JP2015524283A - 脂肪酸および脂肪酸由来生成物の生成のため微生物および方法 - Google Patents

脂肪酸および脂肪酸由来生成物の生成のため微生物および方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、脂肪酸または脂肪酸由来生成物を生成するためにマロニル−ＣｏＡの利用が増加している細菌株などの代謝改変された微生物株であって、マロニル−ＣｏＡ依存性であるがマロニル−ＡＣＰ非依存性である機構によって脂肪酸アシル−ＣｏＡ中間体を生成する、改変された微生物に関する。本発明による炭素源は、主にグルコース、スクロース、フルクトース、デキストロース、ラクトース、キシロース、他のセルロース糖またはこれらの組み合わせであってよい。あるいは、炭素源はグリセロールである。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、仮出願：２０１２年８月１０日に出願された米国出願第６１／６８２，１２７号および２０１２年８月１０日に出願された米国出願第６１／６８２，１３８号の優先権を請求する。
連邦政府後援の研究に関する声明
本発明は、米国エネルギー省によって授与されたＤＥ−ＡＲ０００００８８による国庫補助によってなされた。政府は、本発明における特定の権利を有する。
本発明は、マロニル−ＣｏＡ依存性であるがマロニル−ＡＣＰ非依存性である代謝経路によって脂肪酸または脂肪酸由来生成物を生成するためにマロニル−ＣｏＡの利用が増加している細菌株などの代謝改変された微生物に関する。これらの生成物は、アルデヒド、アルコール、アルカン、アルケン、および二酸、ならびにこのような化学生成物から作製されるさらに下流の生成物を含み得る。また、１つ以上の化学生成物がもたらされるように遺伝子改変を行うことができる。
参照による組み込み
本明細書において列挙されている出願、特許、および刊行物は全て、その全体があらゆる目的について参照により本明細書に組み込まれている。
石油炭化水素の供給量が減少し、そのコストが極めて上昇していることがますます受け入れられるにつれ、化学物質および燃料を生成するための工業微生物系の開発および改良に対する関心が高まっている。このような工業微生物系は、いくつかの化学物質を生成するための石油炭化水素の使用に完全または部分的に取って代わる可能性がある。
このような手段により、抗生物質および抗マラリア医薬品から精密化学品、さらにはエタノールなどの燃料に及ぶ多数の化学物質が生成される。しかし、その化学生成物、例えば、これだけに限定されないが、種々の脂肪酸および脂肪酸由来生成物などの微生物生成経路における基質としてマロニル−ＣｏＡを有する、化学生成物を生成するように適合された改変微生物が依然として商業的に必要とされている。
一実施形態によると、本発明は、これだけに限定されないが、脂肪酸、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケンまたは二酸を含めた脂肪酸または脂肪酸由来生成物を生成するための方法であって、ｉ）炭素源と微生物細胞培養物とを組み合わせてこのような脂肪酸または脂肪酸由来生成物を生成する工程であって、ａ）上記細胞培養物が、脂肪酸合成酵素の阻害剤を含むか、または上記微生物が、微生物の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減のために遺伝子改変されているか、またはｂ）上記微生物が、微生物のマロニル−ＣｏＡ依存性、マロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪酸アシル−ＣｏＡ代謝経路（「ＭＤＭＩＦＡＡ」）における酵素活性の増加のために遺伝子改変されている工程を含む方法を対象とする。この経路は、本明細書ではマロニル−ＣｏＡ依存性であるがマロニル−ＡＣＰ非依存性である脂肪酸アシル−ＣｏＡ代謝経路とも称される。微生物のマロニル−ＣｏＡ依存性、マロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪酸アシル−ＣｏＡ代謝経路におけるこのような増加は、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、ケトアシル−ＣｏＡ合成酵素（またはエロンガーゼ（ｅｌｏｎｇａｓｅ））、エノイル−ＣｏＡ還元酵素、ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素および／または３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼを含む遺伝子または経路の活性または発現の増加と、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの発現または活性の減少との組み合わせによって実現することができる。あるいは、微生物のマロニル−ＣｏＡ依存性、マロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪酸アシル−ＣｏＡ代謝経路における活性の増加は、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、エノイル−ＣｏＡ還元酵素、ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素および／または３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼを含む遺伝子または経路の発現の増加と、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの発現または活性の減少との組み合わせによって実現することができる。様々な態様では、微生物に提供される炭素源は、約１．０×１０−１４以上の炭素１２に対する炭素１４の比を有する。
本発明による炭素源は、主にグルコース、スクロース、フルクトース、デキストロース、ラクトース、キシロース、他のセルロース糖またはこれらの組み合わせであってよい。あるいは、炭素源はグリセロールである。
様々な実施形態では、脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生成の増加は、本発明の遺伝子改変および／または培養系の特徴を含まない微生物における生成物の生成を少なくとも２０パーセント、少なくとも５０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも１００パーセント、または少なくとも１５０パーセント上回るものである。
ある特定の実施形態では、細胞培養物が脂肪酸合成酵素の阻害剤を含むか、または微生物が微生物の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減のために遺伝子改変されている。例えば、脂肪酸合成酵素の阻害剤は、チオラクトマイシン、トリクロサン、セルレニン、チエノジアザボリン（ｔｈｉｅｎｏｄｉａｚａｂｏｒｉｎｅ）、イソニアジド、およびその類似体からなる群から選択することができる。細胞培養物が遺伝子改変微生物を含む実施形態が、本発明に含まれる。遺伝子改変微生物は、微生物の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減、マロニル−ＣｏＡ依存性、マロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪酸アシル−ＣｏＡ代謝経路の１つ以上の酵素における酵素活性の増加、微生物の脂肪酸アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性における酵素活性の増加、微生物のアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素活性における酵素活性の増加、微生物のアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性の酵素活性の減少、微生物のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ経路における酵素活性の増加、およびこれらの組み合わせから選択される形質について改変されていてよい。例えば、遺伝子改変微生物は、微生物の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減について改変されていてよい。あるいは、酵素活性の低減は、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ還元酵素、３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ、またはエノイル−ＡＣＰ還元酵素からなる群から選択される酵素における酵素活性の低減である。様々な態様では、微生物の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減は、脂肪酸合成酵素経路における酵素もしくはそのホモログをコードする配列に作動可能に連結した誘導性プロモーターをコードする異種核酸配列、または低減した活性を有する脂肪酸合成酵素経路における酵素またはそのホモログをコードする異種核酸配列の導入を介して生じる。様々な態様では、脂肪酸合成酵素経路における酵素またはそのホモログは、温度感受性ベータ−ケトアシル−ＡＣＰまたは温度感受性エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性を有するポリペプチドである。Ｅ．ｃｏｌｉでは、これらの温度感受性変異遺伝子として、ｆａｂＩｔｓ（Ｓ２４１Ｆ）、ｆａｂＢｔｓ（Ａ３２９Ｖ）またはｆａｂＤｔｓ（Ｗ２５７Ｑ）を挙げることができる。
様々な実施形態では、微生物のマロニル−ＣｏＡ依存性であるがマロニル−ＡＣＰ非依存性である脂肪酸アシル−ＣｏＡ代謝経路における酵素活性の増加は、パントテン酸キナーゼまたはピルビン酸脱水素酵素を含めたフィードバック抵抗性酵素の発現の増加により生じ得る。Ｅ．ｃｏｌｉでは、これらのフィードバック抵抗性突然変異遺伝子として、それぞれｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）およびｌｐｄ（Ｅ３５４Ｋ）を挙げることができる。
様々な実施形態では、微生物のマロニル−ＣｏＡ依存性、マロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪酸アシル−ＣｏＡ代謝経路における酵素活性の増加は、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、エノイル−ＣｏＡ還元酵素、ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素および３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼを含む経路の発現の増加により生じ得る。エノイル−ＣｏＡ還元酵素は、補因子ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨのいずれかを利用することもでき、または代わりにＮＡＤＰＨとＮＡＤＨの両方を利用することもできる。さらに、ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素は、補因子ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨのいずれかを利用することもでき、または代わりにＮＡＤＰＨとＮＡＤＨの両方を利用することもできる。
様々な実施形態では、微生物のマロニル−ＣｏＡ依存性であるがマロニル−ＡＣＰ非依存性である脂肪酸アシル−ＣｏＡ代謝経路における酵素活性の増加は、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、ケトアシル−ＣｏＡ合成酵素（またはエロンガーゼ）、エノイル−ＣｏＡ還元酵素、ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素および３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼを含む経路の発現の増加により生じ得る。エノイル−ＣｏＡ還元酵素は、補因子ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨのいずれかを利用することもでき、または代わりにＮＡＤＰＨとＮＡＤＨの両方を利用することもできる。さらに、ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素は、補因子ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨのいずれかを利用することもでき、または代わりにＮＡＤＰＨとＮＡＤＨの両方を利用することもできる。
様々な実施形態では、微生物のマロニル−ＣｏＡ依存性であるがマロニル−ＡＣＰ非依存性である脂肪酸アシル−ＣｏＡ代謝経路による脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生成の増加は、遺伝子欠失、破壊または遺伝子突然変異のいずれかによるアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性の低減により生じ得る。
様々な実施形態では、微生物のマロニル−ＣｏＡ依存性であるがマロニル−ＡＣＰ非依存性である脂肪酸アシル−ＣｏＡ代謝経路による脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生成の増加は、微生物ｔｉｇ遺伝子の、遺伝子欠失、破壊または遺伝子突然変異のいずれかによるトリガー因子活性または細胞分裂に関与する分子シャペロンの活性の低減により生じ得る。
微生物のＮＡＤＰＨ依存性トランスヒドロゲナーゼ経路における酵素活性の増加は、ヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ活性をコードするポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により生じ得る。
様々な実施形態では、微生物のマロニル−ＣｏＡ依存性であるがマロニル−ＡＣＰ非依存性である脂肪酸アシル−ＣｏＡ代謝経路による脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生成の増加は、これだけに限定されないが、遺伝子欠失、破壊または遺伝子突然変異による脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素またはリガーゼ活性の低減を含めた、脂肪酸ベータ−酸化活性の低減によって生じ得る。
様々な実施形態では、脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生成の増加は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有する酵素の過剰発現により実現することができる。
様々な実施形態では、細胞内重炭酸塩レベルの増加は、シアナーゼ（ｃｙａｎａｓｅ）活性および／またはカルボニックアンヒドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入によって生じる。
様々な実施形態では、脂肪酸の生成の増加は、脂肪酸アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性のレベルの増加により生じ得る。
様々な実施形態では、脂肪酸生成物の鎖長特異性の増加は、鎖長に特異的な脂肪酸アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性のレベルの増加および望ましくない脂肪酸鎖長に対する脂肪酸アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性の活性の減少により生じ得る。
様々な実施形態では、脂肪酸または脂肪酸由来生成物の鎖長特異性の増加は、鎖長に特異的なケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ活性、エノイル−ＣｏＡ還元酵素活性、ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素活性または３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ活性のレベルの個別の増加または組み合わせた増加のいずれかにより生じ得る。エノイル−ＣｏＡ還元酵素は、補因子ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨのいずれかを利用することもでき、または代わりにＮＡＤＰＨとＮＡＤＨの両方を利用することもできる。さらに、ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素は、補因子ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨのいずれかを利用することもでき、または代わりにＮＡＤＰＨとＮＡＤＨの両方を利用することもできる。
様々な実施形態では、脂肪酸または脂肪酸由来生成物の鎖長特異性の増加は、鎖長に特異的なケトアシル−ＣｏＡ合成酵素（またはエロンガーゼ）活性、エノイル−ＣｏＡ還元酵素活性、ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素活性または３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ活性のレベルの個別の増加または組み合わせた増加のいずれかにより生じ得る。エノイル−ＣｏＡ還元酵素は、補因子ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨのいずれかを利用することもでき、または代わりにＮＡＤＰＨとＮＡＤＨの両方を利用することもできる。さらに、ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素は、補因子ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨのいずれかを利用することもでき、または代わりにＮＡＤＰＨとＮＡＤＨの両方を利用することもできる。
様々な実施形態では、脂肪酸生成の鎖長特異性の増加は、鎖長に特異的な脂肪酸アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性のレベルの増加および望ましくない鎖長に対する脂肪酸アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性の活性の減少により生じ得る。
０．０５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．０８ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒ、０．１ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．１３ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．１５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．１７５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．２ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．２５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．３ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．３５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．４ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．４５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、または０．５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい速度から選択される比速度で脂肪酸または脂肪酸由来生成物を生成することができる遺伝子改変微生物は、本発明の範囲内である。
様々な実施形態では、本発明は、水性培地中の炭素源と、本発明の請求項のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物とを含む培養系であって、上記遺伝子改変微生物が、０．０５ｇＤＣＷ／Ｌより多い、０．１ｇＤＣＷ／Ｌ、１ｇＤＣＷ／Ｌより多い、５ｇＤＣＷ／Ｌより多い、１０ｇＤＣＷ／Ｌより多い、１５ｇＤＣＷ／Ｌより多いまたは２０ｇＤＣＷ／Ｌより多いから選択される量で存在する、例えば上記水性培地の容量が５ｍＬより多い、１００ｍＬより多い、０．５Ｌより多い、１Ｌより多い、２Ｌより多い、１０Ｌより多い、２５０Ｌより多い、１０００Ｌより多い、１０，０００Ｌより多い、５０，０００Ｌより多い、１００，０００Ｌより多いまたは２００，０００Ｌより多いから選択される場合、および上記水性培地の容量が２５０Ｌより多く、鋼容器に含有されている場合などの培養系を包含する。
様々には、このような培養系のための炭素源は、デキストロース、スクロース、ペントース、ポリオール、ヘキソース、ヘキソースとペントースの両方およびこれらの組み合わせから選択され、上記水性培地のｐＨは７．５未満であり、上記培養系は、例えば、ｉ）５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒより大きく、２００ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒ未満の酸素、ｉｉ）５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒより大きく、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒ未満の酸素、ｉｉｉ）５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒより大きく、８０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒ未満の酸素、およびｉｖ）５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒより大きく、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒ未満の酸素から選択される酸素移動速度で通気されている。
本発明の新規な特徴を、特に本特許請求の範囲に示す。本発明の原理が利用されている説明のための実施形態を示す以下の詳細な記載および以下のような添付の図面を参照することにより、本発明の特徴および利点のよりよい理解が得られる。
図１は、本発明の態様、より具体的には中間体マロニル−ＣｏＡを通るフラックスを増加させるための遺伝子改変に関連する微生物の代謝経路を示す図である。
図２は、本発明の態様、より具体的にはブチリル−ＣｏＡおよびブチリル−ＣｏＡ由来生成物の生成に関連する微生物の代謝経路を示す図である。
図３Ａは、本発明の態様、より具体的には脂肪酸アシル−ＣｏＡ、脂肪酸および脂肪酸由来生成物の生成に関連する微生物の代謝経路を示す図である。
図３Ｂは、本発明の態様、より具体的には脂肪酸アシル−ＣｏＡ、脂肪酸および脂肪酸由来生成物の生成に関連する微生物の代謝経路を示す図である。
図４は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるエロンガーゼ遺伝子ＥＬＯ１の活性を示す図である。
図５は、本発明により提供される脂肪酸バイオ生産のための代謝経路の実施形態を示す図である。
図６は、遊離の脂肪酸（ＦＦＡ）バイオ生産活性を増加させる遺伝子改変の組み合わせを保有する微生物の実施形態を示す図である。
表も本明細書で示し、本明細書の一部である。
本発明は、様々な化学生成物の発酵による生成のために有用性を有する様々な生成方法および／または遺伝子改変微生物、容器内のこれらの微生物の集団を利用するこのような化学生成物を作製する方法、ならびにこれらの微生物および方法を採用する化学的生成のための系に関する。このような微生物が、発酵イベントまたは発酵サイクルの間に化学生成物を生成する場合の比生産性の増加が、本発明の利点に含まれる。本発明は、脂肪酸または脂肪酸由来生成物などの対象の化学生成物を、マロニル−ＣｏＡから脂肪酸アシル分子への変換を調整するための１つ以上の手段を用いて生成するための生成技術および／または遺伝子改変微生物を提供し、ここで、生成経路は、マロニル−ＣｏＡを基質として用いるがマロニル−ＡＣＰを基質として用いない酵素変換工程を含む。マロニル−ＣｏＡから脂肪酸アシル分子への変換を調整するための手段は、微生物バイオマスへの炭素フローを、化学生成物への炭素フローと釣り合わせるために有効であり、そして驚くべきことに、比生産性の割合の上昇の達成を与える。具体的には、脂肪酸または脂肪酸由来生成物を、微生物のマロニル−ＣｏＡ依存性かつマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪酸生成経路に依存する様式で、微生物のマロニル−ＡＣＰ依存性脂肪酸合成酵素経路の阻害と組み合わせて生成する。微生物のマロニル−ＣｏＡ依存性かつマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪酸生成経路は、２つの経路のうちの一方を含む。第１の選択肢は、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、エノイル−ＣｏＡ還元酵素、ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素および３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼを含む経路の発現の増加、ならびに必要に応じてアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性の活性の減少を含む。第２の選択肢は、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、ケトアシル−ＣｏＡ合成酵素（またはエロンガーゼ）、エノイル−ＣｏＡ還元酵素、ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素および３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼを含む経路の発現の増加、ならびに必要に応じてアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性の活性の減少を含む。これらの経路を使用して細胞内脂肪酸アシル−ＣｏＡ生成物を生成する。
微生物の細胞内脂肪酸アシル−ＣｏＡ生成物を、今度は、これだけに限定されないが、アルコール、アルデヒド、アルファオレフィンおよびアルカンを含めた脂肪酸または脂肪酸由来生成物を含めた化学生成物に変換することができる。
１つの化学生成物は、炭素数が４〜１８超である任意の鎖長の脂肪酸であってよい。この化学生成物の群としては、ブチレートまたは酪酸、ヘキサノエートまたはヘキサン酸、オクタノエートまたはオクタン酸、デカノエートまたはデカン酸、ドデカノエートまたはドデカン酸、ミリステートまたはミリスチン酸、パルミテートまたはパルミチン酸、パルミトレエートまたはパルミトレイン酸、ステアレートまたはステアリン酸、およびオレエートまたはオレイン酸が挙げられる。これらの脂肪酸生成物は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ中間体から脂肪酸アシル−ＣｏＡチオエステラーゼの活性によって生成することができる。あるいは、これらの脂肪酸は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ中間体から、まず脂肪酸アシル−ホスフェートを生成する脂肪酸アシル−ＣｏＡホスホトランスフェラーゼ、次いで脂肪酸アシル−ホスフェートから脂肪酸が生成するように機能する脂肪酸キナーゼの作用の協調的な活性によって生成することができる。
別の化学生成物は、炭素数が４〜１８超の任意の鎖長の脂肪アルデヒドであってよい。この化学生成物の群としては、ブタナール、ヘキサナール、オクタナール、デカナール、オクタナール、デカナール、ドデカナール、ミリストアルデヒド、パルミトアルデヒド、パルミトレインアルデヒド（ｐａｌｍｉｔｏｌｅｉｃ ａｌｄｅｈｙｄｅ）、ステアリンアルデヒド（ｓｔｅａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）およびオレインアルデヒド（ｏｌｅｉｃ ａｌｄｅｈｙｄｅ）が挙げられる。これらのアルデヒド生成物は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ中間体から脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素またはアシル−ＣｏＡ還元酵素の活性によって生成することができる。脂肪酸を産生する生成株を用いて脂肪アルデヒドを生成することもできる。
別の化学生成物は、炭素数が４〜１８超の任意の鎖長の脂肪アルコールであってよい。この化学生成物の群としては、ブタノール、ヘキサノール、オクタノール、デカノール、ドデカノール、Ｃ１４脂肪アルコール、Ｃ１６脂肪アルコールまたはＣ１８脂肪アルコールが挙げられる。これらの脂肪酸生成物は、脂肪アルデヒドからアルデヒド還元酵素の活性によって生成することができる。脂肪酸を産生する生成株を用いて、脂肪酸アシル−ＣｏＡまたは遊離の脂肪酸を脂肪アルコールに変換する酵素をコードする遺伝子を発現させることによって脂肪アルコールを生成することもできる。これらの酵素の例としては、アルコール形成性アシル−ＣｏＡ還元酵素（ＥＣ１．２．１．−）、または長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素（ＥＣ１．２．１．５０）と、それに加えてアルコール脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．１）、またはアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．−）とアルコール脱水素酵素との組み合わせが挙げられる。脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ＳＰ． ＡＤＰ１のｆａｂＧ遺伝子、受託番号ＹＰ＿０４７８６９によりもたらされる。脂肪酸アシル還元酵素活性を有するポリペプチドは、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉのＦＡＲ−Ｎ＿ＳＤＲ＿ｅ遺伝子、受託番号ＢＡＣ７９４２５によりもたらされる。アルデヒド脱水素酵素を有するポリペプチドは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＮＧ８０−２のＡＬＤＨ遺伝子、受託番号ＹＰ＿００１１２５９７０によってもたらされる。アルコール脱水素酵素活性を有するポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのｙｑｈＤ遺伝子、受託番号ＡＰ＿００３５６２．１によってもたらされる。これらの活性の追加の供給源は当技術分野で公知であり、これらを組み合わせて、脂肪アルコールを生成する生成株を作製することができる。
別の化学生成物は、炭素数が４〜１８超の任意の鎖長のアルファオレフィンであってよい。
別の化学生成物は、炭素数が４〜１８超の任意の鎖長のアルカンであってよい。
別の化学生成物は、炭素数が４〜１８超の任意の鎖長の二酸であってよい。これらの脂肪酸生成物は、脂肪酸から、当技術分野で公知の酵素によるオメガ酸化または末端酸化によって生成することができる。
これらはいずれも、選択された化学生成物、または対象の化学生成物として本明細書に記載することができる。また、上記の一覧表の、いずれの亜群も含めた群分けはいずれも、「選択された化学生成物」、「対象の化学生成物」などにより参照されるものであるとみなすことができる。これらの化学生成物のいずれに関しても、微生物は、このような化学生成物に対する生合成経路を本質的に含み得、かつ／または、このような化学生成物の所望の生成を実現するために、１つ以上の異種核酸配列を付加してこのような生合成経路をもたらすまたは完全にすることを必要とする場合がある。
本明細書に記載の通り、本発明の様々な態様は、マロニル−ＣｏＡから、例えば上記のものなどの対象の化学生成物への代謝経路を含む微生物細胞を対象とし、マロニル−ＣｏＡからアシルＡＣＰ分子への変換を調整するための手段も提供される。次いで、調整するための手段により、このような変換が減少するように調整される場合、比例してより多数のマロニル−ＣｏＡ分子が１）生成され、かつ／または２）マロニル−ＣｏＡから化学生成物への代謝経路を介して変換される。
微生物のマロニル−ＣｏＡ依存性であるがマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪酸アシル−ＣｏＡ生成経路の活性の増加に加えて、遺伝子改変微生物の集団による比生産性の予期せぬ増加が、その微生物がマロニル−ＣｏＡから選択された化学生成物までの微生物生成経路、ならびに、その微生物の脂肪酸合成酵素系の選択された酵素（より具体的には、そのマロニル−ＡＣＰ依存性脂肪酸伸長酵素）の酵素活性の低減をその中に有する方法および系において達成され得る。様々な実施形態では、このような微生物集団を含むバイオリアクタ容器への特定の補充物質も、上記方法および系をさらに改善するために提供され得る。
様々な実施形態についてのその他の追加の遺伝子改変が、本明細書で開示される。
Ｉ．定義
本明細書および本特許請求の範囲で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明らかに命じていない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば「発現ベクター」への言及は、単一の発現ベクターならびに同じ（例えば同じオペロン）であるかまたは異なっているかのいずれかの複数の発現ベクターを含み、「微生物」への言及は、単一の微生物ならびに複数の微生物を含む、などである。
本明細書で用いる場合、「酵素活性が低減された」、「酵素活性を低減する」などは、微生物細胞の酵素または単離酵素が、その同じ種の比較可能な細胞またはその天然酵素で測定される活性よりも低いレベルの活性を示すことを示すことを意味する。つまり、その酵素にとって公知の標準的な条件下で、示される基質（複数可）から示される生成物（複数可）への酵素変換は、天然（非改変）酵素による標準的な特定された条件下での同じ生化学的変換についての酵素活性よりも少なくとも１０パーセント小さい、少なくとも２０パーセント小さい、少なくとも３０パーセント小さい、少なくとも４０パーセント小さい、少なくとも５０パーセント小さい、少なくとも６０パーセント小さい、少なくとも７０パーセント小さい、少なくとも８０パーセント小さいまたは少なくとも９０パーセント小さい。この用語は、その酵素活性の消失も含み得る。酵素の酵素活性が低減された細胞は、当該技術において公知の任意の方法を用いて同定できる。例えば、酵素活性アッセイを用いて、酵素活性が低減された細胞を同定できる。例えば、Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２００７年を参照されたい。
用語「異種ＤＮＡ」、「異種核酸配列」などは、本明細書で用いる場合、以下の少なくとも１つが当てはまる核酸配列のことをいう：（ａ）核酸の配列が、所定の宿主微生物にとって外来である（すなわち、天然で見出されない）；（ｂ）上記配列が、所定の宿主微生物で天然に見出されるが、異常な（例えば予期されるより多い）量で見出され得る、または（ｃ）核酸の配列が、天然における互いの関係と同じ関係で見出されない２つ以上のサブ配列を含む。例えば、（ｃ）の場合に関して、組換え生成される異種核酸配列は、新しい機能的核酸を作製するように配置された無関係の遺伝子からの２つ以上の配列を有する。
用語「異種」は、用語「外因性」（後者の用語は、当該技術において一般的に用いられる）を含むことを意図する。異種核酸配列の導入の前に上記宿主微生物のゲノムについていう場合、上記酵素をコードする核酸配列が異種である（異種核酸配列がそのゲノムに導入されるか否かにかかわらず）。
本明細書で用いる場合、用語「遺伝子破壊」またはその文法的等価物（「酵素機能を破壊する」、「酵素機能の破壊」などを含む）は、コードされる遺伝子生成物を、そのように改変されていない微生物細胞におけるかまたは該微生物細胞からのポリペプチド活性と比較して低減されたポリペプチド活性を有するようにする微生物に対する遺伝子改変を意味することを意図する。上記遺伝子改変は、例えば、遺伝子全体の欠失、転写もしくは翻訳に要求される調節配列の欠失またはその他の改変、切断型遺伝子生成物（例えば酵素）をもたらす遺伝子の構成部分の欠失あるいはコードされる遺伝子生成物の活性を低減する（検出可能でない活性レベルまでを含む）任意の様々な変異ストラテジーによるものであり得る。破壊は、上記酵素をコードする核酸配列全体または一部の欠失を広く含むことができ、それらに限定されないが、その他の型の遺伝子改変、例えば停止コドンの導入、フレームシフト変異、上記遺伝子の構成部分の導入または除去および分解シグナルの導入、ｍＲＮＡ転写レベルおよび／または安定性に影響する遺伝子改変、ならびにその酵素をコードする遺伝子の上流のプロモーターまたはリプレッサーを変更することも含む。
様々な状況では、遺伝子破壊は、ＤＮＡ、そのＤＮＡからコードされるｍＲＮＡ、および対応するアミノ酸配列への任意の遺伝子改変であって、その結果としてポリペプチド活性の低減をもたらすことを意味すると理解される。多くの異なる方法を用いて、ポリペプチド活性が低減された細胞を作製できる。例えば、通常の変異誘発またはノックアウト技術を用いて、破壊された調節配列またはポリペプチドをコードする配列を有するように細胞を設計製作することができる。例えばＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７年版）、Ａｄａｍｓら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９８年）を参照されたい。遺伝子破壊のある特に有用な方法は、完全な遺伝子欠失である。なぜなら、これは、本発明の遺伝子改変微生物における遺伝子復帰の発生を低減または消失させるからである。よって、その生成物が酵素である遺伝子の破壊は、そのことにより酵素機能を破壊する。代わりに、アンチセンス技術を用いて、特定のポリペプチドの活性を低減できる。例えば、細胞は、ポリペプチドが翻訳されることを妨げるアンチセンス分子をコードするｃＤＮＡを含有するように設計製作できる。さらに、遺伝子サイレンシングを用いて、特定のポリペプチドの活性を低減できる。
用語「アンチセンス分子」は、本明細書で用いる場合、内因性ポリペプチドのコード鎖に相当する配列を含有する任意の核酸分子または核酸類似体（例えばペプチド核酸）を包含する。アンチセンス分子は、フランキング配列（例えば調節配列）も有し得る。つまり、アンチセンス分子は、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。
本明細書で用いる場合、リボザイムは、分子がＲＮＡを切断することを条件として、限定することなく、ヘアピン、ハンマーヘッドまたは斧頭構造物を含む任意の一般的な構造を有し得る。
用語「低減」またはこのような句で用いられる場合の「低減する」およびその文法上の等価物は、このような変換（複数可）の完全な消失を包含することを意図する。
バイオ生産は、本明細書で用いる場合、好気、微好気または嫌気であり得る。
本明細書で用いる場合、「十分に相同な」との文言は、タンパク質またはその構成部分がそれぞれの酵素反応および／またはその他の機能を達成できるような本出願で提供されるアミノ酸配列のアミノ酸配列（配列番号／配列表を含む）と比較した場合に、最小限の数の同一または等価なアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する上記タンパク質またはその構成部分のことをいう。特定のタンパク質またはその構成部分が十分に相同であるかは、当該技術において一般的に公知であるものなどの酵素活性のアッセイにより決定できる。
配列同一性および相同性についての記載および方法は、例示的であることを意図し、これらの概念は、当該技術においてよく理解されていると認識される。さらに、核酸配列を変化させてよく、それが酵素または所望の機能性を示すその他のポリペプチドをまだコードでき、このような変化が本発明の範囲内であることが認められる。
さらに核酸配列について、「ハイブリダイゼーション」は、２つの１本鎖ポリヌクレオチドが、非共有結合的に結合して、安定な２本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスのことをいう。用語「ハイブリダイゼーション」は、３本鎖ハイブリダイゼーションのこともいうことがある。得られる（通常は）２本鎖のポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」または「２重鎖」である。「ハイブリダイゼーション条件」は、典型的には、約１Ｍ未満、より一般的には約５００ｍＭ未満および約２００ｍＭ未満の塩濃度を含む。ハイブリダイゼーション温度は、５℃ほどの低い温度であってもよいが、典型的には２２℃より高く、より典型的には約３０℃より高く、しばしば約３７℃を超える。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェント条件、すなわちプローブがその標的配列にハイブリダイズする条件の下で通常行われる。ストリンジェント条件は、配列依存的であり、異なる環境において異なる。より長い断片は、特定のハイブリダイゼーションについてより高いハイブリダイゼーション温度を要求することがある。塩基組成および相補鎖の長さ、有機溶媒の存在および塩基ミスマッチの程度を含む他の要因がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響し得るので、パラメータの組み合わせは、いずれの１つ単独の絶対的尺度よりも重要である。一般的に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についてのＴｍよりも約５℃低く選択される。例示的なストリンジェント条件は、ｐＨ７．０〜８．３および少なくとも２５℃の温度での少なくとも０．０１Ｍから１Ｍ以下のＮａイオン濃度（または他の塩）の塩濃度を含む。例えば、５×ＳＳＰＥの条件（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸Ｎａ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）および２５〜３０℃の温度は、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに適する。ストリンジェント条件について、例えばＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」第１版、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９９年）（ハイブリダイゼーションプロトコールについて本明細書に参照により組み込まれている）を参照されたい。「・・に特異的にハイブリダイズする」または「特異的に・・にハイブリダイズする」または同様の表現は、ストリンジェント条件の下で１つ以上の特定のヌクレオチド配列に実質的にまたはそれだけに分子が結合する、２重鎖を形成するまたはハイブリダイズすることをいう（その配列が複合体混合物（ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｔｕｒｅ）（例えば全細胞の）ＤＮＡまたはＲＮＡに存在する場合）。
「対象のセグメント」の句の使用は、対象の遺伝子および任意のその他の核酸配列セグメントの両方を含むことを意味する。対象のセグメントを得るために用いられる方法の一例は、微生物の培養物を獲得することであり、ここで、その微生物のゲノムは、対象の遺伝子または核酸配列セグメントを含む。
遺伝子生成物、すなわち酵素の遺伝子改変について本特許請求の範囲を含む本明細書で言及する場合、遺伝子改変は、述べられる遺伝子生成物、すなわち酵素を通常コードする遺伝子などの核酸配列またはその遺伝子を含む核酸配列のものであると理解される。
いくつかの実施形態では、各切断型ポリペプチドは、各天然酵素をコードする核酸配列によりコードされるポリペプチドの全長の少なくとも約９０％、より具体的には各天然酵素をコードする核酸配列によりコードされるポリペプチドの全長の少なくとも９５％を有する。ポリペプチドの参照アミノ酸配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関して、本請求されるポリペプチドのアミノ酸配列が、本請求されるポリペプチド配列が上記ポリペプチドの参照アミノ酸の各々１００アミノ酸当たり５アミノ酸までの変更を含むことができる以外は、参照配列と同一であることを意図する。言い換えると、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、上記参照配列のアミノ酸残基の５％までが欠失もしくは別のアミノ酸で置換され得るか、または上記参照配列の全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が、その参照配列に挿入することができる。上記参照配列のこれらの変更は、上記参照アミノ酸配列のアミノ末端の位置もしくはカルボキシ末端の位置で生じることができるか、あるいは、これらの末端位置の間の任意の位置（上記参照配列の残基の間に個々別々に散在するかまたは上記参照配列内の１つ以上の隣接する基（ｇｒｏｕｐ）に散在する）で生じることができる。他の実施形態では、切断は、本明細書の他の場所で記載されるように、より実質的であり得る。
種およびその他の系統発生的同定は、微生物学の分野における当業者に公知の分類に従う。
本明細書で記載する方法および工程が、ある特定の順序で発生するある特定のイベントを示す場合、当業者は、ある特定の工程の順序を改変でき、このような改変が本発明の変形に従っていることを認識する。さらに、ある特定の工程は、可能である場合は並行プロセスにおいて同時に行ってよく、逐次的に行ってもよい。
本明細書で提供する予測的な実施例は、広く例示的で、いずれの様式でも限定しないことを意味する。
略語の意味は、次の通りである：「Ｃ」は、その使用から明確なように摂氏または摂氏℃を意味し、ＤＣＷは、乾燥細胞重量を意味し、「ｓ」は、秒（複数可）を意味し、「ｍｉｎ」は、分（複数可）を意味し、「ｈ」、「ｈｒ」または「ｈｒｓ」は、時間（複数可）を意味し、「ｐｓｉ」は、１平方インチ当たりのポンドを意味し、「ｎｍ」は、ナノメートルを意味し、「ｄ」は、日（複数可）を意味し、「μＬ」または「ｕＬ」または「ｕｌ」は、マイクロリットル（複数可）を意味し、「ｍＬ」は、ミリリットル（複数可）を意味し、「Ｌ」は、リットル（複数可）を意味し、「ｍｍ」は、ミリメートル（複数可）を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」は、ミリモル濃度を意味し、「μＭ」または「ｕＭ」は、マイクロモル濃度を意味し、「Ｍ」は、モル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」は、ミリモル（複数可）を意味し、「μｍｏｌ」または「ｕＭｏｌ」は、マイクロモル（複数可）を意味し、「ｇ」は、グラム（複数可）を意味し、「μｇ」または「ｕｇ」は、マイクログラム（複数可）を意味し、「ｎｇ」は、ナノグラム（複数可）を意味し、「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は、光学濃度を意味し、「ＯＤ６００」は、６００ｎｍの光子波長で測定された光学濃度を意味し、「ｋＤａ」は、キロダルトンを意味し、「ｇ」は、重力定数を意味し、「ｂｐ」は、塩基対（複数可）を意味し、「ｋｂｐ」は、キロ塩基対（複数可）を意味し、「％ｗ／ｖ」は、重量／容量パーセントを意味し、「％ｖ／ｖ」は、容量／容量パーセントを意味し、「ＩＰＴＧ」は、イソプロピル−μ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを意味し、「ＲＢＳ」は、リボソーム結合部位を意味し、「ｒｐｍ」は、毎分回転数を意味し、「ＨＰＬＣ」は、高性能液体クロマトグラフィーを意味し、「ＧＣ」は、ガスクロマトグラフィーを意味する。
ＩＩ．バイオ生産方法
Ａ．炭素源
脂肪酸または脂肪酸由来生成物についての生合成経路を有する組換え微生物とともに本発明において用いられるバイオ生産培地は、適切な炭素源または意図する代謝経路についての基質を含有しなければならない。適切な基質は、それらに限定されないが、グルコースおよびフラクトースなどの単糖、ラクトースもしくはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンもしくはセルロースなどの多糖またはそれらの混合物、ならびにチーズホエー透過物、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜および大麦麦芽などの再生可能な供給材料からの未精製混合物を含み得る。さらに、炭素基質は、二酸化炭素、一酸化炭素またはメタノールなどの、重要な生化学的中間体への代謝変換が証明されている１炭素基質であってもよい。さらに、炭素基質はまたは、二酸化炭素および水素またはこれらの組み合わせ、例えば合成ガスであり得る。１および２炭素基質に加えて、メチロトローフ（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）微生物は、メチルアミン、グルコサミンおよび代謝活性のための様々なアミノ酸などのいくつかのその他の炭素含有化合物を利用することも公知である。
上記の炭素基質およびそれらの混合物の全ては、本発明において炭素源として適切であることが企図されるが、炭素源として用いられる一般的な炭素基質は、グルコース、フラクトースおよびスクロースならびにこれらの糖のいずれかの混合物である。その他の適切な基質は、キシロース、アラビノース、その他のセルロースベースのＣ−５糖、高フラクトースコーンシロップならびに商業的に入手可能な様々なその他の糖および糖混合物を含む。スクロースは、サトウキビ、テンサイ、キャッサバ、バナナまたはその他の果物およびサトウモロコシなどの供給材料から得ることができる。グルコースおよびデキストロースは、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギおよびオート麦などの穀粒を含むデンプンベースの供給材料の糖化により得ることができる。また、いくつかの実施形態では、上記炭素源の全てまたは構成部分は、グリセロールであってよい。代わりに、グリセロールは、追加の炭素源として除外されることがある。
１つの実施形態では、上記炭素源は、グルコース、フラクトース、スクロース、デキストロース、ラクトース、グリセロールおよびそれらの混合物から選択される。様々には、上記炭素源におけるこれらの成分の量は、約５０％より多い、約６０％より多い、約７０％より多い、約８０％より多い、約９０％より多いかもしくはそれより多く最大１００％まで、または本質的に上記炭素源の１００％であってよい。
さらに、メチロトローフ微生物は、メチルアミン、グルコサミンおよび代謝活性のための様々なアミノ酸などのいくつかのその他の炭素含有化合物を利用することが公知である。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンからの炭素を利用して、トレハロースまたはグリセロールを形成することが公知である（Ｂｅｌｌｉｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂ． Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｄ．（Ｉｎｔ． Ｓｙｍｐ．）第７版（１９９３年）、４１５〜３２頁、編集者：Ｍｕｒｒｅｌｌ， Ｊ． Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ， Ｄｏｎ Ｐ．出版社；Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ， Ａｎｄｏｖｅｒ， ＵＫ）。同様に、Ｃａｎｄｉｄａの様々な種は、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒら、Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３巻：４８５〜４８９頁（１９９０年））。よって、本発明の実施形態で利用される炭素の供給源は、広い種類の炭素含有基質を包含し得ることが企図される。
さらに、発酵性糖は、例えば米国特許出願公開第２００７／００３１９１８Ａ１号（これは、本明細書に参照により組み込まれている）に記載されるように、前処理および糖化のプロセスにより、セルロース系バイオマスおよびリグノセルロース系バイオマスから得ることができる。バイオマスとは、任意のセルロース系材料またはリグノセルロース系材料のことをいい、セルロースを含み、必要に応じてヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖および／または単糖をさらに含む材料を含む。バイオマスは、タンパク質および／または脂質などの追加の成分も含んでよい。バイオマスは、単一の供給源に由来してよいか、またはバイオマスは、１より多い供給源に由来する混合物を含むことができる。例えば、バイオマスは、トウモロコシの穂軸とトウモロコシの茎と葉との混合物、または草と葉との混合物を含み得る。バイオマスは、それらに限定されないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、市中の固形廃棄物、工業的固形廃棄物、紙製造からのスラッジ、庭の廃棄物、木材および林業廃棄物を含む。バイオマスの例は、それらに限定されないが、トウモロコシ穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮などの作物残渣、トウモロコシの茎と葉、草、コムギ、コムギわら、オオムギ、オオムギわら、干し草、米わら、スイッチグラス、廃棄紙、サトウキビバガス、モロコシ、ダイズ、穀粒の製粉から得られる成分、木、枝、根、葉、木材チップ、のこくず、灌木および低木、野菜、果物、花ならびに動物堆肥を含む。このようなバイオマスのいずれも、バイオ生産方法または系において用いて、炭素源を提供できる。セルロース系バイオマスを、糖を含むより役に立つ利用できる炭素分子の混合物に分解するための様々なアプローチは、濃酸または希酸（例えば＜１％硫酸）の存在下で加熱すること；アンモニアで処理すること；イオン性の塩での処理；酵素による分解；およびこれらの組み合わせを含む。これらの方法は、通常、機械的分離および粉砕の後であり、適切な分離プロセスが後に続く。
様々な実施形態では、それらに限定されないが、スクロース、グルコース、キシロース、セルロースまたはヘミセルロースを含む広範囲の糖のいずれも、その中で限定培地（例えばそれらに限定されないが、Ｍ９最少培地、硫酸カリウム最少培地、酵母合成最少培地および多くのその他のものまたはこれらの変形物を含む最少塩培地）、脂肪酸または脂肪酸由来生合成経路代替物の１つ以上を提供する微生物の接種材料および上記炭素源が組み合わされ得るリアクタ容器を含む工業的な系などにおいて微生物に与えられる。上記炭素源は、細胞に入り、周知で一般的な代謝経路により異化され、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）を含む一般的な代謝中間体を産生する。（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、第３版、Ｂ． Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４年、４２〜４５頁、６６〜７４頁（糖の基本的な代謝異化経路の教示が参照により組み込まれている）；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、Ｄ． Ｌ． ＮｅｌｓｏｎおよびＭ． Ｍ． Ｃｏｘ、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００年、５２７〜６５８頁（主要な代謝経路の教示が参照により組み込まれている）；ならびにＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版、Ｌ． Ｓｔｒｙｅｒ、Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５年、４６３〜６５０頁（これもまた主要な代謝経路の教示が参照により組み込まれている）を参照されたい。）
バイオベースの炭素は、限定することなくＡＳＴＭ Ｄ６８６６または様々なその他の技術を含む様々な方法に従って、石油ベースの炭素から区別できる。例えば、炭素１４と炭素１２の比は、バイオベースの炭素源と石油ベースの供給源とでは異なり、バイオベースの炭素源においてより高い炭素１４の比が見出される。様々な実施形態では、上記炭素源は石油ベースでないか、または主に石油ベースでない。様々な実施形態では、上記炭素源は、約５０％より多く非石油ベースであり、約６０％より多く非石油ベースであり、約７０％より多く非石油ベースであり、約８０％より多く非石油ベースであり、約９０％より多くまたはそれより多く非石油ベースである。様々な実施形態では、上記炭素源は、約１．０×１０−１４以上の炭素１２に対する炭素１４の比を有する。
Ｂ．微生物
本明細書に記載され、請求される特徴は、本明細書で列挙する微生物またはこれもまた１つ以上の天然の、導入されたかまたは増強された脂肪酸または脂肪酸由来生成物のバイオ生産経路を含む別の適切な微生物から選択される微生物にもたらすことができる。つまり、いくつかの実施形態では、上記微生物は、内因性脂肪酸または内因性脂肪酸由来生成物の生成経路（これは、いくつかのこのような実施形態では、増強されていることがある）を含み、他の実施形態では、上記微生物は、内因性の脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生成経路を含まない。
これらの遺伝子改変微生物のいろいろの種類は、１人以上の本発明者（複数可）のおよび／または本特許出願の所有者に譲渡されたその他の特許出願に記載され得るように、遺伝子改変および／またはその他の系の変更を含んでよい。
実施例は、ある特定の細菌および酵母微生物に対する具体的な改変および評価について記載する。本発明の範囲は、このような種により限定することを意味しないが、広範囲の適切な微生物に全般的に当てはめることができる。全般的に、本発明に用いられる微生物は、細菌、ラン藻類、糸状真菌および酵母から選択できる。
いくつかの実施形態について、選択された化学生成物のバイオ生産について初期に選択された微生物宿主も、グルコースを含む糖を高率に利用する。ほとんどの微生物は、炭水化物を利用できる。しかし、ある特定の環境微生物は、高い効率で炭水化物を利用できず、よって、グルコースまたはその他の炭水化物が主な添加された炭素源であることを意図するこのような実施形態のための、適切な宿主でない。
様々な種のゲノムが公知になっているので、本発明は、絶えず増加している範囲の適切な微生物に容易に用いることができる。さらに、遺伝子配列決定が比較的低コストであることに鑑みて、対象の種の遺伝子配列を容易に決定して、本発明の態様の適用をより容易に実現できるようにすることができる（公知のゲノム配列を有する微生物に対して遺伝子改変を適用することの容易さに基づいて）。
より具体的には、本明細書で記載する様々な基準に基づいて、化学生成物のバイオ生産に適する微生物宿主は、それらに限定されないが、任意のグラム陰性微生物、より具体的にはＥ．ｃｏｌｉなどのＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科のメンバーまたはＯｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎｏｎａｓ ｓｐ．；任意のグラム陽性微生物、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｃｉｌｕｓ ｓｐ．もしくはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．；酵母、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓもしくはＰｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ；およびその他の群または微生物種を一般的に含み得る。より具体的には、脂肪酸または脂肪酸由来生成物のバイオ生産に適する微生物宿主は、それらに限定されないが、属であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、ＨａｎｓｅｎｕｌａおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのメンバーを一般的に含む。特に対象となり得る宿主は、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ（例えばＯＭ５株）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む。
より具体的には、脂肪酸または脂肪酸由来生成物のバイオ生産に適する微生物宿主は、それらに限定されないが、属であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、ＨａｎｓｅｎｕｌａおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのメンバーを一般的に含む。
特に対象となり得る宿主は、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ（例えばＯＭ５Ｔ株）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む。これらの種の任意の公知の株も、出発微生物として利用でき、任意の以下の種（それらの各株を含む）も同様に利用できる：Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｃａｍｐｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｇｉｌａｒｄｉ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｌａｈａｒｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｏｘａｌａｔｉｃｕｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｐａｕｃｕｌｕｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｐｉｎａｔｕｂｏｎｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｒｅｓｐｉｒａｃｕｌｉおよびＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ。
いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、グラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、属であるＺｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａから選択される。いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、種であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａから選択される。いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ株である。
いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、グラム陽性細菌である。いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、属であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍから選択される。いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、種であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓから選択される。特定の実施形態では、組換え微生物は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株である。
いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、酵母である。いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、属であるＰｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、ＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓから選択される。特定の実施形態において、上記組換え微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
本開示に鑑みて、上記の微生物のいずれも、脂肪酸または脂肪酸由来生成物以外の化学生成物の生成に用いてよいことがさらに理解される。
上記宿主を遺伝子改変できることは、任意の組換え微生物の生成のために必須である。遺伝子移入技術の様式は、エレクトロポレーション、接合、形質導入または天然の形質転換によることがある。広範囲の宿主接合性プラスミドおよび薬剤耐性マーカーを利用可能である。クローニングベクターは、その宿主で機能できる抗生物質耐性マーカーの性質に基づいて、その宿主に合わせて作られる。
Ｃ．培地および培養条件
本明細書で開示する型の１つから選択されるような適当な炭素源に加えて、バイオ生産培地は、適切なミネラル、塩、補因子、緩衝剤ならびに培養物の増殖および本発明の下での化学生成物の生成のために必要な酵素経路の促進に適する当業者に公知のその他の成分を含有しなければならない。
本発明の別の態様は、本発明の遺伝子改変微生物および必要に応じて補充物質を含む培地および培養条件に関係する。
典型的には、細胞を、約２５℃〜約４０℃の範囲の温度にて、適当な培地中で、および好熱微生物については７０℃までの温度で増殖させる。本発明における適切な増殖培地は、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）、Ｍ９最少培地、Ｓａｂｏｕｒａｕｄデキストロース（ＳＤ）ブロス、酵母培地（ＹＭ）ブロス、（Ｙｍｉｎ）酵母合成最少培地およびＭ９最少培地などの本明細書で記載する最少培地などの通常の商業的に調製された培地である。その他の限定増殖培地または合成増殖培地も用いてよく、特定の微生物の増殖のための適当な培地は、微生物学またはバイオ生産科学の当業者に公知である。様々な実施形態では、様々な成分を含まないかまたは様々な成分の添加が低レベルである、例えば１０、５、２もしくは１ｇ／Ｌ未満の、それらに限定されないが酵母エキス、ペプトン、トリプトン、大豆粉、コーンスティープリカーもしくはカゼインを含む複合窒素源を含む最少培地を開発して用いてよい。これらの最少培地は、ビオチン、ビタミンＢ１２およびビタミンＢ１２誘導体、チアミン、パントテナートならびにその他のビタミンを含むビタミン混合物が限定的に補充されていてもよい。最少培地は、２８、１７または２．５ｍＭ未満のリン酸塩、２５または４ｍＭ未満の硫酸塩および１３０または５０ｍＭ未満の全窒素を含有する限定された単純無機栄養源を有してもよい。
遺伝子改変微生物を用いる本発明の実施形態において用いられるバイオ生産培地は、意図する代謝経路に適する炭素基質を含有しなければならない。本明細書中の上記のように、適切な炭素基質は、一酸化炭素、二酸化炭素および様々な単糖およびオリゴ糖を含む。
バイオ生産に適するｐＨ範囲は、ｐＨ３．０〜ｐＨ１０．０の間であり、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０の間が、初期の条件について典型的なｐＨ範囲である。しかし、特定の実施形態についての実際の培養条件は、これらのｐＨ範囲により限定されることを意味しない。
バイオ生産は、かき混ぜを行うかもしくは行わない好気、微好気または嫌気条件下で行ってよい。
バイオ生産培地中で生成される脂肪酸または脂肪酸由来生成物の量は、当該技術において公知のいくつかの方法、例えば高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）またはＧＣ／質量分析（ＭＳ）を用いて一般に決定できる。
Ｄ．リアクタおよび系
本発明による方法および／または組成物を利用する発酵系も、本発明の範囲内である。
本明細書に記載されかつ／または言及されるいずれの組換え微生物も、上記微生物が商業的に実行可能な操作で炭素源を脂肪酸または脂肪酸由来生成物に変換する工業的なバイオ生産系に導入してよい。そのバイオ生産系は、このような組換え微生物を、炭素源基質および組換え微生物の増殖に適するバイオ生産培地とともにバイオリアクタ容器に導入し、バイオ生産系を、適切な温度範囲（およびその反応が好気または微好気であるならば溶存酸素濃度範囲）内に適切な時間維持して、選択された化学生成物への基質分子の一部の所望の変換を得ることを含む。工業的なバイオ生産系およびそれらの操作は、化学工学およびバイオプロセス工学の技術における当業者に周知である。
バイオ生産は、かき混ぜを行うかもしくは行わない好気、微好気または嫌気条件下で行ってよい。好気、微好気および嫌気条件を達成するための微生物の培養および集団の操作は、当該技術において公知であり、栄養培地およびそのような微生物集団を含む液体培養物の溶存酸素レベルは、所望の好気、微好気または嫌気条件を維持または確認するために監視してよい。供給材料として合成ガスを用いる場合、好気、微好気または嫌気条件を利用してよい。糖を用いる場合、嫌気、好気または微好気条件を様々な実施形態で実行できる。
本明細書に記載されかつ／または言及されるいずれの組換え微生物も、その微生物が商業的に実行可能な操作で炭素源を選択された化学生成物に変換する工業的なバイオ生産系に導入してよい。上記バイオ生産系は、このような組換え微生物を、炭素源基質および組換え微生物の増殖に適するバイオ生産培地とともにバイオリアクタ容器に導入し、そのバイオ生産系を、適切な温度範囲（および反応が好気または微好気であるならば溶存酸素濃度範囲）内に適切な時間維持して、基質分子の構成部分から選択された化学生成物への所望の変換を得ることを含む。
様々な実施形態では、合成ガス成分または糖が、例えば、その中で限定培地（例えばそれらに限定されないがＭ９最少培地、硫酸カリウム最少培地、酵母合成最少培地および多くのその他のものまたはこれらの変形物を含む最少塩培地）、本明細書で教示する生合成経路（複数可）の実施形態を提供する微生物の接種材料および上記炭素源が組み合わされ得るリアクタ容器を含む工業的な系において微生物に与えられる。上記炭素源は、細胞に入り、周知で一般的な代謝経路により異化され、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）またはアセチル−ＣｏＡを含む一般的な代謝中間体が産生される。（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、第３版、Ｂ． Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４年、４２〜４５頁、６６〜７４頁（糖の基本的な代謝異化経路の教示が参照により組み込まれている）；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、Ｄ． Ｌ． ＮｅｌｓｏｎおよびＭ． Ｍ． Ｃｏｘ、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００年、５２７〜６５８頁（主要な代謝経路の教示が参照により組み込まれている）；ならびにＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版、Ｌ． Ｓｔｒｙｅｒ、Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５年、４６３〜６５０頁（これもまた主要な代謝経路の教示が参照により組み込まれている）を参照されたい。）
工業的バイオ生産の型についてさらに、本発明の様々な実施形態では、バッチ型の工業的バイオリアクタを採用してよい。伝統的なバッチバイオリアクタ系は、その培地の組成が各バイオ生産イベントの開始時に確立され、そのバイオ生産イベントの終末で実質的に終了する期間の間に人工的な変更および追加に供されないことを意味する「閉鎖」であるとみなされる。つまり、上記バイオ生産イベントの開始時に、上記培地には、所望の１つの微生物または複数の微生物が接種され、バイオ生産は、その系に何も添加しないで生じることが許容される。典型的には、しかし、「バッチ」型のバイオ生産イベントは、炭素源の添加に関してバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの因子の制御に対してしばしば試みがなされる。バッチ系において、その代謝産物およびその系のバイオマス組成は、バイオ生産イベントが停止するときまで常に変化する。バッチ培養において、細胞は、静止誘導期から高増殖対数期および最後には増殖速度が減らされるかまたは休止する定常期まで穏やかである。処理しなければ、定常期の細胞は最終的に死滅する。対数期の細胞は、一般的に、所望の最終生成物または中間体の生成の大半を担う。
標準的なバッチ系に対する変形は、流加培養系である。流加培養バイオ生産プロセスも本発明において適切であり、基質を含む栄養分が、バイオ生産が進行するにつれて漸増量で加えられる以外は典型的なバッチ系を含む。流加培養系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にある場合およびその培地中に限定量の基質を有することが望まれる場合に有用である。流加培養系における実際の栄養分濃度の測定は、異なる時間での試料分析によるなど直接測定することができるか、またはｐＨ、溶存酸素およびＣＯ２などの廃ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定できる。バッチおよび流加のアプローチは一般的であり、当該技術において周知であり、例は、Ｔｈｏｍａｓ Ｄ． Ｂｒｏｃｋ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９年）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， Ｍａｓｓ．、Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ、Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．、Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６巻：２２７頁、（１９９２年）ならびにＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ、第２版、Ｊ． Ｅ． ＢａｉｌｅｙおよびＤ． Ｆ． Ｏｌｌｉｓ、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８６年（バイオ生産についての一般的な教示について本明細書に参照により組み込まれている）において見出すことができる。
本発明の実施形態ではバッチ様式または流加様式で行うことができるが、本発明は、連続バイオ生産法に適合可能であることが企図される。連続バイオ生産は、バイオ生産限定培地がバイオリアクタに連続的に加えられ、等量の馴化培地が処理のために同時に除去される「開放」系であるとみなされる。連続バイオ生産は、一般的に、細胞が主に対数期増殖にある制御された密度範囲内にその培養物を維持する。２つの型の連続バイオリアクタ操作は、新鮮な培地が容器に供給され、等しい割合の容器内容物が同時に除去されるケモスタットを含む。このアプローチの制約は、細胞が失われ、高い細胞密度が一般的に達成できないということである。実際には、典型的に、流加培養プロセスを用いてさらにより高い細胞密度を得ることができる。別の連続バイオリアクタは、上記容器から除去される流れを、生存細胞をその容器に戻して再利用する分離技術に供すること以外はケモスタットアプローチと同様である灌流培養を利用する。この型の連続バイオリアクタ操作により、流加培養よりも著しく高い細胞密度が産生されることが示されており、連続的に操作することができる。連続バイオ生産は、工業的操作のために特に有利である。なぜなら、これは、排出、洗浄および次のバイオ生産イベントのための設備の準備に伴う停止時間がより短いからである。さらに、これは、蒸留などの下流ユニット操作を連続的に操作するために、これらをバッチ形態で運転するよりも典型的にはより経済的である。
連続バイオ生産により、細胞増殖または最終生成物濃度に影響する１つの因子または任意の数の因子の調整が可能になる。例えば、１つの方法は、炭素源または窒素レベルなどの制限栄養分を固定の割合に維持し、全てのその他のパラメータを適度に維持することを可能にする。別の系において、増殖に影響するいくつかの因子を連続的に変更し、培地の濁度により測定される細胞濃度を一定に保つことができる。連続バイオ生産プロセスについての栄養分および増殖因子を調整する方法ならびに生成物形成速度を最大限にするための技術は、工業微生物学の技術において周知であり、様々な方法は、Ｂｒｏｃｋ（既出）に詳述されている。
本発明の実施形態では、バッチプロセス、流加プロセスまたは連続プロセスを用いて実行できることおよび、任意の公知の様式のバイオ生産が適切であることが企図される。細胞は、全細胞触媒として不活性足場に固定化して、化学生成物のバイオ生産のための適切なバイオ生産条件に供することができるか、または培養容器などの容器内の液体培地中で培養できることが企図される。つまり、このようなプロセスおよびこれらのプロセスを用いるバイオ生産系において用いられる実施形態は、本発明の遺伝子改変微生物の集団、このような集団を該集団のための栄養分を含む培地中に含む培養系、および選択された化学生成物を製造する方法を含む。
本発明の実施形態は、バイオ生産系において選択された化学生成物を製造する方法を含み、この方法のいくつかは、このようなバイオ生産イベントの後に脂肪酸または脂肪酸由来生成物を得ることを含み得る。例えば、脂肪酸または脂肪酸由来生成物を製造する方法は、適切な栄養分を含む培地を培養容器中に提供する工程と、上記培養容器に、微生物が合成ガスおよび／または糖分子から選択された化学生成物を生成するように本明細書に記載する遺伝子改変を含む遺伝子改変微生物の接種材料を提供する工程と、上記培養容器を、上記遺伝子改変微生物が選択された化学生成物を生成するのに適する条件下に維持する工程とを含み得る。
選択された化学生成物の生成のための工業的バイオ生産系を含むバイオ生産の方法および系において、化学生成物のバイオ生産を、１つ以上の改変を欠く対照微生物に対して少なくとも２０パーセント増加させるのに効果的な１つ以上の態様を改変するように遺伝子操作された組換え微生物を生成して利用することは、本発明の範囲内である。
様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載の化学生成物のバイオ生産のための系であって、微生物細胞培養に適した発酵タンクと、上記発酵タンクからの内容物を抽出容器および／または分離容器に吐出するためのラインと、細胞培養廃棄物から化学生成物を取り出すのに適した抽出容器および／または分離容器とを含む系を対象とする。様々な実施形態では、上記系は、１つ以上の前発酵タンク、蒸留カラム、遠心分離容器、逆抽出カラム、混合容器またはそれらの組み合わせを含む。
以下の出版された情報源は、これらの関連する技術における当業者のレベルを示すため、ならびに必要により、糖供給源からの本発明の下で生成される化学生成物（複数可）の工業的バイオ生産の方法およびこのような変換を達成するために本発明の任意の組換え微生物とともに用い得る工業的な系をどのようにして作製して使用するかを教示する開示を支持するためのそれらの各教示について、本明細書に参照により組み込まれている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ、第２版、Ｊ． Ｅ． ＢａｉｌｅｙおよびＤ． Ｆ． Ｏｌｌｉｓ、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８６年、示された目的のために書物全体、および生物学的リアクタの設計について特に第９章、５３３〜６５７頁；Ｕｎｉｔ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第５版、Ｗ． Ｌ． ＭｃＣａｂｅら、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９３年、示された目的、特にプロセスおよび分離技術分析のために書物全体；Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ Ｓｔａｇｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｐ． Ｃ． Ｗａｎｋａｔ、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ、ＮＪ ＵＳＡ、１９８８年、分離技術の教示のために書物全体）。
Ｅ．遺伝子改変、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列
本発明の実施形態は、宿主微生物への発現ベクターの導入から起こり得、ここでその発現ベクターは、宿主微生物で通常見出されるかまたは見出されない酵素をコードする核酸配列を含有する。
宿主細胞を遺伝子改変できることは、任意の遺伝子改変（組換え）微生物の生成について必須である。遺伝子移入技術の様式は、エレクトロポレーション、接合、形質導入または天然の形質転換によることがある。広範囲の宿主接合性プラスミドおよび薬剤耐性マーカーが利用可能である。クローニングベクターは、その宿主で機能できる抗生物質耐性マーカーの性質に基づいて、宿主生物に合わせて作られる。また、本明細書で開示するように、遺伝子改変（組換え）微生物は、そのゲノムＤＮＡへの改変を含む、プラスミド導入による以外の改変を含んでよい。
アミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸を、タンパク質の構造または機能に対して著しく影響することなく変化させ得ることが、当該技術において長く認識されている。含まれるバリアントは、その示される酵素活性に著しく有害に影響しない限り、欠失、挿入、逆転、反復および型置換を構成できる。どのアミノ酸変化が表現型でサイレントである可能性があるかに関する手引きは、なかでも、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ． Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７巻：１３０６〜１３１０頁（１９９０年）で見出すことができる。この参考文献には、このような教示が参照により組み込まれているが、このような教示は、当業者に一般的に公知でもある。
様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチド分子の発現により得られるポリペプチドは、脂肪酸または脂肪酸由来生成物の耐性関連および生合成経路について本明細書で記載する遺伝子および／または核酸配列によりコードされる１つ以上のアミノ酸配列と少なくともおよそ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有し得る。
任意の特定のポリペプチドが、本明細書で記載する任意のポリペプチド（本明細書で記載する特定の核酸配列に対応し得る）の任意の参照アミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかという実際的な問題として、このような特定のポリペプチド配列は、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｕｎｉｘ（登録商標）用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７１１）などの公知のコンピュータプログラムを用いて従来通り決定できる。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意のその他の配列アラインメントプログラムを用いて特定の配列が本発明による参照配列と例えば９５％同一であるかを決定する場合、パラメータは、同一性のパーセンテージが参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、参照配列におけるアミノ酸残基の合計数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように設定される。
例えば、具体的な実施形態では、参照配列（クエリ配列、すなわち本発明の配列）と対象配列との間の同一性（グローバル配列アラインメントともいう）は、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定できる（Ｃｏｍｐ． Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ． ６巻：２３７〜２４５頁（１９９０年））。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントで用いられる、同一性が狭く解釈される特定の実施形態のための好ましいパラメータは、スコアリングスキーム＝ＰＡＭ（パーセント受容変異）０、ｋ−タプル＝２、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝２０、無作為化割付群長＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象アミノ酸配列長（いずれか短い方）である。この実施形態によると、上記対象配列が、内部欠失のためでなくＮ末端欠失またはＣ末端欠失のために上記クエリ配列より短いならば、結果に対して手動の修正を行って、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、グローバルパーセント同一性を計算する場合に上記対象配列のＮ末端およびＣ末端の切断に相当しないという事実を考慮する。上記クエリ配列に対してＮ末端およびＣ末端で切断された対象配列について、上記パーセント同一性は、上記対象配列のＮ末端およびＣ末端に対して外側のクエリ配列の残基（これらは、対応する対象残基と一致しない／整列されない）の数を、上記クエリ配列の全塩基のパーセントとして計算することにより修正される。残基が一致する／整列されるかどうかの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果により決定される。このパーセンテージは、次いで、特定されたパラメータを用いてＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されるパーセント同一性から減じて、最終パーセント同一性スコアに到達する。この最終パーセント同一性スコアは、本実施形態の目的のために用いられるものである。上記クエリ配列と一致しない／整列されない対象配列のＮ末端残基およびＣ末端残基だけが、上記パーセント同一性スコアを手動で調整する目的のために考慮される。つまり、上記対象配列の最も遠いＮ末端残基およびＣ末端残基の外側のクエリ残基の位置だけが、この手動修正において考慮される。例えば、９０アミノ酸残基の対象配列を、１００残基のクエリ配列と整列させて、パーセント同一性を決定する。欠失は、上記対象配列のＮ末端で生じ、よって、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ末端の最初の１０残基の一致／アラインメントを示さない。１０の対形成していない残基は、配列の１０％を占める（一致していないＮ末端残基およびＣ末端残基の数／クエリ配列の残基の総数）ので、１０％を、ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されるパーセント同一性スコアから減じる。残りの９０残基が完全に一致するならば、上記最終パーセント同一性は、９０％である。別の例において、９０残基の対象配列を、１００残基のクエリ配列と比較する。今回、欠失は内部欠失であるので、上記クエリと一致しない／整列されない対象配列のＮ末端残基またはＣ末端残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算されるパーセント同一性は、手動で修正されない。ここでもまた、上記クエリ配列と一致しない／整列されない、ＦＡＳＴＤＢアラインメントにより表示されるように上記対象配列のＮ末端およびＣ末端の端の外側の残基の位置だけが手動で修正される。
より全般的には、制御配列に適合できる条件下でＥ．ｃｏｌｉなどの微生物においてコード配列の発現を誘導する１つ以上（数個）の制御配列に作動可能に連結した、酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む核酸構築物が、調製できる。上記単離ポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドの発現をもたらすように操作してよい。上記ポリヌクレオチドの配列をベクターに挿入する前に操作することは、発現ベクターに依存して望まれるかまたは必要であることがある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチド配列を改変するための技術は、当該技術においてよく確立されている。
上記制御配列は、適当なプロモーター配列、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞により認識されるヌクレオチド配列であってよい。そのプロモーター配列は、上記ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。上記プロモーターは、変異型、切断型およびハイブリッド型プロモーターを含む、選ばれた宿主細胞において転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であってよく、その宿主細胞と同種または異種のいずれかの細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。特にＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞において上記核酸構築物の転写を誘導するための適切なプロモーターの例は、ｌａｃプロモーター（Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ、１９７６年、ＭｏＩ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １４８巻：２４３〜２５０頁）、ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ８０巻：２１〜２５頁）、ｔｒｃプロモーター（Ｂｒｏｓｉｕｓら、１９８５年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０巻：３５３９〜３５４１頁）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ、１９８６年、Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． １８９巻：１１３〜１３０頁）、ファージプロモーターｐＬ（Ｅｌｖｉｎら、１９９０年、Ｇｅｎｅ ８７巻：１２３〜１２６頁）、ｔｅｔＡプロモーター（Ｓｋｅｒｒａ、１９９４年、Ｇｅｎｅ １５１巻：１３１〜１３５頁）、ａｒａＢＡＤプロモーター（Ｇｕｚｍａｎら、１９９５年、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７巻：４１２１〜４１３０頁）およびｒｈａＰＢＡＤプロモーター（Ｈａｌｄｉｍａｎｎら、１９９８年、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８０巻：１２７７〜１２８６頁）である。その他のプロモーターは、「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ、１９８０年、２４２巻：７４〜９４頁；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版、２００１年（１〜３巻）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に記載されている。
上記制御配列は、適切な転写終結配列、宿主細胞により認識されて転写を終結する配列でもあり得る。上記終結配列は、上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に作動可能に連結している。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において機能的な任意のターミネーターを、本発明において用いてよい。宿主細胞の増殖に関してポ上記リペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することが望ましいこともある。調節系の例は、調節化合物の存在を含む、化学的もしくは物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにするものである。原核生物系における調節系は、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系を含む。
本発明の様々な実施形態について、酵素または各経路のいずれかで同定される酵素の酵素活性の調節と、よって最終的にはそれらの活性とを変化させることを対象とするものを含む、様々な遺伝子操作を含む遺伝子操作が記載され得る。このような遺伝子改変は、選択されかつ／もしくは同定される培養条件下での酵素活性および／または選択性の変化をもたらす転写改変、翻訳改変および翻訳後改変、ならびに／あるいは脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生成に関連付けられる酵素のコピー数および／または変異体を増加させるような追加の核酸配列の提供を対象としてよい。このような遺伝子改変を達成するための具体的な方法およびアプローチは、当業者に周知であり、それらに限定されないが、内因性遺伝要素の発現を増加させること、リプレッサー遺伝子の機能性を減少させること、異種遺伝要素を導入すること、脂肪酸または脂肪酸由来生成物を生成するための酵素変換工程を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列のコピー数を増加させること、遺伝要素を変異させて、変異タンパク質が比酵素活性を増加するようにすること、過剰発現すること、過小発現すること、シャペロンを過剰発現すること、プロテアーゼをノックアウトすること、フィードバック阻害を変更もしくは改変すること、リプレッサーおよび／もしくは競合阻害剤に対し１つ以上の損なわれた結合位置を含む酵素バリアントを提供すること、リプレッサー遺伝子をノックアウトすること、ｍＲＮＡ安定性を改善するための進化、選択および／またはその他のアプローチ、ならびに効果的なレベルの改善を達成するための効果的なコピー数およびプロモーターを有するプラスミドの使用を含む。ランダム変異誘発を実施して、これらのまたはその他の述べられたアプローチのいずれかになり得る遺伝子改変をもたらしてよい。上記遺伝子改変は、さらに広くは、対象の核酸における１つ以上の核酸の付加（挿入を含む）、欠失（例えば変異による）および置換が含まれる。様々な実施形態では、遺伝子改変は、酵素比活性および／または酵素の代謝回転数の改善をもたらす。限定されることなく、変化は、以下の１つ以上により測定してよい：ＫＭ；Ｋｃａｔ；およびＫアビディティ。
様々な実施形態では、より効率的に機能するために、微生物は、１つ以上の遺伝子欠失を含んでよい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、乳酸脱水素酵素（ｌｄｈＡ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）、ピルビン酸酸化酵素（ｐｏｘＢ）およびピルビン酸−ギ酸リアーゼ（ｐｆｌＢ）をコードする遺伝子は、破壊（欠失を含む）されてよい。欠失を含むこのような遺伝子破壊は、限定することを意味せず、様々な実施形態において様々な組み合わせで実行してよい。遺伝子欠失は、変異遺伝子欠失アプローチにより、かつ／またはこれらの酵素の１つ以上の発現が低減しているかまたは発現がない変異株から出発して、かつ／または当業者に公知のその他の方法により成し遂げることができる。遺伝子欠失は、それらに限定されないが、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄｒｅｓｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、＜＜ｗｗｗ．ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ．ｃｏｍ＞＞）により販売されるキットおよびその他の試薬を用いるＲＥＤ／ＥＴ法を含むいくつかの公知の具体的な方法のいずれかにより実現してよい。
より具体的には、後者の方法について、Ｒｅｄ／ＥＴ組換えの使用は、当業者に公知であり、Ｓｔｅｗａｒｔらに対して発行され、この方法についての教示について本明細書に参照することにより組み込まれている米国特許第６，３５５，４１２号および同第６，５０９，１５６号に記載されている。このような方法についての材料およびキットは、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄｒｅｓｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、＜＜ｗｗｗ．ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ．ｃｏｍ＞＞）から入手可能であり、その方法は、製造者の使用説明に従って進めることができる。この方法は、λファージからのリコンビナーゼにより行われる相同組換えにより標的遺伝子を選択マーカーで置き換えることを含む。λ−ｒｅｄリコンビナーゼを発現する宿主生物を、上記標的遺伝子と相同な末端領域（一般的に約５０ｂｐ、代わりに約３００ｂｐまで）に隣接した選択マーカーをコードする直鎖状ＤＮＡ生成物で形質転換する。上記マーカーは、次いで、ＦＬＰ−リコンビナーゼまたはＣｒｅなどの別のリコンビナーゼを保有するプラスミドベクターにより行われる別の組換え工程により除去できる。
微生物染色体ＤＮＡの一部の標的化された欠失または外来遺伝物質の微生物染色体への付加は、アセテート、エタノール、ラクテート、およびその他またはその組み合わせの消失などの、望ましくない代謝生成物の生成を低減または消失するように宿主細胞の代謝を変更するために実施してよい（例えば、図５を参照されたい）。このことは、この一般的な例において本明細書で記載するようなその他の遺伝子改変と組み合わせて用いてよい。この詳細な記載において、複数の実施形態および本発明を実施し得る具体的な例示の実施形態の説明により示される添付の図面に対して言及する。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施できるように十分詳細に記載され、様々な開示される実施形態に対する改変が、当業者により行われ得ることが理解される。
さらに、脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生成について、このような遺伝子改変は、それぞれの脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生成経路内である特定の酵素変換工程を通じてより高い流動速度（ｆｌｕｘ ｒａｔｅ）を達成するように選びかつ／または選択してよく、よって、基本的および／または主な様式で全般的な細胞代謝に影響してよい。例えば、いくつかの実施形態では、この速度は、糖からアセチル−ＣｏＡへの流動を増加させる遺伝子改変によって増加させることができる。
アミノ酸「相同性」は、保存的置換、すなわちポリペプチド中の所定のアミノ酸を、同様の特徴をもつ別のアミノ酸で置換するものを含むことが認められる。保存的置換として典型的に見られるものは、以下の置き換えである：Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅなどの脂肪族アミノ酸の、別の脂肪族アミノ酸での置き換え；Ｓｅｒの、Ｔｈｒでの置き換えもしくはその逆；ＡｓｐもしくはＧｌｕなどの酸性残基の、別の酸性残基での置き換え；ＡｓｎもしくはＧｌｎなどのアミド基を有する残基の、アミド基を有する別の残基での置き換え；ＬｙｓもしくはＡｒｇなどの塩基性残基から別の塩基性残基への交換；ならびにＰｈｅもしくはＴｙｒなどの芳香族残基の、別の芳香族残基での置き換え。
本明細書で示される全ての核酸配列およびアミノ酸配列について、これらの配列の保存的に改変されたバリアントが含まれ、これらが本発明の様々な実施形態において本発明の範囲内であることが認められる。当業者の技能の範囲内に十分に含まれる保存改変バリアントおよびより広範囲に変化した配列を含み得る機能的に等価な核酸配列およびアミノ酸配列（機能性バリアント）ならびにこれらを含む微生物も、このような配列および／または微生物を含む方法ならびに系と同様に、本発明の様々な実施形態の範囲内である。様々な実施形態では、十分に相同なタンパク質またはその構成部分をコードする核酸配列は、本発明の範囲内である。より一般的には、本発明で採用される特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、遺伝子コードの縮重により変化し得るが、それでもなお本発明の範囲内になる。以下の表は、アミノ酸のうちの類似性（保存的置換およびあまり保存的でない置換は、これらに基づくことがある）およびこの縮重を反映する様々なコドン重複性のまとめを示す。
Figure 2015524283
凡例：側基およびその他の関連する特性：Ａ＝酸性；Ｂ＝塩基性；Ａｌｉ＝脂肪族；Ａｍｉ＝アミン；Ａｒｏ＝芳香族；Ｎ＝非極性；ＰＵ＝極性非荷電；ＮＥＧ＝負に荷電；ＰＯＳ＝正に荷電。
また、本明細書で述べる特定の核酸配列およびコードされる各アミノ酸配列のバリアントおよび構成部分は、このような核酸配列バリアントおよび／または構成部分が、限定することなく、ヌクレオチド番号１で始まってヌクレオチド番号１５で終わる配列、ヌクレオチド番号２で始まってヌクレオチド番号１６で終わる配列、ヌクレオチド番号３で始まってヌクレオチド番号１７で終わる配列などを含む、本明細書で述べる核酸配列で示す任意の１５ヌクレオチドの配列と同一の１５ヌクレオチドの配列を含有する場合に、所望の機能性、例えば選択されたレベルでの酵素活性を示し得る。本発明は、１５ヌクレオチドを超える長さ（例えば１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上のヌクレオチド）であり、本明細書で述べる核酸配列に示す配列の任意の構成部分と同一であるヌクレオチド配列を含有する単離核酸も提供することが認められる。例えば、本発明は、限定することなく、ヌクレオチド番号１で始まってヌクレオチド番号２５で終わる配列、ヌクレオチド番号２で始まってヌクレオチド番号２６で終わる配列、ヌクレオチド番号３で始まってヌクレオチド番号２７で終わる配列などを含む、本明細書で述べる任意の１つ以上の（任意の群分けを含む）核酸配列に示す任意の２５ヌクレオチドの配列と同一の２５ヌクレオチドの配列を含有する単離核酸を提供する。追加の例は、限定することなく、５０以上のヌクレオチドの長さ（例えば１００、１５０、２００、２５０、３００以上のヌクレオチド）であり、本明細書で開示する配列のいずれかの任意の構成部分と同一であるヌクレオチド配列を含有する単離核酸を含む。このような単離核酸は、限定することなく、脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生成経路に関係するような考察および／または実施例のいずれか１つのセクションで示す核酸配列、脂肪酸合成酵素系または脂肪酸または脂肪酸由来生成物の耐性の酵素をコードする核酸配列を含有する単離核酸を含み得る。例えば、本発明は、単一挿入、単一欠失、単一置換、複数挿入、複数欠失、複数置換またはそれらの任意の組み合わせ（例えば単一欠失と複数挿入）を含有する本明細書で列挙する核酸配列を含有する単離核酸を提供する。このような単離核酸分子は、本明細書で列挙する（すなわち配列表で）核酸配列と、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９パーセントの配列同一性を共有し得る。
追加の例は、限定することなく、５０以上のアミノ酸残基の長さ（例えば１００、１５０、２００、２５０、３００以上のアミノ酸残基）であり、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列の任意の構成部分と同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有する単離核酸を含む。
さらに、本発明は、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列の変形を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有する単離核酸を提供する。例えば、本発明は、単一挿入、単一欠失、単一置換、複数挿入、複数欠失、複数置換またはそれらの任意の組み合わせ（例えば単一欠失と複数挿入）を含有する本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有する単離核酸を提供する。このような単離核酸分子は、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列と、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９パーセントの配列同一性を共有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有し得る。
保存的アミノ酸置換およびその他のアミノ酸置換についての基礎を与える特性の例は、表１に例示する。よって、当業者は、所望の機能性を示すアミノ酸配列バリアントを得るために多数の置換を行うことができる。ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＰおよびその他のアラインメントツールおよび比較ツールを用いて、より少ない置換を行うことができる（選択されたレベルまで活性を変更すること（これは、複数置換を必要とし得る）を対象とするのでなければ）高度に保存された領域を評価できる。活性部位またはその他の結合モチーフもしくは構造モチーフに関与しないことが認識されるかまたはそのように考えられている領域に、より多くの置換を行うことができる。表１に従って、例えば、必要に応じてサイズ／分子量を考慮して、列挙された配列の１つの極性非荷電（ＰＵ）アミノ酸を極性非荷電アミノ酸に置換してよい（すなわちセリンをトレオニンに代えて置換する）。どのアミノ酸変化が表現型サイレントである可能性があるかに関する手引きは、なかでも、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ． Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７巻：１３０６〜１３１０頁（１９９０年）で見出すことができる。この参考文献には、このような教示が参照により組み込まれているが、このような教示は、当業者に一般的に公知でもある。認識される保存アミノ酸置換は（各組のコロンの後に置換可能なアミノ酸が続く）：ａｌａ：ｓｅｒ；ａｒｇ：ｌｙｓ；ａｓｎ：ｇｌｎまたはｈｉｓ；ａｓｐ：ｇｌｕ；ｃｙｓ：ｓｅｒ；ｇｌｎ：ａｓｎ；ｇｌｕ：ａｓｐ；ｇｌｙ：ｐｒｏ；ｈｉｓ：ａｓｎまたはｇｌｎ；ｉｌｅ：ｌｅｕまたはｖａｌ；ｌｅｕ：ｉｌｅまたはｖａｌ；ｌｙｓ：ａｒｇまたはｇｌｎまたはｇｌｕ；ｍｅｔ：ｌｅｕまたはｉｌｅ；ｐｈｅ：ｍｅｔまたはｌｅｕまたはｔｙｒ；ｓｅｒ：ｔｈｒ；ｔｈｒ：ｓｅｒ；ｔｒｐ：ｔｙｒ；ｔｙｒ：ｔｒｐまたはｐｈｅ；ｖａｌ：ｉｌｅまたはｌｅｕを含む。
特定の種についてのコドンの好みおよびコドン使用の表を用いて、その特定の種のコドン使用の好みの利点を利用する単離核酸分子を設計製作することができることが注目される。例えば、本明細書で提供する単離核酸は、特定の対象の生物により優先的に使用されるコドンを有するように設計できる。多数のソフトウェアおよび配列決定サービスが、このような配列のコドン最適化のために利用可能である。
本発明は、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列の全体のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列の構成部分を含有するポリペプチドを提供する。例えば、本発明は、限定することなく、アミノ酸残基番号１で始まってアミノ酸残基番号１５で終わる配列、アミノ酸残基番号２で始まってアミノ酸残基番号１６で終わる配列、アミノ酸残基番号３で始まってアミノ酸残基番号１７で終わる配列などを含む、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列の任意の１５アミノ酸の配列と同一の１５アミノ酸の配列を含有するポリペプチドを提供する。本発明は、１５アミノ酸残基を超える長さ（例えば１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上のアミノ酸残基）であり、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列の任意の構成部分と同一であるアミノ酸配列を含有するポリペプチドも提供することが認められる。例えば、本発明は、限定することなく、アミノ酸残基番号１で始まってアミノ酸残基番号２５で終わる配列、アミノ酸残基番号２で始まってアミノ酸残基番号２６で終わる配列、アミノ酸残基番号３で始まってアミノ酸残基番号２７で終わる配列などを含む、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列の任意の２５アミノ酸の配列と同一の２５アミノ酸の配列を含有するポリペプチドを提供する。追加の例は、限定することなく、５０以上のアミノ酸残基の長さ（例えば１００、１５０、２００、２５０、３００以上のアミノ酸残基）であり、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列の任意の構成部分と同一であるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む。さらに、上記のことから、１５ヌクレオチドの配列は、５アミノ酸の配列を提供し、よって、それよりあとのより長いアミノ酸配列が、本明細書で提供する配列と同一性を有する上記のヌクレオチド配列の長さにより規定され得ることが認められる。
さらに、本発明は、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列で示されるアミノ酸配列の変形を有するアミノ酸配列であるポリペプチドを提供する。例えば、本発明は、単一挿入、単一欠失、単一置換、複数挿入、複数欠失、複数置換またはそれらの任意の組み合わせ（例えば単一欠失と複数挿入）を含有する本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列を含有するポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドは、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列と、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９パーセントの配列同一性を共有するアミノ酸配列を含有できる。特定のバリアントのアミノ酸配列は、任意の数の変形および変形の型の任意の組み合わせを含んでよい。
本明細書で示すように、バリアントアミノ酸配列を有するポリペプチドは、酵素活性を保持できる。このようなポリペプチドは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、部位特異的変異誘発または様々なＰＣＲ技術などの標準的な手順を用いて操作することにより生成できる。本明細書で注目されるように、１つの型の改変は、１つ以上のアミノ酸残基を、同様の化学的および／または生化学的特性を有するアミノ酸残基の代わりに置換することを含む。例えば、ポリペプチドは、１つ以上の保存的置換を含む、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を有することができる。
より実質的な変化は、あまり保存的でない置換を選択することにより、および／またはより重要であり得る配列の領域において、例えば、（ａ）置換の領域でのポリペプチド主鎖の構造、例えばシートもしくはヘリックス立体構造；（ｂ）標的部位でのポリペプチドの電荷もしくは疎水性；または（ｃ）側鎖の嵩高さを維持するそれらの効果においてより著しく異なる残基を選択することにより得ることができる。一般的に、ポリペプチド機能における最大の変化を生成すると予期される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリンまたはトレオニンが、疎水性残基、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンもしくはアラニンを置換する（またはそれにより置換される）；（ｂ）システインまたはプロリンが、任意のその他の残基を置換する（またはそれにより置換される）；（ｃ）正の電荷を持った側鎖を有する残基、例えばリシン、アルギニンもしくはヒスチジンが、負の電荷を持った残基、例えばグルタミン酸もしくはアスパラギン酸を置換する（またはそれにより置換される）；または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、側鎖を有さないもの、例えばグリシンを置換する（またはそれにより置換される）というものである。これらのアミノ酸置換（またはその他の欠失もしくは付加）の効果は、酵素活性を有するポリペプチドについて、関連する天然ポリペプチドと同じ基質から関連する天然ポリペプチドと同じ生成物への変換をポリペプチドが触媒できることを分析することにより評価できる。よって、５、１０、２０、３０、４０、５０以下の保存的置換を有するポリペプチドが、本発明により提供される。
ポリペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸は、標準的なＤＮＡ変異誘発技術、例えばＭ１３プライマー変異誘発により生成できる。これらの技術の詳細は、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年で提供される。核酸分子は、その分子が導入される特定の生物のコドン使用の偏りに合うようにコード領域に変化を含有できる。
代わりに、上記コード領域は、核酸配列が実質的に変更されるが、それでもなお天然アミノ酸配列と同一または実質的に同様のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするような様式で、そのコード配列を変更するために、遺伝子コードの縮重を利用することにより変更できる。例えば、アラニンは、オープンリーディングフレームにおいて、ヌクレオチドコドントリプレットＧＣＴによりコードされる。上記遺伝子コードの縮重のために、３つのその他のヌクレオチドコドントリプレット（ＧＣＡ、ＧＣＣおよびＧＣＧ）もアラニンをコードする。つまり、上記オープンリーディングフレームの核酸配列は、この位置にて、これらの３つのコドンのいずれかに、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列またはそのポリペプチドの特徴に影響することなく変更することができる。上記遺伝子コードの縮重に基づいて、核酸バリアントを、本明細書で開示する核酸配列から、本明細書で記載する標準的な変異誘発技術を用いて、または核酸配列の合成により、導くことができる。つまり、様々な実施形態について、本発明は、同じポリペプチドをコードするが、上記遺伝子コードの縮重によって核酸配列が変化している核酸分子を包含する。
本発明は、少なくとも約１２塩基の長さ（例えば、少なくとも約１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００または２００００塩基の長さ）であり、ハイブリダイゼーション条件下で、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示する配列を有する核酸のセンス鎖またはアンチセンス鎖とハイブリダイズする単離核酸も提供する。上記ハイブリダイゼーション条件は、中程度または高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件であり得る。
Ｆ．マロニル−ＣｏＡの、ネイティブなマロニル−ＡＣＰ依存性脂肪酸合成からマロニル−ＣｏＡ依存性脂肪酸合成への再指向
遺伝子改変微生物などの本発明の構成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、マロニル−ＣｏＡが基質である、脂肪酸または脂肪酸由来生成物についての生成経路を含み、微生物のマロニル−ＡＣＰ依存性脂肪酸合成酵素系遺伝子の１つ以上によりコードされる酵素の活性を低減するための１つ以上の遺伝子改変も含み得る。上記構成物は本発明の方法および系において用いることができる。
商業的な発酵の対象の多くの微生物におけるいくつかの脂肪酸または脂肪酸由来生成物の微生物発酵に関して、マロニル−ＣｏＡは、通常の増殖条件下では脂肪酸およびリン脂質などのその誘導体（これらは、次いで、細胞膜でおよびその他の重要な細胞機能のために用いられる）に変換される代謝中間体である。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでは、上記脂肪酸合成酵素系は、ＩＩ型または解離脂肪酸合成酵素系である。この系において、マロニル−ＡＣＰ依存性脂肪酸生成経路の酵素は、別々の遺伝子によりコードされ、多くの重要な代謝経路に共通して、上流の酵素を阻害する下流の生成物によることを含んで、良好に調節されている。
様々な微生物では、脂肪酸合成系（すなわち経路または複合体）を介しての代謝中間体マロニル−ＣｏＡから脂肪酸への変換は、マロニル−ＣｏＡが唯一または主要に使用される。代替の化学生成物への生成経路が微生物に存在する場合、マロニル−ＣｏＡから脂肪酸へのこのような変換を低減することにより、その代替の化学生成物の生成についての計量（ｍｅｔｒｉｃ）が改善され得ることが分かっている。例えば、多くの微生物細胞において、上記脂肪酸合成酵素系は、以下の酵素活性を有するポリペプチドを含む：マロニル−ＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）トランスアシラーゼ；β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素；β−ケトアシル−ＡＣＰ還元酵素；β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ；３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ；およびエノイル−ＡＣＰ還元酵素。様々な実施形態では、これらのポリペプチドの温度感受性の形態をコードする核酸配列を、天然酵素の代わりに導入でき、このような遺伝子改変微生物が、（これらの温度に影響されやすいポリペプチドが、タンパク質構造における変更または完全変性のために部分的または完全に不活化される）上昇した温度で培養される場合、化学生成物の増加が観察される。Ｅ．ｃｏｌｉでは、これらの温度感受性変異遺伝子として、ｆａｂＩｔｓ（Ｓ２４１Ｆ）、ｆａｂＢｔｓ（Ａ３２９Ｖ）またはｆａｂＤｔｓ（Ｗ２５７Ｑ）を挙げることができる。他の実施形態では、他の型の遺伝子改変を行って、これらのポリペプチドの１つ以上の酵素活性を別の方法で調整（例えば低くする）してよい。様々な実施形態では、このような遺伝子改変の結果は、マロニル−ＣｏＡからネイティブな経路を介する脂肪酸、全バイオマスへの変換の低減、および炭素源から脂肪酸または脂肪酸由来生成物を含めた化学生成物へのマロニル−ＣｏＡ依存性かつマロニル−ＡＣＰ非依存性の経路を介する変換のより大きい割合が得られるように、マロニル−ＣｏＡの利用をシフトすることである。様々な実施形態では、微生物により生成される化学生成物の比生産性が、予想外に高い。また、マロニル−ＣｏＡ生成を増加させるような追加の遺伝子改変を、ある特定の実施形態について行ってよい。図１は、中間体マロニル−ＣｏＡを通るフラックスを増加させるための遺伝子改変に関連する微生物の代謝経路を示す。
ある酵素、エノイル−アシルキャリアタンパク質還元酵素（ＥＣ番号１．３．１．９、エノイル−ＡＣＰ還元酵素ともいう）は、マロニル−ＣｏＡからの脂肪酸生合成のために重要な酵素である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて、この酵素、ＦａｂＩは、遺伝子ｆａｂＩによりコードされる（「Ｅｎｏｙｌ−Ａｃｙｌ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ （ｆａｂＩ） Ｐｌａｙｓ ａ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｔｉｎｇ Ｃｙｃｌｅｓ ｏｆ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｊ． ＨｅａｔｈおよびＣｈａｒｌｅｓ Ｏ． Ｒｏｃｋ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０巻：４４号、２６５３８〜２６５４３頁（１９９５年）（ｆａｂＩおよび脂肪酸合成酵素系のその論考について参照することにより組み込まれている）を参照されたい）。
本発明は、エノイル−ＡＣＰ還元酵素の酵素活性（これは、発酵イベントの間に調整されることがある）を有するポリペプチドをコードする核酸配列（ポリヌクレオチド）を備える微生物を利用してよい。例えば、温度感受性エノイル−ＡＣＰ還元酵素をコードする核酸配列を、天然エノイル−ＡＣＰ還元酵素の代わりに提供することにより、培養温度の上昇で酵素活性が低減し、次いで、マロニル−ＣｏＡの利用を所望の化学生成物の生成へシフトさせることができる。このような上昇した温度では、上記酵素は、その温度とがそうであるように、非許容性である（ｎｏｎ−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）とみなされる。このような配列の１つは、Ｅ．ｃｏｌｉの変異体温度感受性ｆａｂＩ（ｆａｂＩＴＳ）またはｆａｂＩｔｓ（Ｓ２４１Ｆ）。
Ｅ．ｃｏｌｉ以外の種におけるエノイル−ＡＣＰ還元酵素についての核酸配列およびアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰなどの公知のゲノミクスデータベースにおいて相同性検索を行うことにより容易に得られることが認められる。その他の種における相同体および機能的に等価な配列を得るためのアプローチは、本明細書に記載される。よって、本発明は、商業的な対象の多くの微生物種について当業者により実施できることが認められる。
それに限定されないが、天然エノイル−ＡＣＰまたはエノイル−ＣｏＡ還元酵素を、この酵素の誘導性プロモーターを含む核酸配列で置き換えて、初期の誘導の後に誘導がないようにして、エノイル−ＡＣＰまたはエノイル−ＣｏＡ還元酵素の酵素活性を、選択された細胞密度に到達した後に減少させることなどの当業者に公知の、温度感受性エノイル−ＡＣＰ還元酵素以外のアプローチを採用してよい。
いくつかの態様では、本発明は、マロニル−ＣｏＡを選択された化学生成物に変換するために効果的な選択された化学生成物の生成経路を提供するか、完了するかまたは増強する少なくとも１つの遺伝子改変を含み、上記微生物細胞における重炭酸塩レベルを増加させるためのカルボニックアンヒドラーゼの遺伝子改変および／またはその培養培地への重炭酸塩および／もしくは炭酸塩の補充をさらに含んでよく、かつアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼおよびＮＡＤＰＨ依存性トランスヒドロゲナーゼの１つ以上の酵素活性を増加させるための１つ以上の遺伝子改変をさらに含んでよい遺伝子改変微生物を含む。関連付けられる方法および系は、このような遺伝子改変微生物を利用する。
様々な実施形態では、本発明は、選択された細胞密度の遺伝子改変微生物集団を容器内に提供する工程であって、上記遺伝子改変微生物が、マロニル−ＣｏＡから化学生成物を生成するための生成経路を含む、提供する工程と、上記遺伝子改変微生物のマロニル−ＡＣＰ依存性脂肪酸合成酵素経路の少なくとも１つの酵素の酵素活性を低減させる工程とを含む、化学生成物を作製する方法を対象とする。
様々な実施形態では、微生物宿主細胞においてエノイル−ＡＣＰ還元酵素の酵素活性を低減することにより、上昇した比生産性および容積生産性（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）での化学生成物の生成がもたらされる。さらに他の実施形態では、微生物宿主細胞においてエノイル−ＡＣＰ還元酵素の酵素活性を低減することにより、上昇した比生産性および容積生産性での化学生成物の生成がもたらされる。
図２は、マロニル−ＣｏＡ依存性様式による脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成のためのブチリル−ＣｏＡプライマーを生成するための微生物の代謝経路を示す。これには、マロニル−ＣｏＡ依存性アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素の酵素の活性を増加させることを単独で、または微生物のアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性を減少させることと組み合わせて伴う。アセトアセチル−ＣｏＡのマロニル−ＣｏＡ依存性生成には、その次に、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素または３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素活性、ならびにエノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびトランス−２−エノイル−ＣｏＡ還元酵素活性を増加させることによるブチレートへの還元が続く。次いで、ブチリル−ＣｏＡプライマーを、より長い鎖の脂肪酸アシル−ＣｏＡ、または代わりにブチレート、ブタノールまたは他の生成物を生成するために使用することができる。
図３Ａは、プライマーブチリル−ＣｏＡから開始するアセチル−ＣｏＡ依存性様式による脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成を生じる微生物の代謝経路を示す。これには、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ活性、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素または３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素活性、ならびにエノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびトランス−２−エノイル−ＣｏＡ還元酵素活性の活性を増加させることを伴う。
図３Ｂは、プライマーブチリル−ＣｏＡから開始するマロニル−ＣｏＡ依存性様式による脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成を生じる微生物の代謝経路を示す。これには、３−ケトアシル−ＣｏＡ合成酵素またはエロンガーゼ活性、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素または３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素活性、ならびにエノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびトランス−２−エノイル−ＣｏＡ還元酵素活性の活性を増加させることを伴う。
これらの酵素の酵素活性を低減するための遺伝子改変についての別のアプローチは、上記エノイル−ＡＣＰ還元酵素遺伝子（例えばＥ．ｃｏｌｉにおけるｆａｂＩ）などの１つのこのような酵素を促進する誘導性プロモーターを提供することである。このような例では、このプロモーターは、本明細書の方法の第１段階の間に誘導され（例えばイソプロピル−μ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて）、そのＩＰＴＧが消耗し、第２工程から除かれたかまたは希釈された後に、エノイル−ＡＣＰ還元酵素の酵素活性の低減が開始し得る。本明細書で記載し、かつ／または当業者に公知のような酵素発現および酵素活性を制御するその他のアプローチを用いてよい。例えば、ホスフェート枯渇に応答してオンになるプロモーターを使用して、所望の遺伝子を制御可能に発現させることができる。このようなプロモーターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｙｉｂＤ遺伝子プロモーターまたはｐｓｔＳ遺伝子プロモーターを挙げることができる。
エノイル−ＣｏＡ還元酵素は、上記脂肪酸合成酵素系の重要な酵素とみなされるが、本明細書で列挙するようなこの系の酵素活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（核酸配列）の任意の組み合わせに対して遺伝子改変を行ってよい。例えば、ＦａｂＢである、β−ケトアシル−アシルキャリアタンパク質合成酵素Ｉは、増殖ならびに飽和および不飽和の両方の脂肪酸の生合成に必須であるＥ．ｃｏｌｉにおける酵素である。ＦａｂＢの不活化は、脂肪酸伸長の阻害および細胞増殖の減退、ならびにマロニル−ＡＣＰのマロネート部分をアセチル−ＣｏＡに戻して再利用する無益回路の消失をもたらす。ＦａｂＦである、β−ケトアシル−アシルキャリアタンパク質合成酵素ＩＩは、飽和脂肪酸の合成および細胞における膜流動性の制御に要求される。両酵素は、セルレニンにより阻害される。
ＦａｂＦの過剰発現は、脂肪酸生合成の減退をもたらすと報告されている。ＦａｂＦは、ＦａｂＤである、マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼとの会合についてＦａｂＢに勝ると提案されている。ＦａｂＢとＦａｂＤとの会合は、脂肪酸伸長を開始する縮合反応に要求される（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１９９３年９月、５２２〜５４２頁、５７巻、３号；Ｋ． Ｍａｇｎｕｓｏｎら、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；Ｗ． Ｚｈａら、「Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ ｌｅｖｅｌ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｖｉａ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１巻（２００９年）１９２〜１９８頁を参照されたい）。このような脂肪酸合成酵素の酵素を低減するための遺伝子改変の代替は、培養系に、１つ以上のこのような酵素の適切な阻害剤を提供することである。このアプローチは、独立して、または遺伝子改変アプローチと組み合わせて実行できる。セルレニン、チオラクトマイシンおよびトリクロサン（この列挙は限定しない）などの阻害剤または１つ以上の上記脂肪酸合成酵素系遺伝子によりコードされる酵素の活性を低減することを対象とする遺伝子改変を、単一または組み合わせて採用してよい。
特定の理論と結び付けられることなく、微生物におけるエノイル−ＡＣＰ還元酵素（および／または上記脂肪酸合成酵素系のその他の酵素）の酵素活性を低減することにより、上記酵素の上流の代謝中間体であるマロニル−ＣｏＡの蓄積および／または短絡を導き、このようなマロニル−ＣｏＡは、次いで、化学生成物に変換されることがある（これに対して上記微生物細胞は、マロニル−ＣｏＡを利用する代謝経路を含む）と考えられている。ある特定の本発明の構成物、方法および系では、エノイル−ＡＣＰ還元酵素（またはより一般的には上記脂肪酸合成酵素系のもの）の酵素活性の低減は、遺伝子改変微生物の十分な細胞密度に到達した後に発生するようにされる。この二相培養アプローチは、特定の生成速度を維持する細胞バイオマスにおける生体触媒の所望の量と、上記エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性（および／または脂肪酸合成酵素系のその他の酵素の活性）が低減された後に細胞塊に向けられる炭素をより少なくすることに部分的に起因し得る収率とを釣り合わせる。このことは、マロニル−ＣｏＡの正味の利用のシフトをもたらし、よって、所望の化学生成物への炭素フラックスがより大きくなる。
本発明の様々な実施形態では、上記比生産性が上昇し、これは、全体的に迅速で効率的な微生物発酵の方法および系をもたらす。様々な実施形態では、上記容積生産性も実質的に上昇する。
教示および以前のデータに基づいた、脂肪酸についてなどの比生産性パラメータと容積生産性（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）パラメータの両方の改善は予想外であり、当技術分野を進歩させる。
エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性および／または上記脂肪酸合成酵素系のその他の酵素の低減は、本明細書で論じるように、いくつかの様式で達成できる。
マロニル−ＣｏＡから脂肪酸アシル−ＡＣＰ分子または脂肪酸アシル−ＣｏＡ分子および脂肪酸分子への変換を「調整するための手段」とは、以下のいずれか１つを意味する：１）微生物細胞において、上記マロニル−ＡＣＰ依存性脂肪酸合成酵素系酵素の１つ（例えば本明細書で述べるもの）の活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを提供することであって、このようにコードされる上記ポリペプチドが、低減された酵素活性を有する（例えば、酵素活性を低くするための変異および／またはプロモーター置換などにより）か、または低減された酵素活性を有するように調整され得る（例えば、温度感受性、誘導性プロモーターなどにより）こと、２）微生物細胞または集団を含む容器に、１つ以上の上記マロニル−ＡＣＰ依存性脂肪酸合成酵素系酵素（例えば本明細書で述べるもの）の酵素活性を阻害する阻害剤を、１つ以上のこれらの酵素の酵素活性を低減するために効果的な供与量で提供すること。これらの手段は、互いに組み合わせて行ってよい。調整する手段が、例えば温度感受性脂肪酸合成酵素系ポリペプチド（例えばエノイル−ＡＣＰ還元酵素）を含む遺伝子改変微生物の集団を含む培養容器の温度を増加させることによるか、または阻害剤を加えることにより、発酵イベントの間の上記脂肪酸合成酵素系のより高い活性からより低い活性への変換を含む場合、このような脂肪酸合成酵素系の２つの様式、すなわち１つはその間により高い活性が存在する場合、２つ目は、その間により低い活性が存在する場合が想定される。そのより低い活性の様式の間に、１つ以上のマロニル−ＣｏＡ依存性、マロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪酸アシル−ＣｏＡ代謝経路の活性の増加によるマロニル−ＣｏＡから選択された化学生成物へのより大きい利用へのシフトが進行し得る。
注目した酵素活性（複数可）を低減するための調整が一旦働くと、そのように調整されたそれぞれの各酵素活性は、天然の非調整酵素活性（例えば細胞におけるまたは単離された）の活性と比較して、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０または少なくとも９０パーセント低減され得る。同様に、マロニル−ＣｏＡから脂肪酸アシル−ＡＣＰ分子または脂肪酸アシル−ＣｏＡ分子への変換は、非調整細胞またはその他の系におけるそのような変換と比較して、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０または少なくとも９０パーセント低減され得る。同じように、マロニル−ＣｏＡから脂肪酸分子への変換は、非調整細胞またはその他の系におけるそのような変換と比較して、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０または少なくとも９０パーセント低減され得る。
Ｇ．マロニル−ＣｏＡから脂肪酸アシル−ＣｏＡ依存性生成物への生成経路
様々な実施形態では、本発明の構成物、方法および系には、マロニル−ＣｏＡを脂肪酸または脂肪酸由来生成物に変換する代謝生成経路を含めることが伴う。
上記のポリペプチドのいずれも、ＮＡＤＨ依存性またはＮＡＤＰＨ依存性であってよく、当該技術において公知の方法を用いて、特定の酵素をいずれかの形態に変換してよい。より具体的には、補因子としてＮＡＤＰＨを用いるポリペプチドを、補因子としてＮＡＤＨを用いるポリペプチドに変換するために、他者により記載されるものなどの任意の方法を用いることができる（Eppinkら、J Mol.Biol.、２９２巻（１号）：８７〜９６頁（１９９９年）、HallおよびTomsett、Microbiology、１４６巻（Ｐｔ６号）：１３９９〜４０６頁（２０００年）、およびDohrら、Proc. Natl.Acad. Sci.、９８巻（１号）：８１〜８６頁（２００１年））。（例えば、ＷＯ２００２／０４２４１８を参照されたい）。
様々な実施形態では、選択された化学生成物のバイオ生産は、例えば本明細書で開示する方法の１つを用いることにより、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０および少なくとも５０ｇ／リットルの力価に到達し得る。
本明細書で開示する進歩を認めることによって認識され得るように（これらは選択された化学生成物の商業的発酵に関連するので）、本発明の実施形態は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも８０、少なくとも１００または少なくとも１２０グラムの化学生成物を最終（例えば使った）発酵ブロス１リットル当たり生成するのに効果的で、このことを本明細書で開示する比生産性および／または容積生産性の割合とともに達成する微生物（および対応する方法）を得るように、他の遺伝子改変および／または方法もしくは系の調整と組み合わせてよい。
いくつかの実施形態では、微生物による化学バイオ生産イベント（すなわち、微生物の培養集団を用いる発酵イベント）は、本明細書で記載するような遺伝子改変微生物を用いて進行し、ここで、上記比生産性は、乾燥重量基準の微生物細胞１グラム当たり１時間当たり生成される０．０１から０．６０グラムの間の選択された化学生成物（ｇ選択された化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒ）である。様々な実施形態では、上記比生産性は、０．０１より多い、０．０５より多い、０．１０より多い、０．１５より多い、０．２０より多い、０．２５より多い、０．３０より多い、０．３５より多い、０．４０より多い、０．４５より多いまたは０．５０ｇの選択された化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒより多い。比生産性は、特定の微生物による化学生成イベントにおいて２、４、６、８、１２または２４時間の期間にわたって評価してよい。より具体的には、化学生成物についての上記比生産性は、０．０５から０．１０、０．１０から０．１５、０．１５から０．２０、０．２０から０．２５、０．２５から０．３０、０．３０から０．３５、０．３５から０．４０、０．４０から０．４５または０．４５から０．５０ｇの選択された化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒの間、０．５０から０．５５または０．５５から０．６０ｇの選択された化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒの間である。様々な実施形態は、このような生産性を実証する培養系を含む。
また、本発明の様々な実施形態では、達成される上記容積生産性は、１リットル当たり１時間当たり０．２５ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）（ｇ（化学生成物）／Ｌ−ｈｒ）であってよく、０．２５ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、０．５０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、１．０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、１．５０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、２．０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、２．５０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、３．０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、３．５０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、４．０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、４．５０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、５．０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、５．５０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、６．０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、６．５０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、７．０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、７．５０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、８．０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、８．５０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、９．０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、９．５０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、または１０．０ｇの脂肪酸（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよい。
いくつかの実施形態では、２４時間発酵（培養）期間にわたって測定される場合の比生産性は、微生物１グラムＤＣＷ（２４時間期間の最後における最終ＤＣＷに基づく）当たり０．０１、０．０５、０．１０、０．２０、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０または１２．０グラムより多い化学生成物であってよい。
本発明の様々な態様および実施形態では、脂肪酸（しかしこれに限定されない）などの微生物の化学生成について発酵技術分野および商業的な経済的実行可能性を前進させる、微生物比生産性の実質的な増加がもたらされる。
別の様式で言うと、様々な実施形態では、上記比生産性は、０．０１ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．０５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．１０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．１５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．２０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．２５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．３０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．３５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．４０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．４５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．５０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．６０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超える（少なくともこの量である）。
より一般的には、本明細書で記載する補充物と必要に応じて組み合わせた本明細書で記載する遺伝子改変物の様々な組み合わせに基づいて、脂肪酸または脂肪酸由来生成物および本明細書で記載するその他の化学生成物についての比生産性の値は、０．０１ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．０５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．１０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．１５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．２０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．２５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．３０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．３５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．４０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．４５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．５０ｇまたは０．６０化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよい。このような比生産性は、特定の微生物による化学生成イベントにおいて２、４、６、８、１２または２４時間の期間にわたって評価してよい。
本発明の実施形態により達成される改善は、本明細書で教示する特定の遺伝子改変の組み合わせを欠く（上記微生物集団を含む容器に加えられた、本明細書で教示する補充物質ありまたはなしの）適当な対照微生物と比較した、比生産性のパーセンテージ増加または容積生産性のパーセンテージ増加により決定してよい。特定の実施形態およびその群について、このような比生産性および／または容積生産性の改善は、このような適当な対照微生物の各比生産性および／または容積生産性に対して少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００および少なくとも５００パーセントである。
本明細書および／または参照により組み込まれている引用参考文献の具体的な方法および教示は、本実施例に組み込まれ得る。また、化学生成物の生成は、様々な実施形態では、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０および少なくとも５０ｇ／リットルの力価に到達し得る。
上記計量は、任意の構成物、例えば遺伝子改変微生物、方法、例えば化学生成物を生成する方法、ならびに系、例えば本明細書で開示する遺伝子改変微生物および／もしくは方法を利用する発酵系のいずれにも用いることができる。
本明細書で提供するストラテジーおよび方法を用い、上記経路および経路の構成部分に関し相互関係があることの発見に基づく繰り返しの改善は、バイオ生産イベントの終結でのさらにより大きい化学生成物バイオ生産を導き得ることが認められる。
Ｈ．遺伝子改変の組み合わせ
いくつかの実施形態では、酵素活性を減少させるための少なくとも１つの遺伝子改変は、遺伝子破壊である。いくつかの実施形態では、酵素活性を減少させるための少なくとも１つの遺伝子改変は、遺伝子欠失である。
いくつかの実施形態では、上記遺伝子改変は、選択された脂肪酸または脂肪酸由来化学生成物の微生物合成を、選択された化学生成物を生成するための上記少なくとも１つの遺伝子改変を欠く対照微生物の速度または力価を上回って増加させる。いくつかの実施形態では、上記遺伝子改変は、選択された化学生成物への酵素変換を、遺伝子改変を欠く対照微生物の酵素変換を少なくとも約５パーセント、少なくとも約１０パーセント、少なくとも約２０パーセント、少なくとも約３０パーセント、または少なくとも約５０パーセント上回って増加させるために有効である。酵素または酵素活性に対するこれらの非限定的な遺伝子改変のいくつかが以下の表２に列挙されている。
Figure 2015524283
Figure 2015524283
Figure 2015524283
Figure 2015524283
表２の教示に基づいて酵素機能を減少させることに関してさらに、以下の酵素機能のいずれか１つまたは組み合わせを、特定の実施形態において本明細書で記載する他の遺伝子改変と組み合わせて減少してよい：β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ、３−オキソアシル−ＡＣＰ−合成酵素Ｉ；マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼ；エノイルＡＣＰ還元酵素；およびβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＩＩ。
よって、上記の様々なセクションに記載されるように、本発明のいくつかの構成物、方法および系は脂肪酸または脂肪酸由来生成物などの選択された化学生成物への生成経路と、低減された活性を示すマロニル−ＡＣＰ依存性脂肪酸合成酵素系の酵素をコードする改変ポリヌクレオチドとの両方を含んで、マロニル−ＣｏＡの利用を、このような改変を欠く比較可能な（対照）微生物と比較して上記生成経路に向けてシフトする遺伝子改変微生物を提供することを含む。上記方法は、栄養培地が提供された容器内でこのような遺伝子改変微生物の集団を用いて化学生成物を生成する工程を含む。アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼおよび／またはＮＡＤＰＨ依存性トランスヒドロゲナーゼなどの他の酵素に対する本明細書で記載する他の遺伝子改変は、いくつかのこのような実施形態に存在し得る。これらの酵素活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの追加のコピーを提供することにより、脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生成を増加させることが示されている。これらのそれぞれの酵素活性を増加させるための他の手段は、当該技術において公知であり、本発明の様々な実施形態に用いてよい。
また、限定されることなく、化学生成物を作製するいくつかの多段階方法（ｍｕｌｔｉ−ｐｈａｓｅ ｍｅｔｈｏｄ）の実施形態における第１工程は、培養容器またはバイオリアクタ容器などの容器内に、当業者に公知の最少培地などの栄養培地と、細菌などのこのような微生物の集団、より具体的にはＥ．ｃｏｌｉなどの科であるＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅのメンバーを提供するように遺伝子改変微生物の接種材料とを提供することにより例示でき、ここで、上記遺伝子改変微生物は、マロニル−ＣｏＡを選択された化学生成物へ変換する代謝経路を含む。この接種材料は、細胞密度が、上記方法の次の工程を考慮する全体的な生産性の計量を満たす脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生産レベルに到達するのに適する細胞密度まで増加するように容器内で培養される。様々な代替の実施形態において、これらの遺伝子改変微生物の集団は、第１の準備容器（ｐｒｅｐａｒａｔｏｒｙ ｖｅｓｓｅｌ）において第１細胞密度まで培養され、次いで、選択された細胞密度を提供するように、上記記載の容器に移すことができる。多数の多容器培養ストラテジーが、当業者に公知である。このようないずれの実施形態も、上記方法の第１の記載される工程に従って選択された細胞密度を提供する。
また、限定されることなく、その後の工程は、２つのアプローチにより例示でき、これらも様々な実施形態で組み合わせて実施できる。第１のアプローチは、そのエノイル−ＡＣＰ還元酵素の酵素活性が制御され得るように上記遺伝子改変微生物に遺伝子改変を提供する。一例として、遺伝子改変は、天然のエノイル−ＡＣＰ還元酵素に代えて温度感受性変異体エノイル−ＡＣＰ還元酵素（例えばＥ．ｃｏｌｉにおけるｆａｂＩＴＳ）へ置換するように行ってよい。前者は、３０℃より上の温度で酵素活性の低減を示し得るが、３０℃で通常の酵素活性を示し得るので、培養温度を例えば３４℃、３５℃、３６℃、３７℃または４２℃にまで上昇させることにより、エノイル−ＡＣＰ還元酵素の酵素活性が低減する。このような場合、３０℃におけるよりも多くのマロニル−ＣｏＡが脂肪酸もしくは脂肪酸由来生成物または別の化学生成物に変換され、ここでは、マロニル−ＣｏＡから脂肪酸への変換は、より効果が低いエノイル−ＡＣＰ還元酵素によって妨害されない。
工業的なバイオ生産における選択された化学生成物の力価の上昇をもたらし得る本発明の生成の増加の態様について、上記遺伝子改変は、１つ以上の核酸配列を微生物に導入することを含み、ここで、上記１つ以上の核酸配列は、１つ以上の生成経路の酵素（または生成経路の酵素の酵素活性）をコードし、かつそれを発現する。様々な実施形態では、これらの改善は、それによって組み合わせて、選択された化学生成物の工業的バイオ生産の生成の効率および効力を増加させ、その結果としてそれについてのコストを低くする。
様々な実施形態では、遺伝子改変は、選択されたおよび／または同定された培養条件下での酵素活性および／または選択性の変化をもたらす転写改変、翻訳改変および翻訳後改変を対象とすることができる。したがって、様々な実施形態では、より効率的に機能するために、微生物は、１つ以上の遺伝子欠失を含んでよい。
遺伝子欠失は、変異遺伝子欠失アプローチにより、かつ／またはこれらの酵素の１つ以上の発現が低減しているかまたは発現がない変異株から出発して、かつ／または当業者に公知のその他の方法により成し遂げることができる。
本発明の態様は、選択された炭素源をポリケチドなどの選択された化学生成物へ変換することについての全体的な微生物の有効性を改善するための複数の遺伝子改変を提供することにも関係する。比生産性、容積生産性、力価および収率を、遺伝子改変のより基本的な組み合わせを超えて実質的に増加させるための、本実施例におけるような具体的な組み合わせが示される。
追加の遺伝子改変を、本発明の微生物株に提供してよい。多くのこのような改変は、特定の表現型を与えるために提供してよい。
例えば、スクロースを利用する能力を提供してよく、このことは、脂肪酸もしくは脂肪酸由来生成物またはその他の化学生成物を生成するために利用できる供給材料の範囲を広げる。本明細書で記載する株などのＥ．ｃｏｌｉの一般的な実験室株および工業株は、単独炭素源としてスクロースを利用できない。スクロースおよび糖蜜などのスクロース含有供給材料は豊富にあり、微生物発酵による生成のための供給材料として頻繁に用いられるので、スクロースの取り込みおよび使用を可能にする適当な遺伝子改変を、本明細書で提供するようなその他の特徴を有する株において付加してよい。様々なスクロース取り込みおよび代謝系が、当該技術において公知である（例えば米国特許第６，９６０，４５５号）（そのような教示が参照により組み込まれている）。これらおよびその他のアプローチは、本発明の株に提供してよい。その実施例は、少なくとも２つのアプローチを提供する。
また、セルロースバイオマスもしくはその生成物などのより複雑な炭素源の分解について、そのような炭素源の取り込みおよび／または利用についての機能性を付加するための遺伝子改変を提供してよい。例えば、多数のセルラーゼおよびセルラーゼベースのセルロース分解系が研究され、特徴決定されている（例えばＢｅｇｕｉｎ， ＰおよびＡｕｂｅｒｔ， Ｊ−Ｐ（１９９４年）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ｒｅｖ．１３巻：２５〜５８頁；Ｏｈｉｍａ， Ｋ．ら（１９９７年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．
Ｅｎｇ． Ｒｅｖ． １４巻：３６５４１４頁を参照されたい（そのような教示について本明細書に参照することにより組み込まれている））。
上記の遺伝子改変に加えて、様々な実施形態では、補因子ＮＡＤＰＨのプールおよび利用可能性ならびに／またはその結果としてＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比を増加させるための遺伝子改変も提供する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉについての様々な実施形態では、このことは、１つ以上の以下の遺伝子の活性を例えば遺伝子改変により増加することにより行ってよい：過剰発現されたｐｇｉ（変異形態で）、ｐｎｔＡＢ、ｇａｐＡ：ｇａｐＮ置換／置き換え、およびｓｔｈＡなどの可溶性トランスヒドロゲナーゼを破壊もしくは改変すること、ならびに／またはｚｗｆ、ｇｎｄおよびｅｄｄの１つ以上の遺伝子改変。
任意のこのような遺伝子改変は、このような機能性を有さない種または所望のレベル未満のこのような機能性を有する種に提供してよい。
より全般的に、そして遺伝子改変のために選択した微生物の特定の代謝経路に依存して、任意のサブ群の遺伝子改変を行って、アセテート、アセトイン、アセトン、アクリル酸、マレート、脂肪酸エチルエステル、イソプレノイド、グリセロール、エチレングリコール、エチレン、プロピレン、ブチレン、イソブチレン、エチルアセテート、ビニルアセテート、その他のアセテート、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ブチレート、イソブチレート、２−ＯＨ−イソブチレート（ｉｓｏｂｕｔｒｙａｔｅ）、３−ＯＨ−ブチレート、エタノール、イソプロパノール、Ｄ−ラクテート、Ｌ−ラクテート、ピルベート、イタコネート、レブリネート、グルカレート、グルタレート、カプロラクタム、アジピン酸、プロパノール、イソプロパノール、フーゼルアルコールおよび１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、フォルメート、フマル酸、プロピオン酸、コハク酸、吉草酸ならびにマレイン酸からなる群から選択される発酵生成物（複数可）の細胞による生成を低減させてよい。遺伝子欠失は、本明細書に全般的に開示されるようにして行ってよく、その他のアプローチを用いて、選択された発酵生成物の細胞による生成の所望の減少を達成してよい。
Ｉ．開示されている実施形態は非限定的である
本明細書には本発明の種々の実施形態が示され、記載されているが、そのような実施形態は、単に例として提供されていることが強調される。本明細書の本発明から逸脱することなく、その種々の実施形態において多数の変形、変更および置換を行うことができる。具体的には、いかなる理由であれ、本明細書において一覧表、表に述べられている、またはその他の方法で本明細書に提示されている化合物、核酸配列、機能性酵素、代謝経路の酵素もしくは中間体を含めた特定のタンパク質を含めたポリペプチド、エレメント、または他の組成物、または濃度の群分け、または他の群分け（例えば、図に示されている代謝経路の酵素）のいずれについても、別段の明記のない限り、そのような群分けのそれぞれは、種々のサブセットの実施形態の基礎を提供し、それを規定する働きをするものとし、それらの最も広範な範囲内の上記サブセットの実施形態はそれぞれの述べられた群分けの１つ以上のメンバー（またはサブセット）を除いてそのような群分けのあらゆるサブセットを含む。さらに、任意の範囲が本明細書に記載されている場合、別段の明記のない限り、その範囲は、その中の全ての値およびその中の全ての部分範囲を包含する。
同様に、かつ、より一般的には、本明細書における開示、議論、実施例および実施形態に従って、従来の分子生物学、細胞生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技法を当技術分野の技術の範囲内で使用することができる。そのような技法は、文献において十分に説明されている。（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第３版、２００１年（１〜３巻）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６年を参照されたい）。これらの公開されたリソースは、その中に見出される標準の実験室的方法についてのそれらのそれぞれの教示に関して、参照により本明細書に組み込まれている。最低でも、本明細書において上記参照が引用される場合に示され得る特定の教示および／または他の目的がそのように組み込まれる。特定の教示および／または他の目的が示されていない場合は、上記公開されたリソースは、上記参考文献の表題、要約、および／または概要の１つ以上によって示される教示（複数可）に関して詳細に組み込まれる。そのような詳細に同定された教示および／または他の目的がそのように関連しない可能性がある場合は、上記公開されたリソースは、本発明が属する技術分野の現状をより完全に記載するため、および／または、そのような教示を、当業者には一般に公知であるとおり、適用可能なものとして提供するために組み込まれる。しかし、本明細書において公開されたリソースを引用することは、そのようなものが本発明の先行技術であると承認するものと解釈されるべきではないことが特に明示される。また、組み込まれた公開されたリソースの１つ以上が本出願と異なる、または矛盾するイベント、これらに限定されないが、定義された用語、用語の使用、記載されている技法をなど含めたイベントにおいては、本出願が支配する。本実施例における主題は、既に存在していない限りはこのセクションに組み込まれる。
ＩＩＩ．実施例
本明細書における実施例は、遺伝子改変および補充物質の追加の組み合わせのいくつかの例を提供するが、それに限定するものではない。以下の実施例は、実際の実施例および予測的な実施例の両方を含む。
別段の指定のない限り、温度は摂氏温度の単位であり、圧力は、海抜およそ５，３４０フィート（１，６２８メートル）における気圧またはそれに近い気圧である。外部の分析施設および合成施設において行われた研究は、海抜およそ５，３４０フィート（１，６２８メートル）における気圧またはそれに近い気圧で行われていないことに留意する。全ての試薬は、別段の指定のない限り、商業的に入手される。種および他の系統学的な同定は、微生物学の当業者に公知の分類に従う。
本明細書において、主要な供給者の名称および所在都市が提供される。さらに、Ｑｉａｇｅｎの製品に関しては、本明細書に記載の通り、プラスミドＤＮＡを精製するためにＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ（「ミニプレップ」）、カタログ番号２７１０６を使用し、ゲル抽出するためにＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号２８７０６を使用する。
（実施例１）
宿主細胞に対する遺伝子改変の一般的な例（予測的かつ非特異的）。
この実施例は、選択された微生物に対象の核酸配列を導入するための遺伝子改変の非限定的なアプローチについて記載するものである。この一般的な実施例の範囲内で代替物および変形物が提供される。この実施例の方法を行って、選択された微生物種において所望の遺伝子改変の組み合わせ、例えば、本明細書の複数のセクションに記載の遺伝子改変の組み合わせおよび、例えば他の細菌種および他の微生物種におけるそれらの機能的等価物を実現する。
対象の遺伝子または他の核酸配列のセグメントを、特定の種（本明細書に記載のＥ．ｃｏｌｉなど）において同定し、その遺伝子またはセグメントを含む核酸配列を得る。
対象のセグメントの末端の核酸配列、または対象のセグメントの末端に近接する核酸配列に基づいて、５’核酸プライマーおよび３’核酸プライマーを調製する。各プライマーを、そのような末端または近接する領域とハイブリダイズする十分なオーバーラップ区画を有するように設計する。そのようなプライマーは、その後にベクターを組み入れるため、またはゲノムを挿入するために使用することができるトランスポザーゼ挿入の制限消化のための酵素認識部位を含んでよい。これらの部位は、一般にはハイブリダイズしているオーバーラップ区画の外側にあるように設計する。プライマー配列を注文に応じて調製する多数の契約サービスが公知である（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ ＵＳＡ）。
プライマーを設計し調製したら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、所望の対象のセグメントを特に増幅する。この方法により、微生物のゲノムから分離した対象の領域の複数のコピーがもたらされる。上記微生物のＤＮＡ、プライマーおよび好熱性ポリメラーゼを、緩衝溶液でカリウムおよび二価カチオン（例えば、ＭｇまたはＭｎ）と、および十分な分量のデオキシヌクレオシド三リン酸分子と混ぜ合わせる。この混合物を、温度を増加および減少させる標準のレジメンに曝露させる。しかし、温度、成分、濃度およびサイクルの回数は、コピーされる配列の長さ、アニーリングの温度近似および公知の、または常套的な実験によって当業者に容易に習得される他の因子に応じて、反応に応じて変化させてよい。
代替の実施形態では、対象のセグメントは、微生物または他のＤＮＡの天然の供給源から得るのではなく、例えば、商業的なベンダーによって合成されてよく、ＰＣＲによって調製されてよい。
次いで、例えばアガロースゲル上で電気泳動によって核酸配列を精製し、分離する。必要に応じて、上記領域が精製されたら、それを、標準のＤＮＡ配列決定の方法論によって検証することができ、ベクターに導入することができる。通常当業者に公知のマーカーを含むいくつものベクターのいずれも使用することができ、そのような導入のために標準の方法論を常套的に使用する。一般に使用されるベクター系は、ｐＳＭＡＲＴ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）、ｐＥＴ Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＳＣ−Ｂ ＳｔｒａｔａＣｌｏｎｅ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＲＡＮＧＥＲ−ＢＴＢベクター（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）およびＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）である。同様に、次いで上記ベクターをいくつもの宿主細胞のいずれかに導入する。一般に使用される宿主細胞は、Ｅ．ｃｌｏｎｉ １０Ｇ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）、Ｅ．ｃｌｏｎｉ １０ＧＦ’（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）、ＳｔｒａｔａＣｌｏｎｅ コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３およびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５である。これらのベクターのいくつかは、プロモーター、例えば対象の配列を挿入する領域に近接する（例えば、複数のクローニング部位内）誘導性プロモーターを保有するが、他のベクター、例えばｐＳＭＡＲＴベクター（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）は、プロモーターを伴わず、脱リン酸化された平滑断端を伴って提供される。そのようなプラスミドを含む細胞を培養することにより、プラスミドを複製すること、したがって対象のセグメントを複製することが可能になり、これは、多くの場合、対象のセグメントの発現に対応する。
種々のベクター系は、選択マーカー、例えば、限定条件下で増殖または生存するために必要であるタンパク質をコードする遺伝子を発現できる選択マーカーを含む。骨格ベクター配列に含有される一般的な選択マーカーとしては、抗生物質抵抗性に必要な１つ以上のタンパク質をコードする遺伝子、ならびに栄養要求性欠損を補完するため、または特定の培地において存在しない、または入手できない重要な栄養分を供給するために必要な遺伝子が挙げられる。ベクターは、対象の宿主細胞に適した複製系も含む。
次いで、対象のセグメントを含有するプラスミドを常套的な方法によって単離することができ、それは、対象の他の微生物宿主細胞に導入するために利用可能である。導入の種々の方法は、当技術分野で公知であり、ベクターを導入すること、またはゲノムを組み込むことを含んでよい。種々の代替の実施形態では、そのようなプラスミド以外の手段によって対象のＤＮＡセグメントを対象の宿主細胞に導入する場合、対象のＤＮＡセグメントを他のプラスミドＤＮＡから分離することができる。
一般的な予測的な実施例の工程はプラスミドの使用を伴うが、その代わりに当技術分野で公知の他のベクターを使用することができる。これらとしては、コスミド、ウイルス（例えば、バクテリオファージ、動物ウイルス、植物ウイルス）および人工染色体（例えば、酵母の人工染色体（ＹＡＣ）および細菌の人工染色体（ＢＡＣ））が挙げられる。
対象のセグメントを導入する宿主細胞を、特定の酵素工程に関する性能および／または対象の化合物の耐性またはバイオ生産について評価することができる。性能がよい遺伝子改変された宿主細胞の選択を行うことができ、全体的な性能、耐性、または対象の化学物質の生成もしくは蓄積について選択する。
この手順は、単一の遺伝子（または他の対象の核酸配列のセグメント）、または複数の遺伝子（別々のプロモーターまたは単一のプロモーターの制御下で）についての核酸配列を組み入れることができ、発現ベクターにおいて所望の異種性の核酸配列を創製するためにその手順を繰り返すことができ、次いで、例えば、本明細書に開示されている任意の代謝経路について、酵素変換工程の機能性に対する所望の相補体を有するように選択された微生物にその発現ベクターを供給することに留意する。しかし、多くのアプローチは、対象の配列の全部または一部を転写し、次いで転写されたｍＲＮＡを翻訳することによって発現させて、酵素などのポリペプチドを得ることに依拠するが、対象のある特定の配列は、そのような発現以外の手段によって効果を発揮し得ることに留意する。
これらのアプローチのために使用する特定の実験室的方法は、当技術分野で周知であり、当業者に公知の種々の参考文献、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、２００１年（１〜３巻）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（以下、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）において認めることができる。
上記の代わりとして、上記宿主細胞のゲノムの核酸配列の欠失などの他の遺伝子改変を実施することもできる。これを実現するための１つの非限定的な方法は、Ｒｅｄ／ＥＴ組換えを使用することによるものであり、これは当業者に公知であり、また、Ｓｔｅｗａｒｔらに発行され、この方法についてのその教示に関して参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，３５５，４１２号および同第６，５０９，１５６号に記載されている。そのような方法のための材料およびキットは、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ（Ｇｅｎｅ
Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄｒｅｓｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、＜＜ｗｗｗ．ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ．ｃｏｍ＞＞）から入手可能であり、この方法は、製造者の指示に従って進めることができる。ゲノムＤＮＡの標的欠失を実施して、宿主細胞の代謝を、望ましくない代謝産物の生成を低減させる、または排除するように変化させることができる。これは、本明細書において、この一般的な実施例に記載のような他の遺伝子改変と組み合わせて使用することができる。
（実施例２）
脂肪酸および他の脂肪酸由来生成物を生成するためのフィードストックとしてのスクロースの利用
Ｅ．ｃｏｌｉの一般的な研究室および工業用の株、例えば本明細書に記載の株は、スクロースを唯一の炭素供給源として利用することができないが、この性質は、病原性のＥ．ｃｏｌｉ株を含めたいくつもの野生株に見出される。スクロースおよび糖蜜などのスクロースを含有するフィードストックは豊富であり、多くの場合、有機酸、アミノ酸、ビタミンおよび他の生成物を微生物発酵によって生成するためのフィードストックとして使用される。したがって、スクロースを利用することができる脂肪酸アシル−ＣｏＡ生成株の別の誘導体により、脂肪酸および脂肪酸由来生成物を利用することができるフィードストックの範囲が拡大するはずである。
種々のスクロースの取り込みおよび代謝系が当技術分野で公知であり（例えば、米国特許第６，９６０，４５５号）、そのような教示に関して参照によって組み込まれる。本発明者らは、非ホスホトランスフェラーゼ系を介してスクロースを利用する能力を付与するｃｓｃ遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ株の構築について記載するが、ここで上記ｃｓｃ遺伝子は、スクロース加水分解酵素をコードするｃｓｃＡ、スクロース透過酵素をコードするｃｓｃＢ、フルクトキナーゼをコードするｃｓｃＫ、およびリプレッサーをコードするｃｓｃＲを構成する。これらの遺伝子の配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいて受託番号Ｘ８１４６１ ＡＦ４７３５４４として注釈されている。Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子において極めて豊富であるコドンを利用して効率的に発現させることを可能にするために、ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫおよびｃｓｃＡを含有するオペロンを設計し、商業的な合成ＤＮＡの提供者（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）のサービスを使用して合成した。上記遺伝子のアミノ酸配列は、それぞれ、ｃｓｃＢ−配列番号０１４；ｃｓｃＫ−配列番号０１５：ｃｓｃＡ−配列番号０１６として記載されている。上記合成オペロンは、ａｌｄＡ遺伝子の即５’（上流）の６０塩基対のＥ．ｃｏｌｉゲノムの領域、上記ｃｓｃ遺伝子の発現を誘導するためのコンセンサス強力プロモーター、リボソーム結合部位を含有するがプロモーターを含有しない短い遺伝子間の領域を伴う、ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫおよびｃｓｃＡのコード領域、ならびに上記ａｌｄＡ遺伝子の即３’（下流）の６０ｂｐからなった。上記ａｌｄＡ遺伝子に隣接している配列と相同なセグメントを使用して、上記ｃｓｃオペロン遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ染色体に標的挿入するが、それにはａｌｄＡの欠失が伴う。上記合成ｃｓｃオペロンを、プラスミドｐ１５Ａに由来する複製開始点およびアンピシリンに対する抵抗性を付与する遺伝子を提供するプラスミドｐＪ２１４（ＤＮＡ ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）に構築する。適切な宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉのＢＸ＿５９５株を、上記プラスミドｐＴｒｃ＿ｋａｎ＿ｍｃｒまたは他の適切なプラスミドで同時に形質転換し、形質転換された株を、アンピシリンおよびカナマイシンを含有するＬＢ培地プレート上で選択する。両方のプラスミドを保有する形質転換体を増殖させ、培地中のグルコースが等濃度のスクロースと交換されている以外は他に記載の通り、振とうフラスコにおいて脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生成について評価する。
Ｅ．ｃｏｌｉがスクロースを利用することを可能にする機能を付与する遺伝子は、ホスホエノールピルビン酸依存性の炭水化物取り込みホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）の遺伝子を保有する、天然の分離株ｐＵＲ４００（Cowan, P.J.ら、J. Bacteriol.、１７３巻：７４６４〜７４７０頁、１９９１年）から得ることもできる。これらの遺伝子は、ＰＴＳ輸送複合体の酵素ＩＩ成分をコードするｓｃｒＡ、スクロース６−リン酸加水分解酵素をコードするｓｃｒＢ、フルクトキナーゼをコードするｓｃｒＫ、およびポーリンをコードするｓｃｒＹからなる。これらの遺伝子は、上記の通り単離または合成し、プラスミドに組み入れ、他の適切なプラスミドと同時に、適切な宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉのＢＸ＿８４５株（表３．１）に形質転換し、形質転換された株を、適切な抗生物質を含有するＬＢ培地プレートで選択することができる。両方のプラスミドを保有する形質転換体を増殖させ、ＳＭ３培地中のグルコースが等濃度のスクロースと交換されている以外は、振とうフラスコにおいて脂肪酸生成について評価する。
（実施例３）
脂肪酸生成株の構築および評価
本明細書に記載の種々の遺伝エレメント（付加、欠失および修飾）の組み合わせを含むように生成された他の株を脂肪酸生成について評価し、商業規模の生成を含めた脂肪酸生成のために使用する。以下の２つの表にいくつものこれらの株を例示している。表３．１は、いくつかのＥ．ｃｏｌｉの遺伝子改変宿主株の親遺伝子型を提供し、表３．２は、遺伝子の過剰発現のためにプラスミドが組み入れられているものを含めた、特定の遺伝子改変された脂肪酸生成株の遺伝子型を提供する。以下に記載されている株は全て、共通の方法セクションに記載のプラスミド構築および染色体の修飾のための標準の方法論によって構築した。ＢＷ２５１１３の遺伝子型は、Ｆ−、Δ（ａｒａＤ−ａｒａＢ）５６７、ΔｌａｃＺ４７８７（：：ｒｒｎＢ−３）、ＬＡＭ−、ｒｐｈ−１、Δ（ｒｈａＤ−ｒｈａＢ）５６８、ｈｓｄＲ５１４である。
Figure 2015524283
Figure 2015524283
Figure 2015524283
（実施例４）
脂肪酸合成阻害によりマロニル−ＣｏＡ依存性生成物の生成を増加させるための遺伝子改変
脂肪酸合成の阻害により、マロニル−ＣｏＡ生成のフィードバック阻害の除去が導かれ、これにより、細胞内マロニル−ＣｏＡプールの増加および中間体マロニル−ＣｏＡからの生成物の形成の速度の増加が導かれ得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれている英国特許番号第ＧＢ２４７３７５５号、国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５０４３６号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２２７９０号を参照されたい）。マロニル−ＣｏＡ由来生成物の生成の１つの非限定的な例は以下の通りである：表３．１に列挙されている株のいずれかを、１，３，６，８−テトラヒドロキシナフタレン（ＴＨＮ）合成酵素の制御可能な発現をコードするベクターで形質転換できる。これは、ｐｔｒｃ＿ＴＨＮＳプラスミド（配列番号０１８）の形質転換により実現することができる。次いで、これらの株を、振とうフラスコにおいてＴＨＮの生成またはその紫色の酸化誘導体であるフラビオリンについて評価することができる。簡単に述べると、一晩発端培養物を、適切な抗生物質を含む５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）中に作製し、３０℃で１６〜２４時間、２２５ｒｐｍで振とうしながらインキュベートすることができる。これらの培養物を使用して、各株のＳＭ１１最少培地中培養物１５０ｍＬを０．８のＯＤ６００まで、および５％ＴＢ培養物のキャリーオーバーを出発接種材料として、および抗生物質を接種することができる。２時間後に、ＩＰＴＧを、０．５ｍＭのＩＰＴＧの最終濃度になるように各フラスコに加えることができる。上記培養物を、３０℃でさらにおよそ２時間、１．８〜２．０のＯＤ６００まで増殖させることができ、２時間後に細胞を３７℃にシフトさせ、ＴＨＮまたはフラビオリン（紫色の生成物）の形成について最大７２時間モニターする。
（実施例５）
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ−１におけるチオラーゼによるマロニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡを介した脂肪酸生成
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ株を、共通の方法セクションに記載の当技術分野で周知の方法に従って構築した。その遺伝子型が表３．１および３．２に示されているこれらの株を以下の表５．１および５．２に列挙する。測定の時点、濃度（力価ｇ／Ｌ）を含む結果を表５．１および５．２に示す。株を、共通の方法セクションに記載の１つ以上の振とうフラスコ生成プロトコールに従って評価した。生成開始の２４時間後、４８時間後およびまたは７２時間後にブロス試料を取得し、鎖長が４から１８までにわたる遊離の脂肪酸の生成について評価した。表５．１において、振とうフラスコの温度を３０℃で一定に維持したか、または上記プロトコールに従って３７℃にシフトさせたかのいずれかのプロトコールの比較を示す。これにより、通常のマロニル−ＡＣＰ依存性脂肪酸合成の阻害およびマロニル−ＣｏＡプールの増加の影響を評価することが可能になった（実施例４参照）。表５．２において、脂肪酸生成を増加させるための遺伝学的要件をよりよく定義するために、いくつかの他の株を評価した。
Figure 2015524283
Figure 2015524283
（実施例６）
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ−１における合成酵素によるマロニル−ＣｏＡを介した脂肪酸生成
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ株を構築した。これらの株のいくつかは、遊離の脂肪酸を生成するための、ケトアシル−ＣｏＡ合成酵素またはエロンガーゼの使用を評価するために構築した。本実施例で使用する特定のエロンガーゼ酵素、ＥＬＯ１は、真核性のヒト寄生生物であるＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉに由来するものである（Leeら、Cell １２６巻、６９１〜６９９頁、２００６年）。ＥＬＯ１（Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ）はＥ．ｃｏｌｉにおいて首尾よく異種性発現された。組換えＥＬＯ１遺伝子はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して合成した。合成したＤＮＡは、公開された遺伝子配列（受託番号ＸＭ＿８４０９４８）に基づき、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させるためにコドン最適化した。次いで、合成ＥＬＯ１遺伝子をプラスミドｐＥＴ２８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、配列番号００１）にサブクローニングし、配列番号００５を作製した。方法５に記載の条件下でＥＬＯ１を保有するＥ．ｃｏｌｉ株から調製した総膜画分は、マロニル−ＣｏＡとオクタノイル−ＣｏＡとを縮合させ、β−ケト−デカノイル−ＣｏＡを生成することが示された。特異的なＥＬＯ１活性は、マロニル−ＣｏＡの消費に基づいて３．４ｎｍｏｌｅ／ｍｉｎ−ｍｇ膜タンパク質であると推定された。一方、ＥＬＯ１を有さないＥ．ｃｏｌｉ株から調製した総膜画分では、マロニル−ＣｏＡの消費も全くなく、β−ケト−デカノイル−ＣｏＡも生成されなかった。データを図４に示す。遊離の脂肪酸生成に対するＥＬＯ１活性の影響を評価するために、いくつかの株を構築した。その遺伝子型が表３．１および３．２に示されているこれらの株を、以下の表６．１に列挙する。株を、共通の方法セクションに記載の１つ以上の振とうフラスコ生成プロトコールに従って評価した。ブロス試料を取得し、鎖長が４から１８までにわたる遊離の脂肪酸の生成について評価した。濃度（力価ｇ／Ｌ）ならびに生成された特定の鎖長の脂肪酸の百分率を含む結果を表６．１に示す。これらのデータは、４つのデータポイント（０時間、２４時間、４８時間、および７２時間）に基づくＦＦＡ蓄積の速度（Ｃ６〜Ｃ１８：１）も含む。
Figure 2015524283
（実施例７）
遺伝子改変微生物におけるチオラーゼによるマロニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡを介した脂肪酸生成
本発明の遺伝子改変微生物は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（以前はＲａｌｓｔｏｎｉａもしくはＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈａとして公知であった）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａであってよい。このような微生物は、遊離の脂肪酸を生成するように遺伝子改変することができる細菌宿主としての機能を果たし得る。さらに、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、およびＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓは、本発明の遺伝子改変微生物になり得、遊離の脂肪酸を生成するように構築することができる例示的な酵母または真菌である。ＥＬＯ１、ｎｐｈＴ７、ｈｂｄ、ｃｒｔ、および／またはｔｅｒをコードする異種遺伝子を、染色体内にまたは自己複製性プラスミドもしくはエピソームエレメントとして、組換えによってこれらの宿主に導入することができる。代替の合成酵素、チオラーゼ、３−ケト−アシル−ＣｏＡ還元酵素、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼ、および／またはエノイル−ＣｏＡ還元酵素を、同様のアプローチを用いてこれらの宿主に導入することができる。異種発現のために設計する遺伝子は、発現効率を上昇させるために特定の宿主において優先的に利用されるコドンを使用して合成することができる。マロニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡを介した遊離の脂肪酸の生成を最大にするために、宿主における特定の遺伝学的変化を企図する。これらとしては、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を増加させることによる、およびアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路などの競合経路の活性を減少させることによるマロニル−ＣｏＡの利用可能性の増加が挙げられる。ＦＡＳ経路の活性を条件的に減少させることは、温度感受性対立遺伝子を使用して増殖温度を上昇させ、化学阻害剤を使用して、またはＦＡＳ遺伝子の発現を調節することによって、実現することができる。ブチリル−ＣｏＡなどの短鎖基質に対するアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性を排除することも有益である。これは、遺伝子改変された生成宿主において、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｅｓＢ遺伝子産物に対する相同性により、または、宿主株の溶解物におけるチオエステラーゼ活性、チオエステラーゼ酵素の精製、および、例えば質量分析を使用したポリペプチドの特徴付けについての酵素アッセイにより同定された特異的なチオエステラーゼ遺伝子を欠失させることによって実現することができる。さらに、遊離の脂肪酸の、例えば、β−酸化経路による再消費の排除により、遊離の脂肪酸生成物の分解が防止され、生成物の形成が最大になる。これは、遺伝子改変された生成宿主において特異的な脂肪酸取り込みおよび分解機能を欠失させることによって実現することができる。
（実施例８）
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ−１におけるマロニル−ＣｏＡを介したブチレートの生成
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ株を、共通の方法セクションに記載の当技術分野で周知の方法に従って構築した。その遺伝子型が表３．１および３．２に示されているこれらの株を、以下の表８．１に列挙する。株を、共通の方法セクションに記載の１つ以上の振とうフラスコ生成プロトコールに従って評価した。生成開始の２４時間後にブロス試料を取得し、鎖長が４から１８までにわたるブチレートを含めた遊離の脂肪酸の生成について評価した。濃度（力価ｇ／Ｌ）ならびに生成された特定の鎖長の脂肪酸の百分率を含む結果を表８．１に示す。
Figure 2015524283
（実施例９）
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ−１におけるマロニル−ＣｏＡを介したヘキサン酸の生成
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ株を、共通の方法セクションに記載の当技術分野で周知の方法に従って構築した。その遺伝子型が表３．１および３．２に示されているこれらの株を、以下の表９．１に列挙する。株を、共通の方法セクションに記載の１つ以上の振とうフラスコ生成プロトコールに従って評価した。生成開始の２４時間後にブロス試料を取得し、鎖長が４から１８までにわたるブチレートを含めた遊離の脂肪酸の生成について評価した。濃度（力価ｇ／Ｌ）ならびに生成された特定の鎖長の脂肪酸の百分率を含む結果を表９．１に示す。
Figure 2015524283
（実施例１０）
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ−１におけるマロニル−ＣｏＡを介したオクタン酸の生成
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ株を、共通の方法セクションに記載の当技術分野で周知の方法に従って構築した。その遺伝子型が表３．１および３．２に示されているこれらの株を、以下の表１０．１に列挙する。株を、共通の方法セクションに記載の１つ以上の振とうフラスコ生成プロトコールに従って評価した。ブロス試料を取得し、鎖長が４から１８までにわたるブチレートを含めた遊離の脂肪酸の生成について評価した。濃度（力価ｇ／Ｌ）ならびに生成された特定の鎖長の脂肪酸の百分率を含む結果を表１０．１に示す。
Figure 2015524283
（実施例１１）
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ−１におけるマロニル−ＣｏＡを介したドデカン酸（Ｃ１２脂肪酸）の生成
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ株を、共通の方法セクションに記載の当技術分野で周知の方法に従って構築した。その遺伝子型が表３．１および３．２に示されているこれらの株を、以下の表１１．１に列挙する。株を、共通の方法セクションに記載の１つ以上の振とうフラスコ生成プロトコールに従って評価した。ブロス試料を取得し、鎖長が４から１８までにわたる遊離の脂肪酸の生成について評価した。濃度（力価ｇ／Ｌ）ならびに生成された特定の鎖長の脂肪酸の百分率を含む結果を表１１．１に示す。
Figure 2015524283
（実施例１２）
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ−１におけるマロニル−ＣｏＡを介したミリスチン酸（Ｃ１４脂肪酸）の生成
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ株を、共通の方法セクションに記載の当技術分野で周知の方法に従って構築した。その遺伝子型が表３．１および３．２に示されているこれらの株を、以下の表１２．１に列挙する。株を、共通の方法セクションに記載の１つ以上の振とうフラスコ生成プロトコールに従って評価した。ブロス試料を取得し、鎖長が４から１８までにわたるブチレートを含めた遊離の脂肪酸の生成について評価した。濃度（力価ｇ／Ｌ）ならびに生成された特定の鎖長の脂肪酸の百分率を含む結果を表１２．１に示す。
Figure 2015524283
（実施例１３）
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ−１におけるマロニル−ＣｏＡを介したパルミチン酸（Ｃ１６：０脂肪酸）の生成
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ株を、共通の方法セクションに記載の当技術分野で周知の方法に従って構築した。その遺伝子型が表３．１および３．２に示されているこれらの株を、以下の表１３．１に列挙する。株を、共通の方法セクションに記載の１つ以上の振とうフラスコ生成プロトコールに従って評価した。ブロス試料を取得し、鎖長が４から１８までにわたるブチレートを含めた遊離の脂肪酸の生成について評価した。濃度（力価ｇ／Ｌ）ならびに生成された特定の鎖長の脂肪酸の百分率を含む結果を表１３．１に示す。
Figure 2015524283
（実施例１４）
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ−１におけるマロニル−ＣｏＡを介したパルミトレイン酸（Ｃ１６：１脂肪酸）の生成
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ株を、共通の方法セクションに記載の当技術分野で周知の方法に従って構築した。その遺伝子型が表３．１および３．２に示されているこれらの株を、以下の表１４．１に列挙する。株を、共通の方法セクションに記載の１つ以上の振とうフラスコ生成プロトコールに従って評価した。ブロス試料を取得し、鎖長が４から１８までにわたるブチレートを含めた遊離の脂肪酸の生成について評価した。濃度（力価ｇ／Ｌ）ならびに生成された特定の鎖長の脂肪酸の百分率を含む結果を表１４．１に示す。
Figure 2015524283
（実施例１５）
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ−１におけるマロニル−ＣｏＡを介したオレイン酸およびステアリン酸（Ｃ１８：１脂肪酸）の生成
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ株を、共通の方法セクションに記載の当技術分野で周知の方法に従って構築した。その遺伝子型が表３．１および３．２に示されているこれらの株を、以下の表１５．１に列挙する。株を、共通の方法セクションに記載の１つ以上の振とうフラスコ生成プロトコールに従って評価した。ブロス試料を取得し、鎖長が４から１８までにわたるブチレートを含めた遊離の脂肪酸の生成について評価した。濃度（力価ｇ／Ｌ）ならびに生成された特定の鎖長の脂肪酸の百分率を含む結果を表１５．１に示す。
Figure 2015524283
（実施例１６）
遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ−１における脂肪酸生成の鎖長特異性の変更
遊離の脂肪酸生成物の鎖長の分布を、合成活性と放出活性との組み合わせによって決定する。エロンガーゼによって触媒されるものなどの合成活性には生成物の鎖長の好みがあり、したがって、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ＥＬＯ１はＣ１０−ＣｏＡ生成物を生成し、ＥＬＯ２はＣ１４−ＣｏＡ生成物を生成する（Leeら、２００６年；Cell １２６巻：６９１〜６９９頁；DenicおよびWeissman、２００７年、Cell １３０巻：６６３〜６７７頁）。ＥＬＯ１反応の直接の生成物は３−ケト−ヘキサノイル−ＣｏＡである。ケト−アシル−ＣｏＡ還元酵素（ＫＣＲ）、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡ脱水酵素（３ＨＤｈ）、およびエノイル−ＣｏＡ還元酵素（ＥＣＲ）の連続的な作用により、その後のマロニル−ＣｏＡからの２−炭素単位ごとの伸長のためのプライマーとしての機能を果たすヘキサノイル−ＣｏＡが作製される。これらの活性の鎖長特異性により、最終生成物の分布も決定され、所望の規定された鎖長の生成物が優先的に作製されるように設計することができる。
チオエステラーゼは、アシル−ＣｏＡまたはアシル−ＡＣＰの、それぞれ遊離の脂肪酸および補酵素ＡまたはＡＣＰへの加水分解を触媒し、したがって、遊離の脂肪酸生成物を放出する。多様な供給源に由来する多数のチオエステラーゼが公知であり、アシル−ＡＣＰ基質に対するそれらの鎖長特異性が実証されている（例えば、Jingら、２０１１年、BMC Biochemistry １２巻：１〜１６頁）。本発明者らは、いくつものチオエステラーゼを発現させ、アッセイして、アシル−ＣｏＡ基質に対するそれらの鎖長特異性を決定した。これらのタンパク質に対するチオエステラーゼ活性および鎖長の好みを、共通の方法に記載の通り、これらのタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させることによって決定した。細胞を、マイクロフルイダイザーを通して押出すことによって溶解物を調製し、その溶解物を、Ｇ−２５スピンカラム（ＧＥ２７−５３２５−０１）を使用して脱塩した。２００μｌアッセイは、７ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ８．０、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０４％トリトンＸ１００、０．１０ｍＭのＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）、Ｓｉｇｍａ Ｄ８１３０、ＥＴＯＨ中２５ｍＭ）、０．４０ｍＭのアシル−ＣｏＡ基質を含有し、Ｇ−２５により精製した溶解物を加えて反応を開始させた。５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）生成物の形成を４１２ｎｍにおいて動力学的にモニターし、結果を表１６．１において表にした。
Figure 2015524283
表１６．１に示されているように、これらのチオエステラーゼは、異なった顕著な鎖長の好みを示す。ＡｔＴＥはＣ８−ＣｏＡから出発する短鎖アシル−ＣｏＡ基質を好み、一方、可溶性 ’ｔｅｓＡはＣ１２およびそれより長い基質に対して最も活性である。追加のチオエステラーゼ遺伝子および遺伝子産物を同様に評価することができる。潜在的な遺伝子としては、とりわけ、Ｕｌｍｕｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ（ＡＡＢ７１７３１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ（ＣＡＤ６３３１０）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ（ＡＢＪ６３７５４）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＡＢＧ８２４７０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＡ２８０１）に由来するチオエステラーゼが挙げられる。アシル−ＣｏＡに対する鎖長特異性は、タンパク質工学または定向進化技法を適用して、特定の鎖長をより好むバリアントを作製することによって変更することができる。例えば、チオエステラーゼをコードする遺伝子をシャッフルして（Stemmer、１９９４年、Proc. Natl. Acad.、Sci. USA ９１巻：１０７４７〜１０７５１頁）、バリアントのライブラリーを作製することができる。特定の鎖長のアシル−ＣｏＡに対する活性の増加を有するバリアントの単離は、特定の鎖長のアシル−ＣｏＡに向かう活性について、および望ましくない鎖長のアシル−ＣｏＡに向かう活性の減少についてのスクリーニングによって実現される。
（実施例１７）
Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓにおける脂肪酸または脂肪酸由来生成物のバイオ生産の改善
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて複製するほとんどのプラスミドおよびシャトルベクターは、プロトプラスト形質転換または電気穿孔のいずれかによってＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓを形質転換するために使用する。遊離の脂肪酸の生合成のために必要とされる核酸配列は、様々な供給源から単離し、適切なようにコドン最適化し、プラスミドｐＢＥ２０またはｐＢＥ６０誘導体にクローニングする（Nagarajanら、Gene １１４巻：１２１〜１２６頁（１９９２年））。Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓを形質転換するための方法は、当技術分野において公知である（例えば、Flemingら、Appl. Environ. Microbiol.、６１巻（１１号）：３７７５〜３７８０頁（１９９５年）を参照されたい）。これらの公開されたリソースは、それらのそれぞれの示される教示および構成物について参照によって組み込まれる。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける異種酵素の発現のために構築したプラスミドは、次いで脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生成の改善を実証する組換え微生物を生成するためにＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓに形質転換する。
（実施例１８）
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓにおける脂肪酸または脂肪酸由来生成物のバイオ生産の改善
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける異種酵素の発現のために本明細書に記載の通りプラスミドを構築し、それを使用して、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓをプロトプラスト形質転換によって形質転換して脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生成の改善を実証する組換え微生物を生成する。
（実施例１９）
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）Ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（現在はＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒと称される）における脂肪酸または脂肪酸由来生成物のバイオ生産の改善
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓにおける遺伝子発現および突然変異の創製のための方法は当技術分野で公知である（例えば、Taghaviら、Appl.Environ. Microbiol.、６０巻（１０号）：３５８５〜３５９１頁（１９９４年）を参照されたい）。この公開されたリソースは、その示される教示および構成物について参照によって組み込まれる。脂肪酸の生合成を改善することが同定された核酸配列はいずれも、様々な供給源から単離し、適切なようにコドン最適化し、本明細書において記載される広範囲の宿主領域のベクターのいずれかにクローニングし、脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生成の改善を実証する組換え微生物を作製するために電気穿孔する。重要なことに、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ株を使用すると、唯一の炭素の供給源として二酸化炭素および水素から脂肪酸または脂肪酸由来生成物を生成することができ、この微生物は化学合成無機栄養的に（ｃｈｅｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃａｌｌｙ）増殖することができるので、当量が低減する。
（実施例２０）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａにおける脂肪酸または脂肪酸由来生成物のバイオ生産の改善
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａにおける遺伝子発現ための方法は当技術分野で公知である（例えば、これらの教示について参照により本明細書に組み込まれているBen−Bassatら、米国特許第６，５８６，２２９号を参照されたい）。脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生合成を改善することが同定された核酸配列はいずれも、様々な供給源から単離し、適切なようにコドン最適化し、本明細書において記載される広範囲の宿主領域のベクターのいずれかにクローニングし、脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生合成による生成を実証する組換え微生物を生成するために電気穿孔する。例えば、これらの核酸配列は、ｐＵＣＰ１８に挿入し、このライゲーションしたＤＮＡは、脂肪酸または脂肪酸由来生成物の形成の増加を示す組換えＰ．ｐｕｔｉｄａ微生物を作製するために、エレクトロコンピテントＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０細胞に電気穿孔する。
（実施例２１）
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍにおける脂肪酸または脂肪酸由来生成物のバイオ生産の改善
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ科に属し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの形質転換において使用される多くのプラスミドおよびベクターがＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓに対して使用される。適切なベクターの非限定的な例としては、ｐＡＭ．ベータ．１およびその誘導体（Renaultら、Gene １８３巻：１７５〜１８２頁（１９９６年）；およびO'Sullivanら、Gene １３７巻：２２７〜２３１頁（１９９３年））；ｐＭＢＢ１の誘導体であるｐＭＢＢ１およびｐＨＷ８００（Wyckoffら、Appl. Environ. Microbiol６２巻：１４８１〜１４８６頁（１９９６年））；接合性プラスミドであるｐＭＧ１（Tanimotoら、J. Bacteriol.１８４巻：５８００〜５８０４頁（２００２年））；ｐＮＺ９５２０（Kleerebezemら、Appl. Environ. Microbiol. ６３巻：４５８１〜４５８４頁（１９９７年））；ｐＡＭ４０１（Fujimotoら、Appl. Environ. Microbiol.６７巻：１２６２〜１２６７頁（２００１年））；ならびにｐＡＴ３９２（Arthurら、Antimicrob. AgentsChemother. ３８巻：１８９９〜１９０３頁（１９９４年））が挙げられる。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来のいくつかのプラスミドも報告されている。（例えば、van Kranenburg R、Golic N、Bongers R、Leer R J、de Vos WM、Siezen R J、Kleerebezem M. Appl. Environ. Microbiol. ２００５年３月；７１巻（３号）：１２２３〜１２３０頁）。脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生合成を改善することが同定された核酸配列はいずれも、様々な供給源から単離し、適切なようにコドン最適化し、本明細書において記載されているベクターのいずれかにクローニングし、脂肪酸または脂肪酸由来生成物の生合成による生成を実証する組換え微生物を作製するために導入する。
（実施例２２）
脂肪アルコールの生成
脂肪酸を産生する生成株を用いて、脂肪酸アシル−ＣｏＡまたは遊離の脂肪酸を脂肪アルコールに変換する酵素をコードする遺伝子を発現させることによって脂肪アルコールを生成することもできる。これらの酵素の例としては、アルコール形成性アシル−ＣｏＡ還元酵素（ＥＣ１．２．１．−）、または長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素（ＥＣ１．２．１．５０）と、それに加えてアルコール脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．１）、またはアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．−）とアルコール脱水素酵素との組み合わせが挙げられる。脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ＳＰ．ＡＤＰ１のｆａｂＧ遺伝子、受託番号ＹＰ＿０４７８６９によってもたらされる。脂肪酸アシル還元酵素活性を有するポリペプチドは、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉのＦＡＲ−Ｎ＿ＳＤＲ＿ｅ遺伝子、受託番号ＢＡＣ７９４２５によってもたらされる。アルデヒド脱水素酵素を有するポリペプチドは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＮＧ８０−２のＡＬＤＨ遺伝子、受託番号ＹＰ＿００１１２５９７０によってもたらされる。アルコール脱水素酵素活性を有するポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのｙｑｈＤ遺伝子、受託番号ＡＰ＿００３５６２．１によってもたらされる。これらの活性の追加の供給源は、当技術分野で公知であり、脂肪アルコールを生成する生成株を作製するために組み合わせることができる。
ＩＶ．共通の方法セクション
このセクションにおける方法は全て、参照される場合、実施例への組み込みのために提供される。
サブセクションＡ．微生物種および株、培養物、ならびに増殖培地
必要に応じて利用されてもよい細菌の種は、以下の通りである。
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（ＤＳＭＺ＃１１３９）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ブレインハートインヒュージョン（ＢＨＩ）培地（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）に再懸濁させる。その再懸濁したＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ培養物の段階希釈物は、ＢＨＩ中に作製し、飽和するまで２５０ｒｐｍで３７℃で４８時間好気的に増殖させる。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓは、Ｇｉｌｌ研究所（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ ａｔ Ｂｏｕｌｄｅｒ）からの寄贈品であり、活発に増殖している培養物として得られる。その活発に増殖しているＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ培養物の段階希釈物は、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）中に作製し、飽和するまで２５０ｒｐｍで３７℃で２４時間好気的に増殖させる。
Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｌｉｍｉｃｏｌａ（ＤＳＭＺ＃２４５）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、Ｐｆｅｎｎｉｇ培地ＩおよびＩＩ（＃２８および２９）を使用してＤＳＭＺ説明書によって記載されるように、再懸濁させる。Ｃ．ｌｉｍｉｃｏｌａは、一定のボルテックス下で２５℃で増殖させる。
Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｂｒａａｋｉｉ（ＤＳＭＺ＃３００４０）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ブレインハートインヒュージョン（ＢＨＩ）培地（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）に再懸濁させる。その再懸濁したＣ．ｂｒａａｋｉｉ培養物の段階希釈物は、ＢＨＩ中に作製し、飽和するまで２５０ｒｐｍで３０℃で４８時間好気的に増殖させる。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（ＤＳＭＺ＃７９２）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ＤＳＭＺ説明書によって記載されるように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ培地（＃４１１）に再懸濁させる。Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍは、飽和するまで、２５０ｒｐｍで３７℃で嫌気的に増殖させる。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（ＤＳＭＺ＃２６３４）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ＤＳＭＺ説明書によって記載されるように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ培地（＃２８６）に再懸濁させる。Ｃ．ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍは、飽和するまで、２５０ｒｐｍで３７℃で嫌気的に増殖させる。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ（ＤＳＭＺ＃５５５）は、活発に増殖している培養物として、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ） から得られる。Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ培養物の段階希釈物は、ＤＳＭＺ説明書によって記載されるようにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ培地（＃２８６）中に作製する。Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉは、飽和するまで、２５０ｒｐｍで３７℃で嫌気的に増殖させる。
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ（ＤＭＳＺ＃２８３９）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ブレインハートインヒュージョン（ＢＨＩ）培地（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）に再懸濁させる。その再懸濁したＣ．ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ培養物の段階希釈物は、ＢＨＩ中に作製し、飽和するまで２５０ｒｐｍで３０℃で４８時間好気的に増殖させる。
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（ＤＳＭＺ＃４２８）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ブレインハートインヒュージョン（ＢＨＩ）培地（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）に再懸濁させる。その再懸濁したＣ．ｎｅｃａｔｏｒ培養物の段階希釈物は、ＢＨＩ中に作製し、飽和するまで２５０ｒｐｍで３０℃で４８時間好気的に増殖させる。他のところで述べられるように、この種についての以前の名称は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓおよびＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓである。
Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｆｒｕｃｔｏｓｏｖｏｒａｎｓ（ＤＳＭＺ＃３６０４）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ＤＳＭＺ説明書によって記載されるように、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｆｒｕｃｔｏｓｏｖｏｒａｎｓ培地（＃６３）に再懸濁させる。Ｄ．ｆｒｕｃｔｏｓｏｖｏｒａｎｓは、飽和するまで、２５０ｒｐｍで３７℃で嫌気的に増殖させる。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃｒｏｏｋｓ（ＤＳＭＺ＃１５７６）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ブレインハートインヒュージョン（ＢＨＩ）培地（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）に再懸濁させる。その再懸濁したＥ．ｃｏｌｉ Ｃｒｏｏｋｓ培養物の段階希釈物は、ＢＨＩ中に作製し、飽和するまで２５０ｒｐｍで３７℃で４８時間好気的に増殖させる。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２は、Ｇｉｌｌ研究所（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ ａｔ Ｂｏｕｌｄｅｒ）からの寄贈品であり、活発に増殖している培養物として得られる。その活発に増殖しているＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２培養物の段階希釈物は、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）中に作製し、飽和するまで２５０ｒｐｍで３７℃で２４時間好気的に増殖させる。
Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ（ＤＳＭＺ＃１５７６）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ＤＳＭＺ説明書によって記載されるように、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培地（＃９７）に再懸濁させる。Ｈ．ｓａｌｉｎａｒｕｍは、飽和するまで、２５０ｒｐｍで３７℃で好気的に増殖させる。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ（＃４３３５）は、活発に増殖している培養物としてＷＹＥＡＳＴ ＵＳＡ（Ｏｄｅｌｌ、ＯＲ、ＵＳＡ）から得られる。その活発に増殖しているＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ培養物の段階希釈物は、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）中に作製し、飽和するまで２５０ｒｐｍで３０℃で２４時間好気的に増殖させる。
Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ（ＤＳＭＺ＃５３４８）は、活発に増殖している培養物として、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。Ｍ．ｓｅｄｕｌａ培養物の段階希釈物は、ＤＳＭＺ説明書によって記載されるようにＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ培地（＃４８５）中に作製する。Ｍ．ｓｅｄｕｌａは、飽和するまで、２５０ｒｐｍで６５℃で好気的に増殖させる。
Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ亜種ｓｈｅｒｍａｎｉｉ（ＤＳＭＺ＃４９０２）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ＤＳＭＺ説明書によって記載されるように、ＰＹＧ培地（＃１０４）に再懸濁させる。Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ亜種ｓｈｅｒｍａｎｉｉは、飽和するまで、２５０ｒｐｍで３０℃で嫌気的に増殖させる。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａは、Ｇｉｌｌ研究所（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ ａｔ Ｂｏｕｌｄｅｒ）からの寄贈品であり、活発に増殖している培養物として得られる。その活発に増殖しているＰ．ｐｕｔｉｄａ培養物の段階希釈物は、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）中に作製し、飽和するまで２５０ｒｐｍで３７℃で２４時間好気的に増殖させる。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（ＤＳＭＺ＃６１７８）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）に再懸濁させる。Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、飽和するまで、２５０ｒｐｍで３７℃で好気的に増殖させる。
以下の非限定的な株もまた、本実施例において出発株として使用されてもよい：ＤＦ４０ ［Ｈｆｒ（ＰＯ２Ａ）、ｇａｒＢ１０、ｆｈｕＡ２２、ｏｍｐＦ６２７（Ｔ２Ｒ）、ｆａｄＬ７０１（Ｔ２Ｒ）、ｒｅｌＡ１、ｐｉｔＡ１０、ｓｐｏＴ１、ｒｒｎＢ−２、ｐｇｉ−２、ｍｃｒＢ１、ｃｒｅＣ５１０］、ＢＷ２５１１３ ［Ｆ−、Δ（ａｒａＤ−ａｒａＢ）５６７、ΔｌａｃＺ４７８７（：：ｒｒｎＢ−３）、＆ｌａｍｂｄａ−、ｒｐｈ−１、Δ（ｒｈａＤ−ｒｈａＢ）５６８、ｈｓｄＲ５１４］、ＪＰ１１１ ［Ｈｆｒ（ＰＯ１）、ｇａｌＥ４５（ＧａｌＳ）、ｆａｂＩｔｓ、ｒｅｌＡ１、ｓｐｏＴ１、ｔｈｉ−１］。これらの株は、認識される遺伝子改変を有し、Ｙａｌｅ Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ ＵＳＡ）などの公的な培養物供給源から入手可能である。これらの株から開発された株は、本実施例において記載される。
一般的な研究室用培地としては、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）、およびＭ９最少培地などの商業的に調製された培地が挙げられる。ＳＭ１１培地の内容は以下の通りである（１０００ｍＬ当たり）：
２ｍＬ ＦＭ１０微量ミネラルストック
２．２６ｍＬ １Ｍ ＭｇＳＯ４
３０ｇグルコース
２００ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）
１ｇ／Ｌ酵母抽出物
１．２５ｍＬ ＶＭ１ビタミンミックス
０．３２９ｇ Ｋ２ＨＰＯ４
０．１７３ｇ ＫＨ２ＰＯ４
３ｇ （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．１５ｇ クエン酸（無水）
ＦＭ１０微量ミネラルストックは、以下からなる：
１ｍＬ濃縮ＨＣｌ
４．９ｇ ＣａＣｌ２＊２Ｈ２０
０．９７ｇ ＦｅＣｌ３＊６Ｈ２０
０．０４ｇ ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２０
０．２７ｇ ＣｕＣｌ２＊２Ｈ２０
０．０２ｇ ＺｎＣｌ２
０．０２４ｇ Ｎａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ
０．００７ｇ Ｈ３ＢＯ３
０．０３６ｇ ＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏ
ＤＩ水を用いて１００ｍＬにしたＱ．Ｓ．
ＶＭ１ビタミンミックス溶液は、以下からなる：
５ｇチアミン
５．４ｇパントテン酸
６．０ｇナイアシン
０．０６ｇ
ＤＩ水を用いて１０００ｍＬにしたＱ．Ｓ．
サブセクションＢ：ゲル調製、ＤＮＡ分離、抽出、ライゲーション、および形質転換方法
ＴＡＥ中１％アガロースを作製するために、分子生物学グレードのアガロース（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）を１×ＴＡＥに加える。５０×ＴＡＥを得るため、９００ｍｌ蒸留Ｈ２Ｏに以下を加え：２４２ｇトリス塩基（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）、５７．１ｍｌ氷酢酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、１８．６ｇ ＥＤＴＡ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ ＵＳＡ）、さらなる蒸留水を用いて１Ｌに容量を調整する。１×ＴＡＥを得るために、９８０ｍＬの蒸留水に２０ｍＬの５０×ＴＡＥを加える。次いで、沸騰が生じるまで、そのアガロースＴＡＥ溶液を加熱し、アガロースを完全に溶解する。５０℃までその溶液を冷却させた後、１０ｍｇ／ｍＬ臭化エチジウム（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を１００ｍＬの１％アガロース溶液当たり５μｌの濃度で加える。一旦、臭化エチジウムを添加したら、その溶液を短時間混合し、試料分析あたり、適切な数のコームを有するゲル成型トレイ（Ｉｄｅａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）に注ぐ。次いで、ＤＮＡ試料は、５×ＴＡＥローディングバッファーと適宜混合する。５×ＴＡＥローディングバッファーは、５×ＴＡＥ（本明細書において記載される５０×ＴＡＥから希釈）、２０％グリセロール（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）、０．１２５％ブロモフェノールブルー（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ、ＭＡ、ＵＳＡ）からなり、蒸留水を用いて５０ｍＬに容量を調整する。次いで、ロードしたゲルは、２５〜３０分間、１２５ボルトの定電圧で、１×ＴＡＥを満たしたゲル装置（Ｉｄｅａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｃｏ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）中で泳動する。この時点では、ゲルは、電圧を有するゲルボックスから取り出し、ＵＶトランスイルミネーター（ＦＯＴＯＤＹＮＥ Ｉｎｃ．、Ｈａｒｔｌａｎｄ、ＷＩ、ＵＳＡ）下で視覚化する。
次いで、ゲル抽出を通して単離したＤＮＡは、製造者の指示（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ ＵＳＡ））に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用して抽出する。類似する方法は、当業者に公知である。
プラスミド構築は、当業者に公知の制限酵素／ライゲーション方法論、またはＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）もしくはＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ＵＳＡ）などの相同組換え法のいずれかを使用して行った。
一般的な形質転換および関連する培養方法論：
ケミカルコンピテント形質転換プロトコールは、製造者の指示またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）に含有される文献に従って実行する。一般に、プラスミドＤＮＡまたはライゲーション産物は、ケミカルコンピテント細胞を有する溶液中で５〜３０分間氷上で冷却する。ケミカルコンピテント細胞は、バイオテクノロジーの分野において広く使用される産物であり、本サブセクションにおいて示されるものなどの複数のベンダーから入手可能である。冷却期間後、細胞には、一般に、振盪させずに４２℃で３０秒間熱ショックを与え、再度冷却し、Ｓ．Ｏ．Ｃ．などの２５０マイクロリットルのリッチ培地と組み合わせる。次いで、細胞は、１時間２５０ｒｐｍで振盪させながら、３７℃でインキュベートする。最後に、その細胞は、適切な抗生物質を含有する培地でプレート培養することによって形質転換の成功についてスクリーニングする。
その代わりに、選択した細胞は、当業者に公知のものなどの電気穿孔法によって形質転換されてもよい。
Ｅ．ｃｏｌｉの染色体における遺伝子操作を、当業者に公知のＬａｍｂｄａ−Ｒｅｄ組み換え技術（DatsenkoおよびWanner、２０００年およびＧｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄｒｅｓｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実現させた。これは、遺伝子の欠失、挿入および突然変異を含んだ。
プラスミド構築は、当業者に公知の制限酵素／ライゲーション方法論、またはＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ． Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）もしくはＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ． Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ＵＳＡ）などの相同組換え法のいずれかを製造者の説明書に従って使用して行った。
プラスミド形質転換のためのＥ．ｃｏｌｉ宿主株の選択は、プラスミド安定性、プラスミド適合性、プラスミドスクリーニング法、およびタンパク質発現などの因子を考慮することによって決定する。株のバックグラウンドは、本明細書において記載されるとおりプラスミドＤＮＡを単に精製し、任意の一般に使用されるクローニング株（例えばＤＨ５α、Ｔｏｐ１０Ｆ’、Ｅ．ｃｌｏｎｉ １０Ｇなど）などの、実験的な必要性によって決定されるなどの、所望のまたは別の方法で適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主株にプラスミドを形質転換することによって、変更することができる。
プラスミドＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）からの市販のミニプレップキットを使用して調製した。
本明細書において記載される実施形態、変形物、配列、および図は、本発明の有用性および多用途性の指標を提供するはずである。本明細書において記載される特徴および利点の全てを提供するとは限らない他の実施形態もまた、本発明の精神および範囲から逸脱することなく利用されてもよい。そのような改変物および変形物は、本発明の範囲内にあると考えられる。
サブセクションＣ．振とうフラスコ株評価プロトコール
振とうフラスコ法１：株を振とうフラスコにおいて、遊離の脂肪酸（ＦＦＡ）の生成について評価した。３連の評価を実施した。簡単に述べると、一晩発端培養物を適切な抗生物質を含む５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ中に作製し、３０℃で１６〜２４時間、２２５ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。これらの培養物を使用して、各株のＳＭ１１最少培地中培養物１５０ｍＬを０．８のＯＤ６００まで、および５％ＴＢ培養物のキャリーオーバーを出発接種材料として、および抗生物質を接種した。培養物を、３０℃で２時間、２２５ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。２時間後に、細胞をＳＭ１１（リン酸なし）で洗浄した。細胞を２回遠心沈澱させ（４，０００ｒｐｍ、１５分）、上清をデカントし、ペレットを１５０ｍｌのＳＭ１１（リン酸なし）に再懸濁させた。この培養物を使用して、ＳＭ１１（リン酸なし）中の各株５０ｍＬを３回接種した。この培養物を３０℃でおよそ２時間、２時間後の細胞１．０〜１．５のＯＤ６００まで増殖させ、３７℃にシフトさせ、７２時間にわたり、試料を脂肪酸測定のために定期的に取り出した。
振とうフラスコ法２：株を振とうフラスコにおいて、ＦＦＡの生成について評価した。３連の評価を実施する。簡単に述べると、一晩発端培養物を適切な抗生物質を含む５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ中に作製し、３０℃で１６〜２４時間、２２５ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。これらの培養物を使用して、各株のＳＭ１１最少培地中培養物１５０ｍＬを０．８のＯＤ６００まで、および５％ＴＢ培養物のキャリーオーバーを出発接種材料として、および抗生物質を接種した。２時間後に、細胞をＳＭ１１（リン酸なし）で洗浄した。細胞を２回遠心沈澱させ（４，０００ｒｐｍ、１５分）、上清をデカントし、ペレットを１５０ｍｌのＳＭ１１（リン酸なし）に再懸濁させた。この培養物を使用してＳＭ１１（リン酸なし）中の各株５０ｍＬを３回接種し、それぞれに０．５ｍＭのＩＰＴＧを加えた。この培養物を３０℃でおよそ２時間、１．８〜２．０のＯＤ６００まで増殖させ、その後、培養物を３７℃にシフトさせ、７２時間にわたり、試料を脂肪酸測定のために定期的に取り出した。
振とうフラスコ法３：株を振とうフラスコにおいて、ＦＦＡの生成について評価した。３連の評価を実施した。簡単に述べると、一晩発端培養物を適切な抗生物質を含む５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ中に作製し、３０℃で１６〜２４時間、２２５ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。これらの培養物を使用して、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地中の各株の培養物３００ｍＬを０．８のＯＤ６００まで、および５％ＴＢ培養物のキャリーオーバーを出発接種材料として、および抗生物質を接種した。培養物を、３０℃で４〜６時間、２２５ｒｐｍで振とうしながら、１．８〜２．０のＯＤ６００に達するまでインキュベートした。４〜６時間後、細胞をＳＭ１１（リン酸なし）で洗浄した。細胞を２回遠心沈澱させ（４，０００ｒｐｍ、１５分）、上清をデカントし、ペレットを３００ｍｌのＳＭ１１（リン酸なし）に再懸濁させた。この培養物を使用して、ＳＭ１１（リン酸なし）中の各株１００ｍＬを３回接種した。この培養物を２５℃でおよそ１６時間増殖させ、次いで、３７℃にシフトさせ、７２時間にわたり、試料を脂肪酸測定のために定期的に取り出した。
振とうフラスコ法４：株を振とうフラスコにおいて、ＦＦＡの生成について評価した。３連の評価を実施した。簡単に述べると、一晩発端培養物を適切な抗生物質を含む５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ中に作製し、３０℃で１６〜２４時間、２２５ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。これらの培養物を使用して、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地中の各株の培養物３００ｍＬを０．８のＯＤ６００まで、および５％ＴＢ培養物のキャリーオーバーを出発接種材料として、および抗生物質を接種した。培養物を、３０℃で４〜６時間、２２５ｒｐｍで振とうしながら、１．８〜２．０のＯＤ６００に達するまでインキュベートした。４〜６時間後、細胞をＳＭ１１（リン酸なし）で洗浄した。細胞を２回遠心沈澱させ（４，０００ｒｐｍ、１５分）、上清をデカントし、ペレットを３００ｍＬのＳＭ１１（リン酸なし）に再懸濁させる。この培養物を使用して、ＳＭ１１（リン酸なし）中の各株１００ｍＬを３回接種し、それぞれに０．５ｍＭのＩＰＴＧを加えた。この培養物を２５℃でおよそ１６時間増殖させ、次いで、３７℃にシフトさせ、７２時間にわたり、試料を脂肪酸測定のために定期的に取り出した。
サブセクションＤ．分析物の定量化プロトコール
脂肪酸の定量化を、発酵培地において脂肪酸をエステル化してメチルエステル（ＦＡＭＥ）を作製した後、Ｓｔａｂｉｌｗａｘカラムを使用したガスクロマトグラフィーによって分析することによって実施した。エステル化は、塩酸中メタノールを用いて１００℃で２時間行った。ＦＡＭＥをＧＣカラムで分離し、炎イオン化検出（ＦＩＤ）によって検出した。実行の開始時に各成分の標準曲線を使用してＦＡＭＥを定量化した。データは培地中の各ＦＡＭＥの量（ｍｇ）で報告されている。
溶媒および緩衝液
メチルエステル化溶液（８３％メタノール／８．３％塩酸／８．３％クロロホルム）は、１００ｍＬメタノールを１００ｍＬガラス瓶に加え、１０ｍＬ塩酸を加え、１０ｍＬクロロホルムを加え、十分に混合することによって作製する（室温で保管する）。
抽出溶液（８０％ヘキサン／２０％クロロホルム）は、８０ｍＬヘキサンを１００ｍＬガラス瓶に加え、２０ｍＬクロロホルムを加え、十分に混合することによって作製する（室温で保管する）。
手順
ＧＣは、勾配：５０℃で４分、毎分７℃で１５０℃まで、３分保持、毎分４０℃で２２０℃まで、および２分保持の下で作動させ、総実行時間は２５分である。キャリヤーガスは、４．０ｍＬ／分の流速のヘリウムとし、メイクアップガスは３０ｍＬ／分の流速のヘリウムとする。水素の流速は３５ｍＬ／分とし、空気の流速は３４０ｍＬ／分であり、速度は５５．３ｃｍ／秒とし、圧力は５０℃で１６．３ｐｓｉとし、スプリット比は１７：１とし、スプリットフローは６８ｍＬ／とし、注入量は１μＬとし、注入口の温度は２５０℃とし、検出器の温度は３００℃とする。
ペンタデカンを内部標準として使用する。各脂肪酸に対して、ＧＣソフトウェアおよび線形回帰関数を用い、標準物質の濃度に基づいて標準曲線を準備する。各試料中および対照中の各脂肪酸の量（ｍｇ）は、ＧＣ較正ソフトウェアを使用して決定する。アッセイの判定基準には、脂肪酸標準曲線についての相関係数が０．９９より大きいことが必要である。標準物質の濃度は歴史的な範囲内でなければならない。
試料は以下の通り調製する：＜２ｍＬ培養物を反応バイアルに加える。試料を、ＳｐｅｅｄＶａｃにおいて熱を用いておよそ６０分にわたって乾燥させる。３ｍＬメチルエステル化溶液を加える。１０μＬ内部標準溶液を加える。８５℃で２時間インキュベートする。インキュベーターから取り出し、室温まで冷ます。１ｍＬ脱イオン水を加える。２ｍＬ抽出溶液を加える。１分間にわたって勢いよくボルテックスし、混合物を静置し、分離させる。有機層（ＴＯＰ）を取り出し、アンバーＧＣバイアル中のバイアルインサートに入れる。
質量分析検出器の使用は、ＧＣ−ＦＩＤと同じ試料の調製方法を用いることからなる。化学的実体の同定の追加のツールは、遊離の脂肪酸（ＦＦＡ）を検証するためのＮＩＳＴ０８ライブラリーによるものである。これは質量分析器を使用した、標準物質を用いた保持時間だけでなく、その標準物質に対する標的イオンおよび確認イオン（ｑｕａｌｉｆｉｅｒ ｉｏｎ）にも適合するものである。

Claims (15)

  1. 脂肪酸または脂肪酸由来生成物を生成する遺伝子改変微生物であって、該脂肪酸鎖長が４から＞１８までから選択され得、脂肪酸が、成長する脂肪酸アシル−ＣｏＡ鎖を介して生成され、さらに、該脂肪酸鎖が、少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡ分子を用い、マロニル−ＡＣＰを使用せずに伸長する、遺伝子改変微生物。
  2. ブチリル−ＣｏＡ生成物／中間体がアセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡから作製される、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
  3. ブチリル−ＣｏＡ生成物／中間体がマロニル−ＣｏＡから作製される、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
  4. 鎖長が４を超えるアシル−ＣｏＡ（長さｎ）生成物／中間体がアセチル−ＣｏＡおよびアシル−ＣｏＡ鎖（長さｎ−２）から作製される、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
  5. 鎖長が４を超えるアシル−ＣｏＡ（長さｎ）生成物／中間体がマロニル−ＣｏＡおよびアシル−ＣｏＡ鎖（長さｎ−２）から作製される、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
  6. 前記生成物が、鎖長Ｃ４について濃縮された脂肪酸混合物であり、該Ｃ４鎖が、質量（ｇ）ベースで全脂肪酸生成物の＞９％、＞５０％、＞８５％または＞９５％の百分率を構成する、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
  7. 前記生成物が、鎖長Ｃ６について濃縮された脂肪酸混合物であり、該Ｃ６鎖が、質量（ｇ）ベースで全脂肪酸生成物の＞１０％、＞５０％、＞８５％または＞９５％の百分率を構成する、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
  8. 前記生成物が、鎖長Ｃ８について濃縮された脂肪酸混合物であり、該Ｃ８鎖が、質量（ｇ）ベースで全脂肪酸生成物の＞１０％、＞５０％、＞８５％または＞９５％の百分率を構成する、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
  9. 前記生成物が、鎖長Ｃ１０について濃縮された脂肪酸混合物であり、該Ｃ１０鎖が、質量（ｇ）ベースで全脂肪酸生成物の＞１０％、＞５０％、＞８５％または＞９５％の百分率を構成する、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
  10. 前記生成物が、鎖長Ｃ１２について濃縮された脂肪酸混合物であり、該Ｃ１２鎖が、質量（ｇ）ベースで全脂肪酸生成物の＞１０％、＞５０％、＞８５％または＞９５％の百分率を構成する、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
  11. 前記生成物が、鎖長Ｃ１４について濃縮された脂肪酸混合物であり、該Ｃ１４鎖が、質量（ｇ）ベースで全脂肪酸生成物の＞１０％、＞５０％、＞８５％または＞９５％の百分率を構成する、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
  12. 前記生成物が、鎖長Ｃ１６について濃縮された脂肪酸混合物であり、該Ｃ１６鎖が、質量（ｇ）ベースで全脂肪酸生成物の＞１０％、＞５０％、＞８５％または＞９５％の百分率を構成する、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
  13. 前記生成物が、鎖長Ｃ１８について濃縮された脂肪酸混合物であり、該Ｃ１８鎖が、質量（ｇ）ベースで全脂肪酸生成物の＞１０％、＞５０％、＞８５％または＞９５％の百分率を構成する、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
  14. 前記請求項のいずれかに記載の微生物を使用する発酵プロセスであって、脂肪酸または脂肪酸ベースの生成物が生成される、発酵プロセス。
  15. アシル−ＣｏＡをアルコール、アルデヒド、アルケン、アルカンまたは二酸を含めた脂肪酸由来生成物に変換するようにさらに遺伝子改変されている、前記請求項のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
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