JP2010527612A - 炭化水素産生遺伝子およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本特許出願は、引用により組み込んだ2007年5月22日出願の米国仮特許出願第60/931,370号、2007年5月25日出願の米国仮特許出願第60/931,939号、2007年7月25日出願の米国仮特許出願第60/951,944号、および2007年9月24日出願の米国仮特許出願第60/974,810号からの優先権を主張する。
本明細書と同時に提出され、2008年5月20日に作成された「702724_ST25.TXT」という名称の1,359,078バイトのASCII(テキスト)ファイルで特定されたコンピュータで読み取り可能なヌクレオチド/アミノ酸配列のリストは、全体が本明細書に引用により組み込まれる。
本発明は、OleA、OleB、OleCまたはOleDアミノ酸モチーフ配列を含むポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。
本発明は、少なくとも部分的に、炭化水素の生合成に関与するタンパク質をコードするいくつかの遺伝子の発見に基づいている。本明細書で同定した1種または複数のタンパク質をコードする1種または複数の核酸配列で形質転換された生物は、オレフィンなどの炭化水素および脂肪族ケトンなどの炭化水素中間体の生成に使用することができる。「オレフィン」および「アルケン」という用語は本明細書では同義に使用される。本明細書で記載したように、これらの核酸配列は、炭化水素の生合成に関与する遺伝子として定義された。したがって、1種または複数のこれらの遺伝子で形質転換された細胞は、オレフィンおよびそれらの前駆体(例えば、脂肪族ケトン)を含む炭化水素の製造のための供給源として使用できる。この発見は、限界のある再生不可能な炭化水素資源(例えば、石油をベースにした燃料)の代わりに燃料として使用できる炭化水素供給源を提供する。さらに、特定の適用のために考案された広範な特定なオレフィンおよび脂肪族ケトン生成物を産生することが可能である。宿主生物および/または反応基質を制御することによって(例えば、鎖長、分枝、飽和および/または2重結合の位置を制御することによって)、特定の分枝および不飽和位置を有する炭化水素生成物を含む広範な炭化水素生成物を産生する生物を創出することができる。
1)R+ATP→R−OPO3−アデノシン+ピロリン酸
2)R−OPO3−アデノシン+CoASH→R−SCoA+AMP
δ13C(0/00)=[(13C/12C)試料−(13C/12C)標準物質]/(13C/12C)標準物質×1000
本実施例は、本特許の範囲内で実施例を実行する際に用いられる材料および方法を記載する。特定の方法を記載するが、当業者は他の同様の方法も用い得ることを理解するであろう。一般的に、他に明記しない限りは標準的な実験室業務(laboratory practice)を用いた。例えば、標準的な実験室業務を以下のために用いた: クローニング; 核酸の操作およびシークエンシング; タンパク質の精製および解析; ならびに他の分子生物学的および生化学的手法。かかる手法は、標準的な実験マニュアル、例えば前掲の Sambrook et al.; および前掲の Ausubel et al. において詳細に説明される。
微生物の菌株: 本発明において用いた微生物の菌株は、以下の通りであった:
S. maltophilia (ATCC 菌株番号: 17674、17679、17445、17666);
S. maltophilia ATCC 17679 ΔoleA
S. maltophilia ATCC 17679 ΔoleC
S. maltophilia ATCC 17679 ΔoleD
E. coli T7 Express lysY/Iq (New England Biolabs、Ipswich、MA 01938-2723)
E. coli C41(DE3) (Lucigen Corporation、Middleton、WI 53562)
E. coli C41(DE3) ΔfadE (Lucigen Corporation、Middleton の E. coli C41(DE3)株、fadE 遺伝子 EC 1.3.99.3、アシル-CoA デヒドロゲナーゼの欠失を有する WI 53562、Klein. K. et al.、Eur. J. Biochem. II I 19: 442-450 (1971))。
E. coli C41(DE3) ΔfadE; pET-21b(+)_OleA、pCOLADuet-1_OleC、pCDFDuet-1_OleD
E. coli C41(DE3); pET-21b(+)_OleA
E. coli C41(DE3); pET-21b(+)_OleB
E. coli C41(DE3); pET-21b(+)_OleD
E. coli C41(DE3); pETDuet-1_OleAB; pCOLADuet-1_OleCD
E. coli MG1655 ΔfadE (fadE 遺伝子の欠失を有する E. coli MG1655)
E. coli MG1655 ΔfadE、fadD(+) (fadE 遺伝子の欠失、および fadD の上流の T5 プロモーター配列を有する E. coli MG1655 株)
Saccharomyces cerevisiae Hansen、teleomorph BY4741 (ATCC 201388)
S. cerevisiae BY4741; pESC-HIS_OleA
Bacillus megaterium WH320 (Mo Bi Tec、Germany からの菌株)
B. megaterium WH320; pWH1520_OleCDAB
B. megaterium WH320; pWH1520
Bacillus subtilis IHA01 lacA::spec leuB8 metB5 r(-)m(+) Sp (Bacillus Genetic Stock Center、Columbus からの菌株、OH 菌株番号 BGSC 1A785)
B. subtilis IHA01、pHT01_OleA
Arthrobacter aurescens TC1 (ATCC BAA-1386 からの菌株)
抽出方法 1: 5 mL ペレット抽出
有機化合物(オレフィン、脂肪族ケトンおよび炭化水素)を、メタノール:ヘキサン抽出プロトコールを用いて細菌の細胞ペレットから抽出した。簡潔には、5 mL の培養物/発酵ブロス(broth)をガラス試験管において 3500 rpm で 15 分間遠心し(Allegra X-15R Centrifuge with rotor SX-4750A、Beckman Coulter、Fullerton、CA)、上清をデカントし、得られたペレットを 100 μL の滅菌蒸留水中に再懸濁し、ボルテックスミキサー上で均一になるまで混合した。次に、1 mL のメタノールを添加し、ボルテックスミキサーを用いてサンプルを混合した。次いで、サンプルを超音波ウォーターバス(Bransonic(登録商標)、Tabletop Ultrasonic Cleaners、model 5510、Danbury、CT)中で 15 分から 1.5 時間の間超音波処理した。超音波処理の後、4 mL のヘキサンを添加し、サンプルをボルテックスミキサー上で混合した。次いでサンプルを、3500 rpm で 15 分間遠心した(Allegra X-15R Centrifuge with rotor SX-4750A、Beckman Coulter、Fullerton、CA)。上層(ヘキサン層)を取り除き、清潔なガラスチューブに添加した。次いで、サンプルを、遠心機(Vacufuge 5301、Eppendorf、Westbury、NY)中において減圧下でおよそ 30 分間、本質的に溶剤が存在しなくなるまで乾燥させた。次いでサンプルを 100 μL の酢酸エチルまたはクロロホルム中に再懸濁した。次に、1 μL のサンプルを以下に記載される検出方法にしたがって GC/MS 上で解析した。
インビトロアッセイのために、有機化合物(オレフィン、脂肪族ケトンおよび炭化水素)を、酢酸エチル/1% 酢酸抽出プロトコールを用いて、インビトロのサンプルから抽出した。インビトロアッセイのサンプルを、1% 酢酸を含有する酢酸エチルを 500 μL 添加することによって抽出した。サンプルをボルテックスミキサー上で混合し、その後、水層と有機層を分離するため 3500 rpm で 5 分間遠心した (ローター FA-45-24-11 を備える遠心機 5424、Eppendorf、Westbury、NY)。上層(酢酸エチル層)を、清潔なチューブに移した。次いでサンプルを、遠心機(Vacufuge 5301、Eppendorf、Westbury、NY)中において減圧下でおよそ 30 分間、本質的に溶剤が存在しなくなるまで乾燥させた。サンプルを 50 μL の酢酸エチル中に再懸濁し、GC/MS および/または GC/FID によって解析した。1 から 10 μL の間を、以下に記載される検出方法にしたがって GC/MS または GC/FID 上で炭化水素含有量について解析した。
0.5 から 1 mL の間の発酵培養物を、1.7 mL のエッペンドルフチューブに加えた。次いで、この培養物を、適切な炭化水素のスパイク(spike)(例えば 10 mg/L のシス-9-トリコセンまたはオレフィンのための 10 mg/L のヘキサコサン、脂肪族ケトンのための 10 mg/L の14-ヘプタコサノン等)を含有する 0.25 から 0.5 mL の間の酢酸エチルを用いて抽出した。培養物と酢酸エチルの混合物を、ボルテックスミキサー上で高速で 10 分間、混合した。次いで、サンプルをエッペンドルフ遠心機において 13,000 rpm で 5 分間遠心した (ローター FA-45-24-11 を備える遠心機 5424、Eppendorf、Westbury、NY)。有機層(上層)を、以下に記載される GC/MS または GC/FID 検出法を用いる解析のために取り除いた。
検出方法 1: 20 分 GC/MS
GC/MS 検出について、以下のプロトコールを用いて炭化水素および脂肪族ケトンを観察し、検証した:
実行時間: 20 分
カラム: HP-5-MS (5% ジフェニルシロキサン、95% ジメチルシロキサン) 部品番号 19091S-433E、長さ: (メートル) 30、内径: (mm) 0.25 ナローボア(narrowbore)、フィルム: (μM) 0.25
MSD スキャン範囲: 50 - 800 M/Z
注入: 1μL Agilent 6850 注入口
注入口: 300℃ スプリットレス
キャリアガス: ヘリウム
オーブン温度: 5 分保持 100℃; 25℃/分で 320℃まで; 5 分保持 320℃
検出: Agilent 5975B VL MSD
検出温度: 300℃
GC/MS 検出について、以下のプロトコールを用いて炭化水素および脂肪族ケトンを検出し、検証した:
実行時間: 4.9 分
カラム: HP-5-MS (5% ジフェニルシロキサン、95% ジメチルシロキサン) 部品番号 19091S-433E、長さ: (メートル) 30、内径: (mm) 0.25 ナローボア(narrowbore)、フィルム: (μM) 0.25
MSD スキャン範囲: 50 - 140 M/Z
注入: 1μL Agilent 6850 注入口
注入口: 300℃ スプリットレス
キャリアガス: ヘリウム
オーブン温度: 225℃で保持なし; 25℃/分で 320℃まで; 1.1 分保持 320℃
検出: Agilent 5975B VL MSD
検出温度: 300℃
GC/FID 検出について、以下のプロトコールを用いて炭化水素および脂肪族ケトンを検出し、検証した:
実行時間: 興味の対象である炭化水素の長さに応じて 2.75 から 4 分。より長い炭化水素にはより長い時間を用いる。
カラム: Thermo Electron Corporation: (部品番号 UFMC 002 000 000 00): Ph5、フィルム厚 0.4 mm、
長さ: (メートル) 5、
内径: 0.1 mm、
注入するサンプル容積: 実験に応じて 1 から 10 μl
注入口: スプリットレス
キャリアガス: ヘリウム
オーブン温度: 1 分保持 100℃; 200℃/分で 350℃まで; 0.50 分保持 350℃
検出: Thermo FID detector
GC/MS 検出について、以下のプロトコールを用いて炭化水素および脂肪族ケトンを観察し、検証した:
実行時間: 5.83 分
カラム: DB-1HT (100% ジメチルポリシロキサン) 部品番号 122-1111 (Agilent Technologies、Inc)、長さ: (メートル) 15、内径: (mm) 0.25 ナローボア(narrowbore)、フィルム: (μM) 0.1
MSD スキャン範囲: 50 - 550 m/z
注入: 1μL Agilent 6890 N 注入口
注入口: 300℃ スプリットレス
キャリアガス: ヘリウム (流速: 1.3 mL/分)
オーブン温度: 160℃で 0.3 分保持; 30℃/分で 320℃まで; 0.2 分保持 320℃
検出: Agilent 5975B XL EI/CI MSD
検出温度: 250℃
以下の4つの遺伝子を様々な順序で含有する複数のプラスミドを構築した: oleA、oleB、oleC および oleD。これらのオペロンからの遺伝子を発現する菌株を用いて試験したすべての発酵が、オレフィンを産生した。合成オペロン中の遺伝子の順序は、生物の炭化水素を生産する能力に影響を与えなかった。これらのプラスミドの多くは、以下に記載される実施例において互換的に用いることができる。各々の実施例において用いた実際のプラスミドを、関連の(pertinent)実施例において記載する。
Uc FatB1、Cc FatB1、Ch FatB2 および‘tesA を含む様々なチオエステラーゼについてのコード領域を含有する複数のプラスミドを構築した。E. coli‘tesA の遺伝子配列を、E. coli MG1655 のゲノム DNA からの PCR 増幅によって得た。Umbellularia californica の FatB1 (Uc FatB1)、Cinnamomum camphora の FatB1 (Cc FatB1) および Cuphea hookeriana の FatB2 (Ch FatB2) についての遺伝子配列を、契約に基づく(Codon Devices、Cambridge、MA 02139)合成の遺伝子の設計および生産によって得た。簡潔には、プライマー TesA_F (配列番号50) および TesA_R (配列番号51)を用いて‘tesA (配列番号25) を増幅した。合成の遺伝子を、PCR 増幅ならびに標準的な消化およびライゲーションのプロトコールによって発現プラスミドへ再クローニングした。Cc FatB1 (配列番号26) を、プライマー CcFatB_F (配列番号52) および CcFatB_R (配列番号53) を用いて増幅した。Ch FatB2 (配列番号27) を、プライマー ChFatB2_F (配列番号54) および ChFatB2_R (配列番号55) を用いて増幅した。Uc FatB1 (配列番号28) を、プライマー UcFatB1_F (配列番号56) および UcFatB1_R (配列番号57) を用いて増幅した。‘tesA (配列番号25) および Cc FatB1 (配列番号26) の増幅産物を、制限酵素 NdeI および AvrII を用いて pETDuet-1 へクローニングした。Ch FatB2 (配列番号27) および Uc FatB1 (配列番号28) の増幅産物を、制限酵素 XbaI および HindIII を用いて、malE 遺伝子とインフレームの状態で pMAL-c2X (NEB、Ipswich、MA) へクローニングした。
2つの別個のベクター、pETDuet-1 および pACYCpTrc を含む多数の異なるコンストラクトから、および E. coli 宿主菌株へ直接組み込まれた構成的プロモーターから、fadD 遺伝子を発現させた。これらのコンストラクトを、以下に記載する。
Cre lox 抗菌性耐性マーカーの除去がその後に続く相同組換え(アレル交換)を用いて、fadD 遺伝子の上流の 5’フランキング領域(配列番号495)を T5 プロモーター配列(配列番号496)を含有する合成の DNA 配列と置換することによって、FadD を構成的に発現させた(詳細なプロトコールについては、例えば Valle, Fernando and Noemi Flores, Overexpression of Chromosomal Genes in Escherichia coli. Vol. 267, Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols. Totowa: Humana Press, 2004 and Palmeros et al., Gene, 247: 255-64 (2000) を参照されたい)。簡潔には、プライマー LB284 (配列番号83) および LB285 (配列番号84) を、loxPcat カセットを pLoxCat2 (配列番号89; Genebank 受入# AJ401047) から PCR 増幅するために用いた。次いで、増幅産物を、プラスミド pKD46 を含有する MG1655 ΔfadE (Genebank 受入 # AY048746) へ形質転換した。loxPcat カセットの組み込みについての選抜後、菌株から pKD46 をキュアリングし、その後、プラスミド pJW168 (Palmeros et al.、Gene、247: 255-64 (2000)) を用いてクロラムフェニコール耐性を除去した。T5 プロモーターによる fadD プロモーターの置換を確認した後、菌株から pJW168 をキュアリングした。得られた菌株は、E. coli MG1655 Δ,fadE、fadD(+) である。
本実施例は、細菌における OleA、OleC および OleD の発現がオレフィンの生産をもたらすことを実証する。
本実施例は、細菌における oleA の発現が脂肪族ケトンの生産をもたらしたことを実証する。
本実施例は、oleA (配列番号2) を発現する E. coli の細胞からのライセートをアシル-CoA 基質と混合するインビトロアッセイを用いて、脂肪族ケトンの生産を観察できることを実証する。
本実施例は、pH 7.0 の 0.1 M リン酸バッファー中において精製された酵素(例えば OleA タンパク質)を精製された基質(例えばアシル補酵素A、アシル-ACP 等)と混合するインビトロアッセイを用いて、脂肪族ケトンを観察できることを実証する。
本実施例は、本明細書に記載される S. maltophilia の核酸配列およびアミノ酸配列を用いる、さらなる oleA、oleC および oleD の核酸配列およびアミノ酸配列の同定を記載する。
本実施例は、公的に利用可能なデータベースにおいてさらなる OleA、OleB、OleC および OleD タンパク質配列を同定するために、アミノ酸モチーフを用い得ることを実証する。
本実施例は、脂肪酸生合成経路が変更された細胞における OleA の発現が、脂肪族ケトンの生産の増強をもたらすことを実証する。
(1) 野生型 E. coli C41(DE3);
(2) アシル-CoA デヒドロゲナーゼ fadE の完全な欠失を有する E. coli C41(DE3) ΔfadE;
(3) IPTG で誘導をかけると fadD を発現するプラスミドを有する E. coli C41(DE3);
(4) IPTG で誘導をかけると fadD を発現するプラスミドを有する E. coli C41(DE3) ΔfadE;
(5) IPTG で誘導をかけると tesA チオエステラーゼ A 遺伝子の切断されたバージョンである‘tesA を発現するプラスミドを有する E. coli C41(DE3);
(6) IPTG で誘導をかけると tesA チオエステラーゼ A 遺伝子の切断されたバージョンである‘tesA を発現するプラスミドを有する E. coli C41(DE3) ΔfadE;
(7) 個別のプラスミド上に含有された、IPTG で誘導をかけると発現する‘tesA および fadD の両方を有する E. coli C41(DE3); および
(8) 個別のプラスミド上に含有された、IPTG で誘導をかけると発現する‘tesA および fadD の両方を有する E. coli C41(DE3) ΔfadE。
本実施例は、脂肪酸生合成経路が変更された細胞における oleA、oleC および oleD の発現が、オレフィンの生産の増強をもたらすことを実証する。
本実施例は、OleA および OleD を含有するインビトロアッセイにおいて、アルデヒド、脂肪族ケトンおよびオレフィンが観察されることを実証する。
本実施例は、精製された OleB タンパク質がインビトロアッセイ中に添加されると、アシル補酵素A 基質、OleA および OleD を含むインビトロアッセイにおいて観察されるアルデヒドおよびオレフィンの量が有意に増強されることを実証する。
本実施例は、オレフィンシンターゼ遺伝子 (oleA、oleB、oleC および oleD) と併せてアシル-CoA シンターゼ遺伝子を発現する細菌によって、脂肪酸をオレフィンへ変換し得ることを実証する。
宿主 1: オレフィンシンターゼ オペロン pCL1920pTrcOleABpTrcOleCD (配列番号78) およびアシル-CoA シンターゼ FadD 過剰発現プラスミド pACYCpTrcFadD で形質転換された E. coli MG1655 ΔfadE。
宿主 2: オレフィンシンターゼ オペロン pCL1920pTrcOleABpTrcOleCD (配列番号78) およびアシル-CoA シンターゼ FadD 過剰発現プラスミド pETDuetFadD で形質転換された E. coli C41 (DE3) ΔfadE。
本実施例は、アシル縮合化(acyl-condensing)酵素 OleA と組み合わせてアシル-CoA シンターゼ遺伝子を発現する細菌によって、脂肪酸を脂肪族ケトンへ変換し得ることを実証する。
本実施例は、細菌において生産され得るオレフィンの型を制御する方法を示す。
本実施例は、Saccharomyces cerevisiae における oleA の機能的発現がインビトロでの脂肪族ケトンの生産をもたらすことを実証する。
本実施例は、精製された OleA、OleD を含有する細胞ライセートおよび重水素化された NADPH を含有するインビトロアッセイにおいて、重水素化されたアルデヒドおよびオレフィンが観察されることを実証する。
本実施例は、インビトロで脂肪族オレフィンを合成できることを実証する。
pETDuet_OleAB および pCOLADuet_OleCD で形質転換された E. coli C41(DE3) を、4つの Ole タンパク質 (OleA、OleB、OleC および OleD) を含有する細菌ライセートを作成するために用いた。
ミリストイル-ACP を、いくつかの改変を伴って Rock et al., Methods Enzymol., 72: 397-403 (1981) に記載される通りに合成した。簡潔には、1-4 mL の最終容量中に 5 mM ATP、2 mM DTT、2% Triton X-100、10 mM LiCl、160 μM ミリスチン酸ナトリウム塩、65 μM ACP-SH、10 mM MgCl2、pH 8.0 の 0.1 M トリス-HCl および 1.5 - 3 μg/mL アシル-ACP シンターゼを含有する反応混合物を、37℃で 3 時間インキュベートし、その後 30℃で終夜インキュベートした。用いたアシル-ACP シンターゼは、Invitrogen から購入した。反応混合物を3容量の水で希釈し、酢酸を用いて pH を 6.0 まで滴定した。溶液を HiTrap DEAE FF 5mL カラム (GE Healthcare) にアプライした。Triton X-100 の大部分を除去するため、カラムを、3カラム容量の pH 6.0 の 10 mM ビス-トリス-HCl で洗浄した。3カラム容量の 80% 2-プロパノールを用いてカラムを溶出することによって、残余の Triton X-100 および遊離の脂肪酸を除去した。3カラム容量の pH 6.0 の 10 mM ビス-トリス-HCl を用いて、2-プロパノールを除去した。10 mL の、pH 6.0 の 10 mM ビス-トリス-HCl 中における 0.6 M LiCl を用いて、ミリストイル-ACP および未反応の ACP-SH をカラムから溶出させた。ミリストイル-ACP を含有する溶出物を、pH 7.0 の 50 mM リン酸ナトリウムバッファーへとバッファー交換し、MWCO 3 kDa concentrators (Millipore) を用いて 1 mL まで濃縮した。ミリストイル-ACP の濃度を、Bradford アッセイ (BioRad) および NuPAGE 12% ビス-トリス SDS-PAGE ゲル上でのデンシトメトリー解析 (Invitrogen) を用いて、2段階で決定した: 最初に、C14-ACP/ACP-SH 画分の全タンパク質濃度を Bradford アッセイ (BioRad proten assay) によって決定した; 第二に、C14-ACP 濃度を、その後にデンシトメトリー解析が続く SDS-PAGE に基づいて、全タンパク質濃度のパーセントとして算出した。C14-ACP は、pH 7.0 の 50mM Na-リン酸バッファー中において -20℃で保管され、3 ヶ月間まで安定であった。
上記の通り、OleA、OleB、OleC および OleD タンパク質を含有する細胞ライセートを作成するために、pETDuetOleAOleB および pCOLADuetOleCOleD で形質転換された E. coli C41(DE3) を用いた。インビトロアッセイ反応は、1 mL の総容量中に 0.1 mM ミリストイル補酵素A もしくは 0.1 mM ミリストイル-ACP、10 mM MgCl2、pETDuetOleAOleB および pCOLADuetOleCOleD で形質転換された E. coli C41(DE3) からの 360 μL の細胞ライセート、1 mM NADPH (Sigma、MO)、1 mM ATP (Sigma、MO)、1 mM HSCoA (Sigma、MO) および 100 mM リン酸バッファー (pH 7.0) を含有した。用いたミリストイル補酵素A は、Sigma (M4414、St Louis MO) から入手し、pH 7.0 の 0.1 M リン酸バッファー中における 10 mM ストック溶液として調製した。サンプルを、37℃で 1 時間インキュベートした。反応を、1% 酢酸/0.1% ギ酸を含有する 5 mL の酢酸エチルを用いてクエンチした。混合物をボルテックスによって混合し、その後遠心した。4 mL の上層(酢酸エチル層)を清潔なガラス管へ移し、遠心機(Vacufuge 5301、Eppendorf、Westbury、NY)中において減圧下で乾燥させた。サンプルを、40 μL の酢酸エチルおよび 10 μL の、対照スパイクとして機能する (酢酸エチル中で調製された) 0.1 mg/mL のヘキサコサン溶液中に再懸濁し、GC/MS によって解析した。1 μL を、特定の炭化水素について解析した。
本実施例は、OleA、OleB、OleC および OleD タンパク質配列を、自然に炭化水素を生産する生物を同定するために用い得ることを実証する。
本実施例は、生物に基づく(biologically based)オレフィンは石油に基づくオレフィンとは区別できることを実証する。特に、本実施例は、生物、例えば oleA、oleB、oleC および oleD 遺伝子を発現する E. coli によって生産されるオレフィンを、石油に基づくオレフィンから区別し得ることを実証する。
δ13C (‰) = [(13C/12C)サンプル- (13C/12C)標準]/ (13C/12C)標準 × 1000。
Claims (172)
- 配列番号64-74および91-133からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む1500以下のアミノ酸残基のポリペプチドをコードする単離核酸。
- 核酸が第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドをコードし、第一および第二のポリペプチドのそれぞれが1500 アミノ酸残基以下であり、第一および第二のポリペプチドのそれぞれが配列番号64-74および91-133からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項 1の単離核酸。
- 核酸が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、および第三のポリペプチドをコードし、第一、第二、および第三のポリペプチドのそれぞれが1500 アミノ酸残基以下であり、第一、第二、および第三のポリペプチドのそれぞれが配列番号64-74および91-133からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項 1の単離核酸。
- 核酸が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、および第四のポリペプチドをコードし、第一、第二、第三、および第四のポリペプチドのそれぞれが1500 アミノ酸残基以下であり、第一、第二、第三、および第四のポリペプチドのそれぞれが配列番号64-74および91-133からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項 1の単離核酸。
- 以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離核酸:
(a)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88;
(b)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88のホモログ;
(c)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88の保存的変異体であって、以下からなる群から選択される1以上の保存的アミノ酸置換を含むもの:AlaからCys、Gly、またはSer; ArgからIle、Lys、Met、またはOrn; AsnからAsp、Gln、Glu、またはHis; AspからAsn、Gln、またはGlu; CysからMet、Ser、またはThr; GlnからAsn、Asp、またはGlu; GluからAsn、Asp、またはGln; GlyからAcp、Ala、またはPro; HisからAsnまたはGln; IleからLeu、Met、またはVal; LeuからIle、Met、またはVal; LysからArg、Gln、Glu、Ile、Met、またはOrn; MetからCys、Ile、Leu、またはVal; PheからHis、L-Dopa、Leu、Met、Thr、Trp、Tyr、3-フェニルプロリン、4-フェニルプロリン、または5-フェニルプロリン; ProからL-1-チアゾリジン-4-カルボン酸 またはD-またはL-1-オキサゾリジン-4-カルボン酸; SerからCys、Met、またはThr; ThrからMet、Ser、またはVal; TrpからTyr; TyrからL-Dopa、His、またはPhe;およびValからIle、Leu、またはMet;および、
(d)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88に対して少なくとも約 35%の配列同一性を有する配列。 - 核酸が配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸。
- 核酸が配列番号2、配列番号4、配列番号12、および配列番号18からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸。
- 核酸が配列番号10を含むポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸。
- 核酸が配列番号6、配列番号14、配列番号20、および配列番号88からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸。
- 核酸が配列番号8、配列番号16、および配列番号22からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸。
- 核酸が配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88のホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸。
- 核酸が配列番号2、配列番号4、配列番号12、および配列番号18のホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸。
- 核酸が配列番号10のホモログを含むポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸。
- 核酸が配列番号6、配列番号14、配列番号20、および配列番号88のホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸。
- 核酸が配列番号8、配列番号16、および配列番号22のホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸。
- 核酸が、以下からなる群から選択される1以上の保存的アミノ酸置換を含む、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88の保存的変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸:AlaからCys、Gly、またはSer; ArgからIle、Lys、Met、またはOrn; AsnからAsp、Gln、Glu、またはHis; AspからAsn、Gln、またはGlu; CysからMet、Ser、またはThr; GlnからAsn、Asp、またはGlu; GluからAsn、Asp、またはGln; GlyからAcp、Ala、またはPro; HisからAsnまたはGln; IleからLeu、Met、またはVal; LeuからIle、Met、またはVal; LysからArg、Gln、Glu、Ile、Met、またはOrn; MetからCys、Ile、Leu、またはVal; PheからHis、L-Dopa、Leu、Met、Thr、Trp、Tyr、3-フェニルプロリン、4-フェニルプロリン、または5-フェニルプロリン; ProからL-1-チアゾリジン-4-カルボン酸 またはD-またはL-1-オキサゾリジン-4-カルボン酸; SerからCys、Met、またはThr; ThrからMet、Ser、またはVal; TrpからTyr; TyrからL-Dopa、His、またはPhe; およびValからIle、Leu、またはMet。
- 核酸が、以下からなる群から選択される1以上の保存的アミノ酸置換を含む配列番号2、配列番号4、配列番号12、および配列番号18の保存的変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸:AlaからCys、Gly、またはSer; ArgからIle、Lys、Met、またはOrn; AsnからAsp、Gln、Glu、またはHis; AspからAsn、Gln、またはGlu; CysからMet、Ser、またはThr; GlnからAsn、Asp、またはGlu; GluからAsn、Asp、またはGln; GlyからAcp、Ala、またはPro; HisからAsnまたはGln; IleからLeu、Met、またはVal; LeuからIle、Met、またはVal; LysからArg、Gln、Glu、Ile、Met、またはOrn; MetからCys、Ile、Leu、またはVal; PheからHis、L-Dopa、Leu、Met、Thr、Trp、Tyr、3-フェニルプロリン、4-フェニルプロリン、または5-フェニルプロリン; ProからL-1-チアゾリジン-4-カルボン酸 またはD-またはL-1-オキサゾリジン-4-カルボン酸; SerからCys、Met、またはThr; ThrからMet、Ser、またはVal; TrpからTyr; TyrからL-Dopa、His、またはPhe; および ValからIle、Leu、またはMet。
- 核酸が、以下からなる群から選択される1以上の保存的アミノ酸置換を含む配列番号10の保存的変異体を含むポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸:AlaからCys、Gly、またはSer; ArgからIle、Lys、Met、またはOrn; AsnからAsp、Gln、Glu、またはHis; AspからAsn、Gln、またはGlu; CysからMet、Ser、またはThr; GlnからAsn、Asp、またはGlu; GluからAsn、Asp、またはGln; GlyからAcp、Ala、またはPro; HisからAsnまたはGln; IleからLeu、Met、またはVal; LeuからIle、Met、またはVal; LysからArg、Gln、Glu、Ile、Met、またはOrn; MetからCys、Ile、Leu、またはVal; PheからHis、L-Dopa、Leu、Met、Thr、Trp、Tyr、3-フェニルプロリン、4-フェニルプロリン、または5-フェニルプロリン; ProからL-1-チアゾリジン-4-カルボン酸 またはD-またはL-1-オキサゾリジン-4-カルボン酸; SerからCys、Met、またはThr; ThrからMet、Ser、またはVal; TrpからTyr; TyrからL-Dopa、His、またはPhe; およびValからIle、Leu、またはMet。
- 核酸が、以下からなる群から選択される1以上の保存的アミノ酸置換を含む配列番号6、配列番号14、配列番号20、および配列番号88の保存的変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸:AlaからCys、Gly、またはSer; ArgからIle、Lys、Met、またはOrn; AsnからAsp、Gln、Glu、またはHis; AspからAsn、Gln、またはGlu; CysからMet、Ser、またはThr; GlnからAsn、Asp、またはGlu; GluからAsn、Asp、またはGln; GlyからAcp、Ala、またはPro; HisからAsnまたはGln; IleからLeu、Met、またはVal; LeuからIle、Met、またはVal; LysからArg、Gln、Glu、Ile、Met、またはOrn; MetからCys、Ile、Leu、またはVal; PheからHis、L-Dopa、Leu、Met、Thr、Trp、Tyr、3-フェニルプロリン、4-フェニルプロリン、または5-フェニルプロリン; ProからL-1-チアゾリジン-4-カルボン酸 またはD-またはL-1-オキサゾリジン-4-カルボン酸; SerからCys、Met、またはThr; ThrからMet、Ser、またはVal; TrpからTyr; TyrからL-Dopa、His、またはPhe; およびValからIle、Leu、またはMet。
- 核酸が、以下からなる群から選択される1以上の保存的アミノ酸置換を含む配列番号8、配列番号16、および配列番号22の保存的変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸:AlaからCys、Gly、またはSer; ArgからIle、Lys、Met、またはOrn; AsnからAsp、Gln、Glu、またはHis; AspからAsn、Gln、またはGlu; CysからMet、Ser、またはThr; GlnからAsn、Asp、またはGlu; GluからAsn、Asp、またはGln; GlyからAcp、Ala、またはPro; HisからAsnまたはGln; IleからLeu、Met、またはVal; LeuからIle、Met、またはVal; LysからArg、Gln、Glu、Ile、Met、またはOrn; MetからCys、Ile、Leu、またはVal; PheからHis、L-Dopa、Leu、Met、Thr、Trp、Tyr、3-フェニルプロリン、4-フェニルプロリン、または5-フェニルプロリン; ProからL-1-チアゾリジン-4-カルボン酸 またはD-またはL-1-オキサゾリジン-4-カルボン酸; SerからCys、Met、またはThr; ThrからMet、Ser、またはVal; TrpからTyr; TyrからL-Dopa、His、またはPhe; およびValからIle、Leu、またはMet。
- 核酸が、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88に対して少なくとも約 35%の配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸。
- 核酸が、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88に対して少なくとも 50%の配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸。
- 核酸が、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88に対して少なくとも 80%の配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸。
- 核酸が第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸であって、第一および第二のポリペプチドのそれぞれが以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離核酸:
(a)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88;
(b)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88のホモログ;
(c)以下からなる群から選択される1以上の保存的アミノ酸置換を含む配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88の保存的変異体:AlaからCys、Gly、またはSer; ArgからIle、Lys、Met、またはOrn; AsnからAsp、Gln、Glu、またはHis; AspからAsn、Gln、またはGlu; CysからMet、Ser、またはThr; GlnからAsn、Asp、またはGlu; GluからAsn、Asp、またはGln; GlyからAcp、Ala、またはPro; HisからAsnまたはGln; IleからLeu、Met、またはVal; LeuからIle、Met、またはVal; LysからArg、Gln、Glu、Ile、Met、またはOrn; MetからCys、Ile、Leu、またはVal; PheからHis、L-Dopa、Leu、Met、Thr、Trp、Tyr、3-フェニルプロリン、4-フェニルプロリン、または5-フェニルプロリン; ProからL-1-チアゾリジン-4-カルボン酸 またはD-またはL-1-オキサゾリジン-4-カルボン酸; SerからCys、Met、またはThr; ThrからMet、Ser、またはVal; TrpからTyr; TyrからL-Dopa、His、またはPhe; およびValからIle、Leu、またはMet;および、
(d)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88に対して少なくとも約 35%の配列同一性を有する配列。 - 核酸が、第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、および第三のポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸であって、第一、第二、および第三のポリペプチドのそれぞれが以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離核酸:
(a)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88;
(b)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88のホモログ;
(c)以下からなる群から選択される1以上の保存的アミノ酸置換を含む配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88 の保存的変異体:AlaからCys、Gly、またはSer; ArgからIle、Lys、Met、またはOrn; AsnからAsp、Gln、Glu、またはHis; AspからAsn、Gln、またはGlu; CysからMet、Ser、またはThr; GlnからAsn、Asp、またはGlu; GluからAsn、Asp、またはGln; GlyからAcp、Ala、またはPro; HisからAsnまたはGln; IleからLeu、Met、またはVal; LeuからIle、Met、またはVal; LysからArg、Gln、Glu、Ile、Met、またはOrn; MetからCys、Ile、Leu、またはVal; PheからHis、L-Dopa、Leu、Met、Thr、Trp、Tyr、3-フェニルプロリン、4-フェニルプロリン、または5-フェニルプロリン; ProからL-1-チアゾリジン-4-カルボン酸 またはD-またはL-1-オキサゾリジン-4-カルボン酸; SerからCys、Met、またはThr; ThrからMet、Ser、またはVal; TrpからTyr; TyrからL-Dopa、His、またはPhe;およびValからIle、Leu、またはMet;および、
(d)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88に対して少なくとも約 35%の配列同一性を有する配列。 - 核酸が、第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、および第四のポリペプチドをコードする請求項 5の単離核酸であって、第一、第二、第三、および第四のポリペプチドのそれぞれが以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離核酸:
(a)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88;
(b)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88のホモログ;
(c)以下からなる群から選択される1以上の保存的アミノ酸置換を含む配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88の保存的変異体:AlaからCys、Gly、またはSer; ArgからIle、Lys、Met、またはOrn; AsnからAsp、Gln、Glu、またはHis; AspからAsn、Gln、またはGlu; CysからMet、Ser、またはThr; GlnからAsn、Asp、またはGlu; GluからAsn、Asp、またはGln; GlyからAcp、Ala、またはPro; HisからAsnまたはGln; IleからLeu、Met、またはVal; LeuからIle、Met、またはVal; LysからArg、Gln、Glu、Ile、Met、またはOrn; MetからCys、Ile、Leu、またはVal; PheからHis、L-Dopa、Leu、Met、Thr、Trp、Tyr、3-フェニルプロリン、4-フェニルプロリン、または5-フェニルプロリン; ProからL-1-チアゾリジン-4-カルボン酸 またはD-またはL-1-オキサゾリジン-4-カルボン酸; SerからCys、Met、またはThr; ThrからMet、Ser、またはVal; TrpからTyr; TyrからL-Dopa、His、またはPhe;およびValからIle、Leu、またはMet;および、
(d)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、および配列番号88に対して少なくとも約 35%の配列同一性を有する配列。 - ポリペプチドが1000以下のアミノ酸残基を有する請求項1-26のいずれかの単離核酸。
- ポリペプチドが800以下のアミノ酸残基を有する請求項1-27のいずれかの単離核酸。
- ポリペプチドが600以下のアミノ酸残基を有する請求項1-28のいずれかの単離核酸。
- ポリペプチドが少なくとも約 100 アミノ酸残基を有する請求項1-29のいずれかの単離核酸。
- ポリペプチドが少なくとも約 200 アミノ酸残基を有する請求項 30の単離核酸。
- ポリペプチドが少なくとも約 250 アミノ酸残基を有する請求項 31の単離核酸。
- 核酸が、細菌、植物、昆虫、酵母、真菌、藻類、または動物から単離されたものである請求項1-32のいずれかの単離核酸。
- 核酸が細菌から単離されたものである請求項1-33のいずれかの単離核酸。
- 細菌が以下からなる群から選択される属のものである請求項1-34のいずれかの単離核酸:アナエロミクソバクター、アルスロバクター、ブデロビブリオ、ブラストピレルラ、ブレビバクテリウム、ブルクホルデリア、カンジダツス、クロロフレクサス、クラビバクター、クロストリジウム、コルウェリア、コングレギバクター、デスルファチバチラム、デスルホコッカス、デスルホタレア、デスルフロモナス、フラボバクテリウム(Flavobacteriales)、ゲマータ、ゲオバクター、ハヘラ、ジャナスキア、キネオコッカス、レンチスファエラ、マリカウリス、マリノバクター、ミクロコッカス、ミクロシラ、モリテーラ、マイコバクテリウム、ナイセリア、ノカルジア、オピタタシエ(Opitutaceae)、オピタタス(Opitutus)、パエニバチルス、ペロバクター、フォトバクテリウム、フォトラブダス、プランクトマイセス、プレシオシスチス、シュードアルテロモナス、サイクロモナス、ラルストニア、ロドコッカス、ロドピレルーラ、ロゼオバリウス、シュワネラ、ステノトロホモナス、ストレプトマイセス、ザントモナス、およびキシレラ。
- 細菌が以下からなる群から選択される請求項1-35のいずれかの単離核酸:アナエロミクソバクター・エスピー・Fw109-5、アルスロバクター・アウレッセンス、アルスロバクター・クロロフェノリカス、アルスロバクター・エスピー・FB24、ブデロビブリオ・バクテリオボルス、ブラストピレルラ・マリナ、ブレビバクテリウム・リネンス、ブルクホルデリア・アムビファリア、ブルクホルデリア・セノセパシア、ブルクホルデリア・オクラホメンシス、ブルクホルデリア・シュードマレイ、ブルクホルデリア・エスピー・383、カンジダツス・クエネニア・スツッツガルティエンシス、クロロフレクス・アグレガンス、クロロフレクス・アウランティアカス、クラビバクター・ミシガンエンシス亜種ミシガンエンシス、クラビバクター・ミシガンエンシス亜種セペドニカス、クロストリジウム・ボツリヌム A、クロストリジウム・ボツリヌム A3、クロストリジウム・ボツリヌム B1、クロストリジウム・ボツリヌム Bf、クロストリジウム・ボツリヌム F、クロストリジウム・ボツリヌム、コルウェリア・サイクレリスラエ、コングレギバクター・リトラリス、デスルファチバチラム・アルケニボランス、デスルホコッカス・オレオボランス、デスルホタレア・サイクロフィラ、デスルフロモナス・アセトキシダンス、フラボバクテリウム細菌、ゲマータ・オブスキュリグロブス、ゲオバクター・ベミジェンシス、ゲオバクター・ラヴレイ、ゲオバクター・エスピー・FRC-32、ゲオバクター・ウラニウムレデュセンス、ハヘラ・チェジュエンシス、ジャナスキア・エスピー・CCS1、キネオコッカス・ラジオトレランス、レンチスファエラ・アラネオーサ、マリカウリス・マリス、マリノバクター・アルギコーラ、マリノバクター・アクアエオレイ、ミクロコッカス・ルテウス、ミクロシラ・マリナ、モリテーラ・エスピー・PE36、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス、マイコバクテリウム・マリヌム、マイコバクテリウム・エスピー・GP1、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バンバアレニイ、ナイセリア・ゴノレア、ノカルジア・ファルシニカ、オピタタシエ 細菌、オピタタス・テラエ、パエニバチルス・エスピー・JDR-2、ペロバクター・プロピオニカス、フォトバクテリウム・プロファンダム、フォトバクテリウム・プロファンダム、フォトラブダス・ルミネッセンス亜種ラウモンディイ、プランクトマイセス・マリス、プレシオシスチス・パシフィカ、シュードアルテロモナス・アトランティカ、サイクロモナス・イングラハミィイ、サイクロモナス・エスピー・CNPT3、ラルストニア・ピッケティ、ロドコッカス・ロドクロウス、ロドコッカス・エスピー、ロドピレルーラ・バルティカ 、ロゼオバリウス・ヌビンヒベンス、シュワネラ・アマゾネンシス、シュワネラ・バルティカ、シュワネラ・ベンティカ、シュワネラ・デニトリフィカンス、シュワネラ・フリギディマリナ、シュワネラ・ハリファクセンシス、シュワネラ・ロイヒカ、シュワネラ・オネイデンシス、シュワネラ・ペアレアナ、シュワネラ・プトレファシエンス、シュワネラ・セディミニス、シュワネラ・エスピー・ANA-3、シュワネラ・エスピー・MR-4、シュワネラ・エスピー・MR-7、シュワネラ・エスピー・W3-18-1、シュワネラ・ウーディイ、ステノトロホモナス・マルトフィリア、ストレプトマイセス・アムボファシエンス、ザントモナス・アクソノポディス、ザントモナス・カンペストリス、ザントモナス・オリゼ、およびキシレラ・ファスティディオーサ。
- 核酸が配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、および配列番号87からなる群から選択される請求項 5の単離核酸。
- ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む請求項1-37のいずれかの単離核酸。
- プロモーターが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または細胞特異的プロモーターである請求項 38の単離核酸。
- プロモーターが、T7 プロモーター、PxylA プロモーター、Pgrac プロモーター、GAL1 プロモーター、GAL10 プロモーター、またはpTrc プロモーターである請求項 39の単離核酸。
- 以下からなる群から選択される少なくともひとつのさらなる核酸配列をさらに含む請求項1-40のいずれかの単離核酸:
(a)ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合した制御配列;
(b)ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合した選択マーカー;
(c)ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合した精製部分;
(d)ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合した分泌配列;および、
(e)ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合したターゲティング配列。 - ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合した選択マーカーをさらに含む請求項1-40のいずれかの単離核酸であって、選択マーカーが、アンピシリン/カルベニシリン 耐性、カナマイシン 耐性、クロラムフェニコール 耐性、エリスロマイシン 耐性、ストレプトマイシン/スペクチノマイシン 耐性、またはヒスチジン栄養要求性 選択マーカー遺伝子である単離核酸。
- 請求項1-42のいずれかの単離核酸を含むベクター。
- ベクターがプラスミドである請求項 43のベクター。
- プラスミドが、pET21b(+)、pCOLADuet-1、pCDFDuet-1、pWH1520、pHT01、pESC-HIS、pET-21d(+)、pETDuet-1、pACYCDuet-1、pTrcHis2A、pMAL-c2X、またはpCL1920pTrcである請求項 43のベクター。
- 請求項1-42のいずれかの単離核酸または請求項43-45のいずれかのベクターを含む細胞。
- 請求項1-42のいずれかの単離核酸により形質転換された細胞。
- 請求項43-45のいずれかのベクターをトランスフェクトされた細胞。
- 細胞が、酵母細胞、真菌細胞、動物細胞、昆虫細胞、細菌細胞、藻類細胞、または植物細胞である請求項46-48のいずれかの細胞。
- 細胞が細菌細胞である請求項 49の細胞。
- 細胞が以下の属から選択される請求項 49の細胞:エシェリキア、バチルス、ラクトバチルス、ロドコッカス、シュードモナス、アスペルギルス、トリコデルマ、ニューロスポラ、フザリウム、フミコーラ、リゾムコール、クリベロマイセス、ピキア、ムコール、マイセリオフトラ、ペニシリウム、ファネロカエテ、プレウロツス、トラメテス、クリソスポリウム、サッカロマイセス、シゾサッカロマイセス、ステノトロファモナス、キネオコッカス、ヤロウイア、またはストレプトマイセス。
- 細胞が、バチルス・レンタス 細胞、バチルス・ブレビス 細胞、バチルス・ステアロサーモフィルス 細胞、バチルス・リケニフォルミス 細胞、バチルス・アルカロフィラス 細胞、バチルス・コアグランス 細胞、バチルス・サーキュランス 細胞、バチルス・プミリス 細胞、バチルス・チューリンゲンシス 細胞、バチルス・クラウシィ 細胞、バチルス・メガテリウム 細胞、バチルス・サブティリス 細胞、またはバチルス・アミロリケファシエンス 細胞である請求項 51の細胞。
- 細胞が、トリコデルマ・コニンギ 細胞、トリコデルマ・ビリデ 細胞、トリコデルマ・リーゼイ 細胞、トリコデルマ・ロンギブラチアタム 細胞、アスペルギルス・アワモリ 細胞、アスペルギルス・フミガーツス 細胞、アスペルギルス・フォエティダス 細胞、アスペルギルス・ニデュランス 細胞、アスペルギルス・ニガー 細胞、アスペルギルス・オリザエ 細胞、フミコーラ・インソレンス 細胞、フミコーラ・ラヌギノサ 細胞、リゾムコール・ミーヘイ 細胞、またはムコール・ミーヘイ 細胞である請求項 51の細胞。
- 細胞がストレプトマイセス・リビダンス 細胞またはストレプトマイセス・ミュリナス 細胞である請求項 51の細胞。
- 細胞が放線菌細胞である請求項 50の細胞。
- 細胞が大腸菌細胞である請求項 51の細胞。
- 大腸菌細胞が、菌株 B、菌株 C、菌株 K、または菌株 W 大腸菌細胞である請求項 56の細胞。
- 細胞が、ステノトロホモナス・マルトフィリア 細胞、キネオコッカス・ラジオトレランス 細胞、バチルス・メガテリウム 細胞、およびサッカロマイセス・セレビシエ 細胞からなる群から選択される請求項 49の細胞。
- 細胞が、アナエロミクソバクター・エスピー・Fw109-5、アルスロバクター・アウレッセンス、アルスロバクター・クロロフェノリカス、アルスロバクター・エスピー・FB24、ブデロビブリオ・バクテリオボルス、ブラストピレルラ・マリナ、ブレビバクテリウム・リネンス、ブルクホルデリア・アムビファリア、ブルクホルデリア・セノセパシア、ブルクホルデリア・オクラホメンシス、ブルクホルデリア・シュードマレイ、ブルクホルデリア・エスピー・383、カンジダツス・クエネニア・スツッツガルティエンシス、クロロフレクス・アグレガンス、クロロフレクス・アウランティアカス、クラビバクター・ミシガンエンシス亜種ミシガンエンシス、クラビバクター・ミシガンエンシス亜種セペドニカス、クロストリジウム・ボツリヌム A、クロストリジウム・ボツリヌム A3、クロストリジウム・ボツリヌム B1、クロストリジウム・ボツリヌム Bf、クロストリジウム・ボツリヌム F、クロストリジウム・ボツリヌム、コルウェリア・サイクレリスラエ、コングレギバクター・リトラリス、デスルファチバチラム・アルケニボランス、デスルホコッカス・オレオボランス、デスルホタレア・サイクロフィラ、デスルフロモナス・アセトキシダンス、フラボバクテリウム細菌、ゲマータ・オブスキュリグロブス、ゲオバクター・ベミジェンシス、ゲオバクター・ラヴレイ、ゲオバクター・エスピー・FRC-32、ゲオバクター・ウラニウムレデュセンス、ハヘラ・チェジュエンシス、ジャナスキア・エスピー・CCS1、キネオコッカス・ラジオトレランス、レンチスファエラ・アラネオーサ、マリカウリス・マリス、マリノバクター・アルギコーラ、マリノバクター・アクアエオレイ、ミクロコッカス・ルテウス、ミクロシラ・マリナ、モリテーラ・エスピー・PE36、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス、マイコバクテリウム・マリヌム、マイコバクテリウム・エスピー・GP1、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バンバアレニイ、ナイセリア・ゴノレア、ノカルジア・ファルシニカ、オピタタシエ 細菌、オピタタス・テラエ、パエニバチルス・エスピー・JDR-2、ペロバクター・プロピオニカス、フォトバクテリウム・プロファンダム、フォトバクテリウム・プロファンダム、フォトラブダス・ルミネッセンス亜種ラウモンディイ、プランクトマイセス・マリス、プレシオシスチス・パシフィカ、シュードアルテロモナス・アトランティカ、サイクロモナス・イングラハミィイ、サイクロモナス・エスピー・CNPT3、ラルストニア・ピッケティ、ロドコッカス・ロドクロウス、ロドコッカス・エスピー、ロドピレルーラ・バルティカ 、ロゼオバリウス・ヌビンヒベンス、シュワネラ・アマゾネンシス、シュワネラ・バルティカ、シュワネラ・ベンティカ、シュワネラ・デニトリフィカンス、シュワネラ・フリギディマリナ、シュワネラ・ハリファクセンシス、シュワネラ・ロイヒカ、シュワネラ・オネイデンシス、シュワネラ・ペアレアナ、シュワネラ・プトレファシエンス、シュワネラ・セディミニス、シュワネラ・エスピー・ANA-3、シュワネラ・エスピー・MR-4、シュワネラ・エスピー・MR-7、シュワネラ・エスピー・W3-18-1、シュワネラ・ウーディイ、ステノトロホモナス・マルトフィリア、ストレプトマイセス・アムボファシエンス、ザントモナス・アクソノポディス、ザントモナス・カンペストリス、ザントモナス・オリゼ、およびキシレラ・ファスティディオーサからなる群から選択される請求項 50の細胞。
- 細胞が、CHO 細胞、COS 細胞、VERO 細胞、BHK 細胞、HeLa 細胞、Cv1 細胞、MDCK 細胞、293 細胞、3T3 細胞、およびPC12 細胞からなる群から選択される請求項 49の細胞。
- 細胞が脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子において変化を含む請求項46-60のいずれかの細胞。
- 細胞がアシル-CoA デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子において欠失を含む請求項 61の細胞。
- 細胞がアシル-CoA デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子において突然変異を含む請求項 61の細胞。
- 細胞がチオエステラーゼをコードする遺伝子において欠失を含む請求項 61の細胞。
- 細胞がチオエステラーゼをコードする遺伝子において突然変異を含む請求項 61の細胞。
- 細胞がさらにアシル-CoA シンターゼを含む請求項46-65のいずれかの細胞。
- 細胞がさらにチオエステラーゼを含む請求項46-66のいずれかの細胞。
- 細胞が炭化水素を生産する請求項46-67のいずれかの細胞。
- 炭化水素がオレフィンである請求項 68の細胞。
- 炭化水素が細胞によって分泌される請求項 68の細胞。
- 細胞が脂肪族ケトンを生産する請求項46-67のいずれかの細胞。
- 請求項7、12、または17のいずれかの単離核酸を含む細胞。
- 細胞がサッカロマイセス・セレビシエ 細胞である請求項 72の細胞。
- 請求項46-70のいずれかの細胞を炭化水素を生産するのに十分な条件下で基質とともに培養することを含む、炭化水素を生産する方法。
- 基質が、炭素源、脂肪酸、アシル-CoA、アシル-AMP、アシル-ACP、α-アルキル-β-ケト酸、α-アルキル-β-ケトエステル、または脂肪族ケトンである請求項 74の方法。
- 細胞の生産性が少なくとも約 3 mg/L/OD600である請求項 74または75の方法。
- 細胞の生産性が少なくとも約 5 mg/L/OD600である請求項 74または75の方法。
- 細胞の生産性が少なくとも約 8 mg/L/OD600である請求項 74または75の方法。
- 細胞の生産性が少なくとも約 15 mg/L/OD600である請求項 74または75の方法。
- 細胞の生産性が少なくとも約 20 mg/L/OD600である請求項 74または75の方法。
- 細胞の生産性が少なくとも約 30 mg/L/OD600である請求項 74または75の方法。
- 炭化水素を単離することをさらに含む請求項74-81のいずれかの方法。
- 炭化水素が細胞から単離される請求項 82の方法。
- 炭化水素が細胞が培養された培地から単離される請求項 82の方法。
- 炭化水素をクラッキングまたは精練することをさらに含む請求項74-84のいずれかの方法。
- 炭化水素が約 10 〜約 40 炭素の炭素鎖長を有する請求項74-85のいずれかの方法。
- 炭化水素が約 17 〜約 34 炭素の炭素鎖長を有する請求項 86の方法。
- 炭化水素がモノ-不飽和またはポリ-不飽和である請求項74-87のいずれかの方法。
- 請求項46-67または71-73のいずれかの細胞を脂肪族ケトンを生産するのに十分な条件下で基質とともに培養することを含む脂肪族ケトンを生産する方法。
- 基質が、炭素源、脂肪酸、アシル-CoA、アシル-AMP、またはアシル-ACPである請求項 89の方法。
- 細胞の生産性が少なくとも約 0.1 mg/L/OD600である請求項 89または90の方法。
- 細胞の生産性が少なくとも約 1 mg/L/OD600である請求項 89または90の方法。
- 細胞の生産性が少なくとも約 3 mg/L/OD600である請求項 89または90の方法。
- 細胞の生産性が少なくとも約 6mg/L/OD600である請求項 89または90の方法。
- 細胞の生産性が少なくとも約 9 mg/L/OD600である請求項 89または90の方法。
- 細胞の生産性が少なくとも約 12 mg/L/OD600である請求項 89または90の方法。
- 脂肪族ケトンを単離することをさらに含む請求項89-96のいずれかの方法。
- 脂肪族ケトンが細胞から単離される請求項 97の方法。
- 脂肪族ケトンが細胞が培養された培地から単離される請求項 97の方法。
- 脂肪族ケトンが約 10 〜約 40 炭素の炭素鎖長を有する請求項89-99のいずれかの方法。
- 脂肪族ケトンが約 19 〜約 31 炭素の炭素鎖長を有する請求項 100の方法。
- 脂肪族ケトンが飽和、モノ-不飽和、またはポリ-不飽和である請求項89-101のいずれかの方法。
- 請求項46-73のいずれかの細胞を、単離核酸によってコードされるポリペプチドを生産するのに十分な条件下で培養することを含む、精製ポリペプチドを生産する方法。
- ポリペプチドが OleA、OleB、OleC、OleD、またはOleBCである請求項 103の方法。
- 脂肪族ケトンを生産するのに十分な条件下で基質をOleAとともにインキュベートすることを含む脂肪族ケトンを生産する方法。
- 基質がアシル-CoA、アシル-AMP、またはアシル-ACPを含む請求項 105の方法。
- 炭化水素を生産するのに十分な条件下で基質をOleA、OleB、OleC、OleBC、OleD、またはそれらの組合せとともにインキュベートすることを含む炭化水素を生産する方法。
- 炭化水素を生産するのに十分な条件下で基質をOleAおよびOleDとともにインキュベートすることを含む請求項 107の方法。
- 炭化水素を生産するのに十分な条件下で基質をOleA、OleC、およびOleDとともにインキュベートすることを含む請求項 107の方法。
- OleBをさらに含む請求項 108または109の方法。
- 基質がアシル-CoA、アシル-AMP、またはアシル-ACPを含む請求項107-110のいずれかの方法。
- 請求項74-102および105-110のいずれかの方法を含むバイオ燃料を生産する方法。
- バイオ燃料がガソリン、バイオディーゼル、またはジェット燃料である請求項 112の方法。
- 請求項74-88および107-110のいずれかの方法によって生産される炭化水素。
- 炭化水素が約 -28またはそれより大きいδ13Cを有する炭化水素。
- 炭化水素が約-27 〜約-24のδ13Cを有する請求項 115の炭化水素。
- 炭化水素が約-15 〜約-5またはそれより大きいδ13Cを有する請求項 115の炭化水素。
- 炭化水素が 約-30 〜約-15のδ13Cを有する請求項 117の炭化水素。
- 炭化水素が少なくとも約 50のpMCを有する炭化水素。
- 炭化水素が少なくとも約 80のpMCを有する請求項 119の炭化水素。
- 炭化水素が少なくとも約 90のpMCを有する請求項 119の炭化水素。
- オレフィンが少なくとも約 92のpMCを有する請求項 121の炭化水素。
- 炭化水素が 約 50 〜約 100のpMCを有する請求項 122の炭化水素。
- 炭化水素がオレフィンである請求項114-123のいずれかの炭化水素。
- オレフィンがモノ-不飽和である請求項 124の炭化水素。
- オレフィンがポリ-不飽和である請求項 124の炭化水素。
- オレフィンがジ-不飽和である請求項 124の炭化水素。
- オレフィンがトリ-不飽和である請求項 124の炭化水素。
- オレフィンが約 10 〜約 40 炭素の炭素鎖長を有する請求項124-128のいずれかの炭化水素。
- オレフィンが約 19 〜約 33 炭素の炭素鎖長を有する請求項 129の炭化水素。
- 炭化水素が直鎖炭化水素である請求項114-130のいずれかの炭化水素。
- 炭化水素が分枝鎖炭化水素である請求項114-130のいずれかの炭化水素。
- 炭化水素が環状部分を含む請求項114-130のいずれかの炭化水素。
- 請求項114-133のいずれかの炭化水素を含むバイオ燃料。
- バイオ燃料がガソリン、バイオディーゼル、またはジェット燃料である請求項 134のバイオ燃料。
- バイオ燃料が炭素源に由来する請求項 134または135のバイオ燃料。
- 炭素源が再生可能なエネルギー源である請求項 136のバイオ燃料。
- 再生可能なエネルギー源がバイオマスである請求項 137のバイオ燃料。
- 配列番号2、配列番号4、配列番号12、および配列番号18からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が1以上のアミノ酸置換、付加、挿入、または欠失を含む単離ポリペプチド。
- ポリペプチドがクライゼン縮合活性を有する請求項 139の単離ポリペプチド。
- ポリペプチドが2つのアシルチオエステルの縮合を触媒する請求項 140の単離ポリペプチド。
- 配列番号8、配列番号16、および配列番号22からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が1以上のアミノ酸置換、付加、挿入、または欠失を含む単離ポリペプチド。
- ポリペプチドがオキシドレダクターゼ活性を有する請求項 141の単離ポリペプチド。
- ポリペプチドがケトンの還元を触媒する請求項 142の単離ポリペプチド。
- 配列番号2、配列番号4、配列番号8、配列番号12、配列番号16、配列番号18、および配列番号22からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと同じ生物活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸。
- 単離核酸が; (i)配列番号1、配列番号3、配列番号7、配列番号11、配列番号15、配列番号17、および配列番号21またはそれらの断片からなる群から選択される核酸配列;または(ii)配列番号1、配列番号3、配列番号7、配列番号11、配列番号15、配列番号17、および配列番号21からなる群から選択される核酸配列の相補鎖またはそれらの断片にハイブリダイズする核酸配列を含む請求項 144の単離核酸。
- 生物活性がクライゼン縮合活性である請求項 144または145の単離核酸。
- 生物活性が2つのアシルチオエステルの縮合である請求項 144または145の単離核酸。
- 生物活性がオキシドレダクターゼ活性である請求項 144または145の単離核酸。
- 生物活性がケトンの還元である請求項 144または145の単離核酸。
- (a)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、および配列番号87からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも約 35%の配列同一性を有し、かつ、(b)ポリペプチドをコードするゲノム核酸配列の上流に生物のゲノムに安定に取り込まれた外来性核酸配列を含む遺伝子改変された生物。
- ゲノム核酸配列が、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、および配列番号87からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも 80%の配列同一性を有する請求項 150の遺伝子改変された生物。
- ゲノム核酸配列が、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、および配列番号87からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも 90%の配列同一性を有する請求項 151の遺伝子改変された生物。
- ゲノム核酸配列が、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、および配列番号87からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも 95%の配列同一性を有する請求項 152の遺伝子改変された生物。
- ゲノム核酸配列が、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、および配列番号87からなる群から選択される核酸配列を含む請求項 153の遺伝子改変された生物。
- 生物が、アナエロミクソバクター・エスピー・Fw109-5、アルスロバクター・アウレッセンス、アルスロバクター・クロロフェノリカス、アルスロバクター・エスピー・FB24、ブデロビブリオ・バクテリオボルス、ブラストピレルラ・マリナ、ブレビバクテリウム・リネンス、ブルクホルデリア・アムビファリア、ブルクホルデリア・セノセパシア、ブルクホルデリア・オクラホメンシス、ブルクホルデリア・シュードマレイ、ブルクホルデリア・エスピー・383、カンジダツス・クエネニア・スツッツガルティエンシス、クロロフレクス・アグレガンス、クロロフレクス・アウランティアカス、クラビバクター・ミシガンエンシス亜種ミシガンエンシス、クラビバクター・ミシガンエンシス亜種セペドニカス、クロストリジウム・ボツリヌム A、クロストリジウム・ボツリヌム A3、クロストリジウム・ボツリヌム B1、クロストリジウム・ボツリヌム Bf、クロストリジウム・ボツリヌム F、クロストリジウム・ボツリヌム、コルウェリア・サイクレリスラエ、コングレギバクター・リトラリス、デスルファチバチラム・アルケニボランス、デスルホコッカス・オレオボランス、デスルホタレア・サイクロフィラ、デスルフロモナス・アセトキシダンス、フラボバクテリウム細菌、ゲマータ・オブスキュリグロブス、ゲオバクター・ベミジェンシス、ゲオバクター・ラヴレイ、ゲオバクター・エスピー・FRC-32、ゲオバクター・ウラニウムレデュセンス、ハヘラ・チェジュエンシス、ジャナスキア・エスピー・CCS1、キネオコッカス・ラジオトレランス、レンチスファエラ・アラネオーサ、マリカウリス・マリス、マリノバクター・アルギコーラ、マリノバクター・アクアエオレイ、ミクロコッカス・ルテウス、ミクロシラ・マリナ、モリテーラ・エスピー・PE36、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス、マイコバクテリウム・マリヌム、マイコバクテリウム・エスピー・GP1、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バンバアレニイ、ナイセリア・ゴノレア、ノカルジア・ファルシニカ、オピタタシエ 細菌、オピタタス・テラエ、パエニバチルス・エスピー・JDR-2、ペロバクター・プロピオニカス、フォトバクテリウム・プロファンダム、フォトバクテリウム・プロファンダム、フォトラブダス・ルミネッセンス亜種ラウモンディイ、プランクトマイセス・マリス、プレシオシスチス・パシフィカ、シュードアルテロモナス・アトランティカ、サイクロモナス・イングラハミィイ、サイクロモナス・エスピー・CNPT3、ラルストニア・ピッケティ、ロドコッカス・ロドクロウス、ロドコッカス・エスピー、ロドピレルーラ・バルティカ 、ロゼオバリウス・ヌビンヒベンス、シュワネラ・アマゾネンシス、シュワネラ・バルティカ、シュワネラ・ベンティカ、シュワネラ・デニトリフィカンス、シュワネラ・フリギディマリナ、シュワネラ・ハリファクセンシス、シュワネラ・ロイヒカ、シュワネラ・オネイデンシス、シュワネラ・ペアレアナ、シュワネラ・プトレファシエンス、シュワネラ・セディミニス、シュワネラ・エスピー・ANA-3、シュワネラ・エスピー・MR-4、シュワネラ・エスピー・MR-7、シュワネラ・エスピー・W3-18-1、シュワネラ・ウーディイ、ステノトロホモナス・マルトフィリア、ストレプトマイセス・アムボファシエンス、ザントモナス・アクソノポディス、ザントモナス・カンペストリス、ザントモナス・オリゼ、およびキシレラ・ファスティディオーサからなる群から選択される請求項150-154のいずれかの生物。
- 外来性核酸配列が、同じ条件下での外来性核酸配列の取り込みの前の生物における同じポリペプチドの発現と比較して、ゲノム核酸配列によってコードされるポリペプチドの発現を上昇させる、請求項150-155のいずれかの遺伝子改変された生物。
- 生物が、同じ条件下での野生型生物における炭化水素の生産と比較して上昇した量の炭化水素を生産する、請求項150-156のいずれかの遺伝子改変された生物。
- 以下の工程を含む炭化水素の生産に有用な酵素を同定する方法:
(a) OleA およびOleD、(b) OleA およびOleC、および(c) OleC およびOleD からなる群から選択されるポリペプチドを含む細胞を、炭化水素を生産する能力を有すると疑われる酵素をコードする核酸により形質転換する工程;および、
細胞が炭化水素を生産するか否かを決定する工程、ここで、細胞による炭化水素生産の存在は、核酸が炭化水素の生産に有用なポリペプチドをコードすることを示す。 - OleAが配列番号2、配列番号4、配列番号12、または配列番号18と少なくとも約 35%の配列同一性を共有し; OleC が配列番号6、配列番号14、配列番号20、または配列番号88と少なくとも約 35%の配列同一性を共有し;かつ、OleDが配列番号8、配列番号16、または配列番号22と少なくとも約 35%の配列同一性を共有する、請求項 158の方法。
- OleAが配列番号2、配列番号4、配列番号12、または配列番号18と少なくとも 50%の配列同一性を共有し; OleCが配列番号6、配列番号14、配列番号20、または配列番号88と少なくとも 50%の配列同一性を共有し;かつ、OleD が配列番号8、配列番号16、または配列番号22と少なくとも 50%の配列同一性を共有する、請求項 158の方法。
- OleAが配列番号2、配列番号4、配列番号12、または配列番号18と少なくとも 80%の配列同一性を共有し; OleCが配列番号6、配列番号14、配列番号20、または配列番号88と少なくとも 80%の配列同一性を共有し;かつ、OleDが配列番号8、配列番号16、または配列番号22と少なくとも 80%の配列同一性を共有する、請求項 158の方法。
- 配列番号6、配列番号14、配列番号20、および配列番号88からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列が1以上の アミノ酸置換、付加、挿入、または欠失を含む単離ポリペプチド。
- ポリペプチドがアデニル化活性を有する請求項 162の単離ポリペプチド。
- (a)配列番号5、配列番号7、配列番号13、配列番号15、配列番号19、配列番号21、および配列番号87からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも約 35%の配列同一性を有する核酸配列を有する生物を提供する工程、および(b)該核酸配列に欠失または突然変異を施す工程によって調製される、遺伝子改変された生物。
- 生物が、配列番号5、配列番号7、配列番号13、配列番号15、配列番号19、配列番号21、および配列番号87からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも約 80%の配列同一性を有する核酸配列に欠失または突然変異を施す工程によって調製される、請求項 164の遺伝子改変された生物。
- 生物が、配列番号5、配列番号7、配列番号13、配列番号15、配列番号19、配列番号21、および配列番号87からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも約 90%の配列同一性を有する核酸配列に欠失または突然変異を施す工程によって調製される、請求項 165の遺伝子改変された生物。
- 生物が、配列番号5、配列番号7、配列番号13、配列番号15、配列番号19、配列番号21、および配列番号87からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも約 95%の配列同一性を有する核酸配列に欠失または突然変異を施す工程によって調製される、請求項 166の遺伝子改変された生物。
- 生物が、配列番号5、配列番号7、配列番号13、配列番号15、配列番号19、配列番号21、および配列番号87からなる群から選択される核酸配列に欠失または突然変異を施す工程によって調製される、請求項 167の遺伝子改変された生物。
- 生物が、アナエロミクソバクター・エスピー・Fw109-5、アルスロバクター・アウレッセンス、アルスロバクター・クロロフェノリカス、アルスロバクター・エスピー・FB24、ブデロビブリオ・バクテリオボルス、ブラストピレルラ・マリナ、ブレビバクテリウム・リネンス、ブルクホルデリア・アムビファリア、ブルクホルデリア・セノセパシア、ブルクホルデリア・オクラホメンシス、ブルクホルデリア・シュードマレイ、ブルクホルデリア・エスピー・383、カンジダツス・クエネニア・スツッツガルティエンシス、クロロフレクス・アグレガンス、クロロフレクス・アウランティアカス、クラビバクター・ミシガンエンシス亜種ミシガンエンシス、クラビバクター・ミシガンエンシス亜種セペドニカス、クロストリジウム・ボツリヌム A、クロストリジウム・ボツリヌム A3、クロストリジウム・ボツリヌム B1、クロストリジウム・ボツリヌム Bf、クロストリジウム・ボツリヌム F、クロストリジウム・ボツリヌム、コルウェリア・サイクレリスラエ、コングレギバクター・リトラリス、デスルファチバチラム・アルケニボランス、デスルホコッカス・オレオボランス、デスルホタレア・サイクロフィラ、デスルフロモナス・アセトキシダンス、フラボバクテリウム細菌、ゲマータ・オブスキュリグロブス、ゲオバクター・ベミジェンシス、ゲオバクター・ラヴレイ、ゲオバクター・エスピー・FRC-32、ゲオバクター・ウラニウムレデュセンス、ハヘラ・チェジュエンシス、ジャナスキア・エスピー・CCS1、キネオコッカス・ラジオトレランス、レンチスファエラ・アラネオーサ、マリカウリス・マリス、マリノバクター・アルギコーラ、マリノバクター・アクアエオレイ、ミクロコッカス・ルテウス、ミクロシラ・マリナ、モリテーラ・エスピー・PE36、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス、マイコバクテリウム・マリヌム、マイコバクテリウム・エスピー・GP1、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・バンバアレニイ、ナイセリア・ゴノレア、ノカルジア・ファルシニカ、オピタタシエ 細菌、オピタタス・テラエ、パエニバチルス・エスピー・JDR-2、ペロバクター・プロピオニカス、フォトバクテリウム・プロファンダム、フォトバクテリウム・プロファンダム、フォトラブダス・ルミネッセンス亜種ラウモンディイ、プランクトマイセス・マリス、プレシオシスチス・パシフィカ、シュードアルテロモナス・アトランティカ、サイクロモナス・イングラハミィイ、サイクロモナス・エスピー・CNPT3、ラルストニア・ピッケティ、ロドコッカス・ロドクロウス、ロドコッカス・エスピー、ロドピレルーラ・バルティカ 、ロゼオバリウス・ヌビンヒベンス、シュワネラ・アマゾネンシス、シュワネラ・バルティカ、シュワネラ・ベンティカ、シュワネラ・デニトリフィカンス、シュワネラ・フリギディマリナ、シュワネラ・ハリファクセンシス、シュワネラ・ロイヒカ、シュワネラ・オネイデンシス、シュワネラ・ペアレアナ、シュワネラ・プトレファシエンス、シュワネラ・セディミニス、シュワネラ・エスピー・ANA-3、シュワネラ・エスピー・MR-4、シュワネラ・エスピー・MR-7、シュワネラ・エスピー・W3-18-1、シュワネラ・ウーディイ、ステノトロホモナス・マルトフィリア、ストレプトマイセス・アムボファシエンス、ザントモナス・アクソノポディス、ザントモナス・カンペストリス、ザントモナス・オリゼ、およびキシレラ・ファスティディオーサからなる群から選択される請求項164-168のいずれかの生物。
- 生物における核酸配列の欠失または突然変異の結果、同じ条件下での核酸配列の欠失または突然変異の前の生物における同じポリペプチドの生産と比較して核酸配列によってコードされるポリペプチドの生産が低下する請求項164-169のいずれかの遺伝子改変された生物。
- 遺伝子改変された生物がケトンを生産する請求項164-170のいずれかの遺伝子改変された生物。
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