JP2019205440A - 脂肪アミンの微生物生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年12月5日に提出された米国仮出願第61/912,184号の恩典を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本開示は、脂肪アミンおよびその誘導体の生産のための組換え微生物に関する。インビボで脂肪アルデヒドを脂肪アミンに変換する生合成タンパク質を発現する組換え宿主細胞も、さらに企図している。さらに、これらの生合成タンパク質を発現する宿主細胞を使用することによって脂肪アミンを生産する方法も範囲に含まれる。
脂肪アミンは、脂肪酸、オレフィン、またはアルコールの窒素誘導体である。それらは天然の脂肪および油から、または合成原材料もしくは石油化学原材料から作られる。今日、これらの化合物は主として、獣脂または植物油(例えば、ココナッツ油、カノーラ油およびナタネ油)などのトリグリセリドの化学修飾を通じて生産されている。
本開示の1つの局面は、脂肪アルデヒドを脂肪アミンに変換するための遺伝子操作された代謝経路を含む、脂肪アミンの生産のための組換え微生物を提供する。本明細書において、組換え微生物は、アミノトランスフェラーゼ活性またはアミンデヒドロゲナーゼ活性を有する外因性生合成酵素を含む、脂肪アルデヒドを脂肪アミンに変換するための遺伝子操作された代謝経路を有する。1つの態様において、外因性生合成酵素は、YgjGなどのプトレシンアミノトランスフェラーゼである。もう1つの態様において、外因性生合成酵素は、PuuEなどのGABAアミノトランスフェラーゼである。YgjGは、組換え微生物または組換え微生物細胞において発現されるygjG遺伝子をコードする核酸配列によってコードされる。同様に、PuuEは、組換え微生物または組換え微生物細胞において発現されるpuuE遺伝子をコードする核酸配列によってコードされる。もう1つの態様において、外因性生合成酵素は、パラコッカス・デニトリフィカンス(Paracoccus denitrificans)由来のメチルアミン(amethylamine)デヒドロゲナーゼなどのアミンデヒドロゲナーゼである。これらの組換え微生物または組換え微生物細胞は、インビボまたは細胞内で脂肪アミンを産生する。脂肪アミンは組換え微生物または組換え微生物細胞によって培養培地中に放出される。1つの態様において、組換え微生物または微生物細胞は組換え細菌細胞である。
[本発明1001]
脂肪アルデヒドを脂肪アミンに変換するための遺伝子操作された代謝経路を含む、脂肪アミンの生産のための組換え微生物であって、該代謝経路が、アミノトランスフェラーゼ活性またはアミンデヒドロゲナーゼ活性を有する外因性生合成酵素を含む、インビボで脂肪アミンを産生する該微生物。
[本発明1002]
脂肪アミンが前記微生物によって培養培地中に放出される、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1003]
外因性生合成酵素がプトレシンアミノトランスフェラーゼまたはGABAアミノトランスフェラーゼである、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1004]
プトレシンアミノトランスフェラーゼがYgjGである、本発明1003の組換え微生物。
[本発明1005]
YgjGが、前記微生物において発現されるygjG遺伝子をコードする核酸配列によってコードされる、本発明1004の組換え微生物。
[本発明1006]
GABAアミノトランスフェラーゼがPuuEである、本発明1003の組換え微生物。
[本発明1007]
PuuEが、前記微生物において発現されるpuuE遺伝子をコードする核酸配列によってコードされる、本発明1006の組換え微生物。
[本発明1008]
外因性生合成酵素がアミンデヒドロゲナーゼである、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1009]
アミンデヒドロゲナーゼが、パラコッカス・デニトリフィカンス(Paracoccus denitrificans)のメチルアミンデヒドロゲナーゼである、本発明1008の組換え微生物。
[本発明1010]
アシル-ACPまたはアシル-CoAを脂肪酸に変換するためのもう1つの遺伝子操作された代謝経路をさらに含む、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1011]
アシル-ACPまたはアシル-CoAが、チオエステラーゼ活性を有する生合成酵素によって脂肪酸に変換される、本発明1010の組換え微生物。
[本発明1012]
チオエステラーゼ活性を有する生合成酵素が、前記微生物において発現されるtesA遺伝子をコードする核酸配列によってコードされる、本発明1011の組換え微生物。
[本発明1013]
脂肪酸を脂肪アルデヒドに変換するためのもう1つの遺伝子操作された代謝経路をさらに含む、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1014]
脂肪酸が、カルボン酸レダクターゼ(CAR)活性を有する生合成酵素によって脂肪アルデヒドに変換される、本発明1013の組換え微生物。
[本発明1015]
CAR活性を有する生合成酵素が、前記微生物において発現されるcarB遺伝子をコードする核酸配列によってコードされる、本発明1014の組換え微生物。
[本発明1016]
組換え微生物細胞である、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1017]
組換え細菌細胞である、本発明1016の組換え微生物細胞。
[本発明1018]
エシェリキア(Escherichia)、バチルス(Bacillus)、藍藻植物(Cyanophyta)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、ザイモモナス(Zymomonas)、ロドコッカス(Rhodococcus)、シュードモナス(Pseudomonas)、アスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、ニューロスポラ(Neurospora)、フザリウム(Fusarium)、ヒューミコーラ(Humicola)、リゾムコール(Rhizomucor)、クリベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、ムコール(Mucor)、ミセリオフトラ(Myceliophtora)、ペニシリウム(Penicillium)、ファネロカエテ(Phanerochaete)、プレウロタス(Pleurotus)、トラメテス(Trametes)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、サッカロミセス(Saccharomyces)、ステノトロホモナス(Stenotrophamonas)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウイア(Yarrowia)、およびストレプトミセス(Streptomyces)からなる群より選択される、本発明1016の組換え微生物細胞。
[本発明1019]
エシェリキアが大腸菌(Escherichia coli)である、本発明1018の組換え微生物細胞。
[本発明1020]
藍藻植物が、プロクロロコッカス(Prochlorococcus)、シネココッカス(Synechococcus)、シネコシスティス(Synechocystis)、シアノセイス(Cyanothece)、およびノストック・パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)からなる群より選択される、本発明1018の組換え微生物細胞。
[本発明1021]
藍藻植物が、シネココッカス・エロンガタス(Synechococcus elongatus)PCC7942、シネコシスティス種PCC6803、およびシネココッカス種PCC7001からなる群より選択される、本発明1018の組換え微生物細胞。
[本発明1022]
本発明1001の組換え微生物を、炭素源を含有する発酵ブロス中で培養する段階を含む、脂肪アミンを生産する方法。
[本発明1023]
(i)チオエステラーゼ活性を有する外因性生合成酵素をコードする1つまたは複数の発現された遺伝子;
(ii)カルボン酸レダクターゼ活性を有する外因性生合成酵素をコードする1つまたは複数の発現された遺伝子;および
(iii)アミノトランスフェラーゼ活性またはアミンデヒドロゲナーゼ活性を有する外因性生合成酵素をコードする1つまたは複数の発現された遺伝子
を含む、脂肪アミンの生産のための組換え細菌細胞であって、インビボで脂肪アミンを産生する組換え細菌細胞。
[本発明1024]
脂肪アミンが前記細菌細胞によって培養培地中に放出される、本発明1023の組換え細菌細胞。
[本発明1025]
チオエステラーゼ活性を有する外因性生合成酵素がアシル-ACPまたはアシル-CoAを脂肪酸に変換する、本発明1023の組換え細菌細胞。
[本発明1026]
カルボン酸レダクターゼ活性を有する外因性生合成酵素が脂肪酸を脂肪アルデヒドに変換する、本発明1025の組換え細菌細胞。
[本発明1027]
アミノトランスフェラーゼ活性またはアミンデヒドロゲナーゼ活性を有する外因性生合成酵素が脂肪アルデヒドを脂肪アミンに変換する、本発明1026の組換え細菌細胞。
[本発明1028]
チオエステラーゼ活性を有する外因性生合成酵素が、tesA遺伝子をコードする核酸配列によってコードされる、本発明1023の組換え細菌細胞。
[本発明1029]
カルボン酸レダクターゼ活性を有する外因性生合成酵素が、carB遺伝子をコードする核酸配列によってコードされる、本発明1023の組換え細菌細胞。
[本発明1030]
アミノトランスフェラーゼ活性を有する外因性生合成酵素がプトレシンアミノトランスフェラーゼまたはGABAアミノトランスフェラーゼである、本発明1023の組換え細菌細胞。
[本発明1031]
プトレシンアミノトランスフェラーゼがYgjGである、本発明1030の組換え細菌細胞。
[本発明1032]
YgjGが、ygjG遺伝子をコードする核酸配列によってコードされる、本発明1031の組換え細菌細胞。
[本発明1033]
GABAアミノトランスフェラーゼがPuuEである、本発明1030の組換え細菌細胞。
[本発明1034]
PuuEが、puuE遺伝子をコードする核酸配列によってコードされる、本発明1033の組換え細菌細胞。
[本発明1035]
アミンデヒドロゲナーゼ活性を有する外因性生合成酵素がメチルアミンデヒドロゲナーゼである、本発明1023の組換え細菌細胞。
[本発明1036]
メチルアミンデヒドロゲナーゼがパラコッカス・デニトリフィカンスに由来する、本発明1035の組換え細菌細胞。
[本発明1037]
エシェリキア、バチルス、藍藻植物、ラクトバチルス、ザイモモナス、ロドコッカス、シュードモナス、アスペルギルス、トリコデルマ、ニューロスポラ、フザリウム、ヒューミコーラ、リゾムコール、クリベロミセス、ピキア、ムコール、ミセリオフトラ、ペニシリウム、ファネロカエテ、プレウロタス、トラメテス、クリソスポリウム、サッカロミセス、ステノトロホモナス、シゾサッカロミセス、ヤロウイア、およびストレプトミセスからなる群より選択される、本発明1023の組換え細菌細胞。
[本発明1038]
エシェリキアが大腸菌である、本発明1037の組換え細菌細胞。
[本発明1039]
藍藻植物が、プロクロロコッカス、シネココッカス、シネコシスティス、シアノセイス、およびノストック・パンクチフォルメからなる群より選択される、本発明1037の組換え細菌細胞。
[本発明1040]
藍藻植物が、シネココッカス・エロンガタスPCC7942、シネコシスティス種PCC6803、およびシネココッカス種PCC7001からなる群より選択される、本発明1037の組換え細菌細胞。
[本発明1041]
本発明1023の細菌細胞を含む、細胞培養物。
[本発明1042]
本発明1023の細菌細胞を、炭素源を含有する発酵ブロス中で培養する段階を含む、脂肪アミンを生産する方法。
[本発明1043]
(i)本発明1023の細胞を、発酵ブロス中で炭素源の存在下で培養する段階;および
(ii)発酵ブロス中に収集された脂肪アミンを採取する段階
を含む、細菌細胞において脂肪アミンを生産する方法。
全体的概観
本開示は、新たなクラスの再生可能な化学製品である脂肪アミンの微生物生産に関する。脂肪アミンは、脂肪アルデヒドを脂肪アミンに変換するための遺伝子操作された代謝経路を発現する微生物を通じて生産される。そのため、微生物は、脂肪アミンをインビボで産生するために、少なくとも1つの外因性生合成酵素を発現する。外因性生合成酵素は、アミノトランスフェラーゼ活性もしくはアミンデヒドロゲナーゼ活性;またはカルボン酸レダクターゼ(CAR)活性;またはチオエステラーゼ活性、またはそれらの組み合わせを有してよい。代替的な形態の酵素活性も本明細書において企図している。
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈によって明らかに別様に規定されている場合を除き、複数形の指示物も含む。したがって、例えば、「1つの宿主細胞」への言及は2つまたはそれを上回るそのような宿主細胞を含み、「1つの脂肪アミン」への言及は1つもしくは複数の脂肪アミン、またはアミンの混合物への言及を含み、「1つの核酸配列」への言及は1つまたは複数の核酸配列を含み、「1つの酵素」への言及は1つまたは複数の酵素を含み、他についても同様である。
本開示は、脂肪アミンの微生物生産に関する。本明細書に示されているように、脂肪アミンを生産するために、さまざまな生合成酵素を発現するように微生物をインビボで遺伝的に操作することができる。より具体的には、脂肪アルデヒドを脂肪アミンに変換する代謝経路を発現するように、微生物を遺伝的に操作することができる。経路は、アミノトランスフェラーゼ(例えば、大腸菌由来のプトレシンアミノトランスフェラーゼ(YgjG)もしくはGABAアミノトランスフェラーゼ(PuuE))活性、またはアミンデヒドロゲナーゼ(例えば、パラコッカス・デニトリフィカンスのメチルアミンデヒドロゲナーゼ、もしくはシュードモナス種のキノヘモプロテインアミンデヒドロゲナーゼ)活性、または脂肪アルデヒドを脂肪アミンに変換するアミンオキシダーゼ活性を有する少なくとも1つの生合成酵素を発現する。トランスアミナーゼはアミノトランスフェラーゼと同じ反応を遂行させ、これらの名称は互換的に用いられることがある。例えば、GABAアミノトランスフェラーゼは4-アミノ酪酸トランスアミナーゼとも称される。1つの態様において、アミノトランスフェラーゼまたはトランスアミナーゼまたはアミンデヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼは、外因性生合成酵素であるか、または細胞内で外因性に発現される。または、脂肪アルデヒドを脂肪アミンに変換するアミノトランスフェラーゼ活性またはアミンデヒドロゲナーゼ活性またはアミンオキシダーゼ活性を有する生合成酵素を発現する脂肪アミン生成のための遺伝子操作された経路と、脂肪アルデヒドを生成する外因性生合成酵素を発現する脂肪アルデヒド生産のための遺伝子操作された経路とを組み合わせることによって、脂肪アミンを生産することもできる。そのような脂肪アルデヒド前駆体は、種々の過程および遺伝子操作された経路、例えば、脂肪アルデヒド生産のために利用される遺伝子操作されたカルボン酸レダクターゼ(CAR)経路(参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,097,439号を参照されたい)または脂肪アルコール生産のために利用される遺伝子操作されたCARおよびチオエステラーゼ(TE)経路(米国特許第8,097,439号、前記を参照されたい)または脂肪アミン生産のために利用される遺伝子操作されたホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)およびCAR経路(参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第20130035513号を参照されたい)または脂肪アルデヒド生産(参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,268,599号を参照されたい)のため、もしくはアルカン生産(参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,323,924号を参照されたい)のために利用される遺伝子操作されたアシル-ACPレダクターゼ(AAR)経路などを通じてインビボで生成させることができる。適したTEの一例は、'TesA(すなわち、細胞質中に保たれるように周辺質リーダー配列が除去されている大腸菌由来の短縮型チオエステラーゼ(それがアポストロフィの理由である))である;適したCARの一例はCarBである;適したAARの一例は、シネココッカス・エロンガタスPCC7942由来の酵素である(下記の表6を参照されたい)。
本開示の微生物は微生物宿主細胞として機能し、本開示の少なくとも1つの外因性生合成酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む1つまたは複数のポリヌクレオチド配列を包含する。1つの態様において、脂肪アミン組成物は、外因性生合成酵素(例えば、アミノトランスフェラーゼ/トランスアミナーゼまたはアミンデヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼ)を発現する宿主細胞を、炭素源の存在下で、脂肪アミンを発現させるのに有効な条件下で培養することによって産生される。もう1つの態様において、脂肪アミン組成物は、外因性生合成酵素の1つまたは複数(例えば、アミノトランスフェラーゼ/トランスアミナーゼまたはアミンデヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼと、1つまたは複数のアルデヒド生成酵素、例えばCAR(例えば、CarB)および/またはTE(例えば、TesA、'tesA)などとの組み合わせ)を発現する宿主細胞を、炭素源の存在下で、脂肪アミンを発現させるのに有効な条件下で培養することによって産生される。もう1つの態様において、脂肪アミン組成物は、外因性生合成酵素の1つまたは複数(例えば、アミノトランスフェラーゼ/トランスアミナーゼまたはアミンデヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼと、1つまたは複数のアルデヒド生成酵素、例えばアシル-ACPレダクターゼ(AAR)(例えば、シネココッカス・エロンガタスPCC7942由来との組み合わせ)を発現する宿主細胞を、炭素源の存在下で、脂肪アミンを発現させるのに有効な条件下で培養することによって産生される。もう1つの態様において、脂肪アミン組成物は、外因性生合成酵素の1つまたは複数(例えば、アミノトランスフェラーゼ/トランスアミナーゼまたはアミンデヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼと、1つまたは複数のアルデヒド生成酵素、例えばアシル-CoAレダクターゼ(例えば、Acrl)との組み合わせ)を発現する宿主細胞を、炭素源の存在下で、脂肪アミンを発現させるのに有効な条件下で培養することによって産生される。もう1つの態様において、脂肪アミン組成物は、外因性生合成酵素の1つまたは複数(例えば、アミノトランスフェラーゼ/トランスアミナーゼまたはアミンデヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼと、1つまたは複数のアルデヒド生成酵素、例えばホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)との組み合わせ)を発現する宿主細胞を、炭素源の存在下で、脂肪アミンを発現させるのに有効な条件下で培養することによって産生される。
当技術分野において周知のさまざまな方法を、脂肪アミンおよび/または脂肪アミン組成物もしくは配合物を産生するように宿主細胞を遺伝子操作するために用いることができる。本方法は、本明細書に述べるように、生合成酵素(例えば、アミノトランスフェラーゼもしくはアミンデヒドロゲナーゼ単独、またはアルデヒド生成酵素、例えばCARおよび/もしくはTEおよび/もしくはAARおよび/もしくはPPTアーゼなどとの組み合わせ)をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターの使用を含む。当業者は、種々のウイルス性ベクターおよび非ウイルス性ベクターを本明細書に記載の方法に用いうることを理解するであろう。
本明細書で用いる場合、「発酵」という用語は、組換え宿主細胞の培養物を炭素源を含む培地中で繁殖させることによる、宿主細胞による有機材料の標的物質への変換、例えば、組換え宿主細胞による炭素源の脂肪アミンまたはその誘導体への変換のことを広く指す。本明細書で用いる場合、「生産を許容する条件」とは、宿主細胞が所望の産物、例えば脂肪アミンまたは脂肪アミンの組成物または配合物などを産生することを可能にする、あらゆる条件のことを意味する。同様に、ベクターのポリヌクレオチド配列が発現される条件とは、宿主細胞がポリペプチドを合成することを可能にする、あらゆる条件のことを意味する。適した条件には、例えば、発酵条件が含まれる。発酵条件は、温度範囲、通気レベル、供給速度および培地組成を非限定的に含む多くのパラメーターを含みうる。これらの条件のそれぞれは、個々に、または組み合わされて、宿主細胞が増殖することを可能にする。発酵は、好気性、嫌気性、またはそれらの変形物(微好気性など)であってよい。例示的な培養培地にはブロスまたはゲルが含まれる。一般に、培地は、宿主細胞によって直接代謝されうる炭素源を含む。加えて、炭素源の動態化(例えば、デンプンまたはセルロースの発酵性糖への解重合)およびその後の代謝を助長するために、培地中に酵素を用いることもできる。
本開示の1つの態様において、アミノトランスフェラーゼ/トランスアミナーゼまたはアミンデヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼポリペプチドの活性は、1つまたは複数のアミノトランスフェラーゼ/トランスアミナーゼまたはアミンデヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼポリペプチド配列を(任意で1つまたは複数のアルデヒド生成性ポリペプチドと組み合わせて)包含する組換え宿主細胞を培養し、その後に、例えば、組換え宿主細胞によって産生された脂肪アミン組成物の特性;例えば、脂肪アミンならびにそれらの組成物および配合物の力価、収量および生産性を同定するためにスクリーニングを行うことによって判定される。もう1つの態様において、アミノトランスフェラーゼ/トランスアミナーゼまたはアミンデヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼポリペプチドの活性は、1つまたは複数のアミノトランスフェラーゼ/トランスアミナーゼまたはアミンデヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼポリヌクレオチド配列を包含する組換え宿主細胞を培養し、その後に、例えば、組換え宿主細胞によって産生された脂肪アミン組成物の特性;例えば:脂肪アミンならびにそれらの組成物および配合物の力価、収量および生産性を同定するためにスクリーニングを行うことによって同定される。アミノトランスフェラーゼ/トランスアミナーゼまたはアミンデヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼポリペプチドおよびそれらの断片を、当技術分野において公知の慣行的な方法を用いて、細胞におけるそれらの活性および/またはアミン由来化合物の産生の向上/増加に関してアッセイすることができる。例えば、アミノトランスフェラーゼ/トランスアミナーゼまたはアミンデヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼポリペプチドまたはそれらの断片を、ポリペプチドが機能してその酵素活性を遂行することを可能にする条件下で、インビボで基質(例えば、CARおよび/またはTEおよび/またはAARおよび/またはPPTアーゼを細胞内で共発現させることによって産生された脂肪アルデヒド)と接触させる。基質のレベルの低下、または脂肪アミンもしくは脂肪アミン組成物のレベルの上昇を測定することにより、アミノトランスフェラーゼ/トランスアミナーゼまたはアミンデヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼの活性を判定することができる。または、アミノトランスフェラーゼ/トランスアミナーゼまたはアミンデヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼポリペプチドまたはそれらの断片を発現する細胞に対して、やはりポリペプチドが機能してその酵素活性を遂行することを可能にする条件下で、脂肪アルデヒド基質を供給する。脂肪アミンまたは脂肪アミン組成物のレベルの上昇を測定することにより、アミノトランスフェラーゼ/トランスアミナーゼまたはアミンデヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼの活性を判定することができる。
本明細書で用いる場合、「現代炭素分率」すなわちfMとは、米国国立標準技術研究所(National Institute of Standards and Technology(NIST))標準物質(Standard Reference Material(SRM))4990Bおよび4990C、それぞれシュウ酸標準品HOxIおよびHOxIIとして知られるもの、によって定義されるものと同じ意味を有する。基本的定義はHOxIの14C/12C同位体比の0.95倍に相当する(西暦1950年を基準とする)。これは、減衰補正された産業革命前の木とおおむね等しい。現在の生体生物圏(植物材料)については、fMはおよそ1.1である。
δ13C(‰)=[(13C/12C)試料-(13C/12C)標準物質]/(13C/12C)標準物質×1000
脂肪アミンの構造は、1つまたは複数のC8〜C24脂肪族アルキル基(R=C8〜C24)および1つまたは複数のアミン(N)または第四級アンモニウムに基づく。脂肪族アルキル鎖は強疎水性であり、一方、アミンは親水性である。このため、脂肪アミンは分子として両親媒性を有する(疎水性実体と親水性実体の両方を含む)。水または他の溶媒中に溶解されると、脂肪アミンはミセルを形成するが、これは分子の一部が溶媒による反発を受けるためである。そのため、脂肪アミンは、物理的または化学的な結合のいずれかによって表面に強く付着し、それ故に表面特性を改変する、陽イオン界面活性化合物(すなわち、その親水性モイエティーを特徴とする界面活性剤)である。脂肪アミンの界面活性特性には、乳化、湿潤、発泡および増粘がある。加えて、脂肪アミンは、軟化、粘着、潤滑、腐食抑制、帯電防止特性および疎水化(hydrophobation)を含む吸着特性;ならびにイオン交換、脱色および凝集を含む反応特性も有する。
窒素源(グルタミン酸塩)の補充とともに、チオエステラーゼ('tesA)およびカルボン酸レダクターゼ(CarB)をプトレシンアミノトランスフェラーゼ(ygjG)と共発現させることによって、脂肪アルデヒド前駆体および対応する脂肪アミンをインビボで生成させた。脂肪アルデヒド前駆体を対応するアミンに変換した。
窒素源(グルタミン酸塩)の補充とともに、アシル-ACPレダクターゼ(AAR)をプトレシンアミノトランスフェラーゼ(ygjG)と共発現させることによって、脂肪アルデヒド前駆体および対応する脂肪アミンをインビボで生成させる。脂肪アルデヒド前駆体を対応するアミンに変換する。
窒素源(グルタミン酸塩)の補充とともに、チオエステラーゼ(TesA)およびカルボン酸レダクターゼ(CarB)をGABAアミノトランスフェラーゼ(PuuE)と共発現させることによって、脂肪アルデヒド前駆体および対応する脂肪アミンをインビボで生成させる。脂肪アルデヒド前駆体を対応するアミンに変換する。puuE遺伝子を、適した順方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いるPCRを介して、大腸菌菌株からクローニングする(実施例1および2、前記における教示と同様に)。続いてpuuE遺伝子を、発現ベクター(例えば、pACYC、前記)中に連結させて、プラスミドpACYC-puuEを作製する。第2のプラスミドを作製し、pCL1920-CarB-18-cTesA2-13C05と命名することができるが、これはマイコバクテリウム・スメグマチスcarB遺伝子および大腸菌由来のチオエステラーゼ遺伝子の変異体('tesA)を含有する第2の発現ベクターである(実施例1、前記を参照)。この2つのプラスミドを、脂肪アミンを産生しない大腸菌菌株(前記)中に共形質転換によって導入し、菌株F18-PUを得る。また、対照として用いるために宿主細胞をプラスミドのそれぞれによっても別々に形質転換して、対照菌株F18(pCL1920-CarB-18-cTesA2-13C05)および対照菌株PU(pACYC-puuE)を得る。
窒素源(グルタミン酸塩)の補充とともに、AARをGABAアミノトランスフェラーゼ(PuuE)と共発現させることによって、脂肪アルデヒド前駆体および対応する脂肪アミンをインビボで生成させる。脂肪アルデヒド前駆体を対応するアミンに変換する。
窒素源(アンモニア)の補充とともに、チオエステラーゼ(TesA)およびカルボン酸レダクターゼ(CarB)をアミンデヒドロゲナーゼ(例えば、パラコッカス・デニトリフィカンスのメチルアミンデヒドロゲナーゼまたはシュードモナス種のキノヘモタンパク質アミンデヒドロゲナーゼ)と共発現させることによって、脂肪アルデヒド前駆体および対応する脂肪アミンをインビボで生成させる。脂肪アルデヒド前駆体を対応するアミンに変換する。
窒素源(アンモニア)の補充とともに、AARをアミンデヒドロゲナーゼ(例えば、パラコッカス・デニトリフィカンスのメチルアミンデヒドロゲナーゼまたはシュードモナス種のキノヘモタンパク質アミンデヒドロゲナーゼ)と共発現させることによって、脂肪アルデヒド前駆体および対応する脂肪アミンをインビボで生成させる。脂肪アルデヒド前駆体を対応するアミンに変換する。
Claims (43)
- 脂肪アルデヒドを脂肪アミンに変換するための遺伝子操作された代謝経路を含む、脂肪アミンの生産のための組換え微生物であって、該代謝経路が、アミノトランスフェラーゼ活性またはアミンデヒドロゲナーゼ活性を有する外因性生合成酵素を含む、インビボで脂肪アミンを産生する該微生物。
- 脂肪アミンが前記微生物によって培養培地中に放出される、請求項1記載の組換え微生物。
- 外因性生合成酵素がプトレシンアミノトランスフェラーゼまたはGABAアミノトランスフェラーゼである、請求項1記載の組換え微生物。
- プトレシンアミノトランスフェラーゼがYgjGである、請求項3記載の組換え微生物。
- YgjGが、前記微生物において発現されるygjG遺伝子をコードする核酸配列によってコードされる、請求項4記載の組換え微生物。
- GABAアミノトランスフェラーゼがPuuEである、請求項3記載の組換え微生物。
- PuuEが、前記微生物において発現されるpuuE遺伝子をコードする核酸配列によってコードされる、請求項6記載の組換え微生物。
- 外因性生合成酵素がアミンデヒドロゲナーゼである、請求項1記載の組換え微生物。
- アミンデヒドロゲナーゼが、パラコッカス・デニトリフィカンス(Paracoccus denitrificans)のメチルアミンデヒドロゲナーゼである、請求項8記載の組換え微生物。
- アシル-ACPまたはアシル-CoAを脂肪酸に変換するためのもう1つの遺伝子操作された代謝経路をさらに含む、請求項1記載の組換え微生物。
- アシル-ACPまたはアシル-CoAが、チオエステラーゼ活性を有する生合成酵素によって脂肪酸に変換される、請求項10記載の組換え微生物。
- チオエステラーゼ活性を有する生合成酵素が、前記微生物において発現されるtesA遺伝子をコードする核酸配列によってコードされる、請求項11記載の組換え微生物。
- 脂肪酸を脂肪アルデヒドに変換するためのもう1つの遺伝子操作された代謝経路をさらに含む、請求項1記載の組換え微生物。
- 脂肪酸が、カルボン酸レダクターゼ(CAR)活性を有する生合成酵素によって脂肪アルデヒドに変換される、請求項13記載の組換え微生物。
- CAR活性を有する生合成酵素が、前記微生物において発現されるcarB遺伝子をコードする核酸配列によってコードされる、請求項14記載の組換え微生物。
- 組換え微生物細胞である、請求項1記載の組換え微生物。
- 組換え細菌細胞である、請求項16記載の組換え微生物細胞。
- エシェリキア(Escherichia)、バチルス(Bacillus)、藍藻植物(Cyanophyta)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、ザイモモナス(Zymomonas)、ロドコッカス(Rhodococcus)、シュードモナス(Pseudomonas)、アスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、ニューロスポラ(Neurospora)、フザリウム(Fusarium)、ヒューミコーラ(Humicola)、リゾムコール(Rhizomucor)、クリベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、ムコール(Mucor)、ミセリオフトラ(Myceliophtora)、ペニシリウム(Penicillium)、ファネロカエテ(Phanerochaete)、プレウロタス(Pleurotus)、トラメテス(Trametes)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、サッカロミセス(Saccharomyces)、ステノトロホモナス(Stenotrophamonas)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウイア(Yarrowia)、およびストレプトミセス(Streptomyces)からなる群より選択される、請求項16記載の組換え微生物細胞。
- エシェリキアが大腸菌(Escherichia coli)である、請求項18記載の組換え微生物細胞。
- 藍藻植物が、プロクロロコッカス(Prochlorococcus)、シネココッカス(Synechococcus)、シネコシスティス(Synechocystis)、シアノセイス(Cyanothece)、およびノストック・パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)からなる群より選択される、請求項18記載の組換え微生物細胞。
- 藍藻植物が、シネココッカス・エロンガタス(Synechococcus elongatus)PCC7942、シネコシスティス種PCC6803、およびシネココッカス種PCC7001からなる群より選択される、請求項18記載の組換え微生物細胞。
- 請求項1記載の組換え微生物を、炭素源を含有する発酵ブロス中で培養する段階を含む、脂肪アミンを生産する方法。
- (i)チオエステラーゼ活性を有する外因性生合成酵素をコードする1つまたは複数の発現された遺伝子;
(ii)カルボン酸レダクターゼ活性を有する外因性生合成酵素をコードする1つまたは複数の発現された遺伝子;および
(iii)アミノトランスフェラーゼ活性またはアミンデヒドロゲナーゼ活性を有する外因性生合成酵素をコードする1つまたは複数の発現された遺伝子
を含む、脂肪アミンの生産のための組換え細菌細胞であって、インビボで脂肪アミンを産生する組換え細菌細胞。 - 脂肪アミンが前記細菌細胞によって培養培地中に放出される、請求項23記載の組換え細菌細胞。
- チオエステラーゼ活性を有する外因性生合成酵素がアシル-ACPまたはアシル-CoAを脂肪酸に変換する、請求項23記載の組換え細菌細胞。
- カルボン酸レダクターゼ活性を有する外因性生合成酵素が脂肪酸を脂肪アルデヒドに変換する、請求項25記載の組換え細菌細胞。
- アミノトランスフェラーゼ活性またはアミンデヒドロゲナーゼ活性を有する外因性生合成酵素が脂肪アルデヒドを脂肪アミンに変換する、請求項26記載の組換え細菌細胞。
- チオエステラーゼ活性を有する外因性生合成酵素が、tesA遺伝子をコードする核酸配列によってコードされる、請求項23記載の組換え細菌細胞。
- カルボン酸レダクターゼ活性を有する外因性生合成酵素が、carB遺伝子をコードする核酸配列によってコードされる、請求項23記載の組換え細菌細胞。
- アミノトランスフェラーゼ活性を有する外因性生合成酵素がプトレシンアミノトランスフェラーゼまたはGABAアミノトランスフェラーゼである、請求項23記載の組換え細菌細胞。
- プトレシンアミノトランスフェラーゼがYgjGである、請求項30記載の組換え細菌細胞。
- YgjGが、ygjG遺伝子をコードする核酸配列によってコードされる、請求項31記載の組換え細菌細胞。
- GABAアミノトランスフェラーゼがPuuEである、請求項30記載の組換え細菌細胞。
- PuuEが、puuE遺伝子をコードする核酸配列によってコードされる、請求項33記載の組換え細菌細胞。
- アミンデヒドロゲナーゼ活性を有する外因性生合成酵素がメチルアミンデヒドロゲナーゼである、請求項23記載の組換え細菌細胞。
- メチルアミンデヒドロゲナーゼがパラコッカス・デニトリフィカンスに由来する、請求項35記載の組換え細菌細胞。
- エシェリキア、バチルス、藍藻植物、ラクトバチルス、ザイモモナス、ロドコッカス、シュードモナス、アスペルギルス、トリコデルマ、ニューロスポラ、フザリウム、ヒューミコーラ、リゾムコール、クリベロミセス、ピキア、ムコール、ミセリオフトラ、ペニシリウム、ファネロカエテ、プレウロタス、トラメテス、クリソスポリウム、サッカロミセス、ステノトロホモナス、シゾサッカロミセス、ヤロウイア、およびストレプトミセスからなる群より選択される、請求項23記載の組換え細菌細胞。
- エシェリキアが大腸菌である、請求項37記載の組換え細菌細胞。
- 藍藻植物が、プロクロロコッカス、シネココッカス、シネコシスティス、シアノセイス、およびノストック・パンクチフォルメからなる群より選択される、請求項37記載の組換え細菌細胞。
- 藍藻植物が、シネココッカス・エロンガタスPCC7942、シネコシスティス種PCC6803、およびシネココッカス種PCC7001からなる群より選択される、請求項37記載の組換え細菌細胞。
- 請求項23記載の細菌細胞を含む、細胞培養物。
- 請求項23記載の細菌細胞を、炭素源を含有する発酵ブロス中で培養する段階を含む、脂肪アミンを生産する方法。
- (i)請求項23記載の細胞を、発酵ブロス中で炭素源の存在下で培養する段階;および
(ii)発酵ブロス中に収集された脂肪アミンを採取する段階
を含む、細菌細胞において脂肪アミンを生産する方法。
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