JP5912251B2 - 炭化水素産生遺伝子およびその使用方法 - Google Patents

炭化水素産生遺伝子およびその使用方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、引用により組み込んだ２００７年５月２２日出願の米国仮特許出願第６０／９３１，３７０号、２００７年５月２５日出願の米国仮特許出願第６０／９３１，９３９号、２００７年７月２５日出願の米国仮特許出願第６０／９５１，９４４号、および２００７年９月２４日出願の米国仮特許出願第６０／９７４，８１０号からの優先権を主張する。
電子提出資料の援用
本明細書と同時に提出され、２００８年５月２０日に作成された「７０２７２４＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」という名称の１，３５９，０７８バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルで特定されたコンピュータで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列のリストは、全体が本明細書に引用により組み込まれる。
技術の進歩に伴って燃料原料への依存が増大し、このような燃料原料はますます限られ、獲得が困難になってきている。空前の速度で起こる化石燃料の燃焼によって、世界の燃料需要はまもなく現在の燃料供給量を上回ると考えられる。
現在産出されている燃料原料の大部分は、石油原料由来であるか、または植物油の化学加工によるものである。石油原料は、いくつかの問題に直面している。石油原料は、再生が不可能な資源であり、形成には多大な時間（年数）が必要とされ、形成は特有の地域に限定される。石油はエネルギー源として消費されるので、地質的石油資源はいずれ枯渇するだろう。
結果として、再生可能なエネルギー源、例えば、太陽光、水、風およびバイオマスの利用に努力が傾けられてきた。石油原料由来ではない新たな燃料源（すなわち、バイオ燃料）を生産するためにバイオマスを使用することが１つの選択肢として持ち上がってきた。バイオ燃料（例えば、バイオディーゼル）は、長鎖アルカンおよびエステルから形成された生分解性の可燃性燃料である。バイオディーゼルは、「純」バイオディーゼルと称される純粋な形態で、または通常の石油ディーゼルとの任意の濃度での混合物として、ほとんどの内燃ディーゼルエンジンで使用することができる。
理論的には、バイオ燃料は、いかなる生物炭素源からも製造することができる。最も一般的な生物炭素源は、太陽エネルギーを捕捉する光合成植物であることは間違いない。多種多様な植物および植物由来物質がバイオ燃料を製造するために使用される。技術的も最も困難な問題の１つは、バイオマスエネルギーを特に輸送用液体燃料に変換する方法を開発することである。バイオ燃料を製造するために通常使用される戦略は、糖科作物（例えば、サトウキビもしくはサトウダイコン）またはデンプン作物（例えば、トウモロコシまたはモロコシ）を生育させ、エタノール（すなわち、エチルアルコール）を生成するために酵母発酵を利用することである。バイオ燃料を製造するために通常使用される別の戦略は、天然に油を産生する植物、例えば、油ヤシ、ダイズまたはジャトロファを生育することである。天然に産生される油の代替原料は、生物、例えば、海草から得られる。これらの油を加熱すると、粘度が減少し、ディーゼルエンジン内で直接燃焼させることができる。あるいは、油は燃料、例えば、バイオディーゼルを製造するために化学的に加工することができる。現在のバイオディーゼル製造方法には、脂肪酸エステルと望ましくない副産物、グリセリンの混合物を生じるトリアシルグリセリド（例えば、植物油または動物脂）のエステル転移反応が関与する。これによって、経済的非効率を招く不均一な廃棄物である生成物が生じる。
植物油は、再生可能な資源であるので、化石燃料の代わりとして相変わらず魅力的である。しかし、植物油は、食物連鎖の重要な一部である。食物と産業化学物質、例えば、燃料およびポリマーの両方の必要性を満たすために十分な穀物を生育させることはできないと思われる。さらに、油を産生する植物は、生長する環境条件によって制限され得る。さらに、植物油は、炭化水素（例えば、アルカンまたはアルケン）ではない。それどころか、植物油は主に酸素分子を含有するトリグリセリドで、燃焼機関内で燃焼するときエンジンは焼き付いてしまうだろう。
前記のことを考慮すると、改善されたバイオ燃料製造方法を実現するためには、代替原料から燃料を製造できることが望ましいだろう。本発明は、炭化水素および炭化水素中間体の生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。さらに、本発明は、バイオ燃料の製造にそれを使用する方法を提供する。本明細書で記載した本発明は、限りある再生不可能な炭化水素資源に関連した問題を克服し、バイオ燃料製造に使用できる改善された方法を提供する。本発明のこれらおよびその他の利点は、本明細書に記載した詳細な説明から明らかになるだろう。
発明の簡潔な概要
本発明は、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣまたはＯｌｅＤアミノ酸モチーフ配列を含むポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。
本発明は、（ａ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列、（ｂ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列のホモログ、（ｃ）１個または複数の保存的アミノ酸置換を含むＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列の保存的変異体、および（ｄ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列と少なくとも約３５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。
本発明は、脂肪族ケトンを産生するために十分な条件下で、基質をＯｌｅＡとインキュベートすることを含む脂肪族ケトンの産生方法を提供する。本発明はまた、炭化水素を産生するために十分な条件下で、基質をＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＢＣ、ＯｌｅＤまたはそれらの組合せとインキュベートすることを含む炭化水素の産生方法を提供する。
本発明は、ＯｌｅＡをコードするアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、アミノ酸配列が１個または複数のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を含む単離ポリペプチドを提供する。
本発明は、ＯｌｅＣをコードするアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、アミノ酸配列が１個または複数のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を含む単離ポリペプチドを提供する。
本発明は、ＯｌｅＤをコードするアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、アミノ酸配列が１個または複数のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を含む単離ポリペプチドを提供する。
本発明は、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＣまたはＯｌｅＤをコードするアミノ酸配列を含むポリペプチドと同じ生物活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。
本発明はさらに、（ａ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣまたはＯｌｅＤをコードする核酸配列と少なくとも約３５％の配列同一性を有し、（ｂ）ポリペプチドをコードする、ゲノム核酸配列の上流で生物のゲノムに安定して組み込まれた外来核酸配列を含む遺伝子操作された生物を提供する。
本発明は、（ａ）ＯｌｅＣまたはＯｌｅＤと少なくとも約３５％の配列同一性を有する核酸配列を有する生物を提供し、（ｂ）前記核酸配列を欠失または突然変異させることによって調製した遺伝子操作された生物を提供する。
本発明はまた、炭化水素の産生に有用な酵素を同定する方法であって、（ａ）ＯｌｅＡおよびＯｌｅＤ、（ｂ）ＯｌｅＡおよびＯｌｅＣ、ならびに（ｃ）ＯｌｅＣおよびＯｌｅＤからなる群から選択されたポリペプチドを含む細胞を、炭化水素を産生する能力を有すると推測される酵素をコードする核酸で形質転換することと、細胞が炭化水素を産生するかどうかを決定することとを含み、細胞による炭化水素産生の存在が、前記核酸が炭化水素の産生に有用なポリペプチドをコードすることを示す方法を提供する。
本発明は、約−２８以上のδ１３Ｃを有する炭化水素を提供する。本発明はまた、少なくとも約５０のｐＭＣを有する炭化水素を提供する。
図１は、タンパク質ＯｌｅＡ（配列番号２）、ＯｌｅＣ（配列番号６）およびＯｌｅＤ（配列番号８）を生成するＥ．ｃｏｌｉ Ｃ４１（ＤＥ３）ΔｆａｄＥから抽出された炭化水素の全イオンクロマトグラムを示した図である。 図２Ａ〜２Ｊは、図１で示した炭化水素の一連の１０個の質量スペクトルを示した図である。図２ＡはＣ２７トリエンの質量スペクトルデータを示した図である。図２ＢはＣ２７ジエンの質量スペクトルデータを示した図である。図２ＣはＣ２７モノエンの質量スペクトルデータを示した図である。図２ＤはＣ２８ジエンの質量スペクトルデータを示した図である。図２ＥはＣ２９トリエンの質量スペクトルデータを示した図である。図２ＦはＣ２９ジエンの質量スペクトルデータを示した図である。図２ＧはＣ２９モノエンの質量スペクトルデータを示した図である。図２ＨはＣ３０ジエンの質量スペクトルデータを示した図である。図２ＩはＣ３１トリエンの質量スペクトルデータを示した図である。図２ＪはＣ３１ジエンの質量スペクトルデータを示した図である。 図３は、Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａから抽出した炭化水素の全イオンクロマトグラムを示した図である。 図４Ａ〜４Ｅは、様々なＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ培養物のメタノール：ヘキサン抽出物の一連の全イオンクロマトグラムを示した図である。図４Ａは、野生型Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＡＴＣＣ １７６７９の抽出物中で検出されたオレフィンを示した図である。図４Ｂは、Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ΔｏｌｅＡ株（ｏｌｅＡ欠損）の抽出物中には主要なピークが検出されなかったことを示している。図４Ｃは、野生型Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＡＴＣＣ １７６７９の抽出物中で検出されたオレフィンを示した図である。図４Ｄは、Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ΔｏｌｅＣ株（ｏｌｅＣ欠損）の抽出物中に検出された脂肪族ケトンを示した図である。図４Ｅは、Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ΔｏｌｅＤ株（ｏｌｅＤ欠損）の抽出物中で検出された脂肪族ケトンを示した図である。 図５Ａ〜５Ｃは、タンパク質ＯｌｅＡ（配列番号２）を産生するＥ．ｃｏｌｉＣ４１（ＤＥ３）から抽出された脂肪族ケトンの一連の全イオンクロマトグラムを示した図である。図５Ａは、タンパク質ＯｌｅＡ（配列番号２）を産生するＥ．ｃｏｌｉＣ４１（ＤＥ３）から抽出された脂肪族ケトンを示した図である。図５Ｂは、１６−ヘントリアコントン（飽和Ｃ３１ケトン）を重ね合わせた図５Ａの抽出物を示した図である。図５Ｃは、１４−ヘプタコサノン（飽和Ｃ２７ケトン）を重ね合わせた図５Ａの抽出物を示した図である。 図６Ａ〜６Ｈは、図５Ａで示した各脂肪族ケトンの一連の質量スペクトルを示した図である。図６Ａは、Ｃ２７：２ケトン（２個の不飽和結合を有する）を示した図である。図６Ｂは、Ｃ２７：１ケトン（１個の２重結合を有する）を示した図である。図６Ｃは、Ｃ２７ケトン（飽和している）を示した図である。図６Ｄは、Ｃ２９：２ケトン（２個の不飽和結合を有する）を示した図である。図６Ｅは、Ｃ２９：１ケトン（１個の２重結合を有する）を示した図である。図６Ｆは、Ｃ２９ケトン（飽和している）を示した図である。図６Ｇは、Ｃ３１：２ケトン（２個の不飽和結合を有する）を示した図である。図６Ｈは、Ｃ３１：１ケトン（１個の２重結合を有する）を示した図である。 図７Ａ〜７Ｃは、脂肪族ケトンが、ｏｌｅＡ（配列番号１）を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の溶解物とアシル−ＣｏＡ基質を一緒にするｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで検出されることを示した図である。図７Ａは、ミリストイル−ＣｏＡ基質と共にＯｌｅＡ溶解物を含有する試料の抽出物の全イオンクロマトグラムを示した図である。図７Ｂは、ミリストイル−ＣｏＡ基質を添加していないＯｌｅＡ溶解物を含有する対照抽出物の全イオンクロマトグラムを示した図である。図７Ｃは、試料それぞれに見い出されるケトンの量を比較する図である。ｙ軸が曲線下面積を表し、ｘ軸が指示した脂肪族ケトンを表す。斜線の棒は、ＯｌｅＡ細胞抽出物のみを有する試料を表し、黒い棒はミリストイル−ＣｏＡ基質と一緒にしたＯｌｅＡ細胞抽出物を表す。 図８Ａおよび８Ｂは、精製したＯｌｅＡタンパク質、ミリストイル−ＣｏＡ基質およびＥ．ｃｏｌｉＣ４１（ＤＥ３）細胞溶解物を含有するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの抽出物のＧＣ／ＭＳデータを示した図である。図８Ａは、全イオンクロマトグラムにおいて１３．９５分の保持時間で溶出するピークを示した全イオンクロマトグラムで、飽和Ｃ２７脂肪族ケトンの存在を示している。図８Ｂは、Ｃ２７脂肪族ケトンの質量スペクトルを示した図である。 図９は、ｏｌｅＡタンパク質配列発現のために様々なベクターを含有するＥ．ｃｏｌｉＣ４１（ＤＥ３）ΔｆａｄＥの発酵抽出物において検出された脂肪族ケトンのＧＣ曲線下面積を示した図である。黒い棒は、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓのゲノムに基づいてｏｌｅＡを含有するプラスミドを発現する株の抽出物において認められた脂肪族ケトンの量を表しており、斜め模様の棒は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓのゲノムに基づいてｏｌｅＡを含有するプラスミドを発現する株の抽出物において認められた脂肪族ケトンの量を表しており、白い棒は、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＡＴＣＣ１７６７９のＯｌｅＡポリペプチドをコードする天然のヌクレオチド配列を含有するプラスミドを発現する株の抽出物において認められた脂肪族ケトンの量を表しており、斜線の棒は、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ Ｒ５５１−３（Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＣＯ）のＯｌｅＡポリペプチドをコードする合成されたコドン最適化ヌクレオチド配列を含有するプラスミドを発現する株の抽出物において認められた脂肪族ケトンの量を表している。Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＣＯは、Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ Ｒ５５１−３（配列番号４）のＯｌｅＡのアミノ酸配列をコードするコドン最適化合成ＤＮＡの発現を意味する。 図１０は、ｆａｄＥ、ｆａｄＤおよび／またはｔｅｓＡに変化を有するＥ．ｃｏｌｉＣ４１（ＤＥ３）株において、ｏｌｅＡの発現によって生じた脂肪族ケトン産生の増加を示した図である。白い棒は、Ｃ２７ケトンを表し、斜線の棒はＣ２９ケトンを表し、黒い棒はＣ３１ケトンを表す。Ａ（−）の印は、遺伝子活性のノックアウトを示し、（＋）の印は対象とする遺伝子の過剰発現を示す。 図１１は、ｆａｄＥ、ｆａｄＤおよび／またはｔｅｓＡに変化を有するＥ．ｃｏｌｉＣ４１（ＤＥ３）株におけるｏｌｅＡ、ｏｌｅＣおよびｏｌｅＤの発現によって生じたオレフィン産生の増加を示した図である。白い棒は、Ｃ２７オレフィンを表し、斜線の棒はＣ２９オレフィンを表し、黒い棒はＣ３１オレフィンを表す。Ａ（−）の印は、遺伝子活性のノックアウトを示し、（＋）の印は対象とする遺伝子の過剰発現を示す。 図１２Ａ〜１２Ｅは、ミリストイル補酵素Ａと一緒にしたＯｌｅＡおよびＯｌｅＤ酵素とのｉｎ ｖｉｔｒｏ反応の有機抽出物のＧＣ／ＭＳクロマトグラフィーによるテトラデカナール、１４−ヘプタコサノンおよびヘプタコセンの異性体の所見を示した図である。図１２Ａは、テトラデカナールの全イオンクロマトグラムを示した図である。図１２Ｂは、ヘプタコセンの異性体を示す２ピークを有する全イオンクロマトグラムを示した図である。図１２Ｃは、図１２Ｂのピーク１の質量スペクトルを示した図である。図１２Ｄは、図１２Ｂのピーク２の質量スペクトルを示した図である。図１２Ｅは、１４−ヘプタコサノンの全イオンクロマトグラムを示した図である。 図１３Ａ〜１３Ｃは、ミリストイル補酵素Ａと一緒にしたＯｌｅ酵素の２つのｉｎ ｖｉｔｒｏ反応の有機抽出物のＧＣ／ＭＳクロマトグラフィーによるテトラデカナール、１４−ヘプタコサノンおよびヘプタコセンの異性体の所見を示した一連の全イオンクロマトグラムを示した図である。１つの反応はＯｌｅＡおよびＯｌｅＤ酵素を含み、その他の反応はＯｌｅＡ、ＯｌｅＤおよびＯｌｅＢ酵素を含んだ。図１３Ａは、テトラデカナールの全イオンクロマトグラムを示した図である。図１３Ｂは、ヘプタコセンの異性体を示す２ピークの全イオンクロマトグラムを示した図である。図１３Ｃは、１４−ヘプタコサノンの全イオンクロマトグラムを示した図である。矢印はＯｌｅＡ＋ＯｌｅＤ＋ＯｌｅＢの反応およびＯｌｅＡ＋ＯｌｅＤの反応を示す。ＯｌｅＢの存在は、テトラデカナールおよびヘプタコセンの形成を増強し、１４−ヘプタコサノンのレベルを低下させる。 図１４は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが機能的ＯｌｅＡを産生できることを示す全イオンクロマトグラムを示した図である。図１４は、ミリストイル補酵素Ａを追加したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐＥＳＣ−ＨＩＳ−ＯｌｅＡの細胞溶解物反応の抽出物の全イオンクロマトグラムを示した図である。ミリスチン酸、１４−ヘプタコサノンおよびヘキサコサン対照スパイクが認められる。 図１５Ａ〜１５Ｈは、変性したアルデヒドおよびオレフィンが精製したＯｌｅＡ、ＯｌｅＤを含有する細胞溶解物および変性したＮＡＤＰＨを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの有機抽出物中に認められることを示す一連の全イオンクロマトグラムおよび質量スペクトルを示した図である。図１５Ａは、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＤを含有する細胞溶解物、ミリストイル補酵素ＡおよびＲ−（４−２Ｈ）ＮＡＤＰＨを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ反応の抽出後に認められたテトラデカナールの全イオンクロマトグラムを示した図である。図１５Ｂは、図１５Ａのテトラデカナールの質量スペクトルを示した図である。図１５Ｃは、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＤを含有する細胞溶解物、ミリストイル補酵素Ａおよび変性したＳ−（４−２Ｈ）ＮＡＤＰＨを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ反応の抽出後に認められたテトラデカナールの全イオンクロマトグラムを示した図である。図１５Ｄは、図１５Ｃのテトラデカナールの質量スペクトルを示した図である。図１５Ｅは、ＯｌｅＡおよびＯｌｅＤを含有する細胞溶解物とＲ−（４−２Ｈ）ＮＡＤＰＨとの反応によって形成されたヘプタコセンの異性体の全イオンクロマトグラムを示した図である。図１５Ｆは、図１５Ｅのヘプタコセンの異性体の質量スペクトルを示した図である。図１５Ｇは、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＤを含有する細胞溶解物、ミリストイル補酵素ＡおよびＳ−（４−２Ｈ）ＮＡＤＰＨを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ反応の抽出後に認められたヘプタコセンの異性体の全イオンクロマトグラムを示した図である。図１５Ｈは、図１５Ｇのヘプタコセンの質量スペクトルを示した図である。 図１６Ａ〜１６Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて脂肪族オレフィンを合成する能力を示した一連の全イオンクロマトグラムを示した図である。図１６Ａは、ミリストイル補酵素Ａと共に、ｏｌｅＡ、ｏｌｅＢ、ｏｌｅＣおよびｏｌｅＤを発現するためのプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ Ｃ４１（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株から調製された細胞溶解物で実施した反応の抽出物の全イオンクロマトグラムを示した図である。矢印は、Ｃ２７：１、Ｃ２７：２およびＣ２７：３ヘプタコセンを示す。図１６Ｂは、ミリストイル補酵素Ａを付加して、ｏｌｅＡ、ｏｌｅＢ、ｏｌｅＣおよびｏｌｅＤを発現するためのプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ Ｃ４１（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株から調製された細胞溶解物で実施した反応の抽出物の全イオンクロマトグラムを示した図である。矢印は、Ｃ２７：１、Ｃ２７：２およびＣ２７：３ヘプタコセンを示す。図１６Ｃは、ミリストイル−ＡＣＰを添加して、ｏｌｅＡ、ｏｌｅＢ、ｏｌｅＣおよびｏｌｅＤを発現するためのプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ Ｃ４１（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株から調製された細胞溶解物で実施した反応の抽出物の全イオンクロマトグラムを示した図である。矢印は、Ｃ２７：１、Ｃ２７：２およびＣ２７：３ヘプタコセンを示す。 図１７Ａ〜１７Ｊは、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＨ３２０；ｐＷＨ１５２０＿ＯｌｅＣＤＡＢの発酵から抽出された炭化水素について選択されたイオンの一連の全イオンクロマトグラムおよび質量スペクトルを示した図である。図１７Ａは、３５０の親イオンを有する２５炭素オレフィンの全イオンクロマトグラムを示した図である。図１７Ｂは、保持時間３．０９２分で溶出し、分枝Ｃ２５モノ飽和オレフィンを特徴とする化合物の質量スペクトルを示した図である。図１７Ｃは、３６４の親イオンを有する２６炭素オレフィンの全イオンクロマトグラムを示した図である。図１７Ｄは、保持時間３．３９０分で溶出し、分枝Ｃ２６モノ飽和オレフィンを特徴とする化合物の質量スペクトルを示した図である。図１７Ｅは、３７８の親イオンを有する２７炭素オレフィンの全イオンクロマトグラムを示した図である。図１７Ｆは、保持時間３．５６７分で溶出し、分枝Ｃ２７モノ飽和オレフィンを特徴とする化合物の質量スペクトルを示した図である。図１７Ｇは、３９２の親イオンを有する２８炭素オレフィンの全イオンクロマトグラムを示した図である。図１７Ｈは、保持時間３．８９３分で溶出し、分枝Ｃ２８モノ飽和オレフィンを特徴とする化合物の質量スペクトルを示した図である。図１７Ｉは、４０６の親イオンを有する２９炭素オレフィンの全イオンクロマトグラムを示した図である。図１７Ｊは、保持時間４．０１３分で溶出し、分枝Ｃ２９モノ飽和オレフィンを特徴とする化合物の質量スペクトルを示した図である。 図１８Ａ〜１８Ｅは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの抽出物の一連の全イオンクロマトグラムおよび質量スペクトルを示した図である。図１８Ａは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＨＡ０１；ｐＨＴ０１＿ＯｌｅＡから抽出した脂肪族ケトンの全イオンクロマトグラムを示した図である。図１８Ｂは、いかなる脂肪族炭化水素も産生しないＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＨＡ０１；ｐＨＴ０１の抽出物の全イオンクロマトグラムを示した図である。図１８Ｃは、保持時間３．５８４で溶出し、分枝脂肪族Ｃ２５ケトンを特徴とする化合物の質量スペクトルを示した図である。図１８Ｄは、保持時間４．０３６で溶出し、分枝脂肪族Ｃ２７ケトンを特徴とする化合物の質量スペクトルを示した図である。図１８Ｅは、保持時間４．４８５分で溶出し、分枝脂肪族Ｃ２９ケトンを特徴とする化合物の質量スペクトルを示した図である。 図１９Ａ〜１９Ｂは、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ ＴＣ１の抽出物の全イオンクロマトグラムおよび質量スペクトルを示した図である。図１９Ａは、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ ＴＣ１から抽出された炭化水素の全イオンクロマトグラムを示した図である。３本のピークは、モノ飽和Ｃ２９オレフィンの様々な分枝変種(version)を示す。図１９Ｂは、保持時間１３．６分で溶出し、モノ飽和Ｃ２９オレフィンを特徴とする化合物の質量スペクトルを示した図である。 図２０は、ミコール酸生合成およびＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣおよびＯｌｅＤを使用したオレフィン合成の提案された経路を示した図である。ＸはＣｏＡまたはＡＣＰのいずれかであってよい。 図２１は、ｏｌｅＣおよびｏｌｅＤを発現するミコール酸産生生物における長鎖オレフィン産生の提案された経路を示した図である。 図２２は、ｏｌｅＣを発現するミコール酸産生生物における長鎖オレフィン産生の提案された経路を示した図である。
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的に、炭化水素の生合成に関与するタンパク質をコードするいくつかの遺伝子の発見に基づいている。本明細書で同定した１種または複数のタンパク質をコードする１種または複数の核酸配列で形質転換された生物は、オレフィンなどの炭化水素および脂肪族ケトンなどの炭化水素中間体の生成に使用することができる。「オレフィン」および「アルケン」という用語は本明細書では同義に使用される。本明細書で記載したように、これらの核酸配列は、炭化水素の生合成に関与する遺伝子として定義された。したがって、１種または複数のこれらの遺伝子で形質転換された細胞は、オレフィンおよびそれらの前駆体（例えば、脂肪族ケトン）を含む炭化水素の製造のための供給源として使用できる。この発見は、限界のある再生不可能な炭化水素資源（例えば、石油をベースにした燃料）の代わりに燃料として使用できる炭化水素供給源を提供する。さらに、特定の適用のために考案された広範な特定なオレフィンおよび脂肪族ケトン生成物を産生することが可能である。宿主生物および／または反応基質を制御することによって（例えば、鎖長、分枝、飽和および／または２重結合の位置を制御することによって）、特定の分枝および不飽和位置を有する炭化水素生成物を含む広範な炭化水素生成物を産生する生物を創出することができる。
オレフィンなどの炭化水素および脂肪族ケトンなどの炭化水素中間体の生合成に関与するタンパク質をそれぞれコードする４種類の遺伝子を、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａにおいて同定した。これら４種類の遺伝子は、ｏｌｅＡ、ｏｌｅＢ、ｏｌｅＣおよびｏｌｅＤと称され、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質は、それぞれＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣおよびＯｌｅＤと称される。さらに、これらの遺伝子はまた、その他の生物内でも２つ一組で見い出された。これらの組合せには、本明細書ではｏｌｅＢＣと称したｏｌｅＢとｏｌｅＣとの融合物が含まれ、この遺伝子によってコードされるタンパク質はＯｌｅＢＣと称される。これらの５種類のタンパク質は一緒に、炭化水素および炭化水素中間体の生合成に関与するＯｌｅタンパク質のファミリーを表す。個々には、ＯｌｅＡはＯｌｅＡ活性を備えたタンパク質のファミリーを意味し、ＯｌｅＢはＯｌｅＢ活性を備えたタンパク質のファミリーを意味し、ＯｌｅＣはＯｌｅＣ活性を備えたタンパク質のファミリーを意味し、ＯｌｅＢＣはＯｌｅＢＣ活性を備えたタンパク質のファミリーを意味し、ＯｌｅＤはＯｌｅＤ活性を備えたタンパク質のファミリーを意味する。当業者であれば、Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ｏｌｅ遺伝子配列の構造および機能に関連して本明細書で提供した情報を使用することによって、類似の活性を備えたタンパク質をコードするその他の遺伝子配列を得ることができることを理解するであろう。
これらの教示があれば、当業者であれば他のｏｌｅＡ、ｏｌｅＢ、ｏｌｅＣ、ｏｌｅＢＣおよびｏｌｅＤ配列は容易にクローニングされ、炭化水素および炭化水素中間体の製造に使用され得ることを理解するであろう。したがって、この記載を通じてＯｌｅタンパク質について記載したことは、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＢＣおよびＯｌｅＤを含むＯｌｅファミリータンパク質のいずれかと類似の活性を表すタンパク質すべてを意味するものと理解されたい。同様に、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＢＣまたはＯｌｅＤについて記載したことは、例えば、表１および２に挙げたＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＢＣまたはＯｌｅＤタンパク質すべてを含む各Ｏｌｅタンパク質ならびに様々な生物情報学的方法または分子技術、例えば、抗体結合、核酸ハイブリダイゼーション、ＰＣＲおよびその他の適切な方法によって同定または操作することができるその他のＯｌｅタンパク質の各活性を表すタンパク質すべてを意味するものと理解されたい。
さらに、この記載を通じて、ｏｌｅ遺伝子について記載したことは、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＢＣまたはＯｌｅＤを含むＯｌｅファミリータンパク質のいずれかと類似の活性を表すタンパク質をコードする全遺伝子を意味するものと理解されたい。同様に、ｏｌｅＡ、ｏｌｅＢ、ｏｌｅＣ、ｏｌｅＢＣまたはｏｌｅＤについて記載したことは、例えば、表１および２に挙げたＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＢＣまたはＯｌｅＤタンパク質すべてを含む各Ｏｌｅタンパク質ならびに様々な生物情報学的方法または分子技術、例えば、抗体結合、核酸ハイブリダイゼーション、ＰＣＲおよびその他の適切な方法によって同定または操作することができるその他のＯｌｅタンパク質の各活性を表すタンパク質をコードする全遺伝子を意味するものと理解されたい。
本発明は、Ｏｌｅタンパク質をコードする単離核酸を提供する。核酸に関して「単離された」という用語は、天然の環境から核酸を取り出すことを意味する。さらに、「単離核酸」は、断片として天然に生じない、天然に見い出されない核酸断片を含むことを意味する。本明細書では「単離された」という用語はまた、その他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドのことであり、精製ポリペプチドおよび組換えポリペプチド両方を包含することを意味する。本明細書では、「単離された」という用語はまた、組換えＤＮＡ技術によって生成されたときは、細胞物質、ウイルス物質または培養培地を実質的に含まない核酸またはペプチドを意味する。本明細書では、「単離された」という用語はまた、化学的に合成されたときは、化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドを意味する。
「核酸」および「核酸配列」という用語は、１本鎖または２本鎖であってよく、非天然ヌクレオチドまたは変化したヌクレオチドを含有することができるＤＮＡもしくはＲＮＡのポリマー（すなわち、ポリヌクレオチド）を包含するものとする。この用語はまた、同等物として、ヌクレオチド類似体から形成されたＲＮＡもしくはＤＮＡのいずれかの類似体、および記載した実施形態に適用できるならば、１本鎖（センスもしくはアンチセンス）および２本鎖ポリヌクレオチド、ＥＳＴ、染色体、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを含むものと理解するべきである。
表１および２は、Ｏｌｅタンパク質を例示するリストである。表１において、＃／＃＊は、その生物がそれぞれ独自性を備えた２種類のホモログを含有することを示す。太字の生物は、遺伝子活性が分かっているか、またはオレフィンを産生することが分かっている。パーセント同一性は、初期設定パラメータに設定されたＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェアで計算するとき、Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＡＴＣＣ１７６７９のＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣまたはＯｌｅＤのアミノ酸配列（表１および２に示した通りである）と比較して決定された。例えば、ｂｌａｓｔｎ（バージョン２．０）ソフトウェアは、初期設定のパラメータ（ｅｘｐｅｃｔ＝１０、ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ｆｉｌｔｅｒ＝ＤＵＳＴ（Ｔａｔｕｓｏｖ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎｎ、未発表データ、およびHancock and Armstrong, Comput. Appl. Biosci., 10: 67-70 (1994)）、ｇａｐ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｃｏｓｔ＝１１、ｐｅｒ ｒｅｓｉｄｕｅ ｇａｐ ｃｏｓｔ＝１、およびｌａｍｂｄａ ｒａｔｉｏ＝０．８５）を使用して２種類の核酸配列の間の配列同一性を決定するために使用することができる。２種類のポリペプチドを比較するために、ｂｌａｓｔｐ（バージョン２．０）ソフトウェアを初期設定パラメータ［ｅｘｐｅｃｔ＝１０、ｆｉｌｔｅｒ＝ＳＥＧ（Wootton et al., Computers in Chemistry, 17: 149-163 (1993))、ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ｇａｐ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｃｏｓｔ＝１１、ｐｅｒ ｒｅｓｉｄｕｅ ｇａｐ ｃｏｓｔ＝１、ｌａｍｂｄａ＝０．８５］で使用することができる。
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本発明は、炭化水素の生合成に関与する５種類のタンパク質ファミリー、集合的にＯｌｅタンパク質ファミリーと称するＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＢＣおよびＯｌｅＤタンパク質ファミリーを提供する。生物情報学プログラム、例えば、ＢＬＡＳＴプログラム（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤによって提供される）を使用して、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＢＣおよびＯｌｅＤタンパク質ファミリーに属するタンパク質およびヌクレオチド配列を同定した。
炭化水素生合成に最も関与する可能性があるタンパク質を同定するために、生物情報学的分析にさらに制約を適用した。炭化水素生合成は、単一のＯｌｅタンパク質によっては行われない。したがって、４種類のＯｌｅタンパク質すべてを含有する生物がより炭化水素を産生する可能性がある。したがって、生物情報学的分析は、９４０を上回る細菌ゲノム、ならびに１００を上回る古細菌および真核生物ゲノムで実施した。この検索によって、４種類のｏｌｅ炭化水素合成遺伝子すべてを含有する６７種類の細菌ゲノムが明らかになった：Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ Ｒ５５１−３、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ Ｋ２７９ａ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ ＴＣ１、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ Ａ６、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ ＤＳＭ ３６４５、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｎｅｎｓ ＢＬ２、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ Ｈｘｄ３、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ ＤＳＭ ９４８５、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ Ｊ−１０−ｆｌ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ＮＣＰＰＢ ３８２、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｓ、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ ３４Ｈ、Ｃｏｎｇｒｅｇｉｂａｃｔｅｒ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＫＴ７１、Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ ＬＳｖ５４、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ ＤＳＭ ６８４、Ｇｅｍｍａｔａ ｏｂｓｃｕｒｉｇｌｏｂｕｓ ＵＱＭ ２２４６、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｂｅｍｉｄｊｉｅｎｓｉｓ Ｂｅｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｌｏｖｌｅｙｉ ＳＺ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＦＲＣ−３２、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｕｒａｎｉｕｍｒｅｄｕｃｅｎｓ Ｒｆ４、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ ＳＲＳ３０２１６、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ ａｒａｎｅｏｓａ ＨＴＣＣ２１５５、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ ＮＣＴＣ ２６６５、Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ ｓｐ．ＰＥ３６、Ｏｐｉｔｕｔｕｓ ｔｅｒｒａｅ ＰＢ９０−１、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２３７９、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ ３ＴＣＫ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ ＳＳ９、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｉｓ ＤＳＭ ８７９７、Ｐｌｅｓｉｏｃｙｓｔｉｓ ｐａｃｉｆｉｃａ ＳＩＲ−１、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ ｉｎｇｒａｈａｍｉｉ ３７、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＣＮＰＴ３、Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｂａｌｔｉｃａ ＳＨ １、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ ＳＢ２Ｂ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ ＯＳ１５５、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ ＯＳ１８５、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ ＯＳ１９５、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ ＯＳ２２３、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂｅｎｔｈｉｃａ ＫＴ９９、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＯＳ２１７、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａ ＮＣＩＭＢ ４００、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｈａｌｉｆａｘｅｎｓｉｓ ＨＡＷ−ＥＢ４、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｌｏｉｈｉｃａ ＰＶ−４、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ ＭＲ−１、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｅａｌｅａｎａ ＡＴＣＣ ７００３４５、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ ２００、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ ＣＮ−３２、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｅｄｉｍｉｎｉｓ ＨＡＷ−ＥＢ３、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＡＮＡ−３、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＭＲ−４、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＭＲ−７、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．Ｗ３−１８−１、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｗｏｏｄｙｉ ＡＴＣＣ ５１９０８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ ２３８７７、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｃｉｔｒｉ ｓｔｒ．３０６、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｓｔｒ．８００４、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｓｔｒ．Ｂ１００、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｓｔｒ．ＡＴＣＣ ３３９１３、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｓｔｒ．８５−１０、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ ＫＡＣＣ１０３３１、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ ＭＡＦＦ ３１１０１８、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ ＢＬＳ２５６、Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ ９ａ５ｃ、Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ Ａｎｎ−１、Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ Ｄｉｘｏｎ、Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ Ｍ１２、Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ Ｍ２３、およびＸｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ Ｔｅｍｅｃｕｌａ１。
以前の報告は、様々な生物の炭化水素産生能力を特徴付けることを試みたもので、これらの報告を確認することはできなかった(例えば、Jones et al., J. Gen. Microbiol., 59: 145-152 (1969), Ladygina et al., Process Biochemistry, 41:1001-1014 (2006)参照）。生物が非イソプレノイド型炭化水素を産生する能力についてはほとんど出版されていないが、本明細書で記載した種類のオレフィンを産生することが文献に示された生物は４種類あり、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕs種および最近配列決定された様々なＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓを含むＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種である(Tornabene et al., Can. J. Microbiol., 24: 525-532 (1978); Suen et al., Journal of Industrial Microbiology, 2: 337-348 (1988); Morrison et al., J. Bacteriol., 108: 353-358 (1971); van der Meer et al., Org. Geochem., 30: 1585-1587 (1999); Albro et al., Biochemistry, 8: 394-404 (1969); Philips et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 52: 933-938 (2002))。
生物情報学的検索は、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ（Ｒ５５１−３およびＫ２７９ａ）、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓおよびＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓにおいて４種のｏｌｅ遺伝子を独立して同定した。さらに、これらの生物からの炭化水素（例えば、オレフィン）の産生を確認した。具体的に、これらの生物のいくつかのＯｌｅタンパク質の炭化水素産生能力を試験した。炭化水素を産生することが知られている２種類の生物および炭化水素を産生することは報告されていないが、生物情報学的分析で同定された２種類の生物を選択し、Ｅ．ｃｏｌｉで発現したときの炭化水素産生能力を試験した。
実施例６は、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｘａｎｏｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓおよびＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓのＯｌｅＡ、ＯｌｅＣおよびＯｌｅＤタンパク質配列は、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍなどの宿主において発現したとき、炭化水素を産生する機能を果たすことを示している。さらに、Ｐｌｅｓｉｏｃｙｓｔｉｓ ｐａｃｉｆｉｃａのＯｌｅＣタンパク質配列はまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｏｌｅＡおよびｏｌｅＤと共に発現すると炭化水素を産生する。
これらの遺伝子がＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａに炭化水素産生能力を付与することを確認するために、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａの炭化水素産生株においてｏｌｅＡ、ｏｌｅＣおよびｏｌｅＤの欠損突然変異を作製した。ｏｌｅＡが欠落したＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａの欠損突然変異体は炭化水素を産生せず、ｏｌｅＣまたはｏｌｅＤが欠落しているＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａの欠損突然変異体は炭化水素を産生しないが、代わりに脂肪族ケトンを産生する。
生物情報学を使用して、各Ｏｌｅタンパク質の保存領域を同定することによってＯｌｅアミノ酸モチーフを設計することができる。これらのアミノ酸モチーフは、タンパク質のアラインメントの後、タンパク質配列を視覚的に検査することによって設計することができる。これらのアミノ酸モチーフはその後、Ｏｌｅタンパク質として類似の生物学的機能を有するタンパク質を同定するために使用することができる。当業界で周知のいくつかのプログラムは、アミノ酸モチーフを使用して機能的タンパク質のファミリーに属するタンパク質を同定することができる。例えば、このような公的に利用可能な１つのプログラムは、http://motif.genome.jp/motif2.html（実施例７参照）である。
実験データに基づいて、４種類のｏｌｅ遺伝子すべてを含有する生物が最も炭化水素産生能力を有する可能性があることが予測された。したがって、アミノ酸モチーフは、４種類のＯｌｅタンパク質すべてを含有する６７種類の生物（例えば、表１参照）のＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣおよびＯｌｅＤタンパク質配列すべてをまとめることによって創出した。ＯｌｅＢＣタンパク質などのタンパク質融合物のために、ＯｌｅＢ部分はＯｌｅＢタンパク質配列とアラインし、ＯｌｅＣ部分はＯｌｅＣタンパク質配列とアラインした。部分的なゲノム配列または可能性のあるゲノム再結合を有する生物は表１には含まれていないので、したがって、これらのアミノ酸モチーフを設計するためには使用しなかった。４種類のｏｌｅ遺伝子すべてを含有するこれら６７種類の生物の保存領域に基づいて、これらのアミノ酸モチーフを含有するその他のポリペプチド配列が機能的Ｏｌｅタンパク質であり得ることが予測される。４種類のｏｌｅ遺伝子を含有する６７種類の生物から設計されたアミノ酸モチーフを表３〜６に示す。示したモチーフすべてにおいて、下付の数字はモチーフ内のアミノ酸の位置を示す。Ｘは任意のアミノ酸を表し（例えば、任意の天然に生じるアミノ酸）、括弧付きのものは指示した位置におけるアミノ酸残基の選択を反映している。例えば、［ＬＦ］１は残基位置１におけるＬまたはＦのいずれかを意味している。
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他のアミノ酸モチーフは、これらの生物がまた４種類のｏｌｅ遺伝子すべてを含有することを示した生物情報学的データと組み合わせて、炭化水素を産生する生物を同定した出版文献をさらに考察することによって開発した。さらに、これらのモチーフは、４種類のｏｌｅ遺伝子すべてについて試験した特定の生物が炭化水素を産生することを示した実験的データを使用して開発した。これらのアミノ酸モチーフを表７〜９に示す。
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最後に、他のアミノ酸モチーフは、ｏｌｅ遺伝子がＥ．ｃｏｌｉにおいて異種的に発現し、炭化水素産生において役割を担っていることが確認された生物のＯｌｅタンパク質配列をアラインすることによって開発した（例えば、実施例６参照）。これらのアミノ酸モチーフを表１０〜１２に示す。
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本発明は、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣまたはＯｌｅＤアミノ酸モチーフ配列を含むポリペプチドをコードする単離核酸を対象とする。例えば、単離核酸は、配列番号６４〜７４および９１〜１３３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることができる。
単離核酸は、ＯｌｅＡアミノ酸モチーフ配列を含むポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号６４〜６９、９８〜１０２および１１６〜１２０からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることができる。単離核酸は、ＯｌｅＢアミノ酸モチーフ配列を含むポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号９１〜９７からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることができる。単離核酸は、ＯｌｅＣアミノ酸モチーフ配列を含むポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号７２〜７４、１０３〜１０８および１２１〜１２６からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることができる。単離核酸は、ＯｌｅＤアミノ酸モチーフ配列を含むポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号７０、７１、１０９〜１１５および１２７〜１３３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることができる。
単離核酸は、複数のＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣまたはＯｌｅＤアミノ酸モチーフ配列を含むポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、１個、２個、３個または４個のＯｌｅアミノ酸モチーフ配列を含むポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、ＯｌｅＢアミノ酸モチーフ配列およびＯｌｅＣアミノ酸モチーフ配列を含むポリペプチドをコードすることができる。
あるいは、単離核酸は、Ｏｌｅアミノ酸モチーフ配列を含む複数のポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドをコードすることができ、第１および第２のポリペプチドはそれぞれＯｌｅアミノ酸モチーフ配列を含むか、または第１および第２のポリペプチドはそれぞれ、配列番号６４〜７４および９１〜１３３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。単離核酸は、第１のポリペプチド、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドをコードすることができ、第１、第２および第３のポリペプチドはそれぞれＯｌｅアミノ酸モチーフ配列を含む。例えば、単離核酸は、第１のポリペプチド、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドをコードすることができ、第１、第２および第３のポリペプチドはそれぞれ、配列番号６４〜７４および９１〜１３３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。単離核酸は、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドをコードすることができ、第１、第２、第３および第４のポリペプチドはそれぞれＯｌｅアミノ酸モチーフ配列を含む。例えば、単離核酸は、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドをコードすることができ、第１、第２、第３および第４のポリペプチドはそれぞれ、配列番号６４〜７４および９１〜１３３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、単離核酸は、Ｏｌｅアミノ酸モチーフ配列を含む１５００個以下のアミノ酸残基のポリペプチドをコードする。例えば、単離核酸は、配列番号６４〜７４および９１〜１３３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む１５００個以下のアミノ酸残基のポリペプチドをコードすることができる。別の実施形態では、第１および第２のポリペプチドはそれぞれ、１５００個以下のアミノ酸残基であり、第１、第２および第３のポリペプチドはそれぞれ、１５００個以下のアミノ酸残基であり、第１、第２、第３および第４のポリペプチドはそれぞれ、１５００個以下のアミノ酸残基である。
ｏｌｅ遺伝子の生物情報学的分析によって、これらの遺伝子はまるでオペロン内のように、同方向に転写される５０００から１００００塩基対の領域内でしばしば見い出されることが明らかになった。これらの遺伝子はまた、生物内で２つ１組で見い出された。これらの組合せには、ＯｌｅＢとＯｌｅＣとのタンパク質融合物（本明細書ではＯｌｅＢＣと称する）が含まれる。例えば、ｏｌｅＢＣ遺伝子融合物は、前述の６７種の生物の７種：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓの両種、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｎｅｎｓ、Ｃｏｎｇｒｅｇｉｂａｃｔｅｒ ｌｉｔｏｒａｌｉｓおよびＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓで認められた。
１個または複数のｏｌｅ遺伝子（複数可）を含有する生物を同定することによって、この生物はまた天然に炭化水素を産生することが示されるだろう。生物情報学的技術を使用して、これらの遺伝子ファミリーに属する遺伝子を含有するその他の配列決定された生物を同定した（例えば、表１および２参照）。これらの遺伝子は、それらの宿主生物に、ならびにその他の宿主生物で発現するときはその他の宿主に炭化水素産生を付与するために使用することができる。当業者であれば、付加されたｏｌｅＡ、ｏｌｅＢ、ｏｌｅＣ、ｏｌｅＤおよびｏｌｅＢＣ配列は容易にクローニングされ、炭化水素および炭化水素中間体の形成に使用され得ることを理解するであろう。本明細書で開示した方法を使用して同定されたＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤおよびＯｌｅＢＣタンパク質の例のリストは表１および２に見い出すことができる。当業者であれば、表１および２に記載したＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤおよびＯｌｅＢＣタンパク質配列の遺伝子配列を同定または推定することができよう。
本発明は、（ａ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列、（ｂ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列のホモログ、（ｃ）１個または複数の保存的アミノ酸置換を含むＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列の保存的変異体、および（ｄ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする単離核酸を対象とする。
例えば、単離核酸は、（ａ）１個または複数の保存されたアミノ酸置換を含む配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７；（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７のホモログ、（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７の保存的変異体および（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７と少なくとも３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有する配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。
単離核酸は、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。好ましくは、単離核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、および配列番号８８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。
単離核酸は、ＯｌｅＡアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号１２、配列番号１８および配列番号１５０〜２２９からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。好ましくは、単離核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号１２および配列番号１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。
単離核酸は、ＯｌｅＢアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号１０および配列番号２３０〜３２６らなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。好ましくは、単離核酸は、配列番号１０を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアミノ酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。
単離核酸は、ＯｌｅＣアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号６、配列番号１４、配列番号２０、配列番号８８および配列番号３２７〜４０２からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。好ましくは、単離核酸は、配列番号６、配列番号１４、配列番号２０および配列番号８８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。
単離核酸は、ＯｌｅＤアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号８、配列番号１６、配列番号２２、配列番号１４２〜１４９および配列番号４０３〜４６４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。好ましくは、単離核酸は、配列番号８、配列番号１６および配列番号２２からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。
単離核酸は、ＯｌｅＢＣアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号１３５〜１４１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。
単離核酸は、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列のホモログであるアミノ酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７のホモログからなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。好ましくは、単離核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、および配列番号８８のホモログからなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。
単離核酸は、ＯｌｅＡのホモログであるアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号１２、配列番号１８および配列番号１５０〜２２９のホモログからなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。好ましくは、単離核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号１２および配列番号１８のホモログからなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。
単離核酸は、ＯｌｅＢのホモログであるアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号１０および配列番号２３０〜３２６のホモログからなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。好ましくは、単離核酸は、配列番号１０のホモログを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。
単離核酸は、ＯｌｅＣのホモログであるアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号６、配列番号１４、配列番号２０、配列番号８８および配列番号３２７〜４０２のホモログからなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。好ましくは、単離核酸は、配列番号６、配列番号１４、配列番号２０および配列番号８８のホモログからなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。
単離核酸は、ＯｌｅＤのホモログであるアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号８、配列番号１６、配列番号２２、配列番号１４２〜１４９および配列番号４０３〜４６４のホモログからなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。好ましくは、単離核酸は、配列番号８、配列番号１６および配列番号２２のホモログからなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。
単離核酸は、ＯｌｅＢＣのホモログであるアミノ酸配列を含む、本質的に構成されるまたは構成されるポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号１３５〜１４１のホモログからなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。
ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣタンパク質のホモログは、例えば、炭化水素合成酵素活性に関して、実質的にＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣタンパク質のように機能的に働くものである。例えば、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣタンパク質およびＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣタンパク質ホモログは、類似のアミノ酸配列を必ずしも有する必要はない。しかし、それらは類似の炭化水素合成酵素活性を有する。
２種類の配列の間の「相同性」の計算は、以下の通りに実施することができる。配列を最適な比較のためにアラインする（例えば、最適なアラインメントのためにギャップを第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入することができ、比較のために非相同な配列は無視することができる）。好ましい実施形態では、比較のためにアラインする参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも約３０％、好ましくは約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％である。その後、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められているときは、その分子はその位置で同一である（本明細書では、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同等である）。２種類の配列の間のパーセント同一性は、２種類の配列の最適なアラインメントのために導入することが必要なギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一位置数の関数である。
単離核酸は、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列の保存的変異体であるアミノ酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７の保存的変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。好ましくは、単離核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、および配列番号８８の保存的変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。
単離核酸は、ＯｌｅＡアミノ酸配列の保存的変異体であるアミノ酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号１２、配列番号１８および配列番号１５０〜２２９の保存的変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。好ましくは、単離核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号１２および配列番号１８の保存的変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。
単離核酸は、ＯｌｅＢアミノ酸配列の保存的変異体であるアミノ酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号１０および配列番号２３０〜３２６の保存的変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。好ましくは、単離核酸は、配列番号１０の保存的変異体であるアミノ酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。
単離核酸は、ＯｌｅＣアミノ酸配列の保存的変異体であるアミノ酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号６、配列番号１４、配列番号２０、配列番号８８および配列番号３２７〜４０２の保存的変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。好ましくは、単離核酸は、配列番号６、配列番号１４、配列番号２０および配列番号８８の保存的変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。
単離核酸は、ＯｌｅＤアミノ酸配列の保存的変異体であるアミノ酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号８、配列番号１６、配列番号２２、配列番号１４２〜１４９および配列番号４０３〜４６４の保存的変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。好ましくは、単離核酸は、配列番号８、配列番号１６および配列番号２２の保存的変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。
単離核酸は、ＯｌｅＢＣアミノ酸配列の保存的変異体であるアミノ酸を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、配列番号１３５〜１４１の保存的変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。
本明細書では、ポリペプチドＸの「変異体(variant)」とは、１個または複数のアミノ酸残基が変化しているペプチドＸのアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。変異体は、保存的変化または非保存的変化を有していてよい。生物学的活性に影響を及ぼさずにどのアミノ酸残基を置換、挿入または欠失することができるかを決定する規準は、当業界で周知のコンピュータプログラム、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用して見い出すことができる。
ポリヌクレオチドの配列の文脈で使用したとき、「変異体」という用語は、遺伝子の変異体またはそのコード配列に関連したポリヌクレオチド配列を包含することができる。この定義にはまた、例えば、「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」または「多形」変異体を含めることができる。スプライス変異体は、参照ポリヌクレオチドと著しい同一性を有することができるが、一般的に、ｍＲＮＡプロセシング中のエキソンの選択的スプライシングによってポリヌクレオチドの数が多いか、または少ない。対応するポリペプチドは、機能的ドメインが追加されているか、またはドメインが欠如している。種の変異体とは、種によって変化するポリヌクレオチド配列である。得られたポリペプチドは一般的に、互いに対して著しいアミノ酸同一性を備えている。多形変異体とは、所与の種の個体間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変異(variation)のことである。
保存されたアミノ酸置換は、表１３に示した任意のアミノ酸置換であり得る。具体的に、保存されたアミノ酸置換は、アラニンからＤ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、ベータ−Ａｌａ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｄ−Ｃｙｓ；アルギニンからＤ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、ホモ−Ａｒｇ、Ｄ−ホモ−Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ；アスパラギンからＤ−Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ；アスパラギン酸からＤ−Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ；システインからＤ−Ｃｙｓ、Ｓ−Ｍｅ−Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ；グルタミン酸からＤ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ；グリシンからＡｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｄ−Ｐｒｏ、ｂ−Ａｌａ、Ａｃｐ；イソロイシンからＤ−Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｄ−Ｍｅｔ；ロイシンからＤ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｄ−Ｍｅｔ；リシンからＤ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、ホモ−Ａｒｇ、Ｄ−ホモ−Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ；メチオニンからＤ−Ｍｅｔ、Ｓ−Ｍｅ−Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、フェニルアラニンからＤ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｄｏｐａ、Ｈｉｓ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、トランス−３，４または５−フェニルプロリン、シス−３，４または５−フェニルプロリン；プロリンからＤ−Ｐｒｏ、Ｌ−１−チオアゾリジン−４−カルボン酸、Ｄ−またはＬ−１−オキサゾリジン−４−カルボン酸；セリンからＤ−Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、アロ−Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｍｅｔ（Ｏ）、Ｄ−Ｍｅｔ（Ｏ）、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｄ−Ｃｙｓ；トレオニンからＤ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、アロ−Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｍｅｔ（Ｏ）、Ｄ−Ｍｅｔ（Ｏ）、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ；チロシンからＤ−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｄｏｐａ、Ｈｉｓ、Ｄ−Ｈｉｓ；およびバリンからＤ−Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｄ−Ｍｅｔからなる群から選択することができる。
Figure 0005912251
Ｏｌｅタンパク質の保存的変異体は、１個または複数の保存されたアミノ酸置換を含むことができる。例えば、保存的変異体は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０個の保存されたアミノ酸置換を有することができる。好ましい実施形態では、保存的変異体は、約５０個以下の保存されたアミノ酸置換を有する。例えば、保存的変異体は、約３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０個の保存されたアミノ酸置換を有することができる。配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７の保存的変異体は、アミノ酸置換を有さないそれぞれのアミノ酸配列と実質的に同じように機能的に作用するものである。活性を評価するために、本明細書で挙げたアッセイのいずれか１つを使用することができる。いくつかの例において、ＯｌｅＡタンパク質の保存的変異体は、炭化水素合成酵素活性、例えば、アシル縮合活性、脂肪族ケトン合成酵素活性および／またはオレフィン合成酵素活性について測定することができる。本明細書では、「合成酵素」という用語は、合成プロセスを触媒する酵素を意味する。本明細書では、合成酵素という用語には、シンターゼ、シンテターゼおよびリガーゼが含まれる。
その他の例では、ＯｌｅＣおよびＯｌｅＤの保存的変異体は、本明細書で記載した活性を測定することができる。保存的変異体は、タンパク質の活性が維持される限り、アミノ酸配列中において、例えば、約１個の保存的アミノ酸置換、２個のアミノ酸置換、３個のアミノ酸置換、４個のアミノ酸置換または５個以上のアミノ酸置換を有することができる。
好ましくは、単離核酸は、ＡｌａからＣｙｓ、ＧｌｙまたはＳｅｒ；ＡｒｇからＩｌｅ、Ｌｙｓ、ＭｅｔまたはＯｒｎ；ＡｓｎからＡｓｐ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＨｉｓ；ＡｓｐからＡｓｎ、ＧｌｎまたはＧｌｕ；ＣｙｓからＭｅｔ、ＳｅｒまたはＴｈｒ；ＧｌｎからＡｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕ；ＧｌｕからＡｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｎ；ＧｌｙからＡｃｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎまたはＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕ、ＭｅｔまたはＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅ、ＭｅｔまたはＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、ＭｅｔまたはＯｒｎ；ＭｅｔからＣｙｓ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌ；ＰｈｅからＨｉｓ、Ｌ−Ｄｏｐａ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、３−フェニルプロリン、４−フェニルプロリンまたは５−フェニルプロリン；ＰｒｏからＬ−１−チオアゾリジン−４−カルボン酸またはＤ−またはＬ−１−オキサゾリジン−４−カルボン酸；ＳｅｒからＣｙｓ、ＭｅｔまたはＴｈｒ；ＴｈｒからＭｅｔ、ＳｅｒまたはＶａｌ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＬ−Ｄｏｐａ、ＨｉｓまたはＰｈｅおよびＶａｌからＩｌｅ、ＬｅｕまたはＭｅｔからなる群から選択された１個または複数の保存されたアミノ酸置換を含む、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、および配列番号８８の保存的変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、保存的変異体は、元の配列と比較して１個または複数の保存されたアミノ酸置換を含み、まだその活性を保持している。例えば、保存的変異体は、元の親タンパク質の生物学的活性の少なくとも約１０％、あるいは、親タンパク質の生物学的活性の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％を保持することができる。いくつかの好ましい実施形態では、保存的変異体は、元の親タンパク質の生物学的活性の少なくとも約５０％を保持する。保存的変異体の保存的アミノ酸置換は、タンパク質のいかなるドメインにおいても生じることができる。別の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、親タンパク質と比較したとき、生物学的活性の増強を生じることができる。例えば、保存的変異体は、元の親タンパク質の生物学的活性の少なくとも約１００％、あるいは、元の親タンパク質の生物学的活性の少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％または少なくとも約１０００％の生物学的活性を有することができる。
単離核酸は、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣと少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。単離核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有する配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。好ましくは、単離核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、および配列番号８８と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有する配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。
単離核酸は、ＯｌｅＡと少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。単離核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号１２、配列番号１８および配列番号１５０〜２２９と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有する配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。
単離核酸は、ＯｌｅＢと少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。単離核酸は、配列番号１０および配列番号２３０〜３２６と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有する配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。
単離核酸は、ＯｌｅＣと少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。単離核酸は、配列番号６、配列番号１４、配列番号２０、配列番号８８および配列番号３２７〜４０２と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有する配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。
単離核酸は、ＯｌｅＤと少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。単離核酸は、配列番号８、配列番号１６、配列番号２２、配列番号１４２〜１４９および配列番号４０３〜４６４と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有する配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。
単離核酸は、ＯｌｅＢＣと少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。単離核酸は、配列番号１３５〜１４１と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有する配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。
Ｏｌｅタンパク質をコードするアミノ酸配列と約３５％と約１００％との間の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードする単離核酸も本明細書で提供する。例えば、単離核酸は、Ｏｌｅタンパク質をコードするアミノ酸配列と少なくとも約３５％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドをコードすることができる。
炭化水素および炭化水素中間体を形成する核酸およびアミノ酸配列の特定の実施形態を開示するが、類似の構造特性を有する配列がその他の生物から単離できることを理解されたい。これらの新たに単離された配列の炭化水素合成酵素活性を測定することができる（具体的な関連配列の非限定的な例のリストについては表１および２を参照のこと）。さらに、本明細書で開示した核酸およびアミノ酸配列のその他の機能的に同等な形態は、例えば、部位特異的変異誘発、Ｍ１３プライマー変異誘発、エラープローンＰＣＲ、セクシュアルＰＣＲ、ＤＮＡ合成またはＤＮＡシャッフリングを含む従来の分子生物学的技術を使用して容易に同定および／または生成できることが理解されよう。これらの技術の多くの詳細は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor, New York (2000)に挙げられている。
したがって、構造的に関連のある配列および相同的(homologous)配列に加えて、本発明はまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、および／または配列番号１３５〜４６４と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を包含する。他の実施形態では、本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、および／または配列番号１３５〜４６４と少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を包含する。
ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＢＣおよびＯｌｅＤと構造的および機能的類似性を保持した配列は、様々な公知の方法によって同定することができる。このような一方法には、公知の配列（複数可）との配列アラインメントのためのゲノム配列のスクリーニングが関与する。比較のために配列をアラインする方法は当業界では周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは、Smith et al., Adv. Appl. Math., 2: 482 (1981); Needleman et al., J. Mol. Biol., 48: 443 (1970); Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444 (1988); Higgins et al., Gene, 73: 237 244 (1988); Higgins & Sharp, CABIOS, 5: 151-153 (1989); Corpet et al., Nucleic Acids Research, 16: 10881-10890 (1988); Huang et al., CABIOS, 8: 155-165 (1992);およびPearson et al., Methods in Molecular Biology, 24: 307-331 (1994)に記載されている。Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)は、配列アラインメント方法および相同性の算出を詳細に記載している。
好ましい実施形態では、２種類のアミノ酸配列のパーセント相同性は、前述のＮｅｅｄｌｅｍａｎ、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムに組み込まれているアルゴリズムを使用して、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクス、およびギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４および長さ重み１、２、３、４、５もしくは６を用いて決定する。さらに他の好ましい実施形態では、２種類のヌクレオチド配列のパーセント相同性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスおよびギャップ重み４０、５０、６０、７０もしくは８０および長さ重み１、２、３、４、５もしくは６を用いて決定する。パラメータの特に好ましい組合せ（および分子が特許請求の範囲の相同性制限内にあるかどうかを決定するためにどのパラメータを適用すべきか医師が不明である場合、使用すべきであるパラメータ）は、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスで、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、フレームシフトギャップペナルティ５を用いる。
本発明はまた、複数のポリペプチドをコードする単離核酸を提供し、このポリペプチドはそれぞれ、（ａ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列、（ｂ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列のホモログ、（ｃ）１個または複数の保存的アミノ酸置換を含むＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列の保存的変異体、および（ｄ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。単離核酸は、第１および第２のポリペプチドをコードすることができ、この第１および第２のポリペプチドはそれぞれ、（ａ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列、（ｂ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列のホモログ、（ｃ）１個または複数の保存的アミノ酸置換を含むＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列の保存的変異体、および（ｄ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。例えば、単離核酸は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドをコードすることができ、この第１および第２のポリペプチドはそれぞれ、（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７；（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７；（ｃ）１個または複数の保存されたアミノ酸置換を含む配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７の保存的変異体および、（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有する配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。
単離核酸は、第１、第２および第３のポリペプチドをコードすることができ、この第１、第２および第３のポリペプチドはそれぞれ、（ａ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列、（ｂ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列のホモログ、（ｃ）１個または複数の保存的アミノ酸置換を含むＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列の保存的変異体、および（ｄ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。例えば、単離核酸は、第１のポリペプチド、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドをコードすることができ、この第１、第２および第３のポリペプチドはそれぞれ、（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７；（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７；（ｃ）１個または複数の保存されたアミノ酸置換を含む配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７の保存的変異体および、（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有する配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。
単離核酸は、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドをコードすることができ、この第１、第２、第３および第４のポリペプチドはそれぞれ、（ａ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列、（ｂ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列のホモログ、（ｃ）１個または複数の保存的アミノ酸置換を含むＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列の保存的変異体、および（ｄ）ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣアミノ酸配列と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。例えば、単離核酸は、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドをコードすることができ、この第１、第２、第３および第４のポリペプチドはそれぞれ、（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７；（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７；（ｃ）１個または複数の保存されたアミノ酸置換を含む配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７の保存的変異体および、（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有する配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。
単離核酸は、約１５００個のアミノ酸残基、約１４００個のアミノ酸残基、約１３００個のアミノ酸残基、約１２００個のアミノ酸残基、約１１００個のアミノ酸残基、約１０００個のアミノ酸残基、約９００個のアミノ酸残基、約８００個のアミノ酸残基、約７００個のアミノ酸残基、約６００個のアミノ酸残基、約５００個のアミノ酸残基、約４００個のアミノ酸残基または約３００個のアミノ酸残基を有するポリペプチドをコードすることができる。好ましい実施形態では、単離核酸は、約１５００個以下（例えば、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００または２００個以下）のアミノ酸残基を有するポリペプチドをコードする。
単離核酸は、少なくとも約１００個のアミノ酸残基を有するポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離核酸は、少なくとも約２００個のアミノ酸残基、少なくとも２５０個のアミノ酸残基、または少なくとも３００個のアミノ酸残基を有するポリペプチドをコードすることができる。あるいは、単離核酸は、１００個以上（例えば、１００、１５０、２００または２５０個以上）のアミノ酸残基を有するポリペプチドをコードすることができる。単離核酸は、約２００個のアミノ酸残基と約１５００個のアミノ酸残基の間、約３００個のアミノ酸残基と約１０００個のアミノ酸残基の間、約５００個のアミノ酸残基と約８００個のアミノ酸残基の間、または約６００個のアミノ酸残基と約１０００個のアミノ酸残基の間を有するポリペプチドをコードすることができる。
単離核酸は、細菌、植物、昆虫、酵母、真菌または動物（例えば、哺乳類）から単離することができる。核酸が細菌から単離されるとき、細菌は細菌のいかなる属であってもよい。例えば、細菌は、Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ、Ｃｏｎｇｒｅｇｉｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｂａｃｉｌｌｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｇｅｍｍａｔａ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｈｅｌｌａ、Ｊａｎｎａｓｃｈｉａ、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ、Ｍａｒｉｃａｕｌｉｓ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ、Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｏｐｉｔｕｔｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｌｅｓｉｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ、Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、およびＸｙｌｅｌｌａからなる群から選択された属であってよい。
より具体的には、核酸は、Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＦＢ２４、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｎｅｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｍｂｉｆａｒｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｏｋｌａｈｏｍｅｎｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．３８３、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｋｕｅｎｅｎｉａ ｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｃｏｎｇｒｅｇｉｂａｃｔｅｒ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｂａｃｉｌｌｕｍ ａｌｋｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｍｍａｔａ ｏｂｓｃｕｒｉｇｌｏｂｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｂｅｍｉｄｊｉｅｎｓｉｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｌｏｖｌｅｙｉ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＦＲＣ−３２、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｕｒａｎｉｕｍｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｈａｈｅｌｌａ ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ、Ｊａｎｎａｓｃｈｉａ ｓｐ．ＣＣＳ１、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ ａｒａｎｅｏｓａ、Ｍａｒｉｃａｕｌｉｓ ｍａｒｉｓ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｌｇｉｃｏｌａ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｑｕａｅｏｌｅｉ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ ｓｐ．ＰＥ３６、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＧＰ１、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｎｂａａｌｅｎｉｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔｕｓ ｔｅｒｒａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＪＤＲ−２、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｓ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｉｓ、Ｐｌｅｓｉｏｃｙｓｔｉｓ ｐａｃｉｆｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ａｔｌａｎｔｉｃａ、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ ｉｎｇｒａｈａｍｉｉ、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＣＮＰＴ３、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｂａｌｔｉｃａ、Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ ｎｕｂｉｎｈｉｂｅｎｓ ＩＳＭ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ ＳＢ２Ｂ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ ＯＳ１５５、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂｅｎｔｈｉｃａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｈａｌｉｆａｘｅｎｓｉｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｌｏｉｈｉｃａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｅａｌｅａｎａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｅｄｉｍｉｎｉｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＡＮＡ−３、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＭＲ−４、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＭＲ−７、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．Ｗ３−１８−１、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｗｏｏｄｙｉ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ、およびＸｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａからなる群から選択されたいかなる細菌から単離されてもよい。好ましい実施形態では、核酸は、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ（例えば、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＡＴＣＣ １７６７９、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＡＴＣＣ １７６７４、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＡＴＣＣ １７４４５、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＡＴＣＣ １７６６６、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ Ｋ２７９ａ、またはＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ Ｒ５５１−３）の株から単離される。
ゲノム配列が対象とする特定の種のために利用できないとき、標準ＰＣＲ法を使用して関連のある配列をゲノムＤＮＡから増幅することができる。簡単に説明すると、ゲノムＤＮＡは、様々な周知の方法のいずれか１つによって対象とする細胞から抽出する。Sambrook et al.、前述、およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences (1989)には、ＤＮＡの単離方法が記載されている。一般的に、任意の生物をこのようなＤＮＡの原料として使用することができる。抽出したＤＮＡは、次にポリメラーゼ連鎖反応を実施するための鋳型として使用する。変性したプライマーをＰＣＲのために使用することが必要であり得る。ＰＣＲの方法および条件は、例えば、PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (eds.), Academic Press, Inc., San Diego, California, 1990に記載されている。
増幅プライマーの選択は、増幅すべき特定の遺伝子に応じてなされる。使用するプライマーの具体例を以下の表１４に示す。しかし、これらのプライマーは単なる例に過ぎない。当業者であれば、多くの様々なプライマーがｏｌｅＡ、ｏｌｅＢ、ｏｌｅＣ、ｏｌｅＢＣおよびｏｌｅＤ核酸配列から入手できることを理解するであろう。増幅条件の変化は、長さおよび組成の異なるプライマーおよび単位複製配列を提供するために必要であり得る。このような考慮は当業界では周知で、例えば、PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (eds.), Academic Press, Inc., San Diego, California, 1990に論じられている。
これらの増幅方法によって得られたＰＣＲ産物の配列決定は、増幅された配列の確認を容易にし、様々な種におけるこの配列の天然の変化についての情報を提供するために使用することができる。供給したＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＢＣおよびＯｌｅＤ配列から得られたオリゴヌクレオチドは、このような配列決定方法で使用することができる。密接に関連した相同分子種ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＢＣおよびＯｌｅＤ配列は、開示したＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＢＣおよびＯｌｅＤ配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の配列同一性を共有することができる（例えば、表１および２参照）。
好ましい実施形態では、核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、および配列番号８７からなる群から選択される。
本明細書ではまた、Ｏｌｅタンパク質をコードする１種または複数の単離核酸、Ｏｌｅタンパク質のホモログ、Ｏｌｅタンパク質の保存的変異体、および／またはＯｌｅタンパク質と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有する配列を含む組換え核酸構築物を開示する。組換え核酸構築物の例には、クローニングベクター、発現ベクターまたは合成オペロンが含まれる。
本明細書では、「ベクター」という用語は結合した別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。有用なベクターの１種は、エピソーム（すなわち、染色体外での複製が可能な核酸）である。有用なベクターは、結合した核酸の自己複製および／または発現を可能にするベクターである。作動可能に連結した遺伝子の発現を対象とすることができるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称する。一般的に、組換えＤＮＡ技術で利用される発現ベクターは、ベクター形態で染色体に結合しない環状２本鎖ＤＮＡループを通常意味する「プラスミド」の形態であることが多い。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は同義に使用される。しかし、同等の機能を果たし、今後当業界で公知になる発現ベクターのこのようなその他の形態も含まれる。
クローニングベクターおよび発現ベクターはいずれも、１種または複数の適切な組換え生物においてベクターの複製を可能にするヌクレオチド配列を含有する。クローニングベクターにおいて、この配列は通常、ベクターが組換え生物の染色体とは関係なく複製するのを可能にし、複製起点または自己複製配列のいずれかも含む配列である。様々な細菌およびウイルスの複製起点はよく知られており、ｐＢＲ３２２由来ＣｏｌＥ１レプリコン、Ｐ１５Ａレプリコン、ｐＣｌｏＤＦ１３レプリコン、ｐＫＮ４０２レプリコン、ｐＭＢ１（ｐＵＣ）レプリコン、ｐＳＣ１０１レプリコンおよびＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶおよびＢＰＶウイルス起点が含まれるがそれらだけに限らない。
本明細書で開示した核酸は、単離核酸を含む組換え発現ベクターを使用してタンパク質を生成するために使用することができる。多種多様な発現ベクターを使用することができる。例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、ウイルス、例えば、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス由来のベクターから得られたベクターを含む、プラスミド、染色体由来ベクター、エピソーム由来ベクターおよびウイルス由来ベクター、ならびにそれらの組合せから得られたベクター、例えば、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子要素、例えば、コスミドおよびファージミドから得られたベクター。
一般的に、組換え生物においてポリペプチドを発現するためにポリヌクレオチドを維持し、増殖させ、または発現させるのに適した任意のベクターは、このことに関して発現のために使用することができる。したがって、組換え生物で複製可能で、生存可能なその他の任意のベクターを使用することができる。細菌発現ベクターの非限定的な例には、ｔｒｐ−ｌａｃプロモーターを有するｐＫＫ２２３−３およびｐＴｒｃ ９９Ａ，；ｌａｃプロモーターを有する ｐＵＣ、ｐＴＺ、ｐＳＫおよびｐＧＥＭ；Ｔ７プロモーターを含有するｐＥＴベクターおよびそれらの誘導体；ならびにｐＨＵＢ系のベクター、ｐＰＬｃ系のベクター、いずれもバクテリオファージλρＬプロモーターを含有するｐＫＣ３０、ｐＡＳ１、ｐＲＭ１／ｐＲＭ９ならびにｐＴｒｘＦｕｓが含まれる。他のベクターの例には、ｐＡＴＨ系のベクター、ｐＢＡＤ系のベクター、ｐＢＥｃ系のベクター、ｐＣＡＬ系のベクター、ｐＣＲＴ７系のベクター、ｐＧＡＬ、ｐＧＥＸおよび誘導体、ｐＬＥＸ系のベクター、ｐＭＡＬ系のベクター、ｐＯＳＥＸ系のベクター、ｐＱＥ系のベクター、ｐＲＳＥＴ系のベクターならびにｐＴｒｉＥｘ系のベクターが含まれる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの核酸の発現に適したベクターには、例えば、ｐＡＤ−ＧＡＬ４およびその誘導体、ｐＢｒｉｄｇｅ、ｐＣＭおよびその誘導体、ｐＥＭＢＬＹ系のベクター、ｐＥＳＣおよびその誘導体、ｐＦＬ系のベクター、ｐＳＺ６２、ｐＹＣ２ならびにｐＹＣ６系のベクターならびにＹＩＰ系のプラスミドが含まれる。
適切な核酸配列を、様々な周知の通常通りの技術のいずれかによってベクターに挿入する。一般的に、発現のための核酸配列は、核酸配列および発現ベクターを１種または複数の制限エンドヌクレアーゼで切断し、次にＴ４-ＤＮＡリガーゼを使用して制限断片を一緒に結合することによって発現ベクターに結合させる。制限および連結のための方法は当業界では周知である。この点に関する、および他の技術を使用した発現ベクター構築用の適切な方法はまた、当業界では周知で、前述のSambrook.et al.に非常に詳細に記載されている。これらの他の技術の非限定的な例には、例えば、リコンビナーゼまたはトポイソメラーゼによる核酸配列の組み込みが含まれる。
核酸配列は、ＳＯＥ ＰＣＲ、ＤＮＡ合成、平滑末端連結、または制限酵素部位での連結などの通常の技術によって修飾するか、または一緒に結合させることができる。適切な制限部位が利用できないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用することができる（例えば、Sambrook et al.、前述; Ausubel et al.、前述参照）。
当業者であれば、構成的、誘導的、発生的に調節された、および環境的に調節されたプロモーターを含む数多くのプロモーターが細胞内で機能を果たしており、文献に記載されていることを認識するであろう。特に対象とするのは、適切な組換え生物で機能を果たすプロモーター（転写開始領域とも称される）の使用である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉを組換え生物として使用する場合、使用できるプロモーターの例には、限定はしないが、ラムダファージＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーターならびにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターが含まれる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが宿主の場合、対象とする配列は通常酵母プロモーターの制御下にある。有用な酵母プロモーターの例にはＧＡＬ／ＣＹＣプロモーターが含まれるが限定はされない。
本明細書では触れていない当業者に公知のいかなる適切なプロモーターも、本明細書で記載した本発明において容易に使用することができる。例えば、原核生物および真核生物において遺伝子の発現を制御することが知られているその他のプロモーターを使用することができる。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結部位を含有することができる。ベクターはまた、遺伝子発現の増幅に有用な配列を含有することができる。
本発明は、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む単離核酸を提供する。好ましくは、プロモーターは、誘導的プロモーター、構成的プロモーターまたは細胞特異的プロモーターである。好ましい実施形態では、プロモーターはＴ７プロモーターである。他の好ましい実施形態では、プロモーターはｐＴｒｃプロモーター、ＰｘｙｌＡプロモーター、Ｐｇｒａｃプロモーター、ＧＡＬ１プロモーターまたはＧＡＬ１０プロモーターである。
本明細書では、「作動可能に連結した」という用語は、プロモーターに選択したＤＮＡの発現を制御させるために、選択したヌクレオチド配列（例えば、本明細書で記載したポリヌクレオチドをコードする）がプロモーターの近位にあることを意味する。さらに、プロモーターは、転写および翻訳の方向に関して選択したヌクレオチド配列の上流に位置する。「作動可能に連結した」とは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列（複数可）に結合したとき、ヌクレオチド配列および調節配列（複数可）が遺伝子発現を可能にするような方法で結合することを意味する。
転写終結調節領域は、同様に発現構築物内に形成することができる。転写終結領域は、Ｏｌｅタンパク質配列をコードするベクター配列によって提供することができるか、または転写開始領域に天然に関連している転写終結領域を使用することができる。組換え生物において転写を終結できるいかなる便利な転写終結領域も、本明細書で開示した構築物で使用することができる。発現ベクターおよびクローニングベクターは、構造遺伝子または形質転換細胞を選択するために組換え生物内での発現に必要な調節領域を有する選択マーカーを含有することができ、通常含有する。この遺伝子は、細胞傷害性物質（例えば、抗生物質、重金属または毒素）に対する耐性、栄養要求性宿主に原栄養性を提供する相補性、ウイルス免疫などをもたらすことができる。発現構築物またはそれらの成分を導入する様々な宿主の種類の数に応じて、様々な選択条件が様々な宿主のために使用される１個または複数のマーカーを使用することができる。
適切な選択マーカーの具体的で非限定的な例には、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、グリフォセート、ハイグロマイシン、カナマイシン、メトトレキセート、ナリジクス酸、フレオマイシン、フォスフィノトリシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、スルホニル尿素、アンピシリン／カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン／スペクチノマイシンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。適切な選択マーカーの他の例は、栄養要求性選択マーカー遺伝子、例えば、ヒスチジン選択マーカー遺伝子である。マーカーの具体的な非限定的例には、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ｍｙｃ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、１３グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が含まれるが、それらだけに限らない。好ましくは、単離核酸にはさらに、ポリペプチドをコードする核酸に結合した選択マーカーが含まれる。選択マーカーは、アンピシリン／カルベニシリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性、エリスロマイシン耐性、ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性またはヒスチジン栄養要求性選択マーカー遺伝子であり得る。
さらに、発現ベクターはまた、マーカーとして使用される追加的タンパク質をコードするタンパク質のヌクレオチド配列に作動可能に連結したマーカー配列を含有することができる。その結果は、２個の結合した異なるタンパク質を含むハイブリッドまたは融合タンパク質となる。マーカータンパク質は、例えば、発現ベクターによって産生される組換えタンパク質の免疫学的または酵素的マーカーを提供することができる。さらに、ポリヌクレオチドの末端は、産生されたタンパク質の精製に有用なアミノ酸配列をコードする配列を付加することによって修飾することができる。例えば、特定のクロマトグラフィー法に親和性を与えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含めることができる。タンパク質にこのような親和性精製部分を付加するために様々な方法が考案されてきた。代表的な例は、米国特許第４，７０３，００４号、第４，７８２，１３７号、第４，８４５，３４１号、第５，９３５，８２４号および第５，５９４，１１５号に見い出すことができる。精製部分をコードするヌクレオチド配列を付加するために、当業界で公知の任意の方法を使用することができる（例えば、Sambrook et al.、前述参照）。
特に、本発明は、Ｏｌｅタンパク質またはそれらの変異体およびホモログをコードする１種または複数の単離核酸を含む組換え構築物を提供する。構築物は、配列が前向きまたは逆向きで挿入されたプラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターを含むことができる。組換え構築物はさらに、例えば、配列に作動可能に連結したプロモーターを含む調節配列を含むことができる。多数の適切なベクターおよびプロモーターが知られており、市販されている。一実施形態では、ｐＥＴ−２１ｂ（＋）、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴ６．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターまたは本明細書で記載したベクターのいずれかが使用される。しかし、宿主内で複製が可能で、生存可能である限り、いかなる適切なプラスミドまたはベクターも使用することができる。
本発明は、単離核酸を含むベクターを提供する。例えば、ベクターはプラスミドであってよい。好ましくは、ベクターは、ｐＥＴ２１ｂ（＋）、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１、ｐＡＣＹＣｐＴｒｃ、ｐＣＬ１９２０ｐＴｒｃ、ｐＥＳＣ−ＨＩＳ、ｐＳＵＰ１０４、ｐＭＭ１５２２、ｐＷＨ１５２０およびｐＨＴ０１から選択されたプラスミドである。好ましい実施形態では、ベクターは、ｐＥＴ２１ｂ（＋）、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１、ｐＷＨ１５２０、ｐＨＴ０１、ｐＥＳＣ−ＨＩＳ、ｐＥＴ−２１ｄ（＋）、ｐＥＴＤｕｅｔ−１、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ａ、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸまたはｐＣＬ１９２０ｐＴｒｃから選択されたプラスミドである。
ＯｌｅＡ（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４、および配列番号４７８〜４８７）、ＯｌｅＢ（例えば、配列番号１０および配列番号２３０〜３２６）、ＯｌｅＣ（例えば、配列番号６、配列番号１４、配列番号２０、配列番号８８、および配列番号３２７〜４０２）、ＯｌｅＤ（例えば、配列番号８、配列番号１６、配列番号２２、配列番号１４２〜１４９、および配列番号４０３〜４６４）、ＯｌｅＢＣ（例えば、配列番号１３５〜１４１）、および／またはこれらの配列の変異体およびホモログをコードするそれぞれの核酸の任意の生きた生物の染色体への組み込みを引き起こす組換えＤＮＡ技術によって、それぞれのタンパク質の発現および産生を引き起こすことができる。
単離核酸はまた、最小限、プロモーター、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤもしくはＯｌｅＢＣをコードする１種または複数の単離核酸および組換え生物内で機能する転写終結シグナル配列を含む発現カセットの一部となることができる。プロモーターは、本明細書で記載した種類のいずれか、例えば、誘導的プロモーターまたは構成的プロモーターであってよい。発現カセットはさらに、作動可能に連結した標的化配列または産生するタンパク質の輸送を目的とすることができる輸送もしくは分泌ペプチドコード領域を含むことができる。発現カセットはまた、選択的マーカーおよび／または精製部分をコードする核酸配列をさらに含むことができる。
調節配列、コード配列およびそれらの組合せは、宿主株のゲノムに導入するか、ゲノム内で変化させることができる。いくつかの例では、所望する組換え配列の組換え生物ゲノム配列への組み込みには、抗生物質などの選択マーカーの使用は必要ではない。いくつかの例では、ゲノムの変更には、天然のプロモーター（複数可）を調節に非感受性のプロモーターで置換することによるｏｌｅＡ、ｏｌｅＢ、ｏｌｅＣ、ｏｌｅＢＣまたはｏｌｅＤなどの標的遺伝子の制御配列の変化が含まれる。このことを実施する取り組みは数多くある。例えば、Valle and Flores, Methods Mol. Biol. 267: 113-122 (2006)は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて染色体遺伝子を過剰発現させるＰＣＲをベースにした方法を記載している。他の取り組みは、Costantino et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 100: 15748-15753 (2003)によって開発された技術を使用して染色体に直接特異的変異を創出するために１本鎖オリゴヌクレオチドを使用することに基づいている。この技術は、遺伝子組み換えを増強するためにラムダバクテリオファージからのベータタンパク質の過剰発現を使用することに基づいている。この取り組みの利点は、７０塩基以上の長さの合成オリゴヌクレオチドを点突然変異、挿入および欠失の創出に使用できることである。この方法はクローニング段階を必要としない。さらに、この系は所望する変異の単離にマーカーを必要としないので効率的である。この取り組みは、とりわけ、内在性コード配列、例えば、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤ、ＯｌｅＢＣまたは脂肪酸生合成経路酵素をコードする配列を過剰発現するために有用である。
本発明は、（ａ）ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結した調節配列、（ｂ）ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結した選択マーカー、（ｃ）ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結した精製部分、（ｄ）ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結した分泌配列および（ｅ）ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結した標的化(targeting)配列からなる群から選択された少なくとも１種の追加的核酸配列をさらに含む単離核酸を提供する。
本発明はまた、単離核酸を含む細胞を提供する。特に、細胞は単離核酸または単離核酸を含むベクターを含むことができる。細胞は、当業界で公知の任意の適切な方法を使用して単離核酸で形質転換することができる。あるいは、細胞は、当業界で公知の任意の適切な方法を使用してベクターで形質導入することができる。
本明細書では、「トランスフェクト(transfect)」という用語は、核酸媒介遺伝子輸送による核酸のレシピエント細胞への導入（例えば、発現ベクターによる）を意味する。本明細書では、「形質転換」とは、外来ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞摂取の結果として細胞遺伝子型が変化するプロセスを意味する。これによって、ＲＮＡまたはポリペプチドの組換え形態を発現する形質転換細胞が生じ得る。輸送した遺伝子からのアンチセンス発現の場合、ポリペプチドの天然に生じる形態の発現は中断される。
細胞は酵母細胞、真菌細胞、藻類細胞、動物細胞、昆虫細胞、細菌細胞または植物細胞であってよい。細胞は古細菌細胞であってよい。一実施形態では、細胞は細菌細胞である。
細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈａｍｏｎａｓ、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの属のいずれかの細胞から選択することができる。具体的には、細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞、またはＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ細胞であってよい。さらに、細胞はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ細胞、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ細胞、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ細胞、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ細胞、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ細胞、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｅｓ細胞、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ細胞、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ細胞、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ細胞、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ細胞、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ細胞、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ細胞、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ細胞、またはＭｕｃｏｒ ｍｉｃｈｅｉ細胞であってよい。
好ましい実施形態では、細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ細胞、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ細胞、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞は、Ｂ株、Ｃ株、Ｋ株またはＷ株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞であってよい。細胞はまた、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ細胞、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ細胞、またはａ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞であってよい。
より具体的には、細胞は、Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｆｗ１０９−５、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＦＢ２４、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｎｅｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｍｂｉｆａｒｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｏｋｌａｈｏｍｅｎｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．３８３、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｋｕｅｎｅｎｉａ ｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｃｏｎｇｒｅｇｉｂａｃｔｅｒ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｂａｃｉｌｌｕｍ ａｌｋｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｍｍａｔａ ｏｂｓｃｕｒｉｇｌｏｂｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｂｅｍｉｄｊｉｅｎｓｉｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｌｏｖｌｅｙｉ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＦＲＣ−３２、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｕｒａｎｉｕｍｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｈａｈｅｌｌａ ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ、Ｊａｎｎａｓｃｈｉａ ｓｐ．ＣＣＳ１、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ ａｒａｎｅｏｓａ、Ｍａｒｉｃａｕｌｉｓ ｍａｒｉｓ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｌｇｉｃｏｌａ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｑｕａｅｏｌｅｉ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ ｓｐ．ＰＥ３６、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＧＰ１、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｎｂａａｌｅｎｉｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔｕｓ ｔｅｒｒａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＪＤＲ−２、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｓ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｕｍｏｎｄｉｉ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｉｓ、Ｐｌｅｓｉｏｃｙｓｔｉｓ ｐａｃｉｆｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ａｔｌａｎｔｉｃａ、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ ｉｎｇｒａｈａｍｉｉ、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＣＮＰＴ３、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｂａｌｔｉｃａ、Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ ｎｕｂｉｎｈｉｂｅｎｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂｅｎｔｈｉｃａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｈａｌｉｆａｘｅｎｓｉｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｌｏｉｈｉｃａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｅａｌｅａｎａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｅｄｉｍｉｎｉｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＡＮＡ−３、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＭＲ−４、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＭＲ−７、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．Ｗ３−１８−１、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｗｏｏｄｙｉ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ、およびＸｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａの任意の株であってよい。
所望により、細胞は動物細胞であってよい。例えば、動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃｖ１細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞およびＰＣ１２細胞からなる群から選択することができる。
本発明はまた、脂肪酸生合成経路に関連した遺伝子に変更を含む細胞を提供する。本明細書では、「脂肪酸生合成経路」という用語は、脂肪酸を生成する生合成経路を意味する。脂肪酸生合成経路には、本明細書で記載したように、脂肪酸を生成するために操作することができ、いくつかの実施形態では、所望する炭素鎖の特性を備えた脂肪酸を生成するために他の酵素と共に発現することができる脂肪酸酵素が含まれる。
本明細書では、「脂肪酸酵素」とは、脂肪酸酵素生合成に関与する任意の酵素を意味する。脂肪酸酵素は、脂肪酸を生成するために宿主細胞で発現または過剰発現することができる。脂肪酸酵素の非限定的例には、脂肪酸合成酵素およびチオエステラーゼが含まれる。
例えば、細胞は、アシル−Ｃｏａ合成酵素（ＥＣ６．２．１．３、２．３．１．８６）、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、３．１．１．１５、３．１．２．１４）、アセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２、６．３．４．１４）、アシルキャリアタンパク質、ピルビン酸脱水素酵素（ＥＣ１．２．４．１）、アルデヒドデカルボニラーゼ（ＥＣ４．１．９９．５）、ベータ−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素（ＥＣ４．２．１．６０）、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］合成酵素Ｉ（ＥＣ２．３．１．４１）、［アシルキャリアタンパク質］Ｓ−マロニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．３９）、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］還元酵素（ＥＣ１．１．１．１００）、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］合成酵素ＩＩＩ（ＥＣ２．３．１．１８０）、エノイル−［アシルキャリアタンパク質］還元酵素（ＥＣ１．３．１．９）、（３Ｒ）−ヒドロキシミリストイルアシルキャリアタンパク質脱水酵素（ＥＣ４．２．１．−）、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）、マロニル−ＣｏＡ脱炭酸酵素（ＥＣ４．１．１．９、４．１．１．４１）、アスパラギン酸１−脱炭酸酵素（ＥＣ４．１．１．１１）、パントテン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．３３）、ピルビン酸脱水素酵素（ＥＣ１．２．４．１）、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．６．１．１）およびそれらの組合せを過剰発現することができる。
脂肪酸アシル鎖を含有する基質を生成するために１種または複数のペプチドを過剰発現することに加えて、細胞はさらに１種または複数の機能的に欠失、突然変異、または減弱したペプチドを有することができる。本明細書では、「減弱する」という用語は弱めるか、抑制するか、または減少させることを意味する。例えば、ポリペプチドは、その活性を抑制するためにポリペプチドを改変することによって（例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を改変することによって）減弱することができる。
例えば、以下の１種または複数を欠失、突然変異、または減弱することができる：酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）、アルコール脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．１、１．２．１．１０）、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］合成酵素ＩＩ（ＥＣ２．３．１．１７９）、ＦａｂＲ転写抑制因子（受入番号ＮＰ＿４１８３９８)、アシル−ＣｏＡ脱水素酵素（ＥＣ１．３．９９．３、１．３．９９．−）、生合成ｓｎ−グリセロール３−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．９４）、乳酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．２８）、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．５４）、アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１５）、ピルビン酸酸化酵素（ＥＣ１．２．２．２）およびホスホトランスアセチラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）。
いくつかの例では、細胞は、脂肪アシル鎖を含有する基質、炭化水素および炭化水素中間体を含む分枝生成物を産生することができる。したがって、細胞は、分枝鎖ケト酸脱水素酵素複合体（ＥＣ１．２．４．４）、分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．４２）、ジヒドロリポアミド脱水素酵素（Ｅ３）（ＥＣ１．８．１．４）、クロトニル−ＣｏＡ還元酵素（ＥＣ１．６．５．５、１．１．１．１）、イソブチリル−ＣｏＡムターゼ、サブユニットＡ（ＥＣ５．４．９９．２）、イソブチリル−ＣｏＡムターゼ、サブユニットＢ（５．４．９９．２）、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＩＩ（ＥＣ２．３．１．１８０）、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＩ（ＥＣ２．３．１．１７９）、アシルキャリアタンパク質（ＮＰ＿８２３４６８）、エノイル−ＣｏＡ還元酵素（ＥＣ１．３．１．３４）、エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ（ＥＣ４．２．１．−）およびそれらの組合せの１個または複数の成分から選択されたペプチドを過剰発現することによって、分枝が増加するように操作することができる。
脂肪酸アシル鎖、炭化水素および炭化水素中間体を含有する基質の飽和レベルは、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］合成酵素Ｉ（ＥＣ２．３．１．４１）、トランス−２−エノイル−ＡＣＰ還元酵素ＩＩ（ＥＣ１．３．１．９）、エノイル−（アシルキャリアタンパク質）還元酵素（ＥＣ１．３．１．９）、トランス−２、シス−３−デカノイル−ＡＣＰイソメラーゼ（４．２．１．１７）、アシル−ＣｏＡ脱水素酵素（ＥＣ１．３．９９．３、１．３．９９．−）およびそれらの組合せから選択されたペプチドを過剰発現するように細胞を操作することによって変更することができる。
炭化水素または炭化水素中間体を産生する細胞の操作に加えて、環境条件、例えば、温度も、産生する炭化水素の種類を変更するために調節することができる。例えば、低温を使用して、炭化水素中の二重結合の数を多くすることができ、高温は高い飽和レベルをもたらすことができる。１９６２年に、ＭａｒｒおよびＩｎｇｒａｈａｍは、Ｅ．ｃｏｌｉによって産生される脂質における飽和の程度に温度が影響を及ぼすことを示唆する文献を発表した（Marr et al., J Bacteriol., 84: 1260-7 (1962)）。低温では、不飽和度の高い脂質の生成が生じ、一方、高温では大量の飽和脂質が生じる（例えば、実施例１４参照）。したがって、生成中に温度を低下させると、炭化水素または炭化水素中間体における不飽和度が高くなるように生成物を変化させることができる。
好ましくは、細胞はアシル−ＣｏＡ脱水素酵素をコードする遺伝子に改変を含む。この改変は、アシル−ＣｏＡ脱水素酵素をコードする遺伝子の欠失、突然変異または減弱であってよい。別の好ましい実施形態では、細胞はチオエステラーゼをコードする遺伝子に改変を含む。この改変は、チオエステラーゼをコードする遺伝子の過剰発現であってよい。
いくつかの例では、アシル−ＣｏＡ合成酵素活性を有するペプチドを過剰発現させる。例えば、ｆａｄＤ（ＮＰ＿４１６３１９）、ｆａｄＫ（ＮＰ＿４１６２１６）、ｆａｄＤ（ＹＰ＿０４５０２４）、ｆａｄＤ（ＮＰ＿４３８５５１）、ＢＨ３１０３（ＮＰ＿２４３９６９）、ｙｈｆＬ（ＮＰ＿３８８９０８）、Ｐｆｌ＿４３５４（ＹＰ＿３５００８２）、ｆａｄＤ１（ＮＰ＿２５１９８９）、ｆａｄＤ２（ＮＰ＿２５１９９０）、ｆａｄＤ（ＹＰ＿５３３９１９）、ＲＰＣ＿４０７４（ＹＰ＿５３３９１９）、ｆａｄＤ１（ＮＰ＿５２０９７８）、ｆａｄＤ３５（ＮＰ＿２１７０２１）、ｆａｄＤ２２（ＮＰ＿２１７４６４）などのアシル−ＣｏＡ合成酵素およびそれらの組合せは、発現、欠失、突然変異または減弱することができる。アシル−ＣｏＡ合成酵素の他の例は、Ｓｔｒｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ Ｒ５５１−３（ＺＰ＿０６４４８５７．１）のｆａｄＤホモログである。
さらに、チオエステラーゼ発現は、生成物の量および／または脂肪酸アシル鎖を含む生成物の炭素鎖長を変更するために制御することができる。例えば、リーダー配列を有さないｔｅｓＡ（ＡＡＣ７３５９６）、ｔｅｓＢ（ＡＡＣ７３５５５）、Ｕｃ ｆａｔＢ（Ｑ４１６３５、ＡＡＡ３４２１５）、Ｃｈ ｆａｔＢ２（Ｑ３９５１３、ＡＡＣ４９２６９）、Ｃｈ ｆａｔＢ３（ＡＡＣ４９２６９、ＡＡＣ７２８８１）、Ｃｃ ｆａｔＢ（Ｑ３９４７３、ＡＡＣ４９１５１）、Ａｔ ｆａｔＢ ［Ｍ１４１Ｔ］（ＣＡＡ８５３８８）、Ａｔ ｆａｔＡ（ＮＰ １８９１４７、ＮＰ １９３０４１）、Ｃｈ ｆａｔＡ（ＡＡＣ７２８８３）、Ｈａ ｆａｔＡ１（ＡＡＬ７９３６１）などのチオエステラーゼまたはそれらの組合せは、発現、欠失、突然変異または減弱することができる。
所望により、細胞はアシル−ＣｏＡ合成酵素またはチオエステラーゼを含むことができる。例えば、細胞は、アシル−ＣｏＡ合成酵素またはチオエステラーゼをコードする単離核酸で形質転換することができる。あるいは、細胞は、アシル−ＣｏＡ合成酵素またはチオエステラーゼをコードする単離核酸を含むベクターでトランスフェクトすることができる。
組換え生物は、規定された構造特性（例えば、分枝の程度、飽和または炭素鎖長）を備えた炭化水素および脂肪族ケトンを産生するように、本明細書で開示した単離核酸およびタンパク質を使用して操作することができる。炭化水素を作製する一方法には、１種または複数のアシル縮合酵素（複数のアシル−ＣｏＡ、アシル−ＡＣＰ、アシル−ＡＭＰ、アシル−エステル、脂肪酸またはそれらの混合物を縮合する酵素）のより活性のある形態の発現の増加または発現が関与する。当業者であれば、このような縮合反応によって生じた生成物は、縮合されたアシル鎖が変化していることを理解するであろう。生成することができる生成物には、例えば、炭化水素および脂肪族ケトンなどの炭化水素中間体が含まれる。
当業者であれば、脂肪酸アシル鎖およびそれらの中間体を含有する基質は、化学的変換または酵素的変換を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ反応ならびにｉｎ ｖｉｖｏ反応を使用して生成できることを理解するであろう。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ変換の組合せを利用することができる。さらに、特定の脂肪族ケトンは、変換のために脂肪酸、アシル−ＡＣＰまたはアシル−ＣｏＡなどの選択された基質を選択的に提供することによって生成することができる。あるいは、炭化水素は、変換のために脂肪酸、アシル−ＡＣＰ、アシル−ＣｏＡ、脂肪族ケトン、α−アルキル−β−ケト酸またはα−アルキル−β−ケトエステルなどの選択された基質を選択的に提供することによって生成することができる。
本明細書では、「脂肪酸」という用語は、式ＲＣＯＯＨを有するカルボン酸を意味する。Ｒは脂肪族基、好ましくはアルキル基を表す。Ｒは、約４個と約２２個の間の炭素原子を含んでよい。脂肪酸は、飽和、モノ不飽和、またはポリ不飽和であってよい。好ましい実施形態では、脂肪酸は、脂肪酸生合成経路によって生成される。
「変換する」または「変換」という用語は、第１の中間体または基質を第２の中間体または生成物に変化させる化学的手段または生物学的手段（例えば、反応におけるポリペプチド）のいずれかの使用を意味する。「化学的変換」という用語は、ポリペプチドによって積極的に促進されない反応を意味する。「生物学的変換」という用語は、ポリペプチドによって積極的に促進される反応を意味する。変換は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはその両方で行うことができる。生物学的変換を使用するとき、ペプチドおよび／または細胞は、例えば、ポリマー支持体への化学的結合によって、支持体に固定することができる。変換は、当業者に公知の任意の反応器を使用して、例えば、バッチまたは連続反応器内で実現することができる。
組換え生物は、いくつかの中間体をその後の中間体に変換することができるか、または組換え生物に、生成物に変換される中間体を供給するか、または接触させることができる。特定の例では、組換え生物が、アシル−ＣｏＡ分子などの中間体と接触するように配置され、このアシル−ＣｏＡ分子は次に生成物に変換される。
本明細書で提供した開示によれば、Ｏｌｅタンパク質（例えば、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤおよびＯｌｅＢＣ）およびそれらのホモログの大規模な酵素的生成が今では可能である。簡単に説明すると、これらのペプチドまたはこれらのペプチドのホモログのいずれか１つのコード配列（例えば、表１および２参照）は、高発現プラスミド、例えば、ｐＥＴ−２１ｂ（＋）、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ｐＷＨ１５２０（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはｐＨＴ０１（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にクローニングすることができる。プラスミドは、酵素産生のために宿主細胞に導入することができる。得られたペプチドは、その後精製し、バッチ生成で使用できる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ法を使用するとき、反応に供給したペプチドは、開始物質に左右される。例えば、炭化水素を所望するときは、アシル−ＡＣＰおよび／またはアシル−ＣｏＡ基質が、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＣおよびＯｌｅＤを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏ反応混合物に添加されよう。同様に、開始物質が脂肪族ケトン、α−アルキル−β−ケト酸またはα−アルキル−β−ケトエステルのときは、ペプチドＯｌｅＣおよびＯｌｅＤをｉｎ ｖｉｔｒｏ反応に使用することができる。
第１のペプチドが第１の中間体を第２の中間体に変換するために使用され、次いで第２のペプチドが第２の中間体を第３の中間体に変換するために使用されるとき、ペプチドは反応に同時にまたは順番に添加することができる。いくつかの例では、ペプチドを順番に添加するとき、第１のペプチドは第２のペプチドを添加する前に除去することができる。
さらに、化学的変換および生物学的変換の組合せを、所望する生成物を生成するために使用することができる。例えば、当業者は、化学変換によって２種類の脂肪酸を縮合して脂肪族ケトンを生成することができ、次いで得られた脂肪族ケトンは生物学的変換を使用して炭化水素に変換できることを理解するだろう。
本明細書で提供した開示によれば、脂肪族ケトン、炭化水素およびそれらの中間体は、組換え細胞で産生することができる。組換え細胞は、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤ、ＯｌｅＢＣおよびそれらの関連配列によってコードされた１種または複数のペプチドを産生することができる。当業者であれば、組換え細胞で発現するためのペプチドの選択は、所望する生成物および細胞に供給した開始物質によって左右されることを理解するだろう。例えば、細胞に脂肪族ケトンを供給し、所望する生成物が炭化水素である場合、組換え細胞はＯｌｅＣおよびＯｌｅＤをコードする核酸で操作することができる。
本明細書で記載したｉｎ ｖｉｖｏにおける方法はまた、化学的変換およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける生物学的変換と組み合わせて使用することができる。例えば、第１の中間体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドを使用して第２の中間体に変換することができ、次に第２の中間体は、第２の中間体を第３の中間体に変換するために必要なペプチドを発現する細胞に供給することができる。別の例では、第１の中間体は、化学的変換によって第２の中間体に変換することができ、次に第２の中間体は、その後の変換に必要なペプチドをコードする組換え細胞に供給することができる。
さらに、生成物は２個以上のｉｎ ｖｉｖｏ反応段階を使用して生成することができる。例えば、第１の組換え細胞は、第１の中間体を第２の中間体に変換するために使用することができる。第２の中間体は、例えば受動輸送、能動輸送または細胞溶解によって細胞から放出することができ、その後第２の中間体は第３の中間体に変換される第２の組換え細胞に供給することができる。いくつかの例では、第３の中間体が所望する生成物である。
本発明は、規定された炭素鎖長、飽和レベルおよび分岐点を有する脂肪族ケトン、炭化水素および炭化水素中間体の大規模生成を可能にする。このように操作された分子の生成は、燃料および特殊な化学物質として使用することができる多様な生成物を提供する。
本発明は、本明細書で開示した核酸（例えば、本明細書で開示したポリペプチド配列のいずれかをコードする核酸配列）のいずれかで形質転換した、または本明細書で開示したベクターのいずれかでトランスフェクトした細胞を提供する。好ましくは、細胞は炭化水素または脂肪族ケトンを産生する。炭化水素はオレフィンであってよい。一実施形態では、炭化水素または脂肪族ケトンは細胞によって分泌される。好ましい実施形態では、細胞はＯｌｅＡをコードする単離核酸を含む。具体的に、ＯｌｅＡをコードする単離核酸を含む細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞であってよい。
本発明は、炭化水素を産生するために十分な条件下で、本明細書で開示した単離核酸（例えば、本明細書で開示したポリペプチド配列のいずれかをコードする核酸配列）のいずれかを含む任意の細胞を基質と共に培養することを含む、炭化水素の産生方法を提供する。例えば、基質は、炭素源、脂肪酸、アシル−ＣｏＡ、アシル−ＡＭＰ、アシル−ＡＣＰ、α−アルキル−β−ケト酸、α−アルキル−β−ケトエステルまたは脂肪族ケトンであってよい。好ましくは、細胞の生産性は、少なくとも約３ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００である。例えば、細胞の生産性は、少なくとも約５ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００、少なくとも約８ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００、少なくとも約１５ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００、少なくとも約２０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００または少なくとも約３０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００であってよい。
本発明はさらに、炭化水素の単離を含む炭化水素を産生するために十分な条件下で、本明細書で開示した単離核酸（例えば、本明細書で開示したポリペプチド配列のいずれかをコードする核酸配列）を含む任意の細胞を基質と共に培養することを含む、炭化水素の産生方法を提供する。炭化水素は、細胞または細胞を培養する培地から単離することができる。基質は、例えば、炭素源、脂肪酸、アシル−ＣｏＡ、アシル−ＡＭＰ、アシル−ＡＣＰ、α−アルキル−β−ケト酸、α−アルキル−β−ケトエステルまたは脂肪族ケトンであってよい。
本発明は、炭化水素の分解または精製をさらに含む炭化水素を産生するために十分な条件下で、本明細書で開示した単離核酸（例えば、本明細書で開示したポリペプチド配列のいずれかをコードする核酸配列）を含む任意の細胞を基質（例えば、炭素源、脂肪酸、アシル−ＣｏＡ、アシル−ＡＭＰ、アシル−ＡＣＰ、α−アルキル−β−ケト酸、α−アルキル−β−ケトエステルまたは脂肪族ケトン）と共に培養することを含む、炭化水素の産生方法を提供する。
この方法は、モノ不飽和またはポリ不飽和（例えば、２不飽和、３不飽和など）である炭化水素を産生することができる。炭化水素は、約１０個から約４０個の間の炭素の炭素鎖長を有することができる。例えば、炭化水素は、約１５個から約３５個、約１７個から約３４個、１８個から約３３個、約１９個から約３３個の炭素、約２７個から約３３個の炭素、約２９個から約３１個の炭素、または約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２もしくは３３個の炭素の炭素鎖長を有することができる。
本発明は、脂肪族ケトンを産生するために十分な条件下で、本明細書で開示した単離核酸（例えば、本明細書で開示したポリペプチド配列のいずれかをコードする核酸配列）を含む任意の細胞を基質と共に培養することを含む、脂肪族ケトンの産生方法を提供する。例えば、基質は、炭素源、脂肪酸、アシル−ＣｏＡ、アシル−ＡＭＰ、アシル−ＡＣＰ、α−アルキル−β−ケト酸またはα−アルキル−β−ケトエステルであってよい。好ましくは、細胞の生産性は、少なくとも約０．１ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００である。例えば、細胞の生産性は、少なくとも約０．１ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００、少なくとも約１ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００、少なくとも約３ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００、少なくとも約６ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００、少なくとも約９ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００または少なくとも約１２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００であってよい。
本発明はさらに、脂肪族ケトンを単離することを含む脂肪族ケトンを産生するために十分な条件下で、本明細書で開示した単離核酸を含む任意の細胞を基質と共に培養することを含む、脂肪族ケトンの産生方法を提供する。脂肪族ケトンは、細胞または細胞を培養した培地から単離することができる。
この方法は、飽和、モノ不飽和またはポリ不飽和（例えば、２不飽和、３不飽和など）である脂肪族ケトンを産生することができる。脂肪族ケトンは、約１０個から約４０個の炭素の炭素鎖長を有することができる。例えば、脂肪族ケトンは、約１５個から約３５個、約１７個から約３４個、１８個から約３３個、約１９個から約３３個の炭素、約２３個から約２９個の炭素、約２５個から約２７個の炭素、または約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２もしくは３３個の炭素の炭素鎖長を有することができる。
本発明はまた、単離核酸によってコードされたポリペプチドを産生するために十分な条件下で、本明細書で開示した単離核酸を含む任意の細胞を培養することを含む、精製されたポリペプチドの産生方法を提供する。具体的に、ポリペプチドは、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣである。
本明細書では、「精製する」、「精製した」または「精製」という用語は、例えば、単離または分離によって環境から分子を除去または単離することを意味する。「実質的に精製された」分子は、それらの関連したその他の成分を少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％含まない。本明細書では、これらの用語はまた、試料から混入物質を除去することを意味する。例えば、混入物質の除去は、試料中のオレフィンの割合の増加を引き起こすことができる。例えば、オレフィンを宿主細胞で産生されるとき、オレフィンは宿主細胞タンパク質の除去によって精製することができる。精製後、試料中のオレフィンの割合は増加する。
本明細書では、「精製する」、「精製した」および「精製」という用語は、完全に純粋であることを必要としない。それらは相対的な用語である。したがって、例えば、ポリペプチドを細胞内で産生されるとき、精製したポリペプチドは、その他の細胞成分（例えば、核酸、脂質、炭水化物または炭化水素）から実質的に分離されたポリペプチドである。別の例では、精製されたオレフィン調製物は、オレフィンが混入物質、例えば、発酵後に存在する可能性があるものを実質的に含まないものである。いくつかの実施形態では、試料の少なくとも約５０重量％がオレフィンから構成されるとき、オレフィンは精製されている。その他の実施形態では、試料の少なくとも約６０重量％、７０重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９２重量％、９５重量％、９８重量％または９９重量％以上がオレフィンから構成されるとき、オレフィンは精製されている。
本発明は、脂肪族ケトンを産生するために十分な条件下で、基質をＯｌｅＡとインキュベートすることを含む脂肪族ケトンの産生方法を提供する。具体的に、基質はアシル−ＣｏＡ、アシル−ＡＭＰまたはアシル−ＡＣＰを含むことができる。
本発明は、炭化水素を生成するために十分な条件下で、基質をＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤ、ＯｌｅＢＣまたはそれらの組合せとインキュベートすることを含む炭化水素の生成方法を提供する。基質はアシル−ＣｏＡ、アシル−ＡＭＰまたはアシル−ＡＣＰを含むことができる。炭化水素を生成するために使用したＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤまたはＯｌｅＢＣタンパク質は、精製された、または未精製のタンパク質であってよい。例えば、アシル−ＣｏＡ基質は、炭化水素を生成するために、ｏｌｅ遺伝子を発現する生物の細胞溶解物に添加することができる。
炭化水素を生成するための方法は、炭化水素を生成するために十分な条件下で基質をＯｌｅＡおよびＯｌｅＤとインキュベートすることを含むことができる。所望により、この方法はＯｌｅＢを含むことができる。この方法は、炭化水素を生成するために十分な条件下で基質をＯｌｅＡ、ＯｌｅＣおよびＯｌｅＤとインキュベートすることを含むことができる。所望により、この方法はＯｌｅＢを含むことができる。
アシル縮合ペプチドには、本明細書で記載した方法を使用してアシル−ＡＣＰ、アシル−ＣｏＡ、アシル−ＡＭＰ、脂肪酸およびそれらの混合物の縮合を触媒することができるペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、これらのアシル縮合ペプチドは、高い、中程度の、または低い基質特異性を有する。いくつかの例では、アシル縮合ペプチドは、基質特異性がより高く、特定の鎖長の基質のみを受け入れる。さらに、当業者であれば、いくつかのアシル縮合ペプチドは同様にその他の反応を触媒することを理解するであろう。例えば、いくつかのアシル縮合ペプチドは、アシル−ＣｏＡ、アシル−ＡＣＰ、アシル−ＡＭＰ、アシル−エステル、脂肪酸またはそれらの混合物に加えてその他の基質を受け入れる。したがって、このような非特異的アシル縮合ペプチドも含まれる。表１に挙げたＯｌｅＡ配列に加えて、アシル縮合酵素の例が公的に利用可能である。
他の実施形態では、ＯｌｅＣおよびＯｌｅＤはＯｌｅＡなしでオレフィンを生成するために使用することができる。別の実施形態では、ＯｌｅＣはＯｌｅＡおよびＯｌｅＤなしでオレフィンを生成するために使用することができる。
ミコール酸は、細菌（例えば、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）によって産生される２−アルキル−３−ヒドロキシ脂肪酸である。ミコール酸は、細菌の細胞壁に組み込まれることが多い。これらの２−アルキル−３−ヒドロキシ脂肪酸は、クライゼン縮合およびその後のケト基の還元から得られる。この反応は、本明細書で記載した炭化水素合成プロセスにおいて、ＯｌｅＡおよびＯｌｅＤによって実施された酵素反応と類似している。したがって、ミコール酸経路の第１工程を使用して、炭化水素を産生するためにＯｌｅＣまたはＯｌｅＣおよびＯｌｅＤの組合せに必要な基質を生成することができる。さらに、ミコール酸経路のさらなる遺伝子改変によって、アルケン生成レベルを増加させることができた。
図２０は、ミコール酸生合成（例えば、Lea-Smith et al., Journal of Biological Chemistry, 282: 11000-11008 (2007)およびPortevin et al., Proceedings of the National Academy of Science, 101: 314-319 (2004)を参照）およびｏｌｅ遺伝子によるオレフィン合成のために提案された合成経路の概略を示した図である。これら２種類の経路の検討によって、類似の中間体が明らかである。両経路における脂肪酸縮合の生成物は、２−アルキル-３-ケト−脂肪酸アシル−ＣｏＡまたは２−アルキル-３-ケト−脂肪酸アシル−ＡＣＰである。結果として、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのミコール酸産生生物におけるｏｌｅＣおよびｏｌｅＤの過剰発現は、オレフィンの産生を導くミコール酸生合成経路を「ハイジャック」することができる。
第１のスキームでは、ｏｌｅＣおよびｏｌｅＤがミコール酸産生生物で過剰発現する。適切な宿主生物は、十分に確立された産業的宿主であるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍであってよく、ミコール酸産生の欠如に寛容な、うまく考案された遺伝子的手段を備えている。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのミコール酸遺伝子の脂肪酸特異性は、ｏｌｅＡ、ｏｌｅＢ、ｏｌｅＣおよびｏｌｅＤで認められた特異性プロファイルと類似している。ｏｌｅＣおよびｏｌｅＤの過剰発現は、図２１に概略を示したようなオレフィン合成に対するｐｋｓ１３の産生を対象としている。
第２のスキームでは、ｏｌｅＣのみがミコール酸産生生物で過剰発現する。この提案されたスキームでは、ＯｌｅＣはオレフィンを形成するために２−アルキル-３-ヒドロキシル脂肪酸アシル中間体に独立して影響を及ぼすことができると仮定している。この経路は図２２で明らかである。
ｏｌｅＣおよびｏｌｅＤを発現するミコール酸産生株におけるオレフィン産生の増強は、以下の遺伝子改変を完全にすることによって得ることができる。ＯｌｅＣおよびｏｌｅＤの基質が他に流用されないようにするために、ｃｍｒＡまたはその機能的ホモログは、ミコール酸の形成を防ぎ、一方でＯｌｅＤの基質である２−アルキル-３-ケト−脂肪酸アシル−ＡＣＰの蓄積を可能にするためにノックアウトすることができる。さらに、ｆａｄＤ３２、ａｃｃＡ３、ａｃｃＤ４、ａｃｃＤ５またはｐｋｓ１３が過剰発現することによって、必要なミコール酸中間体の産生が増加し、ｏｌｅＣおよびｏｌｅＤが過剰発現すると共にオレフィン産生の増加が引き起こされる。
一般的に、アシル縮合活性を有するペプチドを同定する方法はいくつかある。これらの方法の１つまたは複数を使用した生成物形成は、ペプチドがアシル縮合活性を有することを示している。実施例３に挙げたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに加えて、ペプチドは、細胞内で外来核酸から発現することができ、その後細胞溶解物を調製することができる。アシル−ＣｏＡ、アシル−ＡＣＰ、アシル−ＡＭＰ、アシル−エステル、脂肪酸などの様々な基質またはそれらの混合物を溶解物に添加することができ、生成物は、本明細書で記載したＧＣ／ＭＳまたはＧＣ／ＦＩＤ法を使用して検出することができる。別の例では、ペプチドを精製し、ペプチドを発現しない細胞の細胞溶解物（以後、野生型溶解物）とインキュベートすることができる。精製したペプチド、野生型溶解物および様々な基質をインキュベートすることができる。得られた生成物は、本明細書で記載したＧＣ／ＭＳまたはＧＣ／ＦＩＤ法を使用して特徴付けることができる。さらに別の例では、アシル縮合活性は、タンパク質を変性するために加熱した細胞溶解物の存在下で、精製した酵素および基質をインキュベートすることによって特徴付けることができる。別の例では、精製したペプチドおよび様々な基質をインキュベートすることができ、得られた生成物は本明細書で記載したＧＣ／ＭＳ法を使用して特徴付けることができる。アシル縮合活性を有するペプチドは、脂肪族ケトンを生成するペプチドとして同定される。当業者であれば、既に脂肪族ケトンを含有する細胞溶解物を使用するとき、アシル縮合活性を有するペプチドは、基質を添加していない溶解物と比較した脂肪族ケトンの増加（例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約９０％の増加）によって認識されることを理解するだろう。
場合によっては、縮合は１種または複数の基質からの分子の生成を生じ得る。例えば、２個のアシル−ＣｏＡ分子の縮合は、少なくとも１個のＣｏＡ分子を生成し得る。ＣｏＡは、反応性の高い遊離チオール部分（ＲＳＨ）を有するので、この分子は様々な方法によって検出することができる。このような一方法は、分光光度的に４１１ｎｍで追跡できるジチオニトロ安息香酸（エルマン試薬）による反応である。あるいは、ＣｏＡは、モノブロモビマンと反応し、ＨＰＬＣによって検出することができる（Fahey, et al., Methods Enzymol. 143: 85-96, (1987)）。
生物情報学的方法を使用してアシル縮合ペプチドを見い出すことができる。アシル縮合は、「クライゼン縮合」として知られている周知の化学反応によって生じる。クライゼン縮合は、β−ケトエステルまたはβ−ジケトンを生じる強塩基の存在下で２個のエステル間または１個のエステルと別のカルボニル化合物との間で生じる炭素−炭素結合形成反応である。
アシル縮合ペプチドは通常、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｓｎから構成される触媒的３連構造を含有する。縮合酵素は、アミノ酸レベルでの類似性はほとんどないが、共通の３次元の折り畳み構造を有する。しかし、それらの活性部位は、顕著な類似性を有している（Heath et al, Nat. Prod. Rep., 19: 581-596, (2002)）。
アシル縮合ペプチドの例には、本明細書で開示したＯｌｅＡ配列、例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号８８、配列番号１３５〜４６４および配列番号４７８〜４８７、これらの配列のホモログ、本明細書で提供したＯｌｅＡ構造モチーフの１個または複数を有する酵素、ならびにアシル縮合活性を示すそれらの活性断片／変異体が含まれる。
組換え生物は、規定した構造特性（分枝、飽和または炭素鎖長の程度）を有する炭化水素および炭水化物中間体を生成するように本明細書で開示したペプチドを使用して操作することができる。炭化水素中間体を作製する一方法には、１種または複数の酵素、例えば、炭化水素合成酵素活性、アデニル化ペプチド、脱水素酵素、脱水酵素もしくはアシル縮合酵素の発現、発現の増加またはより活性のある形態の発現が関与する。炭化水素生成を増加させるために操作できる酵素の例には、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＢＣおよびＯｌｅＤ、ならびに脂肪酸生成を増加または改変するその他の酵素が含まれる。当業者であれば、このような酵素から生じた生成物は基質のアシル鎖を変化させることを理解するであろう。
アデニル化ペプチドには、炭化水素中間体、例えば、α−置換β−ケト酸を含むβ−ケト酸、特にα位に脂肪族炭化水素を含むβ−ケト酸へのアデノシン１リン酸の付加を触媒できるペプチドが含まれる。前述したように、このような中間体のα脂肪族基は通常、炭化水素鎖に１個または複数の不飽和部位、例えば、１個、２個または３個の不飽和部位を所望により含む所望により分枝した炭化水素鎖である。このようなアデニル化ペプチドはまた、β−ケトエステルを形成するためにアデノシン１リン酸のβ−ヒドロキシケト酸への付加を触媒することができ得る。このような活性の確認方法を本明細書で記載する。
いくつかの例では、アデニル化ペプチドは、基質特異性がより高く、例えば、ＣｏＡまたはＡＣＰ活性化β−ケトエステルのみを受け入れる。さらに、当業者であれば、いくつかのアデニル化ペプチドが同様に反応することを理解するであろう。例えば、いくつかのアデニル化ペプチドは、α−置換β−ケト酸に加えてその他の基質を受け入れる。したがって、このような比較的非特異的なアデニル化ペプチドも含まれる。アデニル化ペプチドの例は公的に利用可能である（例えば、表１および２参照）。アデニル化ペプチドは、さらに他の反応、例えば、その他の活性基、例えば、ＣｏＡを有するアデニル化化合物のトランスエステル化を触媒することが多い。この活性は、合成酵素活性と考えられる。以下の一式の反応が一例である。
１）Ｒ＋ＡＴＰ→Ｒ−ＯＰＯ３−アデノシン＋ピロリン酸
２）Ｒ−ＯＰＯ３−アデノシン＋ＣｏＡＳＨ→Ｒ−ＳＣｏＡ＋ＡＭＰ
アデニル化活性を有するペプチドを同定する方法はいくつかある。これらの方法の１つまたは複数を使用する生成物形成は、ペプチドがアデニル化活性を有することを示している。本明細書で提供したｉｎ ｖｉｖｏアッセイに加えて、ペプチドは、細胞内で外来核酸から発現することができ、その後細胞溶解物を調製することができる。ＡＴＰなどの様々な基質を溶解物に添加することができ、生成物は、本明細書で記載した方法を使用して検出することができる。別の例では、ペプチドを精製し、ペプチドを発現しない細胞の細胞溶解物とインキュベートすることができる。精製したペプチド、野生型溶解物および様々な基質をインキュベートすることができる。得られた生成物は、本明細書で記載した方法を使用して特徴付けることができる。当業者であれば、アデニル化生成物を既に含有する細胞溶解物を使用するとき、アデニル化活性を有するペプチドは、基質を添加していない溶解物と比較して遊離ＰＰｉ、ＡＭＰα−置換β−ケトエステルまたはＡＭＰα−置換β−ヒドロキシエステルのいずれかの増加によって認識されることを理解するだろう。アデニル化ペプチドンの例には、ＯｌｅＣ（例えば、配列番号６）、表１に挙げたＯｌｅＣタンパク質およびアデニル化活性を示すそれらの活性断片／変異体が含まれる。
脱水素酵素ペプチドには、脂肪族ケトン、脂肪族β−ケト酸または脂肪族β−ケトエステル分子のケト基の対応する水酸基への還元（炭素−酸素２重結合へのＨ２の付加）を触媒することができるペプチドが含まれる。このような活性の確認方法を本明細書で記載する。いくつかの例では、脱水素酵素ペプチドは、基質特異性がより高く、例えば、α−脂肪族−β−ケトエステルのＣｏＡまたはＡＣＰエステルのみを受け入れる。さらに、当業者であれば、いくつかの脱水素酵素ペプチドはその他の反応を同様に触媒することを理解するであろう。例えば、いくつかの脱水素酵素ペプチドは、β−ケトエステルに加えてその他の基質を受け入れる。したがって、このような非特異的脱水素酵素ペプチドも含まれる。脱水素酵素ペプチドの例は、ＯｌｅＤ（例えば、配列番号８）および表１に挙げた公的に利用可能な脱水素酵素ペプチドである。
脱水素酵素活性を有するペプチドを確認する方法はいくつかある。これらの方法の１つまたは複数を使用した生成物形成は、ペプチドが脱水素酵素活性を有することを示している。本明細書で挙げたｉｎ ｖｉｖｏアッセイに加えて、ペプチドは、細胞内で外来核酸配列から発現することができ、その後細胞溶解物または精製ペプチドを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを調製することができる。ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨなどの様々な基質をアッセイに添加することができ、生成物は、本明細書で記載したＧＣ／ＭＳ法を使用して検出することができる。
別の例では、ペプチドを精製し、ペプチドを発現しない細胞の細胞溶解物とインキュベートすることができる。精製ペプチド、野生型溶解物および様々な基質（例えば、脂肪酸、アシル−ＣｏＡ、アシル−ＡＭＰ、アシル−ＡＣＰ、α−アルキル−β−ケト酸、α−アルキル−β−ケトエステルまたは脂肪族ケトン）をインキュベートすることができる。得られた生成物は、本明細書で記載した方法を使用して特徴付けることができる（例えば、実施例１参照）。
さらに別の例では、脱水素酵素活性は、ケトン基質の存在下でＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの脱水素酵素依存性酸化を分光光度的にモニターすることによって検出することができる。脱水素酵素活性は、反応溶液の３４０ｎｍでの吸収の減少として検出される。
さらに別の例では、脱水素酵素活性は、タンパク質を変性するために加熱した細胞溶解物の存在下で、精製した酵素および基質（例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、α−脂肪族−β−ケトエステルおよび／またはα−脂肪族−β−ケト酸）をインキュベートすることによって特徴付けることができる。脱水素酵素活性を有するペプチドは、１種または複数の前述の反応からβ−ヒドロキシ酸またはエステル（特に、活性化エステル）分子を生成するペプチドとして同定される。当業者であれば、β−ヒドロキシ酸および／またはエステル生成物を既に含有する細胞溶解物を使用するとき、脱水素酵素活性を有するペプチドは基質を添加していない溶解物と比較してＮＡＤＰ、β−ヒドロキシ酸、および／またはエステル分子のいずれかの増加によって認識されることを理解するだろう。
脱水素酵素ペプチドの例には、ＯｌｅＤ（例えば、配列番号８）および表１に示した関連酵素が含まれる。他のＯｌｅＤ酵素は、本明細書で挙げたＯｌｅＤモチーフおよび本明細書で記載した方法を使用して、様々なデータベースを検索することによって同定することができる。
加水分解酵素活性を有するペプチドをコードする核酸も本明細書で開示する。特に、ペプチドはβ−ケトまたはβ−ヒドロキシエステル加水分解活性を有する。このようなペプチドは、対応するカルボン酸を生成するために、前述の基質すべてのエステルの加水分解を触媒する。エステルの加水分解酵素は、β−ケト酸またはβ−ヒドロキシ酸などの生成物の生成をＨＰＬＣ（またはその他の周知の技術）によってモニターすることによって検出することができる。別の実施形態では、遊離酸の形成によって生じたｐＨの減少をモニターすることができる。あるいは、エステル加水分解は、脂肪酸エステルから放出される部分、例えば、ＣｏＡＳＨ、ＡＭＰまたはリン酸の蓄積を測定することによってモニターすることができる。当業者にとって、これらの化合物のモニター方法は周知で、これらの方法のいくつかは前述されている。リン酸は、例えば、モリブデン酸およびマラカイトグリーンとの反応によってモニターすることができる。他のアッセイは、商業的に得ることができる（例えば、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）。
本発明は、１個または複数（例えば、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個または約５０個）のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を含むＯｌｅＡをコードするアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離ポリペプチドを提供する。例えば、単離ポリペプチドは、１個または複数の（例えば、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個または約５０個）アミノ酸置換、付加、挿入または欠失を含む配列番号２、配列番号４、配列番号１２および配列番号１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むことができる。
本発明は、生物学的活性を含むポリペプチドを提供する。ポリペプチドの生物学的活性は、クライゼン縮合活性であってよい。具体的に、ポリペプチドの生物学的活性は、２個のアシルチオエステルの縮合であってよい。
本発明は、１個または複数の（例えば、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個または約５０個）アミノ酸置換、付加、挿入または欠失を含むＯｌｅＤをコードするアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離ポリペプチドを提供する。例えば、単離ポリペプチドは、１個または複数（例えば、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個または約５０個）のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を含む配列番号８、配列番号１６および配列番号２２からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。
本発明は、ＯｌｅＡタンパク質と同じ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。例えば、本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２２からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。好ましくは、単離核酸は、（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２１またはそれらの断片からなる群から選択された核酸配列、あるいは（ｉｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２１またはそれらの断片からなる群から選択された核酸配列の相補配列とハイブリダイズする核酸配列を含むことができる。
ハイブリダイゼーション反応を実施するための指針は、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6に見い出すことができる。水性および非水性の方法は、この文献に記載されており、いずれの方法も使用することができる。本明細書で言及した具体的なハイブリダイゼーション条件は以下の通りである：１）６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、約４５℃の低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の後、少なくとも５０℃で（洗浄温度は低ストリンジェンシー条件では５５℃まで上昇させることができる）０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄、２）６×ＳＳＣ、約４５℃の中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の後、６０℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回または複数回洗浄、３）６×ＳＳＣ、約４５℃の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の後、６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回または複数回洗浄、好ましくは４）非常に高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳで６５℃であり、その後６５℃で０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで１回または複数回洗浄する。非常に高いストリンジェンシー条件（４）は、特に記載しない限り好ましい条件である。本明細書では、「ハイブリダイズする」という用語は一般的に、低ストリンジェンシー条件、中程度のストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、または非常に高いストリンジェンシー条件のことである。
本発明は、生物学的活性を含むポリペプチドを提供する。生物学的活性は、酸化還元酵素活性であってよい。具体的に、生物学的活性は、ケト基（例えば、ケトン、脂肪族ケトン、α−アルキル−β−ケト酸、α−アルキル−β−ケトエステル）の還元であってよい。
炭化水素合成酵素活性は、脂肪酸アシル鎖、例えば、アシル−ＣｏＡ、アシル−ＡＣＰまたは脂肪酸を含有する基質の炭化水素または炭化水素中間体への変換を引き起こす１種または複数のペプチドの活性である。炭化水素合成酵素活性を有するペプチドの例には、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤおよびＯｌｅＢＣが含まれる。
炭化水素合成酵素活性は、例えば、相補性試験（以下の実施例６参照）を使用して試験することができる。ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣおよびＯｌｅＤの発現時に炭化水素を生成することが知られている生物を試験宿主として使用することができる。例えば、ＯｌｅＣ候補の炭化水素合成酵素活性を試験する場合、試験宿主は、ｏｌｅＡおよびｏｌｅＤのみ発現し、ｏｌｅＣを発現しないように操作する。次いで、ｏｌｅＣ候補は、ｏｌｅＣを欠如した試験宿主で発現させる。ＯｌｅＣ候補は、試験宿主が炭化水素を産生する場合、炭化水素合成酵素活性を有するものと考えられる。
本明細書で挙げたＯｌｅＡ、ＯｌｅＢＣ、ＯｌｅＣおよびＯｌｅＤ配列および実施例６で記載した相補性試験を使用して、他の炭化水素および炭化水素中間体形成遺伝子を同定することができる。炭化水素およびそれらの中間体は、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢＣ、ＯｌｅＣおよびＯｌｅＤをＥ．ｃｏｌｉで発現することによって形成することができる。したがって、炭化水素を生成するように操作されたＥ．ｃｏｌｉまたは天然に炭化水素を産生するその他の生物（例えば、Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｃ．ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｘ．ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓまたはＡ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）は、試験する特定のＤＮＡ配列が宿主細胞で発現しないとき、特定のＤＮＡ配列またはタンパク質の炭化水素合成酵素活性を測定するために使用することができる。
本明細書では、「宿主細胞」とは、本明細書で記載した生成物（例えば、本明細書で記載したオレフィン）を産生するために使用した細胞である。宿主細胞は、選択した遺伝子を発現または過剰発現するように、あるいは選択した遺伝子の発現が減弱するように改変することができる。
一例として、試験するＤＮＡ配列がＯｌｅＡタンパク質配列のホモログをコードするとき、ｏｌｅＣおよびｏｌｅＤ配列は既に発現しているが、ｏｌｅＡ配列は発現していない宿主で発現させる。宿主がｏｌｅＡのホモログを発現しているとき炭化水素または炭化水素中間体を産生するならば、ＯｌｅＡのホモログは、活性がある（すなわち、炭化水素合成酵素活性を有する）と考えられる。
本発明は、炭化水素の産生に有用な酵素を同定する方法であって、（ｉ）（ａ）ＯｌｅＡおよびＯｌｅＤ、（ｂ）ＯｌｅＡおよびＯｌｅＣ、ならびに（ｃ）ＯｌｅＣおよびＯｌｅＤからなる群から選択されたポリペプチドを含む細胞を、炭化水素を産生する能力を有すると推測される酵素をコードする核酸で形質転換することと、（ｉｉ）細胞が炭化水素を産生するかどうかを決定することを含み、細胞による炭化水素産生の存在が、前記核酸が炭化水素の産生に有用なポリペプチドをコードすることを示す方法を提供する。
例えば、この方法は、（ｉ）（ａ）ＯｌｅＡおよびＯｌｅＤ、（ｂ）ＯｌｅＡおよびＯｌｅＣ、（ｃ）ＯｌｅＣおよびＯｌｅＤ、（ｄ）ＯｌｅＡおよびＯｌｅＢＣ、ならびに（ｅ）ＯｌｅＢＣおよびＯｌｅＤからなる群から選択されたポリペプチドを含む細胞を、炭化水素を産生する能力を有すると推測される酵素をコードする核酸で形質転換することであって、ＯｌｅＡが配列番号２、配列番号４、配列番号１２または配列番号１８と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有し、ＯｌｅＣが配列番号６、配列番号１４、配列番号２０または配列番号８８と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有し、ＯｌｅＤが配列番号８、配列番号１６または配列番号２２と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有することと、（ｉｉ）細胞が炭化水素を産生するかどうかを決定することとを含むことができ、細胞による炭化水素産生の存在が、核酸が炭化水素の産生に有用なポリペプチドをコードすることを示す。
炭化水素を天然に産生する生物（遺伝子操作されていない）は、本明細書で記載した脂肪酸生合成経路を改変することによって、炭化水素を過剰発現するか、または特定の炭素鎖特性を有する炭化水素を産生するように操作することができる。炭化水素を産生することが知られており、本明細書で提供した教示を使用して炭化水素産生を改変するように操作することができる生物の例には、限定はしないが、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ種、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｕｒｎｉｓｓｉｉおよびｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａが含まれる。これらの遺伝子操作された組換え生物は、炭化水素の産生に有用である。
遺伝子操作された組換え生物はまた、脂肪族ケトンの産生に使用できる。例えば、ｏｌｅＡ、ｏｌｅＣおよびｏｌｅＤを有する生物は、ｏｌｅＣおよびｏｌｅＤをコードする遺伝子を欠失または減弱することによって、脂肪族ケトンを産生するように操作することができる。得られた遺伝子操作された生物は、ｏｌｅＣおよびｏｌｅＤを欠失または減弱したとき、内在性ｏｌｅＡの発現の結果としてケトンを産生する。ｏｌｅＡおよびｏｌｅＣを有する生物は、ｏｌｅＣをコードする遺伝子を欠失または減弱することによって、脂肪族ケトンを産生するように操作することができる。同様に、ｏｌｅＡおよびｏｌｅＤを有する生物は、ｏｌｅＤをコードする遺伝子を欠失または減弱することによって、脂肪族ケトンを産生するように操作することができる。得られた遺伝子操作された生物は、ｏｌｅＣまたはｏｌｅＤを欠失または減弱したとき、内在性ｏｌｅＡの発現の結果としてケトンを産生する。
その他の例では、炭化水素を産生する組換え生物は、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤ、ＯｌｅＢＣおよびそれらの組合せから選択された１種または複数のペプチドを過剰発現するように操作される。これらの遺伝子は、天然に炭化水素を産生する生物、例えば、前述の生物で過剰発現することができるか、または天然に炭化水素を産生しない生物で過剰発現することができる。
本明細書では、「過剰発現」とは、細胞において、対応する野生型細胞で通常発現するよりも高い濃度で核酸、ポリペプチド、または炭化水素を発現すること、あるいは発現させることを意味する。例えば、ポリペプチドが同種の非組換え細胞での濃度と比較して、組換え細胞においてより高い濃度で存在するとき、ペプチドは組換え細胞内で「過剰発現」させることができる。
ペプチドを過剰発現する組換え生物の例には、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤ、ＯｌｅＢＣまたはそれらの組合せをコードする核酸を発現する生物が含まれる。その他の例には、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤ、ＯｌｅＢＣまたはそれらの組合せの内在性コード配列の上流に導入された外来プロモーター配列を有した生物が含まれる。いくつかの例では、１種または複数の脂肪酸生合成経路変更遺伝子の過剰発現は、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＢＣまたはＯｌｅＤと組み合わせて過剰発現させることができる。
１種または複数のＯｌｅＡ（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号１２および配列番号１８）、ＯｌｅＢ（例えば、配列番号１０）、ＯｌｅＣ（例えば、配列番号６、配列番号１４、配列番号２０および配列番号８８）、ＯｌｅＤ（例えば、配列番号８、配列番号１６および配列番号２２）をコードする１種または複数の核酸分子あるいはこれらの配列の１種または複数の変異体またはホモログで遺伝子的に操作された（例えば、形質転換、形質導入もしくはトランスフェクトされた）組換え生物（例えば、細菌、真菌または真核細胞）が提供される。これらの配列は、ベクター構築物から、遺伝子統合後の染色体から直接、または染色体外アレイから発現することができる。例えば、ＯｌｅＡ（例えば、配列番号２）、ＯｌｅＣ（例えば、配列番号６）またはＯｌｅＤ（例えば、配列番号８）タンパク質は、所望する組換え生物において機能する遺伝子発現制御因子、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＴ７プロモーターに作動可能に連結した核酸によってコードされる。
本明細書では、「制御因子」とは、転写制御因子を意味する。制御因子には、プロモーターおよびエンハンサーが含まれる。「プロモーター因子」、「プロモーター」または「プロモーター配列」という用語は、遺伝子の発現を活性化するスイッチとして機能するＤＮＡ配列を意味する。遺伝子が活性化されるならば、転写されたか、または転写に関与していると言われる。転写には、遺伝子からのｍＲＮＡの合成が関与する。したがって、プロモーターは転写調節因子として働き、遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始の部位も提供する。制御因子は、転写に関連した細胞タンパク質と特異的に相互作用する（Maniatis et al., Science 236: 1237 (1987)）。
異種発現系においてタンパク質を発現する方法は、当業界ではよく知られている。通常、細菌または酵母組換え生物は、天然の形質転換、エレクトロポレーション、接合または形質導入によって形質転換される。得られた発現構築物は、プラスミドのように染色体外にあるか、または組換え後染色体中に組み込まれることができる。真核細胞では、通常、組換え生物は、特定の組換え生物に適した任意の方法を使用して、発現ベクターでトランスフェクトされる（または、発現ベクターを含有するウイルスで感染させる）。このようなトランスフェクション法はまた、当業界ではよく知られており、方法の非限定的な例を本明細書で記載する。形質転換された組換え生物は、発現カセットにおける核酸によってコードされるタンパク質を発現することができる。別の実施形態では、組換え生物の１種または複数の発現ベクターでの一時的または安定したトランスフェクションも実施することができた。
多くの異なる種類の組換え生物、例えば、初代細胞および不死化細胞系（適切ならば）を含む細菌、酵母、藻類、真菌、昆虫、脊椎動物細胞（例えば、哺乳類細胞）および植物細胞が、本明細書で挙げたタンパク質を産生するために使用することができる。各細胞種の数多くの代表が通常使用され、例えば、ＡＴＣＣ、ＰｈａｒｍａｃｉａおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎを含む多種多様な商用供給源から入手できる。
通常、異種タンパク質産生のためには様々な酵母株および酵母由来のベクターが使用される。例えば、適切な酵母細胞の特定の非限定的な例には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ細胞、Ｆｕｓａｒｉｕｍ細胞またはＣｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ細胞が含まれる。特定の非限定的な一例において、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得られたＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ発現系は、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＢ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＢＣまたはＯｌｅＤペプチドを産生するために使用することができる。このような系には、適切なＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株、ベクター、試薬、形質転換体、配列決定プライマーおよび培地が含まれる。例えば、利用可能な株には、限定はしないが、ＫＭ７１Ｈ（原栄養体株）、ＳＭＤ１１６８Ｈ（原栄養体株）およびＳＭＤ１１６８（ｐｅｐ４変異株）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、宿主として通常使用される別の種類の酵母である。プラスミドＹＲｐ７（Stinchcomb et al., Nature, 282: 39, (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141, (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157, (1980)）は通常、トリプトファンを産生できないＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ突然変異体において発現ベクターとして使用される。このプラスミドは、酵母の突然変異体株に形質転換すると、酵母の突然変異体株にトリプトファンの産生を可能にさせ、トリプトファン非存在下での増殖を可能にさせるｔｒｐ１遺伝子を含有する。ｔｒｐ１遺伝子を選択的マーカーとして使用することができる宿主株の例には、限定はしないが、ＡＴＣＣ４４，０７６号およびＰＥＰ４−１(Jones, Genetics, 23: 12, (1977)）が含まれる。酵母組換え体生物ゲノムにおけるｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファン非存在下での増殖によって形質転換体を検出する有効な特性を提供する。
酵母組換え生物は、Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929, (1978)によって記載されたように、ポリエチレングリコール法を使用して形質転換することができる。他の酵母形質転換方法は、Gietz et al., Nucl. Acids Res., 20(17): 1425, (1992)およびReeves et al., FEMS, 99(2-3): 193-197, (1992)に記載されている。
酵母、動物および細菌などの多くの細胞生物は、細胞膜の必須成分として脂質を産生する。これらの生物が脂質として使用する脂肪酸アシル基を産生する方法は保存性が高い。それにも関わらず、アシル−ｃｏＡおよびアシル−ＡＣＰなどの脂質中間体のいくつかの利用性に影響を及ぼすことができる経路は多様である。これらの脂質中間体はまた、Ｏｌｅタンパク質による脂肪族ケトンおよび炭化水素の生成における重要な基質である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、アシル−ＣｏＡは、アシル−ＣｏＡをチオエステラーゼによる加水分解から防御するアシル補酵素Ａ−結合タンパク質（ＡＣＢＰ）に結合する（例えば、Rose et al., PNAS, 89: 11287-11291 (1992), Feddersen et al., Biochem. J., 407: 219-230 (2007)参照）。Ｏｌｅタンパク質は、炭化水素または脂肪族ケトン合成の基質として使用するアシル−ｃｏＡをＡＣＢＰと競合するだろう。したがって、ＡＣＢＰの改変は、アシル−ＣｏＡの競合を減じるために必要であり得る。ＡＣＢＰの条件突然変異は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてアシル−ＣｏＡのプールを放出することが文献に示されている（例えば、Gaigg et al., Mol. BIol. Cell, 12: 1147-1160 (2001)参照）。したがって、利用可能な遊離アシル−ＣｏＡの量が制御されている宿主株、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ７００ｐＧＡＬ１−ＡＣＢ１株（例えば、Gaigg et al.、前述参照）におけるｏｌｅ遺伝子の発現は、産生される脂肪族ケトンまたは炭化水素を高レベルにするであろう。
適切な発現ベクターの構築において、これらの遺伝子に関連した終止配列はまた、発現が所望される配列の３’領域に連結する。原核生物ｔＲＮＡ、複製開始点および終止配列をコードする核酸配列を転写できる酵母適合プロモーターを含有するいかなるプラスミドベクターも適している。
その他の適切な組み換え生物は、細菌細胞である。組換え生物となり得る適切な細菌門の具体的で非限定的な例には、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ、およびＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａが含まれる。
組換え生物として使用できる具体的で非限定的な例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉおよびＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ＮＲＣ−ｉなどのＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｉｔ ｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、およびＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍが含まれる。
一実施形態では、組換え生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ細胞、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種細胞、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ細胞またはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細胞である。構築物の組換え生物への導入は、限定はしないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム媒介トランスフェクション、接合、天然の形質転換、エレクトロポレーションおよび当業界で公知のその他の方法を含む様々な方法によって実現することができる。
さらに他の適切な組換え生物は植物細胞（例えば、ヒカゲノカズラ、シダ、被子植物または裸子植物）である。他の適切な組換え生物には、限定はしないが、藻類、蘚類および地衣類が含まれる。任意の公知の方法を植物細胞の形質転換、培養、再生に使用することができる。外来ＤＮＡを植物細胞に導入する方法には、限定はしないが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおよびバイナリーベクターを含む適切なＴｉベクターの使用が関与する導入、化学的に誘導された導入（例えば、ポリエチレングリコールによる）、微粒子銃およびマイクロインジェクション法が含まれる。例えば、An et al., Plant Molecular Biology Manual, A3: 1-19 (1988)を参照のこと。植物細胞における異種遺伝子の発現に適した様々なプロモーターは当業界では公知で、構成的プロモーター、例えば、多くの植物組織で発現するカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、器官または組織特異的プロモーター、および化学物質、例えば、ジャスモン酸メチル、サリチル酸メチルまたは毒性緩和剤によって誘導可能なプロモーターが含まれる。
組換え生物は、適切な条件下で適切な細胞密度まで増殖する。対象とする配列が誘導的プロモーターに作動可能に連結しているならば、発現を誘導するために適した環境変化を生じさせる。生成物（例えば、炭化水素）が組換え生物内に蓄積するならば、細胞は、例えば、遠心または濾過によって収集する。全細胞抽出は、全細胞から生成物を精製するために実施することができる。他の実施形態では、生物、培地および生成物を一緒に収集する全培養抽出は、所望する生成物を回収するために実施することができる。全培養抽出物はその後、所望する生成物を得るために精製することができる。組換え生物が培地中に生成物を分泌するならば、細胞および培地を分離する。次に、所望する生成物を精製するために培地を保持する。
本発明は、（ａ）ｏｌｅ遺伝子の核酸配列と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有し、（ｂ）ポリペプチドをコードする、ゲノム核酸配列の上流で生物のゲノムに安定して組み込まれた外来核酸配列を含む遺伝子操作された生物を提供する。例えば、遺伝子操作された生物は、ゲノム核酸配列の上流で生物のゲノムに安定に組み込まれた配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号８７からなる群から選択された核酸配列および配列番号１３５〜４６４のいずれかをコードする核酸配列と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有する外来核酸配列を含むことができる。好ましくは、遺伝子操作された生物は、ゲノム核酸配列の上流で生物のゲノムに安定に組み込まれた配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、および配列番号８７からなる群から選択された核酸配列と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有する外来核酸配列を含むことができる。
好ましい実施形態では、遺伝子操作された生物は、ゲノム核酸配列の上流で生物のゲノムに安定に組み込まれた配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、および配列番号８７からなる群から選択された核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる外来核酸配列を含む。
本発明はまた、（ａ）ｏｌｅ遺伝子の核酸配列と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有する核酸配列を有する生物を提供し、（ｂ）核酸配列を欠失または突然変異することによって調製された遺伝子操作された生物を提供する。例えば、遺伝子操作された生物は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９配列番号２１、配列番号８７からなる群から選択された核酸配列および配列番号１３５〜４６４のいずれかをコードする核酸配列と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有する核酸配列を欠失または突然変異することによって調製される。好ましくは、遺伝子操作された生物は、配列番号５、配列番号７、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１および配列番号８７からなる群から選択された核酸配列と少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％）の配列同一性を有する核酸配列を欠失または突然変異することによって調製される。
好ましい実施形態では、遺伝子操作された生物は、配列番号５、配列番号７、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１および配列番号８７からなる群から選択された核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる核酸配列を欠失または突然変異することによって調製される。
遺伝子操作された生物は、遺伝子操作に適している任意の生物であってよい。好ましくは、遺伝子操作された生物は、Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｆｗ１０９−５、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＦＢ２４、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｎｅｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｍｂｉｆａｒｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｏｋｌａｈｏｍｅｎｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．３８３、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｋｕｅｎｅｎｉａ ｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ａ３、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｂ１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｂｆ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｆ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｃｏｎｇｒｅｇｉｂａｃｔｅｒ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｂａｃｉｌｌｕｍ ａｌｋｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｍｍａｔａ ｏｂｓｃｕｒｉｇｌｏｂｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｂｅｍｉｄｊｉｅｎｓｉｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｌｏｖｌｅｙｉ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＦＲＣ−３２、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｕｒａｎｉｕｍｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｈａｈｅｌｌａ ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ、Ｊａｎｎａｓｃｈｉａ ｓｐ．ＣＣＳ１、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ ａｒａｎｅｏｓａ、Ｍａｒｉｃａｕｌｉｓ ｍａｒｉｓ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｌｇｉｃｏｌａ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｑｕａｅｏｌｅｉ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ ｓｐ．ＰＥ３６、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＧＰ１、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｎｂａａｌｅｎｉｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔｕｓ ｔｅｒｒａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＪＤＲ−２、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｓ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｕｍｏｎｄｉｉ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｉｓ、Ｐｌｅｓｉｏｃｙｓｔｉｓ ｐａｃｉｆｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ａｔｌａｎｔｉｃａ、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ ｉｎｇｒａｈａｍｉｉ、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＣＮＰＴ３、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｂａｌｔｉｃａ、Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ ｎｕｂｉｎｈｉｂｅｎｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂｅｎｔｈｉｃａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｈａｌｉｆａｘｅｎｓｉｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｌｏｉｈｉｃａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｅａｌｅａｎａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｅｄｉｍｉｎｉｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＡＮＡ−３、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＭＲ−４、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＭＲ−７、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．Ｗ３−１８−１、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｗｏｏｄｙｉ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ、およびＸｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａからなる群から選択される。
好ましい実施形態では、遺伝子操作された生物のゲノムに安定して組み込まれた外来核酸配列は、同一条件下で外来核酸配列を組み込む前の生物における同一ポリペプチドの発現と比較して、ゲノム核酸配列によってコードされたポリペプチドの発現が増加している。好ましくは、遺伝子操作された生物は、同一条件下における野生型生物による炭化水素の産生と比較して、多量の炭化水素を産生する。
好ましい実施形態では、遺伝子操作された生物における核酸配列の欠失または突然変異は、同一条件下で核酸配列を欠失または突然変異する前の生物における同一ポリペプチドの産生と比較して、核酸配列によってコードされたポリペプチドの産生の減少を引き起こす。好ましくは、遺伝子操作された生物はケトンを産生する。例えば、遺伝子操作された生物は、同一条件下で核酸配列を欠失または突然変異する前の生物におけるケトンの産生と比較して、多量のケトンを産生することができる。
本発明は、脂肪族ケトン、炭化水素およびそれらの中間体を製造する方法を提供する。操作された炭素鎖長、不飽和部位および分枝点を備えた生成物を産生するために使用できる様々な組換え生物を提供する。このような生成物を製造する方法はまた、高品質のバイオ燃料および特殊な化学物質を創出するために、分解などによって生成物をさらに修飾する方法も提供する。
脂肪族ケトン、炭化水素および炭化水素中間体は、組み換え生物において様々な酵素を発現させるか、または様々な酵素の発現を減弱させることによって特定の炭素鎖特性を有するように操作することができる。例えば、炭素鎖長は、組換え生物において様々なチオエステラーゼを発現させ、一方で内在性チオエステラーゼの発現を減弱させることによって制御することができる。同様に、様々な分岐点は、様々な分枝鎖α−ケト酸脱炭酸酵素／脱水素酵素遺伝子（例えば、ｂｋｄ遺伝子）を発現することによって炭素鎖に導入することができ、飽和の程度はまた、様々な遺伝子を発現することによって、例えば、β−ケト−ＡＣＰ合成酵素遺伝子（例えば、ｆａｂＢ）を過剰発現させることによって制御することができる。特定の炭素鎖特性を提供し、脂肪酸生合成経路による生成を増加させる組換え生物に含めることができる様々な改変の詳細な説明は、本明細書に全体を引用により組み込んだ国際特許出願公開ＷＯ２００７／１３６７６２号に記載されている。
本発明は、本明細書で記載した方法のいずれかを含むバイオ燃料の製造方法を提供する。本明細書では、「バイオ燃料」という用語は、バイオマスから得られたいかなる燃料も意味する。バイオ燃料は、石油をベースにした燃料と置換することができる。例えば、バイオ燃料には、輸送燃料（例えば、ガソリン、ディーゼル、ジェット燃料など）、加熱燃料および発電燃料が含まれる。バイオ燃料は、再生可能なエネルギー源である。具体的に、製造されたバイオ燃料はガソリン、バイオディーゼルまたはジェット燃料であってよい。
生物学的に産生された炭化水素、特に脂肪酸生合成経路を使用して生物学的に産生された炭化水素を含むバイオ燃料は、再生可能な原料から製造されておらず、それ自体新規な物質組成物である。これらの新規燃料は、２重炭素同位体フィンガープリント法または１４Ｃ年代測定法に基づいて石油化学炭素由来の燃料と区別することができる。さらに、バイオ原料炭素（例えば、グルコース対グリセロール）の特定の原料は、２重炭素同位体フィンガープリント法（本明細書に引用により組み込んだ米国特許第７，１６９，５８８号参照）によって決定することができる。
石油をベースにした燃料からバイオ燃料を区別する能力は、商業目的でこれらの物質を追跡するのに有益である。例えば、生物をベースにした炭素同位体プロファイルおよび石油をベースにした炭素同位体プロファイルの両方を含む燃料または化学物質は、石油をベースにした物質のみから製造された燃料および化学物質と区別することができる。したがって、本発明の物質は、特有の炭素同位体プロファイルに基づいて商業目的のために追跡することができる。
バイオ燃料は、それぞれの燃料中の安定炭素同位体比（１３Ｃ／１２Ｃ）を比較することによって、石油をベースにした燃料と区別することができる。所与の生物をベースにした物質における１３Ｃ／１２Ｃ比は、二酸化炭素が固定された時の大気中の二酸化炭素中の１３Ｃ／１２Ｃ比によるものである。これはまた、正確な代謝経路を反映する。地域的な変動も生じる。石油、Ｃ３植物（広葉樹）、Ｃ４植物（イネ科植物）、海成炭酸塩はすべて、１３Ｃ／１２Ｃおよび対応するδ１３Ｃ値に著しい差異を示す。さらに、Ｃ３およびＣ４植物の脂質物質は、代謝経路の結果、同一植物の炭水化物成分から得られた物質とは異なって分析される。
測定精度内で、１３Ｃは同位体分別効果のため大きな変動を示し、バイオ燃料にとってその最も顕著なのは光合成機構である。植物における炭素同位体比が異なる主な原因は、植物の光合成炭素代謝経路、特に、最初のカルボキシル化の間に生じる反応（すなわち、大気ＣＯ２の最初の固定）における差異に密接に関連している。植物の２つの大きな種類は、「Ｃ３」（またはカルビン−ベンソン）光合成回路を含むものおよび「Ｃ４」（またはハッチ−スラック）光合成回路を含むものである。
Ｃ３植物では、最初のＣＯ２固定またはカルボキシル化反応には、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ酵素が関与し、最初の安定な生成物は、３−炭素化合物である。Ｃ３植物、例えば、広葉樹および針葉樹は、温暖な気候帯で優勢である。
Ｃ４植物では、他の酵素、ホスホエノール−ピルビン酸カルボキシラーゼが関与する他のカルボキシル化反応が最初のカルボキシル化反応である。最初の安定な炭素化合物は、その後脱炭酸化される４−炭素酸である。したがって、放出されたＣＯ２は、Ｃ３サイクルによって再固定される。Ｃ４植物の例は、熱帯牧草、トウモロコシおよびサトウキビである。
Ｃ４およびＣ３植物の両方は、一連の１３Ｃ／１２Ｃ同位体比の範囲を示すが、一般的な値は、Ｃ４植物では約−７から約−１３パーミル（per mil)であり、Ｃ３植物では約−１９から約−２７パーミルである（例えば、Stuiver et al., Radiocarbon, 19: 355 (1977)参照）。石炭および石油が一般的にこれの後者の範囲にある。１３Ｃを測定する目盛りは最初、Ｐｅｅ Ｄｅｅベレムナイト（ＰＤＢ）石灰石をゼロと設定して定義され、値はこの物質からの千分偏差で与えられる。「δ１３Ｃ」値は、千分偏差（パーミル）、略して０／００であり、以下のように算出する。
δ１３Ｃ（０／００）＝［（１３Ｃ／１２Ｃ）試料−（１３Ｃ／１２Ｃ）標準物質］／（１３Ｃ／１２Ｃ）標準物質×１０００
ＰＤＢ参照物質（ＲＭ）は使い果たされたので、一連の代替ＲＭがＩＡＥＡ、ＵＳＧＳ、ＮＩＳＴおよびその他の選択された国際同位体研究所の協力で開発された。ＰＤＢの千分偏差の表記はδ１３Ｃである。ＣＯ２の測定は、高精度安定同位体比質量分析（ＩＲＭＳ）によって、質量４４、４５および４６の分子イオンについて行う。
本発明は、本明細書で開示した方法のいずれかによって製造された炭水化物またはバイオ燃料を提供する。具体的に、炭化水素またはバイオ燃料のδ１３Ｃは約−２８以上、約−２７以上、約−２０以上、約−１８以上、約−１５以上、約−１３以上、約−１０以上、および約−８以上であってよい。例えば、炭化水素のδ１３Ｃは、約−３０から約−１５、約−２７から約−１９、約−２５から約−２１、約−１５から約−５、約−１３から約−７、約−１３から約−１０であってよい。本発明はまた、δ１３Ｃが約−１０、−１１、−１２または−１２．３である炭化水素またはバイオ燃料を提供する。
バイオ燃料はまた、それぞれの燃料中の１４Ｃの量を比較することによって石油をベースにした燃料と区別することもできる。１４Ｃの核半減期は５７３０年なので、「古い」炭素を含有する石油をベースにした燃料は、「新しい」炭素を含有するバイオ燃料と区別することができる（例えば、Currie, "Source Apportionment of Atmospheric Particles" Characterization of Environmental Particles, J. Buffle and H. P. van Leeuwen, Eds., 1 of Vol. I of the IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series (Lewis Publishers, Inc) (1992) 3-74参照）。
放射性炭素年代測定の基本的前提は、大気中の１４Ｃ濃度の定常性が生体中の１４Ｃの定常性を導くということである。しかし、１９５０年以来の大気中における核実験および１８５０年以来の化石燃料の燃焼のため、１４Ｃは第２の地球化学的時間特性を得た。大気中のＣＯ２、したがって生物圏における１４Ｃの濃度は、１９６０年代半ばの核実験最盛期にはほぼ２倍になった。それ以来、徐々に宇宙線による（大気中の）定常な同位体規準比（１４Ｃ／１２Ｃ）約１．２×１０−１２に回復してきており、およその緩和「半減期」は７〜１０年である。（この後者の半減期は厳密な意味にとるべきではない。むしろ、核時代の開始からの大気中および生物圏における１４Ｃの変動を追跡するには、詳細な大気中への核投入／崩壊の関数を使用するべきである）。
生物圏炭素の毎年の年代測定で近年可能性を秘めているのは、この後者の生物圏における１４Ｃ時間特性である。１４Ｃは、加速器質量分析（ＡＭＳ）によって測定することができ、結果は「現代炭素画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｄｅｒｎ ｃａｒｂｏｎ）」（ｆＭ）の単位で得られる。ｆＭは、国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）の標準参照物質（ＳＲＭ）４９９０Ｂおよび４９９０Ｃによって定義される。本明細書では、「現代炭素画分」または「ｆＭ」は、それぞれシュウ酸標準物質ＨＯｘＩおよびＨＯｘＩＩとして知られている国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）の標準物質（ＳＲＭ）４９９０Ｂおよび４９９０Ｃによって定義された意味と同じである。基本定義は、ＨＯｘＩ（ＡＤ１９５０を参考にする）の１４Ｃ／１２Ｃ同位体比の０．９５倍に関する。これはほぼ、産業革命以前の森林に修正された崩壊に相当する。現代の生きている生物圏（植物物質）では、ｆＭは約１．１である。
本発明は、少なくとも約１のｆＭ １４Ｃを有することができる炭化水素またはバイオ燃料を提供する。例えば、炭化水素またはバイオ燃料は、ｆＭ １４Ｃが少なくとも約１．０１、ｆＭ １４Ｃが約１から約１．５、ｆＭ １４Ｃが少なくとも約１．０４から約１．１８、またはｆＭ １４Ｃが少なくとも約１．１１１から約１．１２４である。
１４Ｃの別の測定値は、現在の炭素のパーセント、ｐＭＣとして知られている。１４Ｃ年代測定を使用した考古学者または地質学者にとって、ＡＤ１９５０年は「ゼロ年」に等しい。これはまた、１００ｐＭＣを表す。大気中の「爆弾炭素」は、熱核兵器がピークであった１９６３年には通常レベルのほぼ２倍に達した。大気中におけるその分布は出現以来ほぼ同じで、ＡＤ１９５０から生きている植物および動物では１００ｐＭＣを上回る値が示されている。これは時間と共に徐々に減少し、現在の値は１０７．５ｐＭＣ近辺である。これは、トウモロコシなどの新鮮なバイオマス物質の１４Ｃ特性が約１０７．５ＭＣであることを意味している。石油をベースにした化合物のｐＭＣ値はゼロである。化石炭素と今日の炭素を一緒にすると、現在のｐＭＣ含量の希釈が生じる。１０７．５ｐＭＣが今日のバイオマス物質の１４Ｃ含量を表し、０ｐＭＣが石油をベースにした生成物の１４Ｃ含量を表すと仮定すると、この物質のｐＭＣ測定値は２種類の成分の比率を反映している。例えば、現在のダイズから１００％得られた物質の放射性炭素の特性は約１０７．５ｐＭＣであろう。この物質が石油をベースにした生成物で５０％希釈されるならば、放射性炭素特性は約５４ｐＭＣになるだろう。
生物をベースにした炭素含量は、１００％を１０７．５ｐＭＣとし、０％を０ｐＭＣと指定することによって得られる。例えば、９９ｐＭＣと測定された試料は、生物をベースにした炭素含量が９３％に相当する。この値は、生物をベースにした炭素の平均結果と言われ、分析した物質中の全成分が現在の生物物質か、または石油をベースにした物質のいずれか由来であることを想定している。
本発明は、少なくとも約５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００のｐＭＣを有することができる炭化水素またはバイオ燃料を提供する。本発明はさらに、約５０から約１００、約６０から約１００、約７０から約１００、約８０から約１００、約８５から約１００および約８７から約９８、約９０から約９５の間のｐＭＣを有する炭化水素または燃料を提供する。本発明はさらに、約９０、９１、９２、９３、９４または９４．２のｐＭＣを有する炭化水素またはバイオ燃料を提供する。
炭化水素はオレフィンであってよい。オレフィンは、モノ不飽和またはポリ不飽和（例えば、２不飽和、３不飽和など）であってよい。オレフィンの炭素鎖長は、炭素約１０個から約４０個の間であってよい。例えば、オレフィンの炭素鎖長は、約１５個から約３５個、約１７個から約３４個、１８個から約３３個、約１９個から約３３個の間、約２７個から約３３個の間の炭化水素、約２９個から約３１個の間の炭化水素、または約２７、２８、２９、３０、３１、３２もしくは３３個の炭化水素を有することができる。炭化水素は、直鎖炭化水素または分枝鎖炭化水素であってよい。炭化水素は環状部分を含むことができる。
本発明は、本明細書で開示した炭化水素を含むバイオ燃料を提供する。バイオ燃料は、ガソリン、バイオディーゼルまたはジェット燃料であってよい。バイオ燃料は、炭素源から製造することができる。本明細書では、「炭素源」という語句は、原核細胞または単純な真核細胞の増殖のための炭素の供給源としての使用に適した基質または化合物を意味する。炭素源は、限定はしないが、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドおよび気体（例えば、ＣＯおよびＣＯ２）を含む様々な形態であってよい。これらには、例えば、様々な単糖類、例えば、グルコース、フルクトース、マンノースおよびガラクトース；オリゴ糖類、例えば、フルクトオリゴ糖およびガラクトオリゴ糖；多糖類、例えば、キシロースおよびアラビノース；二糖類、例えば、スクロース、マルトースおよびツラノース；セルロース物質、例えば、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム；飽和または不飽和脂肪酸エステル、例えば、コハク酸エステル、乳酸エステルおよび酢酸エスエル；エタノールなどのアルコールあるいはそれらの混合物が含まれる。炭素源はまた、限定はしないがグルコースを含む光合成の産物であり得る。
好ましい炭素源はバイオマスである。本明細書では、「バイオマス」という用語は、生物物質から得られた炭素源を意味する。バイオマスは、バイオ燃料に変換することができる。バイオマスの原料の一例は、植物物質である。例えば、トウモロコシ、サトウキビまたはアメリカクサキビをバイオマスとして使用することができる。バイオマスの別の非限定的例は、動物物質、例えば、牛糞肥料である。バイオマスにはまた、産業、農業、森林および家庭からの廃棄物が含まれる。バイオマスとして使用できるこのような廃棄物の例は、発酵廃棄物、わら、材木、下水、生ゴミおよび残飯である。バイオマスはまた、炭素源、例えば、炭水化物（例えば、単糖類、二糖類または多糖類）を含む。別の好ましい炭素源はグルコースである。好ましくは、炭素源は、再生可能なエネルギー源である。再生可能なエネルギー源はバイオマスであってよい。
以下の実施例はさらに本発明を例示するが、決してその範囲を制限するものではない。
実施例 1
本実施例は、本特許の範囲内で実施例を実行する際に用いられる材料および方法を記載する。特定の方法を記載するが、当業者は他の同様の方法も用い得ることを理解するであろう。一般的に、他に明記しない限りは標準的な実験室業務(laboratory practice)を用いた。例えば、標準的な実験室業務を以下のために用いた: クローニング; 核酸の操作およびシークエンシング; タンパク質の精製および解析; ならびに他の分子生物学的および生化学的手法。かかる手法は、標準的な実験マニュアル、例えば前掲の Sambrook et al.; および前掲の Ausubel et al. において詳細に説明される。
ゲノム配列: Stenotrophomonas maltophilia の全ゲノム配列は、２つの異なる菌株について公に利用可能である。S. maltophilia R551-3 の全ゲノム配列は、http://genome.ornl.gov/microbial/smal/ (2007年5月16日に最終アクセス) において見つけることができる。S. maltophilia K279a 株の全ゲノム配列は、http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_maltophilia/ (2007年5月16日に最終アクセス) において見つけることができる。本明細書に記載されるタンパク質をコードする核酸配列を、両方の配列解読されたゲノムにおいて見出し、ATCC からの S. maltophilia 菌株 17679 において実験的に確認した。加えて、タンパク質活性のいくつかを、本明細書に記載される核酸配列およびコドンが最適化された核酸配列を用いて、E. coli、B. subtilis、B. megaterium、および S. cerevisiae において確認した。
微生物の菌株: 本発明において用いた微生物の菌株は、以下の通りであった:
S. maltophilia (ATCC 菌株番号: 17674、17679、17445、17666);
S. maltophilia ATCC 17679 ΔoleA
S. maltophilia ATCC 17679 ΔoleC
S. maltophilia ATCC 17679 ΔoleD
E. coli T7 Express lysY/Iq (New England Biolabs、Ipswich、MA 01938-2723)
E. coli C41(DE3) (Lucigen Corporation、Middleton、WI 53562)
E. coli C41(DE3) ΔfadE (Lucigen Corporation、Middleton の E. coli C41(DE3)株、fadE 遺伝子 EC 1.3.99.3、アシル-CoA デヒドロゲナーゼの欠失を有する WI 53562、Klein. K. et al.、Eur. J. Biochem. II I 19: 442-450 (1971))。
E. coli C41(DE3) ΔfadE; pET-21b(+)_OleA、pCOLADuet-1_OleC、pCDFDuet-1_OleD
E. coli C41(DE3); pET-21b(+)_OleA
E. coli C41(DE3); pET-21b(+)_OleB
E. coli C41(DE3); pET-21b(+)_OleD
E. coli C41(DE3); pETDuet-1_OleAB; pCOLADuet-1_OleCD
E. coli MG1655 ΔfadE (fadE 遺伝子の欠失を有する E. coli MG1655)
E. coli MG1655 ΔfadE、fadD(+) (fadE 遺伝子の欠失、および fadD の上流の T5 プロモーター配列を有する E. coli MG1655 株)
Saccharomyces cerevisiae Hansen、teleomorph BY4741 (ATCC 201388)
S. cerevisiae BY4741; pESC-HIS_OleA
Bacillus megaterium WH320 (Mo Bi Tec、Germany からの菌株)
B. megaterium WH320; pWH1520_OleCDAB
B. megaterium WH320; pWH1520
Bacillus subtilis IHA01 lacA::spec leuB8 metB5 r(-)m(+) Sp (Bacillus Genetic Stock Center、Columbus からの菌株、OH 菌株番号 BGSC 1A785)
B. subtilis IHA01、pHT01_OleA
Arthrobacter aurescens TC1 (ATCC BAA-1386 からの菌株)
耐性マーカー: 本明細書に記載される実施例において、AmpR、アンピシリン/カルベニシリン (100 μg/mL); KanR、カナマイシン (30 μg/mL); CamR、クロラムフェニコール (34 μg/mL); SmR、ストレプトマイシン/スペクチノマイシン (50 μg/mL); およびテトラサイクリン (E. coli、B. megaterium には 15 μg/mL、S. maltophilia には 50 μg/mL) 耐性マーカーを用いた。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR): 本明細書に記載される多くの発現コンストラクトを作成するため、PCR を用いて DNA から特定の核酸配列を増幅した。本明細書に記載される PCR 反応に用いたプライマーを、表 14 に示す。プラスミドは、表 15 に示す。

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クローニング方法: DNA を表 15 に記載されるベクターへクローニングするために、標準的な分子生物学のクローニング手法を用いた(例えば、前掲の Sambrook et al. を参照)。制限酵素 AatII、AflII、AvrII、BamHI、BglII、HindIII、NcoI、NdeI、NheI、NruI、PciI、ScaI、SfoI、SpeI、XbaI、XhoI および ZraI を New England Biolabs (Ipswich、MA 01938) から購入した。
発現プロトコール: 産物の発現または生産について試験するため、様々なスケールの発酵を行った。これらのプロトコールを以下に記載し、5 mL 発酵、25 mL 発酵または代替の発酵手法のいずれかが記載される各実施例において言及する。
5 mL 発酵: これらの発酵を、15 mL の試験管中で 5 mL の Luria Broth Miller (LB)(EMD、Chemicals、Inc.、San Diego、CA)と共に行った。培養物を 0.1 から 1 の間の OD600 まで増殖させ、IPTG を用いて終濃度 1 mM で誘導をかけた。培養物を、実験に応じて誘導後 6 から 48 時間までのいずれかにおいて抽出した。発酵を 25℃、30℃または 37℃で振盪しながらインキュベートした。
25 mL 発酵: これらの発酵を、125 mL フラスコ中で最終量 25 mL の培地と共に行った。15 mL 試験管中の 5 mL の LB 培地に冷凍庫のストックの掻き取りからの細胞を接種することによって、種培養を調製した。冷凍庫のストックは、LB 培地中にグリセロールを終濃度 20% まで添加し、培養物を -80℃で保管することによって作成した。培養物の OD600 が 0.15 から 0.6 の間に到達するまで、該種培養を 37℃で振盪しながらインキュベートした。その後、培養物を発酵に接種するために用いた。2% グルコースを伴う 22 mL の M9 培地 (6 g/L の Na2HPO4、3 g/L の KH2PO4、0.5 g/L の NaCl、1 g/L の NH4Cl、1 mg/L のチアミン、1 mM の MgSO4、0.1 mM の CaCl2) に、0.15 OD600 単位の細胞密度を有する LB 培地を 2 mL 接種した。次いで、培養物を OD600 が 0.3 から 0.6 単位の間になるまで振盪しながらインキュベートし、その時点で、培養物を IPTG を用いて終濃度 1 mM で誘導をかけた。脂肪酸を供給した実験においては、培養物に誘導をかけたのと同じ時点で脂肪酸を添加した。実験に応じて誘導後 2 から 48 時間までのいずれかにおいて、培養物を抽出した。発酵を 25℃、30℃ または 37℃で振盪しながらインキュベートした。
細胞ライセート(Lysate)プロトコール: 標準的な細胞溶解プロトコールを用いた。簡潔には、超音波処理および/または BugBuster（登録商標） plus Benzonase（登録商標） nuclease reagent kit (カタログ #70750 Novagen of EMD Chemicals、Inc.、San Diego、CA) の使用によって細胞を破壊した。例えば、10 mL の培養物を 3500 rpm で 15 分間遠心し(ローター SX-4750A を備える Allegra X-15R 遠心機、Beckman Coulter、Fullerton、CA)、得られたペレットを 2 mL の BugBuster（登録商標）および 2 μL の Benzonase（登録商標）nuclease 中に再懸濁した。
タンパク質精製プロトコール: His-タグタンパク質を、標準的な手法を用いて精製した。タンパク質を、ユーザープロトコール TB054 Rev. F0106 (Novagen of EMD Chemicals、Inc.、San Diego、CA) 中にある説明にしたがって精製した。
炭化水素の抽出方法:
抽出方法 1: 5 mL ペレット抽出
有機化合物(オレフィン、脂肪族ケトンおよび炭化水素)を、メタノール:ヘキサン抽出プロトコールを用いて細菌の細胞ペレットから抽出した。簡潔には、5 mL の培養物/発酵ブロス(broth)をガラス試験管において 3500 rpm で 15 分間遠心し(Allegra X-15R Centrifuge with rotor SX-4750A、Beckman Coulter、Fullerton、CA)、上清をデカントし、得られたペレットを 100 μL の滅菌蒸留水中に再懸濁し、ボルテックスミキサー上で均一になるまで混合した。次に、1 mL のメタノールを添加し、ボルテックスミキサーを用いてサンプルを混合した。次いで、サンプルを超音波ウォーターバス(Bransonic（登録商標）、Tabletop Ultrasonic Cleaners、model 5510、Danbury、CT)中で 15 分から 1.5 時間の間超音波処理した。超音波処理の後、4 mL のヘキサンを添加し、サンプルをボルテックスミキサー上で混合した。次いでサンプルを、3500 rpm で 15 分間遠心した(Allegra X-15R Centrifuge with rotor SX-4750A、Beckman Coulter、Fullerton、CA)。上層(ヘキサン層)を取り除き、清潔なガラスチューブに添加した。次いで、サンプルを、遠心機(Vacufuge 5301、Eppendorf、Westbury、NY)中において減圧下でおよそ 30 分間、本質的に溶剤が存在しなくなるまで乾燥させた。次いでサンプルを 100 μL の酢酸エチルまたはクロロホルム中に再懸濁した。次に、1 μL のサンプルを以下に記載される検出方法にしたがって GC/MS 上で解析した。
抽出方法 2: インビトロアッセイのための方法
インビトロアッセイのために、有機化合物(オレフィン、脂肪族ケトンおよび炭化水素)を、酢酸エチル/1% 酢酸抽出プロトコールを用いて、インビトロのサンプルから抽出した。インビトロアッセイのサンプルを、1% 酢酸を含有する酢酸エチルを 500 μL 添加することによって抽出した。サンプルをボルテックスミキサー上で混合し、その後、水層と有機層を分離するため 3500 rpm で 5 分間遠心した (ローター FA-45-24-11 を備える遠心機 5424、Eppendorf、Westbury、NY)。上層(酢酸エチル層)を、清潔なチューブに移した。次いでサンプルを、遠心機(Vacufuge 5301、Eppendorf、Westbury、NY)中において減圧下でおよそ 30 分間、本質的に溶剤が存在しなくなるまで乾燥させた。サンプルを 50 μL の酢酸エチル中に再懸濁し、GC/MS および/または GC/FID によって解析した。1 から 10 μL の間を、以下に記載される検出方法にしたがって GC/MS または GC/FID 上で炭化水素含有量について解析した。
抽出方法 3: 小スケール全細胞培養物抽出
0.5 から 1 mL の間の発酵培養物を、1.7 mL のエッペンドルフチューブに加えた。次いで、この培養物を、適切な炭化水素のスパイク(spike)(例えば 10 mg/L のシス-9-トリコセンまたはオレフィンのための 10 mg/L のヘキサコサン、脂肪族ケトンのための 10 mg/L の14-ヘプタコサノン等)を含有する 0.25 から 0.5 mL の間の酢酸エチルを用いて抽出した。培養物と酢酸エチルの混合物を、ボルテックスミキサー上で高速で 10 分間、混合した。次いで、サンプルをエッペンドルフ遠心機において 13,000 rpm で 5 分間遠心した (ローター FA-45-24-11 を備える遠心機 5424、Eppendorf、Westbury、NY)。有機層(上層)を、以下に記載される GC/MS または GC/FID 検出法を用いる解析のために取り除いた。
炭化水素の検出方法:
検出方法 1: 20 分 GC/MS
GC/MS 検出について、以下のプロトコールを用いて炭化水素および脂肪族ケトンを観察し、検証した:
実行時間: 20 分
カラム: HP-5-MS (5% ジフェニルシロキサン、95% ジメチルシロキサン) 部品番号 19091S-433E、長さ: (メートル) 30、内径: (mm) 0.25 ナローボア(narrowbore)、フィルム: (μM) 0.25
MSD スキャン範囲: 50 - 800 M/Z
注入: 1μL Agilent 6850 注入口
注入口: 300℃ スプリットレス
キャリアガス: ヘリウム
オーブン温度: 5 分保持 100℃; 25℃/分で 320℃まで; 5 分保持 320℃
検出: Agilent 5975B VL MSD
検出温度: 300℃
検出方法 2: 5 分 GC/MS
GC/MS 検出について、以下のプロトコールを用いて炭化水素および脂肪族ケトンを検出し、検証した:
実行時間: 4.9 分
カラム: HP-5-MS (5% ジフェニルシロキサン、95% ジメチルシロキサン) 部品番号 19091S-433E、長さ: (メートル) 30、内径: (mm) 0.25 ナローボア(narrowbore)、フィルム: (μM) 0.25
MSD スキャン範囲: 50 - 140 M/Z
注入: 1μL Agilent 6850 注入口
注入口: 300℃ スプリットレス
キャリアガス: ヘリウム
オーブン温度: 225℃で保持なし; 25℃/分で 320℃まで; 1.1 分保持 320℃
検出: Agilent 5975B VL MSD
検出温度: 300℃
検出方法 3: GC/FID
GC/FID 検出について、以下のプロトコールを用いて炭化水素および脂肪族ケトンを検出し、検証した:
実行時間: 興味の対象である炭化水素の長さに応じて 2.75 から 4 分。より長い炭化水素にはより長い時間を用いる。
カラム: Thermo Electron Corporation: (部品番号 UFMC 002 000 000 00): Ph5、フィルム厚 0.4 mm、
長さ: (メートル) 5、
内径: 0.1 mm、
注入するサンプル容積: 実験に応じて 1 から 10 μl
注入口: スプリットレス
キャリアガス: ヘリウム
オーブン温度: 1 分保持 100℃; 200℃/分で 350℃まで; 0.50 分保持 350℃
検出: Thermo FID detector
検出方法 4: 5.8 分 GC/MS
GC/MS 検出について、以下のプロトコールを用いて炭化水素および脂肪族ケトンを観察し、検証した:
実行時間: 5.83 分
カラム: DB-1HT (100% ジメチルポリシロキサン) 部品番号 122-1111 (Agilent Technologies、Inc)、長さ: (メートル) 15、内径: (mm) 0.25 ナローボア(narrowbore)、フィルム: (μM) 0.1
MSD スキャン範囲: 50 - 550 m/z
注入: 1μL Agilent 6890 N 注入口
注入口: 300℃ スプリットレス
キャリアガス: ヘリウム (流速: 1.3 mL/分)
オーブン温度: 160℃で 0.3 分保持; 30℃/分で 320℃まで; 0.2 分保持 320℃
検出: Agilent 5975B XL EI/CI MSD
検出温度: 250℃
プラスミド構築: E. coli、B. subtilis、B. megaterium および S. cerevisiae を含む興味のあるあらゆる細胞における oleA、oleB、oleC および oleD の発現のために、多数のプラスミドを構築した。これらのコンストラクトは、個別の遺伝子を含有するプラスミド、およびオペロン中に遺伝子の組み合わせを含有するプラスミドに分けることができる。
個別の遺伝子 oleA、oleB、oleC および oleD を含有するプラスミド: oleA、oleB、oleC および oleD の遺伝子配列を、これらの遺伝子配列を含有する宿主株のゲノム DNA からの PCR 増幅、または契約に基づく合成遺伝子の設計および生産(DNA2.0 Inc.、Menlo Park、CA 94025)のいずれかによって得た。簡潔には、以下の通りに、oleA、oleB、oleC および oleD を、S. maltophilia ATCC 17679 から単離されたゲノム DNA から増幅した: oleA (配列番号1) を、プライマー LB118 (配列番号29) および LB119 (配列番号30) を用いて増幅した; oleB (配列番号9) を、プライマー LB151 (配列番号35) および LB152 (配列番号36) を用いて増幅した; oleC (配列番号5) を、プライマー LB155 (配列番号31) および LB159 (配列番号32) を用いて増幅した; oleD (配列番号7) を、プライマー LB157 (配列番号33) および LB158 (配列番号34) を用いて増幅した。oleA (配列番号1)、oleB (配列番号9)、oleC (配列番号5) および oleD (配列番号7) の増幅産物を、制限酵素 NdeI および XhoI を用いて pET-21b(+)、pCDFDuet-1、pCOLADuet-1、pETDuet-1 または pACYCDuet-1 へ挿入した。得られた形質転換体から正しいプラスミドクローンを選択し、DNA 消化およびシークエンシングによって確認した。同様のクローニング方法を、oleA (配列番号1)、oleB (配列番号9)、oleC (配列番号5) および oleD (配列番号7) を興味のあるあらゆるベクターへ挿入するために用いることができる。
上記の標準的なクローニング手法を用いて、oleA ヌクレオチド配列を、S. maltophilia ATCC17679 からの天然の oleA DNA 配列を含有する pET21b(+)_OleA プラスミドから細菌発現ベクター pCL1920pTrc へクローニングすることによってプラスミド pCL1920pTrcOleA を構築した。LS9、Inc. において、ベクター骨格 pCL1920pTrc (配列番号24) を構築した。簡潔には、lacIq 配列、pTrc プロモーターおよびマルチクローニングサイトを含有する PCR産物を、LF302 (配列番号76) および LF303 (配列番号77) を用いてプラスミド pTrcHis2A (Invitrogen、Carlsbad、CA) DNA から増幅した。得られた PCR産物を AflII および ZraI で消化し、標準的 DNA ライゲーションによって、AflII および SfoI で切断されたプラスミド pCL1920 (NCCBNr3176 Nucl. Acids Res.、18: 4631、(1990)) へクローニングした。得られたクローンは、インサートを間違った方向で含有し、AflII 制限部位は保存されなかった。得られたプラスミドを、pCL1920pTrc (配列番号24) と命名した。
プラスミド pCL1920pTrcOleA を構築するため、プライマー LB189 (配列番号45) および LF304 (配列番号44) を用いて oleA (配列番号1) を PCR 増幅した。OleA 増幅産物を、制限酵素 PciI および XhoI を用いて pCL1920pTrc へクローニングしてプラスミド pCL1920pTrcOleA を作成した。
B. subtilis における oleA の発現のためのプラスミド pHT01_OleA を構築するため、E. coli における発現のためにコドンが最適化された、S. maltophilia からのアミノ酸配列に基づくヌクレオチド配列を含有する DNA 鋳型 pCL1920pTrcOleCDAB から、プライマー LB388 (配列番号491) および LB386 (配列番号490) を用いて oleA (配列番号3) を PCR 増幅した。OleA 増幅産物を、制限酵素 BamHI および XbaI を用いて pHT01 へクローニングしてプラスミド pHT01_OleA を作成した。
オレフィンシンターゼオペロンを含有するプラスミド:
以下の４つの遺伝子を様々な順序で含有する複数のプラスミドを構築した: oleA、oleB、oleC および oleD。これらのオペロンからの遺伝子を発現する菌株を用いて試験したすべての発酵が、オレフィンを産生した。合成オペロン中の遺伝子の順序は、生物の炭化水素を生産する能力に影響を与えなかった。これらのプラスミドの多くは、以下に記載される実施例において互換的に用いることができる。各々の実施例において用いた実際のプラスミドを、関連の(pertinent)実施例において記載する。
S. maltophilia からのアミノ酸配列に基づく ole 遺伝子を含有するプラスミドにおいて、DNA 配列中における遺伝子の順序に応じて、例えば、OleA、OleB、OleC、OleD、OleAB、OleBC、OleCD、OleABCD 等を用いてプラスミドを命名した。
ole 遺伝子が別の生物のゲノムからのものである場合、遺伝子の名称の後に該遺伝子が由来した生物の最初の３文字を有する括弧を続けた。例えば、OleA(Xan)は、Xanthomonas axonopodis のゲノム配列において見出された OleA のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を表す。
S. maltophilia に基づくタンパク質の配列をコードする oleA、oleB、oleC および oleD 遺伝子を含有する合成オペロンを作成した。ole 遺伝子を、DNA2.0、Inc. (Menlo Park、CA 94025) におけるプログラム改変(program modification)によって、E. coli における発現のためにコドンを最適化した。
合成された遺伝子配列 (配列番号23) を、プラスミド pCL1920pTrcOleABpTrcLOleCD を構築するために用いた。DNA 2.0 によって提供された合成オレフィンオペロン (配列番号23) を、プラスミド pCL1920pTrc へサブクローニングした。PciI および HindIII で消化することによってオペロン断片を単離し、NcoI および HindIII で切断された pCL1920pTrc プラスミドへ連結した。得られたクローンを、pCL1920pTrcOleABpTrcLOleCD (配列番号78) と命名する。
４つのオレフィンシンターゼ遺伝子 (oleA、oleB、oleC および oleD) を異なる順序で含有する別のプラスミド pCL1920pTrcOleCDAB を構築し、以下の実施例のいくつかにおいて使用した。このプラスミドを、以下のように構築した: 最初に、lacIq 配列を含有する PCR産物を NheI および SpeI で消化された pCL1920pTrcOleABpTrcLOleCD のベクター骨格へクローニングすることによって、プラスミド pCL1920pTrcOleCD を構築した。得られたプラスミドは、oleC および oleD 遺伝子の上流に lacIq 配列を含有する。lac リプレッサーを含有する PCR産物を LB270 (配列番号79) および LB271 (配列番号80) を用いて pCL1920pTrc から増幅し、NheI および SpeI での消化によって PCR産物およびベクターをクローニングのために調製した。
次に、oleA および oleB を含有する PCR 断片を、pCL1920pTrcOleCD プラスミドにおける oleC および oleD の下流へクローニングすることによって、オペロンプラスミド pCL1920pTrcOleCDAB を構築した。oleAB PCR産物を、LB272 (配列番号81) および LB275 (配列番号82) を用いて pCL1920pTrcOleABpTrcLOleCD から増幅した。得られた PCR産物を BamHI および BglII で消化し、標準的な DNA ライゲーションによって、BamHI および BglII で消化され Antarctic フォスファターゼ (New England Biolabs、Ipswich、MA 01938) で処理された pCL1920pTrcOleCD へクローニングした。得られたプラスミドを、pCL1920pTrcOleCDAB と命名した。同様の方法を、合成オレフィンオペロンを興味のあるあらゆるベクターへ挿入するために用いることができる。
B. megaterium における発現のためのプラスミド pWH1520_OleCDAB を構築するため、E. coli における発現のためにコドンが最適化された、S. maltophilia からのアミノ酸配列に基づくヌクレオチド配列を含有する DNA 鋳型 pCL1920pTrcOleCDAB から、プライマー LB402 (配列番号488) および LB387 (配列番号489) を用いて oleC、oleD、oleA および oleB を PCR 増幅した。oleC、oleD、oleA および oleB を含有する PCR産物を、SpeI および BglII で消化し、制限酵素 SpeI および BamHI を用いて pWH1520 へクローニングして、プラスミド pWH1520_OleCDAB を作成した。
チオエステラーゼ遺伝子を含有するプラスミド:
Uc FatB1、Cc FatB1、Ch FatB2 および‘tesA を含む様々なチオエステラーゼについてのコード領域を含有する複数のプラスミドを構築した。E. coli‘tesA の遺伝子配列を、E. coli MG1655 のゲノム DNA からの PCR 増幅によって得た。Umbellularia californica の FatB1 (Uc FatB1)、Cinnamomum camphora の FatB1 (Cc FatB1) および Cuphea hookeriana の FatB2 (Ch FatB2) についての遺伝子配列を、契約に基づく(Codon Devices、Cambridge、MA 02139)合成の遺伝子の設計および生産によって得た。簡潔には、プライマー TesA_F (配列番号50) および TesA_R (配列番号51)を用いて‘tesA (配列番号25) を増幅した。合成の遺伝子を、PCR 増幅ならびに標準的な消化およびライゲーションのプロトコールによって発現プラスミドへ再クローニングした。Cc FatB1 (配列番号26) を、プライマー CcFatB_F (配列番号52) および CcFatB_R (配列番号53) を用いて増幅した。Ch FatB2 (配列番号27) を、プライマー ChFatB2_F (配列番号54) および ChFatB2_R (配列番号55) を用いて増幅した。Uc FatB1 (配列番号28) を、プライマー UcFatB1_F (配列番号56) および UcFatB1_R (配列番号57) を用いて増幅した。‘tesA (配列番号25) および Cc FatB1 (配列番号26) の増幅産物を、制限酵素 NdeI および AvrII を用いて pETDuet-1 へクローニングした。Ch FatB2 (配列番号27) および Uc FatB1 (配列番号28) の増幅産物を、制限酵素 XbaI および HindIII を用いて、malE 遺伝子とインフレームの状態で pMAL-c2X (NEB、Ipswich、MA) へクローニングした。
アシル-CoA シンターゼを含有するプラスミド:
２つの別個のベクター、pETDuet-1 および pACYCpTrc を含む多数の異なるコンストラクトから、および E. coli 宿主菌株へ直接組み込まれた構成的プロモーターから、fadD 遺伝子を発現させた。これらのコンストラクトを、以下に記載する。
pETDuet-1_fadD: E. coli からのアシル-CoA シンターゼをコードする fadD 遺伝子を、NcoI/HindIII で消化された pETDuet-1 ベクターへクローニングした。fadD の核酸配列 (配列番号492) を、プライマー fadD_F (配列番号46) および fadD_R (配列番号47) を用いて E. coli C41(DE3) のゲノム DNA から PCR 増幅した。fadD 増幅産物を、制限酵素 NcoI および HindIII を用いて pETDuet-1 へクローニングして、pETDuet-1_fadD を作成した。
pACYCpTrcfadD: pACYCpTrcfadD を構築するため、ベクタープラスミド pACYCpTrc を最初に構築した。lacIq および pTrc プロモーターならびにターミネーター領域を、プライマー pTrc_F (配列番号493) および pTrc_R (配列番号494) を用いて pTrcHis2A (Invitrogen、Calrsbad、CA) から PCR 増幅した。次いで、PCR産物を AatII および NruI で消化した。次いで、PCR産物を、AatII および ScaI で消化された pACYC177 へクローニングした。fadD の核酸配列を、プライマー fadD_F (配列番号46) および fadD_R (配列番号47) を用いて E. coli C41(DE3) のゲノム DNA から PCR 増幅し、NcoI および EcoRI での消化によって pACYCpTrc へクローニングして、プラスミド pACYCpTrcFadD を作成した。
アシル-CoA シンターゼの構成的発現
Cre lox 抗菌性耐性マーカーの除去がその後に続く相同組換え(アレル交換)を用いて、fadD 遺伝子の上流の 5’フランキング領域(配列番号495)を T5 プロモーター配列(配列番号496)を含有する合成の DNA 配列と置換することによって、FadD を構成的に発現させた(詳細なプロトコールについては、例えば Valle, Fernando and Noemi Flores, Overexpression of Chromosomal Genes in Escherichia coli. Vol. 267, Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols. Totowa: Humana Press, 2004 and Palmeros et al., Gene, 247: 255-64 (2000) を参照されたい)。簡潔には、プライマー LB284 (配列番号83) および LB285 (配列番号84) を、loxPcat カセットを pLoxCat2 (配列番号89; Genebank 受入# AJ401047) から PCR 増幅するために用いた。次いで、増幅産物を、プラスミド pKD46 を含有する MG1655 ΔfadE (Genebank 受入 # AY048746) へ形質転換した。loxPcat カセットの組み込みについての選抜後、菌株から pKD46 をキュアリングし、その後、プラスミド pJW168 (Palmeros et al.、Gene、247: 255-64 (2000)) を用いてクロラムフェニコール耐性を除去した。T5 プロモーターによる fadD プロモーターの置換を確認した後、菌株から pJW168 をキュアリングした。得られた菌株は、E. coli MG1655 Δ,fadE、fadD(+) である。
実施例 2
本実施例は、細菌における OleA、OleC および OleD の発現がオレフィンの生産をもたらすことを実証する。
oleA、oleC および oleD の核酸配列を、PCR を用いて S. maltophilia から増幅した。これらの配列を、標準的なクローニング手法を用いて、実施例 1 に記載される通りに細菌発現ベクターへ挿入した。次いで、oleA、oleC および oleD を含有するプラスミドを、E. coli C41(DE3) ΔfadE を形質転換するために用いた。遺伝子型 E. coli C41(DE3) ΔfadE; pET-21b(+)_OleA、pCOLADuet-1_OleC、pCDFDuet-1_OleD を有する、得られた細菌菌株を 5 mL 発酵プロトコールを用いて試験し、抽出方法 1 を用いて抽出した。次いで、抽出物を、炭化水素(例えばオレフィン)および脂肪族ケトンの検出のために、検出方法 1 を用いて、実施例 1 に記載される通りに、GC/MS によって解析した。GC/MS によって観察された炭化水素は、炭素鎖長が C27 から C31 までの範囲の一価、二価および三価の不飽和オレフィンであった(図 1 および 2A J を参照)。この事は、E. coli における oleA、oleC および oleD の発現がオレフィンの生産をもたらすことを実証した。同様の方法を、興味のあるあらゆる細胞において oleA、oleC および oleD を発現させるために用いることができる。さらに、同様の方法を、脂肪族ケトンまたは炭化水素の生産を解析するために用いることができる。
oleA、oleB、oleC および oleD の発現が広範囲の細菌において炭化水素の生産をもたらすことを実証するため、Bacillus megaterium における oleA、oleB、oleC および oleD の発現のためにプラスミド pWH1520_OleCDAB を作成した(実施例 1 を参照)。B. megaterium WH320 のあらかじめ作成されたプロトプラスト(Mo Bi Tec、Germany から)を、pWH1520_OleCDAB で形質転換して、B. megaterium WH320; pWH1520_OleCDAB 株を作出した。B. megaterium WH320 のあらかじめ作成されたプロトプラスト(Mo Bi Tec、Germany から)を、pWH1520 で形質転換して、空ベクター対照として用いられる B. megaterium WH320; pWH1520 を作成した。
E. coli にコドンが最適化された、S. maltophilia の oleC、oleD、oleA および oleB についての配列を含有するプラスミドを用いて、核酸配列を PCR によって増幅した。これらの配列を、E. coli についての標準的なクローニング手法を用いて、細菌発現ベクターへ挿入した(実施例 1 参照)。次いで、oleA、oleB、oleC および oleD を含有するプラスミド(pWH1520_OleCDAB)ならびに空ベクター対照プラスミド(pWH1520)を、B. megaterium WH320 を形質転換するために用いた。
Puyet et al.、FEMS Microbiol. Lett.、40: 1-5.(1987)からの方法の改変である、プロトプラストと共に提供されるプロトコール(例えば Bacillus megaterium protein expression system Handbook 2007 を参照)を用いて、B. megaterium WH320 のプロトプラスト (Mo Bi Tec、Germany から) を、上記のプラスミドで形質転換した。
遺伝子型 B. megaterium WH320; pWH1520_OleCDAB および B. megaterium WH320; pWH1520 を有する、得られた細菌菌株を、培養物に誘導をかけるために IPTG の代わりに 0.5% キシロースを用いるよう改変された 5 mL 発酵プロトコール(プラスミドで形質転換された細胞を選択するために 15 mg/L テトラサイクリンを用いた)を用いて試験した。用いた抽出方法は、抽出方法 1 であった。
炭化水素の存在についての解析を、検出方法 4 を用いて、実施例 1 に記載される通りに、GC/MS 解析によって行った。GC/MS データを、それぞれ 25、26、27、28 および 29 の炭素を含有する一価不飽和オレフィンの生産を示す別々の親イオン 350、364、378、392 および 406 についてイオン抽出した(図 17A-J を参照)。
これらの化合物は、同じ条件下で解析される同じ炭素数の直鎖オレフィンよりもわすかに早く溶出する。これは、B. megaterium が分枝鎖オレフィンを生産したことを示唆する。B. megaterium は分枝鎖状の脂肪酸アシル基質(fatty acyl substrate)を自然に生産したため、観察されるオレフィンは分枝鎖オレフィンであると思われる。B. megaterium WH320; pWH1520 からの対照抽出物において、炭化水素は検出されなかった。
本実施例において反映される実験結果は、様々な細菌を、oleA、oleB、oleC および oleD を発現し、炭化水素を生産するよう操作し得ることを実証する。さらに、本実施例は、グラム陽性の細菌を、oleA、oleB、oleC および oleD を発現し、炭化水素を生産するよう操作し得ることを実証する。さらに、本実施例は、Bacillus 属の細菌を、oleA、oleB、oleC および oleD を発現し、炭化水素を生産するよう操作し得ることを実証する。加えて、本実施例は、宿主生物によって自然に生産される脂肪族アシル鎖の型が、生産される炭化水素の型に影響を与えることを実証する。
脂肪族ケトンおよび炭化水素(例えばオレフィン)を、S. maltophilia の細菌細胞ペレットからも抽出し、検出方法 1 を用いて GC/MS を使用して解析した。S. maltophilia によって生産されたオレフィン(図 3、4A および 4C を参照)は、E. coli の oleA、oleC および oleD によって生産されたオレフィン(図 1 参照)とは異なる。したがって、オレフィンの構造 (例えば、飽和の程度、鎖の長さおよび分枝鎖または非分枝鎖の存在) は、宿主に依存する。これらの差異は、様々な型の脂肪族アシル鎖を生産する生物の能力を直接に反映するものである。この事は、脂肪酸生合成経路が変更されると、異なる型のオレフィンが生産されることを示す。
oleA が S. maltophilia におけるオレフィンの生産に必要かどうかを決定するため、遺伝子欠失をもたらす相同組換え(アレル交換)の自殺ベクターに基づく方法を用いて、S. maltophilia の oleA ノックアウト株を作出した。簡潔には、Hoang et al.、Gene、212: 77-86、(1998) によって記載される遺伝子置換方法を用いて、oleA 遺伝子領域の欠失を生み出した。より具体的には、SOE PCR 法(例えば Horton et al.、Gene、77: 61-8 (1989) を参照)を用いて、oleA 遺伝子領域の上流および下流の領域を増幅し、一緒にした(placed together)。SOE PCR産物を XbaI および HindIII で切断し、XbaI および HindIII で消化された pEX18Tc 自殺ベクター(前掲の Hoang et al. を参照)へクローニングした。5' フランキング領域は、PCR プライマー LB200 (配列番号58) および LB203 (配列番号61) を用いた。3' フランキング領域は、PCR プライマー LB201 (配列番号59) および LB205 (配列番号63) を用いた。pEX18Tc へクローニングされた、連結された PCR 欠失産物 (配列番号75) は、PCR プライマー LB202 (配列番号60) および LB204 (配列番号62) を用いて、5' および 3' PCR産物の組み合わせから PCR 増幅によって生産された。
野生型 S. maltophilia および変異体 S. maltophilia ΔoleA (oleA を欠く S. maltophilia) からの抽出物を、検出方法 2 を用いて GC/MS によって解析した。野生型 S. maltophilia において、オレフィンが観察された(図 4A 参照)。S. maltophilia ΔoleA においては、オレフィンは観察されなかった(図 4B 参照)。これらの結果は、oleA 遺伝子の欠失が S. maltophilia におけるオレフィン生産の消失をもたらしたことを実証する。
oleC が S. maltophilia におけるオレフィンの生産に必要かどうかを決定するため、遺伝子欠失をもたらす相同組換え(アレル交換)の自殺ベクターに基づく方法を用いて、S. maltophilia の oleC ノックアウト株を作出した。簡潔には、Hoang et al.、Gene、212: 77-86、(1998) によって記載される遺伝子置換方法を用いて、oleC 遺伝子領域の欠失を生み出した。より具体的には、SOE PCR 法 (例えば Horton et al.、Gene、77: 61-8 (1989) を参照) を用いて、oleC 遺伝子領域の上流および下流の領域を増幅し、一緒にした(placed together)。SOE PCR産物を XbaI および HindIII で切断し、XbaI および HindIII で消化された pEX18Tc 自殺ベクター(前掲の Hoang et al. を参照)へクローニングした。
5'フランキング領域は、PCR プライマー LB110 (配列番号465) および LB112 (配列番号467)を用いた。3'フランキング領域は、PCR プライマー LB111 (配列番号466) および LB114 (配列番号469) を用いた。pEX18Tc へクローニングされた、連結された PCR 欠失産物 (配列番号471) は、PCR プライマー LB113 (配列番号468) および LB115 (配列番号470) を用いて、5' および 3' PCR産物の組み合わせから PCR 増幅によって生産された。
野生型 S. maltophilia および変異体 S. maltophilia ΔoleC (oleC を欠く S. maltophilia) からの抽出物を、検出方法 2 を用いて GC/MS によって解析した。野生型 S. maltophilia において、オレフィンが観察された(図 4A 参照)。S. maltophilia ΔoleC においては、オレフィンは観察されなかった(図 4D 参照)。S. maltophilia ΔoleC において、脂肪族ケトンが観察された(図 4D 参照)。これらの結果は、oleC 遺伝子の欠失が S. maltophilia におけるオレフィン生産の消失をもたらしたことを実証する。
oleD が S. maltophilia におけるオレフィンの生産に必要かどうかを決定するため、遺伝子欠失をもたらす相同組換え(アレル交換)の自殺ベクターに基づく方法を用いて、S. maltophilia の oleD ノックアウト株を作出した。簡潔には、Hoang et al.、Gene、212: 77-86、(1998) によって記載される遺伝子置換方法を用いて、oleD 遺伝子領域の欠失を生み出した。より具体的には、SOE PCR 法 (例えば Horton et al.、Gene、77: 61-8 (1989) を参照) を用いて、oleD 遺伝子領域の上流および下流の領域を増幅し、一緒にした(placed together)。SOE PCR産物を XbaI および HindIII で切断し、XbaI および HindIII で消化された pEX18Tc 自殺ベクター(前掲の Hoang et al. を参照)へクローニングした。
5'フランキング領域は、PCR プライマー LB122 (配列番号472) および LB124 (配列番号474) を用いた。3'フランキング領域は、PCR プライマー LB123 (配列番号473) および LB127 (配列番号476) を用いた。pEX18Tc へクローニングされた、連結された PCR 欠失産物 (配列番号477) は、PCR プライマー LB125 (配列番号475) および LB127 (配列番号476) を用いて、5' および 3' PCR産物の組み合わせから PCR 増幅によって生産された。
野生型 S. maltophilia および変異体 S. maltophilia ΔoleD (oleD を欠く S. maltophilia) からの抽出物を、検出方法 2 を用いて GC/MS によって解析した。野生型 S. maltophilia において、オレフィンが観察された(図 4C 参照)。S. maltophilia ΔoleD においては、オレフィンは観察されなかった。S. maltophilia ΔoleD において、脂肪族ケトンが観察された(図 4E 参照)。これらの結果は、oleD 遺伝子の欠失が S. maltophilia におけるオレフィン生産の消失をもたらした事を実証する。
本実施例において反映される実験結果は、細菌における oleA、oleC および oleD の発現がオレフィンの生産をもたらすことを実証する。生産されるオレフィンは、宿主によって構造が異なり得る。さらに、本実施例において反映される実験結果は、OleA、OleC および OleD が S. maltophilia におけるオレフィンの生産に必要であることを実証する 。
実施例 3
本実施例は、細菌における oleA の発現が脂肪族ケトンの生産をもたらしたことを実証する。
実施例 1 および 2 に記載される通りに、E. coli において oleA を発現させた。oleA を含有するプラスミドを、E. coli C41(DE3) を形質転換するために用いた。遺伝子型 E. coli C41(DE3); pET-21b(+)_OleA を有する、得られた細菌菌株を、5 mL 発酵プロトコールを用いて試験した。脂肪族ケトンおよび炭化水素(例えばオレフィン)の生産についての解析を、実施例 1 に記載される通りに、検出方法 1 を用いて、GC/MS 解析がその後に続く抽出方法 1 を用いることによって行った。GC/MS によって観察された脂肪族ケトンは、飽和、一価不飽和および二価不飽和の脂肪族ケトンであった。該脂肪族ケトンは、炭素鎖長が C27 から C31 までの範囲であった(図 5A C および 6A H 参照)。
oleA の発現が広範囲の細菌において脂肪族ケトンの生産をもたらすことを実証するため、Bacillus subtilis における oleA の発現のためにプラスミド pHT01_OleA を作成した (実施例 1 参照)。B. subtilis IHA01 を pHT01_OleA で形質転換して、B. subtilis IHA01; pHT01_OleA 株を作出した。B. subtilis IHA01 を pHT01 で形質転換して、対照として働く B. subtilis IHA01; pHT01 を作出した。
S. maltophilia の、E. coli にコドンが最適化された oleA の配列を含有するプラスミドを用いて、核酸配列を PCR によって増幅した。これらの配列を、E. coli についての標準的なクローニング手法を用いて(例えば、実施例 1 を参照)、細菌発現ベクターへ挿入した。
次いで、oleA (pHT01_OleA) を含有するプラスミドおよび空ベクター対照プラスミド (pHT01) を、B. subtilis IHA01 を形質転換するために用いた。Spizizen、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、44: 1072-1078 (1958) のプロトコールに従い、自然形質転換(natural transformation)によって B. subtilis を形質転換した。
遺伝子型 B. subtilis IHA01; pHT01_OleA および B. subtilis IHA01; pHT01 を有する、得られた細菌菌株を、5 mL 発酵プロトコールを用いて試験した。用いた抽出方法は、抽出方法 1 であった。脂肪族ケトンおよび炭化水素(例えばオレフィン)の存在についての解析を、実施例 1 に記載される通りに、検出方法 4 を用いて GC/MS によって行った。25、27 および 29 の炭素を含有する飽和脂肪族ケトンが観察された。それぞれ C25、C27 および C29 脂肪族ケトンについての複数のピークは、脂肪族ケトンの多数の異なる分枝状異性体が存在したことを反映する (図 18A-E を参照)。
本実施例において反映される実験結果は、様々な細菌を、oleA を発現し、脂肪族ケトンを生産するよう操作し得ることを実証する。さらに、本実施例は、グラム陽性の細菌を、oleA を発現し、脂肪族ケトンを生産するよう操作し得ることを実証する。さらに、本実施例は、Bacillus 属の細菌を、oleA を発現し、脂肪族ケトンを生産するよう操作し得ることを実証する。加えて、本実施例は、宿主生物によって自然に生産される脂肪族アシル鎖の型が、生産される炭化水素の型に影響を与えることを実証する。
実施例 4
本実施例は、oleA (配列番号2) を発現する E. coli の細胞からのライセートをアシル-CoA 基質と混合するインビトロアッセイを用いて、脂肪族ケトンの生産を観察できることを実証する。
実施例 1 および 3 に記載される通りに、E. coli において oleA を発現させた。得られた組換え細菌を、実施例 1 に記載される通りに、培養し、誘導をかけ、ペレット化し、OleA を含有する細胞ライセート(OleA-細胞ライセート)を作るために用いた。インビトロアッセイ混合物は、10 μL の、pH 7.0 の 0.1 M リン酸バッファー中に懸濁されたミリストイル-CoA リチウム塩 (基質) の 10 mM ストック溶液 (Sigma-Aldrich St. Louis、MO からの M4414)、1 μL の 500 mM トリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィン (THP) 還元剤、50 μL の OleA-細胞ライセート、および 39 μL の pH 7.0 の 0.1 M リン酸バッファーから構成された。基質または OleA-細胞抽出物を伴うおよび伴わない組み合わせを含む対照サンプルも調製した。サンプルを、37℃で 1 時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、0.1 mg/mL のヘキサコサン溶液 10 μL を、対照スパイク(control spike)として抽出前に各反応へ添加した。サンプルを、1% 酢酸を含有する酢酸エチル 500 μL を用いて抽出した。混合物をボルテックスミキサー上で混合し、その後に遠心分離した。上層(酢酸エチル層)を清潔なガラス管へ移し、遠心機(Vacufuge 5301、Eppendorf、Westbury、NY)中において減圧下で乾燥させた。サンプルを、50 μL の酢酸エチル中に再懸濁させた。1 から 10 μL の間を、実施例 1 に記載される方法に従って、GC/MS または GC/FID のいずれかによって解析した。あらゆる OleA-細胞ライセートを、脂肪族ケトンを生産するのに十分な条件下で基質と共にインキュベートし、その後に脂肪族ケトンの生産を解析するために、同様の方法を用いることができる。
GC/MS および GC/FID によって観察された、得られた脂肪族ケトンは、飽和、一価不飽和および二価不飽和のものであった。脂肪族ケトンは、炭素鎖長が C27 から C31 までの範囲であった(図 7A および 7B 参照)。基質および OleA 抽出物を含有するサンプルを、他のすべての対照サンプルの組合せと比較した。全ての対照サンプルと比べて増大した量の C27 脂肪族ケトンの生産は、OleA において見出されるアシル縮合(acyl-condensing)活性を示した(図 7C 参照)。
本実施例において反映される実験結果は、アシル補酵素Ａがインビトロアッセイにおける脂肪族ケトンの生産のための基質であること、および oleA の発現が脂肪族ケトンの生産に必要であることを実証する。
実施例 5
本実施例は、pH 7.0 の 0.1 M リン酸バッファー中において精製された酵素(例えば OleA タンパク質)を精製された基質(例えばアシル補酵素Ａ、アシル-ACP 等)と混合するインビトロアッセイを用いて、脂肪族ケトンを観察できることを実証する。
実施例 1 および 3 に記載される通りに、E. coli において oleA を発現させた。得られた組換え細菌を、実施例 1 に記載される通りに、培養し、誘導をかけ、ペレット化し、精製 OleA タンパク質を作るために用いた。インビトロアッセイの混合物は、0.1 mM から 1 mM までの終濃度に希釈された基質(例えばアシル補酵素Ａ、アシル-ACP、またはアシル補酵素Ａとアシル-ACP との混合物)、および 20 μL の、500 mM の塩化マグネシウムを伴う pH 7.0 の 0.1 M リン酸バッファー中の 0.6 mg/mL の精製 OleA タンパク質の溶液で構成された。各々のアッセイ混合物を、37℃で 1 時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、250 μL の酢酸エチルを各アッセイ混合物に添加し、各アッセイ混合物をボルテックスミキサー上で 10 分間混合した。アッセイ混合物の酢酸エチル画分を、微量遠心機における 13000 rpm での 5 分間の遠心分離によって、水相から分離した。15 μL の酢酸エチル画分(上層)を、GC/MS バイアルに移し、各々の酢酸エチル画分を当該技術分野において周知の化学イオン化検出法を用いて GC/MS 上で解析する前に、0.1 mg/mL のヘキサコサン溶液 1.5 μL を対照スパイクとして各々の酢酸エチル画分中に添加した(図 8A B 参照)。
炭素鎖長が C19 から C31 までの範囲の、飽和、一価不飽和および二価不飽和の脂肪族ケトンが観察された。対照アッセイ混合物(例えば、基質を伴わない精製酵素を含有するアッセイ混合物、または精製酵素を伴わない精製基質を含有するアッセイ混合物)のいずれにおいても、脂肪族ケトンは観察されなかった。
表 16-18 は、試験した基質の組合せおよび生産された脂肪族ケトンの型を示す。脂肪族ケトンは、以下の基質の組合せによって形成された: アシル-CoA とアシル-CoA、アシル-ACP とアシル-ACP、およびアシル-CoA と acyl-ACP (各組合せからのデータを、それぞれ表 16、17 および 18 に示す)。基質を表の上側および左側に示し、各々のエントリーは、形成された各々の脂肪族ケトンについての、二重結合の数がその後に続く炭素鎖の長さを示す(例えば、C27:1 は、27 の炭素および１つの二重結合を有する脂肪族ケトンをいい、C23 は、23 の炭素を有する完全に飽和した脂肪族ケトンをいう、等である)。
Figure 0005912251
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本実施例において反映される実験結果は、脂肪族ケトンの存在によって OleA の活性を検出するために、インビトロアッセイを利用できることを実証する。加えて、本実施例において反映される実験結果は、脂肪族ケトンを生産するために、アシル補酵素Ａおよびアシル-ACP の両方を、単独でまたは組合せて、OleA による基質として用い得ることを実証する。広範囲の脂肪族ケトン産物を生み出すため、基質の鎖長および飽和の程度は異なり得る。
実施例 6
本実施例は、本明細書に記載される S. maltophilia の核酸配列およびアミノ酸配列を用いる、さらなる oleA、oleC および oleD の核酸配列およびアミノ酸配列の同定を記載する。
S. maltophilia の OleA、OleC および OleD の配列に関するタンパク質のアミノ酸配列を、NCBI BLAST タンパク質アラインメントプログラムを用いて nr データベースおよび多数の他の公的にアクセス可能なデータベースを検索することによって決定した。To demonstrate how to identify and test for oleA、oleC および oleD 遺伝子ファミリーのさらなるメンバーの活性についてどのように同定および試験するのかを示すため、近縁の生物である Xanthomonas axonopodis からの遺伝子(oleA、oleC および oleD)、および２つの遠縁の生物からの遺伝子、Chloroflexus aggregans の oleA、oleC および oleD ならびに Plesiocystis pacifica の oleC をクローニングし、以下のように試験した。
本実施例において用いるプラスミドを、実施例 1 に記載される同じ細菌菌株、耐性マーカーおよび PCR 手法を用いて作成した。プラスミドのより詳細な説明については、表 15 を参照されたい。同様に、実施例 1 に記載される 5 mL 発酵プロトコール、炭化水素抽出方法 1 および GC/MS 炭化水素検出方法 1 を、炭化水素および炭化水素中間体を同定するために用いた。
自然に高発現する E. coli のタンパク質を模倣するコドン分布を選択するためにタンパク質-2-DNA ソフトウェア(例えば Gustafsson et al.、Trends Biotechnol. 22: 346-353 (2004) を参照)を用いて、興味のある遺伝子を E. coli における発現のために最適化されるよう設計した(例えば Henaut et al., Analysis and predictions from E. coli sequences, In E. coli and Salmonella typhimurium Cellular and Molecular Biology, Volume 2, Edited by: Neidhardt et al., Washington DC, ASM press, pp. 2047-2066 (1996)を参照されたい)。１または複数の遺伝子を、文献において既に記載されているもの(例えば Dillon et al., Biotechniques, 9: 298-300 (1990)を参照) と同様の非鋳型(non-template)PCR によって合成した。遺伝子合成を、DNA2.0 (Menlo Park、CA) によって行った。
合成のオープンリーディングフレームを、プラスミド pJ201 (DNA 2.0、Menlo Park、CA) へクローニングした。これらの遺伝子を、pET21d の T7 プロモーターの上流、マルチクローニングサイトにおける NcoI 部位および HindIII 部位の間へサブクローニングした。タンパク質の配列の 5' および 3' 末端を保存するようにプライマーを設計した。S. maltophilia からのアミノ酸配列に基づいてコドンが最適化された oleA のバージョン(配列番号3)を、LF305 (配列番号37) および LF306 (配列番号38) プライマーを用いて DNA 2.0 プラスミドから PCR 増幅した (プライマー配列については表 14 を参照)。PCR産物を PciI および HindIII で消化し、pET21d ベクターへクローニングした。Xanthomonas axonopodis のアミノ酸配列 GenBank 受入 # NP_640589.1 GI:21241007 (配列番号12) に基づく oleA のオープンリーディングフレーム (配列番号11) を、プライマー LF307 (配列番号39) および LF308 (配列番号40) を用いて DNA 2.0 プラスミドから PCR 増幅した。PCR産物を PciI および HindIII で消化し、pET21d ベクターへクローニングした。Chloroflexus aggregans のアミノ酸配列 DSM 9485 NCBI GenBank 受入 # ZP_01515932.1 GI:118047293 (配列番号18) に基づく oleA のオープンリーディングフレーム (配列番号17) を、プライマー LF313 (配列番号41) および LF314 (配列番号42) を用いて DNA 2.0 プラスミドから PCR 増幅した。PCR産物を PciI および HindIII で消化し、pET21d ベクターへクローニングした。Xanthomonas axonopodis からの oleC (配列番号13) および oleD (配列番号15) 遺伝子、Chloroflexus aggregans からの oleC (配列番号19) および oleD (配列番号21) 遺伝子ならびに Plesiocystis pacifica からの oleC 遺伝子 (配列番号87) の合成のバージョンを、DNA 2.0 pJ201 ベクターから、NcoI および HindIII を用いて pCOLADuet および pET21d ベクター内の T7 プロモーターの前へ直接サブクローニングした。
S. maltophilia、Xanthomonas axonopodis および Chloroflexus aggregans からの OleA の脂肪族ケトン生産活性を、それぞれの OleA を E. coli において発現させた場合の脂肪族ケトンを検出することによって評価した。E. coli C41(DE3) 細胞を、興味のあるプラスミドで形質転換し、記載された T7 発現プロトコールを用いて誘導をかけた。次に、抽出方法 1 を用いてペレットを抽出し、GC/MS 検出方法 1 によって脂肪族ケトンを観察した。同様の方法を、興味のあるあらゆる生物からの OleA を発現させるため、およびその後に GC/MS によって脂肪族ケトンを検出するために用いることができる。GC/MS によって観察された脂肪族ケトンは、炭素鎖長が C27 から C33 までの範囲の、飽和、一価不飽和および二価不飽和のものであった (図 9 および表 19 参照)。
Xanthomonas axonopodis および Chloroflexus aggregans からのOleA、OleC および OleD、ならびに Plesiocystis pacifica からの OleC の炭化水素合成酵素活性を、オレフィン生産について試験する相補性アッセイを用いて評価した。X. axonopodis および C. aggregans からの OleA の活性を、S. maltophilia からの OleC および OleD をも発現した E. coli 菌株において評価した。OleC の活性を、S. maltophilia からの OleA および OleD をも発現した E. coli 菌株において評価した。より具体的には、OleA の炭化水素合成酵素活性について試験するため、細胞を、興味のある生物からの oleA、oleC (S. maltophilia) および oleD (S. maltophilia) を保有する３つのプラスミドで形質転換した。次いで、形質転換された細胞を、発酵、抽出、および GC/MS 検出方法に供した。
OleC の炭化水素合成酵素活性について試験するため、細胞を、oleAB (S. maltophilia)、興味のある生物からの oleC、および oleD (S. maltophilia) を保有する３つのプラスミドで形質転換した。E. coli への OleB の付加は任意である。次いで、形質転換された細胞を、発酵、抽出および GC/MS 検出方法に供した。
OleD の炭化水素合成酵素活性について試験するため、細胞を、oleAB (S. maltophilia)、oleC (S. maltophilia) および興味のある生物からの oleD を保有する３つのプラスミドで形質転換した。E. coli への OleB の付加は任意である。次いで、形質転換された細胞を、発酵、抽出および GC/MS 検出方法に供した。
例えば、C. aggregans、X. axonopodis および P. pacifica からの oleC の活性を評価するために用いた菌株は、以下の遺伝子型のものであった: E. coli C41(DE3) ΔfadE; pCOLADuet_OleAB、pCDFDuet_OleD、pET21d_OleC(Chl)、E. coli C41(DE3) ΔfadE; pCOLADuet_OleAB、pCDFDuet_OleD、pET21d_OleC(Xan)、E. coli C41(DE3) ΔfadE; pCOLADuet_OleAB、pCDFDuet_OleD、pET21d_OleC(Ple)。C. aggregans および X. axonopodis からの oleD の活性を評価するために用いた菌株は、以下の遺伝子型のものであった: E. coli C41(DE3) ΔfadE; pCOLADuet_OleAB、pCDFDuet_OleC、pET21d_OleD(Chl)、E. coli C41(DE3) ΔfadE; pCOLADuet_OleAB、pCDFDuet_OleC、pET21d_OleD(Xan)。C. aggregans および X. axonopodis からの oleA の活性を評価するために用いた菌株は、以下の遺伝子型のものであった： E. coli C41(DE3); ΔfadE; pET21d_OleA(Chl); pACYCDuet_OleCD; pCDFDuet_fadD および E. coli C41(DE3); ΔfadE; pET21d_OleA(Xan); pACYCDuet_OleCD; pCDFDuet_fadD。
専ら S. maltophilia のアミノ酸配列に基づく ole 遺伝子が E. coli における炭化水素生産に必要なわけではない事を実証するため、３つの X. axonopodis のタンパク質配列をコードする oleA、oleC および oleD 遺伝子を有する菌株を、E. coli における炭化水素生産について試験するために用いた。E. coli C41(DE3) ΔfadE; pET21d_OleA(Xan)、pCOLADuet_OleD(Xan)、pCDF_Duet_OleC(Xan) を作成し、炭化水素を生産する能力について評価した。次いで、ペレットを抽出し、GC/MS によって炭化水素の生産について解析した。GC/MS によって観察された炭化水素は、炭素鎖長が C27 から C31 までの範囲の、一価不飽和、二価不飽和および三価不飽和のオレフィンであった (表 19)。
本実施例において反映される実験結果は、E. coli C41(DE3) ΔfadE において発現した場合、S. maltophilia、Xanthomonas axonopodis および Chloroflexus aggregans からの３つの関連する OleA タンパク質配列がすべて、脂肪族ケトンを生産するよう機能することを実証する。本実施例において反映される実験結果はまた、既知の機能する oleC および oleD 遺伝子を発現する E. coli C41(DE3) ΔfadE において発現した場合、S. maltophilia、Xanthomonas axonopodis および Chloroflexus aggregans からの OleA タンパク質配列がすべて、炭化水素を生産するよう機能することを実証する。さらに、本実施例において反映される実験結果は、既知の機能する oleA および oleD 遺伝子を発現する E. coli C41(DE3) ΔfadE において発現した場合、Xanthomonas axonopodis、Chloroflexus aggregans および Plesiocystis pacifica からの３つの関連する OleC タンパク質配列がすべて、オレフィンを生産するよう機能することを実証する。同様に、既知の機能する oleA および oleC 遺伝子を発現する E. coli C41(DE3) ΔfadE において発現した場合、Xanthomonas axonopodis および Chloroflexus aggregans からの２つの関連する OleD タンパク質配列は両者ともに、オレフィンを生産するよう機能する。さらに、他の機能する ole 遺伝子と組み合わせて活性を示す ole 遺伝子は、それらが同じ生物に由来するか否かに関わらず、炭化水素を生産する。例えば、Xanthomonas axonopodis からの ole 遺伝子は、S. maltophilia 由来の ole 遺伝子と共に機能して炭化水素を生産する。

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本実施例は、脂肪族ケトン活性を有する OleA タンパク質を同定するためのインビボアッセイ方法を実証する。さらに、本実験は、炭化水素合成酵素活性を有する OleA、OleC および OleD タンパク質を同定するためのインビボアッセイ方法を実証する。
実施例 7
本実施例は、公的に利用可能なデータベースにおいてさらなる OleA、OleB、OleC および OleD タンパク質配列を同定するために、アミノ酸モチーフを用い得ることを実証する。
簡潔には、タンパク質データベースを特定のアミノ酸パターン(モチーフ)について検索するためのプログラムが、インターネットを通して利用可能である。かかる１つのプログラムは、京都大学バイオインフォマティクスセンターを通して GenomeNet サービスによって提供される。2007年8月1日現在、ウェブサイトは http://motif.genome.jp/MOTIF2.html であった。このモチーフ検索プログラムは、使用者に以下のデータベースを検索する能力を提供する: Swiss-Prot、PDBSTR、PIR、PRF、GENES および NR-AA 。使用者は、PROSITE フォーマットにおいて特定のアミノ酸パターンを入力する (例えば Hofmann et al., Nucleic Acids Res. 27: 215-219 (1999) を参照)。例えば、各々の残基は−(マイナス)によって分離されなければならない; x は、いずれかのアミノ酸を表す; [DE] は D または E のいずれかを意味する; {FWY} は、F、W および Y を除くいずれかのアミノ酸を意味する; A(2,3) は、A が 2 から 3 回連続して現れることを意味する; パターンの文字列はピリオドで終わらなければならない。使用者は、“Search sequence databases for a given pattern”を選択し、上記の通りに特定のアミノパターンをパターンボックスに入力し、検索するデータベースを選択する。
表 3、7 および 10 において提供されるモチーフを、さらなる OleA タンパク質を同定するために用いることができる。例えば、OleA タンパク質クラスターを定義するモチーフである [LF]-X-X-[IVLM]-[ATSV]-G-[IV]-X-[EAHS]-R-R-X-W (配列番号64) を、上記の通りにモチーフ検索プログラムに入力した。このクエリーについての代表的な検索結果を、表 20 において以下に示す。

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同様に、表 4、9 および 12 において提供されるモチーフを、炭化水素合成酵素活性を有するさらなる OleD 酵素を同定するために用いることができる。これらのモチーフを、デヒドロゲナーゼ活性を有する OleD 酵素を同定するために用いることもできる。表 5、8 および 11 において提供されるモチーフを、炭化水素合成酵素活性を有するさらなる OleC 酵素を同定するために用いることができる。表 6 において提供されるモチーフを、炭化水素合成酵素活性を有するさらなる OleB 酵素を同定するために用いることができる。
本実施例の結果は、OleA、OleB、OleC および OleD についてのアミノ酸モチーフを、さらなる OleA、OleB、OleC および OleD のアミノ酸配列を同定するために用い得ることを実証する。当業者は、OleA、OleB、OleC および OleD のアミノ酸配列を用いて、対応するアミノ酸配列をコードする対応する oleA、oleB、oleC および oleD 遺伝子を同定することもできるであろう。より具体的には、これらの結果は、データベースを検索してさらなる OleA、OleB、OleC および OleD 酵素を同定するために配列番号64-74 および 91-133 を用い得ることを実証する。
実施例 8
本実施例は、脂肪酸生合成経路が変更された細胞における OleA の発現が、脂肪族ケトンの生産の増強をもたらすことを実証する。
様々な E. coli 細胞において、実施例 1 および 3 に記載される通りに OleA を発現させた。得られた組換え細菌を、発酵方法 2、抽出方法 1 および検出方法 1 を用いて、培養し、誘導をかけ、ペレット化し、抽出した。GC/MS によって観察された脂肪族ケトンは、炭素鎖長が C27 から C31 までの範囲の、飽和、一価不飽和および二価不飽和のものであった。
８つの異なる E. coli 宿主を試験した:
(1) 野生型 E. coli C41(DE3);
(2) アシル-CoA デヒドロゲナーゼ fadE の完全な欠失を有する E. coli C41(DE3) ΔfadE;
(3) IPTG で誘導をかけると fadD を発現するプラスミドを有する E. coli C41(DE3);
(4) IPTG で誘導をかけると fadD を発現するプラスミドを有する E. coli C41(DE3) ΔfadE;
(5) IPTG で誘導をかけると tesA チオエステラーゼ A 遺伝子の切断されたバージョンである‘tesA を発現するプラスミドを有する E. coli C41(DE3);
(6) IPTG で誘導をかけると tesA チオエステラーゼ A 遺伝子の切断されたバージョンである‘tesA を発現するプラスミドを有する E. coli C41(DE3) ΔfadE;
(7) 個別のプラスミド上に含有された、IPTG で誘導をかけると発現する‘tesA および fadD の両方を有する E. coli C41(DE3); および
(8) 個別のプラスミド上に含有された、IPTG で誘導をかけると発現する‘tesA および fadD の両方を有する E. coli C41(DE3) ΔfadE。
脂肪酸経路の中間体の生産を変化させるプラスミド (例えば fadD および‘tesA) を、標準的な分子生物学の手法を用いて作成した。全てのクローニングされた遺伝子を、IPTG-誘導性プロモーター (例えば T7、tac または lac プロモーター) の制御下に置いた。E. coli の‘tesA 遺伝子 (配列番号25; リーダー配列を伴わないチオエステラーゼ A 遺伝子、受入 NP 415027 (Cho et al.、J.BioI. Chem.、270: 4216-9 (1995)、EC: 3,1,1,5,3.1.2,-)) を、NdeI/AvrII で消化された pETDuet-1 へクローニングした (本明細書において記載される pETDuet-1 は、EMD Chemicals、Inc.、San Diego、CA から入手可能である)。
E. coli からのアシル-CoA シンターゼをコードする fadD 遺伝子 (配列番号492) を、NcoI/HindIII で消化された pCDFDuet-1 へクローニングした。表 15 は、いくつかの代表的な生産菌株を作出するために生成されたプラスミドの概要を提供する。当業者は、同様の菌株を獲得するために異なるプラスミドおよびゲノム改変を用い得ることを理解するであろう。
上記の、fadE、fadD および/または tesA において異なる変更を有する E. coli 菌株の各々において oleA を発現させた場合に、脂肪族ケトン生産が増大した (図 10 参照)。例えば、一つの系における E coli の‘tesA (pETDuet-l-'tesA) の過剰発現は、OleA タンパク質を発現する E. coli C41(DE3) と比較した場合、脂肪族ケトン生産の 2.6 倍の増大を達成した。別の例において、E. coli の‘tesA および fadD の過剰発現と fadE の欠失とを組み合わせる菌株における oleA の発現は、OleA タンパク質を発現する E. coli C41(DE3) と比較した場合、脂肪族ケトン生産の 5 倍の増大を達成した。
本実施例の結果は、細胞の脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子における変更と組み合わせて oleA を発現する細菌細胞によって生産される脂肪族ケトンの増大を観察できることを実証する。
実施例 9
本実施例は、脂肪酸生合成経路が変更された細胞における oleA、oleC および oleD の発現が、オレフィンの生産の増強をもたらすことを実証する。
oleA、oleC および oleD を、実施例 8 に記載される E. coli 菌株において発現させた。得られた組換え細菌を、発酵方法 2、抽出方法 1 および検出方法 1 を用いて、培養し、誘導をかけ、ペレット化し、抽出した。GC/MS によって観察された、得られたオレフィンは、炭素鎖長が C27 から C31 までの範囲の、一価不飽和、二価不飽和および三価不飽和のものであった。
‘tesA および fadD の過剰発現と fadE の欠失とを組み合わせる E. coli 菌株における oleA、oleC および oleD の発現は、野生型の E. coli バックグラウンドにおいて oleA、oleC および oleD を発現する E. coli 菌株と比較して、観察されるオレフィンの量において４倍の増大をもたらした (図 11 参照)。
本実施例において反映される実験結果は、脂肪酸生合成経路における変更と組み合わせて oleA、oleC および oleD が発現する細胞において、著しく増大した量のオレフィンが観察されることを実証する。
実施例 10
本実施例は、OleA および OleD を含有するインビトロアッセイにおいて、アルデヒド、脂肪族ケトンおよびオレフィンが観察されることを実証する。
Hisタグが付された(His-tagged) OleA および OleD タンパク質を、overnight express instant TB medium を用い、製造者のプロトコール (Novagen、CA) に従って、E. coli C41(DE3) ΔfadE において発現させた。タンパク質を、His Bind カラムクロマトグラフィーを用い、500 mM NaCl、20 mM トリス-HCl、pH 7.9 の 5 mM イミダゾールおよび 1 mM トリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィン(THP) (1X 結合バッファー)を用いて精製した。その後、User protocol TB054 Rev. F0106 (Novagen of EMD Chemicals、Inc.、San Diego、CA) における説明にしたがい、500 mM NaCl、60 mM イミダゾール、pH 7.9 の 20 mM トリス-HCl および 1 mM THP (1X 洗浄バッファー) を続けた。OleA タンパク質を、1 M イミダゾール、0.5 M NaCl および pH 7.9 の 20 mM トリス-HCl を用いて、His-bind カラムから溶出させた。OleD タンパク質を、0.5 M NaCl、100 mM EDTA および pH 7.9 の 20 mM トリス-HCl を用いて、His-bind カラムから溶出させた。全てのタンパク質を、製造者のプロトコール (GE Healthcare、NJ) に従い、PD-10 カラムを用いて pH 7.5 の 50 mM トリス、100 mM NaCl、1 mM THP および 10% グリセロールへバッファー交換した。
精製された、Hisタグが付された(His-tagged) OleA および OleD タンパク質を、インビトロアッセイにおいて用いた。インビトロアッセイ反応は、100 μL の総容量中に 1 mM ミリストイル補酵素A、10 mM MgCl2、2.3 μM OleA、2.4 μM OleD、10 mM NADPH および 100 mM リン酸バッファー (pH 7.0) を含有した。アッセイにおいて用いる NADPH を Sigma (N7505、St Louis MO) から入手し、pH 7.5 の 50 mM トリス中の 100 mM ストック溶液として調製した。サンプルを、37℃で 1 時間インキュベートした。反応を、1% 酢酸を含有する 500 μL の酢酸エチルでクエンチ(quench)した。混合物をボルテックスによって混合し、その後遠心した。上層 (酢酸エチル層) を清潔なガラス管へ移し、遠心機(Vacufuge 5301、Eppendorf、Westbury、NY)中において減圧下で乾燥させた。サンプルを、40 μL の酢酸エチルおよび 10 μL の、対照スパイク(control spike)として働く(酢酸エチル中で調製された) 0.1 mg/mL のヘキサコサン溶液中に再懸濁し、GC/MS によって解析した (実行時間: 37.33 分; カラム: HP-5-MS (5% ジフェニルシロキサン、95% ジメチルシロキサン) 部品番号 19091S-433E、長さ: (メートル) 30、内径: (mm) 0.25 ナローボア、フィルム: (μM) 0.25; MSD スキャン範囲: 50 - 550 m/z; 注入: 1μL Agilent 6890 N 注入口; 注入口: 300℃ スプリットレス; キャリアガス: ヘリウム (流速: 1.3 mL/分); オーブン温度: 60℃で 3 分保持; 15℃/分で 320℃まで; 320℃で 17 分保持; 検出: Agilent 5975B XL EI/CI MSD; 検出温度: 300℃)。1 から 10 μL の間を、炭化水素含量について解析した。
GC/MS によって検出された、得られたアルデヒド、ケトンおよびオレフィンは、テトラデカナール、14-ヘプタコサノンおよびヘプタコセンの異性体であった (図 12A-E 参照)。保持時間および MS スペクトルプロファイルに基づいて、化合物を同定した。
本実施例において反映される実験結果は、インビトロアッセイにおいて、OleA および OleD を用いてアルデヒド、脂肪族ケトンおよびオレフィンを観察できることを実証する。具体的には、これらの結果は、インビトロアッセイにおいて、ミリストイル補酵素A、MgCl2、および NADPH の存在下での OleA および OleD のインキュベーションの後にアルデヒド、脂肪族ケトンおよびオレフィンが観察されることを実証する。
実施例 11
本実施例は、精製された OleB タンパク質がインビトロアッセイ中に添加されると、アシル補酵素A 基質、OleA および OleD を含むインビトロアッセイにおいて観察されるアルデヒドおよびオレフィンの量が有意に増強されることを実証する。
実施例 10 に記載される通りに、Hisタグが付された OleA および OleD タンパク質を発現させ、His Bind カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。実施例 10 に記載される方法を用いて、Hisタグが付された OleB タンパク質を発現させ、精製した。OleA および OleB タンパク質を、1 M イミダゾール、0.5 M NaCl および pH 7.9 の 20 mM トリス-HCl を用いて His-bind カラムから溶出させた。OleD タンパク質を、0.5 M NaCl、100 mM EDTA および pH 7.9 の 20 mM トリス-HCl を用いて His-bind カラムから溶出させた。全てのタンパク質を、製造者のプロトコール (GE Healthcare、NJ) に従い、PD-10 カラムを用いて pH 7.5 の 50 mM トリス、100 mM NaCl、1 mM THP および 10% グリセロールへバッファー交換した。
精製された、Hisタグが付された OleA、OleD および OleB タンパク質を、インビトロアッセイにおいて用いた。インビトロアッセイ反応は、100 μL の総容量中に 1 mM ミリストイル補酵素A、10 mM MgCl2、2.3 μM OleA、2.4 μM OleD、2.3 μM OleB、10 mM NADPH および 100 mM リン酸バッファー (pH 7.0) を含有した。サンプルを、37℃で 1 時間インキュベートした。反応を、1% 酢酸を含有する 500 μL の酢酸エチルでクエンチした。混合物をボルテックスによって混合し、その後遠心した。上層 (酢酸エチル層) を清潔なガラス管へ移し、遠心機(Vacufuge 5301、Eppendorf、Westbury、NY)中において減圧下で乾燥させた。サンプルを、40 μL の酢酸エチルおよび 10 μL の、対照スパイクとして働く (酢酸エチル中で調製された) 0.1 mg/mL のヘキサコサン溶液中に再懸濁し、GC/MS によって解析した。1 から 10 μL の間を、存在するアルデヒド、脂肪族ケトンおよびオレフィンの量について解析した。
GC/MS によって検出された、得られたアルデヒド、脂肪族ケトンおよびオレフィンは、テトラデカナール、14-ヘプタコサノンおよびヘプタコセンの異性体であった (図 13A-C 参照)。保持時間および MS スペクトルプロファイルに基づいて、化合物を同定した。各化合物についてのピーク下面積 (AP) を、MSD ChemStation ソフトウェア (Agilent technologies) を用いて評価した。OleA/OleD によって生産された反応産物の各々を 1.0 に規準化することによって、相対値を算出した (例えば、OleA + OleD + OleB によって生産されたアルデヒド = AP (OleA + OleD + OleB 反応)/ AP (OleA + OleD 反応))。OleA+OleD および OleA+OleD+OleB によって生産されたアルデヒド、オレフィンおよび脂肪族ケトンの相対値を、表 21 に示す。

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本実施例において反映される実験結果は、OleA、OleD および OleB を含むインビトロアッセイにおいて観察されるアルデヒドまたはオレフィンの量が、OleA および OleD を含むインビトロアッセイにおいて観察されるアルデヒドまたはオレフィンの量よりも多いことを実証する。
実施例 12
本実施例は、オレフィンシンターゼ遺伝子 (oleA、oleB、oleC および oleD) と併せてアシル-CoA シンターゼ遺伝子を発現する細菌によって、脂肪酸をオレフィンへ変換し得ることを実証する。
アシル-CoA シンターゼ遺伝子は、遊離の脂肪酸を、オレフィンシンターゼ遺伝子の基質の一つである活性化された脂肪族アシル-CoA へと変換する。多数の異なる宿主菌株を、アシル-CoA シンターゼ遺伝子で形質転換した。オレフィンシンターゼ遺伝子を、一連の生物変換実験において用いた。全ての宿主菌株は同様の結果を生み出し、実施例 1 に記載されるプラスミドを用い、標準的な分子生物学の手法を用いて作出された。本実施例において示されるデータを生成するために、以下の宿主菌株を用いた:
宿主 1: オレフィンシンターゼ オペロン pCL1920pTrcOleABpTrcOleCD (配列番号78) およびアシル-CoA シンターゼ FadD 過剰発現プラスミド pACYCpTrcFadD で形質転換された E. coli MG1655 ΔfadE。
宿主 2: オレフィンシンターゼ オペロン pCL1920pTrcOleABpTrcOleCD (配列番号78) およびアシル-CoA シンターゼ FadD 過剰発現プラスミド pETDuetFadD で形質転換された E. coli C41 (DE3) ΔfadE。
実施例 1 に記載される 25 mL 発酵手順を用いて生物変換実験を行った。誘導の時点において、遊離の脂肪酸を、容量あたり 0.01% から 0.05% 重量の間の終濃度まで培地に添加した。炭化水素を抽出するために、1 mL 全細胞培養方法を用いた。生産物を、実施例 1 に記載される通りに GC/MS を用いて解析した。
GC/MS によって検出された炭化水素は、C19 から C33 までの範囲の一価不飽和、二価不飽和および三価不飽和の鎖であった。発酵に添加された脂肪酸基質の型および検出されたオレフィン生産物を、表 22 に示す。検出されたオレフィンの量および型は、培地に添加された脂肪酸基質の型によって異なった。この事は、菌株が、供給されなかった対照の菌株においては検出されないオレフィンを生産する場合に最も目立った。例えば、表 22 は、C10 脂肪酸が C19:1 オレフィンへ変換されることを示し、これは２つの C10 脂肪族アシル-CoA 分子の縮合を反映する。C23:1 および C23:2 オレフィンも形成される。これは、C10 脂肪族アシル-CoA と、E. coli 宿主菌株によって自然に生産される C14:0 または C14:1 脂肪族アシル活性化エステルとの縮合を反映する。細胞が C16:1 脂肪酸をオレフィンに変換する場合、より長い鎖のオレフィン、例えば C31:3 が形成される。非天然の脂肪酸基質、例えば奇数鎖の脂肪酸 C13、C15 および C17 を供給した場合、C26、C28 および C30 のユニークな偶数鎖のオレフィンが検出された。これは、外因性の脂肪酸がオレフィンへ変換されていることを示唆する。

Figure 0005912251
脂肪酸の生物変換は、実験の大部分においてオレフィンの総生産を増強した。例えば、C13、C14、C14:1 および C16:1 脂肪酸の供給後に生産されたオレフィンの総量は、供給されなかった対照菌株において生産されたオレフィンの量と比較した場合、２倍より大きく増大した (表 23 参照)。

Figure 0005912251
本実施例において反映される実験結果は、E. coli における OleA、OleB、OleC、OleD および FadD の発現が、外因性および内因性の脂肪酸に由来するオレフィンの生産をもたらすことを実証する。さらに、本実施例において反映される実験結果は、脂肪酸を供給された細菌における OleA、OleB、OleC、OleD および FadD の発現が、脂肪酸のオレフィンへの生物変換および総オレフィン生産の有意な増大をもたらすことを実証する。さらに、本実施例は、宿主によって生産されるオレフィンの型を制御するために、生物変換を用い得ることを実証する。
実施例 13
本実施例は、アシル縮合化(acyl-condensing)酵素 OleA と組み合わせてアシル-CoA シンターゼ遺伝子を発現する細菌によって、脂肪酸を脂肪族ケトンへ変換し得ることを実証する。
アシル-CoA シンターゼ遺伝子は、遊離の脂肪酸を、OleA のアシル-CoA 縮合反応の基質の一つである活性化脂肪族アシル-CoA へと変換する。
本実施例において示されるデータを生成するために、以下の宿主菌株を用いた: 天然のプロモーターを T5 構成的プロモーターで置換することによって作成される、構成的に発現する fadD 遺伝子 (実施例 1 参照) を伴う、OleA の発現のための pCL1920pTrcOleA プラスミド(このプラスミドの説明については実施例 1 を参照)で形質転換された E. coli MG1655 ΔfadE。該宿主菌株を、実施例 12 に記載される手順にしたがって、培養し、IPTG で誘導をかけ、異なる鎖長の脂肪酸を供給した。炭化水素を抽出するために、1 mL 全細胞培養方法を用いた。生産物を、実施例 1 に記載される通りに、GC/MS を用いて解析した。
GC/MS によって検出された炭化水素は、C19 から C31 までの範囲の、飽和の、ならびに一価不飽和および二価不飽和の脂肪族ケトンであった(表 24 参照)。発酵に添加した脂肪酸の型および観察された脂肪族ケトンを、表 18 に示す。非天然の脂肪酸、例えば C13、C15 および C17 を供給した後に、偶数の炭素鎖の脂肪族ケトンが生産された。

Figure 0005912251
脂肪酸の生物変換は、好ましい基質、例えば C14:1 を供給した場合には 50 倍より大きい増強を伴って、試験したサンプルの全てにおいて脂肪族ケトンの生産を増強した(表 25 参照)。

Figure 0005912251
本実施例において反映される実験結果は、E. coli における OleA および FadD の発現が、外因性および内因性の脂肪酸に由来する脂肪族ケトンの生産をもたらしたことを実証する。加えて、本実施例において反映される実験結果は、脂肪酸を供給された細菌における OleA および FadD の発現が、脂肪酸の脂肪族ケトンへの生物変換および総脂肪族ケトン生産の有意な増大をもたらしたことを実証する。本実施例は、宿主菌株によって生産される脂肪族ケトンの型を制御するため、および生産される脂肪族ケトンの量を増強するために、生物変換を用い得ることを実証する。
実施例 14
本実施例は、細菌において生産され得るオレフィンの型を制御する方法を示す。
異なる鎖長のアシル-CoA (脂肪族ケトンおよびオレフィンの合成のための基質) を細菌において生産するため、Uc FatB1 (Voelker et al.、Science、257: 72-74 (1992))、Ch FatB2 (Dehesh et al.、Plant J.、9: 167-72 (1996))、‘TesA (前掲の Cho et al.) または Cc FatB1 (Yuan et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U S A、92: 10639-43 (1995)) を含む異なるチオエステラーゼを、アシル-CoA シンターゼ (FadD; EC 6.2.1.3) と組合せて生産した。異なる鎖長を有するオレフィンを生産するため、生産されるアシル-CoA 基質の型におけるバリエーション(すなわち、異なるチオエステラーゼを発現する細菌)を、オレフィンシンターゼ遺伝子 oleA、oleB、oleC および oleD と組み合わせた。
異なる鎖長を有する様々なオレフィンを生産する能力を示す多数の菌株を作出した(表 26 参照)。全ての菌株を、標準的な形質転換方法、例えばエレクトロポレーションまたは化学形質転換を用いて、E. coli C41(DE3) ΔfadE 宿主において作成した。菌株内において各々のプラスミドを維持するため、実験の間を通して適切な抗生物質選択を適用した。チオエステラーゼ プラスミドを含有しない対照菌株(OS333)を作出した。加えて、チオエステラーゼ、脂肪族アシル-CoA シンターゼおよびオレフィンシンターゼ遺伝子の組合せを発現する菌株を作出した。各プラスミドの構築についての詳細な説明は、実施例 1 において見出すことができる。本実施例において用いた菌株の一覧を、表 26 に示す。

Figure 0005912251
標準的な 25 mL 発酵および標準的な 1 mL 全細胞培養抽出を、実施例 1 に記載される通りに行った。サンプルを、実施例 1 に記載される GC/MS 方法によって解析した。生産された各々のオレフィンの量を決定するため、ヘキサコサンの内部標準を用いた (表 27 参照)。
1962 年に Marr および Ingraham は、温度が E. coli によって生産される脂質における飽和の程度に影響を与えることを示す論文を発表した (Marr et al.、J Bacteriol.、84: 1260-7 (1962))。低温はより大きな不飽和度を有する脂質の生産をもたらし、一方で高温はより多い量の飽和した脂質をもたらす。温度が飽和度に影響を与えるかどうかを決定するため、２つの異なる温度、37℃および 25℃で発酵を行った。表 27 の上部は 37℃で行った発酵についての結果を示し、表 27 の下半分は 25℃で行った発酵についての結果を示す。

Figure 0005912251
表 27 において反映される結果は、脂肪族アシル-CoA シンターゼおよびオレフィンシンターゼ遺伝子と組み合わせたチオエステラーゼの発現が、用いるチオエステラーゼに応じて異なる鎖長を有するオレフィンを生み出すことを実証する。チオエステラーゼ、例えば C12:0 脂肪族アシル-ACP に対して特異性を有するラウロイル-アシル キャリアータンパク質チオエステラーゼとして知られる Uc FatB1、および Ch FatB2 を、対照菌株においては見られない C23 および C25 の長さのオレフィンを生産するために用いることができる。これらの結果はまた、C14 脂肪族アシル-ACP に対して特異性を有するチオエステラーゼ、例えば Cc FatB1 の添加によって、特定のオレフィン、例えば C27 オレフィンの量を増強し得ることを実証する。あるいは、C14 および C16 の鎖長の脂肪族アシル-ACP に対して特異性を有する‘TesA の添加によって、C27 および C29 の量を増強することができる。
表 27 に示される結果はまた、発酵を行う温度が、細菌によって生産されるオレフィンの型に影響を与えることを実証する。特に、温度は、生産されるオレフィンの飽和レベルに影響を与える。単一の二重結合を有するオレフィンは、２つの飽和脂肪酸の縮合から形成される。37℃で行われた発酵は、25℃で行われた発酵と比較して、より高い飽和度を有するオレフィンの生産をもたらす。
本実施例において反映される実験結果は、オレフィンシンターゼ遺伝子を異なる鎖長の脂肪族アシル-CoA を生産する遺伝子と組み合わせることによって、生産されるオレフィンの長さを制御し得ることを実証する。加えて、本実施例において反映される実験結果は、環境条件、例えば発酵の温度を変更することによって、細菌によって生産されるオレフィンの飽和度を制御し得ることを実証する。
実施例 15
本実施例は、Saccharomyces cerevisiae における oleA の機能的発現がインビトロでの脂肪族ケトンの生産をもたらすことを実証する。
oleA の核酸配列を、標準的な方法によって Stenotrophomonas maltophilia ATCC 17679 の oleA 遺伝子配列 (配列番号1) を含有するプラスミドから PCR 増幅し、本明細書において記載される通りに、標準的な手法を用いて酵母発現ベクターへクローニングした。簡潔には、oleA (配列番号1) を、プライマー LB217 (配列番号43) および LF304 (配列番号44) を用いて増幅した。oleA 増幅産物を、制限酵素 ApaI および XhoI を用いて pESC-HIS へクローニングし、プラスミド pESC-His-oleA (配列番号134) を作成した。
次いで、S. cerevisiae (BY4741) 酵母細胞を、oleA (配列番号134) を含有するプラスミドまたは oleA を含有しないプラスミドのいずれかで形質転換した。形質転換された酵母細胞を、oleA の発現を可能にするために培養した。細胞をペレット化し、その後 YeastBuster(商標)(Novagen、Madison、WI) を用いて溶解した。細胞ライセートへミリストイル-CoA を添加した。脂肪族ケトンを、酢酸エチル中における 1% 酢酸を用いて反応から抽出し、実施例 1 に記載される通りに GC/MS を用いて解析した。
脂肪族ケトン 14-ヘプタコサノン、C27 脂肪族ケトンが、oleA プラスミド pESC-His-oleA で形質転換された酵母細胞からの細胞ライセートにおいて、GC/MS によって同定された(図 14A 参照)。これは、脂肪族ケトンを生産するために S. cerevisiae において oleA を発現させ得ることを実証する。同様の方法を、興味のあるあらゆる細胞において oleA を発現させ、細胞ライセートを調製し、その後脂肪族ケトンの生産を解析するために用いることができる。
本実施例において反映される実験結果は、S. cerevisiae において oleA を発現させ、インビトロでの脂肪族ケトンの生産をもたらし得る事を実証する。
実施例 16
本実施例は、精製された OleA、OleD を含有する細胞ライセートおよび重水素化された NADPH を含有するインビトロアッセイにおいて、重水素化されたアルデヒドおよびオレフィンが観察されることを実証する。
OleA タンパク質を、これらの実験のために、pET-21b(+)_OleA で形質転換された E. coli C41(DE3) の発酵によって生産した。Hisタグが付された OleA を、実施例 10 に記載される通りに精製した。OleD 細胞ライセートを、これらの実験のために、overnight express instant TB medium を用いて、製造者のプロトコール (Novagen、CA) に従い、pET-21b(+)_OleD で形質転換された E. coli C41(DE3) の発酵によって生産した。10 mL の終夜培養物(culture)を、細胞ライセートを調製するために用いた。細胞をペレットへと濃縮するため、培養物(culture)を遠心した。上清を取り除いた。ペレットを、2mL の 50 mM リン酸ナトリウムバッファー (pH 7.0) 中に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、超音波処理 (パワー 0.5 での 5 秒パルスにおいて 5 回) を用いて溶解した。2 μL の Benzonase（登録商標）(Novagen、CA) を細胞ライセートへ添加し、サンプルを室温で 20 分間保持した。この細胞ライセートを、OleD タンパク質の源として用いた。
重水素NADPH(deutero-NADPH) を、以下のプロトコールに従って調製した。5 mg の NADP+ および 3.6 mg の D-グルコース-1-d を、2.5 mL の 50 mM リン酸ナトリウムバッファー (pH 7.0) へ添加した。R-(4-2H)NADPH の生産のための Bacillus megaterium からのグルコースデヒドロゲナーゼ(USB Corporation) または S-(4-2H)NADPH の生産のための Thermoplasma acidophilum からのグルコースデヒドロゲナーゼ(Sigma) のいずれかを 5 ユニット添加することによって、標識された NADPH の酵素的生産を開始した。反応を 37℃で 15 分間インキュベートし、10 KDa MWCO Amicon Ultra centrifuge filter (Millipore) を用いて遠心ろ過(centrifuge-filtered)し、ドライアイス上で急速冷凍し、-80℃で保管した。
インビトロアッセイ反応は、0.1 mL の総容量中に、0.1 mM ミリストイル補酵素A、10 mM MgCl2、10 μL の、OleD ライセートの 1/10 希釈、(上記の通りに調製された) 50 μL の重水素NADPH(deutero-NADPH)、2.1 μM OleA、および 100 mM リン酸バッファー (pH 7.0) を含有した。使用したミリストイル補酵素A は、Sigma (M4414、St Louis MO) から入手し、pH 7.0 の 0.1 M リン酸バッファー中における 10 mM ストック溶液として調製した。サンプルを、37℃で 1 時間インキュベートした。反応を、1% 酢酸/0.15% ギ酸を含有する 500 μL の酢酸エチルでクエンチした。混合物をボルテックスによって混合し、その後遠心した。上層(酢酸エチル層)を清潔なガラス管へ移し、遠心機(Vacufuge 5301、Eppendorf、Westbury、NY)中において減圧下で乾燥させた。サンプルを、40 μL の酢酸エチルおよび 10 μL の対照スパイクとして機能する (酢酸エチル中で調製された) 0.1 mg/mL のヘキサコサン溶液中に再懸濁し、GC/MS によって解析した。1 から 10 μL の間を、特定の炭化水素について解析した。
GC/MS によって検出された、得られたアルデヒドおよびオレフィンは、テトラデカナールおよびヘプタコセンの異性体であった (図 15A-H 参照)。NADPH からの水素化物(hydride)の転移は立体特異的であるため、R-(4-2H)NADPH および S-(4-2H)NADPH の両方を合成した。プラス１単位の質量(plus one unit mass)を有するアルデヒドおよびオレフィンは、R-(4-2H)NADPH のみを用いて観察された。アルデヒドおよびオレフィンが標識されたという事実は、重水素とされた水素が、標識された NADPH から標識されたアルデヒドまたはオレフィンへと転移したことを示す。これは、酵素反応において NADPH が用いられることを実証する。水素化物の転移が立体特異的であるという事実は、酵素反応を示す。
本実施例において反映される実験結果は、oleD がピリジンヌクレオチド酸化還元酵素をコードすることを実証する。さらに、これらの結果は、OleD がオレフィンの生合成において、転移した水素化物がオレフィン産物中に残るように NADPH から中間体への水素化物の転移を触媒することを実証する。OleA およびミリストイル CoA の存在下で起こる水素化物の転移は、C1-重水素(deutero)-テトラデカナール、および C14-重水素(deutero) デルタ-13 ヘプタコセンの両方の検出をもたらした。
実施例 17
本実施例は、インビトロで脂肪族オレフィンを合成できることを実証する。
OleA/B/C/D タンパク質の活性を評価するための、タンパク質発現およびライセートの調製のためのプロトコール
pETDuet_OleAB および pCOLADuet_OleCD で形質転換された E. coli C41(DE3) を、４つの Ole タンパク質 (OleA、OleB、OleC および OleD) を含有する細菌ライセートを作成するために用いた。
pETDuet_OleAB および pCOLADuet_OleCD で形質転換された E. coli C41(DE3) 細胞を、カナマイシン (終濃度 50 μg/mL) およびカルベネシリン(carbenecillin) (終濃度 100 μg/mL) を含有する Luria Broth 中で、37℃において、0.5 - 1.0 の OD600 まで増殖させた。次いで、培養に 1 mM IPTG で誘導をかけ、37℃で終夜増殖させた。終夜増殖させた培養物を、3000 rpm で 20 分間遠心した。上清を廃棄した。後に用いるため、ペレットを -80℃で凍結させた。10 mL の誘導をかけた終夜培養物から得られた細胞ペレットを、2 mL のバッファーに再懸濁し、超音波処理(パワー 0.5 での 5 秒パルスにおいて 5 回)を用いて溶解した。超音波処理されたライセート中に、2 μL の Benzonase（登録商標） (Novagen、CA) を添加し、サンプルを室温で 20 分間保持した。このライセートを、OleA、OleB、OleC および OleD タンパク質の源として用いた。
ミリストイル-ACP の調製のためのプロトコール
ミリストイル-ACP を、いくつかの改変を伴って Rock et al., Methods Enzymol., 72: 397-403 (1981) に記載される通りに合成した。簡潔には、1-4 mL の最終容量中に 5 mM ATP、2 mM DTT、2% Triton X-100、10 mM LiCl、160 μM ミリスチン酸ナトリウム塩、65 μM ACP-SH、10 mM MgCl2、pH 8.0 の 0.1 M トリス-HCl および 1.5 - 3 μg/mL アシル-ACP シンターゼを含有する反応混合物を、37℃で 3 時間インキュベートし、その後 30℃で終夜インキュベートした。用いたアシル-ACP シンターゼは、Invitrogen から購入した。反応混合物を３容量の水で希釈し、酢酸を用いて pH を 6.0 まで滴定した。溶液を HiTrap DEAE FF 5mL カラム (GE Healthcare) にアプライした。Triton X-100 の大部分を除去するため、カラムを、３カラム容量の pH 6.0 の 10 mM ビス-トリス-HCl で洗浄した。３カラム容量の 80% 2-プロパノールを用いてカラムを溶出することによって、残余の Triton X-100 および遊離の脂肪酸を除去した。３カラム容量の pH 6.0 の 10 mM ビス-トリス-HCl を用いて、2-プロパノールを除去した。10 mL の、pH 6.0 の 10 mM ビス-トリス-HCl 中における 0.6 M LiCl を用いて、ミリストイル-ACP および未反応の ACP-SH をカラムから溶出させた。ミリストイル-ACP を含有する溶出物を、pH 7.0 の 50 mM リン酸ナトリウムバッファーへとバッファー交換し、MWCO 3 kDa concentrators (Millipore) を用いて 1 mL まで濃縮した。ミリストイル-ACP の濃度を、Bradford アッセイ (BioRad) および NuPAGE 12% ビス-トリス SDS-PAGE ゲル上でのデンシトメトリー解析 (Invitrogen) を用いて、２段階で決定した: 最初に、C14-ACP/ACP-SH 画分の全タンパク質濃度を Bradford アッセイ (BioRad proten assay) によって決定した; 第二に、C14-ACP 濃度を、その後にデンシトメトリー解析が続く SDS-PAGE に基づいて、全タンパク質濃度のパーセントとして算出した。C14-ACP は、pH 7.0 の 50mM Na-リン酸バッファー中において -20℃で保管され、3 ヶ月間まで安定であった。
オレフィンを生産する方法
上記の通り、OleA、OleB、OleC および OleD タンパク質を含有する細胞ライセートを作成するために、pETDuetOleAOleB および pCOLADuetOleCOleD で形質転換された E. coli C41(DE3) を用いた。インビトロアッセイ反応は、1 mL の総容量中に 0.1 mM ミリストイル補酵素A もしくは 0.1 mM ミリストイル-ACP、10 mM MgCl2、pETDuetOleAOleB および pCOLADuetOleCOleD で形質転換された E. coli C41(DE3) からの 360 μL の細胞ライセート、1 mM NADPH (Sigma、MO)、1 mM ATP (Sigma、MO)、1 mM HSCoA (Sigma、MO) および 100 mM リン酸バッファー (pH 7.0) を含有した。用いたミリストイル補酵素A は、Sigma (M4414、St Louis MO) から入手し、pH 7.0 の 0.1 M リン酸バッファー中における 10 mM ストック溶液として調製した。サンプルを、37℃で 1 時間インキュベートした。反応を、1% 酢酸/0.1% ギ酸を含有する 5 mL の酢酸エチルを用いてクエンチした。混合物をボルテックスによって混合し、その後遠心した。4 mL の上層(酢酸エチル層)を清潔なガラス管へ移し、遠心機(Vacufuge 5301、Eppendorf、Westbury、NY)中において減圧下で乾燥させた。サンプルを、40 μL の酢酸エチルおよび 10 μL の、対照スパイクとして機能する (酢酸エチル中で調製された) 0.1 mg/mL のヘキサコサン溶液中に再懸濁し、GC/MS によって解析した。1 μL を、特定の炭化水素について解析した。
GC/MS によって検出された得られたオレフィンは、C27:1、C27:2 および C27:3 であった(図 16A-C 参照)。表 28 は、pETDuetOleAOleB および pCOLADuetOleCOleD で形質転換された E. coli C41(DE3) からの細胞ライセートによって C14-CoA または C14-ACP の存在下で生産された C27:1 オレフィンのパーセントを示す。C27:1 オレフィンのパーセントを、以下によって算出した: [C27:1 ピーク面積/(C27:1 ピーク面積 + C27:2 ピーク面積 + C27:3 ピーク面積)] x 100。表 28 に示される結果は、pETDuetOleAOleB および pCOLADuetOleCOleD で形質転換された E. coli C41(DE3) からの細胞ライセートへの C14-CoA または C14-ACP の添加が、C27:1 オレフィンの量の増大をもたらすことを示す。この事は、ライセート中に存在する pETDuetOleAOleB および pCOLADuetOleCOleD で形質転換された E. coli C41(DE3) が、C27:1-オレフィンを形成するために C14-CoA または C14-ACP を用い得ることを示す。

Figure 0005912251
本実施例において反映される実験結果は、オレフィンを合成するために、OleA、OleB、OleC および OleD と組み合わせてミリストイル-ACP またはミリストイル補酵素A を含むインビトロアッセイを用い得ることを実証する。
実施例 18
本実施例は、OleA、OleB、OleC および OleD タンパク質配列を、自然に炭化水素を生産する生物を同定するために用い得ることを実証する。
pBLAST 生物情報学プログラムを、OleA、OleB、OleC および OleD タンパク質ファミリーに属するタンパク質配列を同定するために用いた。共にクラスター化される４つ全ての Ole タンパク質配列を含有する少数の生物を同定した (例えば、表 1 を参照)。これらの生物のうち、以下の４つの生物が本明細書に記載されるオレフィンの型を生産することが文献において示されている: Stenotrophomonas maltophilia、Kineococcus radiotolerans、Chloroflexus の種および最近配列決定された Micrococcus luteus を含む様々な Micrococcus の種 (前掲の Tornabene et al.、前掲の Suen et al.、前掲の Morrison et al.; 前掲の van der Meer et al.; 前掲の Albro et al.; 前掲の Philips et al.)。OleA、OleB、OleC および OleD を含有する他の生物が自然にオレフィンを生産することを確かめるため、オレフィン生産について試験するために表 1 から Arthrobacter aurescens TC1 (ATCC BAA-1386) を選択した。Arthrobacter aurescens TC1 は、文献においてオレフィンを生産すると報告されていない。
Arthrobacter aurescens TC1 を、500 mL フラスコ中で、１リットルあたり 10 g のカゼインペプトン(トリプシン消化物)、5 g のグルコース、5 g の酵母抽出物および 5 g の NaCl で構成される 100 mL のコリネバクテリウムブロス(Corynebacterium broth)中において、振盪しながら 30℃で 48 時間増殖させた。48 時間後、5 mL のブロスを、改変した抽出方法 1 に従って抽出した。具体的には、細胞培養物の最初のペレット化の後、ペレットを 1 mL の水に再懸濁し、残余の培養ブロスを除去するために再度遠心した。最終ペレットを 100 μL の水に再懸濁した。抽出方法 1 の残りの部分を続けた(実施例 1 参照)。抽出物を、検出方法 1 を用いて GC/MS によって解析した。GC/MS によって検出されたオレフィンは、C29 の一価不飽和オレフィンであった (図 19A-B 参照)。
本実施例において反映される結果は、OleA、OleB、OleC および OleD についてのタンパク質配列を有する生物がオレフィンを生産することを実証する。加えて、本実施例は、そのタンパク質配列中に OleA、OleB、OleC および OleD を有する生物を同定することにより、バイオインフォマティクスを用いてオレフィンを生産する生物を同定し得ることを実証する。より具体的には、本実施例は、OleA、OleB、OleC および OleD タンパク質配列を有する Arthrobacter aurescens TC1 が、C29 一価不飽和オレフィンを生産することを実証する。
実施例 19
本実施例は、生物に基づく(biologically based)オレフィンは石油に基づくオレフィンとは区別できることを実証する。特に、本実施例は、生物、例えば oleA、oleB、oleC および oleD 遺伝子を発現する E. coli によって生産されるオレフィンを、石油に基づくオレフィンから区別し得ることを実証する。
E. coli C41(DE3); pETDuet-1_OleAB; pCOLADuet-1_OleCD の発酵によって生産された、精製された生物に基づくオレフィンを、標準的な炭素年代測定手法を用いて、石油に基づくオレフィン、(Z)-9-トリコセン (97%、Sigma-Aldrich、CAS 番号: 27519-02-4)と比較した。試験のために、サンプルを Beta Analytic、Inc. (Miami、FL、USA) へ送った。サンプルの生物に基づく炭素の含量を、ASTM D6866 に基づく加速器質量分析(AMS)を用いて測定した。AMS は、サンプル粉末由来のグラファイト中における 12C および 14C に対する 13C の炭素同位体比を測定する。次いで、サンプルの生物に基づく炭素の含量を、12C に対する 13C の炭素同位体比および存在する 14C の量から算出した。
解析されるオレフィンサンプルを、以下の方法を用いて生産および精製した。E. coli C41(DE3); pETDuet-1_OleAB; pCOLADuet-1_OleCD を、100 mg/L のカルベニシリンおよび 50 mg/L のカナマイシンが補充された 5 mL の LB 培地中で 12 時間増殖させた。この 12 時間培養物を、以下を含有する 200 mL の F1 振盪フラスコ培地(F1 shake flask media)で構成されるより大きな培養へ接種するために用いた: 100 mg/L のカルベニシリンおよび 50 mg/L のカナマイシンが補充された、3 g/L の KH2PO4、6.62 g/L の K2HPO4、4g/L の (NH4)2SO4 、0.15 g/L の MgSO4、5 g/L のグルコース (デキストロース DX0145-5 EMD Chemicals、Inc. NJ)、1.25 mL/L の微量ミネラル(trace mineral)溶液および 1.25 mL/L の微量ビタミン溶液。微量ミネラル(trace mineral)溶液は、１リットルあたり以下を含有した: 27 g の FeCl36H2O、2 g の ZnCl24H2O、2 g の CaCl26H2O、2 g の Na2MoO42H2O、1.9 g の CuSO45H2O、0.5 g の H3BO3 および 100 mL の濃塩酸(concentrated HCl)。微量ビタミン溶液は、１リットルあたり以下を含有した: 0.42 g のリボフラビン、5.4 g のパントテン酸、6 g のナイアシン、1.4 g のピリドキシン、0.06 g のビオチンおよび 0.04 g の葉酸。50 mL の種培養を、最初に 1 L の滅菌された F1 発酵培地を含有する 2 L の Biostat Aplus バイオリアクター (Sartorius BBI) へ接種するために用いた。滅菌された F1 発酵培地は、以下を含有した: 1.5 g/L の KH2PO4、4.34 g/L の K2HPO4 三水和物、4g/L の (NH4)2SO4 、0.150 g/L の MgSO4 七水和物、5 g/L の滅菌濾過された(sterile filtered)グルコース(デキストロース EMD Chemicals、Inc. NJ)、1.25 mL/L の微量ミネラル溶液、1.25 mL/L の微量ビタミン溶液および振盪フラスコにおいて利用されるのと同じ濃度の抗生物質。培養の pH を、1 M の H2SO4 および 30% w/v の NH4OH を用いて 7.2 に維持した。温度を 37℃に維持し、通気速度は 2 lpm (2 v/v/m)、溶存酸素の圧力は 30% の飽和、DO コントローラーに繋がった撹拌ループ(agitation loop)を利用する。オートクレーブされた Antifoam 204 (Sigma-Aldrich St. Louis、MO) 溶液の自動添加によって、泡の形成を制御した。60 g/L の(NH4)2SO4、3.9 g/L の MgSO4 七水和物、430 g/L のグルコース、10 mL/L の微量ミネラル溶液および 10 mL/L のビタミン溶液で構成される栄養供給(nutrient feed)を、発酵槽中において好気的発酵条件下で 48 時間、供給した。発酵のためのグルコース糖質源を、トウモロコシから得た。
60 g/L の(NH4)2SO4、3.9 g/L の MgSO4 七水和物、430 g/L のグルコース、10 mL/L の微量ミネラル溶液および 10 mL/L のビタミン溶液で構成される栄養供給(nutrient feed)を、最初の培地中におけるグルコースが枯渇する時(接種後およそ 6 時間)に供給した。発酵の間、10 g/L より少ない培地中の残存グルコースレベルを維持するために、栄養供給(nutrient feed)を徐々に増加または減少させた。培養が 30 AU の OD600 を達成した時(接種後およそ 8 - 9 時間)に、バイオリアクター中におけるオレフィンの生産を、1M IPTG ストック溶液を 1 mM の終濃度まで添加することによって誘導した。発酵の温度を、誘導のときに 30℃ まで下げた。バイオリアクターを、誘導後およそ 48 時間で回収した。
48 時間後、発酵培養物を 3500 rpm で 20 分間遠心した (ローター SX-4750A を備える Allegra X-15R 遠心機、Beckman Coulter、Fullerton、CA)。細胞ペレットを、50 mL の滅菌蒸留水に再懸濁した。100 mL のメタノールをサンプルに添加し、次いでそれを超音波処理の水浴中で 60 分間、超音波処理した。混合物を、n-ヘキサンが最終容量 750 mL まで添加される 1 L の分液漏斗に移した。穏やかに振ってサンプルをよく混合し、その後、混合物は水層から分離したヘキサン層に位置した。二重層が形成され次第、下部の水層を分液漏斗から抜き取った。有機相中のあらゆる余分な H2O を除去するため、残っている有機層へ Na2SO4 を添加した。次いで、有機層を、減圧を適用せずに Whatman #4 150 mm フィルターを通して２回濾過した。２回濾過された有機相を、蒸留塔に連結した丸底フラスコ内へと移した。56℃の後に 66-68℃が続く温度セットでの蒸留によって、ヘキサンおよびアセトンを除去した。残っているサンプルは、黒色であった。サンプルをさらに精製するため、サンプルを 200 mL のシリカゲル 60 (粒子サイズ 0.063 - 0.300 mm、70-230 メッシュ ASTM) カラムを通して濾過した。ヘキサンを用いる溶出によってサンプルをカラムから取り除いた。周囲温度(ambient temperature)でロータリーエバポレーターによって、オレフィンを含有する溶出液(eluant)からヘキサンを除去した。最終の精製工程において Magnesol D-sol (Dallas Group of American、Inc) を用いた。サンプルを、8 mL の最終容量まで、メチル tert-ブチル エーテル (MTBE) に再懸濁した。10:1 の magnesol 対 サンプル (w/v) の割合で、Magnesol をサンプルへ添加した。サンプル-magnesol 混合物を、ロータリーシェーカー上で 1 時間、37℃において混合した。混合物を、0.2 μm PTFE フィルターを通して 20 mL のシンチレーションバイアル(scintillation vial)中へ濾過した。残っている固体を 2.5 mL の MTBE で洗浄した。該洗浄液(the wash)および濾過された混合物を、シンチレーションバイアル中において合わせた。MTBE を、周囲温度でドラフト(chemical fume hood)中において蒸発させた。
ASTM D6866 方法 B を用いる、Beta Analytic、Inc. における AMS によって 14C を決定した。生物に基づく炭素の含量を、現代の標準品(reference standard)の 14C の割合に対する、サンプル中における 14C の割合を導き出すことによって得た。割合は、単位‘pMC’(パーセント現代炭素)を伴うパーセンテージとして報告される。
放射性炭素年代測定において用いる現代の標準品は、およそ AD 1950 年と等しい既知の放射性炭素含量を有する NIST (National Institute of Standards and Technology) の標準である。各々の試験と共に大量の過剰な 14C を大気中へ導入した熱核兵器(thermo-nuclear weapon)の試験(過剰な 14C は“爆弾炭素(bomb carbon)”として知られている)より前の時を代表するため、AD 1950 を選択した。14C 年代を用いる考古学者または地質学者にとって、AD 1950 は“ゼロ歳”に等しい。これはまた、100 pMC を表す。大気中の“爆弾炭素”は、1963 年の熱核兵器(thermo-nuclear weapon)のピークにおいて通常レベルのほぼ２倍に達した。その出現以来、AD 1950 以後生存している植物および動物についての 100 pMC より大きい値を示す、大気中におけるその分布が近似されてきた。それは、今日の値が 107.5 pMC 付近であり、時間と共に徐々に減少してきた。これは、新鮮なバイオマス材料、例えばトウモロコシが、107.5 pMC 付近の 14C の痕跡(signature)を与えるであろうことを意味する。石油に基づく化合物は、ゼロの pMC 値を有する。化石炭素を現代の炭素と組み合わせることは、現代の pMC 含量の希釈をもたらす。推定すれば、107.5 pMC は現代のバイオマス材料の 14C 含量を表し、0 pMC は石油に基づく産物の 14C 含量を表し、その材料について測定された pMC 値は２つの構成要素の型の割合を反映する。例えば、100% 現代の大豆に由来する材料は 107.5 pMC 付近の放射性炭素の痕跡を与えるであろう。その材料が石油に基づく産物で 50% 希釈された場合、それはおよそ 54 pMC の放射性炭素の痕跡を与えるであろう。
100% を 107.5 pMC に割り当て、0% を 0 pMC に割り当てることによって、生物に基づく炭素の含量を得た。例えば、99 pMC を測定するサンプルは、93% に相当する生物に基づく炭素の含量を与える。この値は、平均の生物に基づく炭素の結果とみなされ、現代の生物学的材料または石油に基づく材料のいずれかに起因する、解析される材料内の全ての構成要素を想定する。
所与の生物由来の(biologically derived)材料における安定な炭素同位体比 (13C/12C) は、二酸化炭素が固定される時点での大気の二酸化炭素における 13C/12C の比の結果である。それはまた、二酸化炭素を固定する植物の正確な代謝経路を反映する。13C/12C 比は通常、以下のように算出される δ13C として表される:

δ13C (‰) = [(13C/12C)サンプル- (13C/12C)標準]/ (13C/12C)標準 × 1000。
石油および C4 植物 (トウモロコシ、ソルガム等) の δ13C は同様の範囲(-7 から -13 ppt まで)を有し、一方、C3 植物 (コムギ、エンバク、イネ等) の 13C/12C は、-19 から -27 ppt までの範囲に入る (例えば、前掲の Stuiver et al.、および Gupta, et al., Radiocarbon dating practices at ANU. Handbook, Radiocarbon Dating Laboratory, Research School of Pacific Studies, ANU, Canberra (1985) を参照されたい)。C4 および C3 植物についての δ13C 値の違いは、各々の植物の異なる光合成サイクルに起因する。
生物に基づくオレフィン産物および石油に基づく 9-トリコセンの、pMC および δ13C の値を表 29 に示す。

Figure 0005912251
14C の結果に基づくと、E. coli によって生産される生物に基づくオレフィンは、少なくとも 88% の、生物に基づく炭素に由来する炭素含量を有する。精製の間に用いられる石油に基づく産物である残余の MTBE が、オレフィンサンプルにおける生物に基づく炭素の含量を低下させた可能性がある。さらに、生物に基づくオレフィン産物の δ13C 値は、オレフィン産物およびその中に含まれる炭素が主として生物学的源に由来するというさらなる証拠を提供する。
本実施例において反映される実験結果は、生物に基づく炭化水素を石油に基づく炭化水素から区別し得ることを実証する。特に、本実施例は、生物、例えば oleA、oleB、oleC および oleD 遺伝子を発現する E. coli によって生産されるオレフィンを、石油に基づくオレフィンから区別し得ることを実証する。
本明細書において引用される、出版物、特許出願および特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が引用により取り込まれると個別におよび具体的に示され、本明細書において全体が開示されるのと同程度に、引用により本明細書に取り込まれる。
本発明を説明する文脈における(特に以下の請求項の文脈における)、“ある”および“ひとつの”および“該”の用語ならびに同様の表現の使用は、本明細書において別に示されるかまたは文脈によって別にはっきりと否定されない限り、単数形および複数形の両方に及ぶと解釈されるべきである。“含む”、“有する”、“包含する”および“含有する”の用語は、別に指摘されない限り、無制限の(open-ended)用語(即ち、“含むが、これらに限定されない”ことを意味する)であると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書において別に示されない限り、該範囲内に入る各々の分離した値を個別にいう簡便な方法として役に立つよう意図されているだけであり、各々の分離した値は、それが本明細書において個別に記載されるのと同様に、明細書に取り込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において別に示されるかまたは文脈によって別にはっきりと否定されない限り、あらゆる適切な順序で実行することができる。本明細書において提供されるいずれかのおよび全ての例または例示的な言葉(例えば“例えば”)の使用は、単に本発明をより良く説明することを目的とするのみであり、別に主張しない限りは本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書中におけるどの言葉も、請求項に記載されていない(non-claimed)いずれかの要素を本発明の実施に必須であるとして示すと解釈すべきではない。
本明細書を通して、言及は省略された遺伝子名またはポリペプチド名を用いてなされ得るが、かかる省略された遺伝子またはポリペプチド名が遺伝子またはポリペプチドの属を表すことが理解される。かかる遺伝子名は、同じポリペプチドおよび同じ生理学的機能を有する相同なポリペプチドをコードする全ての遺伝子を包含する。ポリペプチド名は、同じ活性を有する(例えば、同じ基礎的化学反応を触媒する)全てのポリペプチドを包含する。
本明細書において引用される受入番号は、National Institute of Health、U.S.A によって維持されている NCBI データベース (National Center for Biotechnology Information) に由来する。受入番号は、2007年4月15日のデータベースにおいて提供されるものである。
EC 番号は、Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) によって確立される (http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ において利用可能)。本明細書において引用される EC 番号は、東京大学によって部分的に出資されている、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics によって維持されている KEGG リガンドデータベースに由来する。EC 番号は、2007年4月現在のデータベースにおいて提供されるものである。
本明細書においては、発明者らに知られている本発明を実行するための最良の形態を含む本発明の好ましい態様が記載される。前述の説明を読めば、それらの好ましい態様のバリエーションが当業者にとって明らかとなるであろう。発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適切なものとして採用することを予期し、発明者らは、本発明が本明細書において具体的に記載されるのとは別なように実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用される法律によって許容される、全ての改変および本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される対象と均等なものを包含する。さらに、本明細書において別に示されるかまたは文脈によって別にはっきりと否定されない限り、その全ての可能なバリエーションにおける上述の要素のあらゆる組み合わせが、本発明に包含される。

Claims (17)

  1. 配列番号２の配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＯｌｅＡポリペプチドをコードする単離核酸配列で形質転換された細胞であって、該細胞が、該細胞内の該ＯｌｅＡの発現により脂肪族ケトンを生産するものである、形質転換細胞。
  2. 配列番号６の配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＯｌｅＣポリペプチドをコードする核酸配列、及び、配列番号８の配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＯｌｅＤポリペプチドをコードする核酸配列でさらに形質転換され、細胞が、細胞内のＯｌｅＡ、ＯｌｅＣおよびＯｌｅＤの発現によりオレフィンを生産するものである、請求項１に記載の形質転換細胞。
  3. 配列番号１０の配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＯｌｅＢポリペプチドをコードする核酸配列でさらに形質転換され、細胞が、細胞内のＯｌｅＡ、ＯｌｅＣ、ＯｌｅＤおよびＯｌｅＢの発現によりオレフィンを生産するものである、請求項２に記載の形質転換細胞。
  4. ＯｌｅＡポリペプチドが、１５００アミノ酸残基以下であり、配列番号６４〜６９、９８〜１０２、１１６〜１２０、１５０〜２２９および４７８〜４８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３いずれか１項に記載の形質転換細胞。
  5. ＯｌｅＡポリペプチドが、配列番号２の配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の形質転換細胞。
  6. ＯｌｅＣポリペプチドが、１５００アミノ酸残基以下であり、配列番号７２〜７４、１０３〜１０８、１２１〜１２６および３２７〜４０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２〜５いずれか１項に記載の形質転換細胞。
  7. ＯｌｅＤポリペプチドが、１５００アミノ酸残基以下であり、配列番号７０〜７１、１０９〜１１５、１２７〜１３３、１４２〜１４９および４０３〜４８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３〜６いずれか１項に記載の形質転換細胞。
  8. 細胞が、酵母細胞、真菌細胞、細菌細胞、藻類細胞または植物細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の形質転換細胞。
  9. 細胞が、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ヒューミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、マイセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、プレウロタス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈａｍｏｎａｓ）、キネオコッカス属（Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、またはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ）からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の形質転換細胞。
  10. 細胞が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における変異を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の形質転換細胞。
  11. 細胞が、アシル−ＣｏＡシンターゼをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の形質転換細胞。
  12. 細胞が、チオエステラーゼをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の形質転換細胞。
  13. 炭化水素の生産方法であって、オレフィンを生産する請求項３〜７のいずれか１項に記載の細胞を基質とともに、オレフィンを生産するのに十分な条件下で培養することを含む、方法。
  14. 脂肪族ケトンの生産方法であって、脂肪族ケトンを生産する請求項１に記載の細胞を基質とともに、脂肪族ケトンを生産するのに十分な条件下で培養することを含む、方法。
  15. ＯｌｅＣおよび／またはＯｌｅＤをコードする遺伝子が欠失または減衰されている、請求項１、４及び５のいずれか１項に記載の形質転換細胞。
  16. 請求項１５に記載の形質転換細胞を培養することを含む、脂肪族ケトンの生産方法。
  17. オレフィンの産生に有用な酵素を同定する方法であって、
    （ａ）
    （ｉ）ＯｌｅＡおよびＯｌｅＤ、
    （ｉｉ）ＯｌｅＡおよびＯｌｅＣ、ならびに
    （ｉｉｉ）ＯｌｅＣおよびＯｌｅＤ
    からなる群から選択されたポリペプチドを含む細胞を、オレフィンを産生する能力を有すると推測される酵素をコードする核酸で形質転換すること；および、
    （ｂ）細胞がオレフィンを産生するかどうかを決定すること、ここで、細胞によるオレフィン産生の存在が、該核酸がオレフィンの産生に有用なポリペプチドをコードすることを示し、
    さらに、ＯｌｅＡは配列番号２の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＯｌｅＣは配列番号６の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＯｌｅＤは配列番号８の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するものである、
    方法。
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