BR112021008842A2

BR112021008842A2 - método para produzir uma biomassa com um teor aumentado de ácidos graxos poli-insaturados

Info

Publication number: BR112021008842A2
Application number: BR112021008842-3A
Authority: BR
Inventors: Horst Priefert; Jens Schneider; Joachim WINDAU
Original assignee: Evonik Operations Gmbh
Priority date: 2018-11-09
Filing date: 2019-11-07
Publication date: 2021-08-17
Also published as: US20220017929A1; CN112969796A; EP3877534A1; WO2020094750A1; CA3118527A1

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR UMA BIOMASSA COM UM TEOR AUMENTADO DE ÁCIDOS GRAXOS POLI-INSATURADOS. De acordo com a invenção, constatou-se que, quando a quantidade de sulfato usada na cultura de células produtoras de PUFAs for selecionada de modo que a concentração de sulfato na última fase de fermentação seja sempre acima de zero, mas, ao mesmo tempo, sempre abaixo do limite de saturação das células, uma biomassa é obtida, a qual tem uma proporção em massa aumentada de ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) no produto final, sendo que o processo tem, ao mesmo tempo, um alto rendimento de produto/substrato e rendimento de espaço/tempo.

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR UMA BIOMASSA COM UM TEOR AUMENTADO DE ÁCIDOS GRAXOS POLI-INSATURADOS”

[0001] A presente invenção se refere a um processo para produzir uma biomassa que tem um teor aumentado de ácidos graxos poli-insaturados e a uma biomassa obtenível pelo dito processo.

[0002] Processos para produzir biomassa contendo ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) já foram descritos na técnica anterior. Os Labirintulomicetos são frequentemente usados no presente documento, os quais se acumulam naturalmente ácidos graxos poli-insaturados como lipídios de armazenamento em uma quantidade relativamente grande na célula.

[0003] Essas microalgas crescem naturalmente em água do mar, o que significa que o cultivo das microalgas foi inicialmente feito em meios que têm um alto teor de cloreto. No entanto, altos teores de cloreto são inadequados para cultivo em biorreatores de aço, já que causam corrosão do metal.

[0004] Portanto, os meios de fermentação que têm um baixo teor de cloreto e, em vez disso, um alto teor de sulfato foram descritos na técnica anterior como meios de fermentação alternativos.

[0005] No entanto, nesse caso, a biomassa obtida geralmente tem um teor limitado de PUFAs, presumidamente não menos porque a alta quantidade de sulfato significa que a proporção de parede celular formada no produto final é relativamente alta devido à quantidade de PUFAs presente.

[0006] Os experimentos com teor de sulfato muito baixo na última fase de fermentação mostraram que a proporção relativa de PUFAs formados no produto final pode ser distintamente aumentada como um resultado do ajuste da adição de sulfato na última fase de fermentação, embora, ao mesmo tempo, as células sejam desestabilizadas até uma extensão relativamente grande, o que significa que uma liberação parcial do óleo presente no meio de fermentação já pode ocorrer durante o curso de fermentação.

[0007] Procedendo a partir desse conhecimento, é um objetivo de a presente invenção fornecer um processo em que a biomassa obtida tem uma proporção em massa aumentada de PUFAs no produto final. Ao mesmo tempo, pretende-se que, de preferência, um meio de fermentação não corrosivo seja usado no processo e que um alto rendimento de produto e rendimento de espaço/tempo sejam alcançados e que uma liberação prematura do óleo no meio de fermentação seja impedida tanto quanto possível.

[0008] É possível alcançar o objetivo da invenção através de um processo em que o teor de sulfato no meio é ajustado de modo que o sulfato esteja sempre presente no meio na última fase de fermentação, porém a concentração de sulfato está sempre abaixo da concentração de saturação das células, o que significa que o sulfato presente é imediatamente assimilado por completo pelas células.

[0009] A presente invenção portanto, fornece primeiramente um processo para produzir uma biomassa contendo PUFAs, caracterizada pelo fato de que a biomassa é produzida pelo cultivo das células produtoras de PUFAs em um meio de fermentação em que o teor de sulfato é ajustado de modo que o sulfato esteja sempre presente no meio na última fase de fermentação, porém a concentração de sulfato no meio está sempre abaixo do limite de saturação das células.

[0010] De acordo com a invenção, o limite de saturação de sulfato ou a concentração de saturação de sulfato das células é definido como a quantidade de sulfato que pode ser imediatamente assimilada por completo pelas células da biomassa sob as dadas condições. Em uma modalidade da presente invenção que é preferencial de acordo com a invenção, as células da família Thraustochytriaceae são usadas, que têm um limite de saturação de sulfato de aproximadamente 5 g por kg de biomassa livre de lipídio.

[0011] A presente invenção, portanto, de preferência, fornece adicionalmente um processo para produzir uma biomassa contendo PUFAs, caracterizada pelo fato de que a biomassa é produzida pelo cultivo de células da família Thraustochytriaceae em um meio de fermentação em que o teor de sulfato é ajustado de tal modo que, na última fase de fermentação, a concentração de sulfato no meio está sempre entre 0,005 e 5 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio, de preferência, entre 0,01 e 4 e particularmente, de preferência, entre 0,01 e 3, 2 ou 1 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio e, acima de tudo, entre 0,01 e 0,05 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio.

[0012] Os processos de acordo com a invenção compreendem preferencialmente uma fase de crescimento e uma fase de produção de óleo subsequente com o propósito de otimizar a produção de óleo. Na fase de crescimento de abertura, ocorre primeiramente o cultivo e o aumento de biomassa das células produtoras de PUFAs presentes no meio de fermentação - com supressão máxima de produção de óleo - com o resultado de que uma densidade de biomassa o mais alta possível seja ajustada no meio, enquanto, na fase de produção de óleo subsequente, a qual é geralmente introduzida por medidas específicas, ocorre predominantemente a produção de óleo pelas células da biomassa, com o crescimento das células sendo interrompido pelo menos tanto quanto possível. Isso significa que, na fase de produção de óleo, o aumento da biomassa não é pelo menos primariamente atribuível a um aumento de contagem celular, porém é atribuível ao acúmulo de lipídios na célula interior das células presentes. O crescimento das células na fase de crescimento é possibilitado pela provisão de condições ideais de crescimento, enquanto a transição para a fase de produção de óleo pode ser introduzida pela limitação de fatores limitantes individuais ou múltiplos, especialmente componentes de nutriente, como, por exemplo, fontes de nitrogênio.

[0013] De acordo com a invenção, a “última fase de fermentação” é preferencialmente compreendida como a fase de produção de óleo.

[0014] Os processos de acordo com a invenção são, então, de preferência, distinguidos pelo fato de que o sulfato está presente no meio pelo menos durante 50 % do período da fase de produção de óleo, de preferência, pelo menos durante 75 % ou 85 % do período da fase de produção de óleo, particularmente, de preferência, pelo menos durante 90 % ou 95 % do período da fase de produção de óleo e, acima de tudo, durante a fase de produção de óleo completa, mas a concentração de sulfato está sempre abaixo do limite de saturação das células presentes no meio.

[0015] Os processos preferenciais são, nesse contexto, distinguidos pelo fato de que o sulfato está presente no meio pelo menos durante 50 % do período restante da fase de produção de óleo, de preferência, pelo menos durante 75 % ou 85 % do período restante da fase de produção de óleo, particularmente, de preferência, pelo menos durante 90 % ou 95 % do período restante da fase de produção de óleo e, acima de tudo, durante a fase de produção de óleo completa, mas a concentração de sulfato está sempre abaixo do limite de saturação das células presentes no meio; isso significa que, durante o período consequentemente inicial complementar da fase de produção de óleo, a concentração de sulfato pode opcionalmente estar acima do limite de saturação das células.

[0016] A presente invenção consequentemente também fornece um processo para produzir uma biomassa contendo PUFAs, caracterizado pelo fato de que a biomassa é produzida cultivando-se células da família Thraustochytriaceae em um meio de fermentação em que o teor de sulfato é ajustado de modo que, pelo menos durante 50 % do período da fase de produção de óleo, de preferência, pelo menos durante 75 % ou 85 % do período da fase de produção de óleo, particularmente, de preferência, pelo menos durante 90 % ou 95 % do período da fase de produção de óleo e, acima de tudo, durante a fase de produção de óleo completa, a concentração de sulfato no meio esteja sempre 0,005 e 5 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio, de preferência, entre 0,01 e 4 e particularmente, de preferência, entre 0,01 e 3, 2 ou 1 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio e, acima de tudo, entre 0,01 e 0,05 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio.

[0017] A presente invenção consequentemente também fornece adicionalmente um processo para produzir uma biomassa contendo PUFAs, caracterizado pelo fato de que a biomassa é produzida cultivando-se células da família Thraustochytriaceae em um meio de fermentação em que o teor de sulfato é ajustado de modo que, pelo menos durante 50 % do período restante da fase de produção de óleo, de preferência, pelo menos durante 75 % ou 85 % do período restante da fase de produção de óleo, particularmente, de preferência, pelo menos durante 90 % ou 95 % do período restante da fase de produção de óleo e, acima de tudo, durante a fase de produção de óleo completa, a concentração de sulfato no meio esteja sempre 0,005 e 5 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio, de preferência, entre 0,01 e 4 e particularmente, de preferência, entre 0,01 e 3, 2 ou 1 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio e, acima de tudo, entre 0,01 e 0,05 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio.

[0018] A presente invenção fornece adicionalmente biomassas, preferencialmente aquelas contendo células da família Thraustochytriaceae, as quais são obteníveis por processos de acordo com a invenção.

[0019] Em modalidades preferenciais de acordo com a invenção, as biomassas que têm um teor de sulfato de 12 a 20 g de sulfato por kg de biomassa, de preferência, 12 a 16 g de sulfato por kg de biomassa, são obtidas.

[0020] A presente invenção, portanto, particularmente também fornece adicionalmente uma biomassa contendo PUFAs que tem um teor de sulfato de 12 a 20 g de sulfato por kg de biomassa, de preferência, 12 a 18 g de sulfato por kg de biomassa e particularmente 12 a 16 g de sulfato por kg de biomassa, sendo que a biomassa compreende, de preferência, células da família Thraustochytriaceae.

[0021] De acordo com a invenção, o "teor de sulfato" deve ser compreendido de modo que signifique o teor total de sulfato, isto é, o teor de sulfato livre e ligado, em particular organicamente ligado, em relação à biomassa. Presume-se que a maioria do sulfato presente na biomassa está presente como um constituinte de exopolissacarídeos, os quais estão envolvidos na formação da parede celular de microrganismos.

[0022] De acordo com a invenção, o teor de sulfato é determinado, de preferência, determinando-se o teor de enxofre da biomassa obtida, já que a maioria do enxofre presente na biomassa pode ser atribuída ao sulfato presente. O enxofre que pode ser atribuído a outras fontes pode ser desconsiderado devido à quantidade de sulfato presente. Assim, a quantidade de sulfato presente pode ser prontamente determinada a partir da quantidade de enxofre determinada.

[0023] Nesse sentido, o teor de enxofre da biomassa é, de preferência, determinado por análise elementar de acordo com DIN EN ISO 11885. Para analisar o teor de enxofre da biomassa, alíquotas adequadas da amostra são rompidas antes da análise, preferencialmente com o uso de ácido nítrico e peróxido de hidrogênio a 240 °C sob pressão, para garantir que o enxofre que está presente esteja prontamente disponível.

[0024] De acordo com a invenção, “biomassa”, “biomassa seca”, “biomassa de células produtoras de PUFAs” ou “biomassa seca de células produtoras de PUFAs” deve ser geralmente compreendida a biomassa seca determinável.

[0025] Neste contexto, a quantidade de biomassa seca presente em uma amostra é preferencialmente determinada como a seguir: Uma amostra homogênea é coletada e é centrifugada para separar os constituintes líquidos. Posteriormente, a biomassa obtida por centrifugação é lavada com água para dissolver sais e quaisquer outros constituintes solúveis e é, então, centrifugada novamente. A biomassa seca então obtida é, por fim, seca de um dia para o outro em uma cabine de secagem. Neste contexto, a porcentagem de biomassa seca presente na amostra é proveniente do quociente entre a massa de biomassa seca determinada após a secagem e a massa inicial da amostra investigada. A biomassa seca então estabelecida também compreende adicionalmente o óleo formado pela biomassa.

[0026] De acordo com a invenção, “biomassa livre de lipídio”, “biomassa seca livre de lipídio”, “biomassa livre de lipídio de células produtoras de PUFAs” ou “biomassa seca livre de lipídio de células produtoras de PUFAs” deve consequentemente ser compreendida para significar a biomassa seca verificada como antes menos a proporção de gordura presente na biomassa seca.

[0027] A proporção de gordura presente na biomassa seca é preferencialmente determinada pela absorção da biomassa seca em uma solução de metanol/clorofórmio e tratamento por ultrassom subsequente da amostra então obtida. A amostra então obtida é subsequentemente saponificada com hidróxido de potássio e acidificada com o uso de ácido clorídrico. Posteriormente, os ácidos graxos livres são metilados com o uso de BF3 (trifluoreto de boro a 30 % em metanol) e separados por meio de uma cromatografia de partição com um gradiente de temperatura. A detecção é, então, realizada por meio de detecção por ionização de chama (FID). De acordo com a invenção, o teor de biomassa é, então, determinado pela subtração do teor de gordura então determinado a partir do teor de biomassa seca anteriormente determinado.

[0028] De acordo com a invenção, o termo de biomassa seca livre de lipídio é usado devido ao fato de que o limite de saturação de sulfato das células é independente do teor de lipídio das células, mas o teor de lipídio das células aumenta consideravelmente no curso da fase de produção de óleo, o que significa que a quantidade de sulfato a ser adicionada deve ser verificada levando-se em consideração o teor total de biomassa seca livre de lipídio ao invés do teor total de biomassa seca. Uma vez que o teor de biomassa seca livre de lipídio permanece praticamente estável após a introdução da fase de produção de óleo devido à supressão máxima de propagação celular, é geralmente necessário determinar o teor de biomassa seca livre de lipídio novamente após a introdução da fase de produção de óleo.

[0029] De acordo com a invenção, a concentração de sulfato desejada no meio pode ser ajustada de diferentes maneiras.

[0030] De acordo com a invenção, o que é essencial é que uma adição medida de sulfato deve ser feita sempre na última fase de fermentação, de preferência, no fim da fase de produção de óleo (denominado processo em batelada alimentada). O início da adição medida de sulfato é determinado pela possibilidade e o quanto o sulfato está presente no meio de partida no início da fermentação. A quantidade de sulfato no meio de partida pode, em princípio, ser selecionada conforme desejado, o que significa que o requisito para a adição medida de sulfato pode surgir em diferentes momentos no curso da fermentação.

[0031] Do requisito de que sulfato deve estar presente no meio de fermentação na última fase de fermentação, mas a concentração de sulfato no presente documento deve estar abaixo do limite de saturação das células, o que surge em relação à concentração de sulfato no meio de partida de que é um limite superior que deve ser observado consequentemente e é simples de calcular. Em uma modalidade preferencial, a quantidade de sulfato no meio de partida é selecionada de modo que a concentração de sulfato esteja acima da concentração de saturação das células pelo menos durante os primeiros 30 % do período da fase de crescimento das células, preferencialmente pelo menos durante os primeiros 40 %, 50 % ou 60 % e particularmente durante os primeiros 70 %, 80 % ou 90 % do período da fase de crescimento das células. Neste contexto, a concentração de sulfato é preferencialmente pelo menos 5 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio durante a fase especificada.

[0032] A adição medida de sulfato deve começar no mais tardar, antes de a concentração de sulfato cair para zero. Isso é garantido pela determinação contínua da concentração de sulfato no meio. De preferência, a adição medida de sulfato só é feita quando a concentração de sulfato no meio tiver caído abaixo de 2 g de sulfato por kg de biomassa, particularmente, para abaixo de 1 g de sulfato por kg de biomassa, e particularmente, de preferência, apenas quando a concentração de sulfato no meio tiver caído para abaixo de 0,5 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio, e ou seja, de acordo com a invenção, apenas é feito logo antes da transição para a fase de produção de óleo para otimizar a produção de óleo. Em uma modalidade particularmente preferencial de acordo com a invenção, a concentração de sulfato no meio, portanto, cai apenas logo antes do início da fase de produção de óleo, de preferência, até 3 horas, particularmente até 2 horas e, acima de tudo, até uma hora antes do início da fase de produção de óleo, a abaixo de 2 g, particularmente a abaixo de 1 g e particularmente, de preferência, a abaixo de 0,5 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio.

[0033] Ao invés de carregar inicialmente uma quantidade relativamente grande de sulfato no meio de partida, é alternativamente possível também que uma adição medida de sulfato já seja efetuada durante a fase de crescimento das células. Nesse contexto, a adição medida de sulfato na fase de crescimento é consequentemente feita de modo que a quantidade de sulfato esteja sempre acima da concentração de saturação das células, de preferência, em pelo menos 5 g de sulfato por kg de biomassa, pelo menos durante a primeira fase da fase de crescimento. Na fase de produção de óleo subsequente, a adição medida de sulfato é consequentemente reduzida, com o resultado de que a concentração de sulfato na fase de produção de óleo ou logo antes da entrada na fase de produção de óleo caia abaixo da concentração de saturação das células, de preferência, abaixo de 5 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio, particularmente, de preferência, abaixo de 3, 2 ou 1 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio e, acima de tudo, abaixo de 0,5 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio.

[0034] Em uma modalidade adicional de acordo com a invenção, o sulfato é especificado em uma quantidade, com o resultado de que a concentração de sulfato durante todo o processo de fermentação ou pelo menos durante a maior parte do período de todo o processo de fermentação esteja sempre abaixo da concentração de saturação das células, de preferência, abaixo de 5 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio e particularmente abaixo de 4, 3, 2 ou 1 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio.

[0035] Uma vez que é essencial para o processo que a concentração de sulfato não caia para zero, é possível, especialmente quando transpira no curso da fermentação que a quantidade de biomassa produzida exceda o valor originalmente calculado, para garantir que evite que uma queda na concentração de sulfato para zero pelo ajuste adequado da quantidade de sulfato medida na mesma.

[0036] Em uma modalidade preferencial de acordo com a invenção, o sulfato é continuamente medido no meio de fermentação durante a maior parte do período da fase de produção de óleo, de preferência, pelo menos durante 50 %, 60 % ou 70 % do período da fase de produção de óleo e particularmente, de preferência, pelo menos durante os últimos 50 %, 60 % ou 70 % do período da fase de produção de óleo, em uma baixa quantidade, de preferência em uma taxa de 5 a 100 mg, de preferência, 10 a 50 mg, por kg de meio de fermentação.

[0037] De acordo com a invenção, o sal de sulfato usado é preferencialmente sulfato de sódio, sulfato de amônio ou sulfato de magnésio e também misturas dos mesmos. De acordo com a invenção, a alimentação do sulfato também pode ser feita, alternativa ou adicionalmente, com o uso de matérias-primas adicionais que são contaminadas ou suplementadas com sulfato.

[0038] De acordo com a invenção, constatou-se adicionalmente que, surpreendentemente, a baixa concentração de sulfato também pode ser combinada com baixas concentrações de cloreto, o que significa que a biomassa pode ser produzida com o uso de um meio de fermentação não corrosivo.

[0039] Um processo de acordo com a invenção é, portanto, preferencialmente distinguido, ainda, pelo meio de fermentação usado de acordo com a invenção que tem uma concentração de cloreto de menos de 1 g/l, particularmente menos de 500 mg/l e preferencialmente menos de 250 mg/l durante toda a fermentação.

[0040] As biomassas de acordo com a invenção têm, de preferência, um teor de cloreto de no máximo 2 g por kg de biomassa, particularmente, 0,5 a 1,8 g e particularmente, de preferência, 0,5 a 1,5 g por kg de biomassa.

[0041] De acordo com a invenção, “teor de cloreto” é compreendido como a quantidade de cloro determinável. A quantidade de cloro presente pode ser, por exemplo,

determinada por análise elementar de acordo com DIN EN ISO

11885. O cloro está presente na biomassa na forma de sais, os quais são chamados “cloretos”. Quando o presente pedido menciona “cloretos” ou “íons de cloreto”, quer-se dizer sempre a quantidade de cloreto ou cloro detectável, e não a quantidade de sais de cloreto, a qual sempre compreende também contraíons catiônicos além do íon de cloreto.

[0042] As células produtoras de PUFAs são preferencialmente células que já produzem naturalmente PUFAs; no entanto, também podem ser células tornadas capazes de produzir PUFAs por meio de métodos gene- tecnológicos. A produção pode ser, neste contexto, autotrófica, mixotrófica ou heterotrófica.

[0043] A biomassa de acordo com a invenção compreende consequentemente tais células e consiste de modo preferencialmente substancial em tais células.

[0044] Preferencialmente, as células são aquelas que produzem PUFAs heterotroficamente. De acordo com a invenção, as células assumem preferencialmente a forma de algas, fungos, em particular leveduras, ou protistas. De modo particularmente preferencial, as células são microrganismos, em particular algas ou fungos microbianos.

[0045] As células adequadas de leveduras produtoras de óleo são, em particular, cepas de Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon e Lipomyces.

[0046] As células são, de preferência, aquelas do táxon Labirintulomicetos (Labyrinthulea), em particular, aqueles da família das Thraustochytriaceae. A família das Thraustochytriaceae inclui os gêneros Althornia,

Aplanochytrium, Elina, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium e Ulkenia. É dada preferência particular a células dos gêneros Thraustochytrium, Schizochytrium, Aurantiochytrium ou Oblongichytrium, especialmente aquelas do gênero Aurantiochytrium. Uma cepa particularmente preferencial é a cepa Aurantiochytrium limacinum SR21 (IFO 32693).

[0047] A biomassa de acordo com a invenção assume preferencialmente a forma do produto de um processo de cultivo fermentativo. Consequentemente, a biomassa pode conter não apenas as células a serem rompidas, porém também constituintes do meio de fermentação. Esses constituintes podem assumir a forma de, em particular, sais, agentes antiespumantes e fonte de carbono não reagido e/ou fonte de nitrogênio. O teor de célula nessa biomassa é preferencialmente pelo menos 70 % em peso, preferencialmente pelo menos 75 % em peso. Opcionalmente, o teor de célula na biomassa pode ser aumentado por etapas de lavagem adequadas para, por exemplo, pelo menos 80 ou pelo menos 90 % em peso antes da realização do processo de ruptura de célula. No entanto, a biomassa obtida também pode ser usada diretamente no processo de ruptura de célula.

[0048] As células na biomassa são preferencialmente distinguidas pelo fato de que contêm pelo menos 20 % em peso, preferencialmente pelo menos 30 % em peso, em particular pelo menos 40 % em peso, de PUFAs, com base, em cada caso, na massa seca celular.

[0049] Em uma modalidade preferencial, a maioria dos lipídios está presente na forma de triglicerídeos, com, de preferência, pelo menos 50 % em peso, em particular, pelo menos 75 % em peso e, em uma modalidade especialmente preferencial, pelo menos 90 % em peso dos lipídios presentes na célula que está presente na forma de triglicerídeos.

[0050] Preferencialmente, pelo menos 10 % em peso, em particular pelo menos 20 % em peso, especialmente preferencialmente 20 a 60 % em peso, em particular 20 a 40 % em peso, dos ácidos graxos presentes na célula são PUFAs.

[0051] De acordo com a invenção, ácidos graxos poli- insaturados (PUFAs) são compreendidos como ácidos graxos que têm pelo menos duas ligações duplas C-C. De acordo com a invenção, os ácidos graxos altamente insaturados (HUFAs) são preferenciais entre os PUFAs. De acordo com a invenção, os HUFAs são compreendidos de modo a se referir a ácidos graxos que têm pelo menos quatro ligações duplas C-C.

[0052] Os PUFAs podem estar presentes na célula em forma livre ou em forma ligada. Exemplos da presença em forma ligada são fosfolipídios e ésteres dos PUFAs, em particular, monoacil-, diacil- e triacilglicerídeos. Em uma modalidade preferencial, a maioria dos PUFAs está presente na forma de triglicerídeos, com, de preferência, pelo menos 50 % em peso, em particular, pelo menos 75 % em peso e, em uma modalidade especialmente preferencial, pelo menos 90 % em peso dos PUFAs presentes na célula que está presente na forma de triglicerídeos.

[0053] Os PUFAs preferenciais são ácidos graxos ômega-3 e ácidos graxos ômega-6, sendo que os ácidos graxos ômega-3 são especialmente preferenciais. Os ácidos graxos ômega-3 preferenciais, nesse contexto, são ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5ω-3), em particular, ácido (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)- eicosa-5,8,11,14,17-pentaenoico, e ácido docosa-hexaenoico (DHA, 22:6ω-3), em particular, ácido (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoico, sendo que ácido docosa-hexaenoico é especialmente preferencial.

[0054] Os processos para produzir as células contendo PUFAs especialmente da ordem Thraustochytriales foram descritos em detalhes na técnica anterior (consultar, por exemplo, os documentos WO91/07498, WO94/08467, WO97/37032, WO97/36996, WO01/54510). A produção ocorre quando células são cultivadas em um fermentador na presença de uma fonte de carbono e de uma fonte de nitrogênio. Nesse contexto, as densidades de biomassa de mais que 100 gramas por litro e taxas de produção de mais que 0,5 gramas de lipídio por litro por hora podem ser alcançadas. O processo é realizado, de preferência, como o que é conhecido como um processo de batelada alimentada, isto é, a fonte de carbono e possivelmente também as fontes de nitrogênio e fosfato são alimentadas gradualmente durante a fermentação. Após a biomassa desejada ter sido alcançada, produção de lipídio pode ser induzida por várias medidas, por exemplo, limitando-se a fonte de nitrogênio, a fonte de fosfato ou o teor de oxigênio ou combinações dos mesmos.

[0055] As fontes de carbono adequadas são ambas as fontes de carbono alcoólica e não alcoólica. Exemplos de fontes de carbono alcoólicas são metanol, etanol e isopropanol. Exemplos de fontes de carbono não alcoólicas são frutose, glicose, sacarose, melados, amido e xarope de milho, e também ácidos orgânicos, como ácido acético, ácido propiônico e ácidos graxos de cadeia média e longa e os sais dos mesmos. Os processos preferenciais de acordo com a invenção são distinguidos por pelo menos uma fonte de carbono sendo continuamente medida no meio durante o processo de fermentação por completo.

[0056] As fontes de nitrogênio adequadas são ambas as fontes de nitrogênio inorgânicas e orgânicas. Exemplos de fontes de nitrogênio inorgânicas são nitratos e sais de amônio, em particular, sulfato de amônio e hidróxido de amônio. Exemplos de fontes de nitrogênio orgânicas são aminoácidos, em particular, glutamato, e ureia.

[0057] De acordo com a invenção, a introdução da fase de produção de óleo é preferencialmente realizada como descrito no documento WO 01/54510, limitando-se pelo menos um componente de nutriente limitante, preferencialmente limitando-se pelo menos uma fonte de nitrogênio.

[0058] O teor de cloreto do meio de fermentação, de preferência, está sempre abaixo de 2 g/l, particularmente abaixo de 1 g/l, de preferência, abaixo de 500 mg/l e particularmente, de preferência, abaixo de 250 mg/l, de preferência durante toda a fermentação, mas pelo menos durante a fase de produção de óleo.

[0059] Além dos sulfatos e quaisquer cloretos usados, também é opcionalmente possível, durante a fermentação, usar outros sais, especialmente aqueles selecionados a partir de carbonato de sódio, carbonato de sódio e hidrogênio, soda calcinada ou compostos de fósforo inorgânicos. Se demais sais forem usados, esses são preferencialmente usados, cada um, em uma quantidade de menos de 12 g/l, particularmente menos de 8 g/l e de modo particularmente preferencial menos de 5 g/l. O teor de sal total no meio de fermentação é de preferencialmente 5 a 30 g/l, particularmente 10 a 20 g/l, no início da fermentação principal.

[0060] Além disso, compostos de fósforo orgânicos e/ou substâncias estimuladoras de crescimento conhecidas, como, por exemplo, extrato de levedura ou milhocina, também podem ser adicionados de modo a ter um efeito positivo na fermentação.

[0061] As células são, de preferência, fermentadas em um pH de 3 a 11, em particular, 4 a 10 e, de preferência, a uma temperatura de pelo menos 20 °C, em particular, 20 °C a 40 °C, particularmente de preferência, pelo menos 30 °C. Um típico processo de fermentação leva aproximadamente 100 horas.

[0062] De acordo com a invenção, as células são preferencialmente fermentadas até uma densidade de biomassa de pelo menos 50, 60 ou 70 g/l, particularmente 50 a 250 g/l ou 60 a 220 g/l, preferencialmente pelo menos 80 ou 90 g/l, particularmente 80 a 200 g/l, de modo particularmente preferencial pelo menos 100 g/l e particularmente 100 a 180 g/l. Neste contexto, os dados são baseados no teor de biomassa seca em relação ao volume total do caldo de fermentação após a conclusão da fermentação. O teor de biomassa seca é determinado através de filtração da biomassa, removendo-a do caldo de fermentação, de lavagem subsequente com água e, então, de secagem completa – por exemplo, em um micro-ondas – e, por fim, de determinação do peso seco.

[0063] Em uma modalidade preferencial de acordo com a invenção, a concentração de sulfato cai abaixo de 5 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio, de preferência, abaixo de 4, 3, 2 ou 1 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio e particularmente abaixo de 0,5, 0,1 ou 0,05 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio, logo antes do início da fase de produção de óleo, de preferência, após uma densidade de biomassa de pelo menos 50 g, particularmente de preferência, pelo menos 80, 100, 120 ou 140 g, por litro de meio de fermentação ter sido alcançada, e de preferência, também permanece abaixo dessa concentração para o resto da fermentação.

[0064] Após a coleta das células ou, opcionalmente, até mesmo imediatamente antes da coleta das células, as células são, de preferência, pasteurizadas a fim de exterminar as células e inativar enzimas que podem promover degradação lipídica.

[0065] Após a conclusão de fermentação, o caldo de fermentação obtido pode ser submetido a um método de isolamento de óleo, direta ou opcionalmente após concentração prévia, para extrair o óleo presente. Tais métodos de isolamento de óleo são, por exemplo, descritos nos documentos WO 01/53512 e WO 2011/153246.

[0066] Alternativamente, após a conclusão da fermentação, a biomassa contendo PUFAs também pode ser colhida. Com essa finalidade, o caldo de fermentação também é, de preferência, primeiramente concentrado.

[0067] De acordo com a invenção, o caldo de fermentação é preferencialmente concentrado por centrifugação, filtração, decantação e/ou evaporação de solvente para separar primeiramente a maior parte do meio de fermentação da biomassa. A evaporação de solvente é preferencialmente alcançada com o uso de um secador de tambor, um secador tipo túnel, por meio de secagem por aspersão ou evaporação a vácuo. Em particular, a evaporação de solvente também pode ser alcançada com o uso de um evaporador rotativo, um evaporador de filme fino ou um evaporador de filme descendente. Uma alternativa adequada à evaporação de solvente é, por exemplo, osmose reversa para concentrar o caldo de fermentação.

[0068] Para obter a biomassa, o caldo de fermentação concentrado então obtido é, de preferência, adicionalmente seco, preferencialmente por granulação de leito fluidizado. Preferencialmente, o teor de umidade da biomassa é reduzido a menos de 15 % em peso, particularmente menos de 10 % em peso e de modo particularmente preferencial menos de 5 % em peso pelo processo de secagem subsequente.

[0069] Em uma modalidade particularmente preferencial de acordo com a invenção, a biomassa é seca de acordo com a invenção em um processo de granulação de leito fluidizado ou um processo de secagem por aspersão de bocal, como descrito no documento WO 2015/052048, por exemplo.

[0070] Durante o processo de secagem, sílica pode ser opcionalmente adicionada à biomassa como agente antiempelotamento para que a biomassa possa ser convertida em um estado mais fácil de administrar. Com esse propósito, o caldo de fermentação que compreende biomassa e também a sílica são preferencialmente aspergidos na zona de secagem particular. Alternativamente, a biomassa é preferencialmente misturada à sílica apenas após a solução de secagem. Nesse sentido, também é feita referência, em particular, ao pedido de patente WO 2015/052048.

[0071] Em uma modalidade preferencial, uma biomassa a ser usada de acordo com a invenção tem uma concentração de sílica, em particular sílica hidrofílica ou hidrofóbica, de 0,2 a 10 % em peso, em particular 0,5 a 5 % em peso, especialmente 0,5 a 2 % em peso, após a solução de secagem.

[0072] Um produto de fluxo livre, de granulação fina ou de granulação grossa, de preferência, um granulado, é obtido, de preferência, pelo processo de secagem. Um produto que tem o tamanho de partícula desejado pode ser opcionalmente obtido a partir do granulado obtido por peneiramento ou separação de pó.

[0073] Desde que um pó de fluxo livre e de granulação fina tenha sido obtido, esse pode ser opcionalmente convertido em um produto de fluxo prontamente livre de granulação grossa e amplamente livre de pó, o qual pode ser armazenado, por processos adequados de compactação ou granulação.

[0074] Os auxiliares orgânicos ou inorgânicos convencionais ou suportes, como amido, gelatina, derivados de celulose ou substâncias similares, os quais são tipicamente usados em processamento de alimentos ou processamento de rações como agentes ligantes, agentes gelificantes ou espessantes, podem ser opcionalmente usados nesse processo subsequente de granulação ou compactação.

[0075] De acordo com a invenção, “fluxo livre” deve ser compreendido como um pó que pode fluir sem obstáculos a partir de uma série de vasos de efluxo de vidro que têm aberturas de saída de diferentes tamanhos, pelo menos a partir do vaso que tem uma abertura de 5 milímetros (Klein: Seifen, Öle, Fette, Wachse 94, 12 (1968)).

[0076] De acordo com a invenção, “granulação fina” deve ser compreendida como um pó que tem uma fração predominante (> 50 %) de tamanhos de partícula de 20 a 100 micrômetros de diâmetro.

[0077] De acordo com a invenção, “granulação grossa” deve ser compreendida como um pó que tem uma fração predominante (> 50 %) de tamanhos de partícula de 100 a 2500 micrômetros de diâmetro.

[0078] De acordo com a invenção, “livre de pó” deve ser compreendida como um pó contendo apenas pequenas frações (< 10 %, preferencialmente < 5 %) de tamanhos de partícula abaixo de 100 micrômetros.

[0079] Os tamanhos de partícula são determinados, de preferência, de acordo com a invenção por métodos espectrométricos de difração a laser. Métodos úteis são descritos no livro "Teilchengrößenmessung in der Laborpraxis" [Medição de tamanho de partícula em prática laboratorial] de R. H. Müller e R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) e no livro "Introduction to Particle Technology" de M. Rhodes, Wiley & Sons (1998). Embora vários métodos possam ser usados, o primeiro método citado útil do livro de texto de R.H. Müller e R. Schuhmann para a medição de tamanho de partícula é preferencialmente usado.

[0080] Os produtos obtidos por processos de secagem de acordo com a invenção têm, de preferência, uma fração de pelo menos 80 % em peso, particularmente, pelo menos 90 % em peso, particularmente de preferência, pelo menos 95 % em peso, de partículas que têm um tamanho de partícula de 100 a 3500 micrômetros, de preferência, 100 a 3000 micrômetros, com máxima preferência, 100 a 2500 micrômetros.

[0081] Os produtos de um processo de granulação de leito fluidizado obtidos de acordo com a invenção têm preferencialmente, nesse caso, uma fração de pelo menos 80 % em peso, particularmente pelo menos 90 % em peso, de modo particularmente preferencial pelo menos 95 % em peso, de partículas que têm um tamanho de partícula de 200 a 3500 micrômetros, preferencialmente 300 a 3000 micrômetros, com máxima preferência, 500 a 2500 micrômetros.

[0082] Os produtos de um processo de secagem por aspersão obtido de acordo com a invenção têm preferencialmente, em contrapartida, uma fração de pelo menos 80 % em peso, particularmente pelo menos 90 % em peso, de modo particularmente preferencial pelo menos 95 % em peso, de partículas que têm um tamanho de partícula de 100 a 500 micrômetros, preferencialmente 100 a 400 micrômetros, com máxima preferência 100 a 300 micrômetros.

[0083] Os produtos de um processo de secagem por aspersão e do processo de granulação subsequente obtidos de acordo com a invenção têm preferencialmente uma fração de pelo menos 80 % em peso, particularmente pelo menos 90 % em peso, de modo particularmente preferencial pelo menos 95 % em peso, de partículas que têm um tamanho de partícula de 100 a 1000 micrômetros.

[0084] A fração de poeira, isto é, partículas que têm um tamanho de partícula de menos de 100 micrômetros, é preferencialmente no máximo 10 % em peso, particularmente no máximo 8 % em peso, de modo particularmente preferencial no máximo 5 % em peso, com máxima preferência no máximo 3 % em peso.

[0085] A densidade aparente dos produtos de acordo com a invenção é preferencialmente de 400 a 800 kg/m3, de modo particularmente preferencial de 450 a 700 kg/m3.

[0086] Portanto, a presente invenção também fornece, ainda, um alimento para animais que compreende uma biomassa de acordo com a invenção e também ingredientes de alimento para animais adicionais.

[0087] Nesse sentido, os outros ingredientes de alimento para animais são, de preferência, selecionados a partir de componentes que contêm proteína, que contêm carboidrato, que contêm ácido nucleico e solúveis em lipídio e, se apropriado, componentes adicionais que contêm gordura e, além disso, entre outros aditivos, como minerais, vitaminas, pigmentos e aminoácidos. Além disso, materiais estruturantes também podem estar presentes, além dos nutrientes, por exemplo, de modo a melhorar a textura ou a aparência do alimento para animais. Além disso, também é possível usar, por exemplo, ligantes de modo a influenciar a consistência do alimento para animais. Um componente que é, de preferência, empregado e que constitui tanto um nutriente quanto um material estruturante é o amido.

[0088] De acordo com a invenção, um alimento para animais de acordo com a invenção ou uma composição usada para produzir um alimento para animais de acordo com a invenção é preferencialmente distinguida pelo fato de que contém uma biomassa de acordo com a invenção em uma quantidade de 1 a 25 % em peso, preferencialmente 2 a 20 % em peso, em particular 3 a 15 % em peso, com máxima preferência 4 a 12 % em peso.

[0089] O dito alimento para animais ou a composição usada para produzir a alimento para animais tem, de preferência, adicionalmente pelo menos uma, preferencialmente todas, das propriedades a seguir: a) um teor de proteína total de 33 a 67 % em peso, preferencialmente 39 a 61 % em peso, particularmente 44 a 55 % em peso; b) um teor de gordura total de 5 a 25 % em peso, preferencialmente 8 a 22 % em peso, em particular 10 a 20 % em peso, com máxima preferência 12 a 18 % em peso; c) um teor de amido total de no máximo 25 % em peso, em particular, no máximo 20 % em peso, de preferência, 6 a 17 % em peso, especialmente de preferência, 8 a 14 % em peso; d) um teor de ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) de 2 a 13 % em peso, de preferência, 3 a 11 % em peso, em particular, 4 a 10 % em peso, com máxima preferência, 5,5 a 9 % em peso; e) um teor de ácidos graxos ômega-3 de 1 a 7 % em peso, de preferência, 1,5 a 5,5 % em peso, em particular, 2 a 5 % em peso, com máxima preferência, 2,5 a 4,5 % em peso; f) um teor de DHA de 0,5 a 3 % em peso, de preferência, 0,8 a 2,8 % em peso, em particular, 1 a 2,8 % em peso, com máxima preferência, 1,3 a 2,4 % em peso, em particular, 1,3 a 2,2 % em peso.

[0090] A invenção, portanto, também fornece preferencialmente um alimento para animais ou uma composição adequada para a produção do alimento para animais que tem pelo menos uma, preferencialmente todas,

das propriedades a seguir: a) um teor de proteína total de 33 a 67 % em peso, de preferência, 39 a 61 % em peso, em particular, 44 a 55 % em peso; b) um teor de gordura total de 5 a 25 % em peso, preferencialmente 8 a 22 % em peso, em particular 10 a 20 % em peso, com máxima preferência 12 a 18 % em peso; c) um teor de amido total de no máximo 25 % em peso, em particular, no máximo 20 % em peso, de preferência, 6 a 17 % em peso, especialmente de preferência, 8 a 14 % em peso; d) um teor de ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) de 2 a 13 % em peso, de preferência, 3 a 11 % em peso, em particular, 4 a 10 % em peso, com máxima preferência, 5,5 a 9 % em peso; e) um teor de ácidos graxos ômega-3 de 1 a 7 % em peso, de preferência, 1,5 a 5,5 % em peso, em particular, 2 a 5 % em peso, com máxima preferência, 2,5 a 4,5 % em peso; f) um teor de DHA de 0,5 a 3 % em peso, de preferência, 0,8 a 2,8 % em peso, em particular, 1 a 2,8 % em peso, com máxima preferência, 1,3 a 2,4 % em peso, em particular, 1,3 a 2,2 % em peso.

[0091] A invenção, portanto, também fornece preferencialmente um alimento para animais ou uma composição adequada para a produção do alimento para animais que tem pelo menos uma, preferencialmente todas, das propriedades a seguir: a) um teor de proteína total de 33 a 67 % em peso, de preferência, 39 a 61 % em peso, em particular, 44 a 55 % em peso;

b) um teor de gordura total de 5 a 25 % em peso, preferencialmente 8 a 22 % em peso, em particular 10 a 20 % em peso, com máxima preferência 12 a 18 % em peso; c) um teor de amido total de no máximo 25 % em peso, em particular, no máximo 20 % em peso, de preferência, 6 a 17 % em peso, especialmente de preferência, 8 a 14 % em peso; d) um teor de biomassa de acordo com a invenção, em particular, uma biomassa de Labyrinthulea de acordo com a invenção, de preferência, uma biomassa de Thraustochytriaceae de acordo com a invenção, de 2 a 24 % em peso, de preferência, 4 a 22 % em peso, em particular, 9 a 20 % em peso, acima de tudo, 11 a 18 % em peso; e) um teor de ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) de 2 a 13 % em peso, de preferência, 3 a 11 % em peso, em particular, 4 a 10 % em peso, com máxima preferência, 5,5 a 9 % em peso; f) um teor de ácidos graxos ômega-3 de 1 a 7 % em peso, de preferência, 1,5 a 5,5 % em peso, em particular, 2 a 5 % em peso, com máxima preferência, 2,5 a 4,5 % em peso; g) um teor de DHA de 0,5 a 3 % em peso, de preferência, 0,8 a 2,8 % em peso, em particular, 1 a 2,8 % em peso, com máxima preferência, 1,3 a 2,4 % em peso, em particular, 1,3 a 2,2 % em peso.

[0092] A invenção, portanto, também fornece preferencialmente um alimento para animais ou uma composição adequada para a produção do alimento para animais que tem pelo menos uma, preferencialmente todas, das propriedades a seguir: a) um teor de proteína total de 33 a 67 % em peso,

preferencialmente 39 a 61 % em peso, particularmente 40 a 50 % em peso; b) um teor de gordura total de 5 a 25 % em peso, preferencialmente 8 a 22 % em peso, em particular 10 a 20 % em peso, com máxima preferência 12 a 18 % em peso; c) um teor de amido total de no máximo 25 % em peso, em particular, no máximo 20 % em peso, de preferência, 6 a 17 % em peso, especialmente de preferência, 8 a 14 % em peso; d) um teor de uma biomassa de Aurantiochytrium ou Schizochytrium de acordo com a invenção, preferencialmente uma biomassa de Aurantiochytrium limacinum de acordo com a invenção, com máxima preferência uma biomassa de Aurantiochytrium limacinum SR21 de acordo com a invenção, de 1 a 25 % em peso, preferencialmente 2 a 20 % em peso, em particular 3 a 15 % em peso, com máxima preferência 4 a 12 % em peso; e) um teor de ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) de 2 a 13 % em peso, de preferência, 3 a 11 % em peso, em particular, 4 a 10 % em peso, com máxima preferência, 5,5 a 9 % em peso; f) um teor de ácidos graxos ômega-3 de 1 a 7 % em peso, de preferência, 1,5 a 5,5 % em peso, em particular, 2 a 5 % em peso, com máxima preferência, 2,5 a 4,5 % em peso; g) um teor de DHA de 0,5 a 3 % em peso, de preferência, 0,8 a 2,8 % em peso, em particular, 1 a 2,8 % em peso, com máxima preferência, 1,3 a 2,4 % em peso, em particular, 1,3 a 2,2 % em peso.

[0093] Por extrusão das composições mencionadas acima, é possível obter um extrudado. A presente invenção fornece preferencialmente os ditos extrudados. Nesse sentido, a extrusão do alimento para animais é feita preferencialmente a uma entrada de energia de 12 – 28 Wh/kg, em particular 14 – 26 Wh/kg, especialmente preferencialmente 16 – 24 Wh/kg, com máxima preferência 18 – 22 Wh/kg.

[0094] Nesse sentido, uma extrusora de rosca simples ou rosca dupla é, de preferência, empregada no processo de extrusão. O processo de extrusão é, de preferência, realizado a uma temperatura de 80 - 220 °C, em particular, 80 - 130 °C, com máxima preferência, 95 - 110 °C, uma pressão de 1000 - 4000 kPa (10 - 40 bar), e uma velocidade rotacional de eixo de 100 - 1000 rpm, em particular, 300 - 700 rpm. O tempo de permanência da mistura introduzida é preferencialmente de 5 – 30 segundos, em particular, 10 – 20 segundos.

[0095] O processo de extrusão pode compreender, opcionalmente, uma etapa de compactação e/ou uma etapa de compressão.

[0096] É preferencial misturar intensamente os componentes entre si antes de realizar o processo de extrusão. Isso é realizado, de preferência, em um tambor equipado com aletas. Em uma modalidade preferencial, essa etapa de mistura inclui uma injeção de vapor, em particular, de modo a causar o intumescimento do amido que está, de preferência, presente. Nesse sentido, a injeção de vapor é preferencialmente realizada a uma pressão de 100 a 500 kPa (1 a 5 bar), de modo particularmente preferencial a uma pressão de 200 a 400 kPa (2 a 4 bar).

[0097] Antes de ser misturado com a biomassa de algas, os demais ingredientes de alimento para animais são, de preferência, triturados – se exigido – de modo a garantir que uma mistura homogênea seja obtida na etapa de mistura. A trituração dos demais ingredientes de alimento para animais pode ser realizada, por exemplo, com o uso de um moinho de martelos.

[0098] O extrudado criado tem, de preferência, um diâmetro de 1 a 14 mm, de preferência, 2 a 12 mm, em particular, 2 a 6 mm e, de preferência, também tem um comprimento de 1 a 14 mm, de preferência, 2 a 12 mm, em particular, 2 a 6 mm. O comprimento do extrudado é ajustado durante a extrusão com o uso de uma ferramenta de corte. O comprimento do extrudado é, de preferência, selecionado de tal modo que corresponda aproximadamente ao diâmetro do extrudado. O diâmetro do extrudado é definido selecionando- se o diâmetro de tela.

[0099] Em uma modalidade preferencial de acordo com a invenção, o processo de extrusão é sucedido pelo carregamento do extrudado obtido com óleo. Com essa finalidade, o extrudado é, de preferência, primeiramente seco a um teor de umidade de não mais que 5 % em peso. De acordo com a invenção, o produto de extrusão pode ser carregado com óleo, por exemplo, colocando-se o extrudado em óleo ou aspergindo-se o extrudado com óleo; no entanto, de acordo com a invenção, é dada preferência a revestimento a vácuo.

[0100] Desse modo, os alimentos para animais são obtidos, os quais contêm biomassas de acordo com a invenção, de preferência, em uma quantidade de 1 a 25 % em peso, em particular, 2 a 20 % em peso, especialmente de preferência, 3 a 15 % em peso, acima de tudo 4 a 12 % em peso.

[0101] Consequentemente, os ditos alimentos para animais têm, de preferência, adicionalmente pelo menos uma, de preferência todas, das seguintes propriedades: a) um teor de proteína total de 30 a 60 % em peso, de preferência, 35 a 55 % em peso, em particular, 40 a 50 % em peso; b) um teor de gordura total de 15 a 35 % em peso, de preferência, 18 a 32 % em peso, em particular, 20 a 30 % em peso, com máxima preferência, 22 a 28 % em peso; c) um teor de amido total de no máximo 25 % em peso, em particular, no máximo 20 % em peso, de preferência, 5 a 15 % em peso, especialmente de preferência, 7 a 13 % em peso; d) um teor de ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) de 2 a 12 % em peso, de preferência, 3 a 10 % em peso, em particular, 4 a 9 % em peso, com máxima preferência, 5 a 8 % em peso; e) um teor de ácidos graxos ômega-3 de 1 a 6 % em peso, de preferência, 1,5 a 5 % em peso, em particular, 2 a 4,5 % em peso, com máxima preferência, 2,5 a 4 % em peso; f) um teor de DHA de 0,5 a 3 % em peso, de preferência, 0,8 a 2,5 % em peso, em particular, 1 a 2,5 % em peso, com máxima preferência, 1,2 a 2,2 % em peso, em particular, 1,2 a 2,0 % em peso.

[0102] A invenção também fornece, portanto, preferencialmente um alimento para animais, em particular um extrudado, que tem pelo menos uma, preferencialmente todas, das propriedades a seguir: a) um teor de proteína total de 30 a 60 % em peso,

de preferência, 35 a 55 % em peso, em particular, 40 a 50 % em peso; b) um teor de gordura total de 15 a 35 % em peso, de preferência, 18 a 32 % em peso, em particular, 20 a 30 % em peso, com máxima preferência, 22 a 28 % em peso; c) um teor de amido total de no máximo 25 % em peso, em particular, no máximo 20 % em peso, de preferência, 5 a 15 % em peso, especialmente de preferência, 7 a 13 % em peso; d) um teor de ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) de 2 a 12 % em peso, de preferência, 3 a 10 % em peso, em particular, 4 a 9 % em peso, com máxima preferência, 5 a 8 % em peso; e) um teor de ácidos graxos ômega-3 de 1 a 6 % em peso, de preferência, 1,5 a 5 % em peso, em particular, 2 a 4,5 % em peso, com máxima preferência, 2,5 a 4 % em peso; f) um teor de DHA de 0,5 a 3 % em peso, de preferência, 0,8 a 2,5 % em peso, em particular, 1 a 2,5 % em peso, com máxima preferência, 1,2 a 2,2 % em peso, em particular, 1,2 a 2,0 % em peso.

[0103] A invenção também fornece, portanto, preferencialmente um alimento para animais, em particular um extrudado, que tem pelo menos uma, preferencialmente todas, das propriedades a seguir: a) um teor de proteína total de 30 a 60 % em peso, de preferência, 35 a 55 % em peso, em particular, 40 a 50 % em peso; b) um teor de gordura total de 15 a 35 % em peso, de preferência, 18 a 32 % em peso, em particular, 20 a 30 % em peso, com máxima preferência, 22 a 28 % em peso;

c) um teor de amido total de no máximo 25 % em peso, em particular, no máximo 20 % em peso, de preferência, 5 a 15 % em peso, especialmente de preferência, 7 a 13 % em peso; d) um teor de uma biomassa de acordo com a invenção, em particular, uma biomassa de Labyrinthulea de acordo com a invenção, de preferência, uma biomassa de Thraustochytriaceae de acordo com a invenção, de 1 a 25 % em peso, de preferência, 2 a 20 % em peso, em particular, 3 a 15 % em peso, acima de tudo, 4 a 12 % em peso; e) um teor de ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) de 2 a 12 % em peso, de preferência, 3 a 10 % em peso, em particular, 4 a 9 % em peso, com máxima preferência, 5 a 8 % em peso; f) um teor de ácidos graxos ômega-3 de 1 a 6 % em peso, de preferência, 1,5 a 5 % em peso, em particular, 2 a 4,5 % em peso, com máxima preferência, 2,5 a 4 % em peso; g) um teor de DHA de 0,5 a 3 % em peso, de preferência, 0,8 a 2,5 % em peso, em particular, 1 a 2,5 % em peso, com máxima preferência, 1,2 a 2,2 % em peso, em particular, 1,2 a 2,0 % em peso.

[0104] A invenção também fornece, portanto, preferencialmente um alimento para animais, em particular um extrudado, que tem pelo menos uma, preferencialmente todas, das propriedades a seguir: a) um teor de proteína total de 30 a 60 % em peso, de preferência, 35 a 55 % em peso, particularmente, 40 a 50 % em peso; b) um teor de gordura total de 15 a 35 % em peso, de preferência, 18 a 32 % em peso, em particular, 20 a 30 % em peso, com máxima preferência, 22 a 28 % em peso; c) um teor de amido total de no máximo 25 % em peso, em particular, no máximo 20 % em peso, de preferência, 5 a 15 % em peso, especialmente de preferência, 7 a 13 % em peso; d) um teor de uma biomassa de Aurantiochytrium ou Schizochytrium de acordo com a invenção, preferencialmente uma biomassa de Aurantiochytrium limacinum de acordo com a invenção, com máxima preferência uma biomassa de Aurantiochytrium limacinum SR21 de acordo com a invenção, de 1 a 25 % em peso, preferencialmente 2 a 20 % em peso, em particular 3 a 15 % em peso, com máxima preferência 4 a 12 % em peso; e) um teor de ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) de 2 a 12 % em peso, de preferência, 3 a 10 % em peso, em particular, 4 a 9 % em peso, com máxima preferência, 5 a 8 % em peso; f) um teor de ácidos graxos ômega-3 de 1 a 6 % em peso, de preferência, 1,5 a 5 % em peso, em particular, 2 a 4,5 % em peso, com máxima preferência, 2,5 a 4 % em peso; g) um teor de DHA de 0,5 a 3 % em peso, de preferência, 0,8 a 2,5 % em peso, em particular, 1 a 2,5 % em peso, com máxima preferência, 1,2 a 2,2 % em peso, em particular, 1,2 a 2,0 % em peso.

[0105] De acordo com a invenção, o componente que contém gordura usado pode ser, além da biomassa a ser usada de acordo com a invenção, gorduras, em particular, óleos, tanto de origem animal quanto de origem vegetal. De acordo com a invenção, os componentes que contêm gordura adequados são, em particular, óleos vegetais, por exemplo, óleos de soja, óleos de colza, óleos de girassol, óleos de linhaça ou óleos de palma e misturas dos mesmos. Além disso, o óleo de peixe também pode ser opcionalmente usado como componente que contém gordura em pequenas quantidades.

[0106] De acordo com a invenção, o componente que contém proteína usado pode ser, por exemplo, proteína de soja, proteína de ervilha, glúten de trigo ou glúten de milho e misturas dos mesmos.

[0107] Os exemplos a seguir podem ser empregados como um componente que contém proteína que contém adicionalmente gorduras: farinha de peixe, farinha de krill, farinha de mexilhão, farinha de lula ou cascas de camarão. Essas são incluídas a seguir no presente documento sob o termo "farinha marinha". Em uma modalidade preferencial, um alimento para animais de acordo com a invenção compreende farinha marinha, de preferência, farinha de peixe, em uma quantidade de 3 a 18 % em peso, em particular, 5 a 15 % em peso, com máxima preferência, 7 a 13 % em peso.

[0108] O componente que contém carboidrato usado pode ser, por exemplo, farinha de trigo, farinha de girassol ou farinha de soja e misturas dos mesmos.

[0109] Ao usar alimentos para animais de acordo com a invenção, em particular um extrudado revestido com óleo de acordo com a invenção, em criação animal, se tornou evidente que se promove especialmente o crescimento dos animais e melhora o nível de estresse dos animais.

[0110] A presente invenção também fornece adicionalmente um método para criação de animais, caracterizado pelo fato de que eles recebem um alimento para animais de acordo com a invenção.

[0111] Nesse sentido, a presente invenção fornece, em particular, um método para aumentar o crescimento de animais, caracterizado pelo fato de que eles recebem um alimento para animais de acordo com a invenção.

[0112] A presente invenção fornece adicionalmente, em particular de modo similar, um método para aumentar a fração de ácidos graxos ômega-3, em particular DHA, no tecido muscular de animais, caracterizado pelo fato de que recebem um alimento para animais de acordo com a invenção.

[0113] Preferencialmente, no método de acordo com a invenção, o alimento para animais é administrado pelo menos a cada dois dias, preferencialmente pelo menos uma vez ao dia.

[0114] A presente invenção ainda fornece, similarmente, o uso de um alimento para animais de acordo com a invenção para aumentar o crescimento de animais.

[0115] A presente invenção ainda fornece, similarmente, o uso de um alimento para animais de acordo com a invenção para aumentar a fração de ácidos graxos ômega-3 no tecido muscular de animais.

[0116] A presente invenção ainda fornece, similarmente, o uso de um alimento para animais de acordo com a invenção para melhorar a condição física de animais, em particular para melhorar o nível de estresse de animais.

[0117] A presente invenção ainda fornece, similarmente, o uso de um alimento para animais de acordo com a invenção para permitir uma criação com estresse reduzido dos animais.

[0118] Os animais criados alimentados com um alimento para animais de acordo com a invenção são preferencialmente aves, porcos ou gado.

[0119] No entanto, os animais criados são especialmente, de preferência, animais marinhos, especialmente, de preferência, peixes ósseos ou crustáceos. Esses incluem, em particular, carpa, tilápia, peixe-gato, atum, salmão, truta, perca-gigante, sargo, poleiro, bacalhau, camarão, lagosta, caranguejo, pitu e lagostim. Os animais criados são especialmente, de preferência, salmão. Os tipos preferenciais de salmão neste contexto são o salmão do Atlântico, salmão vermelho, salmão masu, salmão real, salmão keta, salmão prateado, salmão do Danúbio, salmão do Pacífico e salmão rosa.

[0120] Os animais criados também podem ser, em particular, peixe que é subsequentemente processado em farinha de peixe ou óleo de peixe. A este respeito, os peixes são, de preferência, arenque, pescada-amarela, savelha, anchova, capelim ou bacalhau. A farinha de peixe ou o óleo de peixe então obtido, por sua vez, pode ser usado em aquicultura para a criação de peixes ou crustáceos comestíveis.

[0121] No entanto, os animais criados também podem ser pequenos organismos que são usados como gênero alimentício em aquicultura. Esses pequenos organismos podem assumir a forma, por exemplo, de nematódeos, crustáceos ou rotíferos.

[0122] A criação de animais marinhos pode ocorrer em viveiros, tanques, bacias ou ainda em áreas separadas no mar ou em lagos, em particular, nesse caso, em gaiolas ou tanques-rede. A criação pode ser usada para a criação do peixe comestível terminado, porém, também pode ser usada para a criação de alevinos que são subsequentemente liberados para reabastecer os estoques de peixes selvagens.

[0123] Na criação de salmão, os peixes são, de preferência, primeiramente cultivados até salmões jovens em tanques de água fresca ou cursos de água artificiais e, então, são cultivados em gaiolas ou tanques-rede que flutuam no mar e que são, de preferência, ancorados em enseadas ou fiordes.

[0124] Consequentemente, o gênero alimentício de acordo com a invenção é, de preferência, um gênero alimentício para uso na criação dos animais mencionados acima. Modalidades exemplificativas Exemplo 1: Produção de biomassa por fermentação de Aurantiochytrium limacinum SR21 em um meio que tem um alto teor de sulfato e secagem subsequente da biomassa

[0125] As células foram cultivadas por cerca de 70 h em um processo de alimentação com o uso de um fermentador de aço que tem um volume de fermentador de 2 litros com uma massa total de partida de cerca de 700 g e uma massa total final alcançada de cerca de 1,5 kg. Durante o processo, uma solução de glicose (570 g/kg de glicose) foi medida (em "processo de batelada alimentada").

[0126] A composição do meio de partida era como a seguir:

[0127] Meio 1: 20 g/kg de glicose; 4 g/kg de extrato de levedura; 2 g/kg de sulfato de amônio; 12 ou 16 g/kg de sulfato de sódio; 2,46 g/kg de sulfato de magnésio (hepta- hidrato); 0,45 g/kg de cloreto de potássio; 4,5 g/kg de fosfato di-hidrogênio de potássio; 0,1 g/kg de tiamina (HCl); 5 g/kg de solução de elemento-traço.

[0128] A composição da solução de elemento-traço era como a seguir: 35 g/kg de ácido clorídrico (37 %); 1,86 g/kg de cloreto de manganês (tetra-hidrato); 1,82 g/kg de sulfato de zinco (hepta-hidrato); 0,818 g/kg de EDTA de sódio; 0,29 g/kg de ácido bórico; 0,24 g/kg de molibdato de sódio (di-hidrato); 4,58 g/kg de cloreto de cálcio (di- hidrato); 17,33 g/kg de sulfato de ferro (hepta-hidrato); 0,15 g/kg de cloreto de cobre (di-hidrato).

[0129] O cultivo foi realizado sob as seguintes condições: Temperatura de cultura 28 °C; taxa de aeração 0,5 vvm, velocidade de agitador 600 a 1950 rpm, controle de pH na fase de crescimento a 4,5 com o uso de água de amônia (25 % em v/v). A fermentação foi realizada até uma densidade de biomassa de 80 g/l antes de a fase de produção de óleo ter sido introduzida por limitação de fosfato e nitrogênio. Devido ao alto teor de sulfato no meio de partida até o fim da fermentação, isto é, incluindo até o fim da fase de produção de óleo, a concentração de sulfato está sempre acima do limite de saturação das células, o qual é de cerca de 5 g por kg de biomassa seca. As biomassas obtidas são denominadas doravante no presente documento “Biomassa 1” (12 g/kg de sulfato de sódio no meio de partida) e “Biomassa 2” (16 g/kg de sulfato de sódio no meio de partida). Exemplo 2: Produção de biomassa por fermentação de Aurantiochytrium limacinum SR21 em um meio que tem um baixo teor de sulfato e secagem subsequente da biomassa

[0130] As células foram cultivadas por cerca de 70 h em um processo de alimentação com o uso de um fermentador de aço que tem um volume de fermentador de 2 litros com uma massa total de partida de 712 g e uma massa total final alcançada de cerca de 1,5 kg. Durante o processo, uma solução de glicose (570 g/kg de glicose) foi medida (em "processo de batelada alimentada").

[0131] A composição do meio de partida era como a seguir:

[0132] Meio 1: 20 g/kg de glicose; 4 g/kg de extrato de levedura; 0 g/kg de sulfato de amônio; 2,46 g/kg de sulfato de magnésio (hepta-hidrato); 0,45 g/kg de cloreto de potássio; 4,5 g/kg de fosfato di-hidrogênio de potássio; 0,1 g/kg de tiamina (HCl); 5 g/kg de solução de elemento- traço.

[0133] A composição da solução de elemento-traço era como a seguir: 35 g/kg de ácido clorídrico (37 %); 1,86 g/kg de cloreto de manganês (tetra-hidrato); 1,82 g/kg de sulfato de zinco (hepta-hidrato); 0,818 g/kg de EDTA de sódio; 0,29 g/kg de ácido bórico; 0,24 g/kg de molibdato de sódio (di-hidrato); 4,58 g/kg de cloreto de cálcio (di- hidrato); 17,33 g/kg de sulfato de ferro (hepta-hidrato); 0,15 g/kg de cloreto de cobre (di-hidrato).

[0134] O cultivo foi realizado sob as seguintes condições: Temperatura de cultura 28 °C; taxa de aeração 0,5 vvm, velocidade de agitador 600 a 1950 rpm, controle de pH na fase de crescimento a 4,5 com o uso de água de amônia (25 % em v/v). A fermentação foi realizada até uma densidade de biomassa de 80 g/l antes de a fase de produção de óleo ter sido introduzida por limitação de fosfato e nitrogênio. A concentração de sulfato já havia decaído para abaixo do limite de detecção de 0,05 g por kg de meio de fermentação mediante a introdução da fase de produção de óleo, e a concentração de sulfato também estava consequentemente abaixo do limite de detecção durante toda a fase de produção de óleo. E, já que não há nenhuma adição medida de sulfato, a concentração de sulfato chega a zero ao longo da fase de produção de óleo. A biomassa obtida é denominada doravante no presente documento “Biomassa 3”. Exemplo 3: Produção de biomassa por fermentação de Aurantiochytrium limacinum SR21 em um meio que tem um baixo teor de sulfato com adição simultânea de sulfato durante a fermentação e secagem subsequente da biomassa

[0135] As células foram cultivadas por cerca de 70 h em um processo de alimentação com o uso de um fermentador de aço que tem um volume de fermentador de 2 litros com uma massa total de partida de 712 g e uma massa total final alcançada de cerca de 1,5 kg. Durante o processo, uma solução de glicose (570 g/kg de glicose) foi medida em (“processo de batelada alimentada”), conforme eram as soluções de sulfato de sódio de concentração diferente (7,4; 14,8 ou 22,2 g/kg de sulfato de sódio) ou soluções de sulfato de amônio de concentração diferente (6,8; 13,6 ou 20,4 g/kg de sulfato de amônio) em seis bateladas diferentes em uma taxa de alimentação constante de 3 g/h. As taxas de alimentação das soluções de sulfato foram selecionadas de modo que o teor de sulfato na fase de armazenamento permaneça abaixo do limite de detecção (0,05 g/l) para sulfato.

[0136] Ademais, a água com a mesma taxa de alimentação (3 g/h) foi usada em uma batelada como um controle negativo a fim de excluir um “efeito de diluição”.

[0137] A composição do meio de partida era como a seguir:

[0138] Meio 1: 20 g/kg de glicose; 4 g/kg de extrato de levedura; 2 g/kg de sulfato de amônio; 2,46 g/kg de sulfato de magnésio (hepta-hidrato); 0,45 g/kg de cloreto de potássio; 4,5 g/kg de fosfato di-hidrogênio de potássio; 0,1 g/kg de tiamina (HCl); 5 g/kg de solução de elemento- traço.

[0139] A composição da solução de elemento-traço era como a seguir: 35 g/kg de ácido clorídrico (37 %); 1,86 g/kg de cloreto de manganês (tetra-hidrato); 1,82 g/kg de sulfato de zinco (hepta-hidrato); 0,818 g/kg de EDTA de sódio; 0,29 g/kg de ácido bórico; 0,24 g/kg de molibdato de sódio (di-hidrato); 4,58 g/kg de cloreto de cálcio (di- hidrato); 17,33 g/kg de sulfato de ferro (hepta-hidrato); 0,15 g/kg de cloreto de cobre (di-hidrato).

[0140] O cultivo foi realizado sob as seguintes condições: Temperatura de cultura 28 °C; taxa de aeração 0,5 vvm, velocidade de agitador 600 a 1950 rpm, controle de pH na fase de crescimento a 4,5 com o uso de água de amônia (25 % em v/v). A fermentação foi realizada até uma densidade de biomassa de 50 g/l antes de a fase de produção de óleo ter sido introduzida por limitação de fosfato e nitrogênio. A concentração de sulfato já havia decaído para abaixo do limite de detecção de 0,05 g por kg de meio de fermentação mediante a introdução da fase de produção de óleo, e a concentração de sulfato também estava consequentemente abaixo do limite de detecção durante toda a fase de produção de óleo. Devido à adição medida de sulfato contínua, a concentração de sulfato no meio é, no entanto, impedida de cair para zero. Doravante, as biomassas com a ração de sulfato de sódio referidas como

“Biomassas 3, 4 e 5” e as biomassas com a ração de sulfato de amônio são referidas como “Biomassas 6, 7 e 8”. Exemplo 4: Tratamento final e comparação das biomassas obtidas e dos processos

[0141] Após o processo de cultivo, os caldos de fermentação foram aquecidos a 60 °C por 20 minutos a fim de impedir atividade celular adicional.

[0142] A isso se sucedeu uma secagem de dois estágios da biomassa: Em primeiro lugar, o caldo de fermentação foi concentrado por evaporação até ficar como uma massa seca de cerca de 20 % em peso. Posteriormente, o caldo de fermentação concentrado foi seco por aspersão com o uso de um Secador Aspersor Production MinorTM (GEA NIRO) a uma temperatura de entrada do ar de secagem de 340 °C. A secagem por aspersão produziu então um pó com mais de 95 % em peso de massa seca. Tabela 1: Comparação das biomassas obtidas Biomassa Teor de Rendimento Produto, Pureza [%] sulfato [%] total (g de DHA por [g/kg] (g de DHA [g] (g g de biomassa (sulfato por g de de DHA) seca) por kg de dextrose) biomassa) 1 29,7 7,8 44,2 15,7 2 32,5 7,3 45,4 15,4 3 8,4 7,1 35,5 20,1 4 12,4 8,3 52,5 21,2 5 13,6 8,7 53,9 22,5 6 15,0 8,5 52,1 21,5

Biomassa Teor de Rendimento Produto, Pureza [%] sulfato [%] total (g de DHA por [g/kg] (g de DHA [g] (g g de biomassa (sulfato por g de de DHA) seca) por kg de dextrose) biomassa) 7 12,2 8,3 51,8 21,3 8 13,9 8,6 55,8 21,7 9 15,4 8,4 51,9 21,3

[0143] As biomassas 1 e 2 são as biomassas obtidas por meio de fermentação em alto teor de sulfato como no Exemplo 1, a Biomassa 3 é a biomassa obtida por meio da fermentação em baixo teor de sulfato como no Exemplo 2, enquanto as Biomassas 4 a 9 foram obtidas por meio de fermentação em baixo teor de sulfato e com alimentação contínua de sulfato em baixa taxa de medição como no Exemplo 3.

[0144] Pode-se perceber que os processos de fermentação que levam às Biomassas 4 a 9 entregaram um rendimento distintamente maior de DHA e também mais produto e um produto mais puro do que o processo realizado em baixo teor de sulfato sem alimentação contínua de sulfato (biomassa 3) ou aqueles processos realizados em alto teor de sulfato (biomassas 1 e 2). As biomassas preferenciais de acordo com a invenção que foram obtidas pelos processos como no Exemplo 3 continham sulfato em uma quantidade de 12 a 16 g por kg de biomassa.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para produzir uma biomassa contendo PUFAs através da cultura de células produtoras de PUFAs em um meio de fermentação, caracterizado pelo fato de que o teor de sulfato é ajustado de modo que o sulfato esteja sempre presente no meio na última fase de fermentação, porém a concentração de sulfato no meio está sempre abaixo do limite de saturação das células.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, em que o processo compreende uma fase de crescimento e uma fase de produção de óleo, caracterizado pelo fato de que o sulfato está presente no meio de fermentação durante todo o período da fase de produção de óleo, mas a concentração de sulfato está abaixo do limite de saturação das células durante a maior parte do período da fase de produção de óleo.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a concentração de sulfato está abaixo do limite de saturação das células pelo menos durante a segunda metade da fase de produção de óleo, de preferência, pelo menos durante os últimos 70 %, 80 % ou 90 % do período da fase de produção de óleo e, particularmente, de preferência, durante toda a fase de produção de óleo.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a concentração de sulfato está entre 0,005 e 5 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio, de preferência, entre 0,01 e 4 e particularmente, de preferência, entre 0,01 e 3, 2 ou 1 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio e acima de tudo 0,01 e 0,05 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio, pelo menos durante a segunda metade da fase de produção de óleo, de preferência, pelo menos durante os últimos 70 %, 80 % ou 90 % do período da fase de produção de óleo e particularmente, de preferência, durante toda a fase de produção de óleo.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as células são cultivadas, preferencialmente na fase de crescimento, até uma densidade de biomassa de pelo menos 50 g por litro de meio de fermentação, particularmente 50 a 250 g por litro de meio de fermentação, preferencialmente pelo menos 80, 100, 120 ou 140 g por litro de meio de fermentação e particularmente 80, 100, 120 ou 140 g a 200 ou 220 g por litro de meio de fermentação.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a fase de produção de óleo é introduzida limitando-se pelo menos um componente de nutriente limitante, especialmente limitando-se uma fonte de nitrogênio.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que o sulfato é continuamente medido no meio de fermentação durante a maior parte do período da fase de produção de óleo em uma quantidade baixa, de preferência, em uma taxa de 5 a 100 mg, de preferência, 10 a 50 mg, por kg de meio de fermentação.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado pelo fato de que, durante a fase de produção de óleo no período em que a concentração de sulfato está abaixo do limite de saturação, o sulfato é continuamente medido em uma quantidade para fornecer uma concentração de sulfato abaixo do limite de detecção de 0,05 g por kg de meio de fermentação.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o sulfato é inicialmente carregado por meio do meio de partida e a adição medida de sulfato é iniciada uma vez que a concentração de sulfato caiu abaixo de 2 g por kg de meio de fermentação, particularmente, abaixo de 1 g por kg de meio de fermentação e, acima de tudo, abaixo de 0,5 g por kg de meio de fermentação.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a concentração de sulfato cai abaixo de 5 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio, de preferência, abaixo de 4, 3, 2 ou 1 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio e particularmente abaixo de 0,5, 0,1 ou 0,05 g de sulfato por kg de biomassa livre de lipídio, logo antes do início da fase de produção de óleo, de preferência, após uma densidade de biomassa de pelo menos 50 g, de preferência, pelo menos 80, 100 ou 120 g, por litro de meio de fermentação ter sido alcançada, e de preferência, permanece abaixo dessa concentração para o resto da fermentação.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a concentração de sulfato está sempre abaixo de 0,5 g por kg de meio de fermentação até o início da adição medida de sulfato.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o meio de fermentação usado tem uma concentração de cloreto menor que 1 g/l, particularmente menor que 500 mg/l e, de preferência, menor que 250 mg/l durante toda a fermentação.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os microrganismos são aqueles do táxon Labirintulomicetos (Labyrinthulea), em particular, aqueles da família da Thraustochytriaceae, de preferência, do gênero Althornia, Aplanochytrium, Elina, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium ou Ulkenia, com máxima preferência aqueles da espécie Aurantiochytrium limacinum.

14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os PUFAs são ácidos graxos ômega-3, de preferência, DHA e/ou EPA.

15. Biomassa contendo PUFAs caracterizada por ter um teor de sulfato de 12 a 20 g por kg de biomassa, de preferência, 12 a 18 g por kg de biomassa e, particularmente, 12 a 16 g por kg de biomassa, e as células da biomassa são, de preferência, aquelas do táxon Labirintulomicetos (Labyrinthulea), em particular, aquelas da família da Thraustochytriaceae, particularmente, de preferência, do gênero Althornia, Aplanochytrium, Elina, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium ou Ulkenia, e com máxima preferência aquelas da espécie Aurantiochytrium limacinum.