引入，并且特别用于参考工艺和分离技术分析；Equilibrium Staged Separations，P.C.Wankat，Prentice Hall，Englewood Cliffs，NJ USA，1988，全书引入以参考关于分离技术的教导)。
E.遗传修饰、核苷酸序列和氨基酸序列
本发明的实施方案可以由表达载体向宿主微生物中的引入引起，其中该表达载体包含编码正常见于或不见于宿主微生物的酶的核酸序列。
遗传修饰宿主细胞的能力对任何遗传修饰的(重组)微生物的生产是至关重要的。基因转移技术的模式可以是通过电穿孔、接合、转导或自然转化。范围广泛的宿主接合质粒和抗药性标记是可得到的。基于可以在该宿主中起作用的抗生素抗性标记的性质，为宿主微生物定制克隆载体。另外，如本文所公开的，遗传修饰的(重组)微生物可以包含除通过质粒引入的以外的修饰，包括对其基因组DNA的修饰。
本领域中早已公认，氨基酸序列中的一些氨基酸可以改变而不显著影响蛋白质的结构或功能。包括的变异体可以构成缺失、插入、倒位、重复和类型置换，只要未显著地不利影响所示的酶活性即可。关于哪些氨基酸变化可能会表型沉默的指导尤其可见Bowie,J.U.等，“Deciphering the Message in Protein Sequences:Tolerance to AminoAcid Substitutions”,Science 247:1306-1310(1990)等等。该参考文献并入本文以参考这些教导，但是，这些教导也是本领域技术人员公知的。
在多种实施方案中，通过本发明多核苷酸分子的表达而获得的多肽可以与由本文对于脂肪酸或脂肪酸衍生产物耐受性相关的和生物合成途径描述的基因和/或核酸序列编码的一个或多个氨基酸序列具有至少大约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
作为一个实际问题，任何特定多肽是否与任何本文描述的多肽的任何参考氨基酸序列(其可以对应于本文描述的特定核酸序列)至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同，可以使用已知的计算机程序，例如Bestfit程序(WisconsinSequence Analysis Package，用于Unix的第8版，Genetics ComputerGroup，University Research Park，575Science Drive，Madison，Wis.53711)，来常规确定这样的特定多肽序列。当使用Bestfit或任何其他序列比对程序来确定特定序列是否与本发明的参考序列例如95％相同时，设置参数，使得在参考氨基酸序列的全长上计算同一性百分比，并且在允许具有可达参考序列中氨基酸残基总数的5％的同源性中的缺口。
例如，在一个具体实施方案中，参考序列(查询序列，即本发明的序列)与目标序列之间的同一性，也称作全局序列比对，可以使用FASTDB计算机程序基于Brutlag等的算法(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990))来确定。对于FASTDB氨基酸比对中使用的、其中狭义地解释同一性的特定实施方案，优选的参数是：评分方案＝PAM(可接受的突变百分比)0，k-元组＝2，错配罚分＝1，连接罚分＝20，随机组长度＝0，截止得分＝1，窗口大小＝序列长度，空位罚分＝5，空位大小罚分＝0.05，窗口大小＝500或目标氨基酸序列的长度，取其较短者。根据该实施方案，如果目标序列由于N-或C-末端缺失而不是因为内部缺失而比查询序列短，则鉴于当计算全局同一性百分比时FASTDB程序不考虑目标序列的N-和C-末端截短的事实，对结果进行手工修正。对于相对于查询序列在N-和C-末端截短的目标序列，通过计算位于目标序列N-和C-末端侧面的、未与对应的目标残基匹配/比对的查询序列的残基数(作为查询序列总碱基的百分比)修正同一性百分比。通过FASTDB序列比对的结果来确定残基是否匹配/比对。然后从FASTDB程序使用指定的参数计算的同一性百分比中减去这一百分比，得到最终的同一性百分比得分。这一最终的同一性百分比得分是用于本实施方案目的的得分。为了手工调整同一性百分比得分的目的，仅考虑未与查询序列匹配/比对的、目标序列N-和C-末端的残基。即，对于这种手工修正，仅考虑目标序列最远的N-和C-末端残基以外的查询残基位置。例如，90个氨基酸残基的目标序列与100个残基的查询序列进行比对，以确定同一性百分比。缺失发生在目标序列的N-末端，因此FASTDB比对不显示N-末端的前10个残基的匹配/比对。这10个未配对的残基占序列的10％(在N-和C-末端未匹配的残基数目/查询序列中的残基总数)，所以从FASTDB程序计算的同一性百分比得分中减去10％。如果剩下的90个残基完全匹配，则最终的同一性百分比将是90％。在另一个实例中，90个残基的目标序列与100个残基的查询序列进行比较。这一次缺失是内部缺失，所以在目标序列的N-或C-末端没有不与查询匹配/比对的残基。在该情况下，FASTDB计算的同一性百分比不必手工修正。再一次地，仅对未与查询序列匹配/比对的、如FASTDB比对中显示的目标序列N-和C-末端以外的残基位置进行手工修正。
更通常地，可以制备包含分离的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸编码具有酶活性的多肽，可操作地连接到一个或多个(数个)控制序列上，该控制序列引导编码序列在微生物例如大肠杆菌中在与该控制序列相容的条件下的表达。可以操作分离的多核苷酸，以提供多肽的表达。在其插入到载体中以前对多核苷酸序列的操作可能是期望的或必要的，这取决于表达载体。利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术在本领域中非常完善。
控制序列可以是适当的启动子序列，即被宿主细胞识别以表达编码本发明多肽的多核苷酸的核苷酸序列。启动子序列包含介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任意核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。指引核酸构建体特别是在大肠杆菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是lac启动子(Gronenborn，1976，MoI.Gen.Genet.148:243-250)、tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 80:21-25)、trc启动子(Brosius等，1985，J.Biol.Chem.260:3539-3541)、T7RNA聚合酶启动子(Studier和Moffatt，1986，J.MoI.Biol.189:113-130)、噬菌体启动子pL(Elvin等，1990，Gene 87:123-126)、tetA启动子(Skerra，1994，Gene 151:131-135)、araBAD启动子(Guzman等，1995，J.Bacteriol.177:4121-4130)和rhaPBAD启动子(Haldimann等，1998，J.Bacteriol.180:1277-1286)。其他启动子在“Useful proteinsfrom recombinant bacteria”，Scientific American，1980，242:74-94；以及Sambrook和Russell，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第三版2001(1-3卷)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.中描述。
控制序列也可以是合适的转录终止子序列，即被宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列可操作地连接到编码多肽的核苷酸序列的3'末端。在大肠杆菌细胞中有功能的任意终止子都可以用于本发明。也可能希望添加允许相对于宿主细胞的生长而调节多肽的表达的调节序列。调节系统的实例是那些响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)引起基因表达的开启或关闭的系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。
对于本发明的多种实施方案，遗传操作可以描述为包括各种遗传操作，包括那些旨在改变在任意各途径中鉴别的酶或酶活性的调节并因此改变其最终活性的遗传操作。此类遗传修饰可以涉及在选定的和/或鉴别的培养条件下导致酶活性和/或选择性改变的转录、翻译和翻译后修饰，和/或涉及额外的核酸序列的供应，例如用以增加与脂肪酸或脂肪酸衍生产物生产相关的酶的拷贝数和/或突变体。具体实现此类遗传修饰的方法和途径是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于：增加内源遗传元件的表达；降低阻遏基因的功能性；引入异源遗传元件；增加编码催化生产脂肪酸或脂肪酸衍生产物的酶转化步骤的多肽的核酸序列拷贝数；将遗传元件突变以提供酶比活性提高的突变蛋白质；过表达；欠表达；过表达陪伴分子；敲除蛋白酶；改变或修饰反馈抑制；提供包含一个或多个受损的针对阻遏物和/或竞争性抑制剂的结合位点的酶变异体；敲除阻遏基因；进化、筛选和/或其他改善mRNA稳定性的方法，以及使用具有有效拷贝数和启动子的质粒来达到有效的改善水平。可以实施随机诱变，以提供可能落入任意这些或其他所述方法内的遗传修饰。遗传修饰进一步广泛地落入目的核酸中一个或多个核酸的添加(包括插入)、缺失(例如通过突变)和置换。在多种实施方案中，遗传修饰导致酶比活性和/或酶的转换数的改善。非限制性地，可以通过以下一个或多个参数来测量改变：KM；Kcat；和K亲合力。
在多种实施方案中，为了更有效地起作用，微生物可以包含一个或多个基因缺失。例如，在大肠杆菌中，编码乳酸脱氢酶(ldhA)、磷酸乙酰基转移酶(pta)、丙酮酸氧化酶(poxB)和丙酮酸-甲酸裂解酶(pflB)的基因可以被破坏，包括缺失。此类基因破坏，包括缺失，不意味着限制，并且可以在多种实施方案中以各种组合实施。可以通过突变基因缺失方法，和/或从这些酶中的一种或多种的表达降低或不表达的突变株开始，和/或通过其他本领域技术人员已知的方法来完成基因缺失。基因缺失可以通过许多已知的具体方法中的任一种实现，包括但不限于使用Gene Bridges(Gene Bridges GmbH，Dresden，德国，<<www.genebridges.com>>)出售的试剂盒和其他试剂的RED/ET方法。
更特别地，关于后一种方法，使用Red/ET重组是本领域普通技术人员已知的，并且在授予Stewart等人的美国专利号6,355,412和6,509,156中描述，该专利并入本文以参考对该方法的教导。用于该方法的材料和试剂盒可从Gene Bridges(Gene Bridges GmbH，Dresden，德国，<<www.genebridges.com>>)得到，并且该方法可以按照生产商的说明进行。该方法包括通过用来自λ-噬菌体的重组酶进行的同源重组，将靶基因替换为选择性标记。用编码侧翼为与靶基因同源的末端区通常～50bp，或者可达约～300bp)的选择性标记的线性DNA产物转化表达λ-red重组酶的宿主微生物。然后可以通过由携带FLP-重组酶或另一种重组酶如Cre的质粒载体进行的另一个重组步骤移除标记。
可以实施微生物染色体DNA的一部分的定向缺失或外来遗传物质向微生物染色体的添加，以改变宿主细胞的代谢，从而降低或消除不想要的代谢产物的产生，例如消除乙酸酯/盐、乙醇、乳酸酯/盐及其他或其组合(例如见图5)。在这一普通实例中，这可以与如本文所述的其他遗传修饰组合使用。在该详细描述中，参考了多个实施方案及附图，其中通过图示显示了可以实施本发明的具体的示例性实施方案。这些实施方案描述得足够详细，使得本领域技术人员能够实施本发明，并且应当理解，熟练技术人员可以对各种公开的实施方案进行修改。
此外，对于脂肪酸或脂肪酸衍生产物的生产，可以选择和/或挑选这样的遗传修饰，以达到更高的通过相应脂肪酸或脂肪酸衍生产物生产途径内某些酶转化步骤的通量率，并因此可以用基本和/或主要方式影响一般细胞代谢。例如，在一些实施方案中，该通量率可以通过增加自糖至乙酰辅酶A的通量的遗传修饰来提高。
应当理解，氨基酸“同源性”包括保守置换，即，将多肽中的给定氨基酸替换为另一种具有相似特征的氨基酸的那些置换。一般以下替换被视为保守置换：将脂族氨基酸例如Ala、Val、Leu和Ile替换为另一种脂族氨基酸；用Thr替换Ser或者相反；将酸性残基例如Asp或Glu替换为另一种酸性残基；将具有酰胺基的残基例如Asn或Gln替换为另一种具有酰胺基的残基；将碱性残基例如Lys或Arg交换为另一种碱性残基；和将芳族残基例如Phe或Tyr替换为另一种芳族残基。
对于所有本文提供的核酸和氨基酸序列，应当理解，包括这些序列的保守修饰的变异体，并且其多种实施方案包括在本发明的范围内。本发明的多种实施方案的范围内也包括功能上等同的核酸和氨基酸序列(功能变异体)，它们可以包括保守修饰的变异体和更广泛变化的序列，该序列完全在本领域普通技术人员的技能内，并且也包括包含它们的微生物，以及包含这些序列和/或微生物的方法和系统。在多种实施方案中，编码足够同源的蛋白质或其部分的核酸序列在本发明的范围内。更一般地，由于遗传密码的简并性，编码在本发明中使用的特定氨基酸序列的核酸序列可以变化，尽管如此，仍然落在本发明的范围内。下表提供了氨基酸之间相似性的概述(保守的和保守性较低的置换可以基于该相似性)，并且也提供了反映这一简并性的各种密码子冗余。
表1：氨基酸之间的相似性
图例：侧基及其他相关性质：A＝酸性；B＝碱性；Ali＝脂肪族；Ami＝胺；Aro＝芳香族；N＝非极性；PU＝极性不带电荷；NEG＝带负电荷；POS＝带正电荷。
另外，当特定核酸序列的变异体和/或部分包含与本文所述核酸序列中显示的任意15个核苷酸的序列(包括但不限于开始于1号核苷酸并终止于15号核苷酸的序列、开始于2号核苷酸并终止于16号核苷酸的序列、开始于3号核苷酸并终止于17号核苷酸的序列等等)相同的15个核苷酸的序列时，该特定核酸序列的变异体和部分，以及本文所述的相应编码氨基酸序列，可以展示所需的功能性，例如，选定水平的酶活性。应当理解，本发明也提供分离的核酸，其包含长度大于15个核苷酸(例如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸)并且与本文列举的核酸序列中所示的序列的任意部分相同的核苷酸序列。例如，本发明提供分离的核酸，其包含与本文列举的任意一个或多个(包括其任意分组)核酸序列中所示的任意25个核苷酸的序列相同的25个核苷酸的序列，包括但不限于，开始于1号核苷酸并终止于25号核苷酸的序列、开始于2号核苷酸并终止于26号核苷酸的序列、开始于3号核苷酸并终止于27号核苷酸的序列，等等。额外的实例包括但不限于这样的分离的核酸，其包含长度是50或更多个核苷酸(例如100、150、200、250、300或更多个核苷酸)并且与本文公开的任意序列的任意部分相同的核苷酸序列。此类分离的核酸可以包括但不限于这样的分离的核酸，其包含在例如关于脂肪酸或脂肪酸衍生产物生产途径、编码脂肪酸合酶系统的酶的核酸序列或脂肪酸或脂肪酸衍生产物耐受性的讨论和/或实施例的任一部分中表述的核酸序列。例如，本发明提供了包含本文列出的核酸序列的分离的核酸，该核酸序列包含单一插入、单一缺失、单一置换、多个插入、多个缺失、多个置换，或其任意组合(例如单一缺失和多个插入一起)。此类分离的核酸分子可以与本文(即在序列表中)列出的核酸序列享有至少60、65、70、75、80、85、90、95、97、98或99％的序列同一性。
额外的实例包括但不限于这样的分离的核酸，其包含的核酸序列编码长度是50或更多个氨基酸残基(例如100、150、200、250、300或更多个氨基酸残基)并且与本文列出或其它公开的氨基酸序列的任意部分相同的氨基酸序列。
另外，本发明提供分离的核酸，其包含的核酸序列编码具有本文列出或其它公开的氨基酸序列的变异的氨基酸序列。例如，本发明提供分离的核酸，其包含的核酸序列编码本文列出或其它公开的氨基酸序列，该序列包含单一插入、单一缺失、单一置换、多个插入、多个缺失、多个置换，或其任意组合(例如单一缺失和多个插入一起)。此类分离的核酸分子可以包含这样一种核酸序列，其编码与本文列出或其它公开的氨基酸序列享有至少60、65、70、75、80、85、90、95、97、98或99％的序列同一性的氨基酸序列。
表1中举例说明了为保守的和其他的氨基酸置换提供碱基的性质的实例。因此，本领域技术人员可以进行众多的置换，以获得展示所需功能性的氨基酸序列变异体。BLASTP、CLUSTALP以及其他比对和比较工具可以用来评估高度保守区域，对该区域可以进行较少的置换(除非旨在改变活性达到选定水平，这可能需要多个置换)。在公认或相信与活性位点或其他结合或结构基序无关的区域中，可以进行更多的置换。根据表1，例如，可以用一种极性不带电荷(PU)氨基酸对列出的序列的极性不带电荷氨基酸进行置换，任选地考虑大小/分子量(例如，用丝氨酸置换苏氨酸)。关于哪些氨基酸变化可能会表型沉默的指导尤其可见Bowie,J.U.等，“Deciphering the Message in ProteinSequences:Tolerance to Amino Acid Substitutions”，Science247:1306-1310(1990)。该参考文献并入以作为此类教导的参考，但是，这些一般也是本领域技术人员已知的。公认的保守氨基酸置换包括(一组的各冒号后是可置换的氨基酸)：ala:ser；arg:lys；asn:gln或his；asp:glu；cys:ser；gln:asn；glu:asp；gly:pro；his:asn或gln；ile:leu或val；leu:ile或val；lys:arg或gln或glu；met:leu或ile；phe:met或leu或tyr；ser:thr；thr:ser；trp:tyr；tyr:trp或phe；val:ile或leu。
应当指出，特定物种的密码子偏好和密码子使用表可以用来工程设计利用该特定物种的密码子使用偏好的分离的核酸分子。例如，本文提供的分离的核酸可以设计为具有目的特定微生物所优先使用的密码子。众多软件和测序服务可用于序列的这种密码子优化。
本发明提供包含本文列出或其它公开的氨基酸序列的整个氨基酸序列的多肽。另外，本发明提供包含本文列出或其它公开的氨基酸序列的一部分的多肽。例如，本发明提供包含15个氨基酸的序列的多肽，该15个氨基酸的序列与本文列出或其它公开的氨基酸序列的任意15个氨基酸的序列(包括但不限于，开始于1号氨基酸残基并终止于15号氨基酸残基的序列、开始于2号氨基酸残基并终止于16号氨基酸残基的序列、开始于3号氨基酸残基并终止于17号氨基酸残基的序列，等等)相同。应当理解，本发明也提供包含长度大于15个氨基酸残基(例如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸残基)并且与本文列出或其它公开的氨基酸序列的任意部分相同的氨基酸序列的多肽。例如，本发明提供包含25个氨基酸的序列的多肽，该25个氨基酸的序列与本文列出或其它公开的氨基酸序列的任意25个氨基酸的序列(包括但不限于，开始于1号氨基酸残基并终止于25号氨基酸残基的序列、开始于2号氨基酸残基并终止于26号氨基酸残基的序列、开始于3号氨基酸残基并终止于27号氨基酸残基的序列，等等)相同。额外的实例包括但不限于包含长度是50或更多个氨基酸残基(例如100、150、200、250、300或更多个氨基酸残基)并且与本文列出或其它公开的氨基酸序列的任意部分相同的氨基酸序列的多肽。此外，应当理解，根据以上所述，15个核苷酸的序列将提供5个氨基酸的序列，所以后者和长度更长的氨基酸序列可以由与本文提供的序列具有同一性的上述核苷酸序列长度来限定。
另外，本发明提供其氨基酸序列具有本文列出或其它公开的氨基酸序列中所示的氨基酸序列的变异的多肽。例如，本发明提供包含本文列出或其它公开的氨基酸序列的多肽，该序列包含单一插入、单一缺失、单一置换、多个插入、多个缺失、多个置换，或其任意组合(例如，单一缺失和多个插入一起)。这样的多肽可以包含与本文列出或其它公开的氨基酸序列享有至少60、65、70、75、80、85、90、95、97、98或99％的序列同一性的氨基酸序列。特定变异氨基酸序列可以包含任意数量的变异和变异类型的任意组合。
如本文所述，具有变异氨基酸序列的多肽可以保持酶活性。可以通过使用标准程序例如定点诱变或各种PCR技术操作编码多肽的核苷酸序列来产生此类多肽。如本文所述，一种类型的修饰包括用一个或多个氨基酸残基置换具有类似化学和/或生化性质的氨基酸残基。例如，多肽可以具有在本文列出或其它公开的氨基酸序列中所示的、包含一个或多个保守置换的氨基酸序列。
通过选择保守性较低的置换，和/或在可能更关键的序列区域中例如选择在其对保持以下方面的效果上更显著不同的残基，可以获得更实质性的改变：(a)置换区域中的多肽骨架的结构，例如作为片状或螺旋构象；(b)多肽在靶位点处的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积。通常期望用来产生多肽功能的最大变化的置换是这样的置换，其中：(a)亲水性残基例如丝氨酸或苏氨酸取代疏水性残基例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸(或被其取代)；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代任意其他残基(或被其取代)；(c)具有带正电的侧链的残基例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代带负电的残基例如谷氨酸或天冬氨酸(或被其取代)；或(d)具有大侧链的残基例如苯丙氨酸取代没有侧链的残基例如甘氨酸(或被其取代)。通过分析多肽催化与相关的天然多肽相同的底物转化成与相关的天然多肽相同的产物的能力，可以评估这些氨基酸置换(或者其他缺失或添加)对具有酶活性的多肽的效果。因此，本发明提供了具有5、10、20、30、40、50个或更少的保守置换的多肽。
可以通过标准DNA诱变技术例如M13引物诱变来产生多肽和编码多肽的核酸。这些技术的细节在Sambrook和Russell，2001中提供。核酸分子可以包含编码区的改变，以适应将要引入该分子的特定微生物的密码子使用偏好。
或者，可以通过利用遗传密码的简并性改变编码区，以这样的方式改变编码序列，使得虽然核酸序列实质上改变，但它仍然编码具有与天然氨基酸序列相同或基本类似的氨基酸序列的多肽。例如，在开放阅读框中，丙氨酸由核苷酸密码子三联体GCT编码。由于遗传密码的简并性，其他三种核苷酸密码子三联体—GCA、GCC和GCG—也编码丙氨酸。因此，开放阅读框的核酸序列可以在这一位置上改变成这三种密码子中的任一种，而不影响所编码的多肽的氨基酸序列或多肽的特征。基于遗传密码的简并性，可以使用如本文描述的标准DNA诱变技术，或通过核酸序列的合成，由本文公开的核酸序列衍生核酸变异体。因此，对于多种实施方案，本发明包含由于遗传密码的简并性而编码相同多肽但核酸序列变化的核酸分子。
本发明也提供了一种分离的核酸，其长度为至少约12个碱基(例如，长度至少约13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000或20000个碱基)，并且在杂交条件下与具有本文列出或其它公开的序列的核酸的有义或反义链杂交。杂交条件可以是中度或高度严格的杂交条件。
F.丙二酰辅酶A从天然丙二酰-ACP依赖性脂肪酸合成到丙二酰辅酶A依赖性脂肪酸合成的重定向
本发明的组合物，例如遗传修饰的微生物，包含其中丙二酰辅酶A是底物的脂肪酸或脂肪酸衍生产物的生产途径，并且也可以包含一个或多个遗传修饰以降低由一个或多个微生物丙二酰-ACP依赖性脂肪酸合成酶系统基因所编码的酶的活性。该组合物可以在本发明的方法和系统中使用。
关于许多脂肪酸或脂肪酸衍生产物在许多具有商业发酵意义的微生物中的微生物发酵，丙二酰辅酶A是代谢中间体，在正常生长条件下转化成脂肪酸及其衍生物，例如磷脂，然后用于细胞膜及其他关键细胞功能。例如，在大肠杆菌中，脂肪酸合酶系统是II型或解离的脂肪酸合酶系统。在该系统中，丙二酰-ACP依赖性脂肪酸生产途径的酶由不同的基因编码，并且是许多关键代谢途径所共有的，其被很好地调节，包括通过抑制上游酶的下游产物来调节。
在各种微生物中，代谢中间体丙二酰辅酶A通过脂肪酸合成系统(即途径或复合物)向脂肪酸的转化是丙二酰辅酶A的唯一的或主要的用途。已经确定，当微生物中存在获得替代化学产品的生产途径时，减少丙二酰辅酶A向脂肪酸的这种转化可以改善该替代化学产品的生产度量(metrics)。例如，在许多微生物细胞中，脂肪酸合酶系统包含具有以下酶活性的多肽：丙二酰辅酶A-酰基载体蛋白(ACP)转酰基酶；β-酮脂酰-ACP合酶；β-酮脂酰-ACP还原酶；β-羟基酰基-ACP脱水酶；3-羟基酰基-ACP脱水酶；和烯酰-ACP还原酶。在多种实施方案中，可以引入编码这些多肽的温度敏感形式的核酸序列来代替天然酶，并且当这样遗传修饰的微生物在升高的温度(在该温度下由于蛋白质结构改变或完全变性，这些不耐热的多肽变得部分或完全失活)下培养时，观察到化学产品的增加。在大肠杆菌中，这些温度敏感性突变基因可以包括fabIts(S241F)、fabBts(A329V)或fabDts(W257Q)。在其他实施方案中，可以进行其他类型的遗传修饰，以调节，例如降低这些多肽中的一种或多种的酶活性。在多种实施方案中，此类遗传修饰的结果是转换丙二酰辅酶A的利用，使得丙二酰辅酶A经由天然途径向脂肪酸的转化、总生物量减少，并且碳源经由依赖丙二酰辅酶A而不依赖丙二酰-ACP的路线向包括脂肪酸或脂肪酸衍生产物在内的化学产品的转化成比例地更高。在多种实施方案中，微生物生产的化学产品的比生产率出乎意料地高。另外，可以对某些实施方案进行额外的遗传修饰，例如用以提高丙二酰辅酶A的产量。图1描绘了微生物的代谢途径，其与用于提高通过中间体丙二酰辅酶A的通量的遗传修饰相关。
一种酶，烯酰(酰基载体蛋白)还原酶(EC号1.3.1.9，也称作烯酰-ACP还原酶)，是由丙二酰辅酶A生物合成脂肪酸的关键酶。在大肠杆菌中，该酶FabI由基因fabI编码(参见“Enoyl-Acyl Carrier Protein(fabI)Plays a Determinant Role in Completing Cycles of Fatty AcidElongation in Escherichia coli”，Richard J.Heath和Charles O.Rock，J.Biol.Chem.270:44，26538-26543页(1995)，并入本文以参考其中关于fabI和脂肪酸合酶系统的讨论)。
本发明可以使用一种微生物，该微生物具有编码具有可以在发酵事件期间调节的烯酰-ACP还原酶酶活性的多肽的核酸序列(多核苷酸)。例如，可以提供编码温度敏感性烯酰-ACP还原酶的核酸序列来代替天然的烯酰-ACP还原酶，使得升高的培养温度导致酶活性降低，然后导致转换的丙二酰辅酶A向所需化学产品生产的利用。在这样升高的温度下，酶被认为对于该温度是不容许的。一个这样的序列是大肠杆菌的突变的温度敏感性fabI(fabITS)或fabIts(S241F)。
应当理解，通过在已知的基因组学数据库例如BLASTN和BLASTP中进行同源性搜索，容易获得烯酰-ACP还原酶在大肠杆菌以外的物种中的核酸和氨基酸序列。在此描述了获得其他物种中的同系物和功能等同序列的方法。因此，应当理解，本领域技术人员可以对许多具有商业意义的微生物物种实施本发明。
如本领域技术人员已知的，可以使用温度敏感性烯酰-ACP还原酶以外的方法，例如但不限于用包含该酶的诱导型启动子的核酸序列替换天然的烯酰-ACP或烯酰辅酶A还原酶，使得在初始诱导后可以无需诱导，从而在达到选定的细胞密度后降低烯酰-ACP或烯酰辅酶A还原酶的酶活性。
在一些方面，本发明包括遗传修饰的微生物，该微生物包含至少一个用以提供、完成或增强将丙二酰辅酶A有效转化成所选化学产品的所选化学产品生产途径的遗传修饰，并且进一步包含用以提高微生物细胞中的碳酸氢盐水平的碳酸酐酶的遗传修饰和/或用碳酸氢盐和/或碳酸盐对其培养基的补充，并且可以进一步包含一个或多个用以提高乙酰辅酶A羧化酶和NADPH依赖的转氢酶中的一种或多种的酶活性的遗传修饰。相关的方法和系统使用这样遗传修饰的微生物。
在多种实施方案中，本发明涉及制备化学产品的方法，包括：在容器中提供选定细胞密度的遗传修饰微生物群体，其中遗传修饰的微生物包含用于由丙二酰辅酶A生产化学产品的生产途径；和降低遗传修饰微生物的丙二酰-ACP依赖性脂肪酸合酶途径的至少一种酶的酶活性。
在多种实施方案中，在微生物宿主细胞中降低烯酰-ACP还原酶的酶活性导致以升高的比生产率和容积生产率生产化学产品。在另外其他的实施方案中，在微生物宿主细胞中降低烯酰-ACP还原酶的酶活性导致以升高的比生产率和容积生产率生产该化学产品。
图2描绘了微生物经由丙二酰辅酶A依赖性方式产生丁酰辅酶A引发物(primer)以用于脂肪酰辅酶A合成的代谢途径。这涉及单独地提高丙二酰辅酶A依赖性乙酰乙酰辅酶A合酶的活性或将其与降低微生物的乙酰乙酰辅酶A硫解酶活性相结合。乙酰乙酰辅酶A的丙二酰辅酶A依赖性生产随后继以通过提高3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶或3-酮脂酰辅酶A还原酶活性以及烯酰辅酶A水合酶和反式-2-烯酰辅酶A还原酶活性还原成丁酸。丁酰辅酶A引发物然后可用于产生较长链脂肪酰辅酶A或可替代地，丁酸、丁醇或其他产品。
图3A描绘了微生物经由乙酰辅酶A依赖性方式，从引发物丁酰辅酶A开始，产生脂肪酰辅酶A合成的代谢途径。这涉及提高3-酮脂酰辅酶A硫解酶活性、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶或3-酮脂酰辅酶A还原酶活性以及烯酰辅酶A水合酶和反式-2-烯酰辅酶A还原酶活性。
图3B描绘了微生物经由丙二酰辅酶A依赖性方式，从引发物丁酰辅酶A开始，产生脂肪酰辅酶A合成的代谢途径。这涉及提高3-酮脂酰辅酶A合酶的活性或延长酶活性、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶或3-酮脂酰辅酶A还原酶活性以及烯酰辅酶A水合酶和反式-2-烯酰辅酶A还原酶活性。
降低这些酶的酶活性的另一种遗传修饰方法是提供促进一种这样的酶例如烯酰-ACP还原酶基因(例如大肠杆菌中的fabI)的诱导型启动子。在这样的实例中，该启动子可以在本文的方法的第一阶段期间被诱导(例如用异丙基-μ-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导)，并且在IPTG耗尽、移除或稀释掉后，可以开始降低烯酰-ACP还原酶的酶活性的第二步。例如本文描述的和/或本领域技术人员已知的，可以应用其他方法来控制酶的表达和活性。例如，响应于磷酸酯的消耗而启动的启动子可用于可控地表达所需基因。这样的启动子可包括大肠杆菌中的yibD或pstS基因启动子。
虽然烯酰辅酶A还原酶被认为是脂肪酸合酶系统的一种重要的酶，但是例如本文所列出的，可以对编码展示该系统的酶活性的多肽的多核苷酸(核酸序列)的任意组合进行遗传修饰。例如，FabB，β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶I，是大肠杆菌中对于生长以及饱和和不饱和脂肪酸的生物合成来说至关重要的酶。FabB的失活导致对脂肪酸延伸的抑制和细胞生长的降低，以及消除了丙二酰-ACP的丙二酸部分再循环回乙酰辅酶A的无效循环。FabF，β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶II，是饱和脂肪酸的合成和细胞中膜流动性的控制所必需的。两种酶都被浅蓝菌素抑制。
据报道，FabF的过表达导致脂肪酸生物合成降低。已提出，FabF在与FabB竞争结合FabD即丙二酰辅酶A:ACP转酰基酶中胜出。FabB与FabD的结合是启动脂肪酸延伸的缩合反应所必需的。(参见Microbiological Reviews，1993年9月，p.522-542，Vol.57，No.3；K.Magnuson等，“Regulation of Fatty Acid Biosynthesis in Escherichiacoli”，American Society for Microbiology；W.Zha等，“Improvingcellular malonyl-CoA level in Escherichia coli via metabolicengineering”，Metabolic Engineering 11(2009)192–198)。降低此类脂肪酸合酶的遗传修饰的一个替代方案是向培养系统中提供一种或多种此类酶的合适的抑制剂。这一方法可以独立实施，或者可以与遗传修饰方法组合实施。可以单独或组合地使用抑制剂例如浅蓝菌素、硫乳霉素和三氯生(该列表不是限制性的)或旨在降低由一个或多个脂肪酸合成酶系统基因编码的酶的活性的遗传修饰。
不受限于特定的理论，相信降低微生物中烯酰-ACP还原酶(和/或脂肪酸合酶系统的其他酶)的酶活性导致酶上游的代谢中间体丙二酰辅酶A的累积和/或分流，该丙二酰辅酶A然后可以转化成化学产品，微生物细胞包含利用丙二酰辅酶A的针对该化学产品的代谢途径。在本发明的某些组合物、方法和系统中，使烯酰-ACP还原酶(或者，更一般地，脂肪酸合酶系统)酶活性的降低在遗传修饰的微生物达到足够的细胞密度之后发生。这一双相培养方法平衡了在支持特定生产速率的细胞生物质中所需的生物催化剂量与产率，这可以部分归因于在烯酰-ACP还原酶活性(和/或脂肪酸合酶系统的其他酶的活性)降低后，有较少的碳被导向细胞物质。这导致转换为丙二酰辅酶A的净利用，因此提供了向所需化学产品的更大碳通量。
在本发明的多种实施方案中，比生产率提高，并且这导致总体上快速且有效的微生物发酵方法和系统。在多种实施方案中，容积生产率也大幅提高。
基于教导和先前的数据，例如对于脂肪酸而言，比生产率和容积生产率参数二者的改善是意料之外的并且推动了技术发展。
如本文所述，可以用许多方式实现烯酰-ACP还原酶活性和/或脂肪酸合酶系统的其他酶的降低。
所谓丙二酰辅酶A向脂肪酰-ACP或脂肪酰辅酶A分子的转化和向脂肪酸分子的转化的“调节手段”是指以下任一种：1)在微生物细胞中提供至少一种多核苷酸，该多核苷酸编码至少一种具有一种(例如本文列举的)丙二酰-ACP依赖性脂肪酸合酶系统酶的活性的多肽，其中这样编码的多肽具有(例如通过突变和/或启动子置换等，以降低酶活性)或可以经调节以具有(例如通过温度敏感性、诱导型启动子等)降低的酶活性；2)以一定的剂量向包含微生物细胞或群体的容器提供抑制一种或多种(例如本文列举的)丙二酰-ACP依赖性脂肪酸合酶系统酶的酶活性的抑制剂，该剂量有效地降低这些酶中的一种或多种的酶活性。这些手段可以彼此组合提供。当调节手段包括在发酵事件期间脂肪酸合成酶系统活性从较高到较低的转化时，例如通过提高包含含有温度敏感性脂肪酸合成酶系统多肽(例如烯酰-ACP还原酶)的遗传修饰微生物群体的培养容器的温度，或者通过添加抑制剂，设想了两种模式——一种在此期间该脂肪酸合酶系统有较高的活性，而第二种在此期间有较低的活性。在较低活性模式期间，可以通过一种或多种依赖丙二酰辅酶A、不依赖丙二酰-ACP的脂肪酰辅酶A代谢途径的活性的增强，进行丙二酰辅酶A向所选化学产品的更大利用的转换。
一旦调节有效降低了所指出的酶活性，各个这样调节的各自酶活性与天然未调节的酶活性(例如在细胞中或分离的)的活性相比，可以降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。类似地，丙二酰辅酶A向脂肪酰-ACP或脂肪酰辅酶A分子的转化与在未调节的细胞或其他系统中的此类转化相比，可以降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。同样地，丙二酰辅酶A向脂肪酸分子的转化与在未调节的细胞或其他系统中的此类转化相比，可以降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。G.从丙二酰辅酶A到脂肪酰辅酶A依赖性产物的生产途径
在多种实施方案中，本发明的组合物、方法和系统涉及包含将丙二酰辅酶A转化成脂肪酸或脂肪酸衍生产物的代谢生产途径。
任意以上多肽可以是NADH-或NADPH-依赖的，并且可以利用本领域已知的方法将特定酶转化为任一形式。更特别地，可以利用任意方法将使用NADPH作为辅因子的多肽转化成使用NADH作为辅因子的多肽，例如其他人描述的那些(Eppink等，J Mol.Biol.,292(1):87-96(1999)，Hall和Tomsett,Microbiology,146(Pt 6):1399-406(2000)，和Dohr等,Proc.Natl.Acad.Sci.,98(1):81-86(2001))。(参见，例如WO 2002/042418)。
在多种实施方案中，例如通过使用本文公开的方法之一，所选化学产品的生物生产可以达到至少1、至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40和至少50g/升的滴度。
因为本文公开的进展与所选化学产品的商业发酵相关，通过了解这些进展可以认识到，本发明的实施方案可以与其他遗传修饰和/或方法或系统调节组合，从而获得每升最终(例如已消耗的)发酵液有效生产至少10、至少20、至少30、至少40、至少45、至少50、至少80、至少100或至少120克化学产品的微生物(及对应的方法)，同时以如本文公开的比生产率和/或容积生产率达到这一点。
在一些实施方案中，使用如本文所述的遗传修饰的微生物进行微生物化学生物生产事件(即，使用培养的微生物群体的发酵事件)，其中比生产率为每克微生物细胞(基于干重)每小时生产0.01到0.60克所选化学产品(g化学产品/g DCW-hr)。在多种实施方案中，比生产率大于0.01、大于0.05、大于0.10、大于0.15、大于0.20、大于0.25、大于0.30、大于0.35、大于0.40、大于0.45或大于0.50g化学产品/gDCW-hr。在特定微生物化学生产事件中，可以在2、4、6、8、12或24小时时间内评估比生产率。更特别地，化学产品的比生产率为0.05至0.10、0.10至0.15、0.15至0.20、0.20至0.25、0.25至0.30、0.30至0.35、0.35至0.40、0.40至0.45或0.45至0.50g化学产品/g DCW-hr、0.50至0.55或0.55至0.60g化学产品/g DCW-hr。多种实施方案包含显示这样的生产率的培养系统。
另外，在本发明的多种实施方案中，达到的容积生产率可以是0.25g脂肪酸(或其他化学产品)每升每小时(g(化学产品)/L-hr)，可以大于0.25g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于0.50g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于1.0g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于1.50g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于2.0g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于2.50g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于3.0g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于3.50g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于4.0g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于4.50g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于5.0g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于5.50g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于6.0g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于6.50g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于7.0g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于7.50g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于8.0g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于8.50g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于9.0g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，可以大于9.50g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr，或可以大于10.0g脂肪酸(或其他化学产品)/L-hr。
在一些实施方案中，如在24小时发酵(培养)时间内测量的比生产率可以大于0.01、0.05、0.10、0.20、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0或12.0克化学产品/克DCW微生物(基于在24小时时间结束时的最终DCW)。
在本发明的各个方面和实施方案中，微生物的比生产率得到显著提高，这推动了发酵技术和例如脂肪酸(但不限于此)的微生物化学生产的商业经济可行性。
以另一种方式阐述，在多种实施方案中，比生产率超过(至少是)0.01g化学产品/g DCW-hr，超过(至少是)0.05g化学产品/g DCW-hr，超过(至少是)0.10g化学产品/g DCW-hr，超过(至少是)0.15g化学产品/g DCW-hr，超过(至少是)0.20g化学产品/g DCW-hr，超过(至少是)0.25g化学产品/g DCW-hr，超过(至少是)0.30g化学产品/g DCW-hr，超过(至少是)0.35g化学产品/g DCW-hr，超过(至少是)0.40g化学产品/g DCW-hr，超过(至少是)0.45g化学产品/g DCW-hr，超过(至少是)0.50g化学产品/g DCW-hr，超过(至少是)0.60g化学产品/g DCW-hr。
更一般地，基于本文描述的遗传修饰的各种组合，任选地与本文描述的补充相组合，脂肪酸或脂肪酸衍生产物和本文描述的其他化学产品的比生产率值可以超过0.01g化学产品/g DCW-hr，可以超过0.05g化学产品/g DCW-hr，可以超过0.10g化学产品/g DCW-hr，可以超过0.15g化学产品/g DCW-hr，可以超过0.20g化学产品/g DCW-hr，可以超过0.25g化学产品/g DCW-hr，可以超过0.30g化学产品/gDCW-hr，可以超过0.35g化学产品/g DCW-hr，可以超过0.40g化学产品/g DCW-hr，可以超过0.45g化学产品/g DCW-hr，并且可以超过0.50g或0.60化学产品/g DCW-hr。在特定微生物化学生产事件中，可以在2、4、6、8、12或24小时时间内评估这种比生产率。
根据与缺乏本文教导的特定遗传修饰组合的适当对照微生物相比(向包含微生物群体的容器添加了或未添加本文教导的补充物)，比生产率的提高百分比或容积生产率的提高百分比，可以确定通过本发明的实施方案达到的改善。对于特定的实施方案及其分组，这样的比生产率和/或容积生产率改善超过这种适当对照微生物的相应比生产率和/或容积生产率至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％和至少500％。
说明书的具体方法和教导，和/或并入作为参考的引用的参考文献，可以并入到实施例中。另外，化学产品的生产在多种实施方案中可以达到至少1、至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40和至少50g/升的效价。
这些度量可以适用于任何组合物，例如，遗传修饰的微生物，方法，例如生产化学产品的方法，和系统，例如使用遗传修饰的微生物和/或本文公开的方法的发酵系统。
应当理解，使用本文提供的策略和方法并基于发现途径和途径部分的相互关系而得到的反复改善，在生物生产事件结束时可以导致甚至更高的化学产品生物生产。
H.遗传修饰的组合
在一些实施方案中，降低酶活性的至少一种遗传修饰是基因破坏。在一些实施方案中，降低酶活性的至少一种遗传修饰是基因缺失。
在一些实施方案中，遗传修饰提高了所选脂肪酸或脂肪酸衍生化学产物的微生物合成，其高于缺少所述至少一种遗传修饰的对照微生物生产所选化学产品的速率或效价。在一些实施方案中，该遗传修饰有效地增加向所选化学产品的酶转化，其比缺少该遗传修饰的对照微生物的酶转化高至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％或至少约50％。对酶或酶活性的这些非限制性遗传修饰中的一些在以下表2中列出。
表2：遗传修饰
E.C.编号＝“酶学委员会编号”
进一步关于基于表2的教导降低酶功能，任一种以下酶功能或其组合可以在与本文描述的其他遗传修饰组合的特定实施方案中降低：β-酮脂酰-ACP合酶I，3-氧代酰基-ACP-合酶I；丙二酰辅酶A-ACP转酰基酶；烯酰ACP还原酶；和β-酮脂酰-ACP合酶III。
因此，如上面各部分中所述，本发明的一些组合物、方法和系统包括提供遗传修饰的微生物，该遗传修饰的微生物包含生产所选化学产品例如脂肪酸或脂肪酸衍生产物的生产途径，以及修饰的多核苷酸，该多核苷酸编码展示降低的活性的丙二酰-ACP依赖性脂肪酸合酶系统的酶，使得与缺乏此类修饰的可比较的(对照)微生物相比，丙二酰辅酶A的利用朝向生产途径转换。该方法包括使用此类遗传修饰的微生物群体在具有营养培养基的容器中生产化学产品。本文描述的对其他酶例如乙酰辅酶A羧化酶和/或NADPH依赖的转氢酶的其他遗传修饰可以在一些这样的实施方案中存在。已表明提供编码展示这些酶活性的多肽的多核苷酸的额外拷贝提高了脂肪酸或脂肪酸衍生产物的生产。提高这些相应的酶活性的其他方式是本领域已知的，并且可以应用于本发明的多种实施方案。
另外，非限制性地，在一些制备化学产品的多阶段方法实施方案中，第一步可以如下举例说明：向容器例如培养或生物反应器容器中提供营养培养基，例如本领域技术人员已知的基本培养基，和遗传修饰微生物的接种物，以便得到该微生物的群体，该微生物例如是细菌，更特别地是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌，其中该遗传修饰的微生物包含将丙二酰辅酶A转化成所选化学产品的代谢途径。在容器中培养该接种物，使得细胞密度增加到适合达到脂肪酸或脂肪酸衍生产物的生产水平的细胞密度，考虑到该方法的下一步，该细胞密度满足总体生产率度量。在各种替代的实施方案中，这些遗传修饰的微生物群体可以在第一个预备容器中培养到第一细胞密度，然后转移到所述的容器中，以便提供选定的细胞密度。众多的多容器培养策略是本领域技术人员已知的。任何这样的实施方案根据该方法的第一个所述步骤提供选定的细胞密度。
另外非限制性地，随后的步骤可以用两个途径来举例说明，这两个途径也可以在多种实施方案中组合实施。第一个途径是向遗传修饰的微生物提供遗传修饰，使得可以控制其烯酰-ACP还原酶的酶活性。作为一个实例，可以进行遗传修饰，以将天然的烯酰-ACP还原酶替换为温度敏感性突变烯酰-ACP还原酶(例如大肠杆菌中的fabITS)。前者在温度超过30℃时可以展示降低的酶活性，但在30℃展示正常酶活性，所以将培养温度升高到例如34℃、35℃、36℃、37℃或甚至42℃降低烯酰-ACP还原酶的酶活性。在这种情况下，与在30℃时相比有更多的丙二酰辅酶A转化成脂肪酸或脂肪酸衍生产物或另一种化学产品，其中效力较低的烯酰-ACP还原酶不阻碍丙二酰辅酶A向脂肪酸的转化。
关于可以导致所选化学产品在工业生物生产中的效价提高的本发明的生产提高方面，遗传修饰包括向微生物中引入一个或多个核酸序列，其中该一个或多个核酸序列编码和表达一种或多种生产途径酶(或生产途径的酶的酶活性)。在多种实施方案中，这些改善因此结合起来，以提高所选化学产品的工业生物生产的效率和效力，并因此降低了其成本。
在多种实施方案中，遗传修饰可以涉及导致酶活性和/或选择性在选定的和/或鉴定的培养条件下改变的转录修饰、翻译修饰和翻译后修饰。因此，在多种实施方案中，为了更有效地起作用，微生物可以包含一个或多个基因缺失。
通过突变基因缺失方法，和/或从具有一种或多种这些酶的降低表达或无表达的突变体菌株开始，和/或通过其他本领域技术人员已知的方法，可以完成基因缺失。
本发明的方面也涉及提供多个遗传修饰，以改善微生物将选定的碳源转化成所选化学产品例如聚酮化合物的总体有效性。例如在实施例中显示了特定组合，用以提高比生产率、容积生产率、效价和产率，使之大幅超过遗传修饰的更基础的组合。
可以在本发明的微生物菌株中提供额外的遗传修饰。可以提供许多这样的修饰，以给予特定的表型。
例如，可以提供利用蔗糖的能力，并且这将扩展可以用来生产脂肪酸或脂肪酸衍生产物或其他化学产品的原料的范围。常见的大肠杆菌的实验室和工业菌株，例如本文描述的菌株，不能够利用作为唯一碳源的蔗糖。因为蔗糖和含蔗糖的原料(例如糖蜜)是丰富的，并且经常用作通过微生物发酵进行生产的原料，因此可以在具有如本文提供的其他特征的菌株中实施添加适当的遗传修饰以允许蔗糖的摄取和使用。各种蔗糖摄取和代谢系统是本领域已知的(例如美国专利号6,960,455)，将其并入以参考这些教导。这些和其他方法可以在本发明的菌株中提供。实施例提供了至少两种方法。
另外，可以提供遗传修饰，以添加用于分解更复杂的碳源例如纤维素生物质或其产物、用于摄取和/或利用此类碳源的功能性。例如，已经研究和表征了众多纤维素酶和基于纤维素酶的纤维素降解系统(参见，例如，Beguin,P和Aubert,J-P(1994)FEMS Microbial.Rev.13:25-58；Ohima,K.等(1997)Biotechnol.Genet.Eng.Rev.14:365414，将其并入本文以参考这些教导)。
除了上述遗传修饰以外，在多种实施方案中也提供用以提高辅因子NADPH的储备和可用性和/或因此提高NADPH/NADP+比率的遗传修饰。例如，在对于大肠杆菌的多种实施方案中，这可以通过以下方式实现：例如通过遗传修饰来提高一个或多个以下基因的活性-pgi(处于突变形式)，pntAB，过表达的，gapA:gapN置换/替换，和破坏或修饰可溶性的转氢酶例如sthA，和/或zwf、gnd和edd中的一个或多个的遗传修饰。
可以向不具有这种功能性或具有小于所需水平的这种功能性的物种提供任何这样的遗传修饰。
更一般地，并且取决于为遗传修饰而选择的微生物的特定代谢途径，可以进行任何亚组的遗传修饰，以降低发酵产物的细胞生产，该产物选自乙酸酯/盐、乙偶姻、丙酮、丙烯酸、苹果酸酯/盐、脂肪酸乙酯、类异戊二烯、甘油、乙二醇、乙烯、丙烯、丁烯、异丁烯、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、其他乙酸酯/盐、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、丁醇、异丁醇、仲丁醇、丁酸酯/盐、异丁酸酯/盐、2-OH-异丁酸酯/盐、3-OH-丁酸酯/盐、乙醇、异丙醇、D-乳酸酯/盐、L-乳酸酯/盐、丙酮酸酯/盐、衣康酸酯/盐、乙酰丙酸酯/盐、葡萄糖二酸酯/盐、戊二酸酯/盐、己内酰胺、己二酸、丙醇、异丙醇、杂醇、和1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、甲酸酯/盐、富马酸、丙酸、琥珀酸、戊酸和顺丁烯二酸。如本文一般公开的，可以进行基因缺失，并且也可以使用其他方法来实现选定的发酵产物的所需降低的细胞生产。
I.公开的实施方案是非限制性的
尽管本文中已显示并描述了本发明的多种实施方案，但是应当强调这些实施方案仅是作为实例提供的。可以在其多种实施方案中进行众多的变化、改变和替代，而不背离本文所述的本发明。具体地，并且无论什么原因，对于本文在列表、表格或其他分组(例如在图中显示的代谢途径酶)中说明或以其他方式提出的化合物、核酸序列、包括特异性蛋白质(包括功能酶)在内的多肽、代谢途径酶或中间体、因子或其他组合物或浓度的任何分组，除非另外明确说明，预期各个这样的分组为多种实施方案子集提供基础并用来对其进行确定，该实施方案子集在其最广泛的范围中包含这些分组的每个子集，排除各自所述分组的一个或多个成员(或子集)。此外，在本文中描述任何范围时，除非另外明确说明，该范围包括其中的所有值和其中的所有子范围。
另外，并且更一般地，根据本文的公开内容、讨论、实施例和实施方案，可以使用本领域技术范围内的常规分子生物学、细胞生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中充分说明。(参见例如Sambrook和Russell，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第三版2001(1-3卷)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.；Animal Cell Culture，R.I.Freshney编，1986。)这些公开的资源并入本文以参考其中分别对其中提到的标准实验室方法的教导。这种并入至少是为了在本文中引用参考文献时可能指出的具体教导和/或其他目的。如果没有这样指出具体教导和/或其他目的，那么具体并入公开的资源是为了参考文献的标题、摘要和/或概述中的一处或多处所说明的教导。如果没有这样涉及这种明确指出的教导和/或其他目的，那么并入公开的资源的目的是为了更全面地描述本发明所属领域的技术水平，和/或如果可以适用，则如本领域技术人员公知的那样提供这样的教导。但是，需要特别说明，本文公开的资源的引用不应当被解释为承认它是本发明的现有技术。另外，如果一种或多种并入的公开的资源与本申请有差异或矛盾，包括但不限于定义的术语、术语使用、描述的技术等，以本申请为准。实施例中的主题以尚未存在的程度并入本部分。
III.实施例
此处的实施例提供了遗传修饰和补充物添加的组合的一些例子，而并非意在限制。以下实施例包括实际实施例和预言性实施例。
除非另行说明，温度为摄氏度，而压力等于或接近海拔约5,340英尺(1,628米)处的大气压。需要指出，在外部分析合成设施完成的工作不是在等于或接近海拔约5,340英尺(1,628米)的大气压下进行的。除非另行说明，所有试剂都通过商业途径获得。物种及其他系统发生鉴定根据微生物学领域技术人员已知的分类进行。
在此提供了主要生产商的名称及城市地址。此外，关于Qiagen的产品，Spin(“小量制备”)，目录号27106，用于质粒DNA纯化；而Gel Extraction Kit，目录号28706，用于如在此所述的凝胶提取。
实施例1
对宿主细胞的遗传修饰的普通实施例
本实施例旨在描述用以引入目的核苷酸序列的、选定微生物的遗传修饰的非限制性方法。在该普通实施例中提供了备选方案和变化方案。进行本实施例的方法以实现所需遗传修饰在选定的微生物种内的组合，例如本文中的章节描述的遗传修饰及他们的功能等同物例如在其他细菌及其他微生物种中功能等同物的组合。
在特定物种(例如本文所述的大肠杆菌)中鉴定目的基因或其他核酸序列片段，并获得包含该基因或片段的核酸序列。
基于在目的片段末端或与末端相邻的核酸序列，制备5’和3’核酸引物。每个引物设计为具有与该末端或相邻区域杂交的充分重叠部分。这样的引物可包括用于转座酶插入的限制酶切消化的酶识别位点，该酶切消化可用于随后的载体引入或基因组插入。这些位点通常设计成位于杂交重叠部分以外。已知有许多签约服务可根据订单制备引物序列(例如，Integrated DNA Technologies,Coralville,IA USA)。
一旦设计和制备好引物，就进行聚合酶链反应(PCR)以特异性扩增所需的目的片段。本方法导致自微生物基因组分离的多个拷贝的目的区域。微生物的DNA、引物以及嗜热聚合酶在缓冲溶液中与钾和二价阳离子(例如，Mg或Mn)以及足量的脱氧核苷三磷酸分子结合。该混合物暴露于标准温度升高与降低方案。然而，温度、成分、浓度以及循环时间可根据反应根据将要拷贝的序列的长度、退火温度近似值以及本领域技术人员已知的或通过常规实验容易了解的其他因素而改变。
在备选实施方案中，可合成目的片段，例如由商业供应商合成，并通过PCR制备，而不是从微生物或其他DNA天然来源获得。
随后纯化和分离核酸序列，例如通过电泳在琼脂糖胶上分离。任选地，一旦该区域被纯化就可通过标准DNA测序方法进行确认并可将其引入载体。可使用任意数量的载体，载体通常包含本领域技术人员所知的标记，且通常采用标准方法进行这种引入。常用的载体系统有pSMART(Lucigen,Middleton,WI)、pET大肠杆菌表达系统(Stratagene,La Jolla,CA)、pSC-B StrataClone载体(Stratagene,La Jolla,CA)、pRANGER-BTB载体(Lucigen,Middleton,WI)以及TOPO载体(Invitrogen Corp,Carlsbad,CA,USA)。类似地，随后将载体引入到任意数量的宿主细胞中。常用的宿主细胞为E.cloni 10G(Lucigen,Middleton,WI)、E.cloni 10GF’(Lucigen,Middleton,WI)、StrataClone感受态细胞(Stratagene,La Jolla,CA)、大肠杆菌BL21、大肠杆菌BW25113以及大肠杆菌K12MG1655。这些载体的一部分拥有启动子，例如诱导型启动子，该启动子邻近插入目的序列的区域(诸如插入多克隆位点)，而其他载体，例如pSMART载体(Lucigen,Middleton,WI)，不具有启动子但具有去磷酸化的平端。这样的负载质粒的细胞的培养允许质粒复制，从而允许目的片段复制，这通常对应于目的片段的表达。
各种载体系统包含选择性标记，例如编码在确定条件下生长或存活所需的蛋白质的可表达的基因。包含于骨架载体序列上的常见的选择性标记包括编码一种或多种抗生素抗性所需蛋白质的基因以及补充营养缺陷或供应特定培养基中不存在的或不可获得的关键营养物所需的基因。载体还包含适合于目的宿主细胞的复制系统。
随后可通过常规方法分离含有目的片段的质粒，并可用于引入其他目的微生物宿主细胞中。各种引入方法是本领域已知的，且可包括载体引入或基因组整合。在各种备选实施方案中，如果通过这种质粒以外的手段将目的DNA片段引入目的宿主细胞内，则可自其他质粒DNA分离该目的DNA片段。
尽管普通预言性实施例的步骤中涉及质粒的使用，但也可以替代地使用本领域所知的其他载体。这些载体包括粘粒、病毒(例如，噬菌体、动物病毒、植物病毒)以及人工染色体(例如，酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体(BAC))。
可以评估引入目的片段的宿主细胞在特定酶步骤和/或目的化学化合物的耐受性或生物生产方面的表现。可以选择表现更好的遗传修饰的宿主细胞，根据整体表现、耐受性或目的化合物的生产或累积进行选择。
应当指出，该程序可引入单基因(或其他目的核酸序列片段)或多基因(在分开的启动子或单一启动子的控制下)的核酸序列，并且可重复该程序以在表达载体中产生所需的异源核酸序列，然后将其提供给选定的微生物以便，例如，期望地为本文所公开的任一代谢途径补充酶转化步骤功能。然而，应当指出，尽管许多途径依赖于通过转录目的序列的全部或部分，随后翻译转录的mRNA以获得诸如酶的多肽而进行的表达，但某些目的序列可能会通过不同于这样的表达的手段发挥作用。
这些途径所用的特定实验室方法是本领域公知的，并且可在若干本领域技术人员所知的参考文献中找到，例如Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版2001(1-3卷),ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(下文称为Sambrook和Russell,2001)。
作为以上所述的备选，也可实行其他遗传修饰，例如宿主细胞基因组的核酸序列的缺失。实现此目的的一个非限制性方法是使用Red/ET重组，该方法是本领域普通技术人员所知的并且在授予Stewart等人的美国专利号6,355,412及6,509,156中描述，所述专利并入本文以参考其中对该方法的教导。用于该方法的材料与试剂盒可自Gene Bridges(Gene Bridges GmbH,Dresden,德国,<<www.genebridges.com>>)获得，并且可根据生产商的说明实施该方法。可实施基因组DNA的定向缺失以改变宿主细胞的新陈代谢，从而减少或消除不需要的代谢产物的产生。这可与如在本文的普通实施例中所述的其他遗传修饰结合使用。
实施例2
利用蔗糖作为原料用于生产脂肪酸和其他脂肪酸衍生产物
常用的实验室及工业大肠杆菌菌株，例如本文所述的菌株，不能利用蔗糖作为唯一的碳源，尽管在包括致病性大肠杆菌菌株在内的很多野生菌株中发现了这个性能。蔗糖以及诸如糖蜜之类的含有蔗糖的原料是丰富的，且常用作原料来通过微生物发酵生产有机酸、氨基酸、维生素及其他产物。因此，能够利用蔗糖的脂肪酰辅酶A生产菌株的进一步衍生物能够扩展可用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的原料的范围。
许多蔗糖摄取及代谢系统是本领域公知的(例如，美国专利号6,960,455)，该专利并入本文以参考这些教导。我们描述了含有提供通过非磷酸转移酶系统利用蔗糖的能力的csc基因的大肠杆菌菌株的构建，其中csc基因由编码蔗糖水解酶的cscA、编码蔗糖通透酶的cscB、编码果糖激酶的cscK以及编码阻抑物的cscR构成。这些基因的序列以登录号X81461AF473544标注在NCBI数据库中。为了应用大肠杆菌基因中高度富含的密码子进行高效表达，使用商业合成DNA提供商(DNA 2.0,Menlo Park,CA)的服务设计及合成含有cscB、cscK和cscA的操纵子。这些基因的氨基酸序列分别显示为：cscB–SEQ.ID.No.014；cscK-SEQ.ID.No.015；cscA-SEQ.ID.No.16。合成操纵子由紧接aldA基因5'侧(上游)的大肠杆菌基因组区域的60个碱基对，驱动csc基因表达的共有强启动子，具有包含核糖体结合位点但不含启动子的短基因间区的cscB、cscK和cscA编码区，和紧接aldA基因3'侧(下游)的60bp组成。与aldA基因侧翼的序列同源的片段用于靶向csc操纵子基因向大肠杆菌染色体内的插入，同时aldA缺失。合成的csc操纵子构建于质粒pJ214(DNA 2.0,Menlo Park,CA)中，该质粒提供来自质粒p15A的复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的基因。用上述质粒pTrc_kan_mcr或其他合适的质粒同时转化合适的宿主细胞，例如大肠杆菌菌株BX_595，并且在含有氨苄青霉素及卡那霉素的LB培养基板上选择转化的菌株。使携带两种质粒的转化体生长，并且除了用等浓度的蔗糖替代该培养基中的葡萄糖外，如在其他部分所述对摇瓶中脂肪酸或脂肪酸衍生产物的生产进行评估。
提供使大肠杆菌能够利用蔗糖的功能的基因也可以从天然分离株pUR400(Cowan,P.J.等.J.Bacteriol.173:7464-7470,1991)获得，pUR400携带磷酸烯醇丙酮酸依赖的碳水化合物摄取磷酸转移酶系统(PTS)的基因。这些基因由编码PTS转运复合物的酶II成分的scrA、编码蔗糖-6磷酸水解酶的scrB、编码果糖激酶的scrK以及编码孔蛋白的scrY组成。可如上所述分离或合成这些基因，将其引入质粒上，并与其他合适的质粒同时转化到合适的宿主细胞，例如大肠杆菌菌株BX_845(表3.1)，并在含有合适的抗生素的LB培养基板上选择转化的菌株。使携带两种质粒的转化体生长，并且除了用等浓度的蔗糖替代SM3培养基中的葡萄糖外，对摇瓶中的脂肪酸生产进行评估。
实施例3
脂肪酸生产菌株的构建和评估
产生包含在此描述的各种遗传元件的组合(添加、缺失及修饰)的其他菌株，评估并用于脂肪酸生产，包括商业规模生产。以下2表说明了许多这样的菌株。表3.1提供了大肠杆菌的几种遗传修饰宿主菌株的亲本基因型，而表3.2提供了特异性遗传修饰的脂肪酸生产菌株的基因型，包括引入质粒中用于基因过表达的那些。所有下述菌株均通过如在共同方法部分中描述的用于质粒构建和染色体修饰的标准方法构建。BW25113的基因型是F-,Δ(araD-araB)567,ΔlacZ4787(::rrnB-3),LAM-,rph-1,Δ(rhaD-rhaB)568,hsdR514。
表3.1：菌株
Lpd*和coaA*表示lpd和coaA基因产物的反馈抗性变体。
表3.2：游离脂肪酸生产菌株
实施例4
经由脂肪酸合成抑制，用以提高丙二酰辅酶A依赖性产物的产量的遗传修饰
脂肪酸合成的抑制可以导致丙二酰辅酶A生产的反馈抑制的去除，导致增加的胞内丙二酰辅酶A集合和提高的由中间体丙二酰辅酶A形成产物的速率。(见例如，英国专利号GB2473755，国际专利申请号PCT/US2010/050436、PCT/US2011/022790，其通过引用并入本文)丙二酰辅酶A衍生产物的生产的一个非限制性实例如下：表3.1中所列出的任意菌株可以用编码1,3,6,8-四羟基萘(THN)合酶的可控表达的载体转化。这可以通过ptrc_THNS质粒(SEQ ID NO.018)的转化来实现。然后在摇瓶中针对THN或其紫色氧化衍生物淡黄霉素的产生评价这些菌株。简言之，过夜起子培养物(starter culture)可以在包含合适的抗生素的50mL Terrific液体培养基(TB)中制备并在30℃下温育16-24小时，同时在225rpm下摇动。这些培养物可用来接种各菌株在SM11基本培养基中的150mL培养物至D600为0.8，剩下5％TB培养物作为起始接种物，和抗生素。在2小时后，可以向各烧瓶中添加IPTG至0.5mM IPTG的最终浓度。所述培养物可在30℃下生长大约另外2h至D600为1.8-2.0，在2h后将细胞转换至37℃并监测THN或淡黄霉素(紫色产物)的形成达72小时。
实施例5
在遗传修饰的大肠杆菌-1中通过硫解酶经丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A的脂肪酸生产
根据在共同方法部分中描述的本领域中公知的方法构建遗传修饰的大肠杆菌菌株。其基因型在表3.1和3.2中给出的这些菌株在以下表5.1和5.2中列出。包括测量的时间点、浓度(效价g/L)在内的结果在表5.1和5.2中给出。根据在共同方法部分中描述的一个或多个摇瓶生产规程对菌株进行评价。在生产开始后24、48和或72小时采集液体培养基样品并评价链长为4至18的游离脂肪酸的产生。在表5.1中，显示了规程的比较，其中摇瓶的温度在30℃下保持恒定或根据规程转换至37℃。这使得能够评价正常丙二酰-ACP依赖性脂肪酸合成的抑制的效果，以及增加的丙二酰辅酶A集合。(参见实施例4)在表5.2中，评价了另外几种菌株，以便更好地确定对提高的脂肪酸产量的遗传要求。
表5.1针对FFA>C4的生产对温度变化的评价
表5.2：针对FFA>C4的生产对遗传要求的评价
实施例6
在遗传修饰的大肠杆菌-1中通过合酶经丙二酰辅酶A的脂肪酸生产
构建遗传修饰的大肠杆菌菌株。构建若干个这样的菌株以评价酮脂肪酰辅酶A合酶或延长酶对于游离脂肪酸生产的应用。在该实施例中使用的特定延长酶ELO1来自布氏锥虫(Trypanosoma brucei)，一种真核人类寄生虫(Lee等,Cell 126,691-699,2006)。ELO1(布氏锥虫)在大肠杆菌中成功地异源表达。使用GenScript(Piscataway,NJ)合成重组ELO1基因。合成的DNA是基于公开的基因序列(登录号XM_840948)并针对在大肠杆菌中的表达而进行密码子优化。然后将合成ELO1基因亚克隆到质粒pET28b(Novagen,SEQ ID 001)中，生成SEQ ID 005。由携带ELO1的大肠杆菌菌株在如方法5中所述的条件下制备的总膜级分显示将丙二酰辅酶A与辛酰辅酶A缩合并产生β-酮-癸酰辅酶A。基于丙二酰辅酶A的消耗，估计ELO1比活性为3.4nmol/min-mg膜蛋白质。同时，由不含ELO1的大肠杆菌菌株制备的总膜级分既没有消耗任何丙二酰辅酶A也没有产生β-酮-癸酰辅酶A。数据示于图4中。构建若干菌株以评价ELO1活性对游离脂肪酸生产的效果。其基因型在表3.1和3.2中给出的这些菌株在以下表6.1中列出。根据在共同方法部分中描述的一种或多种摇瓶生产规程对菌株进行评价。取液体培养基样品并评价链长为4至18的游离脂肪酸的产生。包括所产生的特定链长脂肪酸的浓度(效价g/L)以及百分比在内的结果在表6.1中给出。这些数据还包括FFA积聚(C6-C18:1)速率，其基于4个数据点(0、24、48和72h)。
表6.1：ELO1依赖性脂肪酸生产
实施例7
在遗传修饰的微生物中通过硫解酶经丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A的脂肪酸生产
本发明的遗传修饰的微生物可以是例如枯草杆菌、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)(先前称为真养罗尔斯通菌(Ralstonia eutropha)或真养产碱杆菌)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)或恶臭假单胞菌。这类微生物可以用作细菌宿主，其可经遗传修饰以产生游离脂肪酸。此外，酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)、黑曲霉(Aspergillus niger)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)是示例性的酵母或真菌，它们可以是本发明的遗传修饰的微生物并可以经构建以产生游离脂肪酸。编码ELO1、nphT7、hbd、crt和/或ter的异源基因可以通过重组到染色体中或作为自复制质粒或附加型元件被引入这些宿主中。可以使用类似的方法将可替代的合酶、硫解酶、3-酮-酰基辅酶A还原酶、3-羟基-酰基辅酶A脱水酶和/或烯酰辅酶A还原酶引入这些宿主中。可以使用在特定宿主中被优先利用的密码子来合成设计用于异源表达的基因，以提高表达效率。为最大化通过丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A的脂肪酸的生产，设想在宿主中的一定的基因变化。这些包括通过提高乙酰辅酶A羧化酶的活性以及通过降低竞争途径如酰基载体蛋白(ACP)依赖性脂肪酸合成(FAS)途径的活性来提高丙二酰辅酶A的可用性。条件性降低FAS途径的活性可以使用温度敏感性等位基因和提高生长温度、使用化学抑制剂或通过调节FAS基因的表达来实现。另外有益的是消除酰基辅酶A硫酯酶对短链底物如丁酰辅酶A的活性。这可以通过特定硫酯酶基因的缺失在遗传修饰的生产宿主中实现，该硫酯酶基因根据例如与大肠杆菌tesB基因产物的同源性，或通过对宿主菌株裂解产物中硫酯酶活性的酶试验、硫酯酶纯化和使用例如质谱法对多肽的表征来鉴定。此外，游离脂肪酸的再消耗的消除，例如通过β-氧化途径所导致的，会阻止游离脂肪酸产物的降解并会最大化产物的形成。这可以通过消除特定脂肪酸摄取和降解功能在遗传修饰的生产宿主中实现。
实施例8
在遗传修饰的大肠杆菌-1中通过丙二酰辅酶A的丁酸酯生产
根据在共同方法部分中描述的本领域公知的方法构建遗传修饰的大肠杆菌菌株。其基因型在表3.1和3.2中给出的这些菌株在以下表8.1中列出。根据在共同方法部分中描述的一个或多个摇瓶生产规程对菌株进行评价。在生产开始后24小时取液体培养基样品并评价链长为4至18的、包括丁酸在内的游离脂肪酸的生产。包括所产生的特定链长脂肪酸的浓度(效价g/L)以及百分比在内的结果在表8.1中给出。
表8.1丁酸生产
菌株 摇瓶方法 时间(h) C4(g/L) ％C4
BXF_037 3 24 1.65±0.174 84％
BXF_029 1 24 1.41±0.0794 89％
BXF_031 4 24 1.24±0.0304 65％
BXF_028 1 24 1.22±0.0954 89％
BXF_015 2 24 0.99±0.0309 79％
BXF_011 2 24 0.85±0.0152 80％
BXF_018 2 24 0.68±0.046 87％
BXF_020 1 24 0.68±0.073 61％
菌株 摇瓶方法 时间(h) C4(g/L) ％C4
BXF_011 4 24 0.66±0.044 59％
BXF_027 1 24 0.56±0.070 80％
BXF_014 1 24 0.41±0.036 83％
BXF_019 2 24 0.40±0.040 74％
BXF_015 1 24 0.34±0.163 46％
BXF_024 1 24 0.26±0.046 42％
BXF_021 1 24 0.22±0.006 38％
BXF_030 1 24 0.21 33％
BXF_011 3 24 0.20±0.031 11％
BXF_031 3 24 0.19±0.060 10％
BXF_015 3 24 0.17±0.015 18％
BXF_013 1 24 0.00±0 0.00
BXF_036 3 24 0.00±0 0.00
BXF_012 3 24 0.00±0 0.00
BXF_035 4 24 0.00±0 0.00
BXF_035 3 24 0.00±0 0.00
实施例9
在遗传修饰的大肠杆菌-1中通过丙二酰辅酶A的己酸生产
根据在共同方法部分中描述的本领域公知的方法构建遗传修饰的大肠杆菌菌株。其基因型在表3.1和3.2中给出的这些菌株在以下表9.1中列出。根据在共同方法部分中描述的一个或多个摇瓶生产规程对菌株进行评价。在生产开始后24小时取液体培养基样品并评价链长为4至18的、包括丁酸在内的游离脂肪酸的生产。包括所产生的特定链长脂肪酸的浓度(效价g/L)以及百分比在内的结果在表9.1中给出。
表9.1：己酸生产
实施例10
在遗传修饰的大肠杆菌-1中通过丙二酰辅酶A的辛酸生产
根据在共同方法部分中描述的本领域公知的方法构建遗传修饰的大肠杆菌菌株。其基因型在表3.1和3.2中给出的这些菌株在以下表10.1中列出。根据在共同方法部分中描述的一个或多个摇瓶生产规程对菌株进行评价。取液体培养基样品并评价链长为4至18的、包括丁酸在内的游离脂肪酸的生产。包括所产生的特定链长脂肪酸的浓度(效价g/L)以及百分比在内的结果在表10.1中给出。
表10.1：辛酸生产
菌株 摇瓶方法 时间(h) C8(g/L) ％C8
BXF_018 2 96 0.050±0.011 19.12％
BXF_019 2 96 0.067±0.027 10.19％
BXF_015 2 96 0.021±0.003 1.17％
BXF_011 2 96 0.019±0.004 2.71％
BXF_013 1 96 N.D N.D
BXF_014 1 96 N.D N.D
BXF_015 1 96 N.D N.D
BXF_020 1 96 N.D N.D
BXF_021 1 96 N.D N.D
BXF_024 1 96 N.D N.D
BXF_027 1 96 N.D N.D
BXF_028 1 96 N.D N.D
BXF_029 1 96 N.D N.D
BXF_030 1 96 N.D N.D
BXF_031 3 96 N.D N.D
BXF_036 3 96 N.D N.D
BXF_037 3 96 N.D N.D
BXF-011 4 96 N.D N.D
BXF-011 3 96 N.D N.D
菌株 摇瓶方法 时间(h) C8(g/L) ％C8
BXF-012 3 96 N.D N.D
BXF-015 3 96 N.D N.D
BXF-031 4 96 N.D N.D
BXF-035 4 96 N.D N.D
BXF-035 3 96 N.D N.D
(N.D.–未确定)
实施例11
在遗传修饰的大肠杆菌-1中通过丙二酰辅酶A的十二烷酸(C12脂肪酸)生产
根据在共同方法部分中描述的本领域公知的方法构建遗传修饰的大肠杆菌菌株。其基因型在表3.1和3.2中给出的这些菌株在以下表11.1中列出。根据在共同方法部分中描述的一个或多个摇瓶生产规程对菌株进行评价。取液体培养基样品并评价链长为4至18的游离脂肪酸的生产。包括所产生的特定链长脂肪酸的浓度(效价g/L)以及百分比在内的结果在表11.1中给出。
表11.1：在大肠杆菌中的十二烷酸生产
菌株 摇瓶方法 时间点(h) C12(g/L) ％C12
BXF-011 3 48 0.108±0.004 3.10％
BXF_031 3 48 0.093±0.001 2.88％
BXF_015 3 48 0.038±0.006 3.10％
BXF_031 4 48 0.038±0.002 1.70％
BXF_011 2 48 0.029±0.001 1.92％
BXF_011 4 48 0.029±0.001 1.78％
BXF_030 1 48 0.028±0.002 2.16％
BXF_024 1 48 0.024±0.014 1.82％
BXF_015 1 48 0.023±0.012 1.79％
BXF_015 2 48 0.021±0.002 1.37％
菌株 摇瓶方法 时间点(h) C12(g/L) ％C12
BXF_020 1 48 0.017±0.002 1.24％
BXF_012 3 48 0.013±0.001 5.05％
BXF_035 4 48 0.013±0.001 3.82％
BXF_037 3 48 0.011±0.001 1.89％
BXF_035 3 48 0.011±0.001 3.82％
BXF_021 1 48 0.011±0.001 1.39％
BXF_019 2 48 0.010±0 1.07％
BXF_036 3 48 0.010±0 3.83％
BXF_027 1 48 0.006±0 0.53％
BXF_028 1 48 0.006±0 0.41％
BXF_029 1 48 0.006±0 0.36％
BXF_013 1 48 0.002±0.003 0.75％
BXF_014 1 48 0.000±0 0.00％
BXF_018 2 48 0.000±0 0.00％
实施例12
在遗传修饰的大肠杆菌-1中通过丙二酰辅酶A的肉豆蔻酸(C14脂肪酸)生产
根据在共同方法部分中描述的本领域公知的方法构建遗传修饰的大肠杆菌菌株。其基因型在表3.1和3.2中给出的这些菌株在以下表12.1中列出。根据在共同方法部分中描述的一个或多个摇瓶生产规程对菌株进行评价。取液体培养基样品并评价链长为4至18的、包括丁酸在内的游离脂肪酸的生产。包括所产生的特定链长脂肪酸的浓度(效价g/L)以及百分比在内的结果在表12.1中给出。
表12.1：在大肠杆菌中的肉豆蔻酸生产
菌株 摇瓶方法 时间点(h) C14(g/L) ％C14
BXF_011 3 72 1.704±0.064 35.45％
BXF_031 3 72 1.679±0.196 35.77％
菌株 摇瓶方法 时间点(h) C14(g/L) ％C14
BXF_015 1 72 0.500±0.039 28.35％
BXF_024 1 72 0.497±0.034 25.99％
BXF_030 1 72 0.477±0.032 23.28％
BXF_015 3 72 0.430±0.019 31.81％
BXF_011 4 72 0.315±0.025 11.97％
BXF_031 4 72 0.306±0.014 11.58％
BXF_037 3 72 0.058±0.002 8.09％
BXF_027 1 72 0.048±0.002 3.70％
BXF_035 3 72 0.047±0.001 16.05％
BXF_035 4 72 0.039±0.001 10.77％
BXF_029 1 72 0.037±0.006 1.98％
BXF_028 1 72 0.035±0.002 2.09％
BXF_036 3 72 0.032±0.009 9.38％
BXF_012 3 72 0.030±0.003 11.44％
BXF_011 2 72 N.D. N.D.
BXF_013 1 72 N.D. N.D.
BXF_014 1 72 N.D. N.D.
BXF_015 2 72 N.D. N.D.
BXF_018 2 72 N.D. N.D.
BXF_019 2 72 N.D. N.D.
BXF_020 1 72 N.D. N.D.
BXF_021 1 72 N.D. N.D.
N.D.–未确定
实施例13
在遗传修饰的大肠杆菌-1中通过丙二酰辅酶A的棕榈酸(C16:0脂肪酸)生产
根据在共同方法部分中描述的本领域公知的方法构建遗传修饰的大肠杆菌菌株。其基因型在表3.1和3.2中给出的这些菌株在以下表13.1中列出。根据在共同方法部分中描述的一个或多个摇瓶生产规程对菌株进行评价。取液体培养基样品并评价链长为4至18的、包括丁酸在内的游离脂肪酸的生产。包括所产生的特定链长脂肪酸的浓度(效价g/L)以及百分比在内的结果在表13.1中给出。
表13.1：在大肠杆菌中的棕榈酸生产
菌株 摇瓶方法 时间点(h) C16(g/L) ％C16
BXF_011 3 72 0.729±0.044 15.16％
BXF_031 3 72 0.717±0.046 15.33％
BXF_024 1 72 0.300±0.025 15.67％
BXF_015 3 72 0.294±0.014 21.74％
BXF_015 1 72 0.283±0.032 15.99％
BXF_030 1 72 0.269±0.005 13.21％
BXF_011 4 72 0.259±0.014 9.87％
BXF_031 4 72 0.211±0.01 8.00％
BXF_035 4 72 0.187±0.006 51.96％
BXF_035 3 72 0.177±0.003 61.01％
BXF_036 3 72 0.175±0.051 51.35％
BXF_012 3 72 0.125±0.02 47.41％
BXF_027 1 72 0.118±0.006 9.08％
BXF_028 1 72 0.088±0.026 5.20％
BXF_029 1 72 0.087±0.02 4.64％
BXF_037 3 72 0.069±0.001 9.57％
BXF_011 2 72 N.D N.D
BXF_013 1 72 N.D N.D
BXF_014 1 72 N.D N.D
BXF_015 2 72 N.D N.D
BXF_018 2 72 N.D N.D
BXF_019 2 72 N.D N.D
菌株 摇瓶方法 时间点(h) C16(g/L) ％C16
BXF_020 1 72 N.D N.D
BXF_021 1 72 N.D N.D
N.D.–未确定
实施例14
在遗传修饰的大肠杆菌-1中通过丙二酰辅酶A的棕榈油酸(C16:1脂肪酸)生产
根据在共同方法部分中描述的本领域公知的方法构建遗传修饰的大肠杆菌菌株。其基因型在表3.1和3.2中给出的这些菌株在以下表14.1中列出。根据在共同方法部分中描述的一个或多个摇瓶生产规程对菌株进行评价。取液体培养基样品并评价链长为4至18的、包括丁酸在内的游离脂肪酸的生产。包括所产生的特定链长脂肪酸的浓度(效价g/L)以及百分比在内的结果在表14.1中给出。
表14.1：在大肠杆菌中的棕榈油酸生产
菌株 摇瓶方法 时间点(h) C16:1(g/L) ％C16:1
BXF_011 3 72 1.059±0.026 22.04％
BXF_031 3 72 1.034±0.102 22.06％
BXF_011 4 72 0.329±0.03 12.53％
BXF_030 1 72 0.251±0.019 12.33％
BXF_024 1 72 0.247±0.008 12.94％
BXF_015 3 72 0.247±0.035 18.14％
BXF_015 1 72 0.231±0.046 13.01％
BXF-031 4 72 0.181±0.012 6.84％
BXF_037 3 72 0.143±0.001 20.00％
BXF_029 1 72 0.084±0.005 4.55％
BXF_028 1 72 0.082±0.003 4.84％
BXF_036 3 72 0.054±0.016 15.80％
BXF_035 4 72 0.046±0.004 12.79％
BXF_012 3 72 0.022±0.002 8.41％
BXF_027 1 72 0.017±0.001 1.33％
BXF_035 3 72 0.012±0 4.13％
BXF_011 2 72 N.D N.D
BXF_013 1 72 N.D N.D
BXF_014 1 72 N.D N.D
菌株 摇瓶方法 时间点(h) C16:1(g/L) ％C16:1
BXF_015 2 72 N.D N.D
BXF_018 2 72 N.D N.D
BXF_019 2 72 N.D N.D
BXF_020 1 72 N.D N.D
BXF_021 1 72 N.D N.D
N.D.–未确定
实施例15
在遗传修饰的大肠杆菌-1中通过丙二酰辅酶A的油酸和硬脂酸(C18:1脂肪酸)生产
根据在共同方法部分中描述的本领域公知的方法构建遗传修饰的大肠杆菌菌株。其基因型在表3.1和3.2中给出的这些菌株在以下表15.1中列出。根据在共同方法部分中描述的一个或多个摇瓶生产规程对菌株进行评价。取液体培养基样品并评价链长为4至18的、包括丁酸在内的游离脂肪酸的生产。包括所产生的特定链长脂肪酸的浓度(效价g/L)以及百分比在内的结果在表15.1中给出。
表15.1：在大肠杆菌中的油酸生产
菌株 摇瓶方法 时间点(h) C18:1(g/L) ％C18:1
BXF_031 3 72 0.417±0.045 8.94％
BXF_011 3 72 0.408±0.026 8.48％
BXF_011 4 72 0.239±0.012 9.08％
BXF_031 4 72 0.178±0.002 6.74％
BXF_015 3 72 0.177±0.018 13.04％
BXF_024 1 72 0.113±0.006 5.89％
BXF_015 1 72 0.101±0.023 5.68％
BXF_030 1 72 0.094±0.01 4.65％
BXF_035 4 72 0.044±0.003 12.23％
BXF_029 1 72 0.031±0.006 1.65％
BXF_037 3 72 0.030±0.002 4.18％
BXF_036 3 72 0.029±0.006 8.49％
BXF_012 3 72 0.029±0.003 10.95％
BXF_028 1 72 0.028±0.002 1.65％
BXF_035 3 72 0.028±0 9.64％
BXF_027 1 72 0.027±0.001 2.10％
BXF_011 2 72 N.D. N.D.
BXF_013 1 72 N.D. N.D.
菌株 摇瓶方法 时间点(h) C18:1(g/L) ％C18:1
BXF_014 1 72 N.D. N.D.
BXF_015 2 72 N.D. N.D.
BXF_018 2 72 N.D. N.D.
BXF_019 2 72 N.D. N.D.
BXF_020 1 72 N.D. N.D.
BXF_021 1 72 N.D. N.D.
N.D.–未确定
实施例16
改变在遗传修饰的大肠杆菌-1中的脂肪酸生产的链长特异性
游离脂肪酸产物链长的分布取决于合成和释放活性的组合。合成活性例如由延长酶催化的合成活性具有产物链长偏好，使得布氏锥虫ELO1产生C10辅酶A产物而EOL2产生C14辅酶A产物(Lee等,2006；Cell 126:691-699；Denic和Weissman,2007,Cell 130:663-677)。ELO1反应的直接产物是3-酮-己酰辅酶A。酮-酰基辅酶A还原酶(KCR)、3-羟基-酰基辅酶A脱水酶(3HDh)和烯酰辅酶A还原酶(ECR)的相继作用产生己酰辅酶A，其用作随后从丙二酰辅酶A延长2-碳单元的引发物。这些活性的链长特异性还决定了最终产物的分布，并可以工程化以优先产生所需和特定链长的产物。
硫酯酶催化酰基辅酶A或酰基-ACP分别水解为游离脂肪酸和辅酶A或ACP，由此释放游离脂肪酸产物。来自各种来源的大量硫酯酶是已知的，并且它们对酰基-ACP底物的链长特异性已经记录(例如，Jing等.2011,BMC Biochemistry 12:1-16)。我们已经表达和测定了一些硫酯酶，以确定它们对酰基辅酶A底物的链长特异性。如在共同方法中所述，通过在大肠杆菌中表达这些蛋白质来确定硫酯酶的活性和对这些蛋白质的链长偏好。通过挤出细胞通过微流化器来制备裂解产物，并且使用G-25自旋柱(GE 27-5325-01)将裂解产物脱盐。200-μl测定液含有7mM磷酸钾，pH 8.0，20％(v/v)甘油，0.04％Triton X100，0.10mM DTNB(5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)，Sigma D8130，25mM，在ETOH中)，0.40mM酰基辅酶A底物，并且通过添加G-25纯化的裂解产物来启动反应。在412nm下动力学监测5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)产物的形成，结果列表显示在表16.1中。
表16.1：硫酯酶在裂解产物中的比活性(U/mg)
如在表16.1中所示，这些硫酯酶显示出不同的和显著的链长偏好。AtTE偏好以C8-辅酶A起始的短链酰基辅酶A底物，而可溶的'tesA对C12及更长的底物更具活性。可以以类似的方式评价另外的硫酯酶基因和基因产物。潜在的基因包括来自美洲榆(Ulmus Americana)(AAB71731)、植物乳杆菌(CAD63310)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)(ABJ63754)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)(ABG82470)、铜绿假单胞菌(PA2801)等的硫酯酶。可以通过应用蛋白质工程或定向进化技术产生对特定链长具有更高偏好的变体来改变对酰基辅酶A的链长特异性。例如，可以对编码硫酯酶的基因进行改组(Stemmer,1994,Proc.Natl.Acad.,Sci.USA91:10747-10751)以生成变体文库。对特定链长酰基辅酶A具有提高活性的变体的分离通过筛选来实现，该筛选针对于对该特定链长酰基辅酶A的活性以及针对于对不期望链长的酰基辅酶A的降低的活性。
实施例17
脂肪酸或脂肪酸衍生产物在地衣芽孢杆菌中的生物生产的改善
在枯草芽孢杆菌中复制的大多数质粒和穿梭载体用于通过原生质体转化或电穿孔转化地衣芽孢杆菌。将游离脂肪酸生物合成所需的核酸序列从各种来源中分离，视情况进行密码子优化，并克隆到质粒pBE20或pBE60衍生物中(Nagarajan等,Gene 114:121-126(1992))。转化地衣芽孢杆菌的方法是本领域已知的(例如，参见Fleming等.Appl.Environ.Microbiol.,61(11):3775-3780(1995))。这些出版的资源并入本文以参考其中相应的教导和组成。将为了在枯草芽孢杆菌中表达异源酶而构建的质粒转化到地衣芽孢杆菌中以产生重组微生物，其然后显示出脂肪酸或脂肪酸衍生产物生产的改善。
实施例18
脂肪酸或脂肪酸衍生产物在浸麻类芽孢杆菌中的生物生产的改善
如本文所述构建质粒以供在枯草芽孢杆菌中表达异源酶以及用于通过原生质体转化来转化浸麻类芽孢杆菌以产生重组微生物，其显示出脂肪酸或脂肪酸衍生产物生产的改善。
实施例19
脂肪酸或脂肪酸衍生产物在真养产碱杆菌(罗尔斯通菌)(目前称为钩虫贪铜菌)中的生物生产的改善
在真养产碱杆菌中进行基因表达以及创建突变的方法是本领域公知的(例如，参见Taghavi等,Appl.Environ.Microbiol.,60(10):3585-3591(1994))。该出版的资源并入本文以参考其中相应的教导和组成。将经鉴定能改善脂肪酸生物合成的任意核酸序列从各种来源中分离，视情况进行密码子优化，并克隆到本文所述的任意宽宿主范围载体中，并进行电穿孔以产生重组微生物，其显示出脂肪酸或脂肪酸衍生产物生产的改善。重要的是，使用钩虫贪铜菌菌株，可以由二氧化碳和氢作为唯一的碳源和还原等同物来产生脂肪酸或脂肪酸衍生产物，因为该微生物能够化能无机自养地生长。
实施例20
脂肪酸或脂肪酸衍生产物在恶臭假单胞菌中的生物生产的改善
在恶臭假单胞菌中进行基因表达的方法在本领域中是公知的。(参见例如Ben-Bassat等人的美国专利6,586,229，其并入本文以参考这些教导)。将经鉴定能改善脂肪酸或脂肪酸衍生产物生物合成的任意核酸序列从各种来源中分离，视情况进行密码子优化，并克隆到本文所述的任意宽宿主范围载体中，并进行电穿孔以产生重组微生物，其显示出脂肪酸或脂肪酸衍生产物的生物合成生产。例如，将这些核酸序列插入到pUCP18中，并将此连接的DNA电穿孔到电感受态恶臭假单胞菌KT2440细胞中以产生重组恶臭假单胞菌微生物，其显示出增加的脂肪酸或脂肪酸衍生产物形成。
实施例21
脂肪酸或脂肪酸衍生产物在植物乳杆菌中的生物生产的改善
乳杆菌属属于乳杆菌目家族，并且许多在枯草芽孢杆菌和链球菌属的转化中使用的质粒和载体可用于乳杆菌属。合适的载体的非限制性实例包括pAMβ1及其衍生物(Renault等,Gene 183:175-182(1996)；以及O'Sullivan等,Gene 137:227-231(1993))；pMBB1和pMBB1的衍生物pHW800(Wyckoff等,Appl.Environ.Microbiol62:1481-1486(1996))；pMG1，一种接合质粒(Tanimoto等,J.Bacteriol.184:5800-5804(2002))；pNZ9520(Kleerebezem等,Appl.Environ.Microbiol.63:4581-4584(1997))；pAM401(Fujimoto等,Appl.Environ.Microbiol.67:1262-1267(2001))以及pAT392(Arthur等,Antimicrob.Agents Chemother.38:1899-1903(1994))。也已报告了几种来自植物乳杆菌的质粒(例如，van Kranenburg R,Golic N,Bongers R,Leer R J,deVos W M,Siezen R J,Kleerebezem M.Appl.Environ.Microbiol.2005March；71(3):1223-1230)。将经鉴定能改善脂肪酸或脂肪酸衍生产物生物合成的任意核酸序列从各种来源中分离，视情况进行密码子优化，并克隆到本文所述的任意载体中，并引入以生成重组微生物，其显示出脂肪酸或脂肪酸衍生产物的生物合成生产。
实施例22
脂肪醇的生产
通过表达编码将脂肪酰辅酶A或游离脂肪酸转化为脂肪醇的酶的基因，制备脂肪酸的生产菌株还可用于生产脂肪醇。这些酶的例子包括形成醇的酰基辅酶A还原酶(EC 1.2.1.-)，或长链脂肪酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.50)+醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)，或醛脱氢酶(EC 1.2.1.-)与醇脱氢酶的组合。具有脂肪酰辅酶A还原酶活性的多肽由登录号为YP_047869的不动杆菌SP.ADP1的fabG基因提供。具有脂肪酰还原酶活性的多肽由登录号为BAC79425的家蚕FAR-N_SDR_e基因提供。具有醛脱氢酶活性的多肽由登录号为YP_001125970的嗜热脱氮地芽孢杆菌NG80-2的ALDH基因提供。具有醇脱氢酶的多肽由登录号为AP_003562.1的大肠杆菌的yqhD基因提供。这些活性的另外来源是本领域已知的，并可以组合以产生用于生产脂肪醇的生产菌株。
IV.共同方法部分
本部分的所有方法都为了并入引用该部分的实施例中而提供。子部分A.微生物物种和菌株、培养物及生长培养基
可在需要时使用的细菌种类如下：
醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)(DSMZ#1139)作为真空干燥培养物从德国微生物与细胞培养物保藏中心(GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures)(Braunschweig,德国)获得。随后将培养物重悬浮于脑心浸液(BHI)培养液(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中。重悬浮的醋酸钙不动杆菌培养物在BHI中进行连续稀释，并在需氧条件下于37℃、250rpm下生长48小时直至饱和。
枯草芽孢杆菌由Gill实验室(科罗拉多大学Boulder分校)惠赠，并作为活跃生长培养物获得。活跃生长的枯草芽孢杆菌培养物在LB(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中进行连续稀释，并在需氧条件下于37℃、250rpm下生长24小时直至饱和。
泥生绿菌(Chlorobium limicola)(DSMZ#245)作为真空干燥培养物从德国微生物与细胞培养物保藏中心(Braunschweig,德国)获得。随后利用Pfennig介质I和II(#28和29)如DSMZ说明所述重悬浮该培养物。泥生绿菌在恒定涡旋下在25℃下生长。
布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)(DSMZ#30040)作为真空干燥培养物从德国微生物与细胞培养物保藏中心(Braunschweig,德国)获得。随后将培养物重悬浮在脑心浸液(BHI)培养液(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)。重悬浮的布氏柠檬酸杆菌培养物在BHI中进行连续稀释，并在需氧条件下于30℃、250rpm下生长48小时直至饱和。
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(DSMZ#792)作为真空干燥培养物从德国微生物与细胞培养物保藏中心(Braunschweig,德国)获得。随后如DSMZ说明所述将培养物重悬浮在丙酮丁醇梭菌培养基(#411)中。丙酮丁醇梭菌在厌氧条件下于37℃、250rpm下生长直至饱和。
氨基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)(DSMZ#2634)作为真空干燥培养物从德国微生物与细胞培养物保藏中心(Braunschweig,德国)获得。随后如DSMZ说明所述将培养物重悬浮在氨基丁酸梭菌培养基(#286)中。氨基丁酸梭菌在厌氧条件下于37℃、250rpm下生长直至饱和。
科氏梭菌(Clostridium kluyveri)(DSMZ#555)作为活跃生长的培养物从德国微生物与细胞培养物保藏中心(Braunschweig,德国)获得。如DSMZ说明所述，科氏梭菌培养物在科氏梭菌培养基(#286)中进行连续稀释。科氏梭菌培养物在厌氧条件下于37℃、250rpm下生长直至饱和。
耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)(DMSZ#2839)作为真空干燥培养物从德国微生物与细胞培养物保藏中心(Braunschweig,德国)获得。随后将培养物重悬浮在脑心浸液(BHI)培养液(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中。重悬浮的耐金属贪铜菌培养物在BHI中进行连续稀释，并在需氧条件下于30℃、250rpm下生长48小时直至饱和。
钩虫贪铜菌(DSMZ#428)作为真空干燥培养物从德国微生物与细胞培养物保藏中心(Braunschweig,德国)获得。随后将培养物重悬浮在脑心浸液(BHI)培养液(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中。重悬浮的钩虫贪铜菌培养物在BHI中进行连续稀释，并在需氧条件下于30℃、250rpm下生长48小时直至饱和。如其他部分所述，该物种的曾用名为真养产碱杆菌和富养罗尔斯通氏菌。
食果糖脱硫弧菌(Desulfovibrio fructosovorans)(DSMZ#3604)作为真空干燥培养物从德国微生物与细胞培养物保藏中心(Braunschweig,德国)获得。随后如DSMZ说明所述将培养物重悬浮在食果糖脱硫弧菌培养基(#63)中。食果糖脱硫弧菌在厌氧条件下于37℃、250rpm下生长直至饱和。
大肠杆菌Crooks(DSMZ#1576)作为真空干燥培养物从德国微生物与细胞培养物保藏中心(Braunschweig,德国)获得。随后将培养物重悬浮在脑心浸液(BHI)培养液(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中。重悬浮的大肠杆菌Crooks培养物在BHI中进行连续稀释，并在需氧条件下于37℃、250rpm下生长48小时直至饱和。
大肠杆菌K12由Gill实验室(科罗拉多大学Boulder分校)惠赠，并作为活跃生长的培养物获得。活跃生长的大肠杆菌K12培养物在LB(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中进行连续稀释，并在需氧条件下于37℃、250rpm下生长24小时直至饱和。
盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarum)(DSMZ#1576)作为真空干燥培养物从德国微生物与细胞培养物保藏中心(Braunschweig,德国)获得。随后如DSMZ说明所述将培养物重悬浮在盐杆菌培养基中(#97)。盐沼盐杆菌在需氧条件下于37℃、250rpm下生长直至饱和。
德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)(#4335)作为活跃生长的培养物从WYEAST USA(Odell,OR,USA)获得。活跃生长的德氏乳杆菌培养物系列在脑心浸液(BHI)培养液(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中进行连续稀释，并在需氧条件下于30℃、250rpm下生长24小时直至饱和。
勤奋生金球菌(Metallosphaera sedula)(DSMZ#5348)作为活跃生长的培养物从德国微生物与细胞培养物保藏中心(Braunschweig,德国)获得。如DSMZ说明所述，勤奋生金球菌培养物在生金球菌培养基(#485)中进行连续稀释。勤奋生金球菌在需氧条件下于65℃、250rpm下生长直至饱和。
费氏丙酸杆菌舍氏亚种(Propionibacterium freudenreichii subsp.shermanii)(DSMZ#4902)作为真空干燥培养物从德国微生物与细胞培养物保藏中心(Braunschweig,德国)获得。随后如DSMZ说明所述将培养物重悬浮于PYG-medium(#104)中。费氏丙酸杆菌舍氏亚种在厌氧条件下于30℃、250rpm下生长直至饱和。
恶臭假单胞菌由Gill实验室(科罗拉多大学Boulder分校)惠赠，且作为活跃生长的培养物获得。活跃生长的恶臭假单胞菌培养物在Luria Broth(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中进行连续稀释，并在需氧条件下于37℃、250rpm下生长24小时直至饱和。
变异链球菌(Streptococcus mutans)(DSMZ#6178)作为真空干燥培养物从德国微生物与细胞培养物保藏中心(Braunschweig,德国)获得。随后将培养物重悬浮于Luria Broth(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中。变异链球菌在需氧条件下于37℃、250rpm下生长直至饱和。
在实施例中以下非限制性菌株还可用作起始菌株：DF40[Hfr(PO2A)，garB10，fhuA22，ompF627(T2R)，fadL701(T2R)，relA1，pitA10，spoT1，rrnB-2，pgi-2，mcrB1，creC510]、BW25113[F-，Δ(araD-araB)567，ΔlacZ4787(::rrnB-3)，&lambda-，rph-1，Δ(rhaD-rhaB)568，hsdR514]、JP111[Hfr(PO1)，galE45(GalS)，fabIts，relA1，spoT1，thi-1]。这些菌株具有公认的遗传修饰，并且可从诸如Yale Coli Genetic Stock Collection(New Haven,CT USA)的公共培养物来源中获得。由这些菌株开发的菌株在实施例中描述。
常用实验室培养基包括商业制备的培养基，例如Luria Bertani(LB)液体培养基、Terrific液体培养基(TB)和M9基本培养基。SM11培养基的内容物是(每1000mL)：
2mL FM10痕量矿物质储备液
2.26mL 1M MgSO4
30g葡萄糖
200mM MOPS(pH 7.4)
1g/L酵母提取物
1.25mL VM1维生素混合物
0.329g K2HPO4
0.173g KH2PO4
3g(NH4)2SO4
0.15g柠檬酸(无水)
FM10痕量矿物质储备液由以下成分组成：
1mL浓HCl
4.9g CaCl2*2H2O
0.97g FeCl3*6H2O
0.04g CoCl2*6H2O
0.27g CuCl2*2H2O
0.02g ZnCl2
0.024g Na2MoO4*2H2O
0.007g H3BO3
0.036g MnCl2*4H2O
适量去离子水加至100mL
VM1维生素混合物溶液由以下成分组成：
5g硫胺素
5.4g泛酸
6.0g烟酸
0.06g
适量去离子水加至1000mL
子部分B.凝胶制备、DNA分离、提取、连接和转化方法
将分子生物学级别的琼脂糖(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)加至1x TAE中以制备在TAE中的1％的琼脂糖。为获得50x TAE将如下成分加至900mL蒸馏水中：242g Tris碱(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)、57.1mL冰醋酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)、18.6gEDTA(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA USA)，并用额外的蒸馏水调节体积至1L。为获得1x TAE，将20mL 50x TAE加至980mL蒸馏水中。随后将琼脂糖-TAE溶液加热至发生沸腾并且琼脂糖完全溶解。使该溶液冷却至50℃，之后以每100mL的1％琼脂糖溶液5μL的浓度加入10mg/mL溴化乙锭(Acros Organics,Morris Plains,NJ,USA)。一旦加入溴化乙锭，短暂地混合该溶液并倒入每次样品分析具有适当数目的梳子的凝胶灌注盘中(Idea Scientific Co.,Minneapolis,MN,USA)。随后将DNA样品相应地与5X TAE上样缓冲液混合。5X TAE上样缓冲液由5X TAE(由本文所述的50X TAE稀释)、20％甘油(AcrosOrganics,Morris Plains,NJ,USA)、0.125％溴酚蓝(Alfa Aesar,WardHill,MA,USA)组成，并用蒸馏水调节体积至50mL。上样的凝胶然后在充满1X TAE的凝胶装置(Idea Scientific Co.,Minneapolis,MN,USA)中在125伏恒定电压下运行25-30分钟。此时，利用电压从凝胶盒中取出凝胶并在UV透照仪(FOTODYNE Inc.,Hartland,WI,USA)下可视化。
随后使用QIAquick凝胶提取试剂盒，根据生产商的说明(Qiagen(Valencia CA USA))提取通过凝胶提取分离的DNA。类似的方法是本领域技术人员已知的。
使用本领域技术人员已知的限制酶/连接方法或同源重组法，例如Gibson Assembly(New England BioLabs Inc.,Ipswich,MA USA)或GeneArt Seamless Cloning(Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA USA)，进行质粒构建。
普通转化以及相关培养方法：
化学感受态转化方案根据生产商的说明或根据包含在Molecular Cloning(Sambrook和Russell,2001)中的文献施行。通常，质粒DNA或连接产物在含有化学感受态细胞的溶液中在冰上冷却5至30分钟。化学感受态细胞为生物技术领域广泛使用的产品，并可自多个供应商处获得，例如在本子部分所说明的那些供应商。在冷却期后，细胞通常在不振摇下42℃热激30秒，再冷却，并与250微升的丰富培养基如S.O.C.混合。细胞然后在37℃于250rpm振摇下温育1小时。最后，通过涂布于含有合适的抗生素的培养基上筛选成功转化的细胞。
或者，可通过如本领域技术人员已知的电穿孔方法转化选定的细胞。
使用本领域技术人员已知的λ-Red重组酶技术(Datsenko和Wanner,2000以及Gene Bridges GmbH,Dresden,德国)实现在大肠杆菌的染色体中的遗传操作。这包括基因缺失、插入和突变。
使用本领域技术人员已知的限制酶/连接方法或同源重组法，例如Gibson Assembly(New England Biolabs Inc.Ipswich,MA USA)或GeneArt Seamless Cloning(Invitrogen Inc.Carlsbad,CA USA)，根据制造商的说明进行质粒构建。
用于质粒转化的大肠杆菌宿主菌株的选择通过考虑诸如质粒稳定性、质粒兼容性、质粒筛选方法以及蛋白质表达等因素来决定。通过如本文所述简单纯化质粒DNA，并将该质粒转化到期望的或例如根据实验需要确定的其他合适的大肠杆菌宿主菌株如任何常用的克隆菌株(例如，DH5α、Top10F’、E.cloni 10G等)中，可以改变菌株背景。
利用来自Qiagen(Valencia,CA USA)的商业小量制备试剂盒根据生产商的说明制备质粒DNA。
在此所述的实施方案、变更、序列和图应当提供本发明的实用性和多功能性的指示。也可以在不背离本发明的宗旨和范围的情况下使用其他未提供所有在此提到的特征及优势的实施方案。这样的修改和变更被认为是在本发明范围之内。
子部分C.摇瓶菌株评价规程
摇瓶方法1：在摇瓶中评价菌株的游离脂肪酸(FFA)生产。进行一式三份评价。简言之，过夜起子培养物在包含合适的抗生素的50mLTerrific液体培养基中制备并在30℃下温育16-24小时，同时在225rpm下摇动。用这些培养物接种各菌株在SM11基本培养基中的150mL培养物至D600为0.8，剩下5％TB培养物作为起始接种物，和抗生素。培养物在30℃下温育2小时，同时在225rpm下摇动。在2小时后，用SM11(无磷酸盐)洗涤细胞。将细胞离心2次(4,000rpm，15min)，倾去上清液，将沉淀物再悬浮于150ml的SM11(无磷酸盐)中。使用培养物接种在SM11(无磷酸盐)中的3X 50mL各菌株。使培养物在30℃下生长大约2h至OD600为1.0-1.5，在2小时后，将细胞转换至37℃，在72小时的过程中定期移取样品用于脂肪酸测量。
摇瓶方法2：在摇瓶中评价菌株的FFA生产。进行一式三份评价。简言之，过夜起子培养物在包含合适的抗生素的50mL Terrific液体培养基中制备并在30℃下温育16-24小时，同时在225rpm下摇动。用这些培养物接种各菌株在SM11基本培养基中的150mL培养物至D600为0.8，剩下5％TB培养物作为起始接种物，和抗生素。在2小时后，用SM11(无磷酸盐)洗涤细胞。将细胞离心2次(4,000rpm，15min)，倾去上清液，将沉淀物再悬浮于150ml的SM11(无磷酸盐)中。使用培养物接种在SM11(无磷酸盐)中的3X 50mL各菌株并向每个中加入0.5mM IPTG。使培养物在30℃下生长大约2h至OD600为1.8-2.0，此后，将培养物转换至37℃，在72小时的过程中定期移取样品用于脂肪酸测量。
摇瓶方法3：在摇瓶中评价菌株的FFA生产。进行一式三份评价。简言之，过夜起子培养物在包含合适的抗生素的50mL Terrific液体培养基中制备并在30℃下温育16-24小时，同时在225rpm下摇动。用这些培养物接种各菌株在Terrific液体培养基中的300mL培养物至D600为0.8，剩下5％TB培养物作为起始接种物，和抗生素。培养物在30℃下温育4-6小时，同时在225rpm下摇动直到它们达到1.8-2.0的OD600。在4-6小时后，用SM11(无磷酸盐)洗涤细胞。将细胞离心2次(4,000rpm，15min)，倾去上清液，将沉淀物再悬浮于300ml的SM11(无磷酸盐)中。使用培养物接种在SM11(无磷酸盐)中的3X 100mL各菌株。使培养物在25℃下生长大约16h，然后转换至37℃，在72小时的过程中定期移取样品用于脂肪酸测量。
摇瓶方法4：在摇瓶中评价菌株的FFA生产。进行一式三份评价。简言之，过夜起子培养物在包含合适的抗生素的50mL Terrific液体培养基中制备并在30℃下温育16-24小时，同时在225rpm下摇动。用这些培养物接种各菌株在Terrific液体培养基中的300mL培养物至D600为0.8，剩下5％TB培养物作为起始接种物，和抗生素。培养物在30℃下温育4-6小时，同时在225rpm下摇动直到它们达到1.8-2.0的OD600。在4-6小时后，用SM11(无磷酸盐)洗涤细胞。将细胞离心2次(4,000rpm，15min)，倾去上清液，将沉淀物再悬浮于300ml的SM11(无磷酸盐)中。使用培养物接种在SM11(无磷酸盐)中的3X 50mL各菌株并向每个中加入0.5mM IPTG。使培养物在25℃下生长大约16h，然后转换至37℃，在72小时的过程中定期移取样品用于脂肪酸测量。
子部分D.分析物量化规程
在通过使用Stabilwax柱的气相色谱法分析前，通过在发酵培养基中酯化脂肪酸以制备甲基酯(FAME)来进行脂肪酸的量化。酯化在100℃下利用在盐酸中的甲醇进行2小时。在GC柱上分离FAME并通过火焰电离检测(FID)进行检测。在运行开始时使用各组分的标准曲线量化FAME。以各FAME在培养基中的量(mg)报告数据。
溶剂和缓冲液
如下制备甲基酯化溶液(83％甲醇/8.3％盐酸/8.3％氯仿)：向100mL玻璃瓶中加入100mL甲醇，加入10mL盐酸，加入10mL氯仿，并充分混合(在室温下储存)。
如下制备提取溶液(80％己烷/20％氯仿)：向100mL玻璃瓶中加入80mL己烷，加入20mL氯仿，并充分混合(在室温下储存)。
程序
GC在以下梯度下操作：50℃持续4分钟，7℃/分钟至150℃，保持3min，40℃/分钟至220℃，保持2分钟，总运行时间为25分钟。载气为流速为4.0mL/min的氦气，补充气体为流速为30mL/min的氦气。氢气流速为35mL/min，空气流速为340mL/min，速度为55.3cm/sec，压力为50℃下16.3psi，分流比为17:1，分流流速为68mL/min，注射体积为1μL，入口温度为250℃，且检测器温度为300℃。
十五烷用作内标。使用GC软件和线性回归函数基于标准物的浓度制作各脂肪酸的标准曲线。使用GC校准软件确定各样品和对照中的各脂肪酸的量。试验接受标准需要脂肪酸标准曲线的相关系数大于0.99。标准物的浓度必须在历史范围内。
如下制备样品：向反应小瓶中加入<2mL培养物。用热在SpeedVac中干燥样品大约60min。加入3mL甲基酯化溶液。加入10μL内标溶液。在85℃下温育2小时。从温箱中移出并冷却至室温。加入1mL去离子水。加入2mL提取溶液。剧烈涡旋1分钟并使混合物沉降并分离。移出有机层(TOP)并置于琥珀GC小瓶内的小瓶插入物中。
质谱仪探测器的使用由使用与按照GC-FID的样品制备方法相同的方法组成。化学个体鉴别的附加工具是通过NIST08库以验证游离脂肪酸(FFA)。这是为了使用质谱仪不仅将停留时间与标准物相匹配，而且将定量和定性特征离子(target and qualifier ions)与标准物相匹配。

Claims (15)

1.一种产生脂肪酸或脂肪酸衍生产物的遗传修饰微生物，其中该脂肪酸的链长可选自4至>18，其中通过生长脂肪酰辅酶A链而产生脂肪酸，并且其中另外地，用至少一个丙二酰辅酶A分子且不使用丙二酰-ACP来延长该脂肪酸链。
2.如权利要求1所述的遗传修饰微生物，其中由乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A制成丁酰辅酶A产物/中间体。
3.如权利要求1所述的遗传修饰微生物，其中由丙二酰辅酶A制成丁酰辅酶A产物/中间体。
4.如权利要求1所述的遗传修饰微生物，其中由乙酰辅酶A和酰基辅酶A链(长度n-2)制成链长大于4的酰基辅酶A(长度n)产物/中间体。
5.如权利要求1所述的遗传修饰微生物，其中由丙二酰辅酶A和酰基辅酶A链(长度n-2)制成链长大于4的酰基辅酶A(长度n)产物/中间体。
6.如权利要求1所述的遗传修饰微生物，其中所述产物是链长C4富集的脂肪酸混合物，且其中该C4链以质量(g)计占总脂肪酸产物的>9％、>50％、>85％或>95％百分比。
7.如权利要求1所述的遗传修饰微生物，其中该产物是链长C6富集的脂肪酸混合物，且其中该C6链以质量(g)计占总脂肪酸产物的>10％、>50％、>85％或>95％百分比。
8.如权利要求1所述的遗传修饰微生物，其中该产物是链长C8富集的脂肪酸混合物，且其中该C8链以质量(g)计占总脂肪酸产物的>10％、>50％、>85％或>95％百分比。
9.如权利要求1所述的遗传修饰微生物，其中该产物是链长C10富集的脂肪酸混合物，且其中该C10链以质量(g)计占总脂肪酸产物的>10％、>50％、>85％或>95％百分比。
10.如权利要求1所述的遗传修饰微生物，其中该产物是链长C12富集的脂肪酸混合物，且其中该C12链以质量(g)计占总脂肪酸产物的>10％、>50％、>85％或>95％百分比。
11.如权利要求1所述的遗传修饰微生物，其中该产物是链长C14富集的脂肪酸混合物，且其中该C14链以质量(g)计占总脂肪酸产物的>10％、>50％、>85％或>95％百分比。
12.如权利要求1所述的遗传修饰微生物，其中该产物是链长C16富集的脂肪酸混合物，且其中该C16链以质量(g)计占总脂肪酸产物的>10％、>50％、>85％或>95％百分比。
13.如权利要求1所述的遗传修饰微生物，其中该产物是链长C18富集的脂肪酸混合物，且其中该C18链以质量(g)计占总脂肪酸产物的>10％、>50％、>85％或>95％百分比。
14.一种使用上述权利要求中任一项的微生物的发酵方法，其中产生脂肪酸或基于脂肪酸的产物。
15.如上述权利要求中任一项所述的遗传修饰微生物，其中该微生物被进一步遗传修饰以将酰基辅酶A转化为脂肪酸衍生产物，包括醇、醛、烯烃、烷烃或二酸。
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