JP2008501323A - 多価不飽和脂肪酸生産のための代謝改変細胞 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
本発明は、概ね脂肪酸の生産に関し、具体的には種々の細胞における多価不飽和脂肪酸(PUFA)の産生に関し、より具体的には脂肪酸、特に多価不飽和脂肪酸を生産するための微生物における異種経路の発現に関する。本発明は、特に、宿主生物でのPUFA含有量の改善に関わるもので、この改善は、温度の減少及び/又は最適培地の設計等による発酵最適化、脂肪酸合成酵素の過剰発現、PUFAの前駆体の生合成に関わる他の酵素の過剰発現等による代謝改変による脂肪酸への流れの改善、或いは異種遺伝子のコドン最適化又はPUFA前駆体の生合成に関わる異種酵素の発現を介して、おこなわれる。
【選択図】なし
Description
本出願は、米国特許出願第60/577,245号(2004年6月4日出願)の優先権を主張する。
これらの出願、特許、及び文中に引用された各文献の各々、これらの出願、特許、及び文献に引用された文献の各々(「出願参考文献」)、並びに該出願参考文献に参照又は引用された各文献は、文章中又は出願及びその特許の訴訟中のいずれの場合においても、その訴訟中に提起された特許性を支持する全ての議論と同様に、本明細書の一部をなすものとして本明細書中に援用される。
一態様では、本発明は、酸素要求経路の異種発現を介して非脂肪酸基質から4つ以上の二重結合を有するPUFAを生産するための、非植物、より詳しくは微生物の構築及び改変に関する。
本発明にもとづく方法に関連して上述の特徴及び/又は態様のいずれも類推によって用途に適用されることを、理解すべきである。
本文脈では、用語「多価不飽和脂肪酸」は、少なくとも4つの二重結合と端カルボキシラート基とを有する18個の炭素原子から構成される炭化水素長鎖を持つ多価不飽和脂肪酸である。
「発現(expression)」は、核酸セグメントがmRNAに転写され、mRNAからタンパク質に翻訳されることによって機能性ポリペプチドが生産されることを意味する。
酸素要求経路は、経路内の少なくとも1つの酵素が機能するために酸素を必要とすることを意味する。例えば、不飽和化酵素をコードする核酸の発現は、一般に不飽和化酵素が酸素要求酵素であることから、活性のために酸素を必要とする経路に、通常は至る。
本文脈では、「非脂肪酸基質」は、脂肪酸ではなく、2個以上の炭素原子を有する任意の基質に関し、該基質の例として、限定されるものではないが、ブドウ糖、マンノース、フルクトース、蔗糖、ガラクトース、ラクトース、エリスロース、トレオース、リボース、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、リブロース、セロビオース、澱粉、グリコーゲン、トレハロース、マルトース、マルトトリオース、キシロース、アラビノース、スタキオース、ラフィノース等の糖、又は、限定されるものではないが、エタノール、乳酸、酢酸塩、及びグリセロール等の非発酵性炭素源が挙げられる。
通常、生体は、炭素、硫黄、りん、窒素、酸素、又は水素等の多量栄養素の多く又は全ての供給を必要とする。生物は、異なる炭素源(例えば、脂肪酸基質及び非脂肪酸基質)の混合物によって成長することができる。もし一つ基質又は複数の基質が1つの排他的な炭素源又は複数の排他的な炭素源であるならば、その基質又はそれらの基質のみが炭素源として生物に供給される。このことは、他の多量栄養素又は他の栄養要求(例えば、微量栄養元素及びビタミンの要求)を除外するものではない。例えば、もし非脂肪酸基質が炭素源として排他的に供給される場合である。このことが意味することは、別の炭素源が供給されることなく、非脂肪酸のみが炭素源として供給されるということである。しかし、このことは他の多量栄養素又は他の栄養要求を除外するものではない。
本文脈において、用語「非植物宿主細胞」は、微生物、動物、菌類、細菌、無脊椎動物(昆虫)、又は原生動物からなる群より選択される宿主細胞に関する。特に、それは細菌、単細胞藻類、原生動物等のミクロな生物及び酵母等のミクロな菌類に関する。
本発明の一態様は、PUFAを生産するための少なくとも4つの特異的遺伝子の同時異種発現に関する。
(a)配列番号:1〜38からなる群より選択されるヌクレオチド配列の1つに対して、各々が少なくとも75%の同一性を有する少なくとも4つのヌクレオチド配列を単離するステップと;
(b)ステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列を含むベクターを構築するステップと;
(c)ステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、ステップ(b)のベクターによって一時的に宿主細胞を形質転換させるステップと;
(d)上記宿主細胞を非脂肪酸基質にさらすことで、上記非脂肪酸基質が上記宿主によって所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換されるステップと;
を含み、上記多価不飽和脂肪酸を得る。
(a)デルタ−12不飽和化酵素、デルタ−6不飽和化酵素、デルタ−6伸長酵素、及びデルタ−5不飽和化酵素をコードする少なくとも4つのヌクレオチド配列を単離するステップと;
(b)ステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列を含む1つ以上のベクターを構築し、及び/又は上記単離されたヌクレオチドをサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のゲノムに取り込むステップと;
(c)選択的に、ステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、ステップ(b)の上記ベクターによって一時的にサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)を形質転換させるステップと;
(d)非脂肪酸基質上で上記サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)を増殖させることで、上記宿主によって上記非脂肪酸が所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換されるステップと;
を含み、上記多価不飽和脂肪酸を得る。
(a)デルタ−12不飽和化酵素、デルタ−9伸長酵素、シグマ−8不飽和化酵素、及びデルタ−5不飽和化酵素をコードする少なくとも4つのヌクレオチド配列を単離するステップと;
(b)ステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列を含む1つ以上のベクターを構築し、及び/又は上記単離されたヌクレオチドをサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のゲノムに取り込むステップと;
(c)選択的に、ステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、ステップ(b)の上記ベクターによって一時的にサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)を形質転換させるステップと;
(d)非脂肪酸基質上で上記サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)を増殖させることで、上記宿主によって上記非脂肪酸が所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換されるステップと;
を含み、上記多価不飽和脂肪酸を得る。
本態様によるPUFAの生産のための発酵基質は、任意の天然培地又は合成培地であってもよく、例を挙げれば、糖、例えばブドウ糖、マンノース、フルクトース、ショ糖、ガラクトース、乳糖、エリトロース、トレオース、リボース、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、リブロース、セロビオース、澱粉、グリコーゲン、トレハロース、マルトース、マルトトリオース、キシロース、アラビノース、スタキオース、ラフィノース、又は非発酵性炭素源、例えばエタノール、アセテート、ラクタート、又はグリセロール、又はオイル、例えば植物、動物、又は微生物に由来するオイル、又は脂肪酸、例えば酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、cis−バクセン酸、リノール酸、アルファ−リノレン、ガンマ・リノール酸、ジホモ−ガンマ−リノレン酸、アラキドン酸、EPA、7,10,13,16,19−ドコサペンタエン酸、及び4,7,10、13、16、19−ドコサエキサエン酸DHAが含まれる。
本文脈で、用語「宿主細胞」は、微生物、動物、菌類、バクテリア、無脊椎動物(昆虫)、植物、又は原生動物からなる群より選択される宿主細胞に関する。特に、それは酵母を含むバクテリア、ウイルス、単細胞藻類、原生動物、及び顕微鏡菌類を含む微生物に関する。
本発明の文脈では、多価不飽和脂肪酸は4つ以上の二重結合と末端カルボキシラート基とを有する、少なくとも5つの二重結合と末端カルボキシラート基とを有する、又は6つの二重結合と末端カルボキシラート基を有する炭素原子数18からなる炭化水素長鎖を持つ化合物に関する。
(a)配列番号:5〜10、93、及び95に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有するヌクレオチド配列を単離、配列番号:11〜15、97、及び99に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する別のヌクレオチド配列を単離、配列番号:16〜21、101、及び103に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第3のヌクレオチド配列を単離、並びに配列番号:22〜27、99、105、及び107に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第4のヌクレオチド配列を単離することと;
(b)ステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのベクターを構築することと;
(c)ステップ(b)のベクターによって、一時的に、かつステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、宿主細胞を形質転換させることと;
(d)上記宿主細胞を非脂肪酸基質にさらすことで、上記非脂肪酸を上記宿主によって所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換することと;
を含み、上記アラキドン酸を得る。
(a)配列番号:5〜10、93、95,及び113に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有するヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:37に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する別のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:38に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第3のヌクレオチド配列を単離すること、並びに配列番号:22〜27、99、105、及び107に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第4のヌクレオチド配列を単離することと;
(b)ステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのベクターを構築することと;
(c)ステップ(b)のベクターによって、一時的に、かつステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、宿主細胞を形質転換させることと;
(d)上記宿主細胞を非脂肪酸基質にさらすことで、上記非脂肪酸を上記宿主によって所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換することと;
を含み、上記アラキドン酸を得る。
(a)配列番号:5〜10、93、95,及び113に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有するヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:11〜15、97、及び99に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する別のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:16〜21、101、及び103に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第3のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:22〜27、99、105、及び107に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第4のヌクレオチド配列を単離すること、並びに配列番号:30〜34、87、89、及び111に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第5のヌクレオチド配列を単離することと;
(b)ステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのベクターを構築することと;
(c)ステップ(b)のベクターによって、一時的に、かつステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、宿主細胞を形質転換させることと;
(d)上記宿主細胞を非脂肪酸基質にさらすことで、上記非脂肪酸を上記宿主によって所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換することと;
を含み、上記エイコサペンタエン酸を得る。
(a)配列番号:5〜10、95,及び113に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有するヌクレオチド配列を単離すること、 配列番号:37に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する別のヌクレオチド配列を単離すること、, 配列番号:38に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第3のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:22〜27、99、105、及び107に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第4のヌクレオチド配列を単離すること、並びに配列番号:30〜34、87、89、及び111に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第5のヌクレオチド配列を単離することと;
(b)ステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのベクターを構築することと;
(c)ステップ(b)のベクターによって、一時的に、かつステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、宿主細胞を形質転換させることと;
(d)上記宿主細胞を非脂肪酸基質にさらすことで、上記非脂肪酸を上記宿主によって所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換することと;
を含み、上記エイコサペンタエン酸を得る。
(a)配列番号:5〜10、93、及び95に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有するヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:11〜15、97、及び99に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する別のヌクレオチド配列 を単離すること、配列番号:16〜21、101、及び103に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第3のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:22〜27、99、105、及び107に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第4のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:30〜34、87、89、及び111に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第5のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:19、28、29、及び101に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第6のヌクレオチド配列を単離すること、並びに配列番号:35〜36及び109に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第7のヌクレオチド配列を単離することと;
(b)ステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのベクターを構築することと;
(c)ステップ(b)のベクターによって、一時的に、かつステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、宿主細胞を形質転換させることと;
(d)上記宿主細胞を非脂肪酸基質にさらすことで、上記非脂肪酸を上記宿主によって所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換することと;
を含み、上記ドコサエキサエン酸を得る。
(a)配列番号:5〜10、93、95,及び113に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有するヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:37に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する別のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:38に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第3のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:22〜27、99、105、及び107に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第4のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:30〜34、87、89、及び111に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第5のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:19、28、29、及び101に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第6のヌクレオチド配列を単離すること、並びに配列番号:35〜36及び109に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第7のヌクレオチド配列を単離することと;
(b)ステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのベクターを構築することと;
(c)ステップ(b)のベクターによって、一時的に、かつステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、宿主細胞を形質転換させることと;
(d)上記宿主細胞を非脂肪酸基質にさらすことで、上記非脂肪酸を上記宿主によって所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換することと;
を含み、上記ドコサエキサエン酸を得る。
(a)配列番号:5〜10、93、95,及び113に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有するヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:11〜15、97、及び99に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する別のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:16〜21、101、及び103に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第3のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:22〜27、99、105、及び107に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第4のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:19、28、29、及び101に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第5のヌクレオチド配列を単離すること、並びに配列番号:30〜34、87、89、及び111に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第6のヌクレオチド配列を単離することと;
(b)ステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのベクターを構築することと;
(c)ステップ(b)のベクターによって、一時的に、かつステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、宿主細胞を形質転換させることと;
(d)上記宿主細胞を非脂肪酸基質にさらすことで、上記非脂肪酸を上記宿主によって所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換することと;
を含み、ドコサペンタエン酸を得る。
(a)配列番号:5〜10、93、95,及び113に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有するヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:11〜15、97、及び99に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する別のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:16〜21、101、及び103に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第3のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号:22〜27、99、105、及び107に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第4のヌクレオチド配列を単離すること、並びに配列番号:19、28、29、及び101に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して、少なくとも75%同一性を有する第5のヌクレオチド配列を単離することと;
(b)ステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのベクターを構築することと;
(c)ステップ(b)のベクターによって、一時的に、かつステップ(a)の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、宿主細胞を形質転換させることと;
(d)上記宿主細胞を非脂肪酸基質にさらすことで、上記非脂肪酸を上記宿主によって所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換することと;
を含み、ドコサテトラエン酸を得る。
(a)配列番号:5〜10、93、95、及び113に記載のヌクレオチド配列と;
(b)配列番号:5〜10、93、95、及び113に記載のヌクレオチド配列に対して、少なくとも75%同一性を有するヌクレオチド配列と;
からなる群より選択される。
(a)配列番号:1〜4に記載のヌクレオチド配列と;
(b)配列番号:1〜4に記載のヌクレオチド配列に対して、少なくとも75%同一性を有するヌクレオチド配列と;
からなる群より選択される。
(a)配列番号:11〜15、97、及び99に記載のヌクレオチド配列と;
(b)配列番号:11〜15、97、及び99に記載のヌクレオチド配列に対して、少なくとも75%同一性を有するヌクレオチド配列と;
からなる群より選択される。
(a)配列番号:16〜21、101、及び103に記載のヌクレオチド配列と;
(b)配列番号:16〜21、101、及び103に記載のヌクレオチド配列に対して、少なくとも75%同一性を有するヌクレオチド配列と;
からなる群より選択される。
(a)配列番号:22〜27、99、105、及び107に記載のヌクレオチド配列と;
(b)配列番号:22〜27、99、105、及び107に記載のヌクレオチド配列に対して、少なくとも75%同一性を有するヌクレオチド配列と;
からなる群より選択される。
(a)配列番号:19、28〜29、及び101に記載のヌクレオチド配列と;
(b)配列番号:19、28〜29、及び101に記載のヌクレオチド配列に対して、少なくとも75%同一性を有するヌクレオチド配列と;
(c)配列番号:68に対して少なくとも75%同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と;
からなる群より選択される。
(a)配列番号:35〜36、及び109に記載のヌクレオチド配列と;
(b)配列番号:35〜36、及び109に記載のヌクレオチド配列に対して、少なくとも75%同一性を有するヌクレオチド配列と;
(c)配列番号:76〜77に対して少なくとも75%同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と;
からなる群より選択される。
(a)配列番号:30〜34、87、及び111に記載のヌクレオチド配列と;
(b)配列番号:30〜34、87、89、及び111に記載のヌクレオチド配列に対して、少なくとも75%同一性を有するヌクレオチド配列と;
からなる群より選択される。
2つの配列間の同一率の決定は、ギャップを許すかどうかにかかわりなく、上記のものと同様の技術を用いておこなうことができる。同一率の計算中、完全な一致のみがカウントされる。
本発明に記載された技術は、例えば非脂肪酸基質、例えば上記したような糖源又は複合発酵基質糖の非脂肪酸基質からPUFAを生産する、遺伝的に改変された非植物宿主細胞及び宿主細胞に関する。
「遺伝子」が意味することは、ヌクレオチド配列、及びDNA又はRNA配列のこともいい、これらは特定のタンパク質をコードする。上記PUFA不飽和化酵素及び伸長酵素をコードするヌクレオチド配列を、当該技術分野で公知の標準的技術を用いて、天然の源から単離することができる。そのような方法の1つは、全RNAの単離、オリゴ(dT)又はランダム・プライマーを用いた逆転写、それに続く配列特異的プライマーを用いたPCR増幅を含む。新規のPURA不飽和化酵素コード化ヌクレオチド配列及び伸長酵素コード化ヌクレオチド配列も同様に既知の方法によって単離することができる。優先的に、これらは配列同一性に基づいており、例えば、縮重プライマーを用いたPCRと放射性同位元素標識ポリヌクレオチド・プローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーションによるDNA又はcDNAのスクリーニングを含む。或いは、単離法はポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの機能に基づく。例えば、cDNA発現ライブラリーをPUFA産生生物から生成し、PUFA基質の不飽和化又は伸長についてスクリーニングする。
PUFA(例えばアラキドン酸又はDHA)への異種経路を有する組み換え酵母株を、PUFA含有バイオマスを大量に生産するために、実施例10に記載したように、回分培養、回分培養、又はケモスタット培養で増殖することができる。バイオマスの回収(例えば、遠心又は濾過、及び適当な度合いまでバイオマスを可能な限り乾燥)した後、それを機能性食品成分として、例えばパン酵母、イースト抽出物、又は、化学調味料として、使用することができる。PUFA含有バイオマスを、機能性食品として、例えば魚油カプセルに代わるものとしての錠剤として、直接使用することもできる。
組み換え酵母のPUFA収率を、いくつかの戦略で改善することできる。そのいくつかは全脂肪酸に占めるPUFA率を高めることであり、また他のものは脂肪酸の生産を高めるために宿主の代謝改変をおこなうことを含む。
全脂肪酸中のPUFA率を高めるために使用し得る1つの戦略は、パルミチン酸よりはむしろステアリン酸に対する基質特異性を有するデルタ−9不飽和化酵素の異種発現を伴う。そのようなデルタ−9不飽和化酵素の発現は、脂肪酸組成のオレイン酸(PUFA経路の前駆体)の濃度を高め、PUFA生産を高める(実施例9及び12)。酵母のオレイン酸含有量を増加させることができるもう一つの戦略は、遺伝子ELO1、ELO2及び/又はELO3の過剰発現を伴い、これらの遺伝子は脂肪酸伸長酵素をコードする。これらの遺伝子の過剰発現によって、炭素原子16個有する脂肪酸の濃度に対して炭素原子18個有する脂肪酸の濃縮を増加させることが可能である。或いは、パルミチン酸又はパルミトレイン酸の基質特異性を有する異種伸長酵素は、炭素原子数が18個の脂肪酸の利用可能性を高める。
S.セレビシエ(S.cerevisiae)では、脂肪酸合成を脂肪酸合成酵素(FAS)複合体(図3)でおこなう。この複合体は、2つの機能性サブユニット(α及びβ)のヘテロ多量体複合体からなる。それぞれが酵母遺伝子FAS2及びFAS1によってコードされるアルファ及びβサブユニットの過剰発現は、実質的に、S.セレビシエ(S.cerevisiae)の脂肪酸含有量を高めることができ、それによって細胞乾燥重量でのPUFA収量が高まる。
ミオイノシトールに欠培地上で増殖されるいくつかの酵母種において、脂質収率が増加であることが知られている。したがって、この発明の遺伝子組み換え細胞を、脂質及びPUFA収率が上昇するようにミオイノシトールが補充されていない培地上で増殖することが有利である。
コドン使用頻度は、多くの場合、異なる種の間で異なる。異なるコドン使用頻度を持つ生物からの異種タンパク質の発現のために、異種タンパク質のコドン使用頻度を宿主細胞のものに一致するように変えることが有利である。したがって、タンパク質発現を改善することができる。例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)と比較して、コドン使用頻度は多くの多くの菌類、例えばモルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)、クリプトコッカス・カルバタス(Cryptococcus curvatus)、,及びヒストプラズマ・カプスラタス(Histoplasma capsulatus)、ムコール・ロウキシ(Mucor rouxii)、ムコール・シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギラス・フミガーツフ(Aspergillus fumigatus)、サッカロマイセス・クリベリ(Saccharomyces klyveri)、フィトフセラ・メガスペルマ(Phytophthera megasperma)、ピチウム・イレグラレ(Pythium irregulare)、及びアスペルギラス・パラスチカス(Aspergillus parasiticus)、昆虫、例えばトリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)、ほ乳類、例えばマス・マスクラス(Mus musculus)、及びホモ・サピエンス(Homo sapiens)、藻類、例えばスラウソシトリウム・アウレウム(Thraustocytrium aureum)、ユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)、イソクリシス・ガルバナ(Isochrysis galbana)、サプリレグニア・ジクリアン(Saprilegnia diclian)、ファエオダクチルム・トリコルヌツム(Phaeodactylum tricornutum)、サプロレグニア(Saprolegnia)、及びシュイゾチゾチトリウム・アグレガツム(Schizochytrium aggregatum)及びパブロバ・ルセリ(Pavlova lutheri)、蠕虫、例えばカエノルハブジチス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)、植物、例えばアラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)、プラシカ・ナプス(Brassica napus)、グリシネ・ソヤ(Glycine soya)、ボラゴ・オフィシナリス(Borago officinalis)、アネモネ・レベイレイ(Anemone leveillei)、マルチャンチア・ポリモルファ(Marchantia polymorpha)、フィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)、ペトロセリヌム・クリスプム(Petroselinum crispum)、及びフィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)、魚類、例えばシプリナス・カルピオ(Cyprinus carpio)、及びサルモ・サラル(Salmo salar)で異なる。したがって、表1に示す対応酵素のヌクレオチド配列のコドン最適化は、PUFA生産の増加をもたらす。
PUFA不飽和化酵素及び伸長酵素をコードするポリヌクレオチドを、染色体外因子から宿主生物内で発現させることができる。酵母等での染色体外遺伝子に関して、高コピー数プラスミドが好ましい。他の酵母ベクターとして、酵母複製プラスミド(YRp)、例えば、染色体由来の複製配列を有し、中程度のコピー数(1細胞あたり20乃至40コピー)で増殖する2μプラスミド、並びに安定した分離を確実にする複製起点及びセントロメア配列の両方を有する酵母セントロメア・プラスミド(Ycp;CENプラスミドとしても知られている)が挙げられる。安定した分離を確実にする複製起点及びセントロメア配列の両方を有し、安定した分離を確実にする。異なった選択マーカーを有するいくつかの酵母発現ベクトルを、目的がいくつかの異種遺伝子を発現することである場合、組合せて使用することができる。加えて、いくつかの異種遺伝子を同じプラスミドから発現させることができる。例えばpESCベクター(Stratagene)を使用する。それは分散GAL1/GAL10プロモータ配列から同時に誘導発現を可能にする。種々の原核生物の発現系を使用することで、pBR322プラスミド、pUCプラスミド、及びその誘導体を含むPUFAを合成する不飽和化酵素及び伸長酵素を発現することができる。原核生物での発現を目的として、異種遺伝子を人工オペロンに組み入れる。このことは、単一プロモーター配列が遺伝子の一群の発現を制御する。PUFA合成不飽和化酵素及び伸長酵素をコードするいくつかの遺伝子を、PCRによって融合することができ、その後、標準的方法を使用して細菌発現ベクターにサブクローニングすることができる。
別の態様では、本発明は、本発明によるベクターを含む遺伝子組み換え細胞に関する。
1つの態様において、本発明は、本発明による遺伝子組み換え細胞によって生産される多価不飽和脂肪酸を含んでいる組成物に関する。
今では、多数のデータがPUFAの利点になっている。臨床所見が集められ、それらによれば、DHA及びARAが神経及び網膜機能の発達に有益であることから、乳児の記憶及び視力の改善に有利かもしれないことが示されている。また、早産児及び年少乳児は、充分な量のDHAを合成し、母乳によって自然にPUFAを受けることが実際のところ不可能である。しかし、PUFAは以前から牛乳と同様に特殊調整粉乳には含まれていなかった。DHAも、心血管疾患のような種々の疾患に関係するリスクファクタを低下又は除去して、高血圧、関節炎、動脈硬化、及び血栓症上にいくつかの効能を持つ。今や、両PUFAがともに、ますます食物で、例えば特殊調整粉乳、更には製薬及び化粧品製剤のかたちで提供されることが確認されている。このような需要の高まりは、非脂肪酸基質上で増殖される場合に4つ以上の二重結合を有するPUFAを生産することできる 遺伝子組み換えサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)によって、再現性高く、かつ一定の品質で生産されるトリアシルグリセリド、リン脂質、又は遊離脂肪酸(PUFA強化)を含む油等のPUFAの供給を通して、本発明に述べられる技術でカバーすることができる。
組成物を、多価不飽和脂肪酸含有油PUFAとすることが可能であり、またPUFAをトリグリセリド、リン脂質、又は遊離脂肪酸の形態にすることができる。
配列番号:1は、デルタ−9不飽和化酵素をコードしているモルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:2は、デルタ−9不飽和化酵素をコードしているクリプトコッカス・カルバタス(Cryptococcus curvatus)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:3は、デルタ−9不飽和化酵素をコードしているヒストプラズマ・カプスラタス(Histoplasma capsulatus)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:4は、デルタ−9不飽和化酵素をコードしているトリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:5は、デルタ−12不飽和化酵素をコードしているモルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:6は、デルタ−12不飽和化酵素をコードしているムコール・ロウキシ(Mucor rouxii)からヌクレオチド配列である。
配列番号:7は、デルタ−12不飽和化酵素をコードしているムコール・シルシネロイデス(Mucor circinelloides)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:8は、デルタ−12不飽和化酵素をコードしているアスペルギルス・フミガーツフ(Aspergillus fumigatus)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:9は、デルタ−12不飽和化酵素をコードしているクリプトコッカス・カルバタス(Cryptococcus curvatus)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:10は、デルタ−12不飽和化酵素をコードしているカエノルハブジチス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:11は、デルタ−6不飽和化酵素をコードしているモルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:12は、デルタ−6不飽和化酵素をコードしているムコール・ロウキシ(Mucor rouxii)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:13は、デルタ−6不飽和化酵素をコードしているボラゴ・オフィシナリス(Borago officinalis)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:14は、デルタ−6不飽和化酵素をコードしているアネモネ・レベイレイ(Anemone leveillei)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:15は、デルタ−6不飽和化酵素をコードしているカエノルハブジチス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:16は、デルタ−6伸長酵素。をコードしているモルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:17は、デルタ−6伸長酵素をコードしているフィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:18は、デルタ−6伸長酵素をコードしているカエノルハブジチス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:19は、デルタ−6伸長酵素をコードしているマウスからのヌクレオチド配列である。
配列番号:20は、デルタ−6伸長酵素をコードしているスラウストキトリウム・アウレウム(Thraustochytrium aureum)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:21は、デルタ−6伸長酵素をコードしているフィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:22は、デルタ−5不飽和化酵素をコードしているモルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:23は、デルタ−5不飽和化酵素をコードしているフィトフトラ・メガスペルマ(Phytophthora megasperma)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:24は、デルタ−5不飽和化酵素をコードしているスラウストキトリウム(Thraustochytrium)sp.ATCC 21685からのヌクレオチド配列である。
配列番号:25は、デルタ−5不飽和化酵素をコードしているカエノルハブジチス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:26は、デルタ−5不飽和化酵素をコードしているピチウム・イレグラレ(Pythium irregulare)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:27は、デルタ−5不飽和化酵素をコードしているファエオダクチルム・トリコルヌツム(Phaeodactylum tricornutum)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:28は、デルタ−5伸長酵素をコードしているマウスからのヌクレオチド配列である。
配列番号:29は、デルタ−5伸長酵素をコードしているヒトからのヌクレオチド配列である。
配列番号:30は、オメガ−3不飽和化酵素をコードしているカエノルハブジチス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:31は、オメガ−3不飽和化酵素をコードしているペトロセリヌム・クリスプム(Petroselinum crispum)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:32は、オメガ−3不飽和化酵素をコードしているアラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:33は、オメガ−3不飽和化酵素をコードしているブラシカ・ナプス(Brassica napus)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:34は、オメガ−3不飽和化酵素をコードしているグリシネ・ソヤ(Glycine soya)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:35は、デルタ−4不飽和化酵素をコードしているスラウストキトリウム・アウレウム(Thraustochytrium aureum)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:36は、デルタ−4不飽和化酵素をコードしているユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:37は、デルタ−9伸長酵素をコードしているイソクリシス・ガルバナ(Isochrysis galbana)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:38は、デルタ−8不飽和化酵素をコードしているユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)からのヌクレオチド配列である。
配列番号:39は、配列番号:1によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:40は、配列番号:2によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:41は、配列番号:3によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:42は、配列番号:4によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:43は、配列番号:5によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:44は、配列番号:6によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:45は、配列番号:7によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:46は、配列番号:8によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:47は、配列番号:9によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:48は、配列番号:10によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:49は、配列番号:11によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:50は、配列番号:12によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:51は、配列番号:13によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:52は、配列番号:14によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:53は、配列番号:15によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:54は、配列番号:16によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:55は、配列番号:17によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:56は、配列番号:18によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:57は、配列番号:19によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:58は、配列番号:20によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:59は、配列番号:21によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:60は、配列番号:22によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:61は、配列番号:23によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:62は、配列番号:24によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:63は、配列番号:25によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:64は、配列番号:26によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:65は、配列番号:27によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:66は、配列番号:28によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:67は、配列番号:29によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:68は、パブロバ(Pavlova)由来デルタ−5伸長酵素のアミノ酸配列である。
配列番号:69は、配列番号:30によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:70は、配列番号:31によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:71は、配列番号:32によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:72は、配列番号:33によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:73は、配列番号:34によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:74は、配列番号:35によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:75は、配列番号:36によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:76は、イソクリシス・ガルバナ(Isochrysis galbana)由来デルタ−4不飽和化酵素のアミノ酸配列である。
配列番号:77は、シュイゾチゾチトリウム・アグレガツム(Schizochytrium aggregatum)由来デルタ−4不飽和化酵素のアミノ酸配列である。
配列番号:78は、配列番号:37によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:79は、配列番号:38によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:80は、ATP:クエン酸リアーゼのサブユニット1をコードしているソルダリア・マクロスポラ(Sordaria macrospora)由来ヌクレオチド配列である。
配列番号:81は、配列番号:80によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:82は、ATP:クエン酸リアーゼのサブユニット2をコードしているソルダリア・マクロスポラ(Sordaria macrospora)由来ヌクレオチド配列である。
配列番号:83は、配列番号:82によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:84はデルタ−4不飽和化酵素をコードしている合成ヌクレオチド配列であり、S.セレビシエ(S.cerevisiae)での発現に最適化されたコドンである。
配列番号:85はデルタ−9伸長酵素をコードしている合成ヌクレオチド配列であり、S.セレビシエ(S.cerevisiae)での発現に最適化されたコドンである。
配列番号:86はデルタ−8不飽和化酵素をコードしている合成ヌクレオチド配列であり、S.セレビシエ(S.cerevisiae)での発現に最適化されたコドンである。
配列番号:87は、オメガ−3不飽和化酵素をコードしているサッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)由来のヌクレオチド配列である。
配列番号:88は、配列番号:87によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:89は、オメガ−3不飽和化酵素をコードしているモルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)由来のヌクレオチド配列である。
配列番号:90は、配列番号:89によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:92は、配列番号:91によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:93は、デルタ−12不飽和化酵素をコードしているアスペルギラス・パラスチカス(Aspergillus parasiticus)由来のヌクレオチド配列である。
配列番号:94は、配列番号:93によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:95は、デルタ−12不飽和化酵素をコードしているピチア・パストリス(Pichia pastoris)由来のヌクレオチド配列である。
配列番号:96は、配列番号:95によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:97は、デルタ−6不飽和化酵素をコードしているマルチャンチア・ポリモルファ(Marchantia polymorpha)由来のヌクレオチド配列である。
配列番号:98は、配列番号:97によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:99は、delta−6/デルタ−5不飽和化酵素をコードしているシプリナス・カルピオ(Cyprinus carpio)由来のヌクレオチド配列である。
配列番号:100は、配列番号:99によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:101は、delta−6/デルタ−5伸長酵素をコードしているサルモ・サラル(Salmo salar)由来のヌクレオチド配列である。
配列番号:102は、配列番号:101によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:103は、デルタ−6伸長酵素をコードしているマルチャンチア・ポリモルファ(Marchantia polymorpha)由来のヌクレオチド配列である。
配列番号:104は、配列番号:103によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:105は、デルタ−5不飽和化酵素をコードしているサルモ・サラル(Salmo salar)由来のヌクレオチド配列である。
配列番号:106は、配列番号:105によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:107は、デルタ−5不飽和化酵素をコードしているマルチャンチア・ポリモルファ(Marchantia polymorpha)由来のヌクレオチド配列である。
配列番号:108は、配列番号:107によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:109は、デルタ−4不飽和化酵素をコードしているパブロバ・ルセリ(Pavlova lutheri)由来のヌクレオチド配列である。
配列番号:110は、配列番号:109によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:111は、オメガ−3不飽和化酵素をコードしているサプロレイグナ・ジクリナ(Saproleigna diclina)由来のヌクレオチド配列である。
配列番号:112は、配列番号:111によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号:113は、デルタ−12不飽和化酵素をコードしているサッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)由来のヌクレオチド配列である。
配列番号:114は、配列番号:113によってコードされるアミノ酸配列である。
実施例1
デルタ−9不飽和化酵素、デルタ−12不飽和化酵素、デルタ−6不飽和化酵素、デルタ−6伸長酵素、及びデルタ−5不飽和化酵素をコードしている遺伝子の単離
真菌類モルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)は、経路を経てアラキドン酸を生産する。ここで、オレイン酸は脱飽和されて、次々にデルタ−12不飽和化酵素、デルタ−6不飽和化酵素、デルタ−6伸長酵素とデルタ−5不飽和化酵素によって延長される。これらの酵素をコードしているヌクレオチド配列を、モルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)CBS608.70から、第1鎖cDNAを用いるPCRによって増幅した。また、M.アルピナ(M.alpina)のデルタ−9不飽和化酵素をコードしているヌクレオチド配列を単離した。増幅のために用いられる所定のプライマーを、これらの酵素をコードしているM.アルピナ(M.alpina)遺伝子の公表された配列にマッチするように設計した 。
M.アルピナ(M.alpina)CBS 608.70を、100mlのGY培地(20g/Lブドウ糖、10g/Lイースト抽出物pH6.0)で、室温で3日間培養した。バイオマスを濾過によって集め、Trizol試薬(ギブコBRL)を用いて、全RNAを単離した。約5μgのrRNAを、プライマーとしてOligo(dT)12−18を用いる逆転写(Superscript II RT,Invitrogen)に用いられた。第1鎖cDNA合成後、相補的RNAを、RNアーゼ消化によって除去した。cDNAを、次に、以下のプライマーを用いるPCR(Phusion酵素、Finnzymes)のテンプレートとして用いた。すなわち、デルタ−9不飽和化酵素に対して5’ATGGCAACTCCTCTTCCCCCCTCC3’及び5’CTATTCGGCCTTGACGTGGTCAGTGC3’、デルタ−12不飽和化酵素に対して5’AACCCTTTTTCAGGATGGCACC3’及び5’AAAGTTGTGTCCGGTAAATGCTTC3’、デルタ−6不飽和化酵素に対して3’GGACTAGTCCACCATGGCTGCTGCTCCCAGTGTGAGG5’及び3’CCATCGATGGCTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGGAGG5’、デルタ6−伸長酵素に対して5’ATGGAGTCGATTGCGCCATTCC3’及び5’TTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTCC3’、並びにデルタ−5不飽和化酵素に対して5’ATGGGTACGGACCAAGGAAAAACC3’及び5’CTACTCTTCCTTGGGACGGAGTCC3’。予想される大きさの結果として生じるフラグメントを、アガロース・ゲルから切り取だけでなく、GFX−カラム(Amersham)を用いて精製した。
デルタ−12不飽和化酵素発現のための酵母ベクターの構築
実施例1に記載したようにして単離されたデルタ−12不飽和化酵素をコードしている遺伝子をPCRによって再増幅した。この際、用いたプライマーは、5’GACCTCGAGTAAGCTTATGGCACCTCCCAACACTATTG3’及び5’GCTAGCCGCGGTACCAATTACTTCTTGAAAAAGACC3’である。これらのプライマーを、その遺伝子の5’及び3’にあるXhoI及びNheI制限部位にそれぞれ導入し、XhoI/NheI制限PCRフラグメントをXhoI/NheI消化pESC−TRPベクター(Stratagene)に連結し、pESC−TRP−デルタ−12を得た。デルタ−12不飽和化酵素(配列番号:5)をコードしている遺伝をコードしている遺伝子の配列を、pESC−TRP−デルタ−12の2つの異なるクローンのシークエンシングによって得た。
デルタ−12不飽和化酵素及びデルタ−6不飽和化酵素発現のための酵母ベクターの構築
実施例1に記載したようにして、デルタ−6不飽和化酵素をコードする遺伝子を単離した。結果として得られるPCRフラグメントは、その遺伝子の5’及び3’末端にあるSpeI及びClaI制限部位を含んだ。このフラグメントをSpeI及びClaIで制限し、SpeI/ClaI消化pESC−TRP−デルタ−12に連結した(実施例2)。結果として得られるプラスミドpESC−TRP−デルタ−12 デルタ−6は、分岐GAL1/GAL10プロモーターの制御下、デルタ−12不飽和化酵素及びデルタ−6不飽和化酵素をコードする遺伝子を含んだ(図9A)。デルタ−6不飽和化酵素をコードする遺伝子(配列番号:11)の配列を、2つの異なるクローンのシークエンシングによって得た。
デルタ−6伸長酵素発現のための酵母ベクターの構築
実施例1に記載したようにして単離されたデルタ−6伸長酵素をコードしている遺伝子をPCRによって再増幅した。この際、用いたプライマーは、5’GACCTCGAGTAAGCTTATGGAGTCGATTGCGCC3’及び5’GCTAGCCGCGGTACCAATTACTGCAACTTCCTTGC3’である。これらのプライマーをその遺伝子の遺伝子の5’及び3’末端にあるHindIII及びNheI制限部位に導入し、HindIII/NheI制限PCRフラグメントをHindIII/NheI消化pESC−URAベクター(Stratagene)に連結し、pESC−URA−eloを得た。pESC−URA−eloの2つの異なるクローンをシークエンシングすることで、クローン遺伝子の配列(配列番号:16)を得た。
デルタ−6伸長酵素及びデルタ−5不飽和化酵素発現のための酵母ベクターの構築
実施例1に記載したようにして単離されたデルタ−5不飽和化酵素をコードしている遺伝子をPCRによって再増幅した。この際、用いたプライマーは、5’CGCACTAGTATCGATATGGGTACGGACCAAGG3’及び5’TTAATTAAGAGCTCAGATCTTCTACTCTTCCTTGGGACG3’である。これらのプライマーを、その遺伝子の5’及び3’末端にあるClaI及びSacI制限部位にそれぞれ導入し、ClaI/SacI制限PCRフラグメントをClaI/SacI消化pESC−URA−eloに連結した(実施例4)。結果として得られるプラスミドpESC−URA−elo−5は、分岐GAL1/GAL10プロモーターの制御下、デルタ−6伸長酵素及びデルタ−5不飽和化酵素をコードする遺伝子を含んだ(図9B)。デルタ−5不飽和化酵素をコードする遺伝子(配列番号:22)の配列を、pESC−URA−elo−デルタ−5の2つの異なるクローンのシークエンシングによって得た。
酵母でのアラキドン酸への経路の発現
適当な遺伝マーカーを有する酵母株を、実施例2、3、4、及び5に記載したベクターを別々に、或いは組み合わせて用いることで、形質転換した。形質転換体の選択は、ウラシル及びトリプトファンを欠いた培地上でおこない、続いて同培地上でストリーク精製した。
M.アルピナ(M.alpina)olelによる酵母OLE1の置換
M.アルピナ(M.alpina)の対応遺伝子によるS.セレビシエ(S.cerevisiae)OLE1遺伝子の置換を、二連基質による同一組み換えを介して実施した(図10)。二連基質の一方の部分は、K.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(3’末端に向けて)からなり、TDH3プロモーター配列、M.アルピナ(M.alpina)olel遺伝子、及び.セレビシエ(S.cerevisiae)OLE1の標的配列下流に融合している。二連基質の第2の部分は、天然OLE1の標的配列上流からなり、TDH3プロモーター配列及びK.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(5’末端に向けて)と融合している。二連基質による形質転換とウラシル欠損培地上での選択との後に形質転換体を得た。この形質転換体は、天然OLE1が不活性化され、また第2のTDH3プロモーター反復配列の直下流にあるM.アルピナ(M.alpina)olel遺伝子とK.ラクチス(K.lactis)URA3マーカー遺伝子の一方の側にある直接反復配列として、TDH3プロモーター配列の2つのコピーと置き換わっている。選択マーカーのループ・アウトをもたらす第2の組み換えイベントを、URA3遺伝子を発現する細胞には毒性のある5’−フルオロオロチン酸(5−FOA)を含む培地上に形質転換体を再播種することで、選択した。これによって、天然S.セレビシエ(S.cerevisiae)OLE1遺伝子がTDH3プロモーターの制御下でM.アルピナ(M.alpina)ole1によって置換されている株が得られた。この株に、それとは反対の接合型の株を交配させて所望のマーカー(芽胞形成誘発)を含ませ、胞子を切開し、更に新規一倍体の株の遺伝子型を記録することで、適当な遺伝マーカーを導入した。
二連遺伝子標的基質の第1の部分を構築するために、実施例1に記載したようにして単離されたM.アルピナ(M.alpina)ole1遺伝子(配列番号:1)をPCRによって再度増幅した。この際、用いたプライマーは、5’ATGGCAACTCCTCTTCCCCCCTCC3’及び5’TTGTTATTGTAATGTGATACCTATTCGGCCTTGACGTGG3’である。S.セレビシエ(S.cerevisiae)OLE1の標的配列下流をPCRによって増幅した。この際、テンプレートとしてS.セレビシエ(S.cerevisiae)ゲノムDNAを用い、またプライマーとして5’GTATCACATTACAATAACAAAACTGCAAC3’及び5’ACCAGCATCTATTAAAGTAAAATACCG3’を用いた。第3のDNAフラグメントをPCRによって生成した。この際、テンプレートとして、K.ラクチス(K.lactis)URA3の下流にTDH3プロモーター配列(−1〜−1067)を含むプラスミドを用い、またプライマー5’CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC3’及び5’GGGGGGAAGAGGAGTTGCCATTTTGTTTGTTTATGTGTG3’を用いた。これらのPCRフラグメントを、次に、PCRの2回のラウンドの過程で融合させた。最初に、プライマー5’ATGGCAACTCCTCTTCCCCCCTCC3’及び5’ACCAGCATCTATTAAAGTAAAATACCG3’を用いて、M.アルピナ(M.alpina)ole1を下流標的配列に融合させた。第2に、第1の融合反応の産物を、K.ラクチス(K.lactis)URA3/TDH3プロモーター・フラグメントに融合させた。この際、プライマー5’CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC3’及び5’ACCAGCATCTATTAAAGTAAAATACCG3’を用いた。これによって、遺伝子標的二連基質の第1の部分を構成する融合生成物2/3URA3−TDH3p−ole1−DOWNが得られた。
酵母での異種デルタ−9不飽和化酵素と組み合わせたアラキドン酸への経路の発現
天然OLE1がM.アルピナ(M.alpina)(実施例7)由来のole1と置換され、かつ適当な遺伝マーカーを含む酵母株を、実施例2、3、4、及び5に記載したベクターを別々に、或いは組み合わせて用いて、形質転換した。形質転換体をウラシル及びトリプトファンを欠いた培地上で選択し、同一培地上でストリーク精製した。
振とうフラスコでの組み換え酵母株による発酵
単一の酵母のコロニーを、100mlの最少培地(5g/Lのブドウ糖、20g/Lのガラクトース、15g/Lの(NH4)2SO4、1g/LのMgSO4・7H2O、14.4g/LのKH2PO4、1mL/Lのビタミン溶液、1mL/Lの微量金属溶液、pH6.5)が入ったバッフル付き振とうフラスコ(500ml)に植え付けた。ビタミン溶液は以下のものを含む:50mg/Lのビオチン、1g/Lのパントテン酸カルシウム、1g/Lのニコチン酸、25g/Lのミオイノシトール、1g/LのチアミンHCI、1g/LのピリドキサールHCI、及び0.2g/Lのp‐アミノ安息香酸。微量金属溶液は以下のものを含む:15g/LのEDTA、4.5g/LのZnSO4・7H2O、1g/LのMnCl2・2H2O、0.3g/LのCoCl2・6H2O、0.4g/LのNa2MoO4・2H2O、4.5g/LのCaCl2・2H2O、3g/LのFeSO4・7H2O、1g/LのH3BO3、及び0.1g/LのKI。ura3株FS01309については、0.22μm滅菌フィルターでろ過することによって、100ml/Lのアミノ酸カクテル(0.5g/Lのヒスチジン、0.5g/Lのトリプトファン、0.5g/Lのウラシル、0.5g/Lのロイシン)を培地に加えた。培養液を、それぞれ18又は30℃で96又は72時間振とう(150rpm)してインキュベートをおこなった。インキュベーション後、バイオマスを濾過によって回収し、脂質組成を実施例11の記載通りに分析した。
発酵槽での組み換え酵母株による発酵
組み換え酵母株を、回分培養、硫加培養、又はケモスタット培養として操作される発酵槽で増殖させることができる。
前培養として、実施例9に記載したようにして、単一の酵母のコロニーを100mlの最少培地を含む500mlのバッフル付き振とうフラスコの100mlの最少培地に植え付け、30℃で振とう(150rpm)してインキュベートした。指数的に増殖している前培養を、開始濃度1mgDW/Lでの回分培養の植菌に用いた。回分培養は、実用容量を2Lとして検査室発酵槽(例えばB.Braun Biotech、Melsungen、Germany)で実施することができる。培養を目的として、合成培地を用いることができ、この合成培地は、40g/Lのグルコース又はガラクトース、5.0g/Lの(NH4)2SO4、3.0g/LのKH2PO4、及び0.5g/LのMgSO4・7H2Oを含み、微量金属及びビタミンは実施例9の記載どおりである。泡立ちを回避するために、消泡剤(300μl/L、Sigma A−8436)を加える。炭素源の選択は、異種発現のために選択されるプロモーターに依存する。例えば、GAL1/GAL10プロモーターが用いられる場合、ガラクトースが炭素源として用いられ、構成型酵母プロモーターが用いられる場合、ブドウ糖が通常、炭素源として選択される。炭素源を、最少培地とは別に加圧滅菌した後、発酵槽に加えなけらばならない。また、ビタミンと微量金属溶液は濾過滅菌法によって高圧蒸気殺菌及び培地の冷却後、発酵槽に加えられる。培養は、一定の温度(例えば、18℃又は30℃)、撹拌速度600rpm、及び1vvm(空気容量/液体容量/分)でおこなう。pHの調整は、4MのKOHを自動的に添加することでおこなう。バイオリアクターは冷却器を備えており、排出された気体が気体分析装置(INNOVA、Ballerup、Denmark)に送られ、排出気体中のCO2濃度が測定される。
ケモスタット培養では、細胞を、例えば、実用容量1LのApplikon社製検査室発酵槽で増殖することができる。手短に言えば、培養は、増殖制限的栄養物質(回分発酵に関しては同じ培地)としてグルコース又はガラクトースを含む特定培地が供給される。定常状態培養での希釈率(それは比成長率に等しい)は、異なる値に設定することができる(例えば、0.050h−1、0.10h−1、0.15h−1、又は0.20h−1)。温度を一定の値(例えば、18℃又は30℃)に設定し、培養pHを5.0に設定することができる。好気条件は培養物に空気(例えば0.5L/分)をスプレーすることによって維持される。溶存酸素濃度を、例えばインゴールド(Ingold)モデル341003002によって連続的モニターすることで、飽和気体の50%を上回る値を維持する。
メチルエステルとしてのPUFAの分析
実施例9の記載したように、最少培地を用いて100ml振とうフラスコで細胞の増殖を、炭素源が枯渇するまでおこなう。バイオマスの分離は、3000rpmで遠心することによっておこない、脂質の抽出を30mlのクロロホルム/メタノール混合物(2:1、v:v)を用いて一晩おこなう。次のステップでは、飼料をろ過し、溶媒溶液を6mlのNaCIで洗い、更に飼料を窒素上で乾燥する。脂質に対して、2mlのトルエンと2ml 1%の硫酸とを含むメタノールを加え、脂質のエステル交換反応のために試料を50℃で一晩放置する。試料を5mlのNaCI溶液で洗い、ボルテックスする。メチルエステルの抽出を5mlのヘキサンを添加することで開始し、次いで、この試料をボルテックスし、上側のヘキサン相を除去する。更にヘキサンを5ml添加し、抽出を続ける。4mlの炭酸ナトリウムをヘキサンに加え、この試料をボルテックスし、相を2000rpmで2分間、遠心分離する。試料の乾燥は、無水硫酸ナトリウムを用いておこない、溶液をろ過して窒素上で乾燥した。乾燥試料に対して、ヘキサンを0.5ml加え、この試料をメチルエステル定量に用意する。メチルエステルの定量は質量選択検出器と組み合わさったガスクロマトグラフィ(GC/MS)を用いておこなう。GC/MSは、ヒューレットパッカード(Hewlett Packard)HP G1723A(70eVで動作するガスクロマトグラフ−クアドロプル質量選択検出器(EI))である。カラムは、JW−1701(30m、250μm、内径、0.15μm膜厚)である。MSを、SCANモードで操作する。オーブン温度を、当初170℃とし、その後4℃/分で220℃まで上げる。最終温度を3分間保つ。カラムの流量は、1mlHe/分である。注入容量は、5μlである。インジェクターを、すべての分析に対して、100:1スプリットレスのスプリットで駆動する。入り口の温度を300℃、界面温度を230℃、及びクアドロプル温度を105℃とする。検出された脂肪酸メチルエステルの確認は、1998NISTマス・スペクトル・データベース(Mass Spectral Database)によっておこない、滞留時間を標準脂肪酸メチルエステルで確認する。典型的なガスクロマトグラムを図11に示す。
組み換え酵母株の脂肪酸組成
デルタ−12不飽和化酵素、デルタ−6不飽和化酵素、デルタ−6伸長酵素、及びデルタ−5不飽和化酵素をコードしているM.アルピナ(M.alpina)遺伝子を発現する組み換え酵母FS01324株と、M.アルピナ(M.alpina)遺伝子に加えてM.アルピナ(M.alpina)ole1遺伝子も発現する組み換え酵母FS01329株を実施例9に記載通りに培養し、脂肪酸組成を実施例11の記載通りに分析した。同一の遺伝的バックグラウンドの野生型株(FS01201)もまた、参照として分析に含めた。FS01329及びFS01201株を30℃で培養し、FS01324株を17℃で培養した。
酵母ゲノムへのデルタ−12不飽和化酵素、デルタ−6不飽和化酵素、デルタ−9、及びデルタ−5不飽和化酵素をコードする遺伝子の組み込み
実施例1にもとづいて単離されたデルタ−12不飽和化酵素、デルタ−6不飽和化酵素、デルタ−6伸長酵素、及びデルタ−5不飽和化酵素をコードする遺伝子を、単一プラスミド上の、別々の、強力な酵母構成プロモーター(例えば、TDH3プロモーター、ADH1プロモーター、GPDプロモーター、又はTPIプロモーター)の下流に、各々配置する。プラスミドはまた、同一組み換えによる酵母ゲノムへの組み込みのための標的配列と直接反復配列によってフランキングされたK.ラクチス(K.lactis)URA3遺伝子とを含む。標的配列を改変することで、プラスミドの直線化を可能にする固有の制限部位を含むようにする。
酵母発現ベクターへのデルタ−5伸長酵素のクローニング
マウス遺伝子Ssc2は、酵母由来の脂肪酸デルタ−9伸長酵素ELO1pに対する配列同一性を持つタンパク質をコードする(Tvrdik et al.2000)。ヒト胎児腎臓(Human Embryonic Kidney)293細胞での遺伝子の発現後、該細胞から抽出したタンパク質の生体外アッセイをおこなったところ、Ssc2遺伝子産物が20:4(n−6)及び20:5(n−3)、すなわちアラキドン酸及びエイコサペンタエン酸を伸長させることができることが示された(Moon et al.2001)。
酵母発現ベクターへのオメガ−3不飽和化酵素のクローニング
C.エレガンス(C.elegans)fatl(Spychalla et al.1997)は、KpNI制限部位を含む遺伝子特異的フォワード・プライマーとNheI制限部位を含む遺伝子特異的リバース・プライマーとを用いて、C.エレガンス(C.elegans)cDNAライブラリー(Stratagene)から増幅される。PCR産物をKpNI/NheIで消化し、KpNI/NheI消化されたpESC−TRP−デルタ−5eloベクター(実施例15)に連結することで、ベクターpESC−TRP−デルタ−5elo−オメガ3が得られる。
酵母発現ベクターへのデルタ−4不飽和化酵素のクローニング
スラウストキトリウム(Thraustochytrium)sp.ATCC26185を100mlの培地を含む500ml振とうフラスコで、振とうしながら室温で培養した。バイオマスを回収した後、全RNAを単離し、オリゴ(dT)12〜18をプライマーとして使用するcDNA調製に用いた。スラウストキトリウム(Thraustochytrium)Fad4 の増幅を、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)cDNAをテンプレートとし、かつ適当な制限部位を含む遺伝子特異的プライマーを用いて、おこなった。次に、Fad4遺伝子を、適当な酵母発現ベクター(例えば、HIS又はLEU選択を持つ高コピー・ベクター及びガラクトース誘導性又は構成プロモーター)に連結する。
酵母でのドコサヘキサエン酸への経路の発現
ゲノムに組み込まれたデルタ−12不飽和化酵素、デルタ−6不飽和化酵素、デルタ−6伸長酵素、及びデルタ−5不飽和化酵素をコードする遺伝子を含む酵母株(実施例14)を、pESC−TRP−デルタ−5elo−オメガ−3(実施例16)とデルタ−4不飽和化酵素(実施例17)をコードする遺伝子を含む発現ベクターとによって、同時形質転換をおこなった。
酵母ゲノムへのデルタ−5伸長酵素、オメガ−3不飽和化酵素、及びデルタ−4不飽和化酵素をコードする遺伝子の組み込み
デルタ−5伸長酵素、オメガ−3不飽和化酵素、及びデルタ−4不飽和化酵素をコードする遺伝子を、単一プラスミド上の、別々の、強力な酵母構成プロモーター(例えば、TDH3プロモーター、ADH1プロモーター、GPDプロモーター、又はTPIプロモーター)の下流に、各々配置する。プラスミドはまた、同一組み換えによる酵母ゲノムへの組み込みのための標的配列と直接反復配列によってフランキングされたK.ラクチス(K.lactis)URA3遺伝子を含む。標的配列を改変することで、プラスミドの直線化を可能にする固有の制限部位を含むようにする。適当な酵母株を線状化プラスミドで形質転換し、形質転換体をウラシル欠損培地上で選択する。同一培地でのストリーク精製の後、5−FOA含有培地上で、K.ラクチス(K.lactis)URA3のポップ・アウトを選択する。プラスミドが正しく組み込まれているかどうかをPCR及び改変領域のシークエンシングによって確認する。結果として得られる株に所望の遺伝的特徴を導入するために、接合型が反対の適当な酵母株と好配させる。二倍体の選択、芽胞形成、及び切開の後、新規の一倍体株を実施例7に記載の方法によって記録する。
E.コリ(E.coli)でのPUFA生産のためのベクターの構築
PUFA生産に必要な遺伝子(例えば、アラキドン酸生産のためのデルタ−12不飽和化酵素、デルタ−6不飽和化酵素、デルタ−9、及びデルタ−5不飽和化酵素をコードする遺伝子)を、停止及び開始コドンが互いに重なり合うようにして、PCRによって融合する。適当なプライマーを使用して、固有の制限部位が融合産物の5’末端及び3’末端に導入されるようにする。融合産物を、プロモーター下流のE.コリ(E.coli)発現ベクター(例えば、pTXB1、pBR322、又はpUCベクター)に連結することで、人工オペロンを得る。再びPCR融合法を用い、その後、クラスターのクローニングに元々使用された3’末端制限部位での挿入によって、さらなる遺伝子(例えば、デルタ−5伸長酵素、デルタ−3不飽和化酵素、デルタ−4不飽和化酵素)をこのオペロンに添加することができる。好ましくは、発現系は構成プロモーター、例えばバクテリオファージガンマタンデム・プロモーターPR、PL、又は強構成E.コリ(E.coli)プロモーターに基づく。或いは、このシステムは温度誘導性のものであり、例えばバクテリオファージガンマタンデム・プロモーターPR、PLをcI857レプレッサーと組み合わせて使用され、又はIPTG誘導性のものであり、例えばT7プロモーターを使用する。
E.コリ(E.coli)でのPUFAの生産
適当な遺伝子型のE.コリ(E.coli)株を、PUFA(実施例21)の生産のために必要な遺伝子による人工遺伝子クラスターを含んでいる発現ベクターで形質転換し、組み換え細胞を、選択培地(例えば5mg/Lのアンピシリンを含むLB培地)上で同定する。単一コロニーを100mlの培地に植菌する。この培地は、バッフル付き500ml振とうフラスコに、20g/Lのグルコース、3g/LのKH2PO4、7g/LのK2HPO4、2g/Lの(NH4)2SO4、0.25g/LのMgSO4・7H2Oを含み、5mg・l−1アンピシリンが追加されたものである。クラスターを、炭素源が枯れるまで、200rpmで振とうさせながら、37℃で16〜20時間インキュベートし、バイオマスを、実施例11に記載したように、脂肪酸組成の分析のために回収した。IPTG誘導性プロモーター(例えば、T7プロモーター)を使用する場合、IPTGを最終濃度が0.01〜1mMになるようにして添加する。
株構築に使用される一般分子生物学的方法
実施例で用いられる標準組み換えDNA及び分子クローニング技術は、周知の技術であり、文献(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1989))に記載されている。微生物培養の維持及び増殖に適する材料及び方法は、周知の技術であり、例えば、Manual of Methods for General Bacteriology(Gerhardt,P.,Murray,R.G.E.,Costilow,R.N.,Nester,E.W.,Wood,W.A.,Krieg,N.R.,and Briggs,G.,Eds.)American Society for Microbiology:Washington,D.C.(1994)に記載されている。細胞の維持及び増殖に使用される全ての薬品及び試薬は、特に指定しない限り、シグマ(Sigma)、DIFCOラボラトリーズ(DIFCO Laboratories)、又はGIBCO/BRLから入手した。制限酵素及びDNAリガーゼは、ニューイングランド・バイオラボラトリーズ(New England Biolabs)から購入した。全てのPCR反応をフューション(Phusion)ポリメラーゼ(Finnzymes)を用いておこなった。オリゴヌクレオチド及びシークエンシング・サービスは、MWGバイオテック(MWG Biotech,Ebersberg,Germany)から購入した。DNAフラグメントの精製は、GFXカラム(Amersham)又はQiaexII精製キット(Qiagen)を用いておこなった。
pWAD1及びpWAD2の構築
2種類のベクター(pWAD1及びpWAD2)を、ADH1プロモーターによる遺伝子の過剰発現のための遺伝子標的基質の構築においてPCRのテンプレートとして使用した。pWAD1及びpWAD2を構築するために、ADH1プロモーター(ADH1遺伝子の直上流側の1467bpからなる)を、酵母ゲノムDNAから増幅した。この際、用いたプライマーは、5’AAATCGATAACCGCGGAGGGGGATCGAAGAAATGATGG3’及び5’TTGGGCCCTTTCCCGGGTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC3’である。これらのプライマーをプロモーター配列の5’末端にあるClaI及びSacII制限部位と3’末端にあるXmaI及びApaI制限部位に導入した。pWAD1を構築するために、ADH1プロモーター・フラグメントをClaI及びApaIで消化し、ClaI/ApaI消化pWJ716に導入した。これによって、ADH1プロモーターがK.ラクチス(K.lactis)URA3の直下流に配置されたプラスミド・コンストラクトが得られた。ADH1プロモーター配列に突然変異が生じていないことの確認は、pWAD1のシークエンシングによっておこなった。pWAD2を構築するために、ADH1プロモーター・フラグメントを、SacII及びXmaIによる消化を通してpWAD1から放出させた。このフラグメントを精製し、SacII/XmaI消化pWJ716に導入した。。これによって、ADH1プロモーターがK.ラクチス(K.lactis)URA3の直下流に配置されたプラスミド・コンストラクトが得られた。pWAD1及びpWAD2のプラスミド・マップを図13に示す。天然プロモーターの制御下で、K.ラクチス(K.lactis)URA3構造を担持し、天然ターミネーター配列に結合したプラスミドpWJ716は、ウッフェ・H・モルテンセン(Uffe H.Mortensen,Center for Microbial Biotechnology,Bio−Centrum DTU,Technical University of Denmark)のご好意により頂いたものである。
PWJ716−TD1及びpWJ716−TD2の構築
2種類のベクター(PWJ716−TD1及びpWJ716−TD2)を、TDH3プロモーターによる遺伝子の過剰発現のための遺伝子標的基質の構築においてPCRのテンプレートとして使用した。PWJ716−TD1及びpWJ716−TD2を構築するために、TDH3プロモーター(TDH3遺伝子の直上流側の1067bpからなる)を、酵母ゲノムDNAから増幅した。この際、用いたプライマーは、5’TTGGGCCCΠTTCCCGGGTTTTGTTTGTTTATGTGTG3’及び5’AAATCGATAACCGCGGATGAAAGAAGCTTACCAG3’である。これらのプライマーをプロモーター配列の5’末端にあるClaI及びSacII制限部位と3’末端にあるXmaI及びApaI制限部位に導入した。PWJ716−TD1を構築するために、TDH3プロモーター・フラグメントをClaI及びApaIで消化し、ClaI/ApaI消化pWJ716に導入した。これによって、ADH1プロモーターがK.ラクチス(K.lactis)URA3の直下流に配置されたプラスミド・コンストラクトが得られた。TDH3プロモーター配列に突然変異が生じていないことの確認は、PWJ716−TD1のシークエンシングによっておこなった。pWJ716−TD2を構築するために、TDH3プロモーター・フラグメントを、SacII及びXmaIによる消化を通してpWAD1から放出させた。このフラグメントを精製し、SacII/XmaI消化pWJ716に導入した。これによって、TDH3プロモーターがK.ラクチス(K.lactis)URA3の直下流に配置されたプラスミド・コンストラクトが得られた。PWJ716−TD1及びpWJ716−TD2のプラスミド・マップを図14に示す。
遺伝子組み換え酵母株の概要
実施例で述べられるように。いくつかの遺伝子組み換え酵母株を構築した。実施例で言及される株の概要を表3に示す。すべての改変は、CEN.PK遺伝的バックグラウンドでおこなった。CEN.PK110−10C株とCEN.PK113−6B株とを交配させ、結果として生じる二倍体の子嚢を切開し、結果として生じる一倍体の株の遺伝子型を記録することによって、株FS01267、FS01269、及びFS01277を得た。
脂肪酸合成酵素(FAS)の過剰発現
酵母脂肪酸合成酵素のベータ及びアルファ・サブユニットをそれぞれコードする2つの遺伝子FAS1及びFAS2が、強力な酵母プロモーターによって過剰発現した。このことは、遺伝子標的二連基質に基づくプロモーター置換法を用い、野生型のFAS1プロモーター及びFAS2プロモーターをADH1プロモーターと置き換えることによっておこなった(図15)。この2つの遺伝子を別々に過剰発現させ、続いて株の交配を一時的変異を組み合わせた。各々の過剰発現のために、K.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(3’末端方向)からある二連基質の一部分を、ADH1 プロモーター配列と過剰発現させる遺伝子の始まりに対応する標的とに融合させた。過剰発現させる遺伝子の標的配列上流からなる二連基質の第2の部分を、ADH1プロモーター配列とK.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3の部分(5’末端方向)に融合させた。二連基質による形質転換及びウラシル欠損培地上での選択をおこなった後、野生型プロモーターがノック・アウトされ、K.ラクチス(K.lactis)URA3マーカー遺伝子の片側に直接反復配列としてあるADH1プロモーター配列の2つのコピーと置き換わった。選択マーカーのルーピング・アウトをもたらす第2の組み換えイベントの選択は、URA3遺伝子を発現させる細胞に対して毒性のある5’−フルオロチン酸(5−FOA)を含む培地上で形質転換を置き換えることにより、なされる。このことは、野生型プロモーターがADH1プロモーターによって置き換わった株をもたらした。
遺伝子標的二連基の第1部(図15)を構築するために、K.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(3’末端方向)とADH1プロモーターとからなるフラグメントをプラスミドpWAD1から増幅した。FAS1の過剰発現について、プライマー対5’CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC3’及び5’TGGTCTTGTGGAGTAAGCGTCCATTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC3’を、この増幅に対して使用し、またFAS2の過剰発現に対して、プライマー対5’CTTGAGTTCTTCGACTGATGAGC3’及び5’TTCTTCTCAACTTCCGGCCTTCATTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC3’を使用した。更に、FAS1及びFAS2のそれぞれの先頭から構成される下流標的配列を、FAS1標的配列のプライマー対5’ATGGACGCTTACTCCACAAGACCATTAAC3’及び5’TTGATATAGATCACGCAATTCTTCAAAGTAGTC3’と、5’ATGAAGCCGGAAGTTGAGCAAGAATTAGC3’及び5’ACTTCTTCAACTTGTGAGCAACCAAAACG3’のFAS2標的配列のプライマー対を用いることで、酵母ゲノムDNAから増幅した。最後に、FAS1及びFAS2下流標的配列を、K.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(3’末端方向)とADH1プロモーターとからなるフラグメントに融合させた。FAS1についてはプライマー対5’CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC3’及び5’TTGATATAGATCACGCAATTCTTCAAAGTAGTC3’を融合反応に用い、又はFAS2についてはプライマー対5’CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC3’及び5’ACTTCTTCAACTTGTGAGCAACCAAAACG3’用いた。結果として得られる融合産物である3’2/3K.lactis URA3−pADH1−DOWN(FAS1)及び3’2/3K.lactis URA3−pADH1−DOWN(FAS2)は、FAS1及びFAS2プロモーター置換にそれぞれ使われる標的二連基質の部分1であった。
ACC1の過剰発現
アセチル−CoAカルボキシラーゼをコードする酵母遺伝子ACC1を、強力な酵母構成プロモーターで過剰発現させた。このことは、遺伝子標的二連基質に基づいたプロモーター置換法を用いて、野生型ACC1プロモーターをTPI1プロモーターによって置き換えることでおこなった(図15)。K.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(3’末端方向)からなる二連基質の一部分を、TPI1プロモーター配列とにACC1の先頭部分に対応する標的配列とに融合させた。ACC1の上流にある標的配列からなる二連基質を、TPI1プロモーター配列とK.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(5’末端方向)とに融合させた。二連基質による形質転換とウラシル欠損培地上での選択との後に、形質転換体が得られ、該形質転換体では、野生型プロモーターがノック・アウトされてK.ラクチス(K.lactis)URA3マーカー遺伝子の片側上の直接反復配列としてのTPI1プロモーター配列の2つのコピーと置き換えられている。選択マーカーのループ・アウトをもたらす第2の組み換えイベントを、URA3遺伝子を発現する細胞に対して毒性を示す5’−フルオロオロチン酸(5−FOA)を含む培地上で形質転換体を置き換えることで、選択した。これによって、野生型ACC1プロモーターがTPI1プロモーターと置き換わっている株が得られた。
S.セレビシエ(S.cerevisiae)のPOX1遺伝子座でのM.アルピナ(M.alpina)ole1の組込み
デルタ−9不飽和化酵素をコードするM.アルピナ(M.alpina)ole1遺伝子をS.セレビシエ(S.cerevisiae)のゲノムに組込み、酵母TDH3プロモーターの制御下においた。TDH3プロモーター及びM.アルピナ(M.alpina)ole1遺伝子を、ベータ酸化経路の第1の酵素をコードするPOXl1遺伝子座を組み込むことで、この遺伝子のノック・アウトが生じた。組込みを、遺伝子標的二連基質を用い、同一組み換えを介して、おこなった(図16)。K.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(3’末端方向)からなる二連基質の一部を、TDH3 プロモーター配列、M.アルピナ(M.alpina)ole1遺伝子、及びPOX1の下流にある標的配列に融合させた。POX1の上流にある標的配列からなる二連基質の第2の部分を、TDH3 プロモーター配列とK.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(5’末端方向)とに融合させた。二連基質による形質転換とウラシル欠損培地上での選択の後、形質転換体を得た。この形質転換体では、POX1がノック・アウトされて、K.ラクチス(K.lactis)URA3マーカー遺伝子の片側にある直接反復配列としてのTDH3プロモーター配列の2つのコピーと、第2のTDH3プロモーター反復配列の直ぐ下流にあるM.アルピナ(M.alpina)ole1遺伝子によって置換されている。選択マーカーのループ・アウトをもたらす第2の組み換えイベントを、URA3遺伝子を発現する細胞には毒性のある5’−フルオロオロチン酸(5−FOA)を含む培地上に形質転換体を再播種することで、選択した。これによって、POX1遺伝子が、TDH3プロモーターの制御下でM.アルピナ(M.alpina)ole1によって置換されている株が得られた。
遺伝子標的二連基質の部分1(図16)の構築をおこなうために、TDH3プロモーターが後に続くK.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(3’末端方向)からなるフラグメントを、プラスミドPWJ716−TD1を用いて、PCRにより増幅した。この際、プライマーとして、5’CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC3’及び5’GGGGGGAAGAGGAGTTGCCATTTTGTTTGTTTATGTGTG3’を用いた。更に、実施例1の記載通りに単離したM.アルピナ(M.alpina)ole1遺伝子(配列番号:1)をPCRによって再び増幅させた。この際、プライマーとして5’ATGGCAACTCCTCTTCCCCCCTCC3’及び5’TTGTTATTGTAATGTGATACCTATTCGGCCTTGACGTGG3’を用いた。POX1の下流にある標的配列をPCRによって酵母ゲノムDNAから増幅した。この際、プライマーとして、5’GTATCACATTACAATAACAATTCCTTCGAACCCTCTGTTTTGC3’及び5’TTAGAGCTTCATTCCAACAAGTGCC3’を用いた。次に、これら3つのフラグメントを、PCRを2ラウンドおこなうことで、融合させた。最初に、M.アルピナ(M.alpina)ole1遺伝子を下流標的配列に融合させた。この際、プライマーとして、5’ATGGCAACTCCTCTTCCCCCCTCC3’及び5’TTAGAGCTTCATTCCAACAAGTGCC3’を用いた。次に、結果として得られるフラグメントを、TDH3プロモーターが後に続くK.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(3’末端方向)を含むフラグメントに、融合させた。結果として得られるフラグメント、すなわちpADH1−5’2/3K.lactis URA3−pTDH3−M.アルピナ(M.alpina)ole1−DOWN(POX−1)は、標的二連基質の部分1を構成した。
DGA1の過剰発現
ジアシルグリセロール・アシルトランスフェラーゼをコードする酵母遺伝子DGA1を、強力な酵母構成プロモーターによって過剰発現させた。このことを、遺伝子標的二連基質に基づいたプロモーター置換法を用いて野生型DGA1プロモーターをTDH3プロモーターと置き換えたことによって、おこなった(図15)。K.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(3’末端方向)からなる二連基質の一部分を、TDH3プロモーター配列とDGA1の先頭部分に一致する下流標的配列と融合させた。DGA1の上流にある標的配列からなる二連基質の第2の部分を、TDH3 プロモーター配列及びK.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(5’末端方向)に融合させた。二連基質による形質転換とウラシル欠損培地上での選択の後、形質転換体を得た。この形質転換体では、野生型プロモーターがノック・アウトされ、かつK.ラクチス(K.lactis)URA3マーカー遺伝子の片側にある直接反復配列としてのTDH3プロモーター配列の2つのコピーによって置き換えられた。選択マーカーのループ・アウトをもたらす第2の組み換えイベントを、URA3遺伝子を発現する細胞には毒性のある5’−フルオロオロチン酸(5−FOA)を含む培地上に形質転換体を再播種することで、選択した。このことから、野生型DGA1プロモーターがTDH3プロモーターによって置き換えられている株が得られた。
遺伝子標的二連基質の部分1(図15)の構築をおこなうために、TDH3プロモーターが後に続くK.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(3’末端方向)からなるフラグメントを、プラスミドPWJ716−TD1を用いて、PCRにより増幅した。この際、プライマーとして、5’CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC3’及び5’TITGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCGAAACTAAG3’を用いた。更に、DGA1の先頭部分に一致する下流標的配列を、酵母ゲノムDNAからPCRを用いて増幅させた。この際、プライマーとして、5’CGAATAAACACACATAAACAAACAAAATGTCAGGAACATTCAATGATATA3’及び5’GTTTTAAATTGACAGTTTTAATCAAACTTATAGGG3’を用いた。次に、これらのフラグメントを、PCRを用いて融合させた。この際、プライマーとして、5’CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC3’及び5’GTTTTAAATTGACAGTTTTAATCAAACTTATAGGG3’を用いた。結果として生ずるフラグメント3’ pADH1-5’2/3K.lactis URA3−pTDH3−DOWN(DGA1)は、標的二連基質の部分1を構成した。
GAT1、SLC1、及びYDR531W
グリセロール−3−ホスフェート・アシルトランスフェラーゼをコードする酵母遺伝子GAT1,1−アシル−1−sn−グリセロール−3−ホスフェート・アシルトランスフェラーゼをコードするSCL1、及びパントテン酸塩キナーゼをコードすると考えられているYDR531Wという酵母遺伝子を、すべて、遺伝子標的二連基質に基づいたプロモーター置換法を用い、強力な構成TPI1プロモーターによって、過剰発現させた(図15)。各々の過剰発現について、K.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(3’末端方向)からなる二連基質の第一の部分を、TPI1プロモーター配列と、過剰発現すべき遺伝子の先端部分に対応した標的配列を融合させた。過剰発現すべき遺伝子の上流にある標的配列からなる二連基質の第2の部分を、TPI1プロモーター配列及びK.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(5’末端方向)に融合させた。二連基質による形質転換とウラシル欠損培地上での選択の後、形質転換体が得られ、ここでは野生型プロモーターがノック・アウトされ、K.ラクチス(K.lactis)URA3マーカー遺伝子の片側上の直接反復配列としてTPI1プロモーター配列の2つのコピーと置換されている。選択マーカーのループ・アウトをもたらす第2の組み換えイベントの選択は、5−FOA含有培地上に形質転換体を再び播種することで、おこなった。したがって、ポップ・アウト組み換え体では、野生型プロモーターをTPI1プロモーターと置き換えることで、GAT1、SLC1、及びYDR531Wの過剰発現がそれぞれ生じた。
YBR159W及びTSC13の過剰発現
ベータ−ケトアシル−CoA合成酵素をコードする酵母遺伝子YBR159Wとトランス−2−エノイル−CoA還元酵素をコードする酵母遺伝子TSC13とを、遺伝子標的二連基質に基づいたプロモーター置換法(図15)を用いて、強い構成ADH1プロモーターで、両方とも過剰発現させた。各々の過剰発現について、K.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(3’末端方向)からなる二連基質の第1の部分を、ADH1 プロモーター配列と過剰発現させる遺伝子の先頭部分に対応する標的配列とを融合させた。過剰させる遺伝子の上流にある標的配列からなる二連基質の第2の部分を、ADH1 プロモーター配列及びK.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(5’末端方向)に融合させた。二連基質による形質転換とウラシル欠損培地上での選択の後、形質転換体を得た。この形質転換体では、野生型プロモーターをノック・アウトし、K.ラクチス(K.lactis)URA3マーカー遺伝子の片側に直接反復配列としてADH1プロモーター配列の2つのコピーと置き換えた。選択マーカーのループ・アウトをもたらす第2の組み換えイベントの選択を、5−FOA含有培地上で形質転換体を置換させることでおこなった。ポップ・アウト組み換え体では、したがって、野生型プロモーターをADH1プロモーターと置換することで、YBR159W及びTSC13の過剰発現がそれぞれ得られた。
遺伝子標的二連基質(図15)を構築するために、K.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(3’末端方向)及びADH1プロモーターのフラグメントを、プラスミドpWAD1を増幅させた。この際、YBR159W標的配列に対してはプライマー対5’CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC3’及び5’TGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC3’を用い、TSC13標的配列に対してはプライマー対5’GCATACAATCAACTATCTCATATACAATGCCTATCACCATAAAAAGCC3’及び5’GGAAGCCGTAGCCAAAGTAACC3’を用いた。最終的に、YBR159W及びTSC13下流標的配列を、K.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(3’末端方向及びADH1プロモーターからなるフラグメントと、PCRにより融合させた。YBR159Wについては、プライマー対5’CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC3’及び5’GACCAACATTATTGACCAAAACGG3’を用いて融合反応をおこない、TSC13ついては、プライマー対5’CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC3’及び5’GGAAGCCGTAGCCAAAGTAACC3’を用いた。結果として得られる融合産物3’pADH1−5’2/3K.lactis URA3−PADH1−DOWN(YBR159W)及び3’pADH1−5’2/3K.lactis URA3−pADH1−DOWN(TSC13)は、YBR159W及びTSC13プロモーター置換にそれぞれ用いられる標的二連基質の部分1であった。
菌類ATP:クエン酸リアーゼのサブユニットをコードする遺伝子の単離
菌類ATP:クエン酸リアーゼは、別々の遺伝子によってコードされる2つのサブユニットからなる。油性酵母ソルダリア・マクロスポラ(Sordaria macrospora)では、これら2つのサブユニットが遺伝子acl1及びacl2によってコードされている(Minou et al.2000 Curr Genet 37:189−193)。S.マクロスポラ(S.macrospora)acl1及びacl2のコード配列を、テンプレートとしてS.マクロスポラ(S.macrospora)CBS957.73由来の第1鎖cDNAからPCRによって単離した。増幅に用いた所定のプライマーは、公表されたacl1のコード配列(配列番号:80)及びacl2のコード配列(配列番号:82)であった。手順を以下に説明する:
S.セレビシエ(S.cerevisiae)のゲノム内への菌類ATP:クエン酸リアーゼのサブユニットをコードする遺伝子の取り込み
ATP:クエン酸リアーゼ(acl1及びacl2)の2つのサブユニットを組込むために使われる戦略を図17に示す。ゲノムへの組込みのための親株として、FS10396(POX1遺伝子座に組み込まれたM.アルピナ(M.alpina)ole1を有する株)を選択した。acl1及びacl2遺伝子を、この株のM.アルピナ(M.alpina)ole1遺伝子の下流に組み込んだ。この際、4種類の線状フラグメント、すなわちACL−F1、ACL−F2、ACL−F3、及びACL−F4からなる遺伝子標的基質を用いた。ACL−F1は、正配向のCYCターミネーター配列と逆配向のADH1ターミネーター配列に加えて、ゲノム内の正しい位置に基質を向けるための上流標的配列を含む。ACL−F1は、それに加えて、ACL−F2の5’末端と同一である20bpの3’配列を含んだ。ACL−F2は、TDH3プロモーターの制御下、逆方向のacl2遺伝子を含み、正配向のADH1プロモーターと融合した。ACL−F2は、更に、ACL−F3の5’末端と同一である20bpの3’配列を含むのものであった。ACL−F3は、正配向のADH1プロモーター配列が後に続く逆配向の完全K.ラクチス(K.lactis)URA3マーカー遺伝子からなるものであった。ACL−F4は、acl1遺伝子からなり、ゲノム内の正しい位置に基質を向けるために使われる下流標的配列に融合した。更に、ACL−F4は、ACL−F3の3’末端と同一である20bpの5’配列を含んだ。
フラグメントACL−F1を構築するために、M.アルピナ(M.alpina)ole1の5’末端に対応する上流標的配列を最初に、PCRで増幅した。この際、テンプレートとしてゲノムDNAを用い、プライマーとして5’CAACGCTATCCGCTTTTACCAGT3’及び5’CTATTCGGCCTTGACGTGGTCAGTGC3’を用いた。更に、逆配向でCYC1及びADH1ターミネーターを含むフラグメントを、PCRにより増幅させた。この際、プラスミドp300をテンプレートとして用い、またプライマーとして、5’GCACTGACCACGTCAAGGCCGAATAGCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGG3’及び5’GTGCGGTGGAGTTCCAGGCCTAACGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTA3’を用いた。その結果、フラグメントACL−F1が得られた。
プラスミドpESC−URA−elo−デルタ−5−ATの構築
プラスミドpESC−URA−elo−デルタ−5−ATは、pESC−URA−elo−デルタ−5の分岐GAL10/GAL1プロモーターと引き替えに、短いバージョンのTDH3及びADH1プロモーターを含む。短いバージョン(TDH3及びADH1開始コドンのそれぞれ674及び439bp上流に一致するフラグメント)のTDH3及びADH1プロモーターをPCRによって増幅した。この際、酵母ゲノムDNAをテンプレートとして用い、またpTDH3増幅に対してはプライマー対5’AAGCGGCCGCTTTΓGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCG3’及び5’AAATGGAAAAAGGGTAGTGAAAAGTTTATCATTATCAATACTGCCATTTC3’を用い、またpADH1増幅に対してはプライマー対5’TTTCACTACCCTTTTTCCATTTGCCATC3’及び5’TTCCCGGGTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC3’を用いた。次に、2つのフラグメントをPCRで融合した。この際、プライマー5’AAGCGGCCGCTTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCG3’及び5’TTCCCGGGTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC3’を用いた。このことによって、分岐配向にあるTDH3及びADH1プロモーターの短いバーションからなるフラグメントが得られ、該フラグメントは、NotI制限部位を5’末端に有し、またXmaI制限部位を3’末端に有した。NotI及びXmaIによる制限の後、フラグメントをNotI/XmaI消化pESC−URA−elo−デルタ−5に導入した。これによって、プラスミドpESC−URA−elo−デルタ−5−ATが得られ、分岐GAL10/GAL1プロモーターが分岐TDH3/ADH1プロモーターと置き換わっている。PCRにより生じた突然変異がpESC−URA−elo−デルタ−5−ATにないことは、pTDH3/pADH1プロモーター配列のシークエンシングによって確認した。
アンモニア同化改変とFAS過剰発現との組合わせ
GDH1遺伝子の欠失並びにGDH2遺伝子又はGLN1及びGLT1遺伝子の過剰発現は、酵母のアンモニア同化経路の共同因子依存性の変化をもたらし、このような改変を受けた株は、脂肪酸合成に用いられるNADPHの有用性が高まるように思われる。したがって、GDH1の欠失及びGDH2の過剰発現を、FAS1及びFAS2の過剰発現と組み合わせた。同様に、GDH1の欠失及びGLN1及びGLT1の過剰発現もまた、FAS1及びFAS2の過剰発現と組み合わせた。このことは、アンモニア同化改変を含む株とFAS1及びFAS2の過剰発現を含む株とを交配させることでおこなった。結果として生ずる二倍体の芽胞形成、子嚢の芽胞形成及び切開に続いて、新規の一倍体を、所望同定の遺伝的改変を有するかどうか同定した。上記アンモニア同化改変を有する本実施例で用いたCEN.PK株を、CEN.MS1−10C T1及びCEN.MS5−3A株から誘導した。これらの株は、Microbial Biotechnology,Bio−Centrum DTU,Technical University of Denmarkの好意により入手されたものである。手順は以下のとおりである。
poxl::pTDH3−M.アルピナ(M.alpina)ole1改変とFAS過剰発現及びACC1過剰発現との組み合わせ
M.アルピナ(M.alpina)ole1の遺伝的組込みをFAS1及びFAS2の過剰発現と組み合わせるために、FS01368(MATalpha ura3 trp1 poxl::pTDH3−M.アルピナ(M.alpina)ole1、実施例8)を、F01372(MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1−FAS2、実施例26)と交配させた。二倍体の同定を、交配から単一コロニーに細胞をストリーク・アウトし、多数のコロニーをマスター・プレートに移し、選択されたコロニーが芽胞形成培地での芽胞形成能を持つか試験することで、おこなった。芽胞形成後、子嚢を切り開いて子嚢胞子四分子にした。結果として生ずるADH1−FAS1及びpADH1−FAS2過剰発現の一倍体の存在と、poxl::pTDH3−M.アルピナ(M.alpina)ole1改変の存在とを、適当なプライマーを用いたコロニーPCRで決定し、標準方法を用いて交配型を記録した。交配によって生じた一倍体株の組から、遺伝子型MATa ura3 trp1 pADH1−FAS1 pADH1−FAS2 poxl::pTDH3−M.アルピナ(M.alpina)ole1を持つ株を選択し、これをFS01396と命名した。更に、遺伝子型MATalpha ura3 trp1 pADH1−FAS1 poxl::pTDH3−M.アルピナ(M.alpina)ole1を持つ株を選択し、これをFS01408と命名した。
遺伝子組み換え酵母でのアラキドン酸への経路の発現
先行する実施例に記載した改変株背景でのアラキドン酸への経路を発現させるために、改変株をプラスミドpESC−TRP−デルタ−12 デルタ−6及びpESC−URA−elo−デルタ−5によって同時形質転換させた。形質転換によって生じる株の概要を表4に示す。
振とうフラスコ内でのアラキドン酸産生酵母株の脂肪酸組成
株FS01324(MATa ura3 trp1[pESC−TRP−デルタ−12 デルタ−6][pESC−URA−elo−デルタ−5])とその代謝的に改変された株FS01373、FS01413、FS01369、FS01371、FS01417、FS01414、FS01415、FS01416、FS01418、FS01429、FS01430、FS01431、FS01439、及びFS01442(実施例37)を実施例9に記載したように、17℃で振とうフラスコ内で培養した。炭素源欠乏後、脂質を抽出し、その株の脂質組成を実施例45に記載したようにして分析した。分析の結果を表5に示す。ピークを完全分離するSP−Xカラムを用いて、試料すべてを分析した。比較のために、実施例12(表2)示す結果は、JW−1701カラムを用いて得られたものであり、このカラムはピークを完全に分けるものではないことから、結果として、より小さいピークの面積比の過剰評価となる。
振とうフラスコでのアラキドン酸産生酵母の脂質収率
参照株FS01324(MATa ura3 trp1[pESC−TRP−デルタ−12 デルタ−6][pESC−URA−eIo−デルタ−5])と代謝的に改変された株FS01373、FS01413、FS01369、FS01371、FS01417、FS01414、FS01415、FS01416、FS01418、FS01429、FS01430、FS01431、及びFS01439(実施例37)を実施例19に記載したように、17℃で培養した。脂質を実施例44に記載したように抽出して定量した。改変された株の脂質収率、バイオマス収率、及びアラキドン酸収率を表6にまとめる。
ケモスタット発酵
連続培養を、ブラウン・バイオスタット(Braun Biostat)B発酵槽(Braun Biotech International)でおこなった。限定最小培地中での48時間振とうフラスコ培養から得た細胞を用い、日立製作所製U−100分光光度計(日本東京)による測定でOD600が0.2となるように、1.0リットル培地への植菌をおこなった。発酵は、17℃で、2MのKOHで調製したpH5.0でおこなった。泡立ちは、1リットルの培地あたり100μlの消泡剤(Antiform 204,Sigma−Aldrich,St Louis,Missouri)を用いて防いだ。好気条件は、溶存酸素濃度が60%を上回るように、流速1.5〜2.5リットル/分で滅菌空気を発酵槽にまき散らすことで得た。撹拌速度を800rpmに保ち、流出二酸化炭素ガス濃度をブルーエル・カイヤー(Bruel and Kjaer)音響ガス分析装置(Bruel&Kjaer,Denmark)によって測定した。炭素源が消費された後、希釈率0.05h−1で段階制御連続発酵モードを適用した。
ケモスタット発酵で使用される増殖培地
グルコース又はエタノールを炭素源とする炭素制限培地は、12.5g/lのグルコース又は10/lのエタノール、5g/lの(NH4)2SO4、3g/lのKH2PO4、0.5g/lのMgSO4・7H2O、1ml/lのビタミン溶液、1ml/lの微量金属溶液を含むものとした。グルコース/ガラクトース炭素制限最少培地は、2.5g/lのグルコース、10g/lのガラクトース、5g/lの(NH4)2SO4、3g/lのKH2PO4、0.5g/lのMgSO4・7H2O、1ml/lのビタミン溶液、及び1ml/lの微量金属溶液を含むものとした。上記したすべての培地について、ビタミン溶液は、50mg/lのビオチン、1g/lのパントテン酸カルシウム、1g/lのニコチン酸、25g/lのミオイノシトール、1g/lのチアミンHCl、1g/lのピリドキサルHCl、及び0.2g/lのパラアミノベンゾン酸を含むものとし、微量金属溶液は、15g/lのEDTA、4.5g/lのZnSO4・7H2O、1g/lのMnCl2・2H2O、0.3g/lのCoCl2・6H2O、0.4g/lのNa2MoO4・2H2O、4.5g/lのCaCl2・2H2O、3g/lのFeSO4・7H2O、1g/lのH3BO3、及び0.1g/lのKIを含むものとした。改良ミオイノシトール欠損培地は、ミオイノシトールを含まず、さもなければブドウ糖/ガラクトース・カーボンを制限された最少培地と同一のものとした。
HPLC分析
培養液中のグルコース、ガラクトース、エタノール、グリセロール、酢酸塩、及びピルビン酸塩濃度は、遠心を介して培養液から細胞を取り除いた後に、ダイオネクス・スミット(Dionex Summit)CLCシステム(Dionex,Sunnyvale,CA)を用いた液体カラム・クロマトグラフィによって測定した。210nmに設定したウオーターズ410ディファレンシアル(Waters 410 Differential)屈折率検出器(Millipore,Milford,MA)及びウオーターズ(Waters)486同調光吸度測定器(UV検出器)とともに、アミネックス(Aminex)HPX−87Hカラム(BioRad,Hercules,CA)を60℃で用いた。2つの検出器を直列に接続した。移動相として、5mMのH2SO4を流速0.6ml/分で用いた。
バイオマス乾燥重量測定
細胞乾燥重量の測定は、既知量の培養液を、予め計量した0.45μmスポア(Supor)膜(Pall Corporation,Ann Arbor,MI)フィルターで濾過することで、おこなった。1容量の蒸留水で洗い、かつ150Wで15分間にわたり電子レンジによる乾燥をおこなった後、フィルターを再び計量した。
総脂質分析
総脂質収量を分析するために、バイオマスを、5分間、5000rpmの遠心にかけて分離した。バイオマスを10mlの蒸留水に再び溶解させ、結果として生ずる細胞懸濁液をガラス・ビーズ法で破壊し、細胞抽出物を生成した。細胞抽出物の調製は、直径250乃至500μmのガラス・ビーズ(Sigma−Aldrich,St Louis,Missouri)1mlをスクリュー・キャップが付いた微小管に入った1mlの細胞懸濁液に対して添加することでおこなった。各々の細胞懸濁液に対して、6本の試験管を処理した。試験管を、ファスト・プレプ(FastPrep)FP120機器(Qbiogene,France)で20秒間、レベル4で、振とうさせた。これを各管あたり6ラウンドおこない、その際、3ラウンド後に、管を5分間氷冷させた。600μlの細胞抽出物を移すことで2mlエッペンドルフ管内で細胞抽出物の混ぜ合わせをおこない、各々がガラス・ビーズ無しの1.2ml細胞抽出物を含む3本のエッペンドルフ管を得た。1mlの細胞抽出物を、20mlクロロホルム/メタノール(2:1)を含むねじ蓋付きのガラス管に移した。この管内に窒素を拡散させ、直ちに密閉し、回転混合機にセットし、総質量抽出を一晩おこなった。これを3回反復しておこなった。抽出物をワットマン(Whatman)フィルター(Whatman International,England)で濾過し、回収した溶媒を、予め計量した10mlガラス管内で、4mlのNaClで洗い、最終的に窒素で乾燥させた。乾燥脂質分画を持つこの管を計量し、当初の細胞懸濁液1ml中のバイオマスの乾燥重量で脂質乾燥重量を割る計算をおこなうことで、脂質収量を決定した。
脂質のエステル転移反応とGC−MS分析
総脂質量を測定するために乾燥脂を生成し(実施例44)、また乾燥脂質を1mlのトルエンと2mlの1%硫酸含有メタノールに添加した。窒素との混合及び窒素の拡散後に、管を閉じ、脂質のエステル転移反応のために一晩50℃に置いた。次に試料を5mlの5%NaCl溶液で洗浄した。続いて、5mlのヘキサンを添加することで2回抽出し、試料をボルテックス処理し、有機上相を回収した。有機相を4mlの2%炭酸ナトリウムで洗い、有機相を再び回収した。水相の痕跡を、無水硫酸ナトリウムを添加し、試料をワットマン(Whatman)濾紙(Whatman International,England)で濾過することで取り除き、硫酸ナトリウムを除去した。次に、ヘキサン相を窒素気流で乾燥させた。乾燥した場合、二重結合を保護するために0.01%ブチルオキシトルエン(BHT)(Sigma−Aldrich,St Louis,Missouri)含有ヘキサン0.5mlに、試料を再び溶解させ、メチルセルロースについて試料を分析した。分析は、ガスクロマトグラフ質量分析計(GC/MS)を用いておこなった。GC/MS装置を、70eVで作動するガスクロマトグラフ4重質量選択検出器(EI)を備えたヒューレットパッカード(Hewlett Packard)HPG1723Aとした。カラムとして、スペルコ(Spelco)SP(登録商標)−2380を使用した。上記MSをスキャン(SCAN)モードで作動させた。オーブン温度を、当初170℃とし、その後4℃/分で220℃まで上昇させた。最終温度で15分間保った。カラム内の流れを0.6mlHe/分とした。注入量を1〜5μlとした。すべての分析で、インジェクターを100:1スプリットレスのスプリットで駆動させた。注入口の温度を300℃とし、界面温度を230℃、更に四重温度105℃とした。検出された脂肪酸メチルエステルを、1998NIST質量スペクトル・データベースを確認し、持続時間は標準的脂肪酸メチルエステルで確認した。
連続発酵でのアラキドン酸産生酵母株の分析
参照株FS01324(MATa ura3 trp1[pESC−TRP−デルタ−12 デルタ−6] [pESC−URA−elo−デルタ−5])及び代謝改変された株FS01373及びFS01413(実施例37)を実施例40に記載したようにケモスタット培養で増殖させた。培地を、実施例41に記載したように、グルコース/ガラクトース炭素制限最小培地とした。定常状態で、上記実施例に記載したように、HPLC分析、バイオマス乾燥重量、脂質収量、及び脂肪酸組成の分析に、試料を供した。分析のまとめを表7に示す。
増加アラキドン酸収量のための培地最適化
野生株CEN.PK113−7D、参照株FS01324(MATa ura3 trp1[pESC−TRP−デルタ−12 デルタ−6] [pESC−URA−elo−デルタ−5])、及び代謝改変された株FS01373、FS01413、FS01417、及びFS01430(実施例37)を、実施例40の記載どおりに、ケモスタット培養で増殖させた。これらの実験で使用した培地は改変炭素制限最小培地であり、この培地はミオイノシトールを含まなかった(実施例41)。定常状態で、上記実施例に記載したように、HPLC分析、バイオマス乾燥重量、脂質収量、及び脂肪酸組成の分析に、試料を供した。分析のまとめを表8に示す。
全脂肪酸収量増加のための培地最適化
振とうフラスコ実験(実施例39)の結果と比較して、改変株は、実施例46及び47のケモスタット培養で、参照株と比較して脂質収量の増加がみられなかった。このことは、実験が脂質集積には最適ではない炭素制限化で行われることに起因していると思われる。したがって、代謝改変された株が、脂質集積を促進する条件下で分析した場合、参照株に比較して脂質収量の増加が起こり得る。脂質蓄積のためのケモスタット条件を最適化するために、野生株CEN.PK113−7Dを、異なる培地組成物で実施例40に記載したように、ケモスタットで増殖させた。これらの実験で使用した培地は、(i)炭素源としてのグルコースを有する炭素制限、(ii)炭素源としてグルコースを有する窒素制限、(iii)炭素源としてエタノールを有する炭素制限、或いは、(iv)炭素源としてエタノールを有する窒素制限のいずれかであった(実施例41)。定常状態で、上記実施例に記載したように、HPLC分析、バイオマス乾燥重量、及び脂質収量の分析に、試料を供した。分析のまとめを表9に示す。
最適化増殖培地による連続発酵でのアラキドン酸産生酵母株の分析
参照株FS01324(MATa ura3 trp1[pESC−TRP−デルタ−12 デルタ−6] [pESC−URA−elo−デルタ−5])及び改変株FS01373、FS01413、FS01369、FS01371、FS01417、FS01414、FS01415、FS01416、FS01418、FS01429、FS01430、FS01431、FS01439、及びFS01442(実施例37)を、窒素制限、ミノイノシトール欠損培地を用いた連続培養で増殖させた。定常状態で、上記実施例に記載したように、HPLC分析、バイオマス乾燥重量、脂質収量、及び脂肪酸組成の分析に、試料を供した。窒素制限培地を使用することで、脂肪収量の増加を導くことが予想されることから、アラキドン酸収量の増加をもたらす。また、脂質収量の改善を目的とした遺伝子組み換えがなされた株は、窒素制限培地で参照株よりも脂質収量が高くなる可能性がある。
デルタ−12不飽和化酵素、デルタ−6不飽和化酵素、デルタ−6伸長酵素、及びデルタ−5不飽和化酵素をコードする遺伝子を含む単一酵母発現ベクターであるp300の構築
PUFA経路の発現に必要なプラスミドの数を少なくするために、アラキドン酸生産に必要な4つの遺伝子(−12不飽和化酵素、デルタ−6不飽和化酵素、デルタ6−伸長酵素、及びデルタ−5不飽和化酵素をコードするM.アルピナ(M.alpina)遺伝子)を単一のプラスミドp300に配置した。p300を構築するために用いた戦略を図19に示した。最初に、第2のPacI制限部位をNheI制限部位でpESC−TRP−デルタ−12 デルタ−6に導入した。この目的のために、パリンドローム合成オリゴヌクレオチド5’CTAGCAATTCCTTAATTAAGGAATTG3’を用いた。このオリゴヌクレオチドは、それ自体をアニールし、PacI制限部位とNheI制限部位に一致する両端のオーバーハングとを含む二本鎖DNAフラグメントを生ずる。このフラグメントを、pESC−TRP−デルタ−12 デルタ−6のNheI制限部位にクローニングすることで、プラスミドpESC−TRP−デルタ−12 デルタ−6−PacIが得られた。次に、背中合わせの配向にあるADH1及びCYC1ターミネーター配列を含むフラグメントを、pESC−TRP−デルタ−12 デルタ−6−PacIに導入した。ADH1−CYC1−ターミネーター・フラグメントを構築するために、ADH1ターミネーターをPCRで増幅させ、この際プライマーとして5’TGTTCTCGAGAAGGTGTTGAGCGACCTCATGCTATACCTGAGAAAG3’及び5’CCATCGATGGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTA3’を用い、またCYC1ターミネーターをPCRで増幅させ、この際プライマーとして5’GAAGATCTTCCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGG3’及び5’AACACCTTCTCGAGAACACTTCGAGCGTCCCAAAACC3’を用い、両方の反応のテンプレートとしてpESC−URAを用いた。ADH1及びCYC1ターミネーター・フラグメントの精製後、それらをプライマー5’GAAGATCTTCCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGG3’及び5’CCATCGATGGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTA3’を用いてPCRにより増幅させた。これらのプライマーに含まれるClaI及びBgIII制限部位によって、ADH1-CYC1-ターミネーター・フラグメントをClaI/BglII消化pESC−TRP−デルタ−12 デルタ−6−PacIに導入し、結果としてプラスミドpESC−TRP−デルタ−12 デルタ−6−PacI−Tが得られた。ターミネーター配列に変異が存在しないことを、pESC−TRP−デルタ−12 デルタ−6−PacI−Tのシークエンシングによって確認した。プラスミドp300を構築するために、pESC−TRP−デルタ−12 デルタ−6−PacI−TをPadにより消化することで、デルタ−12不飽和化酵素をコードするM.アルピナ(M.alpina)遺伝子、分岐GAL1/GAL10プロモーター、M.アルピナ(M.alpina)デルタ−6不飽和化酵素をコードする遺伝子、ADH1ターミネーター、並びにCYCターミネーターを含むインサート(図19)の放出をもたらした。このインサートを、精製し、Pad消化pESC−URA−elo−デルタ−5に導入することで、結果としてプラスミドp300が得られた。p300内のpESC−TRP−デルタ−12 デルタ−6−PacI−T-由来インサートの正確な配向を制限分析によって確認した。
A.タリアナ(A.thaliana)由来オメガ−3不飽和化酵素の酵母発現ベクターへのクローニング
オメガ−3不飽和化酵素をコードするFAD3遺伝子(配列番号:32)をA.タリアナ(A.thaliana)cDNA調製品(植物正常組織第1鎖cDNA/シロイヌナズナ(Arabidopsis)、ゲントール・モルキュラー・プロダクト(Gentaur Molecular Products))から増幅させた。この際、プライマーとして、5’GGTCTCGAGCCACCATGGTTGTTGCTATGGACCAAC3’及び5’GGGGTACCATTAATTGATTTTAGATTTGTCAGAAGCGTAA3’を用いた。これらのプライマーによって、遺伝子の5’及び3’末端に、それぞれXhoI及びKpNI制限部位が導入される。A.タリアナ(A.thaliana)FAD3遺伝子を、XhpI/KpNI消化pESC−TRPに導入することで、プラスミドpESC−TRP−Aro3を得た。A.タリアナ(A.thaliana)FAD3に変異がないことを、pESC−TRP−Aro3のシークエンシングにより確認した。
サッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)からの酵母発現ベクターへのオメガ−3不飽和化酵素のクローニング
オメガ−3不飽和化酵素をコードするS.クルイベリ(S.kluyveri)FAD3(配列番号:87)をS.クルイベリ(S.kluyveri)由来ゲノムDNA調製品から増幅させた。この際、プライマーとして、5’GGTCTCGAGCCACCATGTCTATTGAAACAGTCGG3’及び5’GGCCGCGGATCATTGACTGGAACCATCTT3’を用いた。これらのプライマーによって、この遺伝子の5’及び3’末端に、それぞれXhoI及びSacII制限部位を導入した。S.クルイベリ(S.kluyveri)FAD3遺伝子を、XhoI/SacII消化pESC−TRPに導入し、結果としてプラスミドpESC−TRP−SK33を得た。クルイベリ(S.kluyveri)FAD3に変異がないことを、pESC−TRP−SK33のシークエンシングにより確認した。
S.クルイベリ(S.kluyveri)からのオメガ−3不飽和化酵素の発現及びp300の評価
酵母FS01267株(MATa trp1 ura3)に対して、p300及びpESC−TRP−SK33による同時形質転換をおこなった。形質転換体をウラシル及びトリプトファン欠損培地でおこない、更に同一培地上でストリーク精製をおこなった。形質転換株をFS01432と命名した。FS01432を実施例9の記載どおりに振とうフラスコで増殖させ、脂肪酸組成物を実施例45の記載どおりに分析した。FS01432、参照株FS01324、及びS.クルイベリ(S.kluyveri)Y159の脂肪酸分析を表10に示した。分析の結果によれば、FS10432株は、S.クルイベリ(S.kluyveri)由来オメガ−3不飽和化酵素及びアラキドン酸への経路を発現するものであり、アルファ−リノール酸と小量のステアリン酸とを含んでいた。この株のアルファ−リノール酸含有量は、ガンマ−リノール酸含有量よりも高いことから、S.クルイベリ(S.kluyveri)由来のオメガ−3不飽和化酵素が、M.アルピナ(M.alpina)由来のデルタ−6不飽和化酵素よりも、リノール酸をより効率的に不飽和化することを示している。
ベクターpESC−LEU−SK33の構築
ベクターpESC−LEU−SK33を構築するために、S.クルイベリ(S.kluyveri)FAD3を、ApaI及びNheIによる消化によりpESC−TRP−SK33(実施例52)から放出させ、ApaI/NheI消化pESC−LEUに導入することで、プラスミドpESC−LEU−SK33を得た(実施例20A)。S.クルイベリ(S.kluyveri)FAD3の正確な挿入を制限分析によって確認した。
ベクターpESC−LEU−Ssc2の構築
ベクターpESC−LEU−Ssc2を構築するために、マウスSsc2を、BgIII及びPacIによる消化によりpESC−TRP−デルタ−5elo(実施例15)から放出させ、BgIII/PacI消化pESC−LEUに導入することで、プラスミドpESC−LEU−Ssc2を得た(図20B)。マウスSsc2の正確な挿入を制限分析によって確認した。
ベクターpESC−LUE−Ssc2−SK33の構築
ベクターpESC−LUE−Ssc2−SK33を構築するために、S.クルイベリ(S.kluyveri)FAD3を、ApaI及びNheIによる消化によってpESC−TRP−デルタ−5elo(実施例52)から放出させ、ApaI/NheI消化pESC−LEU−Ssc2−SK33(実施例55)に導入することで、プラスミドpESC−LUE−Ssc2−SK33を得た(図20C)。S.クルイベリ(S.kluyveri)FAD3の正確な挿入を制限分析によって確認した。
pox1::pTDH3−M.アルピナ(M.alpina)ole1背景でのleu2突然変異の導入
ゲノムに組み込まれたM.アルピナ(M.alpina)ole1を持つ株でURA3、trp1、及びLEU2マーカーを各々が持つ3つのプラスミドからPUFA経路の発現を可能にするために、leu2突然変異をこの株の背景に導入した。この目的のために、FS01358(MATalpha ura3 trp1 pox1::pTDH3−M.アルピナ(M.alpina)ole1)をFS01277(MATa ura3 Ieu2 trp1)と交配させた。二倍体の同定は、単一コロニーとの交配から細胞をストリーク・アウトし、いくつかのコロニーをマスター・プレートに移し、更に、選択されたコロニーの芽胞形成培地での芽胞形成能について試験することによって、おこなった芽胞形成後、子嚢を切り開いて子嚢胞子四分子にした。pox1::pTDH3−M.アルピナ(M.alpina)ole1改変の存在は、適当なプライマーを用いたコロニーPCRによって判断した。交配由来の一倍体株の組から、遺伝子型MATalpha ura3 trp1 pox1::pTDH3−M.アルピナ(M.alpina)ole1を持つ株を選択し、これをFS01444と命名した。
S.セレビシエ(S.cerevisiae)でのエイコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸、及びドコサペンタエン酸への経路の発現
S.セレビシエ(S.cerevisiae)でのエイコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸、及びドコサペンタエン酸への経路を発現させるために、実施例54〜56で構築したプラスミドを、2種類のプラスミドpESC−TRP−デルタ−12 デルタ−6及びpESC−URA−elo−デルタ−5とともに酵母に導入することで、結果として株FS01446、FS01447、及びFS01448が得られた(表11)。
スラウストキトリウム(Thraustochytrium)由来の合成デルタ−4不飽和化酵素のコドン最適化及び構築
合成デルタ−4不飽和化酵素の酵母発現ベクターへのクローニング
合成により構築された、デルタ−4不飽和化酵素(実施例59)をコードする遺伝子をXmaI及びSacIIによって消化し、XmaI/SacII消化pESC−LEU−Ssc2に導入し、その結果としてプラスミドpESC−LEU−Ssc2−デルタ−4dが得られた(図23)。
S.セレビシエ(S.cerevisiae)のゲノムへのS.クルイベリ(S.kluyveri)FAD3の組込み
オメガ−3不飽和化酵素をコードするS.クルイベリ(S.kluyveri)FAD3遺伝子を、S.セレビシエ(S.cerevisiae)のゲノムに組込み、酵母GAL1プロモーターの制御下に置くことで、この遺伝子をノックアウトした(実施例66も参照)。この組込みは、遺伝子標的二連基質を用いて、同一組み換えを介しておこなった(図24)。K.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(3’末端方向)からなる二連基質の第1の部分をGAL1プロモーター配列、S.クルイベリ(S.kluyveri)FAD3遺伝子、及びGPP1の下流にある標的配列に融合させた。GPP1の上流にある標的配列からなる二連基質の第2の部分に、GAL1プロモーター配列おおびK.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3(5’末端方向)を融合させた。GPP1がノックアウトされ、第2のGAL1プロモーター反復配列の直下流にあるK.ラクチス(K.lactis)URA3マーカー遺伝子及びS.クルイベリ(S.kluyveri)FAD3遺伝子の片側に直接反復配列として、GAL1プロモーター配列の2つのコピーと置換された。選択マーカーのループ・アウトをもたらす第2の組み換えイベントを、URA3遺伝子を発現する細胞には毒性のある5’−フルオロオロチン酸(5−FOA)を含む培地上に形質転換体を再播種することで、選択した。この結果、GPP1遺伝子が、GAL1プロモーターによる制御下、S.クルイベリ(S.kluyveri)FAD3によって置き換えられた株が得られた。
遺伝子標的二連基質の第1の部分を構築するために、S.クルイベリ(S.kluyveri)FAD3の直上流にGAL1プロモーターを含むフラグメントを含むフラグメントを、プラスミドpESC−TRP−SK33から増幅した(pESC−TRP−SK33の構築に関して実施例10参照)。この際、プライマーとして、5’ACTACATCATCGAATTCCAGAACGAATCAAATTAACAACCATAG3’及び5’TCATTGACTGGAACCATCTT3’を用いた。S.セレビシエ(S.cerevisiae)GPP1の下流にある標的配列をPCRによって増幅した。この際、テンプレートとしてS.セレビシエ(S.cerevisiae)ゲノムDNAを用い、またプライマーとして5’AAGATGGTTCCAGTCAATGATAAGGATGACTTGTTGAAATGGTAA3’及び5’CCACAAGACTGTTTCCAGAGC3’を用いた。3’末端方向のK.ラクチス(K.lactis)URA3の2/3からなる第3のDNAフラグメントをPCRによって生成した。この際、テンプレートとしてK.ラクチス(K.lactis)URA3を含むプラスミドを、またプライマーとして5’CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC3’及び5’CTGGAATTCGATGATGTAGTTTCTGG3’を用いた。次に、これらのPCRフラグメントを、PCRを2ラウンドおこなう過程で融合した。最初に、GAL1プロモーター及びS.クルイベリ(S.kluyveri)FAD3を含むフラグメントを下流標的配列に融合させた。この際、プライマーとして、5’ACTACATCATCGAATTCCAGAACGAATCAAATTAACAACCATAG3’及び5’CCACAAGACTGTTTCCAGAGC3’を用いた。次に、第1回目の融合反応の産物を3’pADH1-5’2/3K.lactis URA3フラグメントに融合させた。この際、プライマーとして5’CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC3’及び5’CCACAAGACTGTTTCCAGAGC3’を用いた。これによって得られた副産物は、遺伝子標的二連基質の第1の部分を構成する2/3URA3−pGAL1−S.クルイベリ(S.kluyveri)FAD3-DOWNであった。
ドコサエキサエン酸への経路の発現
ドコサエキサエン酸への完全経路を発現するために、FS01460(MATアルファ ura3 trp1 Ieu2 pox1::pTDH3 GPP1::pGAL1−S.クルイベリ(S.kluyveri)FAD3、実施例61)を、プラスミドpESC−TRP−デルタ−12 デルタ−6、pESC−URA−elo−デルタ−5、及びpESC−LEU−Ssc2−デルタ−4dによって同時形質転換させた。形質転換体の選択及びストリーク精製を、ウラシル、トリプトファン、及びロイシンを欠いた培地上でおこなった。次に、形質転換株を、GALプロモーター誘導条件(例えば、実施例9、実施例49)下で培養し、脂肪酸組成を実施例45の記載どおりに分析した。
LRO1の過剰発現
S.セレビシエ(S.cerevisiae)のLRO1によってコードされたアシルトランスフェラーゼを、ホスファチジルコリンの2位にあるアシル鎖からジアグリセロールへの転移を触媒することで、トリアシルグリセロールの形成をもたらす。多飽和化脂肪酸不飽和化は、主にホスファチジルコリンの2位で主に起こる(Domergue,F.et al.(2003)J Biol Chem 278:35115−35126)ことから、LRO1の過剰発現は、多価不飽和脂肪酸のトリアシルグリセロールへの取り込みを増加せ、全体的な多価不飽和脂肪酸含有量の増加をもたらすと思われる。LRO1は、実施例26及び実施例30等に記載されたように、遺伝子標的二連基質に基づいたプロモーター置換法(図15)を用いて、強力な酵母プロモーター(例えば、TDH3, ADH1、TPI1、又はHXT7プロモーター)によって過剰発現される。
ARE1及びARE2の過剰発現
S.セレビシエ(S.cerevisiae)でARE1及びARE2によりコードされるアシルトランスフェラーゼは、ジアシルグリセロールへのアシル鎖の付加を触媒して、トリアシルグリセロールを形成する。ARE1及びARE2の過剰発現は、脂質収量の増加及び全体的な多価不飽和脂肪酸含有量の増加をもたらすと思われる。ARE1及びARE2は、実施例26及び実施例30等に記載されたように、遺伝子標的二連基質に基づいたプロモーター置換法(図15)を用いて、強力な酵母プロモーター(例えば、TDH3, ADH1、TPI1、又はHXT7プロモーター)によって過剰発現される。
ELO1、ELO2、及びELO3の過剰発現
酵母遺伝子ELO1、ELO2、及びELO3は、脂肪酸伸長酵素をコードする。ELO1によってコードされた伸長酵素は、C14脂肪酸からC16種への伸長に感著する(Toke et al.(1996)J Biol Chem 271:18413−18422)。ELO2は、長さが最大で24炭素原子の飽和及び不飽和脂肪酸の合成に関与する伸長酵素をコードする。また、ELO3は、基質範囲が広い伸長酵素をコードする(Oh,C.−S.et al.(1997)J Biol Chem 272:17376−17384)。これらの伸長酵素の過剰発現は、C18脂肪酸含有量、多価不飽和脂肪酸経路の基質の含有量増加に寄与し、それによって多価不飽和脂肪酸の生産を高めることが可能である。ELO1、ELO2、及びELO3は、遺伝子標的二連基質に基づいたプロモーター置換法(図15)を用いて、実施例26及び実施例30に記載されたように、強力な酵母プロモーター、例えばTDH3、ADH1、TPI1、又はHXT7プロモーターによって過剰発現する。
GPP1の過剰発現並びにGPP1及びGPP2の欠失
脂質合成用の汎用前駆体は、酵母ではGPDL1によってコードされるNAD依存グリセロール−3−ホスフェート脱水素酵素の作用によってジヒドロキシアセトンホスフェートから形成されるグリセロール−3−ホスフェートである。グリセロール−3−ホスフェートは、脂質合成経路に入るか、或いはGPP1及びGPP2によってコードされたグリセロール−3−ホスファターゼの作用によって、脱リン酸化されてグリセロールを形成することができる。GPD1の過剰発現とGPP1及びGPP2の欠失によって、グリセロール−3−ホスフェートの有用性が高まる(Nguyen,H.T.T.et al.(2004)Metab Eng.6,155−163)。これらの改変を脂質合成経路でアシルトランスフェラーゼとFAS複合体の過剰発現とに組み合わせることで、脂質収量及び多価不飽和脂肪酸収量が改善されると考えられる。
異種NADP+依存グリセルアルデヒド3−ホスフェート脱水素酵素の発現
NADP+依存グリセルアルデヒド3−ホスフェート脱水素酵素をコードするストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus nutans)GapN遺伝子(配列番号:91)の発現は、脂肪酸合成のための細胞質性NADPHの有用性を高める。S.セレビシエ(S.cerevisiae)ゲノムへのS・ムタンス(S.mutans)GapNの組込みを、FAS1、FAS2、及びACC1の過剰発現と組合わせる。
単一株での遺伝子組み換えの組み合わせ
脂質収量及び/又は多価不飽和脂肪酸収量の改善をもたらす複数の遺伝子組み換えを、株間の交配によって、或いは異なる株背景でのプロモーター置換法を繰り返すことによって、組み合わせられる。例えば、FAS1、FAS2、及びACC1の過剰発現をGAT1、SLC1、並びにDGA1及び/又はLRO1の過剰発現と組み合わせる。
イソクリシス・ガルバナ(Isochrysis galbana)からの合成デルタ−9伸長酵素のコドン最適化及び構築
イソクリシス・ガルバナ(Isochrysis galbana)デルタ−9伸長酵素をコードする配列(配列番号:37)及びユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)由来の合成デルタ−8不飽和酵素をコードする配列(配列番号:38)に対して、「50%理論比よりも低いコドンは破棄」というオプションを付したバックトランスレーション・ツール(Backtranslation tool)(Entelechon)を用いて、S.セレビシエ(S.cerevisiae)での発現に対するコドン最適化をおこなう。次に、コドン最適化遺伝子(それぞれ配列番号:85及び配列番号:86)を、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築し、この構築は、原則的に、デルタ−4不飽和化酵素の構築に関する記載(実施例59)にもとづく。
酵母発現ベクターへの合成デルタ−9伸長酵素及びデルタ−8不飽和化酵素のクローニング
デルタ−9伸長酵素(配列番号:85,実施例70)をコードするコドン最適化遺伝子を酵母発現ベクターpESC−TRP−デルタ−12(実施例12)にクローニングし、その結果としてベクターpESC−TRP−デルタ−12 デルタ−9eが得られる。更に、ベクターpESC−URA−elso−デルタ−5を適当な制限酵素によって消化することで、このプラスミド由来の、M.アルピナ(M.alpina)デルタ6−伸長酵素をコードする遺伝子の放出が生じる。線状プラスミドを精製し、コドン最適化デルタ−8不飽和化酵素(配列番号:86、実施例71)をM.アルピナ(M.alpina) デルタ6−伸長酵素の代わりに導入する。結果として得られるプラスミドをpESC−URA−デルタ−8 デルタ−5と命名する。
コドン最適化デルタ−9伸長酵素及びデルタ−8不飽和化酵素を介したアラキドン酸への経路の発現
好適な酵母株(例えば、FSO1267、FS01368、FS01408、又はFS01423)に対してプラスミドpESC−TRP−デルタ−12 デルタ−9e及びpESC-URA−デルタ−8 デルタ−5による同時形質転換をおこなった。結果として生じた株をGALプロモーター(例えば、実施例9、実施例49)に導入するための適当な条件下で培養し、脂肪酸組成を実施例45の記載どおりに分析する。
コドン最適化デルタ−9伸長酵素及びデルタ−8不飽和化酵素を介したエイコサペンタエン酸への経路の発現
適当な酵母株(例えば、FSO1277又はFS01444)に対してプラスミドpESC−TRP−デルタ−12 デルタ−9e(実施例70)、pESC−URA−デルタ−8 デルタ−5(実施例70)、及びpESC−LEU−SK33(実施例54)による同時形質転換をおこなった。結果として生じた株をGALプロモーター(例えば、実施例9、実施例49)に導入するための適当な条件下で培養し、脂肪酸組成を実施例45の記載どおりに分析する。
コドン最適化デルタ−9伸長酵素及びデルタ−8不飽和化酵素を介したドコサテトラエン酸への経路の発現
好適な酵母株(例えば、FSO1277又はFS01444)に対してプラスミドpESC−TRP−デルタ−12 デルタ−9e(実施例70)、pESC−URA−デルタ−8デルタ−5(実施例70)、及びpESC−LEU−Ssc2(実施例55)による同時形質転換をおこなった。結果として生じた株をGALプロモーター(例えば、実施例9、実施例49)に導入するための好適な条件下で培養し、脂肪酸組成を実施例45の記載どおりに分析する。
コドン最適化デルタ−9伸長酵素及びデルタ−8不飽和化酵素を介したドコサペンタエン酸への経路の発現
好適な酵母株(例えば、FSO1277又はFS01444)に対してプラスミドpESC−TRP−デルタ−12 デルタ−9e(実施例70)、pESC−URA−デルタ−8デルタ−5(実施例70)、及びpESC−LEU−Ssc2−SK33(実施例56)による同時形質転換をおこなった。結果として生じた株をGALプロモーター(例えば、実施例9、実施例49)に導入するための好適な条件下で培養し、脂肪酸組成を実施例45の記載どおりに分析する。
コドン最適化デルタ−9伸長酵素及びデルタ−8不飽和化酵素を介したドコサヘキサエン酸への経路の発現
好適な酵母株FS01460(実施例61)に対してプラスミドpESC−TRP−デルタ−12 デルタ−9e(実施例70)、pESC−URA−デルタ−8デルタ−5(実施例70)、及びpESC−LEU−Ssc2−デルタ−4d(実施例60)による同時形質転換をおこなった。結果として生じた株をGALプロモーター(例えば、実施例9、実施例49)に導入するための好適な条件下で培養し、脂肪酸組成を実施例45の記載どおりに分析する。
デルタ−9不飽和化酵素、デルタ−12不飽和化酵素、デルタ−6不飽和化酵素、デルタ6−伸長酵素、デルタ−5不飽和化酵素、デルタ−5伸長酵素、及びオメガ−3不飽和化酵素をコードする遺伝子のコドン最適化
M.アルピナ(M.alpina)デルタ−9不飽和化酵素(配列番号:1)、デルタ−12不飽和化酵素(配列番号:5)、デルタ−6不飽和化酵素(配列番号:11)、デルタ6−伸長酵素(配列番号:16)、及びデルタ−5不飽和化酵素(配列番号:22)、マウス・デルタ−5伸長酵素(配列番号:28)、S.クルイベリ(S.kluyveri)・オメガ−3不飽和化酵素(配列番号:87)を、S.セレビシエ(S.cerevisiae)での発現に対してコドン最適化し、またデルタ−4不飽和化酵素をコードする合成遺伝子の構築に関する記載(実施例59)と同様の原理を用いて、合成オリゴヌクレオチドから構築する。
DE10005973−A1
欧州特許出願第50424号
欧州特許出願第84796号
欧州特許出願第258017号
欧州特許出願第237362号
欧州特許出願第201184号
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Claims (41)
- 4つ又はそれ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸の産生方法が、非脂肪酸基質上で増殖するサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)での酸素要求経路の異種発現を含むことを特徴とする、多価不飽和脂肪酸の産生方法。
- 前記非脂肪酸基質が、排他的な炭素源であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記異種発現が、デルタ−12不飽和化酵素、デルタ−6不飽和化酵素、デルタ−6伸長酵素、及びデルタ−5不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現を組み合わせることを含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記異種発現が、デルタ−12不飽和化酵素、デルタ−9伸長酵素、デルタ−8不飽和化酵素、及びデルタ−5不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現を組み合わせることを含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 組み合わさった前記異種発現が、デルタ−5伸長酵素、オメガ−3不飽和化酵素、及び/又はデルタ−4不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現を更に含むことを特徴とする、請求項1乃至4のいずれか一項に記載の方法。
- 組み合わさった前記異種発現が、デルタ−9不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現を更に含むことを特徴とする、請求項1乃至5のいずれか一項に記載の方法。
- 組み合わさった前記異種発現が、ACC1、YBR159W、ELO1、ELO2、ELO3、FAS1、FAS2、DGA1、LRO1、ARE1、ARE1、及びGPD1からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の過剰発現を更に含むことを特徴とする、請求項1乃至6のいずれか一項に記載の方法。
- 組み合わさった前記異種発現が、GPP1、GPP2、及びPOX1からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の欠失を更に含むことを特徴とする、請求項1乃至7のいずれか一項に記載の方法。
- 組み合わさった前記異種発現が、ATP:クエン酸リアーゼ及び/又はATPによって刺激されるイソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列の異種発現を更に含むことを特徴とする、請求項1乃至8のいずれか一項に記載の方法。
- 組み合わさった前記異種発現が、非リン酸化NADP依存型D−グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド発現の異種発現を更に含むことを特徴とする、請求項1乃至9のいずれか一項に記載の方法。
- 組み合わさった前記異種発現が、遺伝子GDH1の欠失と、選択的に、GDH2、GLN1、及びGLT1から選択される少なくとも1つの遺伝子の過剰発現とを更に含むことを特徴とする、請求項1乃至10のいずれか一項にもとづく方法。
- 組み合わさった前記異種発現が、TSC13、GAT1、SLC1、及びYDR531Wからなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の過剰発現を更に含むことを特徴とする、請求項1乃至11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異種ヌクレオチド配列が、サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)での発現に最適化されたコドンであることを特徴とする、請求項1乃至12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)をミオイノシトール欠損培地で培養することを特徴とする、請求項1乃至13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多価不飽和脂肪酸が、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1乃至14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異種発現が、アラキドン酸, エイコサペンタエン酸及び/又はドコサエキサエン酸の含有量を増加して前記サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)での総脂肪酸含有量の2%を上回る量にすることを特徴とする、請求項1乃至15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記デルタ−12不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列が、
(a)配列番号:5〜10、93、95、及び113に記載のヌクレオチド配列と;
(b)配列番号:5〜10、93、95、及び113に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも75%同一であるヌクレオチド配列と;
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項3乃至16のいずれか一項に記載の方法。 - 前記デルタ−9伸長酵素をコードするヌクレオチド配列が、配列番号:37のヌクレオチドを含む、又は少なくとも75%同一であることを特徴とする、請求項4乃至17のいずれか一項に記載の方法。
- デルタ−9不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列が、
(a)配列番号:1〜4に示すヌクレオチド配列と;
(b)配列番号:1〜4に示すヌクレオチド配列と少なくとも75%同一であるヌクレオチド配列と;
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項6乃至18のいずれか一項に記載の方法。 - 前記デルタ−8不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列が、配列番号:38のヌクレオチド配列を含む、又は少なくとも75%同一であることを特徴とする、請求項4乃至19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記デルタ−6不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列が、
(a)配列番号:11〜15、97、及び99に示すヌクレオチド配列と;
(b)配列番号:11〜15、97、及び99に示すヌクレオチド配列と少なくとも75%同一であるヌクレオチド配列と;
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項3乃至17又は19のいずれか一項に記載の方法。 - 前記デルタ−6伸長酵素をコードするヌクレオチド配列が、
(a)配列番号:16〜21、101、及び103に示すヌクレオチド配列と;
(b)配列番号:16〜21、101、及び103に示すヌクレオチド配列と少なくとも75%同一であるヌクレオチド配列と;
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項3乃至17、19又は21のいずれか一項に記載の方法。 - 前記デルタ−5不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列が、
(a)配列番号:22〜27、99、105、及び107に示すヌクレオチド配列と;
(b)配列番号:22〜27、99、105、及び107に示すヌクレオチド配列と少なくとも75%同一であるヌクレオチド配列と;
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項3乃至22のいずれか一項に記載の方法。 - 前記デルタ−5伸長酵素をコードするヌクレオチド配列が、
(a)配列番号:19、28、29、及び101に示すヌクレオチド配列と;
(b)配列番号:19、28、29、及び101に示すヌクレオチド配列と少なくとも75%同一であるヌクレオチド配列と;
(c)配列番号:68に少なくとも75%同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と;
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項3乃至23のいずれか一項に記載の方法。 - デルタ−4不飽和化素をコードするヌクレオチド配列が、
(a)配列番号:35〜36、及び109に示すヌクレオチド配列と;
(b)配列番号:35〜36、及び109に示すヌクレオチド配列と少なくとも75%同一であるヌクレオチド配列と;
(c)配列番号:76〜77に少なくとも75%同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と;
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項3乃至24のいずれか一項に記載の方法。 - オメガ−3不飽和化素をコードするヌクレオチド配列が、
(a)配列番号:30〜34、87、89、及び111に示すヌクレオチド配列と;
(b)配列番号:30〜34、87、89、及び111に示すヌクレオチド配列と少なくとも75%同一であるヌクレオチド配列と;
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項2乃至25のいずれか一項に記載の方法。 - 多価不飽和脂肪酸を生産する方法であって、
(a)デルタ−12不飽和化酵素、デルタ−6不飽和化酵素、デルタ−6伸長酵素、及びデルタ−5不飽和化酵素をコードする少なくとも4つのヌクレオチド配列を単離するステップと;
(b)ステップ(a)の前記単離されたヌクレオチド配列を含む1つ又はそれ以上のベクターを構築し、及び/又は前記単離されたヌクレオチドをサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)のゲノムに取り込むステップと;
(c)選択的に、ステップ(a)の前記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、ステップ(b)の前記ベクターによって一時的にサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)を形質転換させるステップと;
(d)非脂肪酸基質上で前記サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)を増殖させることで、前記宿主によって前記非脂肪酸を所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換するステップと;
を含み、前記多価不飽和脂肪酸を得ることを特徴とする、多価不飽和脂肪酸を生産する方法。 - 多価不飽和脂肪酸を生産する方法であって、
(a)デルタ−12不飽和化酵素、デルタ−9伸長酵素、デルタ−8不飽和化酵素、及びデルタ−5不飽和化酵素をコードする少なくとも4つのヌクレオチド配列を単離するステップと;
(b)ステップ(a)の前記単離されたヌクレオチド配列を含む1つ又はそれ以上のベクターを構築し、及び/又は前記単離されたヌクレオチドをサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)のゲノムに取り込むステップと;
(c)選択的に、ステップ(a)の前記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、ステップ(b)の前記ベクターによって一時的にサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)を形質転換させるステップと;
(d)非脂肪酸基質上で前記サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)を増殖させることで、前記宿主によって前記非脂肪酸を所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換するステップと;
を含み、前記多価不飽和脂肪酸を得ることを特徴とする、多価不飽和脂肪酸を生産する方法。 - 前記異種発現が、デルタ−9不飽和化酵素、デルタ−5伸長酵素、オメガ−3不飽和化酵素、及び/又はデルタ−4不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現を含むことを特徴とすること、請求項27又は28に記載の方法。
- 非脂肪酸基質上で増殖する場合、4つ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を生産することができることを特徴とする、遺伝子組み換えサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)。
- 排他的な炭素源としての非脂肪酸基質上で増殖する場合に、前記サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)が4つ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸することができることを特徴とする、請求項30に記載の遺伝子組み換えサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)。
- 組成物が、請求項30又は31に記載の遺伝子組み換えサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)によって生産された多価不飽和脂肪酸を含むことを特徴とする、組成物。
- 組成物が、請求項30又は31に記載の遺伝子組み換え細胞によって生産された総脂肪酸組成で少なくとも25%の多価不飽和脂肪酸を含むことを特徴とする、組成物。
- 前記組成物が、油であることを特徴とする、請求項32又は33に記載の組成物。
- 前記多価不飽和脂肪酸が、トリアシルグリセリドに取り込まれることを特徴とする、請求項32又は33に記載の組成物。
- 前記多価不飽和脂肪酸が、リン脂質に取り込まれることを特徴とする、請求項32又は33に記載の組成物。
- 前記多価不飽和脂肪酸が、遊離脂肪酸の形態であることを特徴とする、請求項32又は33に記載の組成物。
- 食品の成分としての、請求項32乃至37のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- 化粧品の成分としての、請求項32乃至37のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- 飼料の成分としての、請求項32乃至37のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- 飼料の成分としての、請求項29に記載の遺伝子組換サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)の使用。
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