JP6272757B2 - 2,4−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、1,3−ブタンジオールおよび関連アルコールを生成するための微生物および方法 - Google Patents
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Description
本発明は、一般的に生合成プロセス、より詳しくは、2,4−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、1,3−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは3−ブテン−1−オールの生合成能を有する生物体に関する。
本発明は、2,4−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、1,3−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは3−ブテン−1−オールを生成するのに充分な量で発現されるブタジエン経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を有する2,4−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、1,3−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは3−ブテン−1−オール経路を含めた非天然微生物体を提供する。本発明は、さらに、かかる微生物体を、本明細書に記載の2,4−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、1,3−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは3−ブテン−1−オール経路を含めた非天然微生物体を2,4−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、1,3−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは3−ブテン−1−オールが生成される条件下で該生成に充分な期間、培養することにより、2,4−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、1,3−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは3−ブテン−1−オールを作製するために使用する方法を提供する。
本発明は、例えば、以下を提供する。
(項目1)
1,3−ブタンジオールを生成するのに充分な量で発現される1,3−ブタンジオール経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含む1,3−ブタンジオール経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、前記1,3−ブタンジオール経路は:
(33)7AS,7P,7Nおよび7AA;
(1)4A,4B,4Cおよび4D;
(2)5A,5H,5J,5Kおよび5G;
(3)5A,5H,5Iおよび5G;
(4)5A,5Hおよび5L;
(5)5A,5Fおよび5G;
(6)7A,7D,7E,7F,7Gおよび7S;
(7)7A,7D,7I,7Gおよび7S;
(8)7A,7D,7K,および7S;
(9)7A,7H,7F,7Gおよび7S;
(10)7A,7J,7Gおよび7S;
(11)7A,7J,7Rおよび7AA;
(12)7A,7H,7F,7Rおよび7AA;
(13)7A,7H,7Q,7Zおよび7AA;
(14)7A,7D,7I,7Rおよび7AA;
(15)7A,7D,7E,7F,7Rおよび7AA;
(16)7A,7D,7E,7Q,7Zおよび7AA;
(17)7A,7D,7P,7Nおよび7AA;
(18)7A,7D,7P,7Y,7Zおよび7AA;
(19)7A,7B,7Mおよび7AA;
(20)7A,7B,7L,7Zおよび7AA;
(21)7A,7B,7X,7Nおよび7AA;
(22)7A,7B,7X,7Y,7Zおよび7AA;
(23)7A,7D,7Pおよび7O;
(24)7A,7B,7Xおよび7O;
(25)7A,7D,7E,7F,7R,7AA;
(26)7A,7D,7E,7F,7G,7S;
(27)7AS,7E,7F,7Gおよび7S;
(28)7AS,7I,7Gおよび7S;
(29)7AS,7K,および7S;
(30)7AS,7I,7Rおよび7AA;
(31)7AS,7E,7F,7Rおよび7AA;
(32)7AS,7E,7Q,7Zおよび7AA;
(34)7AS,7P,7Y,7Zおよび7AA;
(35)7AS,7Pおよび7O;
(36)7AS,7E,7F,7R,および7AA;ならびに
(37)7AS,7E,7F,7G,および7S
から選択される経路を含み、
前記4Aは3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAチオラーゼまたは3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンターゼであり、前記4Bは3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAヒドロラーゼ、3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAトランスフェラーゼまたは3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼであり、前記4Cは3−オキソ−5−ヒドロキシペンタン酸デカルボキシラーゼであり、前記4Dは3−オキソブタノールレダクターゼであり、前記5Aは4−
ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸アルドラーゼであり、前記5Fは4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸デカルボキシラーゼであり、前記5Gは3−ヒドロキシブタナールレダクターゼであり、前記5Hは4−ヒドロキシ−2−オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ、4−ヒドロキシ−2−オキソペンタン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼまたは4−ヒドロキシ−2−オキソペンタン酸ギ酸リアーゼであり、前記5Iは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記5Jは3−ヒドロキシブチリル−CoAヒドロラーゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼまたは3−ヒドロキシブチリル−CoAシンテターゼであり、前記5Kは3−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、前記5Lは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)であり、前記7Aは3−ケトアシル−ACPシンターゼであり、前記7Bはアセトアセチル−ACPレダクターゼであり、前記7Dはアセトアセチル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、前記7Eはアセトアセチル−CoAヒドロラーゼ、アセトアセチル−CoAトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−CoAシンテターゼであり、前記7Fはアセト酢酸レダクターゼ(酸還元)であり、前記7Gは3−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ(アルデヒド還元)であり、前記7Hはアセトアセチル−ACPチオエステラーゼであり、前記7Iはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(CoA依存性、アルデヒド形成)であり、前記7Jはアセトアセチル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Kはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)であり、前記7Lは3−ヒドロキシブチリル−ACPチオエステラーゼであり、前記7Mは3−ヒドロキシブチリル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Nは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Oは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)であり、前記7Pはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(ケトン還元)であり、前記7Qはアセト酢酸レダクターゼ(ケトン還元)であり、前記7Rは3−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ(ケトン還元)であり、前記7Sは4−ヒドロキシ−2−ブタノンレダクターゼであり、前記7Xは3−ヒドロキシブチリル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、前記7Yは3−ヒドロキシブチリル−CoAヒドロラーゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼまたは3−ヒドロキシブチリル−CoAシンテターゼであり、前記7Zは3−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、前記7AAは3−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼであり、前記7ASはアセトアセチル−CoAシンターゼである、
非天然微生物体。
(項目2)
前記微生物体が、各々が1,3−ブタンジオール経路の酵素をコードしている2、3、4または5種類の外因性核酸を含むものである、項目1に記載の非天然微生物体。
(項目3)
前記微生物体が、(1)〜(37)から選択される経路のうちの少なくとも1つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目2に記載の非天然微生物体。
(項目4)
前記少なくとも1種類の外因性核酸が異種核酸である、項目1に記載の非天然微生物体。
(項目5)
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、項目1に記載の非天然微生物体。
(項目6)
さらに:
(i)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも1種類の外因性核酸がATP−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−CoAシンテターゼ、シトリル−CoAリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的TCA経路;
(ii)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含
み、前記少なくとも1種類の外因性核酸がピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼおよびH 2 ヒドロゲナーゼから選択される、還元的TCA経路;または
(iii)COデヒドロゲナーゼ、H 2 ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸
を含む、項目1に記載の非天然微生物体。
(項目7)
(i)を含む前記微生物体が、さらに、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目6に記載の非天然微生物体。
(項目8)
(ii)を含む前記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目6に記載の非天然微生物体。
(項目9)
(i)を含む前記微生物体が、ATP−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている3種類の外因性核酸を含むものである;
(ii)を含む前記微生物体が、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ;ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ;COデヒドロゲナーゼ;およびH 2 ヒドロゲナーゼをコードしている4種類の外因性核酸を含むものである;または
(iii)を含む前記微生物体が、COデヒドロゲナーゼおよびH 2 ヒドロゲナーゼをコードしている2種類の外因性核酸を含むものである、
項目6に記載の非天然微生物体。
(項目10)
項目1〜9のいずれか1項に記載の非天然微生物体を、1,3−ブタンジオールが生成される条件下で前記生成に充分な期間、培養することを含む、1,3−ブタンジオールを生成するための方法。
(項目11)
2,4−ペンタジエノエートを生成するのに充分な量で発現される2,4−ペンタジエノエート経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含む2,4−ペンタジエノエート経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、前記2,4−ペンタジエノエート経路は:
(1)1D,1I,1B,1C,1Kおよび1G;
(2)1D,1E,1Fおよび1G;
(3)1D,1E,1L,1M,1Pおよび1G;
(4)1D,1I,1Bおよび1J;
(5)1D,1I,1B,1C,1K,1P,1Nおよび1O;
(6)1D,1E,1F,1P,1Nおよび1O;
(7)1D,1E,1L,1M,1Nおよび1O;
(8)1D,1E,1L,1Qおよび1O;
(9)1S,1I,1B,1C,1Kおよび1G;
(10)1S,1E,1Fおよび1G;
(11)1S,1I,1Bおよび1J;
(12)1S,1I,1B,1C,1K,1P,1Nおよび1O;
(13)1S,1E,1F,1P,1Nおよび1O;
(14)1S,1E,1L,1M,1Nおよび1O;
(15)1S,1E,1L,1Qおよび1O;
(16)1B,1C,1Kおよび1G;
(17)1I,1E,1Fおよび1G;
(18)1I,1E,1L,1M,1Pおよび1G;
(19)1Bおよび1J;
(20)1I,1E,1F,1P,1Nおよび1O;
(21)1I,1E,1L,1M,1Nおよび1O;
(22)1I,1E,1L,1Qおよび1O;
(23)3A,3B,3C,3D,3Eおよび3F;ならびに
(24)3A,3B,3C,3Gおよび3F
から選択される経路を含み、
前記1Bは5−アミノペンタン酸レダクターゼであり、前記1Cは5−アミノペント−2−エン酸アミノトランスフェラーゼ、5−アミノペント−2−エン酸デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼであり、前記1Dは2−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼであり、前記1Eはグルタル酸セミアルデヒドレダクターゼであり、前記1Fは5−ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼであり、前記1Gは5−ヒドロキシペント−2−エン酸デヒドラターゼであり、前記1Iは5−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、5−アミノペンタン酸デヒドロゲナーゼまたは5−アミノペンタン酸アミンオキシダーゼであり、前記1Jは5−アミノペント−2−エン酸デアミナーゼであり、前記1Kは5−ヒドロキシペント−2−エン酸レダクターゼであり、前記1Lは5−ヒドロキシバレリル−CoAトランスフェラーゼまたは5−ヒドロキシバレリル−CoAシンテターゼであり、前記1Mは5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドロゲナーゼであり、前記1Nは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼであり、前記1Oは2,4−ペンタジエノイル−CoAトランスフェラーゼ、2,4−ペンタジエノイル−CoAシンテターゼまたは2,4−ペンタジエノイル−CoAヒドロラーゼであり、前記1Pは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAトランスフェラーゼまたは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼであり、前記1Qは5−ヒドロキシバレリル−CoAデヒドラターゼ/デヒドロゲナーゼであり、前記1Sはグルタリル−CoAレダクターゼであり、前記3Aは3−オキソペンタノイル−CoAチオラーゼまたは3−オキソペンタノイル−CoAシンターゼであり、前記3Bは3−オキソペンタノイル−CoAレダクターゼであり、前記3Cは3−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼであり、前記3Dはペント−2−エノイル−CoAイソメラーゼであり、前記3Eはペント−3−エノイル−CoAデヒドロゲナーゼであり、前記3Fは2,4−ペンタジエノイル−CoAヒドロラーゼ、2,4−ペンタジエノイル−CoAトランスフェラーゼまたは2,4−ペンタジエノイル−CoAシンテターゼであり、前記3Gはペント−2−エノイル−CoAデヒドロゲナーゼである、
非天然微生物体。
(項目12)
前記微生物体が、各々が2,4−ペンタジエノエート経路の酵素をコードしている2、3、4、5、6、7、8、9または10種類の外因性核酸を含むものである、項目11に記載の非天然微生物体。
(項目13)
前記微生物体が、(1)〜(24)から選択される経路のうちの少なくとも1つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目12に記載の非天然微生物体。
(項目14)
前記少なくとも1種類の外因性核酸が異種核酸である、項目11に記載の非天然微生
物体。
(項目15)
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、項目11に記載の非天然微生物体。
(項目16)
(9)〜(15)から選択される2,4−ペンタジエノエート経路を含む前記非天然微生物体が、さらに、グルタリル−CoAを生成するのに充分な量で発現されるグルタリル−CoA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含むグルタリル−CoA経路を含むものであり、前記グルタリル−CoA経路が:
アセトアセチル−CoAチオラーゼもしくはアセトアセチル−CoAシンターゼ;アセトアセチル−CoAレダクターゼ;3−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドラターゼ;およびグルタリル−CoAデヒドロゲナーゼ;または
2−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、2−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは2−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼ;および2−オキソアジピン酸デヒドロゲナーゼ、2−オキソアジピン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼまたは2−オキソアジピン酸ギ酸リアーゼ
から選択される経路を含む、項目11に記載の非天然微生物体。
(項目17)
(16)〜(22)から選択される2,4−ペンタジエノエート経路を含む前記非天然微生物体が、さらに、5−アミノペンタノエートを生成するのに充分な量で発現される5−アミノペンタノエート経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含む5−アミノペンタノエート経路を含むものであり、前記5−アミノペンタノエート経路が、2−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼ;または2−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼおよび2−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、2−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは2−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを含むものである、項目11に記載の非天然微生物体。
(項目18)
(1)〜(8)から選択される2,4−ペンタジエノエート経路を含む前記非天然微生物体が、さらに、2−オキソアジペートを生成するのに充分な量で発現される2−オキソアジペート経路の酵素をコードしている外因性核酸を含む2−オキソアジペート経路を含むものであり、前記2−オキソアジペート経路が、2−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、2−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼまたは2−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを含むものである、項目11に記載の非天然微生物体。
(項目19)
さらに:
(i)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも1種類の外因性核酸がATP−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−CoAシンテターゼ、シトリル−CoAリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的TCA経路;
(ii)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも1種類の外因性核酸がピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼおよびH 2 ヒドロゲナーゼから選択される、還元的TCA経路;または
(iii)COデヒドロゲナーゼ、H 2 ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸
を含む、項目11に記載の非天然微生物体。
(項目20)
(i)を含む前記微生物体が、さらに、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ
、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目19に記載の非天然微生物体。
(項目21)
(ii)を含む前記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目19に記載の非天然微生物体。
(項目22)
(i)を含む前記微生物体が、ATP−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている3種類の外因性核酸を含むものである;
(ii)を含む前記微生物体が、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ;ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ;COデヒドロゲナーゼ;およびH 2 ヒドロゲナーゼをコードしている4種類の外因性核酸を含むものである;または
(iii)を含む前記微生物体が、COデヒドロゲナーゼおよびH 2 ヒドロゲナーゼをコードしている2種類の外因性核酸を含むものである、
項目19に記載の非天然微生物体。
(項目23)
項目11〜22のいずれか1項に記載の非天然微生物体を、2,4−ペンタジエノエートが生成される条件下で前記生成に充分な期間、培養することを含む、2,4−ペンタジエノエートを生成するための方法。
(項目24)
ブタジエンを生成するのに充分な量で発現されるブタジエン経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含むブタジエン経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、前記ブタジエン経路は:
(1)1D,1I,1B,1C,1K,1Gおよび1T;
(2)1D,1E,1F,1Gおよび1T;
(3)1D,1E,1L,1M,1P,1Gおよび1T;
(4)1D,1I,1B,1Jおよび1T;
(5)1D,1I,1B,1C,1K,1P,1N,1Oおよび1T;
(6)1D,1E,1F,1P,1N,1Oおよび1T;
(7)1D,1E,1L,1M,1N,1Oおよび1T;
(8)1D,1E,1L,1Q,1Oおよび1T;
(9)1D,1E,1F,1Uおよび1V;
(10)1D,1I,1B,1C,1K,1Uおよび1V;
(11)1D,1E,1L,1M,1P,1Uおよび1V;
(12)1D,1E,1Wおよび1V;
(13)1D,1I,1B,1C,1K,1G,6Aおよび6B;
(14)1D,1E,1F,1G,6Aおよび6B;
(15)1D,1E,1L,1M,1P,1G,6Aおよび6B;
(16)1D,1I,1B,1J,6Aおよび6B;
(17)1D,1I,1B,1C,1K,1P,1N,1O,6Aおよび6B;
(18)1D,1E,1F,1P,1N,1O,6Aおよび6B;
(19)1D,1E,1L,1M,1N,1O,6Aおよび6B;
(20)1D,1E,1L,1Q,1O,6Aおよび6B;
(21)1D,1I,1B,1C,1K,1G,6H,6Eおよび6B;
(22)1D,1E,1F,1G,6H,6Eおよび6B;
(23)1D,1E,1L,1M,1P,1G,6H,6Eおよび6B;
(24)1D,1I,1B,1J,6H,6Eおよび6B;
(25)1D,1I,1B,1C,1K,1P,1N,1O,6H,6Eおよび6B;
(26)1D,1E,1F,1P,1N,1O,6H,6Eおよび6B;
(27)1D,1E,1L,1M,1N,1O,6H,6Eおよび6B;
(28)1D,1E,1L,1Q,1O,6H,6Eおよび6B;
(29)1D,1I,1B,1C,1K,1P,1N,6Cおよび6B;
(30)1D,1E,1F,1P,1N,6Cおよび6B;
(31)1D,1E,1L,1M,1N,6Cおよび6B;
(32)1D,1E,1L,1Q,6Cおよび6B;
(33)1D,1I,1B,1C,1K,1P,1N,6D,6Eおよび6B;
(34)1D,1E,1F,1P,1N,6D,6Eおよび6B;
(35)1D,1E,1L,1M,1N,6D,6Eおよび6B;
(36)1D,1E,1L,1Q,6D,6Eおよび6B;
(37)1D,1I,1B,1C,1K,1G,6F,6Cおよび6B;
(38)1D,1E,1F,1G,6F,6Cおよび6B;
(39)1D,1E,1L,1M,1P,1G,6F,6Cおよび6B;
(40)1D,1I,1B,1C,1K,1G,6F,6D,6Eおよび6B;
(41)1D,1E,1F,1G,6F,6D,6Eおよび6B;
(42)1D,1E,1L,1M,1P,1G,6F,6D,6Eおよび6B;
(43)1S,1I,1B,1C,1K,1Gおよび1T;
(44)1S,1E,1F,1Gおよび1T;
(45)1S,1I,1B,1Jおよび1T;
(46)1S,1I,1B,1C,1K,1P,1N,1Oおよび1T;
(47)1S,1E,1F,1P,1N,1Oおよび1T;
(48)1S,1E,1L,1M,1N,1Oおよび1T;
(49)1S,1E,1L,1Q,1Oおよび1T;
(50)1S,1E,1F,1Uおよび1V;
(51)1S,1I,1B,1C,1K,1Uおよび1V;
(52)1S,1E,1L,1M,1P,1Uおよび1V;
(53)1S,1E,1Wおよび1V;
(54)1S,1I,1B,1C,1K,1G,6Aおよび6B;
(55)1S,1E,1F,1G,6Aおよび6B;
(56)1S,1I,1B,1J,6Aおよび6B;
(57)1S,1I,1B,1C,1K,1P,1N,1O,6Aおよび6B;
(58)1S,1E,1F,1P,1N,1O,6Aおよび6B;
(59)1S,1E,1L,1M,1N,1O,6Aおよび6B;
(60)1S,1E,1L,1Q,1O,6Aおよび6B;
(61)1S,1I,1B,1C,1K,1G,6H,6Eおよび6B;
(62)1S,1E,1F,1G,6H,6Eおよび6B;
(63)1S,1I,1B,1J,6H,6Eおよび6B;
(64)1S,1I,1B,1C,1K,1P,1N,1O,6H,6Eおよび6B;
(65)1S,1E,1F,1P,1N,1O,6H,6Eおよび6B;
(66)1S,1E,1L,1M,1N,1O,6H,6Eおよび6B;
(67)1S,1E,1L,1Q,1O,6H,6Eおよび6B;
(68)1S,1I,1B,1C,1K,1P,1N,6Cおよび6B;
(69)1S,1E,1F,1P,1N,6Cおよび6B;
(70)1S,1E,1L,1M,1N,6Cおよび6B;
(71)1S,1E,1L,1Q,6Cおよび6B;
(72)1S,1I,1B,1C,1K,1P,1N,6D,6Eおよび6B;
(73)1S,1E,1F,1P,1N,6D,6Eおよび6B;
(74)1S,1E,1L,1M,1N,6D,6Eおよび6B;
(75)1S,1E,1L,1Q,6D,6Eおよび6B;
(76)1S,1I,1B,1C,1K,1G,6F,6Cおよび6B;
(77)1S,1E,1F,1G,6F,6Cおよび6B;
(78)1S,1I,1B,1C,1K,1G,6F,6D,6Eおよび6B;
(79)1S,1E,1F,1G,6F,6D,6Eおよび6B;
(80)1B,1C,1K,1Gおよび1T;
(81)1I,1E,1F,1Gおよび1T;
(82)1I,1E,1L,1M,1P,1Gおよび1T;
(83)1B,1Jおよび1T;
(84)1I,1E,1F,1P,1N,1Oおよび1T;
(85)1I,1E,1L,1M,1N,1Oおよび1T;
(86)1I,1E,1L,1Q,1Oおよび1T;
(87)1B,1C,1K,1Uおよび1V;
(88)1I,1E,1F,1Uおよび1V;
(89)1I,1E,1L,1M,1P,1Uおよび1V;
(90)1I,1E,1Wおよび1V;
(91)1B,1C,1K,1G,6Aおよび6B;
(92)1I,1E,1F,1G,6Aおよび6B;
(93)1I,1E,1L,1M,1P,1G,6Aおよび6B;
(94)1B,1J,6Aおよび6B;
(95)1I,1E,1F,1P,1N,1O,6Aおよび6B;
(96)1I,1E,1L,1M,1N,1O,6Aおよび6B;
(97)1I,1E,1L,1Q,1O,6Aおよび6B;
(98)1B,1C,1K,1G,6H,6Eおよび6B;
(99)1I,1E,1F,1G,6H,6Eおよび6B;
(100)1I,1E,1L,1M,1P,1G,6H,6Eおよび6B;
(101)1B,1J,6H,6Eおよび6B;
(102)1I,1E,1F,1P,1N,1O,6H,6Eおよび6B;
(103)1I,1E,1L,1M,1N,1O,6H,6Eおよび6B;
(104)1I,1E,1L,1Q,1O,6H,6Eおよび6B;
(105)1I,1E,1F,1P,1N,6Cおよび6B;
(106)1I,1E,1L,1M,1N,6Cおよび6B;
(107)1I,1E,1L,1Q,6Cおよび6B;
(108)1I,1E,1F,1P,1N,6D,6Eおよび6B;
(109)1I,1E,1L,1M,1N,6D,6Eおよび6B;
(110)1I,1E,1L,1Q,6D,6Eおよび6B;
(111)1B,1C,1K,1G,6F,6Cおよび6B;
(112)1I,1E,1F,1G,6F,6Cおよび6B;
(113)1I,1E,1L,1M,1P,1G,6F,6Cおよび6B;
(114)1B,1C,1K,1G,6F,6D,6Eおよび6B;
(115)1I,1E,1F,1G,6F,6D,6Eおよび6B;
(116)1I,1E,1L,1M,1P,1G,6F,6D,6Eおよび6B;
(117)3A,3B,3C,3D,3E,3Fおよび1T;
(118)3A,3B,3C,3D,3E,3F,6Aおよび6B;
(119)3A,3B,3C,3D,3E,3F,6H,6Eおよび6B;
(120)3A,3B,3C,3D,3E,6Cおよび6B;
(121)3A,3B,3C,3D,3E,6D,6Eおよび6B;ならびに
(122)3A,3B,3C,3G,3Fおよび1T;
(123)3A,3B,3C,3G,3F,6Aおよび6B;
(124)3A,3B,3C,3G,3F,6H,6Eおよび6B;
(125)3A,3B,3C,3G,6Cおよび6B;
(126)3A,3B,3C,3G,6D,6Eおよび6B;
(127)5A,5B,5C,5Dおよび5E;
(128)7A,7J,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(129)7A,7H,7F,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(130)7A,7H,7Q,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(131)7A,7H,7Q,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;(132)7A,7D,7I,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(133)7A,7D,7E,7F,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(134)7A,7D,7E,7Q,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(135)7A,7D,7E,7Q,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(136)7A,7D,7P,7N,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(137)7A,7D,7P,7Y,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(138)7A,7D,7P,7Y,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(139)7A,7D,7P,7AB,7V,7AH,12A,12Bおよび12C;
(140)7A,7D,7P,7AB,7AF,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(141)7A,7B,7M,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(142)7A,7B,7L,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(143)7A,7B,7L,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;(144)7A,7B,7X,7Y,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(145)7A,7B,7X,7Y,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(146)7A,7B,7X,7AB,7V,7AH,12A,12Bおよび12C;
(147)7A,7B,7X,7AB,7AF,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(148)7A,7B,7C,7U,7AH,12A,12Bおよび12C;
(149)7A,7B,7C,7T,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(150)7A,7B,7C,7AE,7AF,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(151)7A,7D,7P,7AB,7W,12A,12Bおよび12C;
(152)7A,7B,7X,7AB,7W,12A,12Bおよび12C;
(153)7A,7B,7C,7AE,7W,12A,12Bおよび12C;
(154)7A,7B,7C,7AE,7V,7AH;,12A,12Bおよび12C
(155)7A,7J,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(156)7A,7H,7F,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(157)7A,7H,7Q,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(158)7A,7H,7Q,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(159)7A,7D,7I,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(160)7A,7D,7E,7F,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(161)7A,7D,7E,7Q,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(164)7A,7D,7E,7Q,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(163)7A,7D,7P,7N,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(164)7A,7D,7P,7Y,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(165)7A,7D,7P,7Y,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(166)7A,7D,7P,7AB,7V,7AH,12Dおよび12C;
(167)7A,7D,7P,7AB,7AF,7AG,7AH,12Dおよび12C;(168)7A,7B,7M,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(169)7A,7B,7L,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(170)7A,7B,7L,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(171)7A,7B,7X,7Y,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(172)7A,7B,7X,7Y,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(173)7A,7B,7X,7AB,7V,7AH,12Dおよび12C;
(174)7A,7B,7X,7AB,7AF,7AG,7AH,12Dおよび12C;(175)7A,7B,7C,7U,7AH,12Dおよび12C;
(176)7A,7B,7C,7T,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(177)7A,7B,7C,7AE,7AF,7AG,7AH,12Dおよび12C;(178)7A,7D,7P,7AB,7W,12Dおよび12C;
(179)7A,7B,7X,7AB,7W,12Dおよび12C;
(180)7A,7B,7C,7AE,7W,12Dおよび12C;
(181)7A,7B,7C,7AE,7V,7AH,12Dおよび12C;
(182)7I,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(183)7E,7F,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(184)7E,7Q,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(185)7E,7Q,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(186)7P,7N,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(187)7P,7Y,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(188)7P,7Y,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(189)7P,7AB,7V,7AH,12A,12Bおよび12C;
(190)7P,7AB,7AF,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(191)7P,7AB,7W,12A,12Bおよび12C;
(192)7I,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(193)7E,7F,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(194)7E,7Q,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(195)7E,7Q,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(196)7P,7N,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(197)7P,7Y,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(198)7P,7Y,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(199)7P,7AB,7V,7AH,12Dおよび12C;
(200)7P,7AB,7AF,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(201)7P,7AB,7W,12Dおよび12C;
(202)7AS,7I,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(203)7AS,7E,7F,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;(204)7AS,7E,7Q,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;(205)7AS,7E,7Q,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(206)7AS,7P,7N,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(207)7AS,7P,7Y,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;(208)7AS,7P,7Y,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(209)7AS,7P,7AB,7V,7AH,12A,12Bおよび12C;
(210)7AS,7P,7AB,7AF,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(211)7AS,7P,7AB,7W,12A,12Bおよび12C;
(212)7AS,7I,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(213)7AS,7E,7F,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(214)7AS,7E,7Q,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(215)7AS,7E,7Q,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(216)7AS,7P,7N,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(217)7AS,7P,7Y,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(218)7AS,7P,7Y,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(219)7AS,7P,7AB,7V,7AH,12Dおよび12C;
(220)7AS,7P,7AB,7AF,7AG,7AH,12Dおよび12C;ならびに
(221)7AS,7P,7AB,7W,12Dおよび12C
から選択される経路を含み、
前記1Bは5−アミノペンタン酸レダクターゼ、5−アミノペント−2−エン酸アミノトランスフェラーゼ、5−アミノペント−2−エン酸デヒドロゲナーゼまたは5−アミノペント−2−エン酸アミンオキシダーゼであり、前記1Dは2−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼであり、前記1Eはグルタル酸セミアルデヒドレダクターゼであり、前記1Fは5−ヒドロキシ吉草酸レダクターゼであり、前記1Gは5−ヒドロキシペント−2−エン酸デヒドラターゼであり、前記1Iは5−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、5−アミノペンタン酸デヒドロゲナーゼまたは5−アミノペンタン酸アミンオキシダーゼであり、前記1Jは5−アミノペント−4−エン酸デアミナーゼであり、前記1Kは5−ヒドロキシペント−2−エン酸レダクターゼであり、前記1Lは5−ヒドロキシバレリル−CoAトランスフェラーゼまたは5−ヒドロキシバレリル−CoAシンテターゼであり、前記1Mは5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドロゲナーゼであり、前記1Nは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼであり、前記1Oは2,4−ペンタジエノイル−CoAトランスフェラーゼ、2,4−ペンタジエノイル−CoAシンテターゼまたは2,4−ペンタジエノイル−CoAヒドロラーゼであり、前記1Pは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAトランスフェラーゼまたは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼであり、前記1Qは5−ヒドロキシバレリル−CoAデヒドラターゼ/デヒドロゲナーゼであり、前記1Sはグルタリル−CoAレダクターゼであり、前記1Tは2,4−ペンタジエン酸デカルボキシラーゼであり、前記1Uは5−ヒドロキシペント−2−エン酸デカルボキシラーゼであり、前記1Vは3−ブテン−1−オールデヒドラターゼであり、前記1Wは5−ヒドロキシ吉草酸デカルボキシラーゼであり、前記3Aは3−オキソペンタノイル−CoAチオラーゼまたは3−オキソペンタノイル−CoAシンターゼであり、前記3Bは3−オキソペンタノイル−CoAレダクターゼであり、前記3Cは3−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼであり、前記3Dはペント−2−エノイル−CoAイソメラーゼであり、前記3Eはペント−3−エノイル−CoAデヒドロゲナーゼであり、前記3Fは2,4−ペンタジエノイル−CoAヒドロラーゼ、2,4−ペンタジエノイル−CoAトランスフェラーゼまたは2,4−ペンタジエノイル−CoAシンテターゼであり、前記3Gはペント−2−エノイル−CoAデヒドロゲナーゼであり、前記5Aは4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸アルドラーゼであり、前記5Bは4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸デヒドラターゼであり、前記5Cは2−オキソペンテン酸デカルボキシラーゼであり、前記5Dは3−ブテン−1−アールレダクターゼであり、前記5Eは3−ブテン−1−オールデヒドラターゼであり、前記6Aは2,4−ペンタジエン酸レダクターゼ(酸還元)であり、前記6Bはペンタ−2,4−ジエナールデカルボニラーゼであり、前記6Cは2,4−ペンタジエノイル−CoAレダクターゼ(酸還元)であり、前記6Dは2,4−ペンタジエノイル−CoAホスホトランスフェラーゼであり、前記6Eは2,4−ペンタジエノイル−リン酸レダクターゼ
であり、前記6Fは2,4−ペンタジエノイル−CoAヒドロラーゼ、2,4−ペンタジエノイル−CoAトランスフェラーゼまたは2,4−ペンタジエノイル−CoAシンテターゼであり、前記6Hは2,4−ペンタジエン酸キナーゼであり、前記7Aは3−ケトアシル−ACPシンターゼであり、前記7Bはアセトアセチル−ACPレダクターゼであり、前記7Cは3−ヒドロキシブチリル−ACPデヒドラターゼであり、前記7Dはアセトアセチル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、前記7Eはアセトアセチル−CoAヒドロラーゼ、アセトアセチル−CoAトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−CoAシンテターゼであり、前記7Fはアセト酢酸レダクターゼ(酸還元)であり、前記7Hはアセトアセチル−ACPチオエステラーゼであり、前記7Iはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(CoA依存性,アルデヒド形成)であり、前記7Jはアセトアセチル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Kはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)であり、前記7Lは3−ヒドロキシブチリル−ACPチオエステラーゼであり、前記7Mは3−ヒドロキシブチリル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Nは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Oは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)であり、前記7Pはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(ケトン還元)であり、前記7Qはアセト酢酸レダクターゼ(ケトン還元)であり、前記7Rは3−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ(ケトン還元)であり、前記7Tはクロトニル−ACPチオエステラーゼであり、前記7Uはクロトニル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Vはクロトニル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Wはクロトニル−CoA(アルコール形成)であり、前記7Xは3−ヒドロキシブチリル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、前記7Yは3−ヒドロキシブチリル−CoAヒドロラーゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼまたは3−ヒドロキシブチリル−CoAシンテターゼであり、前記7Zは3−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、前記7ABは3−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドラターゼであり、前記7ACは3−ヒドロキシ酪酸デヒドラターゼであり、前記7ADは3−ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドラターゼであり、前記7AEはクロトニル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、前記7AFはクロトニル−CoAヒドロラーゼ、クロトニル−CoAトランスフェラーゼまたはクロトニル−CoAシンテターゼであり、前記7AGはクロトン酸レダクターゼであり、前記7AHはクロトンアルデヒドレダクターゼであり、前記7ASはアセトアセチル−CoAシンターゼであり、前記12Aはクロチルアルコールキナーゼであり、前記12Bは2−ブテニル−4−リン酸キナーゼであり、前記12Cはブタジエンシンターゼであり、前記12Dはクロチルアルコールジホスホキナーゼである、
非天然微生物体。
(項目25)
前記微生物体が、各々がブタジエン経路の酵素をコードしている2、3、4、5、6、7、8、9、10または11種類の外因性核酸を含むものである、項目24に記載の非天然微生物体。
(項目26)
前記微生物体が、(1)〜(221)から選択される経路のうちの少なくとも1つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目25に記載の非天然微生物体。
(項目27)
前記少なくとも1種類の外因性核酸が異種核酸である、項目24に記載の非天然微生物体。
(項目28)
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、項目24に記載の非天然微生物体。
(項目29)
(43)〜(79)から選択されるブタジエン経路を含む前記非天然微生物体が、さらに、グルタリル−CoAを生成するのに充分な量で発現されるグルタリル−CoA経路の
酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含むグルタリル−CoA経路を含むものであり、前記グルタリル−CoA経路が:
アセトアセチル−CoAチオラーゼもしくはアセトアセチル−CoAシンターゼ;アセトアセチル−CoAレダクターゼ;3−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドラターゼ;およびグルタリル−CoAデヒドロゲナーゼ;または
2−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、2−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは2−アミノ(aminino)アジピン酸アミンオキシダーゼ;および2−オキソアジピン酸デヒドロゲナーゼ、2−オキソアジピン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼもしくは2−オキソアジピン酸ギ酸リアーゼ
から選択される経路を含む、項目24に記載の非天然微生物体。
(項目30)
(80)〜(116)から選択されるブタジエン経路を含む前記非天然微生物体が、さらに、5−アミノペンタノエートを生成するのに充分な量で発現される5−アミノペンタノエート経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含む5−アミノペンタノエート経路を含むものであり、前記5−アミノペンタノエート経路が、2−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼ;または2−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼおよび2−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、2−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは2−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを含むものである、項目24に記載の非天然微生物体。
(項目31)
(1)〜(42)から選択されるブタジエン経路を含む前記非天然微生物体が、さらに、2−オキソアジペートを生成するのに充分な量で発現される2−オキソアジペート経路の酵素をコードしている外因性核酸を含む2−オキソアジペート経路を含むものであり、前記2−オキソアジペート経路が2−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、2−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼまたは2−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを含むものである、項目24に記載の非天然微生物体。
(項目32)
さらに:
(i)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも1種類の外因性核酸がATP−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−CoAシンテターゼ、シトリル−CoAリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的TCA経路;
(ii)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも1種類の外因性核酸がピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼおよびH 2 ヒドロゲナーゼから選択される、還元的TCA経路;または
(iii)COデヒドロゲナーゼ、H 2 ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸
を含む、項目24に記載の非天然微生物体。
(項目33)
(i)を含む前記微生物体が、さらに、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目32に記載の非天然微生物体。
(項目34)
(ii)を含む前記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目32に記載の非天然微生物体。
(項目35)
(i)を含む前記微生物体が、ATP−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている3種類の外因性核酸を含むものである;
(ii)を含む前記微生物体が、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ;ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ;COデヒドロゲナーゼ;およびH 2 ヒドロゲナーゼをコードしている4種類の外因性核酸を含むものである;または
(iii)を含む前記微生物体が、COデヒドロゲナーゼおよびH 2 ヒドロゲナーゼをコードしている2種類の外因性核酸を含むものである、
項目32に記載の非天然微生物体。
(項目36)
項目24〜35のいずれか1項に記載の非天然微生物体を、ブタジエンが生成される条件下で前記生成に充分な期間、培養することを含む、ブタジエンを生成するための方法。
(項目37)
3−ブテン−1−オールを生成するのに充分な量で発現される3−ブテン−1−オール経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含む3−ブテン−1−オール経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、前記3−ブテン−1−オール経路は:
(1)1D,1E,1Fおよび1U;
(2)1D,1I,1B,1C,1Kおよび1U;
(3)1D,1E,1L,1M,1Pおよび1U;
(4)1D,1Eおよび1W;
(5)1S,1E,1Fおよび1U;
(6)1S,1I,1B,1C,1Kおよび1U;
(7)1S,1E,1L,1M,1Pおよび1U;
(8)1S,1Eおよび1W;
(9)1B,1C,1Kおよび1U;
(10)1I,1E,1Fおよび1U;
(11)1I,1E,1L,1M,1Pおよび1U;
(12)1I,1Eおよび1W;ならびに
(13)5A,5B,5Cおよび5D
から選択される経路を含み、
前記1Bは5−アミノペンタン酸レダクターゼであり、前記1Cは5−アミノペント−2−エン酸アミノトランスフェラーゼ、5−アミノペント−2−エン酸デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼであり、前記1Dは2−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼであり、前記1Eはグルタル酸セミアルデヒドレダクターゼであり、前記1Fは5−ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼであり、前記1Iは5−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、5−アミノペンタン酸デヒドロゲナーゼまたは5−アミノペンタン酸アミンオキシダーゼであり、前記1Kは5−ヒドロキシペント−2−エン酸レダクターゼであり、前記1Lは5−ヒドロキシバレリル−CoAトランスフェラーゼまたは5−ヒドロキシバレリル−CoAシンテターゼであり、前記1Mは5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドロゲナーゼであり、前記1Pは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAトランスフェラーゼまたは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼであり、前記1Sはグルタリル−CoAレダクターゼであり、前記1Uは5−ヒドロキシペント
−2−エン酸デカルボキシラーゼであり、前記1Wは5−ヒドロキシ吉草酸デカルボキシラーゼであり、前記5Aは4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸アルドラーゼであり、前記5Bは4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸デヒドラターゼであり、前記5Cは2−オキソペンテン酸デカルボキシラーゼであり、前記5Dは3−ブテン−1−アールレダクターゼである、
非天然微生物体。
(項目38)
前記微生物体が、各々が3−ブテン−1−オール経路の酵素をコードしている2、3、4、5または6種類の外因性核酸を含むものである、項目37に記載の非天然微生物体。
(項目39)
前記微生物体が、(1)〜(13)から選択される経路のうちの少なくとも1つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目38に記載の非天然微生物体。
(項目40)
前記少なくとも1種類の外因性核酸が異種核酸である、項目37に記載の非天然微生物体。
(項目41)
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、項目37に記載の非天然微生物体。
(項目42)
さらに:
(i)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも1種類の外因性核酸がATP−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的TCA経路;
(ii)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも1種類の外因性核酸がピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼおよびH 2 ヒドロゲナーゼから選択される、還元的TCA経路;または
(iii)COデヒドロゲナーゼ、H 2 ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸
を含む、項目37に記載の非天然微生物体。
(項目43)
(i)を含む前記微生物体が、さらに、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目42に記載の非天然微生物体。
(項目44)
(ii)を含む前記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目42に記載の非天然微生物体。
(項目45)
(i)を含む前記微生物体が、ATP−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている3種類の外因性核酸を含むものである;
(ii)を含む前記微生物体が、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ;
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ;COデヒドロゲナーゼ;およびH 2 ヒドロゲナーゼをコードしている4種類の外因性核酸を含むものである;または
(iii)を含む前記微生物体が、COデヒドロゲナーゼおよびH 2 ヒドロゲナーゼをコードしている2種類の外因性核酸を含むものである、
項目42に記載の非天然微生物体。
(項目46)
項目37〜45のいずれか1項に記載の非天然微生物体を、3−ブテン−1−オールが生成される条件下で前記生成に充分な期間、培養することを含む、3−ブテン−1−オールを生成するための方法。
(項目47)
項目37〜45のいずれか1項に記載の非天然微生物体を、3−ブテン−1−オールが生成される条件下で前記生成のために充分培養すること、および前記3−ブテン−1−オールを化学的に脱水させてブタジエンを生成させることを含む、ブタジエンを生成するための方法。
(項目48)
クロチルアルコールを生成するのに充分な量で発現されるクロチルアルコール経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含むクロチルアルコール経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、前記クロチルアルコール経路は:
(1)7A,7J,7R,7ADおよび7AH;
(2)7A,7H,7F,7R,7ADおよび7AH;
(3)7A,7H,7Q,7Z,7ADおよび7AH;
(4)7A,7H,7Q,7AC,7AGおよび7AH;
(5)7A,7D,7I,7R,7ADおよび7AH;
(6)7A,7D,7E,7F,7R,7ADおよび7AH;
(7)7A,7D,7E,7Q,7Z,7ADおよび7AH;
(8)7A,7D,7E,7Q,7AC,7AGおよび7AH;
(9)7A,7D,7P,7N,7ADおよび7AH;
(10)7A,7D,7P,7Y,7Z,7ADおよび7AH;
(11)7A,7D,7P,7Y,7AC,7AGおよび7AH;
(12)7A,7D,7P,7AB,7Vおよび7AH;
(13)7A,7D,7P,7AB,7AF,7AGおよび7AH;
(14)7A,7B,7M,7ADおよび7AH;
(15)7A,7B,7L,7Z,7ADおよび7AH;
(16)7A,7B,7L,7AC,7AGおよび7AH;
(17)7A,7B,7X,7Y,7Z,7ADおよび7AH;
(18)7A,7B,7X,7Y,7AC,7AGおよび7AH;
(19)7A,7B,7X,7AB,7Vおよび7AH;
(20)7A,7B,7X,7AB,7AF,7AGおよび7AH;
(21)7A,7B,7C,7Uおよび7AH;
(22)7A,7B,7C,7T,7AGおよび7AH;
(23)7A,7B,7C,7AE,7AF,7AGおよび7AH;
(24)7A,7D,7P,7ABおよび7W;
(25)7A,7B,7X,7ABおよび7W;
(26)7A,7B,7C,7AEおよび7W;
(27)7A,7B,7C,7AE,7Vおよび7AH;
(28)7I,7R,7ADおよび7AH;
(29)7E,7F,7R,7ADおよび7AH;
(30)7E,7Q,7Z,7ADおよび7AH;
(31)7E,7Q,7AC,7AGおよび7AH;
(32)7P,7N,7ADおよび7AH;
(33)7P,7Y,7Z,7ADおよび7AH;
(34)7P,7Y,7AC,7AGおよび7AH;
(35)7P,7AB,7Vおよび7AH;
(36)7P,7AB,7AF,7AGおよび7AH;
(37)7P,7ABおよび7W;
(38)7AS,7I,7R,7ADおよび7AH;
(39)7AS,7E,7F,7R,7ADおよび7AH;
(40)7AS,7E,7Q,7Z,7ADおよび7AH;
(41)7AS,7E,7Q,7AC,7AGおよび7AH;
(42)7AS,7P,7N,7ADおよび7AH;
(43)7AS,7P,7Y,7Z,7ADおよび7AH;
(44)7AS,7P,7Y,7AC,7AGおよび7AH;
(45)7AS,7P,7AB,7Vおよび7AH;
(46)7AS,7P,7AB,7AF,7AGおよび7AH;ならびに
(47)7AS,7P,7ABおよび7W
から選択される経路を含み、
前記7Aは3−ケトアシル−ACPシンターゼであり、前記7Bはアセトアセチル−ACPレダクターゼであり、前記7Cは3−ヒドロキシブチリル−ACPデヒドラターゼであり、前記7Dはアセトアセチル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、前記7Eはアセトアセチル−CoAヒドロラーゼ、アセトアセチル−CoAトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−CoAシンテターゼであり、前記7Fはアセト酢酸レダクターゼ(酸還元)であり、前記7Hはアセトアセチル−ACPチオエステラーゼであり、前記7Iはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(CoA依存性,アルデヒド形成)であり、前記7Jはアセトアセチル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Kはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)であり、前記7Lは3−ヒドロキシブチリル−ACPチオエステラーゼであり、前記7Mは3−ヒドロキシブチリル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Nは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Oは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)であり、前記7Pはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(ケトン還元)であり、前記7Qはアセト酢酸レダクターゼ(ケトン還元)であり、前記7Rは3−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ(ケトン還元)であり、前記7Tはクロトニル−ACPチオエステラーゼであり、前記7Uはクロトニル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Vはクロトニル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Wはクロトニル−CoA(アルコール形成)であり、前記7Xは3−ヒドロキシブチリル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、前記7Yは3−ヒドロキシブチリル−CoAヒドロラーゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼまたは3−ヒドロキシブチリル−CoAシンテターゼであり、前記7Zは3−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、前記7ABは3−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドラターゼであり、前記7ACは3−ヒドロキシ酪酸デヒドラターゼであり、前記7ADは3−ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドラターゼであり、前記7AEはクロトニル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、前記7AFはクロトニル−CoAヒドロラーゼ、クロトニル−CoAトランスフェラーゼまたはクロトニル−CoAシンテターゼであり、前記7AGはクロトン酸レダクターゼであり、前記7AHはクロトンアルデヒドレダクターゼであり、前記7ASはアセトアセチル−CoAシンターゼである、
非天然微生物体。
(項目49)
前記微生物体が、各々がクロチルアルコール経路の酵素をコードしている2、3、4、5、6または7種類の外因性核酸を含むものである、項目1に記載の非天然微生物体。
(項目50)
前記微生物体が、(1)〜(47)から選択される経路のうちの少なくとも1つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目1Aに記載の非天然微生物体。
(項目51)
前記少なくとも1種類の外因性核酸が異種核酸である、項目1に記載の非天然微生物体。
(項目52)
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、項目1に記載の非天然微生物体。
(項目53)
さらに:
(i)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも1種類の外因性核酸がATP−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−CoAシンテターゼ、シトリル−CoAリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的TCA経路;
(ii)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも1種類の外因性核酸がピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼおよびH 2 ヒドロゲナーゼから選択される、還元的TCA経路;または
(iii)COデヒドロゲナーゼ、H 2 ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸
を含む、項目48に記載の非天然微生物体。
(項目54)
(i)を含む前記微生物体が、さらに、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目53に記載の非天然微生物体。
(項目55)
(ii)を含む前記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目53に記載の非天然微生物体。
(項目56)
(i)を含む前記微生物体が、ATP−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている3種類の外因性核酸を含むものである;
(ii)を含む前記微生物体が、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ;ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ;COデヒドロゲナーゼ;およびH 2 ヒドロゲナーゼをコードしている4種類の外因性核酸を含むものである;または
(iii)を含む前記微生物体が、COデヒドロゲナーゼおよびH 2 ヒドロゲナーゼをコードしている2種類の外因性核酸を含むものである、
項目53に記載の非天然微生物体。
(項目57)
項目48〜56のいずれか1項に記載の非天然微生物体を、クロチルアルコールが生成される条件下で前記生成に充分な期間、培養することを含む、クロチルアルコールを生成するための方法。
(項目58)
プロピレンを生成するのに充分な量で発現されるプロピレン経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含むプロピレン経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、前記プロピレン経路は:
(1)7A,7J,7R,7ADおよび7AO;
(2)7A,7H,7F,7R,7ADおよび7AO;
(3)7A,7D,7I,7R,7ADおよび7AO;
(4)7A,7D,7E,7F,7R,7ADおよび7AO;
(5)7A,7H,7Q,7Z,7ADおよび7AO;
(6)7A,7D,7E,7Q,7ADおよび7AO;
(7)7A,7D,7P,7Y,7Z,7ADおよび7AO;
(8)7A,7D,7P,7N,7ADおよび7AO;
(9)7A,7B,7X,7N,7ADおよび7AO;
(10)7A,7B,7X,7Y,7Z,7ADおよび7AO;
(11)7A,7H,7Q,7V,7AGおよび7AO;
(12)7A,7D,7E,7Q,7AC,7AGおよび7AO;
(13)7A,7D,7P,7Y,7AC,7AGおよび7AO;
(14)7A,7D,7P,7AB,7AF,7AGおよび7AO;
(15)7A,7P,7AB,7Vおよび7AO;
(16)7A,7B,7M,7ADおよび7AO;
(17)7A,7B,7L,7Z,7ADおよび7AO;
(18)7A,7B,7X,7N,7ADおよび7AO;
(19)7A,7B,7X,7Y,7Z,7ADおよび7AO;
(20)7A,7B,7C,7Uおよび7AO;
(21)7A,7B,7C,7T,7AGおよび7AO;
(22)7A,7B,7C,7AE,7Vおよび7AO;
(23)7A,7B,7C,7AE,7AF,7AGおよび7AO;
(24)7A,7H,7Qおよび7AR;
(25)7A,7D,7E,7Qおよび7AR;
(26)7A,7D,7P,7Yおよび7AR;
(27)7A,7B,7X,7Yおよび7AR;
(28)7A,7B,7Lおよび7AR;
(29)7A,7H,7Q,7ACおよび7AQ;
(30)7A,7D,7E,7Q,7ACおよび7AQ;
(31)7A,7D,7P,7Y,7ACおよび7AQ;
(32)7A,7D,7P,7AB,7AFおよび7AQ;
(33)7A,7B,7L,7ACおよび7AQ;
(34)7A,7B,7X,7Y,7ACおよび7AQ;
(35)7A,7B,7X,7AB,7AFおよび7AQ;
(36)7A,7B,7C,7AE,7AFおよび7AQ;
(37)7A,7B,7C,7Tおよび7AQ;
(38)7A,7H,7Q,7AC,7ANおよび7AK
(39)7A,7D,7E,7Q,7AC,7ANおよび7AK;
(40)7A,7D,7P,7Y,7AC,7ANおよび7AK;
(41)7A,7D,7P,7AB,7AF,7ANおよび7AK;
(42)7A,7D,7P,7AB,7AM,7AJおよび7AK;
(43)7A,7B,7L,7AC,7ANおよび7AK;
(44)7A,7B,7X,7Y,7AC,7ANおよび7AK;
(45)7A,7B,7X,7AB,7AF,7ANおよび7AK;
(46)7A,7B,7X,7AB,7AM,7AJおよび7AK;
(47)7A,7B,7C,7T,7ANおよび7AK;
(48)7A,7B,7C,7AE,7AF,7ANおよび7AK;
(49)7A,7B,7C,7AE,7AM,7AJおよび7AK;
(50)7A,7B,7C,7AL,7APおよび7AK;
(51)7A,7B,7C,7AL,7AI,7AJおよび7AK;
(52)7A,7B,7X,7AB,7Vおよび7AO;
(53)7A 7B,7L,7AC,7AGおよび7AO;
(54)7A,7B,7X,7Y,7AC,7AC,7AGおよび7AO;
(55)7A,7B,7X,7AB,7AF,7AGおよび7AO;
(56)7A,7H,7Q,7AC,7AGおよび7AO;
(57)7I,7R,7ADおよび7AO;
(58)7E,7F,7R,7ADおよび7AO;
(59)7E,7Q,7Z,7ADおよび7AO;
(60)7P,7Y,7Z,7ADおよび7AO;
(61)7P,7N,7ADおよび7AO;
(62)7E,7Q,7AC,7AGおよび7AO;
(63)7P,7Y,7AC,7AGおよび7AO;
(64)7P,7AB,7AF,7AGおよび7AO;
(65)7P,7AB,7Vおよび7AO;
(66)7E,7Qおよび7AR;
(67)7P,7Yおよび7AR;
(68)7E,7Q,7ACおよび7AQ;
(69)7P,7Y,7ACおよび7AQ;
(70)7P,7AB,7AFおよび7AQ;
(71)7E,7Q,7AC,7ANおよび7AK;
(72)7P,7Y,7AC,7ANおよび7AK;
(73)7P,7AB,7AF,7ANおよび7AK;
(74)7P,7AB,7AM,7AJおよび7AK;
(75)7AS,7I,7R,7ADおよび7AO;
(76)7AS,7E,7F,7R,7ADおよび7AO;
(77)7AS,7E,7Q,7ADおよび7AO;
(78)7AS,7P,7Y,7Z,7ADおよび7AO;
(79)7AS,7P,7N,7ADおよび7AO;
(80)7AS,7E,7Q,7AC,7AGおよび7AO;
(81)7AS,7P,7Y,7AC,7AGおよび7AO;
(82)7AS,7P,7AB,7AF,7AGおよび7AO;
(83)7AS,7E,7Qおよび7AR;
(84)7AS,7P,7Yおよび7AR;
(85)7AS,7E,7Q,7ACおよび7AQ;
(86)7AS,7P,7Y,7ACおよび7AQ;
(87)7AS,7P,7AB,7AFおよび7AQ;
(88)7AS,7E,7Q,7AC,7ANおよび7AK;
(89)7AS,7P,7Y,7AC,7ANおよび7AK;
(90)7AS,7P,7AB,7AF,7ANおよび7AK;ならびに
(91)7AS,7P,7AB,7AM,7AJおよび7AK
から選択される経路を含み、
前記7Aは3−ケトアシル−ACPシンターゼであり、前記7Bはアセトアセチル−ACPレダクターゼであり、前記7Cは3−ヒドロキシブチリル−ACPデヒドラターゼであり、前記7Dはアセトアセチル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、前記7Eはアセトアセチル−CoAヒドロラーゼ、アセトアセチル−CoAトランスフェラーゼま
たはアセトアセチル−CoAシンテターゼであり、前記7Fはアセト酢酸レダクターゼ(酸還元)であり、前記7Hはアセトアセチル−ACPチオエステラーゼであり、前記7Iはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(CoA依存性,アルデヒド形成)であり、前記7Jはアセトアセチル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Lは3−ヒドロキシブチリル−ACPチオエステラーゼであり、前記7Mは3−ヒドロキシブチリル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Nは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Pはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(ケトン還元)であり、前記7Qはアセト酢酸レダクターゼ(ケトン還元)であり、前記7Rは3−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ(ケトン還元)であり、前記7Sは4−ヒドロキシ−2−ブタノンレダクターゼであり、前記7Tはクロトニル−ACPチオエステラーゼであり、前記7Uはクロトニル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Vはクロトニル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Xは3−ヒドロキシブチリル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、前記7Yは3−ヒドロキシブチリル−CoAヒドロラーゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼまたは3−ヒドロキシブチリル−CoAシンテターゼであり、前記7Zは3−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、前記7ABは3−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドラターゼであり、前記7ACは3−ヒドロキシ酪酸デヒドラターゼであり、前記7ADは3−ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドラターゼであり、前記7AEはクロトニル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、前記7AFはクロトニル−CoAヒドロラーゼ、クロトニル−CoAトランスフェラーゼまたはクロトニル−CoAシンテターゼであり、前記7AGはクロトン酸レダクターゼであり、前記7AIはブチリル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、前記7AJはブチリル−CoAトランスフェラーゼ、ブチリル−CoAヒドロラーゼまたはブチリル−CoAシンテターゼであり、前記7AKは酪酸デカルボキシラーゼであり、前記7ALはクロトニル−ACPレダクターゼであり、前記7AMはクロトニル−CoAレダクターゼであり、前記7ANはクロトン酸レダクターゼであり、前記7AOはクロトンアルデヒドデカルボニラーゼであり、前記7APはブチリル−ACPチオエステラーゼであり、前記7AQはクロトン酸デカルボキシラーゼであり、前記7ARは3−ヒドロキシ酪酸デカルボキシラーゼであり、前記7ASはアセトアセチル−CoAシンターゼである、
非天然微生物体。
(項目59)
前記微生物体が、各々がプロピレン経路の酵素をコードしている2、3、4、5、6、7または8種類の外因性核酸を含むものである、項目58に記載の非天然微生物体。
(項目60)
前記微生物体が、(1)〜(91)から選択される経路のうちの少なくとも1つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目59に記載の非天然微生物体。
(項目61)
前記少なくとも1種類の外因性核酸が異種核酸である、項目58に記載の非天然微生物体。
(項目62)
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、項目58に記載の非天然微生物体。
(項目63)
さらに:
(i)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも1種類の外因性核酸がATP−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−CoAシンテターゼ、シトリル−CoAリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的TCA経路;
(ii)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも1種類の外因性核酸がピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクタ
ーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼおよびH 2 ヒドロゲナーゼから選択される、還元的TCA経路;または
(iii)COデヒドロゲナーゼ、H 2 ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸
を含む、項目58に記載の非天然微生物体。
(項目64)
(i)を含む前記微生物体が、さらに、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目63に記載の非天然微生物体。
(項目65)
(ii)を含む前記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目63に記載の非天然微生物体。
(項目66)
(i)を含む前記微生物体が、ATP−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている3種類の外因性核酸を含むものである;
(ii)を含む前記微生物体が、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ;ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ;COデヒドロゲナーゼ;およびH 2 ヒドロゲナーゼをコードしている4種類の外因性核酸を含むものである;または
(iii)を含む前記微生物体が、COデヒドロゲナーゼおよびH 2 ヒドロゲナーゼをコードしている2種類の外因性核酸を含むものである、
項目63に記載の非天然微生物体。
(項目67)
項目58〜66のいずれか1項に記載の非天然微生物体を、プロピレンが生成される条件下で前記生成に充分な期間、培養することを含む、プロピレンを生成するための方法。
(項目68)
(a)充分な量の栄養素と培地中で、項目48〜56のいずれか1項に記載の非天然微生物体を発酵により培養し、クロチルアルコールを生成させること;および
(b)前記非天然微生物体を培養することによって生成したクロチルアルコールをブタジエンに変換させること
を含む、ブタジエンを生成するためのプロセス。
(項目69)
工程(b)を触媒の存在下での化学的脱水によって行なう、項目68に記載の方法。
本発明は、2,4−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、1,3−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは3−ブテン−1−オールの生合成的生成能を有する細胞および生物体の設計および作製に関する。本発明は、特に、2,4−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、1,3−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは3−ブテン−1−オール経路の酵素をコードしている1種類以上の核酸を導入することにより、2,4−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、1,3−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは3−ブテン−1−オールを生成し得る微生物体の設計に関する。
図1に示した経路により、使用したグルコース1モルあたり0.85モル収量の2,4−ペンタジエノエートが得られる。生成物収量の増大は、細胞がCO2を還元的(もしくは逆)TCA回路またはWood−Ljungdahl経路などの経路によって固定し得る場合に可能である。また、図1に示した経路を有するように操作された生物体では、ほぼ理論最大2,4−ペンタジエノエート収量を達成することが可能である。
図1に示した経路により、使用したグルコース1モルあたり0.85モル収量のブタジエンが得られる。ほぼ理論最大値までの生成物収量の増大は、細胞がCO2を還元的(もしくは逆)TCA回路またはWood−Ljungdahl経路などの経路によって固定し得る場合に可能である。また、図5、6または図1に示した経路を図12に示した経路との組合せで有するように操作された生物体では、ほぼ理論最大ブタジエン収量を達成することが可能である。
図5に示した経路により、使用したグルコース1モルあたり1モル収量の1,3−ブタンジオールが得られる。理論最大値までの生成物収量の増大は、細胞がCO2を還元的(もしくは逆)TCA回路またはWood−Ljungdahl経路などの経路によって固定し得る場合に可能である。また、図7に示した経路を有するように操作された生物体では、理論最大1,3−ブタンジオール収量を達成することが可能である。
図1に示した経路により、使用したグルコース1モルあたり0.85モル収量の3−ブテン−1−オールが得られる。ほぼ理論最大値までの生成物収量の増大は、細胞がCO2を還元的(もしくは逆)TCA回路またはWood−Ljungdahl経路などの経路によって固定し得る場合に可能である。また、図5に示した経路を有するように操作された生物体では、ほぼ理論最大ブタジエン収量を達成することが可能である。
図7に示した経路により、使用したグルコース1モルあたり1.08モル収量のクロチルアルコールが得られる。理論最大値までの生成物収量の増大は、細胞がCO2を還元的(もしくは逆)TCA回路またはWood−Ljungdahl経路などの経路によって固定し得る場合に可能である。
図7に示した経路により、使用したグルコース1モルあたり1.2モル収量のプロピレンが得られる。ほぼ理論最大値までの生成物収量の増大は、細胞がCO2を還元的(もしくは逆)TCA回路またはWood−Ljungdahl経路などの経路によって固定し得る場合に可能である。
および12C;(165)7A,7D,7P,7Y,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;(166)7A,7D,7P,7AB,7V,7AH,12Dおよび12C;(167)7A,7D,7P,7AB,7AF,7AG,7AH,12Dおよび12C;(168)7A,7B,7M,7AD,7AH,12Dおよび12C;(169)7A,7B,7L,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;(170)7A,7B,7L,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;(171)7A,7B,7X,7Y,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;(172)7A,7B,7X,7Y,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;(173)7A,7B,7X,7AB,7V,7AH,12Dおよび12C;(174)7A,7B,7X,7AB,7AF,7AG,7AH,12Dおよび12C;(175)7A,7B,7C,7U,7AH,12Dおよび12C;(176)7A,7B,7C,7T,7AG,7AH,12Dおよび12C;(177)7A,7B,7C,7AE,7AF,7AG,7AH,12Dおよび12C;(178)7A,7D,7P,7AB,7W,12Dおよび12C;(179)7A,7B,7X,7AB,7W,12Dおよび12C;(180)7A,7B,7C,7AE,7W,12Dおよび12C;(181)7A,7B,7C,7AE,7V,7AH,12Dおよび12C;(182)7I,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;(183)7E,7F,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;(184)7E,7Q,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;(185)7E,7Q,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;(186)7P,7N,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;(187)7P,7Y,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;(188)7P,7Y,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;(189)7P,7AB,7V,7AH,12A,12Bおよび12C;(190)7P,7AB,7AF,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;(191)7P,7AB,7W,12A,12Bおよび12C;(192)7I,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;(193)7E,7F,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;(194)7E,7Q,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;(195)7E,7Q,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;(196)7P,7N,7AD,7AH,12Dおよび12C;(197)7P,7Y,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;(198)7P,7Y,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;(199)7P,7AB,7V,7AH,12Dおよび12C;(200)7P,7AB,7AF,7AG,7AH,12Dおよび12C;(201)7P,7AB,7W,12Dおよび12C,(202)7AS,7I,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;(203)7AS,7E,7F,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;(204)7AS,7E,7Q,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;(205)7AS,7E,7Q,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;(206)7AS,7P,7N,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;(207)7AS,7P,7Y,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;(208)7AS,7P,7Y,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;(209)7AS,7P,7AB,7V,7AH,12A,12Bおよび12C;(210)7AS,7P,7AB,7AF,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;(211)7AS,7P,7AB,7W,12A,12Bおよび12C;(212)7AS,7I,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;(213)7AS,7E,7F,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;(214)7AS,7E,7Q,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;(215)7AS,7E,7Q,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;(216)7AS,7P,7N,7AD,7AH,12Dおよび12C;(217)7AS,7P,7Y,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;(218)7AS,7P,7Y,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;(219)7AS,7P,7AB,7V,7AH,12Dおよび12C;(220)7AS,7P,7AB,7AF,7AG,7AH,12Dおよび12C;ならびに(221)7AS,7P,7AB,7W,12Dおよび12Cから選択される図1、3,5、6および/または12に示す経路を含み、該1Bは5−アミノペンタン酸レダクターゼ、5−アミノペント−2−エン酸アミノトランスフェラーゼ、5−アミノペント−2−エン酸デヒドロゲナーゼまたは5−アミノペント−2−エン酸アミンオキシダーゼであり、該1Dは2−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼであり、該1Eはグルタル酸セミアルデヒドレダクターゼであり、該1Fは5−ヒドロキシ吉草酸レダクターゼであり、該1Gは5−ヒドロキシペント−2−エン酸デヒドラターゼであり、該1Iは5−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、5−アミノペンタン酸デヒドロゲナーゼまたは5−アミノペンタン酸アミンオキシダーゼであり、該1Jは5−アミノペント−4−エン酸デアミナーゼであり、該1Kは5−ヒドロキシペント−2−エン酸レダクターゼであり、該1Lは5−ヒドロキシバレリル−CoAトランスフェラーゼまたは5−ヒドロキシバレリル−CoAシンテターゼであり、該1Mは5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドロゲナーゼであり、該1Nは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼであり、該1Oは2,4−ペンタジエノイル−CoAトランスフェラーゼ、2,4−ペンタジエノイル−CoAシンテターゼまたは2,4−ペンタジエノイル−CoAヒドロラーゼであり、該1Pは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAトランスフェラーゼまたは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼであり、該(wherein in)1Qは5−ヒドロキシバレリル−CoAデヒドラターゼ/デヒドロゲナーゼであり、該1Sはグルタリル−CoAレダクターゼであり、該1Tは2,4−ペンタジエン酸デカルボキシラーゼであり、該1Uは5−ヒドロキシペント−2−エン酸デカルボキシラーゼであり、該1Vは3−ブテン−1−オールデヒドラターゼであり、該1Wは5−ヒドロキシ吉草酸デカルボキシラーゼであり、該3Aは3−オキソペンタノイル−CoAチオラーゼまたは3−オキソペンタノイル−CoAシンターゼであり、該3Bは3−オキソペンタノイル−CoAレダクターゼであり、該3Cは3−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼであり、該3Dはペント−2−エノイル−CoAイソメラーゼであり、該3Eはペント−3−エノイル−CoAデヒドロゲナーゼであり、該3Fは2,4−ペンタジエノイル−CoAヒドロラーゼ、2,4−ペンタジエノイル−CoAトランスフェラーゼまたは2,4−ペンタジエノイル−CoAシンテターゼであり、該3Gはペント−2−エノイル−CoAデヒドロゲナーゼであり、該5Aは4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸アルドラーゼであり、該5Bは4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸デヒドラターゼであり、該5Cは2−オキソペンテン酸デカルボキシラーゼであり、該5Dは3−ブテン−1−アールレダクターゼであり、該5Eは3−ブテン−1−オールデヒドラターゼであり、該6Aは2,4−ペンタジエン酸レダクターゼ(酸還元)であり、該6Bはペンタ−2,4−ジエナールデカルボニラーゼであり、該6Cは2,4−ペンタジエノイル−CoAレダクターゼ(酸還元)であり、該6Dは2,4−ペンタジエノイル−CoAホスホトランスフェラーゼであり、該6Eは2,4−ペンタジエノイル−リン酸レダクターゼであり、該6Fは2,4−ペンタジエノイル−CoAヒドロラーゼ、2,4−ペンタジエノイル−CoAトランスフェラーゼまたは2,4−ペンタジエノイル−CoAシンテターゼであり、該6Hは2,4−ペンタジエン酸キナーゼであり、該7Aは3−ケトアシル−ACPシンターゼであり、該7Bはアセトアセチル−ACPレダクターゼであり、該7Cは3−ヒドロキシブチリル−ACPデヒドラターゼであり、該7Dはアセトアセチル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、該7Eはアセトアセチル−CoAヒドロラーゼ、アセトアセチル−CoAトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−CoAシンテターゼであり、該7Fはアセト酢酸レダクターゼ(酸還元)であり、該7Hはアセトアセチル−ACPチオエステラーゼであり、該7Iはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(CoA依存性,アルデヒド形成)であり、該7Jはアセトアセチル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、該7Kはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)であり、該7Lは3−ヒドロキシブチリル−ACPチオエステラーゼであり、該7Mは3−ヒドロキシブチリル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、該7Nは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、該7Oは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)であり、該7Pはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(ケトン還元)であり、該7Qはアセト酢酸レダクターゼ(ケトン還元)であり、該7Rは3−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ(ケトン還元)であり、該7Tはクロトニル−ACPチオエステラーゼであり、該7Uはクロトニル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、該7Vはクロトニル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、該7Wはクロトニル−CoA(アルコール形成)であり、該7Xは3−ヒドロキシブチリル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、該7Yは3−ヒドロキシブチリル−CoAヒドロラーゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼまたは3−ヒドロキシブチリル−CoAシンテターゼであり、該7Zは3−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、該7ABは3−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドラターゼであり、該7ACは3−ヒドロキシ酪酸デヒドラターゼであり、該7ADは3−ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドラターゼであり、該7AEはクロトニル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、該7AFはクロトニル−CoAヒドロラーゼ、クロトニル−CoAトランスフェラーゼまたはクロトニル−CoAシンテターゼであり、該7AGはクロトン酸レダクターゼであり、該7AHはクロトンアルデヒドレダクターゼであり、該7ASはアセトアセチル−CoAシンターゼであり、該12Aはクロチルアルコールキナーゼであり、該12Bは2−ブテニル−4−リン酸キナーゼであり、該12Cはブタジエンシンターゼであり、該12Dはクロチルアルコールジホスホキナーゼである非天然微生物体を提供する。
、Ralstonia metallidurans、Ralstonia pickettii、Rattus norvegicus、Rhizobium leguminosarum、Rhodobacter capsulates、Rhodobacter capsulatus、Rhodobacter sphaeroides、Rhodococcus opacus、Rhodococcus ruber、Rhodopseudomonas palustris、Rhodopseudomonas palustris CGA009、Rhodospirillum rubrum、Roseburia intestinalis L1−82、Roseburia inulinivorans、ロゼブリア属の一種A2−183、Roseiflexus castenholzii、Saccharomyces cerevisae、Salinispora arenicola、Salmonella enteric、Salmonella entericaの亜種arizonae serovar、Salmonella typhimurium、Salmonella typhimurium LT2、Schizosaccharomyces pombe、Selenomonas ruminantium、Serratia marcescens、Simmondsia chinensis、Solibacillus silvestris、Sordaria macrospora、Sporosarcina newyorkensis、Staphylococcus pseudintermedius、Streptococcus mutans、Streptococcus oligofermentans、Streptococcus pyogenes ATCC 10782、Streptomyces clavuligenus、Streptomyces coelicolor、Streptomyces griseus、Streptomyces griseusの亜種griseus NBRC 13350、Sulfolobus acidocalarius、スルフォロブス属の一種7株、Sulfolobus tokodaii、Sulfolobus tokodaii 7、Sulfurihydrogenibium subterraneum、Sulfurimonas denitrificans、Sus scrofa、Synechocystis str.PCC 6803、Syntrophus aciditrophicus、Thauera aromatic、Thauera aromatic、Thermoanaerobacter brockii HTD4、Thermocrinis albus、Thermoproteus neutrophilus、Thermotoga maritime、Thermus thermophilus、Thiobacillus denitrificans、Treponema denticola、Trichomonas vaginalis G3、Trypanosoma brucei、Tsukamurella paurometabola DSM 20162、コレラ菌、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus、Vitis vinifera、Yarrowia lipolytica、Yersinia intermedia ATCC 29909、Zea mays、Zoogloea ramigera、Zymomonas mobilis、Carthamus tinctorius、Cuphea hookeriana、Cuphea palustris、シアノセイス属の一種PCC 7425、Elizabethkingia meningoseptica、リングビア属の一種PCC 8106、Nodularia spumigena CCY9414、Nostoc azollae、Plasmodium falciparum、Prochlorococcus marinus、肺炎連鎖球菌、Streptococcus pyogenes ATCC 10782、Streptomyces avermitillis、Synechococcus elongatus、Synechococcus elongatus PCC7942、Thermomyces lanuginosus、Umbellularia californica、Arabidopsis thaliana col、Enterococcus faecalis、Mycoplasma pneumoniae M129、Populus alba、Populus tremula、Pueraria montana、黄色ブドウ球菌、ストレプトマイセス属の一種ACT−1、Thermotoga maritime MSB8、Streptomyces sp CL190、ストレプトマイセス属の一種KO−3988、Streptomyces cinnamonensis、Streptomyces anulatus、Nocardia brasiliensisが挙げられるとともに、本明細書に開示した他の例示的な種が、対応遺伝子の供給源生物体として利用可能である。しかしながら、現在、395種の微生物ゲノムならびにさまざまな酵母、真菌、植物および哺乳動物ゲノムなどを含む550種超について完全なゲノム配列が入手可能なことにより(これらの半数超はNCBIなどの公的データベースで入手可能である)、関連種または遠縁種における1つ以上の遺伝子(例えば、既知遺伝子のホモログ、オーソログ、パラログおよび非オーソロガス遺伝子置換など、ならびに生物体間での遺伝子改変の交換)について、必要とする2,4−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、1,3−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは3−ブテン−1−オールの生合成活性をコードしている遺伝子を同定することは常套的であり、当該技術分野でよく知られている。したがって、大腸菌などの具体的な生物体に関する本明細書に記載の2,4−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、1,3−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは3−ブテン−1−オールの生合成を可能にする代謝改変は、他の微生物、例えば、原核生物生物体および真核生物生物体に同様に容易に適用され得る。本明細書に示した教示および手引きに鑑みて、当業者には、ある生物体において例示した代謝改変が他の生物体に等しく適用され得ることがわかるであろう。
2CO2+4H2+n ADP+n Pi → CH3COOH+2H2O+n ATP
によって要約され得る。
2−アミノペンタノエート、2−オキソアジペートおよびグルタリル−CoAから2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オールおよびブタジエンを作製するための経路
2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オールおよびブタジエンまでのいくつかの経路を図1に示す。出発代謝産物としては、2−オキソアジペート、グルタリル−CoA、および5−アミノペンタノエートが挙げられる。これらの経路は、以下の酵素:2−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼ、5−アミノペンタン酸レダクターゼ、5−アミノペント−2−エン酸アミノトランスフェラーゼ、デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼ、2−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼ、グルタル酸セミアルデヒドレダクターゼ、5−ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼ、5−ヒドロキシペント−2−エン酸デヒドラターゼ、2−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼ、5−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼ、5−アミノペント−2−エン酸デアミナーゼ、5−ヒドロキシペント−2−エン酸レダクターゼ、5−ヒドロキシバレリル−CoAトランスフェラーゼおよび/またはシンテターゼ、5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドロゲナーゼ、5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼ、2,4−ペンタジエノイル−CoAトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAトランスフェラーゼまたはシンテターゼ、5−ヒドロキシバレリル−CoAデヒドラターゼ/デヒドロゲナーゼ、2−オキソアジピン酸デヒドロゲナーゼ、2−オキソアジピン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、2−オキソアジピン酸ギ酸リアーゼ、グルタリル−CoAレダクターゼ、2,4−ペンタジエン酸デカルボキシラーゼ、5−ヒドロキシペント−2−エン酸デカルボキシラーゼ、3−ブテン−1−オールデヒドラターゼおよび5−ヒドロキシ吉草酸デカルボキシラーゼのうちの1種類以上によって触媒される。
アセチル−CoAからグルタリル−CoAを作製するための経路
図2は、2分子のアセチル−CoAをグルタリル−CoAに変換させるためのカーボン・エフィシェント経路を示す。第1工程では、アセトアセチル−CoAが、β−ケトチオラーゼ酵素であるアセトアセチル−CoAチオラーゼによる2分子のアセチル−CoAの縮合によって形成される。択一的には、アセトアセチル−CoAは、マロニル−CoAとアセチル−CoAからアセトアセチル−CoAシンターゼによって形成され得る。次いで、アセトアセチル−CoAの3−ケト基が還元および脱水され、クロトニル−CoAが形成される。グルタリル−CoAは、クロトニル−CoAの還元的カルボキシル化により形成される。アセトアセチル−CoAのグルタリル−CoAへの変換のための酵素および遺伝子候補を実施例VIIにさらに詳細に記載する。
プロピオニル−CoAから2,4−ペンタジエノエートを作製するための経路
この実施例では、図3に示すプロピオニル−CoAを2,4−ペンタジエノエートに変換させるための経路を説明する。酵素としては:3−オキソペンタノイル−CoAチオラーゼまたはシンターゼ、3−オキソペンタノイル−CoAレダクターゼ、3−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、ペント−2−エノイル−CoAイソメラーゼ、ペント−3−エノイル−CoAデヒドロゲナーゼ、1種類以上の2,4−ペンタジエノイル−CoAヒドロラーゼ、トランスフェラーゼまたはシンテターゼおよびペント−2−エノイル−CoAデヒドロゲナーゼが挙げられる。
3−ヒドロキシプロピオニル−CoAから1,3−ブタンジオールを合成するための経路.
この実施例では、図4に示す3−ヒドロキシプロピオニル−CoAを1,3−ブタンジオールに変換させるための経路を説明する。酵素としては:3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAチオラーゼまたは3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンターゼ、3−オキソ−5−ヒドロキシペンタン酸デカルボキシラーゼ、3−オキソブタノールレダクターゼおよび1種類以上の3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAヒドロラーゼ、トランスフェラーゼまたはシンテターゼが挙げられる。
ピルベートおよびアセトアルデヒドからの1,3−ブタンジオール、3−ブテン−1−オールおよびブタジエンの形成のための経路.
この実施例では、ピルベートおよびアセトアルデヒドを1,3−ブタンジオール、3−ブテン−1−オールおよびブタジエンに変換させるための経路を説明する。該経路を図5に示す。該当する酵素としては:4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸アルドラーゼ、4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸デヒドラターゼ、2−オキソペンテン酸デカルボキシラーゼ、3−ブテン−1−アールレダクターゼ、3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ、4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸デカルボキシラーゼ、3−ヒドロキシブタナールレダクターゼ、4−ヒドロキシ−2−オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ、4−ヒドロキシ−2−オキソペンタン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)、3−ヒドロキシブチリル−CoAヒドロラーゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼまたは3−ヒドロキシブチリル−CoAシンテターゼ、3−ヒドロキシ酪酸レダクターゼおよび3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)が挙げられる。また、工程Eは化学的脱水によっても触媒され得る。
2,4−ペンタジエノエートまたは2,4−ペンタジエノイル−CoAをブタジエンに変換させるための経路.
図1および3は、2,4−ペンタジエノエートまたは2,4−ペンタジエノイル−CoAを共通の代謝前駆体から形成するための経路を示す。図6は、さらに2,4−ペンタジエノエートまたは2,4−ペンタジエノイル−CoAをブタジエンに変換させるための経路を示す。2,4−ペンタジエノエートはいくつかの択一的な経路によってブタジエンに変換される。経路の1つは、工程Gに示した直接脱炭酸である。択一的には、該酸部分がカルボン酸レダクターゼ酵素によってアルデヒドに還元される(工程A)。ペンタ−2,4−ジエナール中間体の脱カルボニルによりブタジエンが形成される(工程B)。工程HとEは、2,4−ペンタジエノエートが、まずキナーゼによって2,4−ペンタジエノイル−ホスフェートに活性化され、続いてリン酸レダクターゼによってペンタ−2,4−ジエナールに還元される択一的な経路を示す。2,4−ペンタジエノエートと2,4−ペンタジエノイル−CoAは、CoAトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼまたはシンテターゼによって相互変換される。2,4−ペンタジエノイル−CoAのその対応するアルデヒドへの還元は、アシル化性アルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒される(工程C)。択一的には、CoA部分が2,4−ペンタジエノイル−CoAホスホトランスフェラーゼによってホスフェートに交換される(工程D)。2,4−ペンタジエノイル−ホスフェートまたはペンタ−2,4−ジエナール中間体は、既述のように、さらにブタジエンに変換される。図6に示した反応の酵素および遺伝子候補を実施例VIIにさらに詳細に記載する。
図1〜6に示した反応の酵素候補
図1〜5に示したいくつかの反応はアルコールデヒドロゲナーゼ酵素によって触媒される。このような反応としては、図1の工程EとK、図2の工程B、図3の工程B、図4の工程Dおよび図5の工程DとGが挙げられる。例示的なアルコールデヒドロゲナーゼ酵素を以下にさらに詳細に記載する。
二元機能オキシドレダクターゼは、アシル−CoAをその対応するアルコールに変換させる。この活性を有する酵素が3−ヒドロキシブチリル−CoAの1,3−ブタンジオールへの変換に必要とされる(図5の工程L)。
1.2.1ファミリーのアシル−CoAレダクターゼは、アシル−CoAをその対応するアルデヒドに還元する。かかる変換は、グルタリル−CoAのグルタル酸セミアルデヒドへの(図1の工程S)、および3−ヒドロキシブチリル−CoAの3−ヒドロキシブチルアルデヒドへの(図5の工程I)還元を触媒するために必要とされる。いくつかのアシル−CoAレダクターゼ酵素が周知文献において報告されており、この工程の好適な候補となる。このようなものを以下に記載する。
2−オキソアジペートのグルタル酸セミアルデヒドへの還元的脱炭酸およびアシル化(図1の工程D)は、EC分類1.2のオキシドレダクターゼによって触媒される。同様の酵素が4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートの3−ヒドロキシブチリル−CoAへの変換に必要とされる(図5の工程H)。例示的な酵素は、2−ケト酸デヒドロゲナーゼファミリーおよび2−ケトグルタル酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ(OFOR)ファミリーにみられるものである。
ホスホン酸のその対応するアルデヒドへの還元は、EC分類1.2.1のオキシドレダクターゼまたはリン酸レダクターゼによって触媒される。図6の工程Eには、2,4−ペンタジエノイル−ホスフェートのその対応するアルデヒドへの還元のためにかかる酵素が必要とされる。この変換は、これまでに文献において特性評価されていない。例示的なホスホン酸レダクターゼ酵素としては、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.12)、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.11)アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ(EC 1.2.1.38)およびグルタミン酸−5−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.−)が挙げられる。アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ASD,EC 1.2.1.11)は、4−アスパルチルホスフェートのアスパラギン酸−4−セミアルデヒドへのNADPH依存性還元を触媒する。ASDは、アミノ酸の生合成に関与しており、最近では、抗菌薬の標的として研究されている(Hadfieldら,Biochemistry 40:14475−14483(2001))。大腸菌のASDの構造が解明され(Hadfieldら,J Mol.Biol.289:991−1002(1999))、該酵素は、代替基質β−3−メチルアスパルチルホスフェートを許容することが示されている(Shamesら,J Biol.Chem.259:15331−15339(1984))。インフルエンザ菌の該酵素は、活性部位における基質結合親和性を改変するための酵素操作研究の主題となっている(Blancoら,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.60:1388−1395(2004);Blancoら,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.60:1808−1815(2004))。他のASD候補は、Mycobacterium tuberculosis(Shafianiら,J Appl Microbiol 98:832−838(2005))、Methanococcus jannaschii(Faehnleら,J Mol.Biol.353:1055−1068(2005))、および感染性微生物であるコレラ菌およびピロリ菌(Mooreら,Protein Expr.Purif.25:189−194(2002))に見出されている。関連する酵素候補は、自然状態でアセチルグルタミルホスフェートをアセチルグルタミン酸−5−セミアルデヒドに還元し、S.cerevisiae(Pauwelsら,Eur.J Biochem.270:1014−1024(2003))、枯草菌(O’Reillyら,Microbiology 140(Pt 5):1023−1025(1994))、大腸菌(Parsotら,Gene.68:275−283(1988))および他の生物体にみられる酵素アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ(EC 1.2.1.38)である。大腸菌のさらなるリン酸レダクターゼ酵素としては、グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA(Branlantら,Eur.J.Biochem.150:61−66(1985)))およびグルタミン酸−5−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(proA(Smithら,J.Bacteriol.157:545−551(1984)))が挙げられる。Salmonella typhimurium(Mahanら,J Bacteriol.156:1249−1262(1983))およびCampylobacter jejuni(Louieら,Mol.Gen.Genet.240:29−35(1993))由来のグルタミン酸−5−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素をコードしている遺伝子が大腸菌においてクローニングされ、発現された。
酸のアルデヒドへの変換は熱力学的に有利でなく、典型的には高エネルギー補因子および多酵素工程が必要とされる。単独酵素による酸のアルデヒドへの直接変換は、1.2.1ファミリーの酸レダクターゼ酵素によって触媒される。このEC分類の酵素は、3−ヒドロキシブチレートの3−ヒドロキシブタナールへの(図5の工程5K)、および2,4−ペンタジエノエートのペンタ−2,4−ジエナールへの(図6の工程A)の変換に必要とされる。
図1のいくつかの変換、例えば、工程B、FおよびMはアルカンのアルケンへの酸化を伴うものである。工程BおよびFは、逆方向に作動するデヒドロゲナーゼまたはエン酸レダクターゼによって触媒される。工程Mは、5−ヒドロキシバレリル−CoAデヒドロゲナーゼ、アシル−CoAデヒドロゲナーゼまたはエン酸レダクターゼによって触媒される。図3の工程EとGは、それぞれ、ペント−3−エノイル−CoAまたはペント−2−エノイル−CoAの2,4−ペンタジエノイル−CoAへの酸化を伴うものである。例示的な酵素候補を以下に記載する。
EC分類1.4.1の酵素は、アミンのアルデヒドまたはケトンへの酸化的脱アミノ化を触媒する。このEC分類の酵素は、典型的には電子受容体としてNAD+、NADP+またはFADを使用し、反応は典型的には可逆的である。図1の工程C、HおよびIは、脱アミノ化性オキシドレダクターゼによって触媒され得る。酵素候補を以下に記載する。
EC分類1.4.3のアミンオキシダーゼ酵素は、アミノ基のその対応するアルデヒドまたはケトンへの酸化的脱アミノ化を触媒する。この分類の酵素は、電子受容体として酸素を利用し、アミン、O2および水をアルデヒドまたはケトン、アンモニアおよび過酸化水素に変換させる。L−アミノ酸オキシダーゼは、いくつかのL−アミノ酸のそのそれぞれの2−オキソ酸への酸化的脱アミノ化を触媒する。Streptococcus oligofermentansの該酵素は大腸菌において過剰発現された(Tongら,J Bacteriol 190:4716−21(2008))。他のアミンオキシダーゼ酵素、例えば、リシン−6−オキシダーゼ(EC 1.4.3.20)およびプトレシンオキシダーゼ(EC 1.4.3.10)は末端アミンに特異的である。リシン−6−オキシダーゼ酵素は、Marinomonas mediterraneaのlodA(Lucas−Elioら,J Bacteriol 188:2493−501(2006))およびPseudoalteromonas tunicataのalpP(Mai−Prochnowら,J Bacteriol 190:5493−501(2008))にコードされている。プトレシンオキシダーゼ酵素は、Kocuria roseaのpuo(Ishizukaら,J Gen Microbiol 139:425−32(1993))ならびにArabidopsis thalianaのATAO1(MollerおよびMcPherson,Plant J 13:781−91(1998))にコードされている。
2,4−ペンタジエノイル−CoAホスホトランスフェラーゼ活性を有する酵素が2,4−ペンタジエノイル−CAの2,4−ペンタジエノイル−ホスフェートへの変換に必要とされる(図6,工程D)。例示的なリン酸基転移性アシルトランスフェラーゼとしては、ホスホトランスアセチラーゼ(EC 2.3.1.8)およびホスホトランスブチリラーゼ(EC 2.3.1.19)が挙げられる。大腸菌由来のpta遺伝子には、アセチル−CoAをアセチル−ホスフェートに可逆的に変換させるホスホトランスアセチラーゼがコードされている(Suzuki,Biochim.Biophys.Acta 191:559−569(1969))。また、この酵素は基質としてプロピオニル−CoAを利用することもでき、該過程においてプロピオネートが形成される(Hesslingerら,Mol.Microbiol 27:477−492(1998))。プロピオニル−CoAに対して活性を示す他のリン酸アセチルトランスフェラーゼは、枯草菌(Radoら,Biochim.Biophys.Acta 321:114−125(1973))、Clostridium kluyveri(Stadtman,Methods Enzymol 1:596−599(1955))、およびThermotoga maritima(Bockら,J Bacteriol.181:1861−1867(1999))において見出されている。同様に、C.acetobutylicum由来のptb遺伝子には、ブチリル−CoAをブチリル−ホスフェートに可逆的に変換させる酵素ホスホトランスブチリラーゼがコードされている(Wiesenbornら,Appl Environ.Microbiol 55:317−322(1989);Walterら,Gene 134:107−111(1993))。さらなるptb遺伝子は、酪酸産生菌L2−50(Louisら,J.Bacteriol.186:2099−2106(2004))およびBacillus megaterium(Vazquezら,Curr.Microbiol 42:345−349(2001))において見出されている。
EC分類2.3.1のβ−ケトチオラーゼ酵素は、2つのアシル−CoA基質の縮合を触媒する。図2〜4のいくつかの変換にはβ−ケトチオラーゼ、が必要とされる(例えば、図2の工程A、図3の工程Aおよび図4の工程A)。
EC分類2.3.1のギ酸C−アシルトランスフェラーゼ酵素は、ケト酸のアシル化およびホルメートの同時放出を触媒する。かかる酵素は、図1(工程R)の2−オキソアジペートのグルタリル−CoAへの変換および図5の工程Hの4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートの3−ヒドロキシブチリル−CoAへの変換に適している。
3−オキソアシル−CoA生成物、例えば、アセトアセチル−CoA、3−オキソペンタノイル−CoA、3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAは、アシル−CoAおよびマロニル−CoA基質から3−オキソアシル−CoAシンターゼによって合成され得る(工程2A,3A,4A,7AS)。この分類の酵素は本質的に不可逆的な反応を触媒するため、3−オキソアシル−CoA中間体(アセトアセチル−CoAなど)から誘導される代謝産物、燃料または化学薬品を過剰生産させるための代謝操作用途に特に有用である。例えば、アセトアセチル−CoAシンターゼは、ブタノール(Lanら,PNAS USA(2012))およびポリ−(3−ヒドロキシブチレート)(Matsumotoら,Biosci Biotech Biochem,75:364−366(2011)を生合成する生物体において異種発現されている。アセトアセチル−CoAシンターゼ(EC 2.3.1.194)酵素(FhsA)は土壌細菌ストレプトマイセス属の一種CL190(ここで、これはメバロネート生合成に関与している)において特性評価されている(Okamuraら,PNAS USA 107:11265−70(2010))。他のアセトアセチル−CoAシンターゼ遺伝子はfhsAとの配列相同性により同定され得る。
アミノトランスフェラーゼはアミノ基をアルデヒドまたはケトンに可逆的に変換させる。アルデヒドを第1級アミンに変換するための例示的な酵素としては、リシン−6−アミノトランスフェラーゼ(EC 2.6.1.36)、5−アミノ吉草酸アミノトランスフェラーゼ(EC 2.6.1.48)、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼおよびジアミンアミノトランスフェラーゼ、例えばプトレシンアミノトランスフェラーゼ(EC 2.6.1.82および2.6.1.29)が挙げられる。このような酵素は図1の工程CおよびIの触媒に適している。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよび同様の酵素は、アミノ酸をその対応する2−ケト酸に変換させる。アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、2−オキソアジペートと2−アミノアジペートの相互変換に好適な候補である(図1の工程H)。
EC分類2.7.2のキナーゼまたはホスホトランスフェラーゼ酵素は、カルボン酸をホスホン酸に変換させるとともに1分子のATPの同時加水分解を伴う。2,4−ペンタジエン酸キナーゼ活性を有する酵素が図6の工程Hに必要とされる。例示的な酵素候補としては、酪酸キナーゼ(EC 2.7.2.7)、イソ酪酸キナーゼ(EC 2.7.2.14)、アスパルトキナーゼ(EC 2.7.2.4)、酢酸キナーゼ(EC 2.7.2.1)およびグリセリン酸キナーゼが挙げられる。酪酸キナーゼは、クロストリジウム属の種における酸生成(acidogenesis)の際のブチリル−ホスフェートのブチレートへの可逆的変換を触媒する(Caryら,Appl Environ Microbiol 56:1576−1583(1990))。Clostridium acetobutylicumの該酵素は、2種類のbuk遺伝子産物のいずれかにコードされている(Huangら,J Mol.Microbiol Biotechnol 2:33−38(2000))。他の酪酸キナーゼ酵素は、C.butyricumおよびC.tetanomorphum(Twarogら,J Bacteriol.86:112−117(1963))において見出されている。関連酵素であるThermotoga maritima由来のイソ酪酸キナーゼは大腸菌において発現され、結晶化された(Diaoら,J Bacteriol.191:2521−2529(2009);Diaoら,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.59:1100−1102(2003))。アスパルトキナーゼは、アスパルテートのATP依存性リン酸化を触媒し、いくつかのアミノ酸の合成に関与している。大腸菌のアスパルトキナーゼIII酵素は、lysCにコードされており、広い基質範囲を有し、基質特異性に関与している触媒性残基が解明されている(Kengら,Arch Biochem Biophys 335:73−81(1996))。また、大腸菌の2種類のさらなるキナーゼも酢酸キナーゼおよびγ−グルタミルキナーゼである。大腸菌の酢酸キナーゼは、ackAにコードされており(Skarstedtら,J.Biol.Chem.251:6775−6783(1976))、アセテートに加えてプロピオネートもリン酸化する(Hesslingerら,Mol.Microbiol 27:477−492(1998))。大腸菌のγ−グルタミルキナーゼは、proBにコードされており(Smithら,J.Bacteriol.157:545−551(1984))、グルタメートのγ炭酸基をリン酸化する。
2.8.3ファミリーの酵素は、ある分子から別の分子へのCoA部分の可逆的転移を触媒する。かかる変換は図1の工程L、PおよびO、図3の工程F、図4の工程B、図5の工程Jならびに図6の工程Fに必要とされる。いくつかのCoAトランスフェラーゼ酵素が周知文献において報告されており、これらの工程の好適な候補となる。このようなものを以下に記載する。
3.1.2ファミリーの酵素はアシル−CoA分子をその対応する酸に加水分解する。かかる変換は、図1の工程O、図3の工程F、図4の工程B、図5の工程Jおよび図6の工程Fに必要とされる。いくつかのかかる酵素が文献に記載されており、これらの工程の好適な候補となる。
EC分類4.1.1のデカルボキシラーゼ酵素は図1の工程A、D、TおよびU、図2の工程D、図4の工程C、図5の工程CおよびFならびに図6の工程Gを触媒するために必要とされる。
オレフィン形成デカルボキシラーゼ酵素は5−ヒドロキシバレレートの3−ブテン−1−オールへの変換を触媒する(図1の工程W)。末端オレフィン形成性脂肪酸デカルボキシラーゼは、ジェオトガリコッカス属の一種ATCC8456のoleT遺伝子産物にコードされている(Rudeら,AEM 77(5):1718−27(2011))。この最近見出された酵素は、シトクロムP450酵素ファミリーの構成員であり、脂肪酸のヒドロキシル化を触媒するP450sと類似している。oleTおよびホモログを以下の表に示す。さらなる脂肪酸デカルボキシラーゼ酵素はUS2011/0196180において知得される。
ペンタ−2,4−ジエナールのブタジエンへの変換はデカルボニラーゼによって触媒される(図6の工程B)。デカルボニラーゼ酵素は、植物、哺乳動物および細菌におけるアルカンの生合成の最終工程を触媒する(Dennisら,Arch.Biochem.Biophys.287:268−275(1991))。非酸化性デカルボニラーゼはアルデヒドをアルカンに変換し、同時にCOの放出を伴う。例示的なデカルボニラーゼ酵素としては、オクタデカナールデカルボニラーゼ(EC 4.1.99.5)、ステロールデサチュラーゼおよび脂肪アルデヒドデカルボニラーゼが挙げられる。コバルト−ポルフィリン含有デカルボニラーゼが藻類Botryococcus brauniiにおいて精製され、特性評価された;しかしながら、この活性と関連している遺伝子はこれまでにない(Dennisら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 89:5306−5310(1992))。また、Pisum sativum由来の銅含有デカルボニラーゼも精製され、特性評価された(Schneider−Belhaddadら,Arch.Biochem.Biophys.377:341−349(2000))。Arabidopsis thalianaのCER1遺伝子は、エピクチクラワックスの形成に関与している脂肪酸デカルボニラーゼをコードしている(US 6,437,218)。さらなる脂肪酸デカルボニラーゼは、Medicago truncatula、Vitis viniferaおよびOryza sativaにおいて見出されている(米国特許出願公開第2009/0061493号)。
ピルベートとアセトアルデヒドの4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートへの縮合(図5の工程A)は4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸アルドラーゼ(EC 4.1.3.39)によって触媒される。この酵素は、フェノール、クレゾールおよびカテコールの分解経路に関与している。大腸菌の該酵素は、mhpEにコードされており、受容体としてのアセトアルデヒドに高度に特異的であるが、供与体として代替基質2−ケトブチレートまたはフェニルピルベートを許容する(Pollardら,Appl Environ Microbiol 64:4093−4094(1998))。同様の酵素がPseudomonas putidaのcmtGおよびtodH遺伝子にコードされている(Lauら,Gene 146:7−13(1994);Eaton,J Bacteriol.178:1351−1362(1996))。シュードモナス属のCF600では、この酵素はdmpFGにコードされた二元機能アルドラーゼ−デヒドロゲナーゼヘテロ二量体の一部である(Manjasettyら,Acta Crystallogr.D.Biol Crystallogr.57:582−585(2001))。該デヒドロゲナーゼ機能性はアセトアルデヒドとアセチル−CoAを相互変換させ、一部の細胞に対して毒性であるアセトアルデヒドの細胞内濃度の低下という利点をもたらす。同様のアルドラーゼ−デヒドロゲナーゼ複合体がBurkholderia xenovoransのBphIJにコードされている(Bakerら,Biochem 48:6551−8(2009))。
水の除去による二重結合の形成は4.2.1酵素ファミリーのデヒドラターゼ酵素によって触媒される。ヒドラターゼ酵素は場合によっては可逆性であり、脱水も触媒する。デヒドラターゼ酵素は場合によっては可逆性であり、水和も触媒する。所与の基質からの水の除去は、図1の工程G、NおよびV、図2の工程C、図3の工程Cおよび図5の工程BとEに必要とされる。いくつかのヒドラターゼおよびデヒドラターゼ酵素が文献に記載されており、これらの工程の好適な候補となる。
図1の工程Jでは、EC分類4.3.1のアンモニアリアーゼが、5−アミノペン−2−エノエートの2,4−ペンタジエノエートへの脱アミノ化を触媒するために必要とされる。例示的な酵素はアスパルターゼおよび3−メチルアスパルターゼである。アスパルターゼ(EC 4.3.1.1)は、アスパルテートのフマレートへの脱アミノ化を触媒し、広く特性評価されている(Viola,Adv Enzym Relat Areas Mol Biol,74:295−341(2000))。大腸菌の該酵素は、さまざまな代替基質、例えば、アスパラギン酸フェニルメチルエステル、アスパラギン、ベンジル−アスパルテートおよびマレートに対して活性である(Maら,Ann NY Acad Sci,672:60−65(1992))。また、この酵素に対して基質特異性を改変するために指向性進化が使用された(Asanoら,Biomol Eng 22:95−101(2005))。aspAにコードされた大腸菌のアスパルターゼの結晶構造が解明されている(Shiら,Biochem,36:9136−9144(1997))。また、アスパルターゼ機能性を有する酵素は、インフルエンザ菌(Sjostromら,Biochim.Biophys.Acta 1324:182−190(1997))、Pseudomonas fluorescens(Takagiら,J.Biochem.96:545−552(1984))、枯草菌(Sjostromら,Biochim Biophys Acta 1324:182−190(1997))およびSerratia marcescens(Takagiら,J Bacteriol,161:1−6(1985))においても特性評価されている。3−メチルアスパルターゼは、トレオ−3−メチルアスパルテート(asparatate)のメサコネートへの脱アミノ化を触媒する。Clostridium tetanomorphum由来の3−メチルアスパルターゼは大腸菌においてクローニングされ、機能発現されており、結晶化されている(Asuncionら,Acta Cryst D Biol Crystallog,57:731−733(2001);Asuncionら,J Biol Chem.277:8306−8311(2002);Bottingら,Biochem 27:2953−2955(1988);Godaら,Biochem 31:10747−10756(1992))。Citrobacter amalonaticusでは、この酵素はBAA28709にコードされている(Katoら,Arch.Microbiol 168:457−463(1997))。また、大腸菌YG1002由来の3−メチルアスパルターゼも結晶化されている(Asanoら,FEMS Microbiol Lett.118:255−258(1994))が、該タンパク質の配列はGenBankなどの公的データベースには示されていない。配列相同性を用いて、さらなる候補遺伝子、例えば、C.tetaniのCTC_02563および大腸菌O157:H7のECs0761が特定され得る。
いくつかの特性評価された酵素は、エノイル−CoA基質の二重結合を2位から3位にシフトさせる。かかる変換は図3の工程Dに必要とされる。例示的な酵素としては、4−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドラターゼ/ビニルアセチル−CoAδ−イソメラーゼ(EC 5.3.3.3)、δ−3,δ−2−エノイル−CoAイソメラーゼ(EC 5.3.3.8)および脂肪酸酸化複合体が挙げられる。4−ヒドロキシブチリル(butyrul)−CoAデヒドラターゼ酵素は、4−ヒドロキシブチリル−CoAのクロトニル−CoAへの可逆的変換を触媒する。このような酵素は二元機能であり、4−ヒドロキシブチリル−CoAのビニルアセチル−CoAへの脱水、またビニルアセチル−CoAとクロトニル−CoAの異性化の両方を触媒する。C.aminobutyriumおよびC.kluyveri由来の4−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドラターゼ酵素が精製され、特性評価され、N末端の配列が決定された(Scherfら,Arch.Microbiol 161:239−245(1994);ScherfおよびBuckel,Eur.J Biochem.215:421−429(1993))。C.kluyveriの酵素は、abfDにコードされており、大腸菌においてクローニングされ、配列決定され、発現された(Gerhardtら,Arch.Microbiol 174:189−199(2000))。Porphyromonas gingivalis ATCC 33277由来のabfD遺伝子産物は、クロストリジウム属の遺伝子産物との配列相同性により近縁である。4−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドラターゼ/イソメラーゼ活性はMetallosphaera sedulaにおいても検出され、おそらくMsed_1220遺伝子と関連している(Bergら,Science 318(5857):1782−6(2007)。また、δ異性化反応は脂肪酸酸化複合体によって触媒される。大腸菌では、fadJおよびfadB遺伝子産物が、それぞれ、好気性条件下および嫌気性条件下でシス−3−エノイル−CoA分子をトランス−2−エノイル−CoA分子に変換させる(Campbellら,Mol Micro 47(3):793−805(2003))。Cucumis sativusのペルオキシソームから単離された単機能性δ−イソメラーゼは、シス−およびトランス−3−エノイル−CoAのどちらのトランス−2−エノイル−CoAへの可逆的変換も触媒する(Engelandら,Eur J Biochem,196(3):699−705(1991)。この酵素と関連している遺伝子はこれまでに同定されていない。また、Cucumis sativus由来のいくつかの多元機能タンパク質(MFP)、例えば、MFP−aの遺伝子産物もこの活性を触媒する(Preisig−Mullerら,J Biol Chem 269:20475−81(1994))。
アシル−CoA基質のその酸生成物への変換は6.2.1酵素ファミリーのCoA酸−チオールリガーゼまたはCoAシンテターゼによって触媒され得、該酵素のうちいくつかは可逆性である。図1〜6に示したいくつかの反応は酸−チオールリガーゼ酵素によって触媒される。このような反応としては、図1の工程L、PおよびO、図3の工程F、図4の工程B、図5の工程Jならびに図6の工程Fが挙げられる。CoA酸−チオールリガーゼ活性またはCoAシンテターゼ活性を触媒するいくつかの酵素が文献に記載されており、これらの工程の好適な候補となる。
図1の工程Qでは、5−ヒドロキシバレリル−CoAの2,4−ペンタジエノイル−CoAへの変換が、二元機能酵素5−ヒドロキシバレリル−CoAデヒドラターゼ/デヒドラターゼによって触媒される。Clostridium aminovalericumによる5−アミノバレレート発酵に関与しているため、この酵素が精製され、特性評価され、結晶化された(Eikmannsら,Proteins:Struct Fun Gen 19:269−271(1994)、EikmannsおよびBuckel,Eur J Biochem,197:661−668(1991))。そのタンパク質配列は既知であるが、これまでにGenBank識別番号は割り当てられていない。類似したタンパク質配列を有するホモログを以下の表に示す。
1,3−ブタンジオールおよび3−ブテン−1−オールのブタジエンへの化学的脱水
アルコールは、適切な条件下での適当な脱水触媒との反応によりオレフィンに変換され得る。ブタノールおよびペンタノールなどのアルコールをオレフィンに変換させる典型的な脱水触媒としては、種々の酸処理および未処理のアルミナ(例えば、γ−アルミナ)ならびにシリカ触媒およびクレイ、例えば、ゼオライト(例えば、β−型ゼオライト、ZSM−5またはY−型ゼオライト、フッ化物処理β−ゼオライト触媒、フッ化物処理クレイ触媒など)、スルホン酸樹脂(例えば、スルホン化スチレン系樹脂(Amberlyst(登録商標)15)など)、強酸(リン酸および硫酸など)、ルイス酸(三フッ化ホウ素および三塩化アルミニウムなど)、ならびに多くの異なる型の金属塩、例えば金属酸化物(例えば、酸化ジルコニウムまたはに酸化チタン)および金属塩化物(例えば、Latshaw B E,Dehydration of Isobutanol to Isobutylene in a Slurry Reactor,Department of Energy Topical Report,February 1994)が挙げられる。
シンガスからの還元性対応物の抽出のための例示的なヒドロゲナーゼおよびCOデヒドロゲナーゼ酵素ならびに例示的な還元的TCA回路酵素
本発明の非天然微生物体に有用な還元的TCA回路の酵素としては、ATP−クエン酸リアーゼおよび3種類のCO2固定酵素:イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼのうちの1種類以上が挙げられる。ATP−クエン酸リアーゼまたはクエン酸リアーゼおよびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼの存在は、生物体における活発な還元的TCA回路の存在を示す。還元的TCA回路の各工程の酵素を以下に示す。
COおよび嫌気性培養物の取り扱い方法
この実施例では、COおよび嫌気性培養物の取り扱いに使用される方法を説明する。
CO酸化(CODH)アッセイ
この実施例では、CO酸化(COデヒドロゲナーゼ;CODH)を測定するためのアッセイ方法を説明する。
大腸菌のCO耐容性実験およびCO濃度アッセイ(ミオグロビンアッセイ)
この実施例では、大腸菌の高濃度のCOに対する耐容性を説明する。
1,3−ブタンジオール、プロピレンおよびクロチルアルコールまでの経路
1,3−ブタンジオール、プロピレンおよびクロチルアルコールまでの経路を図7に示す。これらの経路は、マロニル−ACPがアセチル−CoAまたはアセチル−ACPと縮合し、アセトアセチル−ACPが形成される脂肪酸生合成の開始により開始され得る(工程A)。第2工程は、アセトアセチル−ACPの3−ヒドロキシブチリル−ACPへの還元を伴う。クロトニル−ACPへの脱水およびさらなる還元後、ブチリル−ACPが形成される。鎖伸長が典型的には長鎖アシル鎖が形成されるまでのマロニル−ACPのさらなる付加に伴って継続され、次いで、チオエステラーゼによって遊離C16脂肪酸に加水分解される。細菌の脂肪酸合成系(FAS II)では各工程で個別の(discreet)タンパク質が使用されるが、真菌および哺乳動物の脂肪酸合成系(FAS I)では複合体の多元機能タンパク質が使用される。該経路には、C3およびC4生成物プロピレン、1,3−ブタンジオールおよびクロチルアルコールの生成のために脂肪酸生合成の1種類以上の酵素が使用される。
図7に示したいくつかの反応は、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素によって触媒される。このような反応としては工程B、G、P、Q、R、S、AAおよびAHが挙げられる。工程G、P、Q、R、S、AAおよびAHを触媒するための例示的なアルコールデヒドロゲナーゼ酵素は実施例VIIにおいて上記に記載した。工程Bの触媒に適した酵素候補を以下に記載する。
アシル−ACPのその対応するアルデヒドへの還元はアシル−ACPレダクターゼ(AAR)によって触媒される。かかる変換を図7の工程J、MおよびUに示す。好適な酵素候補としては、Synechococcus elongatus PCC7942のorf1594遺伝子産物およびそのホモログが挙げられる(Schirmerら,Science、329:559−62(2010))。S.elongates PCC7942のアシル−ACPレダクターゼは、藍色細菌生物体の大部分において保存されているようであるオペロン内でアルデヒドデカルボニラーゼと共発現される。この酵素は、大腸菌において該アルデヒドデカルボニラーゼとともに発現され、アルカン生成能を付与した。また、P.marinusのAARも大腸菌においてクローニングされ、デカルボニラーゼとともにアルカン生成を示した(米国特許出願公開第2011/0207203号)。
図7のいくつかの変換はアルケンのアルカンへの還元を伴うものである。工程AMおよびANでは、エノイル−CoAがその対応するアシル−CoAに還元される。このような反応を触媒するための酵素候補は実施例VIIにおいて先に報告した。工程ALは、ブチリル−ACPレダクターゼによって触媒されるクロトニル−ACPのブチリル−ACPへの還元を示す。この工程に好適な酵素候補は本明細書に記載している。
図7の工程Aでは、アセトアセチル−ACPがマロニル−ACPとアセチル−CoAまたはアセチル−ACPのいずれかとから形成される。この反応は、EC分類2.3.1のアシル−ACP C−アシルトランスフェラーゼによって触媒される。マロニル−ACPとアセチル−CoAの縮合はβ−ケトアシル−ACPシンターゼ(KAS,EC 2.3.1.180)によって触媒される。大腸菌は、fabB、fabFおよびfabHにコードされた3種類のKAS酵素を有する。FabH(KAS III)は、大腸菌における脂肪酸生合成の開始の枢要な酵素であり、アセトアセチル−ACPの形成に選択的である。FabBとFabFは、マロニル−ACPとアシル−ACP基質との縮合を触媒し、主に脂肪酸の伸長において機能するが、アセチル−ACPと反応することもでき、それにより脂肪酸の開始に関与する。例えば、枯草菌のKAS酵素はFabHと類似しているが選択性は低く、分枝状アシル−CoA基質を許容する(Choiら,J Bacteriol 182:365−70(2000))。
ACP部分のCoAでの交換はEC分類2.3.1の酵素によって触媒される。この反応を図7の工程D、X、AEおよびAIに示す。また、アセチル−CoAのアセチル−ACPへの活性化(図7の工程A)はCoA:ACPアシルトランスフェラーゼによっても触媒される。CoA−ACPアシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素としては、アセチル−CoA:ACPトランスアシラーゼ(EC 2.3.1.38)およびマロニル−CoA:ACPトランスアシラーゼ(EC 2.3.1.39)が挙げられる。
図7の工程A、B、CおよびALは、脂肪酸シンターゼまたは脂肪アシル−CoAシンターゼ、多コピーの1種類以上のサブユニットで構成された多元機能酵素複合体によって総合的に触媒され得る。Saccharomyces cerevisiaeの脂肪酸シンターゼは、脂肪酸合成に必要とされるすべての反応:活性化、プライミング、伸長および終結を一緒になって触媒する2つの多元機能サブユニットFAS1とFAS2で構成された12量体である(Lomakinら,Cell 129:319−32(2007))。この酵素複合体は、アセチル−CoAとマロニル−CoAからの長鎖脂肪酸の形成を触媒する。真核生物のFAS系で有利に生成されるのはパルミチン酸(C16)である。同様の脂肪酸シンターゼ複合体がCandida parapsilosisおよびThermomyces lanuginosusにおいて見出されている(Nguyenら,PLoS One 22:e8421(2009);Jenniら,Science 316:254−61(2007))。また、Mycobacterium tuberculosisおよび哺乳動物(ホモサピエンスなど)の多元機能Fas酵素も好適な候補である(FernandesおよびKolattukudy,Gene 170:95−99(1996)ならびにSmithら,Prog Lipid Res 42:289−317(2003))。
アシル−ACPチオエステラーゼ酵素はアシル−ACPをその対応する酸に変換させる。かかる変換は図7の工程H、L、TおよびAPに必要とされる。例示的な酵素としては、Arabidopsis thalianaのFatAおよびFatBアイソフォームが挙げられる(Salasら,Arch Biochem Biophys 403:25−34(2002))。この2つのタンパク質の活性は炭素鎖長によって異なり、FatAはオレイル−ACPを好み、FatBはパルミトイル−ACPを好む(3.1.2.14参照)。異なる鎖長特異性を有するいくつかのチオエステラーゼがWO2008/113041に示されており、以下の表に含めている[該特許の126頁の表2A参照]。例えば、大腸菌における植物性中鎖チオエステラーゼ(Umbellularia californica由来のFatBなど)の発現により高レベルの中鎖脂肪酸、主にラウレート(C12:0)の蓄積がもたらされることが以前に示されている。同様に、大腸菌におけるCuphea palustris FatB1のチオエステラーゼの発現によりC8−10:0アシル−ACPの蓄積がもたらされた(Deheshら,Plant Physiol 110:203−10(1996))。同様に、Carthamus tinctoriusのチオエステラーゼでは、大腸菌において発現させると、C18:1鎖終結および遊離脂肪酸としての放出の>50倍の上昇がもたらされる(Knutzonら,Plant Physiol 100:1751−58(1992))。また、アシル−ACPチオエステラーゼの基質特異性の改変方法も当該技術分野で知られている(例えば、EP1605048)。
実施例VIIに記載のデカルボニラーゼ酵素候補もこの場合に該当する。図1〜7の脱カルボニル反応の触媒に適したさらなる酵素候補としては、Synechococcus elongatus PCC7942のorf1593遺伝子産物およびそのホモログが挙げられる。(米国特許出願公開第2011/0207203号)。
図7のいくつかの反応、例えば工程C、AB、ACおよびADは脱水反応を示す。実施例VIIに記載の候補ヒドロ−リアーゼ酵素もこの場合に適用可能である。オレイン酸ヒドラターゼ酵素は、図1〜7のすべての脱水反応、特に3−ブテン−1−オールをブタジエンに脱水を触媒するのに適用可能である。オレイン酸ヒドラターゼ酵素は、非活性化型アルケンのその対応するアルコールへの可逆的水和を触媒する。このような酵素は、WO2011076691に示唆されているように、さらなる好適な候補である。Elizabethkingia meningosepticaおよびStreptococcus pyogenes由来のオレイン酸ヒドラターゼが特性評価されている(WO2008/119735)。例としては以下のタンパク質が挙げられる。
クロチルアルコールからのブタジエンの化学的作製
クロチルアルコールをブタジエンに変換するための典型的なプロセスでは、クロチルアルコールを無希釈または溶媒中のいずれかで、および蒸気の存在下または非存在下のいずれかで、40〜400℃の範囲の温度まで加熱した固形の無機、有機または金属含有脱水触媒上を反応槽または管の内部で通過させて水の脱離とブタジエンのガスとしての放出をもたらし、これを凝縮させ(ブタジエンの沸点=−4.4℃)、さらなる加工、保存または使用のためのレザーバ内に収集する。典型的な触媒としては、モリブデン酸ビスマス、ホスフェート−リン酸、酸化セリウム、カオリン−酸化鉄、カオリン−リン酸、シリカ−アルミナ、およびアルミナが挙げられ得る。典型的なプロセス処理量は0.1〜20,000kg/時間の範囲である。典型的な溶媒はトルエン、ヘプタン、オクタン、エチルベンゼンおよびキシレンである。
クロチルアルコールからのブタジエンの生成のための酵素的経路
この実施例では、クロチルアルコールをブタジエンに変換させるための酵素的経路を説明する。2つの経路を図12に示す。一方の経路では、クロチルアルコールがクロチルアルコールキナーゼによって2−ブテニル−4−ホスフェートにリン酸化される(工程A)。2−ブテニル−4−ホスフェート中間体が2−ブテニル−4−ジホスフェートに再度リン酸化される(工程B)。ブタジエンシンターゼ酵素は2−ブテニル−4−ジホスフェートのブタジエンへのの変換を触媒する(工程C)。かかるブタジエンシンターゼは、リン酸リアーゼ酵素(イソプレンシンターゼなど)から本明細書に記載の指向性進化などの方法を用いて誘導されたものであり得る。択一的な経路では、クロチルアルコールがジホスホキナーゼによって直接2−ブテニル−4−ジホスフェートに変換される(工程D)。工程A〜Dの酵素候補は以下に示している。
クロチルアルコールキナーゼ酵素はクロチルアルコールのヒドロキシル基へのリン酸基の転移を触媒する。後述する酵素は、自然状態でかかる活性を有するか、またはこの活性を示すように操作され得るものである。アルコール基へのリン酸基の転移を触媒するキナーゼはEC 2.7.1酵素分類の構成員である。以下の表に、EC 2.7.1酵素分類のいくつかの有用なキナーゼ酵素を示す。
2−ブテニル−4−リン酸キナーゼ酵素は、2−ブテニル−4−ホスフェートのリン酸基へのリン酸基の転移を触媒する。後述する酵素は、自然状態でかかる活性を有するか、またはこの活性を示すように操作され得るものである。別のリン酸基へのリン酸基の転移を触媒するキナーゼはEC 2.7.4酵素分類の構成員である。以下の表に、EC 2.7.4酵素分類のいくつかの有用なキナーゼ酵素を示す。
ブタジエンシンターゼは2−ブテニル−4−ジホスフェートの1,3−ブタジエンの変換を触媒する。後述する酵素は、自然状態でかかる活性を有するか、またはこの活性を示すように操作され得るものである。ホスフェートに対して作用する炭素−酸素リアーゼが、EC 4.2.3酵素分類において見出されている。以下の表に、EC分類4.2.3のいくつかの有用な酵素を示す。
クロチルアルコールジホスホキナーゼ酵素は、クロチルアルコールのヒドロキシル基への二リン酸基の転移を触媒する。後述する酵素は、自然状態でかかる活性を有するか、またはこの活性を示すように操作され得るものである。二リン酸基の転移を触媒するキナーゼはEC 2.7.6酵素分類の構成員である。以下の表に、EC 2.7.6酵素分類のいくつかの有用なキナーゼ酵素を示す。
(項目1)
1,3−ブタンジオールを生成するのに充分な量で発現される1,3−ブタンジオール経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含む1,3−ブタンジオール経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、上記1,3−ブタンジオール経路は:
(33)7AS,7P,7Nおよび7AA;
(1)4A,4B,4Cおよび4D;
(2)5A,5H,5J,5Kおよび5G;
(3)5A,5H,5Iおよび5G;
(4)5A,5Hおよび5L;
(5)5A,5Fおよび5G;
(6)7A,7D,7E,7F,7Gおよび7S;
(7)7A,7D,7I,7Gおよび7S;
(8)7A,7D,7K,および7S;
(9)7A,7H,7F,7Gおよび7S;
(10)7A,7J,7Gおよび7S;
(11)7A,7J,7Rおよび7AA;
(12)7A,7H,7F,7Rおよび7AA;
(13)7A,7H,7Q,7Zおよび7AA;
(14)7A,7D,7I,7Rおよび7AA;
(15)7A,7D,7E,7F,7Rおよび7AA;
(16)7A,7D,7E,7Q,7Zおよび7AA;
(17)7A,7D,7P,7Nおよび7AA;
(18)7A,7D,7P,7Y,7Zおよび7AA;
(19)7A,7B,7Mおよび7AA;
(20)7A,7B,7L,7Zおよび7AA;
(21)7A,7B,7X,7Nおよび7AA;
(22)7A,7B,7X,7Y,7Zおよび7AA;
(23)7A,7D,7Pおよび7O;
(24)7A,7B,7Xおよび7O;
(25)7A,7D,7E,7F,7R,7AA;
(26)7A,7D,7E,7F,7G,7S;
(27)7AS,7E,7F,7Gおよび7S;
(28)7AS,7I,7Gおよび7S;
(29)7AS,7K,および7S;
(30)7AS,7I,7Rおよび7AA;
(31)7AS,7E,7F,7Rおよび7AA;
(32)7AS,7E,7Q,7Zおよび7AA;
(34)7AS,7P,7Y,7Zおよび7AA;
(35)7AS,7Pおよび7O;
(36)7AS,7E,7F,7R,および7AA;ならびに
(37)7AS,7E,7F,7G,および7S
から選択される経路を含み、
上記4Aは3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAチオラーゼまたは3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンターゼであり、上記4Bは3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAヒドロラーゼ、3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAトランスフェラーゼまたは3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼであり、上記4Cは3−オキソ−5−ヒドロキシペンタン酸デカルボキシラーゼであり、上記4Dは3−オキソブタノールレダクターゼであり、上記5Aは4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸アルドラーゼであり、上記5Fは4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸デカルボキシラーゼであり、上記5Gは3−ヒドロキシブタナールレダクターゼであり、上記5Hは4−ヒドロキシ−2−オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ、4−ヒドロキシ−2−オキソペンタン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼまたは4−ヒドロキシ−2−オキソペンタン酸ギ酸リアーゼであり、上記5Iは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記5Jは3−ヒドロキシブチリル−CoAヒドロラーゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼまたは3−ヒドロキシブチリル−CoAシンテターゼであり、上記5Kは3−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、上記5Lは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)であり、上記7Aは3−ケトアシル−ACPシンターゼであり、上記7Bはアセトアセチル−ACPレダクターゼであり、上記7Dはアセトアセチル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、上記7Eはアセトアセチル−CoAヒドロラーゼ、アセトアセチル−CoAトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−CoAシンテターゼであり、上記7Fはアセト酢酸レダクターゼ(酸還元)であり、上記7Gは3−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ(アルデヒド還元)であり、上記7Hはアセトアセチル−ACPチオエステラーゼであり、上記7Iはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(CoA依存性、アルデヒド形成)であり、上記7Jはアセトアセチル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記7Kはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)であり、上記7Lは3−ヒドロキシブチリル−ACPチオエステラーゼであり、上記7Mは3−ヒドロキシブチリル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記7Nは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記7Oは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)であり、上記7Pはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(ケトン還元)であり、上記7Qはアセト酢酸レダクターゼ(ケトン還元)であり、上記7Rは3−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ(ケトン還元)であり、上記7Sは4−ヒドロキシ−2−ブタノンレダクターゼであり、上記7Xは3−ヒドロキシブチリル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、上記7Yは3−ヒドロキシブチリル−CoAヒドロラーゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼまたは3−ヒドロキシブチリル−CoAシンテターゼであり、上記7Zは3−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、上記7AAは3−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼであり、上記7ASはアセトアセチル−CoAシンターゼである、
非天然微生物体。
(項目2)
上記微生物体が、各々が1,3−ブタンジオール経路の酵素をコードしている2、3、4または5種類の外因性核酸を含むものである、項目1に記載の非天然微生物体。
(項目3)
上記微生物体が、(1)〜(37)から選択される経路のうちの少なくとも1つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目2に記載の非天然微生物体。
(項目4)
上記少なくとも1種類の外因性核酸が異種核酸である、項目1に記載の非天然微生物体。
(項目5)
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、項目1に記載の非天然微生物体。
(項目6)
さらに:
(i)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも1種類の外因性核酸がATP−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−CoAシンテターゼ、シトリル−CoAリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的TCA経路;
(ii)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも1種類の外因性核酸がピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼおよびH2ヒドロゲナーゼから選択される、還元的TCA経路;または
(iii)COデヒドロゲナーゼ、H2ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸
を含む、項目1に記載の非天然微生物体。
(項目7)
(i)を含む上記微生物体が、さらに、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目6に記載の非天然微生物体。
(項目8)
(ii)を含む上記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目6に記載の非天然微生物体。
(項目9)
(i)を含む上記微生物体が、ATP−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている3種類の外因性核酸を含むものである;
(ii)を含む上記微生物体が、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ;ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ;COデヒドロゲナーゼ;およびH2ヒドロゲナーゼをコードしている4種類の外因性核酸を含むものである;または
(iii)を含む上記微生物体が、COデヒドロゲナーゼおよびH2ヒドロゲナーゼをコードしている2種類の外因性核酸を含むものである、
項目6に記載の非天然微生物体。
(項目10)
項目1〜9のいずれか1項に記載の非天然微生物体を、1,3−ブタンジオールが生成される条件下で上記生成に充分な期間、培養することを含む、1,3−ブタンジオールを生成するための方法。
(項目11)
2,4−ペンタジエノエートを生成するのに充分な量で発現される2,4−ペンタジエノエート経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含む2,4−ペンタジエノエート経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、上記2,4−ペンタジエノエート経路は:
(1)1D,1I,1B,1C,1Kおよび1G;
(2)1D,1E,1Fおよび1G;
(3)1D,1E,1L,1M,1Pおよび1G;
(4)1D,1I,1Bおよび1J;
(5)1D,1I,1B,1C,1K,1P,1Nおよび1O;
(6)1D,1E,1F,1P,1Nおよび1O;
(7)1D,1E,1L,1M,1Nおよび1O;
(8)1D,1E,1L,1Qおよび1O;
(9)1S,1I,1B,1C,1Kおよび1G;
(10)1S,1E,1Fおよび1G;
(11)1S,1I,1Bおよび1J;
(12)1S,1I,1B,1C,1K,1P,1Nおよび1O;
(13)1S,1E,1F,1P,1Nおよび1O;
(14)1S,1E,1L,1M,1Nおよび1O;
(15)1S,1E,1L,1Qおよび1O;
(16)1B,1C,1Kおよび1G;
(17)1I,1E,1Fおよび1G;
(18)1I,1E,1L,1M,1Pおよび1G;
(19)1Bおよび1J;
(20)1I,1E,1F,1P,1Nおよび1O;
(21)1I,1E,1L,1M,1Nおよび1O;
(22)1I,1E,1L,1Qおよび1O;
(23)3A,3B,3C,3D,3Eおよび3F;ならびに
(24)3A,3B,3C,3Gおよび3F
から選択される経路を含み、
上記1Bは5−アミノペンタン酸レダクターゼであり、上記1Cは5−アミノペント−2−エン酸アミノトランスフェラーゼ、5−アミノペント−2−エン酸デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼであり、上記1Dは2−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼであり、上記1Eはグルタル酸セミアルデヒドレダクターゼであり、上記1Fは5−ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼであり、上記1Gは5−ヒドロキシペント−2−エン酸デヒドラターゼであり、上記1Iは5−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、5−アミノペンタン酸デヒドロゲナーゼまたは5−アミノペンタン酸アミンオキシダーゼであり、上記1Jは5−アミノペント−2−エン酸デアミナーゼであり、上記1Kは5−ヒドロキシペント−2−エン酸レダクターゼであり、上記1Lは5−ヒドロキシバレリル−CoAトランスフェラーゼまたは5−ヒドロキシバレリル−CoAシンテターゼであり、上記1Mは5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドロゲナーゼであり、上記1Nは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼであり、上記1Oは2,4−ペンタジエノイル−CoAトランスフェラーゼ、2,4−ペンタジエノイル−CoAシンテターゼまたは2,4−ペンタジエノイル−CoAヒドロラーゼであり、上記1Pは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAトランスフェラーゼまたは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼであり、上記1Qは5−ヒドロキシバレリル−CoAデヒドラターゼ/デヒドロゲナーゼであり、上記1Sはグルタリル−CoAレダクターゼであり、上記3Aは3−オキソペンタノイル−CoAチオラーゼまたは3−オキソペンタノイル−CoAシンターゼであり、上記3Bは3−オキソペンタノイル−CoAレダクターゼであり、上記3Cは3−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼであり、上記3Dはペント−2−エノイル−CoAイソメラーゼであり、上記3Eはペント−3−エノイル−CoAデヒドロゲナーゼであり、上記3Fは2,4−ペンタジエノイル−CoAヒドロラーゼ、2,4−ペンタジエノイル−CoAトランスフェラーゼまたは2,4−ペンタジエノイル−CoAシンテターゼであり、上記3Gはペント−2−エノイル−CoAデヒドロゲナーゼである、
非天然微生物体。
(項目12)
上記微生物体が、各々が2,4−ペンタジエノエート経路の酵素をコードしている2、3、4、5、6、7、8、9または10種類の外因性核酸を含むものである、項目11に記載の非天然微生物体。
(項目13)
上記微生物体が、(1)〜(24)から選択される経路のうちの少なくとも1つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目12に記載の非天然微生物体。
(項目14)
上記少なくとも1種類の外因性核酸が異種核酸である、項目11に記載の非天然微生物体。
(項目15)
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、項目11に記載の非天然微生物体。
(項目16)
(9)〜(15)から選択される2,4−ペンタジエノエート経路を含む上記非天然微生物体が、さらに、グルタリル−CoAを生成するのに充分な量で発現されるグルタリル−CoA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含むグルタリル−CoA経路を含むものであり、上記グルタリル−CoA経路が:
アセトアセチル−CoAチオラーゼもしくはアセトアセチル−CoAシンターゼ;アセトアセチル−CoAレダクターゼ;3−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドラターゼ;およびグルタリル−CoAデヒドロゲナーゼ;または
2−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、2−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは2−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼ;および2−オキソアジピン酸デヒドロゲナーゼ、2−オキソアジピン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼまたは2−オキソアジピン酸ギ酸リアーゼ
から選択される経路を含む、項目11に記載の非天然微生物体。
(項目17)
(16)〜(22)から選択される2,4−ペンタジエノエート経路を含む上記非天然微生物体が、さらに、5−アミノペンタノエートを生成するのに充分な量で発現される5−アミノペンタノエート経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含む5−アミノペンタノエート経路を含むものであり、上記5−アミノペンタノエート経路が、2−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼ;または2−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼおよび2−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、2−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは2−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを含むものである、項目11に記載の非天然微生物体。
(項目18)
(1)〜(8)から選択される2,4−ペンタジエノエート経路を含む上記非天然微生物体が、さらに、2−オキソアジペートを生成するのに充分な量で発現される2−オキソアジペート経路の酵素をコードしている外因性核酸を含む2−オキソアジペート経路を含むものであり、上記2−オキソアジペート経路が、2−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、2−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼまたは2−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを含むものである、項目11に記載の非天然微生物体。
(項目19)
さらに:
(i)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも1種類の外因性核酸がATP−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−CoAシンテターゼ、シトリル−CoAリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的TCA経路;
(ii)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも1種類の外因性核酸がピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼおよびH2ヒドロゲナーゼから選択される、還元的TCA経路;または
(iii)COデヒドロゲナーゼ、H2ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸
を含む、項目11に記載の非天然微生物体。
(項目20)
(i)を含む上記微生物体が、さらに、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目19に記載の非天然微生物体。
(項目21)
(ii)を含む上記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目19に記載の非天然微生物体。
(項目22)
(i)を含む上記微生物体が、ATP−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている3種類の外因性核酸を含むものである;
(ii)を含む上記微生物体が、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ;ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ;COデヒドロゲナーゼ;およびH2ヒドロゲナーゼをコードしている4種類の外因性核酸を含むものである;または
(iii)を含む上記微生物体が、COデヒドロゲナーゼおよびH2ヒドロゲナーゼをコードしている2種類の外因性核酸を含むものである、
項目19に記載の非天然微生物体。
(項目23)
項目11〜22のいずれか1項に記載の非天然微生物体を、2,4−ペンタジエノエートが生成される条件下で上記生成に充分な期間、培養することを含む、2,4−ペンタジエノエートを生成するための方法。
(項目24)
ブタジエンを生成するのに充分な量で発現されるブタジエン経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含むブタジエン経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、上記ブタジエン経路は:
(1)1D,1I,1B,1C,1K,1Gおよび1T;
(2)1D,1E,1F,1Gおよび1T;
(3)1D,1E,1L,1M,1P,1Gおよび1T;
(4)1D,1I,1B,1Jおよび1T;
(5)1D,1I,1B,1C,1K,1P,1N,1Oおよび1T;
(6)1D,1E,1F,1P,1N,1Oおよび1T;
(7)1D,1E,1L,1M,1N,1Oおよび1T;
(8)1D,1E,1L,1Q,1Oおよび1T;
(9)1D,1E,1F,1Uおよび1V;
(10)1D,1I,1B,1C,1K,1Uおよび1V;
(11)1D,1E,1L,1M,1P,1Uおよび1V;
(12)1D,1E,1Wおよび1V;
(13)1D,1I,1B,1C,1K,1G,6Aおよび6B;
(14)1D,1E,1F,1G,6Aおよび6B;
(15)1D,1E,1L,1M,1P,1G,6Aおよび6B;
(16)1D,1I,1B,1J,6Aおよび6B;
(17)1D,1I,1B,1C,1K,1P,1N,1O,6Aおよび6B;
(18)1D,1E,1F,1P,1N,1O,6Aおよび6B;
(19)1D,1E,1L,1M,1N,1O,6Aおよび6B;
(20)1D,1E,1L,1Q,1O,6Aおよび6B;
(21)1D,1I,1B,1C,1K,1G,6H,6Eおよび6B;
(22)1D,1E,1F,1G,6H,6Eおよび6B;
(23)1D,1E,1L,1M,1P,1G,6H,6Eおよび6B;
(24)1D,1I,1B,1J,6H,6Eおよび6B;
(25)1D,1I,1B,1C,1K,1P,1N,1O,6H,6Eおよび6B;
(26)1D,1E,1F,1P,1N,1O,6H,6Eおよび6B;
(27)1D,1E,1L,1M,1N,1O,6H,6Eおよび6B;
(28)1D,1E,1L,1Q,1O,6H,6Eおよび6B;
(29)1D,1I,1B,1C,1K,1P,1N,6Cおよび6B;
(30)1D,1E,1F,1P,1N,6Cおよび6B;
(31)1D,1E,1L,1M,1N,6Cおよび6B;
(32)1D,1E,1L,1Q,6Cおよび6B;
(33)1D,1I,1B,1C,1K,1P,1N,6D,6Eおよび6B;
(34)1D,1E,1F,1P,1N,6D,6Eおよび6B;
(35)1D,1E,1L,1M,1N,6D,6Eおよび6B;
(36)1D,1E,1L,1Q,6D,6Eおよび6B;
(37)1D,1I,1B,1C,1K,1G,6F,6Cおよび6B;
(38)1D,1E,1F,1G,6F,6Cおよび6B;
(39)1D,1E,1L,1M,1P,1G,6F,6Cおよび6B;
(40)1D,1I,1B,1C,1K,1G,6F,6D,6Eおよび6B;
(41)1D,1E,1F,1G,6F,6D,6Eおよび6B;
(42)1D,1E,1L,1M,1P,1G,6F,6D,6Eおよび6B;
(43)1S,1I,1B,1C,1K,1Gおよび1T;
(44)1S,1E,1F,1Gおよび1T;
(45)1S,1I,1B,1Jおよび1T;
(46)1S,1I,1B,1C,1K,1P,1N,1Oおよび1T;
(47)1S,1E,1F,1P,1N,1Oおよび1T;
(48)1S,1E,1L,1M,1N,1Oおよび1T;
(49)1S,1E,1L,1Q,1Oおよび1T;
(50)1S,1E,1F,1Uおよび1V;
(51)1S,1I,1B,1C,1K,1Uおよび1V;
(52)1S,1E,1L,1M,1P,1Uおよび1V;
(53)1S,1E,1Wおよび1V;
(54)1S,1I,1B,1C,1K,1G,6Aおよび6B;
(55)1S,1E,1F,1G,6Aおよび6B;
(56)1S,1I,1B,1J,6Aおよび6B;
(57)1S,1I,1B,1C,1K,1P,1N,1O,6Aおよび6B;
(58)1S,1E,1F,1P,1N,1O,6Aおよび6B;
(59)1S,1E,1L,1M,1N,1O,6Aおよび6B;
(60)1S,1E,1L,1Q,1O,6Aおよび6B;
(61)1S,1I,1B,1C,1K,1G,6H,6Eおよび6B;
(62)1S,1E,1F,1G,6H,6Eおよび6B;
(63)1S,1I,1B,1J,6H,6Eおよび6B;
(64)1S,1I,1B,1C,1K,1P,1N,1O,6H,6Eおよび6B;
(65)1S,1E,1F,1P,1N,1O,6H,6Eおよび6B;
(66)1S,1E,1L,1M,1N,1O,6H,6Eおよび6B;
(67)1S,1E,1L,1Q,1O,6H,6Eおよび6B;
(68)1S,1I,1B,1C,1K,1P,1N,6Cおよび6B;
(69)1S,1E,1F,1P,1N,6Cおよび6B;
(70)1S,1E,1L,1M,1N,6Cおよび6B;
(71)1S,1E,1L,1Q,6Cおよび6B;
(72)1S,1I,1B,1C,1K,1P,1N,6D,6Eおよび6B;
(73)1S,1E,1F,1P,1N,6D,6Eおよび6B;
(74)1S,1E,1L,1M,1N,6D,6Eおよび6B;
(75)1S,1E,1L,1Q,6D,6Eおよび6B;
(76)1S,1I,1B,1C,1K,1G,6F,6Cおよび6B;
(77)1S,1E,1F,1G,6F,6Cおよび6B;
(78)1S,1I,1B,1C,1K,1G,6F,6D,6Eおよび6B;
(79)1S,1E,1F,1G,6F,6D,6Eおよび6B;
(80)1B,1C,1K,1Gおよび1T;
(81)1I,1E,1F,1Gおよび1T;
(82)1I,1E,1L,1M,1P,1Gおよび1T;
(83)1B,1Jおよび1T;
(84)1I,1E,1F,1P,1N,1Oおよび1T;
(85)1I,1E,1L,1M,1N,1Oおよび1T;
(86)1I,1E,1L,1Q,1Oおよび1T;
(87)1B,1C,1K,1Uおよび1V;
(88)1I,1E,1F,1Uおよび1V;
(89)1I,1E,1L,1M,1P,1Uおよび1V;
(90)1I,1E,1Wおよび1V;
(91)1B,1C,1K,1G,6Aおよび6B;
(92)1I,1E,1F,1G,6Aおよび6B;
(93)1I,1E,1L,1M,1P,1G,6Aおよび6B;
(94)1B,1J,6Aおよび6B;
(95)1I,1E,1F,1P,1N,1O,6Aおよび6B;
(96)1I,1E,1L,1M,1N,1O,6Aおよび6B;
(97)1I,1E,1L,1Q,1O,6Aおよび6B;
(98)1B,1C,1K,1G,6H,6Eおよび6B;
(99)1I,1E,1F,1G,6H,6Eおよび6B;
(100)1I,1E,1L,1M,1P,1G,6H,6Eおよび6B;
(101)1B,1J,6H,6Eおよび6B;
(102)1I,1E,1F,1P,1N,1O,6H,6Eおよび6B;
(103)1I,1E,1L,1M,1N,1O,6H,6Eおよび6B;
(104)1I,1E,1L,1Q,1O,6H,6Eおよび6B;
(105)1I,1E,1F,1P,1N,6Cおよび6B;
(106)1I,1E,1L,1M,1N,6Cおよび6B;
(107)1I,1E,1L,1Q,6Cおよび6B;
(108)1I,1E,1F,1P,1N,6D,6Eおよび6B;
(109)1I,1E,1L,1M,1N,6D,6Eおよび6B;
(110)1I,1E,1L,1Q,6D,6Eおよび6B;
(111)1B,1C,1K,1G,6F,6Cおよび6B;
(112)1I,1E,1F,1G,6F,6Cおよび6B;
(113)1I,1E,1L,1M,1P,1G,6F,6Cおよび6B;
(114)1B,1C,1K,1G,6F,6D,6Eおよび6B;
(115)1I,1E,1F,1G,6F,6D,6Eおよび6B;
(116)1I,1E,1L,1M,1P,1G,6F,6D,6Eおよび6B;
(117)3A,3B,3C,3D,3E,3Fおよび1T;
(118)3A,3B,3C,3D,3E,3F,6Aおよび6B;
(119)3A,3B,3C,3D,3E,3F,6H,6Eおよび6B;
(120)3A,3B,3C,3D,3E,6Cおよび6B;
(121)3A,3B,3C,3D,3E,6D,6Eおよび6B;ならびに
(122)3A,3B,3C,3G,3Fおよび1T;
(123)3A,3B,3C,3G,3F,6Aおよび6B;
(124)3A,3B,3C,3G,3F,6H,6Eおよび6B;
(125)3A,3B,3C,3G,6Cおよび6B;
(126)3A,3B,3C,3G,6D,6Eおよび6B;
(127)5A,5B,5C,5Dおよび5E;
(128)7A,7J,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(129)7A,7H,7F,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(130)7A,7H,7Q,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(131)7A,7H,7Q,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(132)7A,7D,7I,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(133)7A,7D,7E,7F,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(134)7A,7D,7E,7Q,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(135)7A,7D,7E,7Q,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(136)7A,7D,7P,7N,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(137)7A,7D,7P,7Y,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(138)7A,7D,7P,7Y,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(139)7A,7D,7P,7AB,7V,7AH,12A,12Bおよび12C;
(140)7A,7D,7P,7AB,7AF,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(141)7A,7B,7M,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(142)7A,7B,7L,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(143)7A,7B,7L,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(144)7A,7B,7X,7Y,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(145)7A,7B,7X,7Y,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(146)7A,7B,7X,7AB,7V,7AH,12A,12Bおよび12C;
(147)7A,7B,7X,7AB,7AF,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(148)7A,7B,7C,7U,7AH,12A,12Bおよび12C;
(149)7A,7B,7C,7T,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(150)7A,7B,7C,7AE,7AF,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(151)7A,7D,7P,7AB,7W,12A,12Bおよび12C;
(152)7A,7B,7X,7AB,7W,12A,12Bおよび12C;
(153)7A,7B,7C,7AE,7W,12A,12Bおよび12C;
(154)7A,7B,7C,7AE,7V,7AH;,12A,12Bおよび12C
(155)7A,7J,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(156)7A,7H,7F,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(157)7A,7H,7Q,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(158)7A,7H,7Q,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(159)7A,7D,7I,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(160)7A,7D,7E,7F,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(161)7A,7D,7E,7Q,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(164)7A,7D,7E,7Q,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(163)7A,7D,7P,7N,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(164)7A,7D,7P,7Y,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(165)7A,7D,7P,7Y,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(166)7A,7D,7P,7AB,7V,7AH,12Dおよび12C;
(167)7A,7D,7P,7AB,7AF,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(168)7A,7B,7M,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(169)7A,7B,7L,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(170)7A,7B,7L,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(171)7A,7B,7X,7Y,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(172)7A,7B,7X,7Y,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(173)7A,7B,7X,7AB,7V,7AH,12Dおよび12C;
(174)7A,7B,7X,7AB,7AF,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(175)7A,7B,7C,7U,7AH,12Dおよび12C;
(176)7A,7B,7C,7T,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(177)7A,7B,7C,7AE,7AF,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(178)7A,7D,7P,7AB,7W,12Dおよび12C;
(179)7A,7B,7X,7AB,7W,12Dおよび12C;
(180)7A,7B,7C,7AE,7W,12Dおよび12C;
(181)7A,7B,7C,7AE,7V,7AH,12Dおよび12C;
(182)7I,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(183)7E,7F,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(184)7E,7Q,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(185)7E,7Q,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(186)7P,7N,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(187)7P,7Y,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(188)7P,7Y,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(189)7P,7AB,7V,7AH,12A,12Bおよび12C;
(190)7P,7AB,7AF,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(191)7P,7AB,7W,12A,12Bおよび12C;
(192)7I,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(193)7E,7F,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(194)7E,7Q,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(195)7E,7Q,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(196)7P,7N,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(197)7P,7Y,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(198)7P,7Y,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(199)7P,7AB,7V,7AH,12Dおよび12C;
(200)7P,7AB,7AF,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(201)7P,7AB,7W,12Dおよび12C;
(202)7AS,7I,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(203)7AS,7E,7F,7R,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(204)7AS,7E,7Q,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(205)7AS,7E,7Q,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(206)7AS,7P,7N,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(207)7AS,7P,7Y,7Z,7AD,7AH,12A,12Bおよび12C;
(208)7AS,7P,7Y,7AC,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(209)7AS,7P,7AB,7V,7AH,12A,12Bおよび12C;
(210)7AS,7P,7AB,7AF,7AG,7AH,12A,12Bおよび12C;
(211)7AS,7P,7AB,7W,12A,12Bおよび12C;
(212)7AS,7I,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(213)7AS,7E,7F,7R,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(214)7AS,7E,7Q,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(215)7AS,7E,7Q,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(216)7AS,7P,7N,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(217)7AS,7P,7Y,7Z,7AD,7AH,12Dおよび12C;
(218)7AS,7P,7Y,7AC,7AG,7AH,12Dおよび12C;
(219)7AS,7P,7AB,7V,7AH,12Dおよび12C;
(220)7AS,7P,7AB,7AF,7AG,7AH,12Dおよび12C;ならびに
(221)7AS,7P,7AB,7W,12Dおよび12C
から選択される経路を含み、
上記1Bは5−アミノペンタン酸レダクターゼ、5−アミノペント−2−エン酸アミノトランスフェラーゼ、5−アミノペント−2−エン酸デヒドロゲナーゼまたは5−アミノペント−2−エン酸アミンオキシダーゼであり、上記1Dは2−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼであり、上記1Eはグルタル酸セミアルデヒドレダクターゼであり、上記1Fは5−ヒドロキシ吉草酸レダクターゼであり、上記1Gは5−ヒドロキシペント−2−エン酸デヒドラターゼであり、上記1Iは5−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、5−アミノペンタン酸デヒドロゲナーゼまたは5−アミノペンタン酸アミンオキシダーゼであり、上記1Jは5−アミノペント−4−エン酸デアミナーゼであり、上記1Kは5−ヒドロキシペント−2−エン酸レダクターゼであり、上記1Lは5−ヒドロキシバレリル−CoAトランスフェラーゼまたは5−ヒドロキシバレリル−CoAシンテターゼであり、上記1Mは5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドロゲナーゼであり、上記1Nは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼであり、上記1Oは2,4−ペンタジエノイル−CoAトランスフェラーゼ、2,4−ペンタジエノイル−CoAシンテターゼまたは2,4−ペンタジエノイル−CoAヒドロラーゼであり、上記1Pは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAトランスフェラーゼまたは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼであり、上記1Qは5−ヒドロキシバレリル−CoAデヒドラターゼ/デヒドロゲナーゼであり、上記1Sはグルタリル−CoAレダクターゼであり、上記1Tは2,4−ペンタジエン酸デカルボキシラーゼであり、上記1Uは5−ヒドロキシペント−2−エン酸デカルボキシラーゼであり、上記1Vは3−ブテン−1−オールデヒドラターゼであり、上記1Wは5−ヒドロキシ吉草酸デカルボキシラーゼであり、上記3Aは3−オキソペンタノイル−CoAチオラーゼまたは3−オキソペンタノイル−CoAシンターゼであり、上記3Bは3−オキソペンタノイル−CoAレダクターゼであり、上記3Cは3−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼであり、上記3Dはペント−2−エノイル−CoAイソメラーゼであり、上記3Eはペント−3−エノイル−CoAデヒドロゲナーゼであり、上記3Fは2,4−ペンタジエノイル−CoAヒドロラーゼ、2,4−ペンタジエノイル−CoAトランスフェラーゼまたは2,4−ペンタジエノイル−CoAシンテターゼであり、上記3Gはペント−2−エノイル−CoAデヒドロゲナーゼであり、上記5Aは4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸アルドラーゼであり、上記5Bは4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸デヒドラターゼであり、上記5Cは2−オキソペンテン酸デカルボキシラーゼであり、上記5Dは3−ブテン−1−アールレダクターゼであり、上記5Eは3−ブテン−1−オールデヒドラターゼであり、上記6Aは2,4−ペンタジエン酸レダクターゼ(酸還元)であり、上記6Bはペンタ−2,4−ジエナールデカルボニラーゼであり、上記6Cは2,4−ペンタジエノイル−CoAレダクターゼ(酸還元)であり、上記6Dは2,4−ペンタジエノイル−CoAホスホトランスフェラーゼであり、上記6Eは2,4−ペンタジエノイル−リン酸レダクターゼであり、上記6Fは2,4−ペンタジエノイル−CoAヒドロラーゼ、2,4−ペンタジエノイル−CoAトランスフェラーゼまたは2,4−ペンタジエノイル−CoAシンテターゼであり、上記6Hは2,4−ペンタジエン酸キナーゼであり、上記7Aは3−ケトアシル−ACPシンターゼであり、上記7Bはアセトアセチル−ACPレダクターゼであり、上記7Cは3−ヒドロキシブチリル−ACPデヒドラターゼであり、上記7Dはアセトアセチル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、上記7Eはアセトアセチル−CoAヒドロラーゼ、アセトアセチル−CoAトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−CoAシンテターゼであり、上記7Fはアセト酢酸レダクターゼ(酸還元)であり、上記7Hはアセトアセチル−ACPチオエステラーゼであり、上記7Iはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(CoA依存性,アルデヒド形成)であり、上記7Jはアセトアセチル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記7Kはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)であり、上記7Lは3−ヒドロキシブチリル−ACPチオエステラーゼであり、上記7Mは3−ヒドロキシブチリル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記7Nは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記7Oは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)であり、上記7Pはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(ケトン還元)であり、上記7Qはアセト酢酸レダクターゼ(ケトン還元)であり、上記7Rは3−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ(ケトン還元)であり、上記7Tはクロトニル−ACPチオエステラーゼであり、上記7Uはクロトニル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記7Vはクロトニル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記7Wはクロトニル−CoA(アルコール形成)であり、上記7Xは3−ヒドロキシブチリル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、上記7Yは3−ヒドロキシブチリル−CoAヒドロラーゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼまたは3−ヒドロキシブチリル−CoAシンテターゼであり、上記7Zは3−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、上記7ABは3−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドラターゼであり、上記7ACは3−ヒドロキシ酪酸デヒドラターゼであり、上記7ADは3−ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドラターゼであり、上記7AEはクロトニル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、上記7AFはクロトニル−CoAヒドロラーゼ、クロトニル−CoAトランスフェラーゼまたはクロトニル−CoAシンテターゼであり、上記7AGはクロトン酸レダクターゼであり、上記7AHはクロトンアルデヒドレダクターゼであり、上記7ASはアセトアセチル−CoAシンターゼであり、上記12Aはクロチルアルコールキナーゼであり、上記12Bは2−ブテニル−4−リン酸キナーゼであり、上記12Cはブタジエンシンターゼであり、上記12Dはクロチルアルコールジホスホキナーゼである、
非天然微生物体。
(項目25)
上記微生物体が、各々がブタジエン経路の酵素をコードしている2、3、4、5、6、7、8、9、10または11種類の外因性核酸を含むものである、項目24に記載の非天然微生物体。
(項目26)
上記微生物体が、(1)〜(221)から選択される経路のうちの少なくとも1つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目25に記載の非天然微生物体。
(項目27)
上記少なくとも1種類の外因性核酸が異種核酸である、項目24に記載の非天然微生物体。
(項目28)
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、項目24に記載の非天然微生物体。
(項目29)
(43)〜(79)から選択されるブタジエン経路を含む上記非天然微生物体が、さらに、グルタリル−CoAを生成するのに充分な量で発現されるグルタリル−CoA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含むグルタリル−CoA経路を含むものであり、上記グルタリル−CoA経路が:
アセトアセチル−CoAチオラーゼもしくはアセトアセチル−CoAシンターゼ;アセトアセチル−CoAレダクターゼ;3−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドラターゼ;およびグルタリル−CoAデヒドロゲナーゼ;または
2−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、2−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは2−アミノ(aminino)アジピン酸アミンオキシダーゼ;および2−オキソアジピン酸デヒドロゲナーゼ、2−オキソアジピン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼもしくは2−オキソアジピン酸ギ酸リアーゼ
から選択される経路を含む、項目24に記載の非天然微生物体。
(項目30)
(80)〜(116)から選択されるブタジエン経路を含む上記非天然微生物体が、さらに、5−アミノペンタノエートを生成するのに充分な量で発現される5−アミノペンタノエート経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含む5−アミノペンタノエート経路を含むものであり、上記5−アミノペンタノエート経路が、2−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼ;または2−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼおよび2−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、2−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは2−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを含むものである、項目24に記載の非天然微生物体。
(項目31)
(1)〜(42)から選択されるブタジエン経路を含む上記非天然微生物体が、さらに、2−オキソアジペートを生成するのに充分な量で発現される2−オキソアジペート経路の酵素をコードしている外因性核酸を含む2−オキソアジペート経路を含むものであり、上記2−オキソアジペート経路が2−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、2−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼまたは2−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを含むものである、項目24に記載の非天然微生物体。
(項目32)
さらに:
(i)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも1種類の外因性核酸がATP−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−CoAシンテターゼ、シトリル−CoAリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的TCA経路;
(ii)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも1種類の外因性核酸がピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼおよびH2ヒドロゲナーゼから選択される、還元的TCA経路;または
(iii)COデヒドロゲナーゼ、H2ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸
を含む、項目24に記載の非天然微生物体。
(項目33)
(i)を含む上記微生物体が、さらに、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目32に記載の非天然微生物体。
(項目34)
(ii)を含む上記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目32に記載の非天然微生物体。
(項目35)
(i)を含む上記微生物体が、ATP−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている3種類の外因性核酸を含むものである;
(ii)を含む上記微生物体が、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ;ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ;COデヒドロゲナーゼ;およびH2ヒドロゲナーゼをコードしている4種類の外因性核酸を含むものである;または
(iii)を含む上記微生物体が、COデヒドロゲナーゼおよびH2ヒドロゲナーゼをコードしている2種類の外因性核酸を含むものである、
項目32に記載の非天然微生物体。
(項目36)
項目24〜35のいずれか1項に記載の非天然微生物体を、ブタジエンが生成される条件下で上記生成に充分な期間、培養することを含む、ブタジエンを生成するための方法。
(項目37)
3−ブテン−1−オールを生成するのに充分な量で発現される3−ブテン−1−オール経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含む3−ブテン−1−オール経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、上記3−ブテン−1−オール経路は:
(1)1D,1E,1Fおよび1U;
(2)1D,1I,1B,1C,1Kおよび1U;
(3)1D,1E,1L,1M,1Pおよび1U;
(4)1D,1Eおよび1W;
(5)1S,1E,1Fおよび1U;
(6)1S,1I,1B,1C,1Kおよび1U;
(7)1S,1E,1L,1M,1Pおよび1U;
(8)1S,1Eおよび1W;
(9)1B,1C,1Kおよび1U;
(10)1I,1E,1Fおよび1U;
(11)1I,1E,1L,1M,1Pおよび1U;
(12)1I,1Eおよび1W;ならびに
(13)5A,5B,5Cおよび5D
から選択される経路を含み、
上記1Bは5−アミノペンタン酸レダクターゼであり、上記1Cは5−アミノペント−2−エン酸アミノトランスフェラーゼ、5−アミノペント−2−エン酸デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼであり、上記1Dは2−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼであり、上記1Eはグルタル酸セミアルデヒドレダクターゼであり、上記1Fは5−ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼであり、上記1Iは5−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、5−アミノペンタン酸デヒドロゲナーゼまたは5−アミノペンタン酸アミンオキシダーゼであり、上記1Kは5−ヒドロキシペント−2−エン酸レダクターゼであり、上記1Lは5−ヒドロキシバレリル−CoAトランスフェラーゼまたは5−ヒドロキシバレリル−CoAシンテターゼであり、上記1Mは5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドロゲナーゼであり、上記1Pは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAトランスフェラーゼまたは5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼであり、上記1Sはグルタリル−CoAレダクターゼであり、上記1Uは5−ヒドロキシペント−2−エン酸デカルボキシラーゼであり、上記1Wは5−ヒドロキシ吉草酸デカルボキシラーゼであり、上記5Aは4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸アルドラーゼであり、上記5Bは4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸デヒドラターゼであり、上記5Cは2−オキソペンテン酸デカルボキシラーゼであり、上記5Dは3−ブテン−1−アールレダクターゼである、
非天然微生物体。
(項目38)
上記微生物体が、各々が3−ブテン−1−オール経路の酵素をコードしている2、3、4、5または6種類の外因性核酸を含むものである、項目37に記載の非天然微生物体。
(項目39)
上記微生物体が、(1)〜(13)から選択される経路のうちの少なくとも1つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目38に記載の非天然微生物体。
(項目40)
上記少なくとも1種類の外因性核酸が異種核酸である、項目37に記載の非天然微生物体。
(項目41)
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、項目37に記載の非天然微生物体。
(項目42)
さらに:
(i)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも1種類の外因性核酸がATP−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的TCA経路;
(ii)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも1種類の外因性核酸がピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼおよびH2ヒドロゲナーゼから選択される、還元的TCA経路;または
(iii)COデヒドロゲナーゼ、H2ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸
を含む、項目37に記載の非天然微生物体。
(項目43)
(i)を含む上記微生物体が、さらに、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目42に記載の非天然微生物体。
(項目44)
(ii)を含む上記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目42に記載の非天然微生物体。
(項目45)
(i)を含む上記微生物体が、ATP−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている3種類の外因性核酸を含むものである;
(ii)を含む上記微生物体が、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ;ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ;COデヒドロゲナーゼ;およびH2ヒドロゲナーゼをコードしている4種類の外因性核酸を含むものである;または
(iii)を含む上記微生物体が、COデヒドロゲナーゼおよびH2ヒドロゲナーゼをコードしている2種類の外因性核酸を含むものである、
項目42に記載の非天然微生物体。
(項目46)
項目37〜45のいずれか1項に記載の非天然微生物体を、3−ブテン−1−オールが生成される条件下で上記生成に充分な期間、培養することを含む、3−ブテン−1−オールを生成するための方法。
(項目47)
項目37〜45のいずれか1項に記載の非天然微生物体を、3−ブテン−1−オールが生成される条件下で上記生成のために充分培養すること、および上記3−ブテン−1−オールを化学的に脱水させてブタジエンを生成させることを含む、ブタジエンを生成するための方法。
(項目48)
クロチルアルコールを生成するのに充分な量で発現されるクロチルアルコール経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含むクロチルアルコール経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、上記クロチルアルコール経路は:
(1)7A,7J,7R,7ADおよび7AH;
(2)7A,7H,7F,7R,7ADおよび7AH;
(3)7A,7H,7Q,7Z,7ADおよび7AH;
(4)7A,7H,7Q,7AC,7AGおよび7AH;
(5)7A,7D,7I,7R,7ADおよび7AH;
(6)7A,7D,7E,7F,7R,7ADおよび7AH;
(7)7A,7D,7E,7Q,7Z,7ADおよび7AH;
(8)7A,7D,7E,7Q,7AC,7AGおよび7AH;
(9)7A,7D,7P,7N,7ADおよび7AH;
(10)7A,7D,7P,7Y,7Z,7ADおよび7AH;
(11)7A,7D,7P,7Y,7AC,7AGおよび7AH;
(12)7A,7D,7P,7AB,7Vおよび7AH;
(13)7A,7D,7P,7AB,7AF,7AGおよび7AH;
(14)7A,7B,7M,7ADおよび7AH;
(15)7A,7B,7L,7Z,7ADおよび7AH;
(16)7A,7B,7L,7AC,7AGおよび7AH;
(17)7A,7B,7X,7Y,7Z,7ADおよび7AH;
(18)7A,7B,7X,7Y,7AC,7AGおよび7AH;
(19)7A,7B,7X,7AB,7Vおよび7AH;
(20)7A,7B,7X,7AB,7AF,7AGおよび7AH;
(21)7A,7B,7C,7Uおよび7AH;
(22)7A,7B,7C,7T,7AGおよび7AH;
(23)7A,7B,7C,7AE,7AF,7AGおよび7AH;
(24)7A,7D,7P,7ABおよび7W;
(25)7A,7B,7X,7ABおよび7W;
(26)7A,7B,7C,7AEおよび7W;
(27)7A,7B,7C,7AE,7Vおよび7AH;
(28)7I,7R,7ADおよび7AH;
(29)7E,7F,7R,7ADおよび7AH;
(30)7E,7Q,7Z,7ADおよび7AH;
(31)7E,7Q,7AC,7AGおよび7AH;
(32)7P,7N,7ADおよび7AH;
(33)7P,7Y,7Z,7ADおよび7AH;
(34)7P,7Y,7AC,7AGおよび7AH;
(35)7P,7AB,7Vおよび7AH;
(36)7P,7AB,7AF,7AGおよび7AH;
(37)7P,7ABおよび7W;
(38)7AS,7I,7R,7ADおよび7AH;
(39)7AS,7E,7F,7R,7ADおよび7AH;
(40)7AS,7E,7Q,7Z,7ADおよび7AH;
(41)7AS,7E,7Q,7AC,7AGおよび7AH;
(42)7AS,7P,7N,7ADおよび7AH;
(43)7AS,7P,7Y,7Z,7ADおよび7AH;
(44)7AS,7P,7Y,7AC,7AGおよび7AH;
(45)7AS,7P,7AB,7Vおよび7AH;
(46)7AS,7P,7AB,7AF,7AGおよび7AH;ならびに
(47)7AS,7P,7ABおよび7W
から選択される経路を含み、
上記7Aは3−ケトアシル−ACPシンターゼであり、上記7Bはアセトアセチル−ACPレダクターゼであり、上記7Cは3−ヒドロキシブチリル−ACPデヒドラターゼであり、上記7Dはアセトアセチル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、上記7Eはアセトアセチル−CoAヒドロラーゼ、アセトアセチル−CoAトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−CoAシンテターゼであり、上記7Fはアセト酢酸レダクターゼ(酸還元)であり、上記7Hはアセトアセチル−ACPチオエステラーゼであり、上記7Iはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(CoA依存性,アルデヒド形成)であり、上記7Jはアセトアセチル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記7Kはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)であり、上記7Lは3−ヒドロキシブチリル−ACPチオエステラーゼであり、上記7Mは3−ヒドロキシブチリル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記7Nは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記7Oは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)であり、上記7Pはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(ケトン還元)であり、上記7Qはアセト酢酸レダクターゼ(ケトン還元)であり、上記7Rは3−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ(ケトン還元)であり、上記7Tはクロトニル−ACPチオエステラーゼであり、上記7Uはクロトニル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記7Vはクロトニル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記7Wはクロトニル−CoA(アルコール形成)であり、上記7Xは3−ヒドロキシブチリル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、上記7Yは3−ヒドロキシブチリル−CoAヒドロラーゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼまたは3−ヒドロキシブチリル−CoAシンテターゼであり、上記7Zは3−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、上記7ABは3−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドラターゼであり、上記7ACは3−ヒドロキシ酪酸デヒドラターゼであり、上記7ADは3−ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドラターゼであり、上記7AEはクロトニル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、上記7AFはクロトニル−CoAヒドロラーゼ、クロトニル−CoAトランスフェラーゼまたはクロトニル−CoAシンテターゼであり、上記7AGはクロトン酸レダクターゼであり、上記7AHはクロトンアルデヒドレダクターゼであり、上記7ASはアセトアセチル−CoAシンターゼである、
非天然微生物体。
(項目49)
上記微生物体が、各々がクロチルアルコール経路の酵素をコードしている2、3、4、5、6または7種類の外因性核酸を含むものである、項目1に記載の非天然微生物体。
(項目50)
上記微生物体が、(1)〜(47)から選択される経路のうちの少なくとも1つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目1Aに記載の非天然微生物体。
(項目51)
上記少なくとも1種類の外因性核酸が異種核酸である、項目1に記載の非天然微生物体。
(項目52)
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、項目1に記載の非天然微生物体。
(項目53)
さらに:
(i)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも1種類の外因性核酸がATP−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−CoAシンテターゼ、シトリル−CoAリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的TCA経路;
(ii)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも1種類の外因性核酸がピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼおよびH2ヒドロゲナーゼから選択される、還元的TCA経路;または
(iii)COデヒドロゲナーゼ、H2ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸
を含む、項目48に記載の非天然微生物体。
(項目54)
(i)を含む上記微生物体が、さらに、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目53に記載の非天然微生物体。
(項目55)
(ii)を含む上記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目53に記載の非天然微生物体。
(項目56)
(i)を含む上記微生物体が、ATP−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている3種類の外因性核酸を含むものである;
(ii)を含む上記微生物体が、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ;ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ;COデヒドロゲナーゼ;およびH2ヒドロゲナーゼをコードしている4種類の外因性核酸を含むものである;または
(iii)を含む上記微生物体が、COデヒドロゲナーゼおよびH2ヒドロゲナーゼをコードしている2種類の外因性核酸を含むものである、
項目53に記載の非天然微生物体。
(項目57)
項目48〜56のいずれか1項に記載の非天然微生物体を、クロチルアルコールが生成される条件下で上記生成に充分な期間、培養することを含む、クロチルアルコールを生成するための方法。
(項目58)
プロピレンを生成するのに充分な量で発現されるプロピレン経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含むプロピレン経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、上記プロピレン経路は:
(1)7A,7J,7R,7ADおよび7AO;
(2)7A,7H,7F,7R,7ADおよび7AO;
(3)7A,7D,7I,7R,7ADおよび7AO;
(4)7A,7D,7E,7F,7R,7ADおよび7AO;
(5)7A,7H,7Q,7Z,7ADおよび7AO;
(6)7A,7D,7E,7Q,7ADおよび7AO;
(7)7A,7D,7P,7Y,7Z,7ADおよび7AO;
(8)7A,7D,7P,7N,7ADおよび7AO;
(9)7A,7B,7X,7N,7ADおよび7AO;
(10)7A,7B,7X,7Y,7Z,7ADおよび7AO;
(11)7A,7H,7Q,7V,7AGおよび7AO;
(12)7A,7D,7E,7Q,7AC,7AGおよび7AO;
(13)7A,7D,7P,7Y,7AC,7AGおよび7AO;
(14)7A,7D,7P,7AB,7AF,7AGおよび7AO;
(15)7A,7P,7AB,7Vおよび7AO;
(16)7A,7B,7M,7ADおよび7AO;
(17)7A,7B,7L,7Z,7ADおよび7AO;
(18)7A,7B,7X,7N,7ADおよび7AO;
(19)7A,7B,7X,7Y,7Z,7ADおよび7AO;
(20)7A,7B,7C,7Uおよび7AO;
(21)7A,7B,7C,7T,7AGおよび7AO;
(22)7A,7B,7C,7AE,7Vおよび7AO;
(23)7A,7B,7C,7AE,7AF,7AGおよび7AO;
(24)7A,7H,7Qおよび7AR;
(25)7A,7D,7E,7Qおよび7AR;
(26)7A,7D,7P,7Yおよび7AR;
(27)7A,7B,7X,7Yおよび7AR;
(28)7A,7B,7Lおよび7AR;
(29)7A,7H,7Q,7ACおよび7AQ;
(30)7A,7D,7E,7Q,7ACおよび7AQ;
(31)7A,7D,7P,7Y,7ACおよび7AQ;
(32)7A,7D,7P,7AB,7AFおよび7AQ;
(33)7A,7B,7L,7ACおよび7AQ;
(34)7A,7B,7X,7Y,7ACおよび7AQ;
(35)7A,7B,7X,7AB,7AFおよび7AQ;
(36)7A,7B,7C,7AE,7AFおよび7AQ;
(37)7A,7B,7C,7Tおよび7AQ;
(38)7A,7H,7Q,7AC,7ANおよび7AK
(39)7A,7D,7E,7Q,7AC,7ANおよび7AK;
(40)7A,7D,7P,7Y,7AC,7ANおよび7AK;
(41)7A,7D,7P,7AB,7AF,7ANおよび7AK;
(42)7A,7D,7P,7AB,7AM,7AJおよび7AK;
(43)7A,7B,7L,7AC,7ANおよび7AK;
(44)7A,7B,7X,7Y,7AC,7ANおよび7AK;
(45)7A,7B,7X,7AB,7AF,7ANおよび7AK;
(46)7A,7B,7X,7AB,7AM,7AJおよび7AK;
(47)7A,7B,7C,7T,7ANおよび7AK;
(48)7A,7B,7C,7AE,7AF,7ANおよび7AK;
(49)7A,7B,7C,7AE,7AM,7AJおよび7AK;
(50)7A,7B,7C,7AL,7APおよび7AK;
(51)7A,7B,7C,7AL,7AI,7AJおよび7AK;
(52)7A,7B,7X,7AB,7Vおよび7AO;
(53)7A 7B,7L,7AC,7AGおよび7AO;
(54)7A,7B,7X,7Y,7AC,7AC,7AGおよび7AO;
(55)7A,7B,7X,7AB,7AF,7AGおよび7AO;
(56)7A,7H,7Q,7AC,7AGおよび7AO;
(57)7I,7R,7ADおよび7AO;
(58)7E,7F,7R,7ADおよび7AO;
(59)7E,7Q,7Z,7ADおよび7AO;
(60)7P,7Y,7Z,7ADおよび7AO;
(61)7P,7N,7ADおよび7AO;
(62)7E,7Q,7AC,7AGおよび7AO;
(63)7P,7Y,7AC,7AGおよび7AO;
(64)7P,7AB,7AF,7AGおよび7AO;
(65)7P,7AB,7Vおよび7AO;
(66)7E,7Qおよび7AR;
(67)7P,7Yおよび7AR;
(68)7E,7Q,7ACおよび7AQ;
(69)7P,7Y,7ACおよび7AQ;
(70)7P,7AB,7AFおよび7AQ;
(71)7E,7Q,7AC,7ANおよび7AK;
(72)7P,7Y,7AC,7ANおよび7AK;
(73)7P,7AB,7AF,7ANおよび7AK;
(74)7P,7AB,7AM,7AJおよび7AK;
(75)7AS,7I,7R,7ADおよび7AO;
(76)7AS,7E,7F,7R,7ADおよび7AO;
(77)7AS,7E,7Q,7ADおよび7AO;
(78)7AS,7P,7Y,7Z,7ADおよび7AO;
(79)7AS,7P,7N,7ADおよび7AO;
(80)7AS,7E,7Q,7AC,7AGおよび7AO;
(81)7AS,7P,7Y,7AC,7AGおよび7AO;
(82)7AS,7P,7AB,7AF,7AGおよび7AO;
(83)7AS,7E,7Qおよび7AR;
(84)7AS,7P,7Yおよび7AR;
(85)7AS,7E,7Q,7ACおよび7AQ;
(86)7AS,7P,7Y,7ACおよび7AQ;
(87)7AS,7P,7AB,7AFおよび7AQ;
(88)7AS,7E,7Q,7AC,7ANおよび7AK;
(89)7AS,7P,7Y,7AC,7ANおよび7AK;
(90)7AS,7P,7AB,7AF,7ANおよび7AK;ならびに
(91)7AS,7P,7AB,7AM,7AJおよび7AK
から選択される経路を含み、
上記7Aは3−ケトアシル−ACPシンターゼであり、上記7Bはアセトアセチル−ACPレダクターゼであり、上記7Cは3−ヒドロキシブチリル−ACPデヒドラターゼであり、上記7Dはアセトアセチル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、上記7Eはアセトアセチル−CoAヒドロラーゼ、アセトアセチル−CoAトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−CoAシンテターゼであり、上記7Fはアセト酢酸レダクターゼ(酸還元)であり、上記7Hはアセトアセチル−ACPチオエステラーゼであり、上記7Iはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(CoA依存性,アルデヒド形成)であり、上記7Jはアセトアセチル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記7Lは3−ヒドロキシブチリル−ACPチオエステラーゼであり、上記7Mは3−ヒドロキシブチリル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記7Nは3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記7Pはアセトアセチル−CoAレダクターゼ(ケトン還元)であり、上記7Qはアセト酢酸レダクターゼ(ケトン還元)であり、上記7Rは3−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ(ケトン還元)であり、上記7Sは4−ヒドロキシ−2−ブタノンレダクターゼであり、上記7Tはクロトニル−ACPチオエステラーゼであり、上記7Uはクロトニル−ACPレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記7Vはクロトニル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、上記7Xは3−ヒドロキシブチリル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、上記7Yは3−ヒドロキシブチリル−CoAヒドロラーゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼまたは3−ヒドロキシブチリル−CoAシンテターゼであり、上記7Zは3−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、上記7ABは3−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドラターゼであり、上記7ACは3−ヒドロキシ酪酸デヒドラターゼであり、上記7ADは3−ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドラターゼであり、上記7AEはクロトニル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、上記7AFはクロトニル−CoAヒドロラーゼ、クロトニル−CoAトランスフェラーゼまたはクロトニル−CoAシンテターゼであり、上記7AGはクロトン酸レダクターゼであり、上記7AIはブチリル−CoA:ACPトランスフェラーゼであり、上記7AJはブチリル−CoAトランスフェラーゼ、ブチリル−CoAヒドロラーゼまたはブチリル−CoAシンテターゼであり、上記7AKは酪酸デカルボキシラーゼであり、上記7ALはクロトニル−ACPレダクターゼであり、上記7AMはクロトニル−CoAレダクターゼであり、上記7ANはクロトン酸レダクターゼであり、上記7AOはクロトンアルデヒドデカルボニラーゼであり、上記7APはブチリル−ACPチオエステラーゼであり、上記7AQはクロトン酸デカルボキシラーゼであり、上記7ARは3−ヒドロキシ酪酸デカルボキシラーゼであり、上記7ASはアセトアセチル−CoAシンターゼである、
非天然微生物体。
(項目59)
上記微生物体が、各々がプロピレン経路の酵素をコードしている2、3、4、5、6、7または8種類の外因性核酸を含むものである、項目58に記載の非天然微生物体。
(項目60)
上記微生物体が、(1)〜(91)から選択される経路のうちの少なくとも1つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目59に記載の非天然微生物体。
(項目61)
上記少なくとも1種類の外因性核酸が異種核酸である、項目58に記載の非天然微生物体。
(項目62)
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、項目58に記載の非天然微生物体。
(項目63)
さらに:
(i)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも1種類の外因性核酸がATP−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−CoAシンテターゼ、シトリル−CoAリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的TCA経路;
(ii)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも1種類の外因性核酸がピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼおよびH2ヒドロゲナーゼから選択される、還元的TCA経路;または
(iii)COデヒドロゲナーゼ、H2ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸
を含む、項目58に記載の非天然微生物体。
(項目64)
(i)を含む上記微生物体が、さらに、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目63に記載の非天然微生物体。
(項目65)
(ii)を含む上記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目63に記載の非天然微生物体。
(項目66)
(i)を含む上記微生物体が、ATP−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている3種類の外因性核酸を含むものである;
(ii)を含む上記微生物体が、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ;ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ;COデヒドロゲナーゼ;およびH2ヒドロゲナーゼをコードしている4種類の外因性核酸を含むものである;または
(iii)を含む上記微生物体が、COデヒドロゲナーゼおよびH2ヒドロゲナーゼをコードしている2種類の外因性核酸を含むものである、
項目63に記載の非天然微生物体。
(項目67)
項目58〜66のいずれか1項に記載の非天然微生物体を、プロピレンが生成される条件下で上記生成に充分な期間、培養することを含む、プロピレンを生成するための方法。
(項目68)
(a)充分な量の栄養素と培地中で、項目48〜56のいずれか1項に記載の非天然微生物体を発酵により培養し、クロチルアルコールを生成させること;および
(b)上記非天然微生物体を培養することによって生成したクロチルアルコールをブタジエンに変換させること
を含む、ブタジエンを生成するためのプロセス。
(項目69)
工程(b)を触媒の存在下での化学的脱水によって行なう、項目68に記載の方法。
Claims (20)
- 1,3−ブタンジオールを生成するのに充分な量で発現される1,3−ブタンジオール経路の酵素の各々をコードしている外因性核酸を含む1,3−ブタンジオール経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、前記1,3−ブタンジオール経路は:
(33)7AS,7P,7Nおよび7AA;
(27)7AS,7E,7F,7Gおよび7S;
(28)7AS,7I,7Gおよび7S;
(29)7AS,7K,および7S;
(30)7AS,7I,7Rおよび7AA;
(31)7AS,7E,7F,7Rおよび7AA;
(32)7AS,7E,7Q,7Zおよび7AA;
(34)7AS,7P,7Y,7Zおよび7AA;ならびに
(35)7AS,7Pおよび7O
から選択される経路を含み、
前記7Eは、アセトアセチル−CoAのアセトアセテートへの変換を触媒するアセトアセチル−CoAヒドロラーゼ、アセトアセチル−CoAトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−CoAシンテターゼであり、前記7Fは、アセトアセテートの3−オキソブチルアルデヒドへの変換を触媒するアセト酢酸レダクターゼ(酸還元)であり、前記7Gは、3−オキソブチルアルデヒドの4−ヒドロキシ−2−ブタノンへの変換を触媒する3−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ(アルデヒド還元)であり、前記7Iは、アセトアセチル−CoAの3−オキソブチルアルデヒドへの変換を触媒するアセトアセチル−CoAレダクターゼ(CoA依存性、アルデヒド形成)であり、前記7Kは、アセトアセチル−CoAの4−ヒドロキシ−2−ブタノンへの変換を触媒するアセトアセチル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)であり、前記7Nは、3−ヒドロキシブチリル−CoAの3−ヒドロキシブチルアルデヒドへの変換を触媒する3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)であり、前記7Oは、3−ヒドロキシブチリル−CoAの1,3−ブタンジオールへの変換を触媒する3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成)であり、前記7Pは、アセトアセチル−CoAの3−ヒドロキシブチリル−CoAへの変換を触媒するアセトアセチル−CoAレダクターゼ(ケトン還元)であり、前記7Qは、アセトアセテートの3−ヒドロキシブチレートへの変換を触媒するアセト酢酸レダクターゼ(ケトン還元)であり、前記7Rは、3−オキソブチルアルデヒドの3−ヒドロキシブチルアルデヒドへの変換を触媒する3−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ(ケトン還元)であり、前記7Sは、4−ヒドロキシ−2−ブタノンの1,3−ブタンジオールへの変換を触媒する4−ヒドロキシ−2−ブタノンレダクターゼであり、前記7Yは、3−ヒドロキシブチリル−CoAの3−ヒドロキシブチレートへの変換を触媒する3−ヒドロキシブチリル−CoAヒドロラーゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼまたは3−ヒドロキシブチリル−CoAシンテターゼであり、前記7Zは、3−ヒドロキシブチレートの3−ヒドロキシブチルアルデヒドへの変換を触媒する3−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、前記7AAは、3−ヒドロキシブチルアルデヒドの1,3−ブタンジオールへの変換を触媒する3−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼであり、前記7ASは、マロニル−CoAのアセトアセチル−CoAへの変換を触媒するアセトアセチル−CoAシンターゼであり、ここで、前記微生物体は、大腸菌である、
非天然微生物体。 - 前記1,3−ブタンジオール経路が、経路(27)7AS,7E,7F,7Gおよび7Sを含む、請求項1に記載の非天然微生物体。
- 前記1,3−ブタンジオール経路が、経路(28)7AS,7I,7Gおよび7Sを含む、請求項1に記載の非天然微生物体。
- 前記1,3−ブタンジオール経路が、経路(29)7AS,7K,および7Sを含む、請求項1に記載の非天然微生物体。
- 前記1,3−ブタンジオール経路が、経路(30)7AS,7I,7Rおよび7AAを含む、請求項1に記載の非天然微生物体。
- 前記1,3−ブタンジオール経路が、経路(31)7AS,7E,7F,7Rおよび7AAを含む、請求項1に記載の非天然微生物体。
- 前記1,3−ブタンジオール経路が、経路(32)7AS,7E,7Q,7Zおよび7AAを含む、請求項1に記載の非天然微生物体。
- 前記1,3−ブタンジオール経路が、経路(33)7AS,7P,7Nおよび7AAを含む、請求項1に記載の非天然微生物体。
- 前記1,3−ブタンジオール経路が、経路(34)7AS,7P,7Y,7Zおよび7AAを含む、請求項1に記載の非天然微生物体。
- 前記1,3−ブタンジオール経路が、経路(35)7AS,7Pおよび7Oを含む、請求項1に記載の非天然微生物体。
- 少なくとも1種類の前記外因性核酸が、異種核酸である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の非天然微生物体。
- 少なくとも2種類の前記外因性核酸が、異種核酸である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の非天然微生物体。
- 少なくとも3種類の前記外因性核酸が、異種核酸である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の非天然微生物体。
- 少なくとも4種類の前記外因性核酸が、異種核酸である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の非天然微生物体。
- 少なくとも5種類の前記外因性核酸が、異種核酸である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の非天然微生物体。
- さらに:
(i)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸であって、ATP−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−CoAシンテターゼ、シトリル−CoAリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、少なくとも1種類の外因性核酸;
(ii)還元的TCA経路の酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸であって、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼおよびH2ヒドロゲナーゼから選択される、少なくとも1種類の外因性核酸;または
(iii)COデヒドロゲナーゼ、H2ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも1種類の外因性核酸
を含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の非天然微生物体。 - 請求項1〜16のいずれか1項に記載の非天然微生物体を、1,3−ブタンジオールが生成される条件下で前記生成に充分な期間、培養することを含む、1,3−ブタンジオールを生成するための方法。
- 前記1,3−ブタンジオールを培養物中の他の成分から分離することをさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 前記分離することが、抽出、連続液−液抽出、パーベーパレーション、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、晶出、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーまたは限外濾過を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記分離することが蒸留を含む、請求項19に記載の方法。
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