JP2009529890A - Pufaポリケチドシンターゼ系を用いた異種生物における多価不飽和脂肪酸の生産方法 - Google Patents
Pufaポリケチドシンターゼ系を用いた異種生物における多価不飽和脂肪酸の生産方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は概して、多価不飽和脂肪酸(PUFA)、特に長鎖PUFA(LCPUFA)の生産を改良するための、そのようなPUFA(すなわち、PUFA PKS系またはPUFAシンターゼ)を産生するようにPKS様の系(PKS-like system)によって遺伝的に改変された宿主生物における、アクセサリータンパク質および標的の使用に関する。本発明はまた、そのようなアクセサリータンパク質を発現するように遺伝的に改変された、またはそのような標的に関して改変された生物、ならびにそのような生物を作製および使用する方法にも関する。
多価不飽和脂肪酸(PUFA)は、栄養学的用途、薬学的用途、産業的用途および他の目的に有用であると考えられている。しかし、天然供給源から、および化学合成からのPUFAの現在の供給は、商業的需要に対して十分でない。油糧種子作物に由来する植物油は比較的安価であり、魚油に付随する汚染の問題がない。しかし、商業的に開発された植物油中に見いだされるPUFAは、典型的には、リノール酸(Δ9位およびΔ12位に2個の二重結合を有する18個の炭素‐18:2 Δ9,12)およびリノレン酸(18:3 Δ9,12,15)に限定される。リノレン酸およびリノレン酸から、より飽和度が高くかつ長鎖のPUFAを生成させる脂肪酸合成のためには、多数の別個のデサチュラーゼおよびエロンガーゼ酵素が必要である。このため、EPAおよびドコサヘキサ塩酸(DHA)などのPUFAの発現のために植物宿主細胞を操作するには、合成を達成するために、いくつかの別個の酵素の発現が必要になると思われる。さらに、このようなPUFAの利用可能な量での産生のためには、さらなる操作の取り組みも必要と思われる。このため、ポリケチドシンターゼ様の系である、PUFAの産生のための代替的な系の発見は、「古典的」または「標準的」な脂肪酸合成経路のデサチュラーゼおよびエロンガーゼを用いる植物または他の生物(例えば、微生物)の遺伝子操作に代わる重要な選択肢をもたらした。
本発明の1つの態様は、長鎖PUFA遊離脂肪酸(FFA)のアシル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子であって、核酸配列が以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するACoASと少なくとも60%同一なアシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)をコードする、核酸分子に関する:SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97およびSEQ ID NO:99。1つの局面において、核酸配列は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)をコードする:SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97およびSEQ ID NO:99。1つの局面において、核酸配列は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする:SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85およびSEQ ID NO:97。1つの局面において、核酸配列は、以下からなる群より選択される:SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96およびSEQ ID NO:98。
少なくとも1つのエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン;
少なくとも4つのアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメイン;
少なくとも2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;
少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン;
少なくとも1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)ドメイン;
少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン;および
少なくとも1つの鎖長因子(CLF)ドメイン;
少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン。
2つのエノイルACP-レダクターゼ(ER)ドメイン;
8つまたは9つのアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメイン;
2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;
1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン;
1つのケトレダクターゼ(KR)ドメイン;
2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン;
1つの鎖長因子(CLF)ドメイン;および
1つのマロニルCoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン。
少なくとも1つのエノイルACP-レダクターゼ(ER)ドメイン;
少なくとも6つのアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメイン;
少なくとも2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;
少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン;
少なくとも1つのケトレダクターゼ(KR)ドメイン;
少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン;
少なくとも1つの鎖長因子(CLF)ドメイン;
少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン;および
少なくとも1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)ドメイン。
本発明は一般に、多価不飽和脂肪酸(PUFA)、特に長鎖PUFA(LCPUFA)の生産の改良のための、そのようなPUFAを産生するように遺伝的に改変された宿主生物における、タンパク質または標的(本明細書では一般に「アクセサリータンパク質」または「アクセサリー標的」と称する)およびそのようなタンパク質をコードする核酸分子の提供に関する。本発明はまた、そのようなタンパク質のいくつかを発現するように遺伝的に改変された生物、ならびにそのような生物を作製および使用する方法にも関する。本発明はまた、PUFAを産生する生物に対するさらなる遺伝的改変(PUFAを産生させるための遺伝的改変によるものを含む)にも関し、それには生物における特定の遺伝子または標的の欠失または不活性化が含まれうる。特に、本発明は、生物によるPUFA産生および/または蓄積を改善または向上させるための、PUFA PKS系を(内因的に、または遺伝子操作によって)発現する生物の遺伝的改変に関する。例えば、本発明はまた、突然突然変異誘発、またはプラスチドオルガネラならびにサイトゾルに対する酵素のターゲティングなどによる、基質をめぐって競合する酵素のダウンレギュレーションへの人為的操作、およびより高い酵素活性への人為的操作にも関する。
タンパク質の発現を得るためには、遺伝子配列を異種宿主のそれに適合させるための最適化が必要な可能性がある。これは以下に述べる実施例で例証されており、そこでは、シゾキトリウム属由来のPUFA PKS系からのタンパク質をコードする遺伝子が、細菌宿主ならびに酵母におけるコドン用法に対して最適化されている。細菌における使用に対して最適化された遺伝子は、植物におけるシゾキトリウム属PUFA PKSの発現のためにも有用であることが見いだされた。これらの最適化された遺伝子に関する詳細については以下に述べる。
本発明者らは、大腸菌、酵母および植物に存在する内因性PPTアーゼが、PUFAシンターゼのACPドメインを活性化できないことを突き止めた。本発明者らは以前に、内因性PPTアーゼがPUFAシンターゼのACPドメインを活性化しない宿主において用いうる、適した代替的なPPTアーゼである、ネンジュモ(Nostoc)由来のHetI(米国特許出願公開第20020194641号に記載)を同定した。他の適したPPTアーゼも記載されており、容易に入手することができる。種々の異種宿主細胞におけるPPTアーゼが記載されており、以下に例示されている。
PUFAシンターゼは、伸長反応のためにマロニル-CoAを炭素源として利用する。マロニル-CoAはまた、FAS、細胞質脂肪酸伸長反応および他の酵素(例えば、カルコンシンターゼ)によっても用いられる。PUFAシンターゼはマロニル-CoAをめぐってこれらの他の酵素系と競合する。このことは、PUFAシンターゼ経路の流れを増大させる1つのやり方が、マロニル-CoAのプールをめぐって競合するその能力を強化することであることを示している。この基質をめぐって競合する能力を強化するために考えられるやり方は数多く存在する。これらには、1)競合性経路の阻害、これには例えば、そのような経路に関与する酵素またはサブユニットの発現レベルを低下させることによる(例えば、アンチセンスRNA、RNAi、共抑制または突然変異の使用による)、FAS経路内の任意の要素の阻害が含まれる、2)競合性経路が減弱化またはブロックされている異種宿主(例えば、細胞質中の脂肪酸を伸長させる能力がブロックされているキャノーラ)におけるPUFAシンターゼの発現、および/または3)マロニル-CoAのプールを増加させること(例えば、アセチル-CoAカルボキシラーゼの発現による)が非限定的に含まれる。この戦略の例は以下により詳細に述べられており、実施例に例示されている。
シゾキトリウム属に存在する酵素は、PUFAシンターゼの遊離脂肪酸生成物をアシル-CoAに効率的に変換する。異種宿主に存在する酵素は、そのような遊離脂肪酸が典型的にはそのような生物に遭遇しないと思われるため、これらの反応を同程度の効率では遂行できないと思われる。例えば、そのような異種宿主における、さまざまなPUFAシンターゼの遊離脂肪酸生成物(例えば、DHA、DPA n-6、EPAまたは他の生成物)をアシル-CoAに効率的に変換するアシル-CoAシンテターゼ酵素の発現は、そのような生成物を蓄積する能力の増大をもたらす可能性がある。この点に関して、シゾキトリウム属、またはPUFAシンターゼ経路を介してPUFAを産生する他の生物は、そのような酵素をコードする遺伝子の優れた供給源として役立つと考えられる(以下の説明および実施例を参照)。
シゾキトリウム属に存在する酵素は、PUFAシンターゼのアシル-CoA型の生成物を効率的に利用して、PLおよびTAG分子を合成する。異種宿主に存在する酵素は、PUFA-CoAが典型的にはそのような生物に遭遇しないと思われるため、これらの反応を同程度の効率では遂行できないと思われる。例えば、そのような異種宿主における、さまざまなPUFAシンターゼのアシル-CoA生成物(例えば、DHA-CoA、DPA n-6-CoA、EPA-CoAまたは他のもの)をPLまたはTAG分子に効率的に組み込むPLまたはTAG合成酵素の発現は、そのような生成物を蓄積する能力の増大をもたらす可能性がある。この点に関して、シゾキトリウム属、またはPUFAシンターゼ経路を介してPUFAを産生する他の生物は、そのような酵素をコードする遺伝子の優れた供給源として役立つと考えられる(以下の説明および実施例を参照)。
異種宿主に蓄積するPUFAの量を増加させる、またはそのプロフィールを変化させるために利用しうる他の方法も本明細書では想定している。一例として、PUFAシンターゼ系を宿主内の別個の区画で発現させ、それにより、蓄積の増大をもたらすと思われる別個のマロニル-CoAプールを得ることができる(例えば、植物細胞のプラスチドおよび細胞質において)。この戦略も以下の実施例に例示されている。
したがって、本発明は、PUFA PKS系とともに用いるためのアクセサリータンパク質および他の標的の提供を対象とする。本明細書で用いる場合、PUFA PKS系(これはPUFAシンターゼ系またはPUFAシンターゼと称してもよい)は一般に、以下の識別的な特徴を有する:(1)それはPUFA、特に長鎖PUFAを、系の天然生成物として生成する;および(2)それは、選択されたサイクルにおけるトランス-シス異性化およびエノイル還元反応を含む、脂肪酸鎖の反復的処理と非反復的処理との両方を遂行する複合体として構築される複数の多機能性タンパク質を含む。加えて、PUFAシンターゼ酵素に存在するACPドメインは、補因子(4-ホスホパンテテイン)の結合による活性化も必要とする。この補因子の結合はホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)によって行われる。宿主生物の内因性PPTアーゼがPUFAシンターゼのACPドメインを活性化することができなければ、その機能を遂行しうるPPTアーゼを与えることが必要である。本発明者らは、ネンジュモ属のHetI酵素が、PUFAシンターゼのACPドメインを活性化するための例示的でかつ適切なPPTアーゼであるとして同定している。PUFA PKS系またはPUFAシンターゼに対する言及は、生物においてPUFAを産生するように複合体中で働く遺伝子およびそれらにコードされる産物のすべてをまとめて指す。したがって、PUFA PKS系は具体的には、天然生成物がPUFAであるPKS系のことを指す。
(a)少なくとも1つのエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン;(b)複数のアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメイン(例えば、少なくとも1つ〜4つの、好ましくは少なくとも5つのACPドメイン、いくつかの態様においては最大で6つ、7つ、8つ、9つ、10個または10個を上回るACPドメイン);(c)少なくとも2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;(d)少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン;(e)少なくとも1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)ドメイン;(f)少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン;(g)少なくとも1つの鎖長因子(CLF)ドメイン;(h)少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン。1つの態様において、本発明によるPUFA PKS系はまた、デヒドラターゼ(DH)の保存的活性部位モチーフを含む少なくとも1つの領域も含む。
1つの態様において、シゾキトリウム属由来のPUFA PKS系は、少なくとも以下の生物活性ドメインを含む:(a)2つのエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン;(b)5つ〜10個またはそれ以上のアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメイン、1つの局面においては9つのACPドメイン;(c)2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;(d)1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン;(e)1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)ドメイン;(f)2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン;(g)1つの鎖長因子(CLF)ドメイン;および(h)1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン。1つの態様において、本発明によるシゾキトリウム属PUFA PKS系はまた、FabA様DHドメインの一部ではない、デヒドラターゼ(DH)の保存的活性部位モチーフを含む少なくとも1つの領域またはドメインも含む。これらのドメインの構造的および機能的な特徴は、当技術分野で個別的に一般に知られている(例えば、米国特許6,566,583号;Metz et al., Science 293:290-293 (2001);米国特許出願公開第20020194641号;およびPCT公開第WO 2006/135866を参照)。
OrfAに関する全ヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:1として表されている。OrfAは、本明細書にSEQ ID NO:2として表されている2910アミノ酸の配列をコードする、8730ヌクレオチドの配列(終止コドンを含めず)である。OrfAの内部には12個のドメインがある:(a)1つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;(b)1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン;(c)9つのアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメイン;および(d)1つのケトレダクターゼ(KR)ドメイン。シゾキトリウム属ATCC 20888株、およびシゾキトリウム属N230D株と命名されたATCC 20888株の娘株の両方から、OrfAをコードするゲノムDNAクローン(プラスミド)が単離され、シークエンシングが行われている。
があり、これは本明細書にSEQ ID NO:15として表されている。SEQ ID NO:2のアミノ酸配列に関して、9つのACPドメインのそれぞれについての活性部位セリン残基(すなわち、パンテテイン結合部位)の位置は以下の通りである:ACP1=S1157;ACP2=S1266;ACP3=S1377;ACP4=S1488;ACP5=S1604;ACP6=S1715;ACP7=S1819;ACP8=S1930;およびACP9=S2034。ACPドメインの平均サイズがリンカーを除いて約85アミノ酸、リンカーを含めて約110アミノ酸であり、活性部位セリンがほぼドメインの中央にあることを考慮して、当業者は、OrfAにおける9つのACPドメインのそれぞれの位置を容易に決定することができる。
OrfBに関する全ヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:3として表されている。OrfBは、本明細書にSEQ ID NO:4として表されている2059アミノ酸の配列をコードする、6177ヌクレオチドの配列(終止コドンを含めず)である。OrfBの内部には4つのドメインがある:(a)1つの-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;(b)1つの鎖長因子(CLF)ドメイン;(c)1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン;および(d)1つのエノイルACP-レダクターゼ(ER)ドメイン。
OrfCに関する全ヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:5として表されている。OrfCは、本明細書にSEQ ID NO:6として表されている1502アミノ酸の配列をコードする、4506ヌクレオチドの配列(終止コドンを含めず)である。OrfCの内部には3つのドメインがある:(a)2つのFabA様-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン;および(b)1つのエノイルACPレダクターゼ(ER)ドメイン。
1つの態様において、ヤブレツボカビ属のPUFA PKS系は、少なくとも以下の生物活性ドメインを含む:(a)2つのエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン;(b)5つ〜10個またはそれ以上のアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメイン、1つの局面においては8つのACPドメイン;(c)2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;(d)1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン;(e)1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)ドメイン;(f)2つのFabA様β-ヒドロキシアシルACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン;(g)1つの鎖長因子(CLF)ドメイン;および(h)1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン。1つの態様において、本発明によるヤブレツボカビ属PUFA PKS系はまた、FabA様DHドメインの一部ではない、デヒドラターゼ(DH)の保存的活性部位モチーフを含む少なくとも1つの領域またはドメインも含む。これらのドメインの構造的および機能的な特徴は、当技術分野で個別的に一般に知られている(例えば、米国特許公報第2004035127号、前記を参照)。
Th. 23B OrfAに関する全ヌクレオチド配列は本明細書にSEQ ID NO:38として表されている。Th. 23B OrfAは、本明細書にSEQ ID NO:39として表されている2811アミノ酸の配列をコードする、8433ヌクレオチドの配列(終止コドンを含めず)である。SEQ ID NO:38は、Th. 23B OrfAにおける以下のドメインをコードする:(a)1つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;(b)1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン;(c)8つのアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメイン;および(d)1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)ドメイン。
Th. 23B OrfBに関する全ヌクレオチド配列は本明細書にSEQ ID NO:51として表されており、これは本明細書にSEQ ID NO:52として表されている1935アミノ酸の配列をコードする、5805ヌクレオチドの配列(終止コドンを含めず)である。SEQ ID NO:51は、Th. 23B OrfBにおける以下のドメインをコードする:(a)1つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;(b)1つの鎖長因子(CLF)ドメイン;(c)1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン;および(d)1つのエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン。
Th. 23B OrfCに関する全ヌクレオチド配列は本明細書にSEQ ID NO:61として表されており、これは本明細書にSEQ ID NO:62として表されている1470アミノ酸の配列をコードする、4410ヌクレオチドの配列(終止コドンを含めず)である。SEQ ID NO:61は、Th. 23B OrfCにおける以下のドメインをコードする:(a)両方ともFabAタンパク質(トランス-2-デセノイル-ACPの合成およびこの生成物のシス-3-デセノイル-ACPへの可逆的異性化を触媒する酵素)との相同性を有する、2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン;および(b)シゾキトリウム属OrfBのERドメインに対する高度の相同性を有する、1つのエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン。
以前に記載されている、シュワネラ-ジャポニカのコアPUFA PKS系およびそのPPTアーゼを構成するオープンリーディングフレームは5つある。各オープンリーディングフレームのドメイン構造は以下の通りである。
以前に記載されている、シュワネラ-オレヤナコアPUFA PKS系およびそのPPTアーゼを構成するオープンリーディングフレームは5つある。各オープンリーディングフレームのドメイン構造は以下の通りである。
本発明は、異種宿主におけるPUFA PKS系の発現に用いるためのさまざまな最適化された配列を含み、その例は以下に提示されている。当業者は、最適化された配列、特に、異種宿主における好ましいコドン用法またはより優れた発現および機能のために最適化された配列を作製しうると考えられる。
sOrfAと命名されたSEQ ID NO:35は、酵母における最適化されたコドン用法のために再合成された、シゾキトリウム属由来のOrfAをコードする核酸配列(SEQ ID NO:1)を表す。SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:35はそれぞれSEQ ID NO:2をコードする。
sOrfBと命名されたSEQ ID NO:36は、酵母における最適化されたコドン用法のために再合成された、シゾキトリウム属由来のOrfBをコードする核酸配列(SEQ ID NO:3)を表す。SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:36はそれぞれSEQ ID NO:4をコードする。
OrfB*と命名されたSEQ ID NO:37は、植物細胞における使用のためにSEQ ID NO:3の一部分の内部に再合成され、OrfB*とも称される、大腸菌における最適化されたコドン用法のために最初は開発された極めて類似した配列に由来するシゾキトリウム属由来のOrfBをコードする核酸配列(SEQ ID NO:3)を表す。OrfB*はいずれの型(大腸菌用および植物用)も、SacII断片(SEQ ID NO:3における一意的な部位)に対するBspHI再合成(SEQ ID NO:3のヌクレオチド4415)を除いて、SEQ ID NO:3と同一である。どちらのバージョン(大腸菌および植物)も、orfBの元のゲノム配列(SEQ ID NO:3)と比較して、遺伝子の開始部付近に他の2つのコドン改変を有する。第1に、第4のコドンであるアルギニン(R)が、ゲノム配列におけるCGGからorfB*ではCGCに変化している。第2に、第5のコドンであるアスパラギン(N)が、ゲノム配列におけるAATからorfB*ではAACに変化している。SEQ ID NO:37を作り出すための植物ベクター中へのこの遺伝子のクローニングを容易にするために、大腸菌orfB*配列中の、遺伝子の開始部から20塩基の箇所にPstI部位(CTGCAG)も人為的に作製した。この変化は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させなかった。SEQ ID NO:37およびSEQ ID NO:3(ならびに大腸菌用のOrfB*型)はいずれもSEQ ID NO:4をコードする。
本発明によれば、異種宿主におけるPUFAの産生および/もしくは蓄積のため、または内因性宿主におけるPUFAの産生および/もしくは蓄積の改良のためのPUFA PKS系は、PUFAの産生のための上記のさまざまな標的または戦略の1つまたは複数を利用することが好ましい(上記の6つの指針および戦略を参照)。これらの戦略には、とりわけ、上記のコアPUFA PKS系の部分ではない(すなわち、PUFAシンターゼ酵素複合体それ自体の部分ではない)と考えられるタンパク質と定義されるが、本発明のコアPUFAシンターゼ酵素複合体を用いたPUFA産生のため、または少なくとも効率的なPUFA産生のためには必要と思われる、または必要である、さまざまなアクセサリータンパク質の使用が含まれる。これらの戦略にはまた、マロニル-CoAのプールをめぐって競合するその能力を強化することにより、PUFAシンターゼ経路を通じての基質マロニル-CoAの流れを増大させるためのさまざまな遺伝的改変も含まれる。本発明のこれらの態様の変形物について以下に述べる。
異種宿主におけるPUFAの産生のための一般的な指針および戦略の下で以上に考察したように、PUFAを生成するためには、PUFA PKS系は、4'-ホスホパンテテイニル部分を補酵素Aからアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメインに転移させるアクセサリータンパク質とともに働かなくてはならない。このため、PUFA PKS系は少なくとも1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)ドメインを含むと考えることができ、またはそのようなドメインはPUFA PKS系にとってのアクセサリードメインまたはタンパク質であると考えることができる。PPTアーゼの構造的および機能的な特徴は、例えば、米国特許出願公開第20020194641号;米国特許出願公開第20040235127号;および米国特許出願公開第20050100995号に詳細に記載されている。
以上に考察したように、PUFA PKS系(PUFAシンターゼ)の基質であるマロニル-CoAは、脂肪酸シンターゼ系(FAS)、細胞質脂肪酸伸長反応および他の酵素(例えば、カルコンシンターゼ)によっても利用される。このため、PUFAシンターゼは、マロニル-CoAをめぐってこれらの他の酵素系と競合する。したがって、本発明の1つの態様は、マロニル-CoAのプールをめぐって競合するPUFAシンターゼ酵素の能力を強化することによって、PUFAシンターゼ経路を通じてのマロニル-CoAの流れを増大させるための方法および遺伝的改変に関する。本明細書で提唱する方法には、以下が非限定的に含まれる:1)競合性経路の阻害、これには例えば、そのような経路に関与する酵素またはサブユニットの発現レベルを低下させることによる(例えば、アンチセンスRNA、RNAi、共抑制または突然変異の使用による)、FAS経路内の任意の要素の阻害が含まれる、2)競合性経路が減弱化またはブロックされている異種宿主(例えば、細胞質中の脂肪酸を伸長させる能力がブロックされているキャノーラ)におけるPUFAシンターゼの発現、および/または3)マロニル-CoAのプールを増加させること(例えば、アセチル-CoAカルボキシラーゼの発現による)。
本発明のもう1つの態様は、長鎖PUFA遊離脂肪酸(FFA)のアシル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)タンパク質を提供する。
上記の異種宿主におけるPUFAの産生および/または蓄積を増加させるためのもう1つの戦略と関連して、本発明のもう1つの態様は、PLまたはTAGの生成においてPUFA-CoAを基質として利用する、さらなるアシルトランスフェラーゼタンパク質(例えば、3-グリセロール-リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)およびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DAGAT))、またはPLもしくはTAGにおけるPUFAの富化をもたらしうる他のアシルトランスフェラーゼ(例えば、リン脂質:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(PDAT))を提供する。本発明は、特に生物におけるPUFAの産生および蓄積を強化するための、そのような単離されたタンパク質およびその相同体、そのようなタンパク質をコードする核酸分子、そのようなタンパク質を発現する遺伝的に改変された生物、ならびにそのようなタンパク質を用いるさまざまな方法を含む。
上記のもう1つの戦略と関連して、本発明の1つの態様は、宿主の1つまたは複数のオルガネラに対する、PUFAシンターゼ酵素、PPTアーゼおよび/またはアクセサリータンパク質の任意の1つもしくは複数の発現のターゲティング、ならびに/または標的指向的な遺伝的改変に関する。例えば、1つの態様において、PUFAシンターゼ系およびPPTアーゼの発現は、植物のプラスチドに対してターゲティングされる。もう1つの態様において、PUFAシンターゼ系およびPPTアーゼの発現はサイトゾルに対してターゲティングされる。もう1つの態様において、PUFAシンターゼ系およびPPTアーゼの発現は植物のプラスチドおよびサイトゾルの両方に対してターゲティングされる。これらの態様のいずれかにおいて、他の標的をプラスチドまたはサイトゾルに向かわせることができる。1つの局面において、アシル-CoAシンテターゼの発現はサイトゾルに対してターゲティングされ、もう1つの態様において、そのような発現はプラスチドに対してターゲティングされる。1つの態様において、1つのアシル-CoAシンテターゼはサイトゾルに対してターゲティングされ、もう1つのアシル-CoAシンテターゼはプラスチドに対してターゲティングされる。好ましくは、アシル-CoAシンテターゼは、DHAおよび/またはDPA遊離脂肪酸をアシル-CoAに変換し、続いてそれがアシルトランスフェラーゼによって利用されるように、サイトゾル中で発現される。アシルトランスフェラーゼは一般に、小胞体に対して共翻訳的に(co-translationally)ターゲティングされる。1つまたは複数の宿主酵素を阻害するための遺伝的改変などによるFAS系の阻害を、PUFAシンターゼが発現されるのと同じオルガネラに向かわせることができる。
本発明によれば、1つまたは複数の標的PUFAの産生および蓄積のための異種宿主の作製において、宿主におけるPUFAの産生および/または蓄積を改良するための、本明細書に記載した戦略の任意の1つまたは複数(任意の組み合わせ)を用いることができる。実際に、戦略のさまざまな組み合わせは相加的または相乗的と考えられ、1つまたは複数のそのような戦略の非存在下と比較して、PUFAの産生および/または蓄積の改良をもたらすことが予期される。実際に、実施例は、宿主生物(異種宿主であるもの、およびPUFA PKS系を天然に発現する生物の両方)におけるPUFAの産生のための、戦略の種々の組み合わせを含む、複数の例示的な戦略を提供している。
(a)アシル-CoAシンテターゼ(例示されているのはACS-1およびACS-2である)の発現;
(b)FASの阻害(例示されているのは、KASII RNAi、KAS IIアンチセンス、KASIII RNAi、およびKASIIIアンチセンスによる阻害である);
(c)アシル-CoAシンテターゼの発現とFASの阻害との組み合わせ(例示されているのは、ACS-1の発現と、KASII RNAi、KAS IIアンチセンス、KASIII RNAiおよびKASIIIアンチセンスのそれぞれによるFASの阻害とのものである);
(d)アシルトランスフェラーゼ(例示されているのはLPAAT-1である)の発現;
(e)アシルトランスフェラーゼの発現と、アシル-CoAシンテターゼの発現およびFASの阻害との組み合わせ(例示されているのは、DAGAT-1の発現とACS-1の発現とのものであり、それぞれの組み合わせはKASII RNAiまたはKASIIIアンチセンスによるFASの阻害を伴う);
(f)アシルトランスフェラーゼの発現と、2つのアシル-CoAシンテターゼの発現およびFASの阻害との組み合わせ(例示されているのは、DAGAT-1の発現とACS-1の発現、ACS-8の発現とのものであり、それぞれの組み合わせはKASII RNAiまたはKASIIIアンチセンスによるFASの阻害を伴う);
(g)2つのアシルトランスフェラーゼの発現と、アシル-CoAシンテターゼの発現およびFASの阻害との組み合わせ(例示されているのは、DAGAT-1およびLPAAT-1の発現とACS-1の発現とのものであり、それぞれの組み合わせはKASII RNAiまたはKASIIIアンチセンスによるFASの阻害を伴う);および
(h)2つのアシルトランスフェラーゼの発現と、2つのアシル-CoAシンテターゼの発現およびFASの阻害との組み合わせ(例示されているのは、DAGAT-1およびLPAAT-1の発現と、ACS-1およびACS-8の発現とのものであり、それぞれの組み合わせはKASII RNAiまたはKASIIIアンチセンスによるFASの阻害を伴う)。
意味のある高収量の1つまたは複数の所望の多価不飽和脂肪酸または他の生物活性分子を産生させる目的で、微生物もしくは植物におけるPUFA PKS系の活性および特に最終生成物を変化させるため、またはPUFA PKS系を微生物もしくは植物に導入するために、生物、好ましくは微生物または植物を遺伝的に改変することができる。本発明は、そのような遺伝的改変の有効性を改良または強化するための、特にPUFA PKS系の最終生成物、好ましくはPUFAの産生および/または蓄積を改良または強化するための方法に関する。
本明細書で用いる場合、遺伝的に改変された微生物には、遺伝的に改変された細菌、原生生物、微小藻類、真菌類またはその他の微生物が含まれうる。そのような遺伝的に改変された微生物は、所望の結果(すなわち、PUFA PKS活性および/またはPUFA PKS系を用いた所望の生成物の産生の増大または改変)が達成されるように、その正常な(すなわち、野生型または天然の)形態から改変された(すなわち、突然変異または変化した)ゲノムを有する。微生物の遺伝的改変は、古典的な系統開発および/または分子遺伝学の手法を用いて達成されうる。そのような技術は当技術分野で公知であり、微生物については、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Pressにおいて一般に開示されている。この文献(Sambrookら、同上)は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。遺伝的に改変された微生物には、そのような改変が微生物の内部に望ましい効果を与えるような様式で核酸分子が挿入、欠失または改変された(すなわち、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換および/または反転により突然変異した)微生物が含まれうる。
界:ストラメノパイル(クロミスタ)
門:ラビリンチュラ菌門
網:ラビリンチュラ網(Labyrinthulomycetes)
目:ラビリンチュラ目
科:ラビリンチュラ科
目:ヤブレツボカビ目
科:ヤブレツボカビ科
本発明のもう1つの態様は、遺伝的に改変された植物であって、本明細書に記載したようなPPTアーゼを含むPUFA PKS系を組換え的に発現するように遺伝的に改変されており、かつ、宿主によるPUFA(またはPUFA PKS系の他の生物活性生成物)の産生および/または蓄積の改良のために本明細書に記載したようなアクセサリータンパク質を発現するように、ならびに/または、PUFA PKS系と競合する経路を阻害するために(例えば、FAS系の阻害)、さらに遺伝的に改変されている植物に関する。好ましくは、そのようなアクセサリータンパク質は、ACoASおよび/またはPLもしくはTAGの生成においてPUFA-CoAを基質として利用するタンパク質(例えば、GPAT、LFAATまたはDAGAT)である。
本発明の1つの態様は、本発明の遺伝的に改変された生物(例えば、微生物または植物)(以上に詳述)を成育させること、または培養することによって、所望の生物活性分子(産物または化合物とも称される)を生産するための方法である。好ましくは、生物活性分子はPUFAであり、最も好ましくはLCPUFAである。好ましくは、遺伝的に改変された生物は、遺伝的に改変された微生物または遺伝的に改変された植物である。そのような方法は、本明細書で以前に記載した通りに、および本発明に従って、遺伝的改変を有する微生物または植物をそれぞれ、発酵培地中で培養する段階、または土壌などの適当な環境中で成育させる段階を含む。本発明のPUFA PKS系に関連した遺伝的改変のために好ましい宿主細胞については上述している。
本発明によれば、単離されたタンパク質とは、その天然の環境から取り出された(すなわち、人為的な操作を受けた)タンパク質またはその断片(ポリペプチドまたはペプチドを含む)のことであり、これには例えば、精製されたタンパク質、部分的に精製されたタンパク質、組換的に産生されたタンパク質、および合成的に生成されたタンパク質が含まれうる。このため、「単離された」タンパク質は、タンパク質が精製される程度を反映しない。好ましくは、本発明の単離されたタンパク質は、組換え的に産生される。単離されたペプチドは、合成的に(例えば、ペプチド合成などによって化学的に)または組換え的に生産することができる。
0 BLOSUM62行列を用いる、blastnに関して:
マッチについての報酬=1
ミスマッチについてのペナルティ=-2
オープンギャップ(5)および伸長ギャップ(2)ペナルティ
ギャップx_ドロップオフ(50)期待(10)ワードサイズ(11)フィルター(オン)
0 BLOSUM62行列を用いる、blastpに関して:
オープンギャップ(11)および伸長ギャップ(1)ペナルティ
ギャップx_ドロップオフ(50)期待(10)ワードサイズ(3)フィルター(オン)。
実施例に対する一般的序論.PUFAシンターゼをコードする遺伝子が、海洋細菌およびヤブレツボカビ科生物の種において同定された。これらの遺伝子セットのいくつかは大腸菌において発現されており、適切なPPTアーゼを供給した場合には、そのような酵素のPUFA生成物がそれらの細胞内に蓄積しうる。しかし、本発明者らが知る限りでは、これらの酵素からのPUFAの放出の方法は以前に記載されていない。放出機構は、異種宿主生物におけるPUFAシンターゼ系の発現に関して意味がある。それはまた、その系を通じての炭素の流れ、および異種またはネイティブ性の宿主生物に蓄積するPUFAの最終的な量を調節することを目的とする取り組みに対する指示も与えることができる。ここで本発明者らは、シゾキトリウム属PUFAシンターゼ(および、理論に拘束されるわけではないが、可能性としては、すべてのヤブレツボカビ科PUFA PKS系を含む、すべての真核生物PUFAシンターゼ系)の生成物が、遊離脂肪酸であること、および遊離脂肪酸の放出が酵素複合体それ自体と不可分であることを示す。さらに、シゾキトリウム属において、PUFA FFAは、リン脂質(PL)およびトリアシルグリセロール(TAG)に組み込まれる前に、エステル化されてCoAとなる。下記の実施例に記載したデータは、異種宿主生物における発現のため、ならびにネイティブ性の宿主生物におけるPUFA蓄積の改変のための戦略を示している。
本実施例は、生化学的検討のためのシゾキトリウム属FASノックアウト株の作出を説明している。
下記の実施例は、シゾキトリウム属Ac66、ならびにシゾキトリウム属Ac66に由来するPUFAシンターゼKO株およびFAS-KO株の無細胞抽出物の調製のための一般的なプロトコールを説明している。
本実施例は、インビトロでのFASおよびPUFAシンターゼの活性アッセイに関する一般的な条件を説明している。
下記の実施例は、FAS活性およびPUFAシンターゼ活性に関するインビトロアッセイの結果を説明している。
下記の実施例は、シゾキトリウム属におけるPUFA合成のさらなる特徴づけを説明しており、シゾキトリウム属PUFAシンターゼの初期生成物が遊離脂肪酸(FFA)であるという証拠を提供している。
下記の実施例は、シゾキトリウム属のPUFA蓄積経路におけるアシル-CoAシンテターゼ反応の関与を裏づける証拠を提供している。
下記の実施例は、シゾキトリウム属Orf A、OrfBss(OrfB*)、OrfCおよびネンジュモ属HetIを発現する大腸菌からの抽出物のインビトロアッセイを説明している。
下記の実施例は、パン酵母における、シゾキトリウム属PUFAシンターゼ(sOrf A、sOrfBおよびネイティブ性OrfC、以下を参照)をコードする遺伝子の、HetIを伴っての発現を示している。
下記の実施例は、特定のアシル-CoAシンテターゼとの共発現によって、シゾキトリウム属PUFAシンターゼを発現する酵母におけるPUFAの蓄積を増加させることを説明している。
1.長さ=2004ヌクレオチド(終止コドンを含めず)(SEQ ID NO:82)。これは668アミノ酸(SEQ ID NO:83)、73.5kDaのタンパク質をコードすると予想される。このタンパク質配列は、既知のACSに対して良好な相同性を有する。最良のBlastマッチは、DHAとの高い活性を有することが特徴づけられて示されているタラシオシラ-シュードナナのACS(TplacA、アクセッション番号:AAW58006)に対してである(Tonon et al., Plant Physiol. 2005 May;138(1):402-8)。SEQ ID NO:83のC末端の3つのアミノ酸は以下である:SKL‐ペルオキシソームに対するタンパク質のターゲティングと関連するモチーフ。このC末端モチーフは、上述したタラシオシラ-シュードナナのACSにも存在する。
下記の実施例は、FAS経路を阻害するセルレニンの存在下での増殖により、シゾキトリウム属PUFAシンターゼを、ScACoAS-1を伴わずに、または伴って発現する酵母におけるPUFAのレベルが上昇することを実証している。
・株5.5は、上記の実施例8に記載したように、PUFAシンターゼ遺伝子(sOrfA、sOrfB、OrfCおよびHetI)を含んだ;および
・株5.6は、上記の実施例9に記載したように、株5.5のPUFAシンターゼ遺伝子セットに加えて、ScACoAS-1(SEQ ID NO:82)も含んだ。
下記の実施例は、異種宿主におけるPUFAの産生および/または蓄積を増加させるのに用いるための、さらなるアクセサリータンパク質または標的の同定を説明している。
本発明者らは、シゾキトリウム属ESTデータベースを、DAGAT活性が知られている(または疑われる)タンパク質に対する相同性を示すようなESTに関して検討した。本発明者らは、PUFA PKS系とともに用いるための可能性のあるDAGAT酵素として3つの候補を同定しており、その1つを以下に説明するが、これはシゾキトリウム属におけるTAG分子への遊離脂肪酸の蓄積に関与することが示されている。
本発明者らはまた、シゾキトリウム属ESTデータベースを、LPAAT活性が知られている(または疑われる)タンパク質に対する相同性を示すようなESTに関しても検討した。本発明者らは、上記のように、これらを複数のコンティグにアセンブルし(2つまたはそれ以上の部分的に重複する配列が得られた場合)、これらを個々の配列情報の質に基づいて編集した。この取り組みの結果を以下にまとめる。LPAAT活性と関連づけられる特に優れた候補である、3つの異なるコンティグおよび1つのシングレット(部分的に重複する配列がデータベース中にない)が同定された。これらの配列によってコードされる酵素は、推定されるLPAAT活性と関係するがそれとは異なる活性を有しうることが確認された。4つのケースのすべてにおいて、Orfと推定されるもの(開始コドンおよび終止コドンを含む)が同定された。さらにデータが得られるに伴って、内因性開始コドンの同定を含め、正確な配列の表現は変わりうると認識される。
1.ScLPAAT-1コンティグ:長さ=1478ヌクレオチド(SEQ ID NO:102)。これは927ntの完全長Orfを含むように思われる(終止コドンを含む、ScLPAAT-1 CDS、SEQ ID NO:103)。CDSの翻訳物(SEQ ID NO:104)を用いたBlast検索は、既知および推定的なアシルトランスフェラーゼタンパク質に対して、コードされるタンパク質の大部分にわたって良好な相同性がみられることを示している。最良のマッチは、アラビドプシス由来のタンパク質に対してである。Pfam解析により、PlsC(1-アシル-sn-グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼ、すなわちLPAAT)ファミリーと関連する大きな保存的中心ドメインが示されている。
本発明者らはまた、クリプテコディニウム-コーニイのESTデータベースを、DAGATまたはLPAAT活性活性が知られている(または疑われる)タンパク質に対する相同性を示すようなESTに関しても検討した。この取り組みの結果を以下にまとめる。
1.CA5 PTA.838.C:長さ=817ヌクレオチド(SEQ ID NO:114)。PCT公開第WO 2004/087902号に記載されているクリプテコディニウムのアシルトランスフェラーゼ配列に対して、この配列の最後の274ヌクレオチドにわたって良好な相同性がみられる。
2.CA5 PTA.131.C1:長さ=850ヌクレオチド(SEQ ID NO:115)。
3.CA12 cot10 003a h10:長さ=663ヌクレオチド(SEQ ID NO:116)
4.CA12 cot10 001a h02:長さ=807ヌクレオチド(SEQ ID NO:117)
5.CA12 cot10 005b g12:長さ=765ヌクレオチド(SEQ ID NO:118)
6. CA12 cot50 005c d07:長さ=782ヌクレオチド(SEQ ID NO:119)
1.CA12 cot10 003a e11:長さ=793ヌクレオチド(SEQ ID NO:120)
2.CA12 PTA.739.C1:長さ=744ヌクレオチド(SEQ ID NO:121)
下記の実施例は、アラビドプシスにおける、シゾキトリウム属PUFAシンターゼをコードする遺伝子(OrfA、OrfB*およびOrfC)のHetIを伴っての発現、ならびに検出可能な中間体または副生成物が実質的に存在しない標的PUFA、DHAおよびDPAn-6の産生を説明している。
Orf B*(SEQ ID NO:4をコードする)を、flax lininプロモーター/ターミネーター(米国特許第6,777,591号)の制御下にある発現カセット中に制限クローニングした。lininプロモーターは種子発生中に導入遺伝子の特異的な時間的および組織特異的な発現を制御する。シゾキトリウム属Orf B*のすぐ上流かつインフレームには、プラスチドに対するOrf B*のターゲティングのための、アブラナのアシル-ACPチオエステラーゼ由来のプラスチドターゲティング配列(PT-シグナルペプチド)があった。この植物バイナリーベクターはまた、陽性選択用の左および右の境界配列(Haldrup et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37:287-296)の間のパセリ(Petroselinum crispum)由来のユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684)によって作動される既存の大腸菌ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子(Miles and Guest, 1984, Gene 32: 41-48)も含んでいた。
シゾキトリウム属Orf C(SEQ ID NO:5によって表されるヌクレオチド配列)を、HetI(SEQ ID NO:33によって表されるヌクレオチド配列)とともに、flax lininプロモーター/ターミネーター(米国特許第6,777,591号)の制御下にある発現カセット中にクローニングした。lininプロモーターは種子発生中に導入遺伝子の特異的な時間的および組織特異的な発現を制御する。シゾキトリウム属Orf CおよびHetIのすぐ上流かつインフレームには、プラスチドに対するPUFAシンターゼおよびPPTアーゼのターゲティングのための、アブラナのアシル-ACPチオエステラーゼ由来のプラスチドターゲティング配列(PT-シグナルペプチド)があった。続いて、両方のプラスミドを、左および右の境界配列の間のパセリ由来のユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684)によって作動される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性を付与するpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)を含む、1つの植物バイナリーベクター中に集成させた。
シゾキトリウム属Orf A(SEQ ID NO:1によって表されるヌクレオチド配列)を、flax lininプロモーター/ターミネーター(米国特許第6,777,591号)の制御下にある発現カセット中にクローニングした。lininプロモーターは種子発生中に導入遺伝子の特異的な時間的および組織特異的な発現を制御する。シゾキトリウム属Orf Aすぐ上流かつインフレームには、プラスチドに対するPUFAシンターゼおよびPPTアーゼのターゲティングのための、アブラナのアシル-ACPチオエステラーゼ由来のプラスチドターゲティング配列(PT-シグナルペプチド)があった。この発現カセットは、左および右の境界配列の間のMASプロモーター/ターミネーターによって作動される、宿主植物にカナマイシン耐性を付与するnptII遺伝子を含む植物バイナリーベクターの内部に含まれた。
このペプチドをコードするヌクレオチド配列を、各PUFAシンターゼOrfの開始メチオニンコドン、ならびにHetIの人工的に作製した開始コドン(ATG)に対してインフレームで配置した。PUFAシンターゼの局在を植物細胞の細胞質に対してターゲティングさせる他の構築物では、Orfの5'末端に追加的なタンパク質コード配列を付け加えなかった。
以下の実施例は、植物におけるPUFAの産生および/または蓄積を増加させるための、本明細書に記載したさまざまな戦略(戦略の組み合わせを含む)の使用を説明している。
(1)構築物
構築物4127の構築:PT-シグナルペプチド:nORFA、PT-シグナルペプチド:nORFB*、PT-シグナルペプチド:HetI、PT-シグナルペプチド:nORFC(シゾキトリウム属PUFAシンターゼとHetIとの、プラスチドを標的とする発現)
シゾキトリウム属のネイティブ性OrfA(nOrfA、SEQ ID NO:1によって表される、SEQ ID NO:2をコードする)、合成(再合成された)OrfB*(OrfB*、SEQ ID NO:37によって表され、SEQ ID NO:4をコードする)およびネイティブ性OrfC(nOrfC、SEQ ID NO:5によって表され、SEQ ID NO:6をコードする)を、ネンジュモ属由来のHetI(SEQ ID NO:33によって表され、SEQ ID NO:34をコードする)とともに、flax lininプロモーター/ターミネーター(プロモーター/ターミネーターに関しては米国特許第6,777,591号を参照)の制御下にある発現カセット中にクローニングした。lininプロモーターは種子発生中に導入遺伝子の特異的な時間的および組織特異的な発現を制御する。シゾキトリウム属Orf A、B*、CおよびHetIのすぐ上流かつインフレームには、プラスチドに対するPUFAシンターゼおよびPPTアーゼのターゲティングのための、実施例12にも記載した、アブラナのアシル-ACPチオエステラーゼ(本明細書においてはPT-シグナルペプチドと称し、そのアミノ酸配列はSEQ ID NO:81によって表される)由来のプラスチドターゲティング配列があった。続いて、4つの発現カセットすべてを、左および右の境界配列の間のパセリ由来のユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684)によって作動される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性を付与するpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)を含む、1つの植物バイナリーベクター中に集成させた。
アシル-CoAシンテターゼの発現のために、シゾキトリウム属ACS-1の核酸配列(SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83をコードする)を発現させるための別の植物バイナリーベクターを構築した。適切な制限部位が5'および3'末端に人工的に作製されたACS-1をサブクローニングして、配列を決定した。続いてACS-1を、陽性選択用の左および右の境界配列(Haldrup et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37:287-296)の間のパセリ由来のユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684)によって作動される大腸菌ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子(Miles and Guest, 1984, Gene 32:+ 41-48)を含む植物バイナリーベクター中の、flax lininプロモーター/ターミネーター(米国特許第6,777,591号)の制御下にある発現カセット中に制限クローニングした。
FASの阻害のために、KAS IIの発現を減弱させるための別の植物バイナリーベクターを構築した。この場合には、At1g74960座位によってコードされる、核にコードされるKAS II転写物(Carlsson et al., 2002, Plant J. 29:761-770)の499bp領域を、ペチュニアのカルコンシンターゼA(CHSA)遺伝子(McGinnis et al., 2005, Methods in Enzymology 392:1-24; Koes et al., 1989, Gene 81: 245-257)に由来する介在性イントロンによるRNA干渉(RNAi)の標的とした。CHSAイントロンによるKAS II RNAi(SEQ ID NO:122によって表される)を、陽性選択用の左および右の境界配列(Haldrup et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37:287-296)の間のパセリ由来のユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684)によって作動される大腸菌ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子(Miles and Guest, 1984, Gene 32: 41-48)を含む植物バイナリーベクター中の、lininプロモーター/ターミネーター(米国特許第6,777,591号)の間の植物バイナリーベクター中にクローニングした。
FASの阻害のために、KAS IIIの発現を減弱させるための別の植物バイナリーベクターを構築した。この場合には、At1g62640座位によってコードされる、核にコードされる転写物に由来する1210bpアンチセンスのKAS III配列(Yamada et al., 2002, GenBankアクセッションAY091275)を標的とした。KAS IIIアンチセンス配列(本明細書でSEQ ID NO:125によって表される)を、陽性選択用の左および右の境界配列(Haldrup et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37:287-296)の間のパセリ由来のユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684)によって作動されるホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子(Miles and Guest, 1984, Gene 32: 41-48)を含む植物バイナリーベクター中の、lininプロモーター/ターミネーター(米国特許第6,777,591号)の間の植物バイナリーベクター中にクローニングした。
FASの阻害と組み合わせたアシル-CoAシンテターゼの発現のために、KAS IIの発現を減弱させるため、およびシゾキトリウム属ACS-1の核酸配列(SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83をコードする)を発現させるための別の植物バイナリーベクターを構築した。この構築物に関しては、ACS-1およびイントロンによるKAS II RNAiの二重発現カセットを、陽性選択用の左および右の境界配列(Haldrup et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37:287-296)の間のパセリ由来のユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684)によって作動される大腸菌ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子(Miles and Guest, 1984, Gene 32: 41-48)を含む植物バイナリーベクター中にてflax lininプロモーター/ターミネーター(米国特許第6,777,591号)の制御下で発現させた。
FASの阻害と組み合わせたアシル-CoAシンテターゼの発現のために、KAS IIの発現を減弱させるため、およびシゾキトリウム属ACS-1の核酸配列(SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83をコードする)を発現させるための別の植物バイナリーベクターを構築した。この構築物に関しては、ACS-1およびKAS IIアンチセンス(KAS IIアンチセンス配列は本明細書でSEQ ID NO:123によって表されている)の二重発現カセットを、陽性選択用の左および右の境界配列(Haldrup et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37:287-296)の間のパセリ由来のユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684)によって作動される大腸菌ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子(Miles and Guest, 1984, Gene 32: 41-48)を含む植物バイナリーベクター中にてflax lininプロモーター/ターミネーター(米国特許第6,777,591号)の制御下で発現させた。
FASの阻害と組み合わせたアシル-CoAシンテターゼの発現のために、KAS IIIの発現を減弱させるため、およびシゾキトリウム属ACS-1の核酸配列(SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83をコードする)を発現させるための別の植物バイナリーベクターを構築した。この構築物に関しては、ACS-1およびKAS III RNAi(KAS III RNAi配列は本明細書でSEQ ID NO:124によって表されている)の二重発現カセットを、陽性選択用の左および右の境界配列(Haldrup et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37:287-296)の間のパセリ由来のユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684)によって作動される大腸菌ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子(Miles and Guest, 1984, Gene 32: 41-48)を含む植物バイナリーベクター中にてflax lininプロモーター/ターミネーター(米国特許第6,777,591号)の制御下で発現させた。
FASの阻害と組み合わせたアシル-CoAシンテターゼの発現のために、KAS IIIの発現を減弱させるため、およびシゾキトリウム属ACS-1の核酸配列(SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83をコードする)を発現させるための別の植物バイナリーベクターを構築した。この構築物に関しては、ACS-1およびKAS IIIアンチセンスの二重発現カセットを、陽性選択用の左および右の境界配列(Haldrup et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37:287-296)の間のパセリ由来のユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684)によって作動される大腸菌ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子(Miles and Guest, 1984, Gene 32: 41-48)を含む植物バイナリーベクター中にてflax lininプロモーター/ターミネーター(米国特許第6,777,591号)の制御下で発現させた。
DAGATの発現のために、シゾキトリウム属DAGAT-1の核酸配列(SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101をコードする)を発現させるための別の植物バイナリーベクターを構築した。シゾキトリウム属DAGAT(SEQ ID NO:100によって表されるヌクレオチド配列)を、flax lininプロモーター/ターミネーター(米国特許第6,777,591号)の制御下にある発現カセット中にクローニングした。。lininプロモーターは種子発生中に導入遺伝子の特異的な時間的および組織特異的な発現を制御する。この発現カセットは、左および右の境界配列の間のMASプロモーター/ターミネーターによって作動される、宿主植物にカナマイシン耐性を付与するnptII遺伝子を含む植物バイナリーベクターの内部に含まれた。
DAGATおよびアシル-CoAシンテターゼの発現のために、以下を発現させるための別の植物バイナリーベクターを構築した:(1)シゾキトリウム属DAGATの核酸配列(SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101をコードする)および(2)シゾキトリウム属ACS-8の核酸配列(SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97をコードする)。この構築物に関しては、ACS-8およびDAGATの二重発現カセットを、陽性選択用の左および右の境界配列の間のMASプロモーター/ターミネーターによって作動される、宿主植物にカナマイシン耐性を付与するnptII遺伝子を含む植物バイナリーベクター中にてflax lininプロモーター/ターミネーター(米国特許第6,777,591号)の制御下で発現させた。
LPAATおよびDAGATの発現のために、以下を発現させるための別の植物バイナリーベクターを構築した:(1)シゾキトリウム属LPAATの核酸配列(SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104をコードする)および(2)シゾキトリウム属DAGAT-1の核酸配列(SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101をコードする)。この構築物に関しては、LPAATおよびDAGATの二重発現カセットを、陽性選択用の左および右の境界配列の間のMASプロモーター/ターミネーターによって作動される、宿主植物にカナマイシン耐性を付与するnptII遺伝子を含む植物バイナリーベクター中にてflax lininプロモーター/ターミネーター(米国特許第6,777,591号)の制御下で発現させた。
アシル-CoAシンテターゼ、LPAATおよびDAGATの発現のために、以下を発現させるための別の植物バイナリーベクターを構築した:(1)シゾキトリウム属LPAATの核酸配列(SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:8104をコードする)、(2)シゾキトリウム属DAGAT-1の核酸配列(SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101をコードする)および(3)シゾキトリウム属ACS-8の核酸配列(SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97をコードする)。この構築物に関しては、ACS-8、LPAATおよびDAGATの三重発現カセットを、陽性選択用の左および右の境界配列の間のMASプロモーター/ターミネーターによって作動される、宿主植物にカナマイシン耐性を付与するnptII遺伝子を含む植物バイナリーベクター中にてflax lininプロモーター/ターミネーター(米国特許第6,777,591号)の制御下で発現させた。
すべての植物バイナリーベクターの完全性が、診断用制限消化おおよび配列解析によって確かめられた。続いて、単離されたプラスミドを用いて、エレクトロポレーション(25μF、2.5kV、200Ω)によるコンビテントアグロバクテリウム株EH101(Hood et al., 1986, J. Bacteriol. 144:732-743)の形質転換を行った。組換えアグロバクテリウムをAB-スペクチノマイシン/カナマイシン(20x AB塩、2Mグルコース、0.25mg/ml FeSo4 7H2O、1M MgSo4、1M CaCl2)上にプレーティングし、単一のコロニーを5mlのAB-スペクチノマイシン/カナマイシンブロスへの接種に用いた。これらの培養物を28℃で一晩増殖させた。続いて、4127プラスミドを含む組換えアグロバクテリウムを用いて、花浸漬法(clough et al., 1998, Plant J. 16: 735-743)による野生型C24シロイヌナズナ植物の形質転換を行った。これらの植物から得られた種子をホスフィノトリシンの存在下で選択培地上にプレーティングして出芽させた。陽性と同定された実生を土壌に移して成熟に至らせ、その後に種子をPUFA含量に関して分析した。
本実施例は、シゾキトリウム属PUFAシンターゼ(OrfA、OrfB*およびOrfC)をHetIとともに超構築物(4127)上で発現するトランスジェニックシロイヌナズナ種子におけるDHAおよびDPAn-6の産生を説明する。
本実施例は、シゾキトリウム属PUFAシンターゼ(OrfA、OrfB*およびOrf C)をHetIとともに(4127)、シゾキトリウム属ScACS-1遺伝子(5723)またはScACS-2遺伝子(5724)と組み合わせて発現するトランスジェニックシロイヌナズナ種子におけるDHAn-3およびDPAn-6の産生を説明する。
本実施例は、シゾキトリウム属PUFAシンターゼ(OrfA、OrfB*およびOrfC)をHetIとともに発現する、RNA干渉(RNAi)を用いたKAS IIの減弱化を通じてのFASの阻害と組み合わせたトランスジェニックシロイヌナズナ種子におけるDHAおよびDPAn-6の産生を説明する。
本実施例は、シゾキトリウム属PUFAシンターゼ(OrfA、OrfB*およびOrfC)をHetIとともに発現する、アンチセンスRNAを用いたKAS IIIの減弱化を通じてのFASの阻害と組み合わせたトランスジェニックシロイヌナズナ種子におけるDHAおよびDPAn-6の産生を説明する。
本実施例は、シゾキトリウム属PUFAシンターゼ(OrfA、OrfB*およびOrfC)をHetIとともに発現する、ScACS-1遺伝子の発現およびアンチセンスRNAを用いたKAS IIIの減弱化を通じてのFASの阻害と組み合わせたトランスジェニックシロイヌナズナ種子におけるDHAおよびDPAn-6の産生を説明する。
本実施例は、シゾキトリウム属PUFAシンターゼ(OrfA、OrfB*およびOrfC)をHetIとともに発現する、シゾキトリウム属LPAATの発現と組み合わせたトランスジェニックシロイヌナズナ種子におけるDHAおよびDPAn-6の産生を説明する。
本実施例は、シゾキトリウム属PUFAシンターゼ(OrfA、OrfB*およびOrfC)をHetIとともに発現する、シゾキトリウム属DAGATおよびACS-1の発現、ならびにRNAiを用いたKAS II減弱化またはアンチセンスを用いたKAS IIIの減弱化を通じてのFASの阻害と組み合わせたトランスジェニックシロイヌナズナ種子におけるDHAおよびDPAn-6の産生を説明する。
本実施例は、シゾキトリウム属PUFAシンターゼ(OrfA、OrfB*およびOrfC)をHetIとともに発現する、シゾキトリウム属DAGATおよびACS-8の発現と組み合わせ、さらにシゾキトリウム属ACS-1の発現、およびRNAiを用いたKAS II減弱化またはアンチセンスを用いたKAS IIIの減弱化を通じてのFASの阻害と組み合わせたトランスジェニックシロイヌナズナ種子におけるDHAおよびDPAn-6の産生を説明する。
本実施例は、シゾキトリウム属PUFAシンターゼ(OrfA、OrfB*およびOrfC)をHetIとともに発現する、シゾキトリウム属LPAATおよびシゾキトリウム属DAGATの発現と組み合わせ、さらにシゾキトリウム属ACS-1の発現、およびRNAiを用いたKAS II減弱化またはアンチセンスを用いたKAS IIIの減弱化を通じてのFASの阻害と組み合わせたトランスジェニックシロイヌナズナ種子におけるDHAおよびDPAn-6の産生を説明する。
本実施例は、シゾキトリウム属PUFAシンターゼ(OrfA、OrfB*およびOrfC)をHetIとともに発現する、シゾキトリウム属LPAATおよびシゾキトリウム属DAGAT、およびシゾキトリウム属ACS-8の発現と組み合わせ、さらにシゾキトリウム属ACS-1の発現、およびRNAiを用いたKAS II減弱化またはアンチセンスを用いたKAS IIIの減弱化を通じてのFASの阻害と組み合わせたトランスジェニックシロイヌナズナ種子におけるDHAおよびDPAn-6の産生を説明する。
Claims (96)
- 長鎖PUFA遊離脂肪酸(FFA)のアシル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子であって、核酸配列が以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するACoASと少なくとも60%同一なアシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)をコードする、核酸分子:SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97およびSEQ ID NO:99。
- 核酸配列が、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)をコードする、請求項1記載の単離された核酸分子:SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97およびSEQ ID NO:99。
- 核酸配列が、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする、請求項1記載の単離された核酸分子:SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85およびSEQ ID NO:97。
- 核酸配列が、以下からなる群より選択される、請求項1記載の単離された核酸分子:SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96およびSEQ ID NO:98。
- リン脂質(PL)またはトリアシルグリセロール(TAG)の生成においてPUFA-CoAを基質として利用するタンパク質をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子であって、タンパク質が以下からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%同一なアミノ酸配列を含む、核酸分子:SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:110およびSEQ ID NO:113。
- 核酸配列が、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項5記載の単離された核酸分子:SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:110およびSEQ ID NO:113。
- 核酸配列が、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項5記載の単離された核酸分子:SEQ ID NO:102およびSEQ ID NO:104。
- 核酸配列が、以下からなる群より選択される、請求項5記載の単離された核酸分子:SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111およびSEQ ID NO:112。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載の核酸分子によってコードされる、単離されたタンパク質。
- 発現制御配列と機能的に連結された、請求項1〜8のいずれか一項記載の核酸分子を含む組換え核酸分子。
- 請求項10記載の組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞。
- 微生物である、請求項11記載の組換え宿主細胞。
- 植物細胞である、請求項11記載の組換え宿主細胞。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載の単離された核酸分子を発現するように遺伝的に改変されている、遺伝的に改変された生物。
- 請求項1〜4のいずれか一項記載の少なくとも1つの単離された核酸分子を発現するように遺伝的に改変されている、遺伝的に改変された生物。
- 請求項5〜8のいずれか一項記載の少なくとも1つの単離された核酸分子を発現するように遺伝的に改変されている、遺伝的に改変された生物。
- 請求項1〜4のいずれか一項記載の少なくとも1つの単離された核酸分子および請求項5〜8のいずれか一項記載の少なくとも1つの単離された核酸分子を発現するように遺伝的に改変されている、遺伝的に改変された生物。
- 請求項3記載の少なくとも1つの単離された核酸分子および請求項7記載の少なくとも1つの単離された核酸分子を発現するように遺伝的に改変されている、遺伝的に改変された生物。
- PUFAシンターゼおよびホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)を発現する、請求項14〜18のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- 前記シンターゼおよびPPTアーゼを発現するように遺伝的に改変されている、請求項19記載の遺伝的に改変された生物。
- 少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を生成するPUFAシンターゼおよびホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)を発現し、かつ、長鎖PUFA遊離脂肪酸(FFA)のアシル-CoAへの変換を触媒する1つまたは複数の異種アシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)またはその相同体を発現するための遺伝的改変を含む、遺伝的に改変された生物。
- PUFAシンターゼを内因的に発現する生物由来のアシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)またはその相同体をコードする核酸配列を含む核酸分子によって形質転換されている、請求項21記載の遺伝的に改変された生物。
- 長鎖PUFA遊離脂肪酸(FFA)のアシル-CoAへの変換を触媒する、クリプテコディニウム-コーニイ(Crypthecodinium cohnii)由来のアシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)またはその相同体をコードする核酸配列を含む核酸分子によって形質転換されている、請求項21記載の遺伝的に改変された生物。
- 長鎖PUFA遊離脂肪酸(FFA)のアシル-CoAへの変換を触媒する、ヤブレツボカビ目(Thraustochytriales)の微生物由来のアシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)またはその相同体をコードする核酸配列を含む核酸分子によって形質転換されている、請求項21記載の遺伝的に改変された生物。
- 長鎖PUFA遊離脂肪酸(FFA)のアシル-CoAへの変換を触媒する、シゾキトリウム属(Schizochytrium)由来のアシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)またはその相同体をコードする核酸配列を含む核酸分子によって形質転換されている、請求項21記載の遺伝的に改変された生物。
- 請求項1〜4のいずれか一項記載の核酸分子によって形質転換されている、請求項21記載の遺伝的に改変された生物。
- 生物によって発現される脂肪酸シンターゼ(FAS)を欠失または不活性化させるためのさらなる遺伝的改変を含む、請求項21〜26のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- 生物における、マロニルCoAをめぐるPUFAシンターゼとの競合を減少させるため、またはマロニルCoAのレベルを上昇させるためのさらなる遺伝的改変を含む、請求項21〜27のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- PUFAを内因的に産生する生物由来の1つまたは複数の異種タンパク質を発現するためのさらなる遺伝的改変を含み、該タンパク質がリン脂質(PL)またはトリアシルグリセロール(TAG)の生成においてPUFA-CoAを基質として利用する、請求項21〜28のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- 少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を生成するPUFAシンターゼおよびホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)を発現し、かつ、生物によって発現される脂肪酸シンターゼ(FAS)を欠失または不活性化させるための遺伝的改変を含む、遺伝的に改変された生物。
- 生物における、マロニルCoAをめぐるPUFAシンターゼとの競合を減少させるため、またはマロニルCoAのレベルを上昇させるためのさらなる遺伝的改変を含む、請求項30記載の遺伝的に改変された生物。
- 少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を生成するPUFAシンターゼおよびホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)を発現し、かつ、生物における、マロニルCoAをめぐるPUFAシンターゼとの競合を減少させるため、またはマロニルCoAのレベルを上昇させるための遺伝的改変を含む、遺伝的に改変された生物。
- 生物によって発現される脂肪酸シンターゼ(FAS)を欠失または不活性化させるためのさらなる遺伝的改変を含む、請求項32記載の遺伝的に改変された生物。
- 少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を生成するPUFAシンターゼおよびホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)を発現し、かつ、PUFAを内因的に産生する生物由来の1つまたは複数の異種タンパク質を発現するための遺伝的改変を含む、遺伝的に改変された生物であって、該タンパク質がリン脂質(PL)またはトリアシルグリセロール(TAG)の生成においてPUFA-CoAを基質として利用する、遺伝的に改変された生物。
- 前記タンパク質がDAGATまたはLPAATである、請求項34記載の遺伝的に改変された生物。
- リン脂質(PL)またはトリアシルグリセロール(TAG)の生成においてPUFA-CoAを基質として利用するヤブレツボカビ科(Thraustochytrid)またはラビリンチュラ科(Labyrinthulid)由来のタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子によって形質転換されている、請求項34記載の遺伝的に改変された生物。
- リン脂質(PL)またはトリアシルグリセロール(TAG)の生成においてPUFA-CoAを基質として利用するシゾキトリウム属由来のタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子によって形質転換されている、請求項34記載の遺伝的に改変された生物。
- 請求項5〜8のいずれか一項記載の核酸分子によって形質転換されている、請求項34記載の遺伝的に改変された生物。
- 長鎖PUFA遊離脂肪酸(FFA)のアシル-CoAへの変換を触媒する1つまたは複数の異種アシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)またはその相同体を発現するためのさらなる改変を含む、請求項34〜39のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- 生物によって発現される脂肪酸シンターゼ(FAS)を欠失または不活性化させるためのさらなる遺伝的改変を含む、請求項34〜40のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- 生物における、マロニルCoAをめぐるPUFAシンターゼとの競合を減少させるため、またはマロニルCoAのレベルを上昇させるためのさらなる遺伝的改変を含む、請求項34〜41のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- PUFAシンターゼが、ヤブレツボカビ科またはラビリンチュラ科由来のPUFAシンターゼからの少なくとも1つの機能性ドメインを含む、請求項21〜42のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- PUFAシンターゼが、ヤブレツボカビ目の微生物由来のPUFAシンターゼからの少なくとも1つの機能性ドメインを含む、請求項21〜42のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- PUFAシンターゼが、以下からなる群より選択される生物由来のPUFAシンターゼからの少なくとも1つの機能性ドメインを含む、請求項21〜42のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物:シゾキトリウム属、ヤブレツボカビ属(Thraustochytrium)、ウルケニア属(Ulkenia)およびラビリンチュラ属(Labyrinthula)。
- PUFAシンターゼが、シゾキトリウム属由来のPUFAシンターゼからの少なくとも1つの機能性ドメインを含む、請求項21〜42のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- PUFAシンターゼが、シゾキトリウム属American Type Culture Collection(ATCC)番号20888、ヤブレツボカビ属23B ATCC番号20892および該微生物のいずれかの突然変異株からなる群より選択される生物由来のPUFAシンターゼからの少なくとも1つの機能性ドメインを含む、請求項21〜42のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- PUFAシンターゼが、海洋細菌由来のPUFAシンターゼからの少なくとも1つの機能性ドメインを含む、請求項21〜42のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- PUFAシンターゼが、シュワネラ属(Shewanella)、モリテラ属(Moritella)およびフォトバクテリウム属(Photobacterium)からなる群より選択される生物由来のPUFAシンターゼからの少なくとも1つの機能性ドメインを含む、請求項21〜42のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- PUFAシンターゼが、以下を含む1つまたは複数のタンパク質からなる、請求項21〜42のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物:
a)少なくとも1つのエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン;
b)少なくとも4つのアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメイン;
c)少なくとも2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;
d)少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン;
e)少なくとも1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)ドメイン;
f)少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン;および
g)少なくとも1つの鎖長因子(CLF)ドメイン;
h)少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン。 - PUFAシンターゼが、以下を含む1つまたは複数のタンパク質からなる、請求項21〜42のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物:
a)2つのエノイルACP-レダクターゼ(ER)ドメイン;
b)8つまたは9つのアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメイン;
c)2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;
d)1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン;
e)1つのケトレダクターゼ(KR)ドメイン;
f)2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン;
g)1つの鎖長因子(CLF)ドメイン;および
h)1つのマロニルCoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン。 - PUFAシンターゼが少なくとも約25℃の温度でPUFAを生成する細菌PUFAシンターゼであり、PUFAシンターゼが、以下を含む1つまたは複数のタンパク質からなる、請求項21〜42のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物:
a)少なくとも1つのエノイルACP-レダクターゼ(ER)ドメイン;
b)少なくとも6つのアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメイン;
c)少なくとも2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;
d)少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン;
e)少なくとも1つのケトレダクターゼ(KR)ドメイン;
f)少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン;
g)少なくとも1つの鎖長因子(CLF)ドメイン;
h)少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン;および
i)少なくとも1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)ドメイン。 - PUFAシンターゼが、以下からなる群より選択される1つまたは複数の配列を含む、または以下からなる群より選択される1つまたは複数の配列によりコードされる、請求項21〜42のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物:SEQ ID NO:1〜32のいずれか1つ、およびSEQ ID NO:35〜80のいずれか1つ。
- PUFAシンターゼをコードする1つまたは複数の核酸配列が、生物におけるPUFAシンターゼの発現を改善するために最適化されている、請求項21〜52のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- 以下からなる群より選択される少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を産生する、請求項21〜53のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物:EPA(C20:5、n-3)、DHA(C22:6、n-3)、DPA(C22:5、n-6またはn-3)、ARA(C20:4、n-6)、GLA(C18:3、n-6)および/またはSDA(C18:4、n-3))。
- 以下からなる群より選択される少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を産生する、請求項21〜53のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物:DHA、EPAおよびDPAn-6。
- DHAおよびDPAn-6を産生する、請求項21〜53のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- ARAを産生する、請求項21〜53のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- 生物における総脂肪酸プロフィールが、PUFAシンターゼによって生成される少なくとも1つのPUFAを、少なくとも0.5重量%含む、請求項21〜53のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- 微生物である、請求項21〜58のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- 微生物がPUFA PKS系を内因的に発現する、請求項59記載の遺伝的に改変された生物。
- 微生物がヤブレツボカビ目の微生物および海洋細菌からなる群より選択される、請求項59記載の遺伝的に改変された生物。
- 微生物がPUFA PKS系を発現するように遺伝的に改変されている、請求項59記載の遺伝的に改変された生物。
- 微生物が酵母または細菌である、請求項59記載の遺伝的に改変された生物。
- 植物または植物細胞である、請求項21〜53のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物。
- PUFAシンターゼおよびPPTアーゼの発現が、植物または植物細胞のプラスチドに対してターゲティングされている、請求項64記載の遺伝的に改変された生物。
- 植物が油糧種子植物である、請求項64記載の遺伝的に改変された生物。
- 植物が双子葉植物である、請求項64記載の遺伝的に改変された生物。
- 植物が以下からなる群より選択される、請求項64記載の遺伝的に改変された生物:キャノーラ、ダイズ、ナタネ、アマニ、トウモロコシ、ベニバナ、ヒマワリおよびタバコ。
- 前記少なくとも1つのPUFA以外の、PUFAシンターゼによって生成される総脂肪酸が、植物または植物細胞によって産生される総脂肪酸の約10重量%未満を構成する、請求項64記載の遺伝的に改変された生物。
- 前記少なくとも1つのPUFA以外の、PUFAシンターゼによって生成される総脂肪酸が、植物または植物細胞によって産生される総脂肪酸の約5重量%未満を構成する、請求項64記載の遺伝的に改変された生物。
- 植物、植物の部分または植物細胞における総脂肪酸プロフィールが、少なくとも20個の炭素および4つまたはそれ以上の炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を少なくとも約0.5重量%含み、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、以下のすべてのPUFAを合計で5%未満含む、請求項64記載の遺伝的に改変された生物:γ-リノレン酸(GLA;18:3、n-6)、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA。
- 植物、植物の部分または植物細胞における総脂肪酸プロフィールが、少なくとも20個の炭素および4つまたはそれ以上の炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を少なくとも約0.5重量%含み、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、以下のPUFAをそれぞれ1%未満含む、請求項64記載の遺伝的に改変された生物:γ-リノレン酸(GLA;18:3、n-6)、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA。
- 植物、植物の部分または植物細胞における総脂肪酸プロフィールが、少なくとも20個の炭素および4つまたはそれ以上の炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を少なくとも約0.5重量%含み、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、γ-リノレン酸(GLA;18:3、n-6)およびジホモ-γ-リノレン酸(DGLAまたはHGLA;20:3、n-6)を2%未満含む、請求項64記載の遺伝的に改変された生物。
- 植物、植物の部分または植物細胞における総脂肪酸プロフィールが、γ-リノレン酸(GLA;18:3、n-6)およびジホモ-γ-リノレン酸(DGLAまたはHGLA;20:3、n-6)を1重量%未満含む、請求項73記載の遺伝的に改変された生物。
- 植物、植物の部分または植物細胞における総脂肪酸プロフィールが、少なくとも20個の炭素および4つまたはそれ以上の炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を少なくとも約0.5重量%含み、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、γ-リノレン酸(GLA;18:3、n-6)を1%未満含む、請求項64記載の遺伝的に改変された生物。
- 植物、植物の部分または植物細胞における総脂肪酸プロフィールが、γ-リノレン酸(GLA;18:3、n-6)を0.5重量%未満含む、請求項64記載の遺伝的に改変された生物。
- 請求項21〜76のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物から得られた油。
- 請求項21〜76のいずれか一項記載の生物を成育させる段階を含む、少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を含む油を生産するための方法。
- 請求項78記載の方法によって生産された油。
- 検出可能な量のDHA(ドコサヘキサエン酸(C22:6、n-3))およびDPA(ドコサペンタエン酸(C22:5、n-6)を含む植物油であって、DPAn-6のDHAに対する比が1:1であるか1:1を上回る、請求項64〜76のいずれか一項記載の植物または植物細胞から得られた、植物油。
- 請求項64〜76のいずれか一項記載の植物から得られた種子。
- 以下からなる群より選択される少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を含む、請求項77、79または80のいずれか一項記載の油:EPA(C20:5、n-3)、DHA(C22:6、n-3)、DPA(C22:5、n-6またはn-3)、ARA(C20:4、n-6)、GLA(C18:3、n-6)および/またはSDA(C18:4、n-3))。
- 以下からなる群より選択される少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を含む、請求項77、79または80のいずれか一項記載の油:EPA(C20:5、n-3)、DHA(C22:6、n-3)、DPA(C22:5、n-6またはn-3)またはDTA(C22:4、n-6)。
- 以下からなる群より選択される少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を含む、請求項77、79または80のいずれか一項記載の油:EPA(C20:5、n-3)、DHA(C22:6、n-3)および/またはDPA(C22:5、n-6またはn-3)。
- 請求項77、79もしくは80のいずれか一項記載の油、または請求項81記載の種子を含む、食品。
- 請求項77、79または80のいずれか一項記載の油を含む医薬生成物。
- 請求項81記載の種子から油を回収する段階を含む、少なくとも1つのPUFAを含む油を生産するための方法。
- 請求項21〜76のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物から油を回収する段階を含む、少なくとも1つのPUFAを含む油を生産するための方法。
- 請求項21〜76のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物を成育させる段階を含む、少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を生産するための方法。
- 請求項21〜76のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物からPUFAを入手または回収する段階を含む、少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を生産するための方法。
- 少なくとも1つのPUFAを含む栄養補助食品または治療用生成物を個体に対して提供するための方法であって、個体に対して、請求項21〜76のいずれか一項記載の遺伝的に改変された生物もしくはその部分、請求項81記載の種子、請求項77、79もしくは80記載の油、請求項85記載の食品、または請求項86記載の医薬生成物を提供する段階を含む方法。
- PUFAを発現させるために生物を形質転換するための方法であって、PUFAシンターゼをコードする核酸分子、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)をコードする核酸分子、および請求項1〜8のいずれか一項記載の少なくとも1つの核酸分子によって生物を形質転換する段階を含む方法。
- 生物が、該生物によって発現される脂肪酸シンターゼ(FAS)を欠失または不活性化させるための遺伝的改変を含む、請求項92記載の方法。
- 生物が、該生物における、マロニルCoAをめぐるPUFAシンターゼとの競合を減少させるため、またはマロニルCoAのレベルを上昇させるための遺伝的改変を含む、請求項92記載の方法。
- 生物が植物である、請求項92記載の方法。
- 生物が微生物である、請求項92記載の方法。
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