WO2020094750A1 - Verfahren zur herstellung einer biomasse mit erhöhtem gehalt an polyungesättigten fettsäuren - Google Patents

Verfahren zur herstellung einer biomasse mit erhöhtem gehalt an polyungesättigten fettsäuren Download PDF

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WO2020094750A1
WO2020094750A1 PCT/EP2019/080455 EP2019080455W WO2020094750A1 WO 2020094750 A1 WO2020094750 A1 WO 2020094750A1 EP 2019080455 W EP2019080455 W EP 2019080455W WO 2020094750 A1 WO2020094750 A1 WO 2020094750A1
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sulfate
weight
biomass
per
oil production
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PCT/EP2019/080455
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French (fr)
Inventor
Horst Priefert
Jens Schneider
Joachim WINDAU
Original Assignee
Evonik Operations Gmbh
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Priority to US17/291,608 priority patent/US20220017929A1/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/158—Fatty acids; Fats; Products containing oils or fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/10—Protozoa; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a biomass with an increased polyunsaturated fatty acid content and to a biomass obtainable by this method.
  • Processes for producing biomass containing polyunsaturated fatty acids (PUFAs) have already been described in the prior art.
  • Network slime molds are often used, which naturally accumulate polyunsaturated fatty acids in the cell in large quantities as storage lipids.
  • microalgae naturally grow in seawater, so that the microalgae were initially cultivated in media with a high chloride content.
  • high chloride levels are unsuitable for cultivation in steel bioreactors because they cause corrosion of the metal.
  • fermentation media therefore, those with a low chloride content and instead a high sulfate content are described in the prior art.
  • the biomass obtained generally has a limited PUFA content, probably not least because, owing to the high amount of sulfate, the proportion of cell wall formed in the final product is relatively high at the expense of the amount of PUFAs contained.
  • the object according to the invention could be achieved by a method in which the sulfate content in the medium is adjusted such that sulfate is always present in the medium in the last phase of the fermentation, but the sulfate concentration is always below the
  • Saturation concentration of the cells is such that the sulfate present is immediately completely assimilated by the cells.
  • a first object of the present invention is therefore a process for the production of a biomass containing PUFAs, characterized in that for the production of the biomass, the cells producing the PUFAs are cultivated in a fermentation medium, the sulfate content being adjusted so that in the last phase the fermentation always contains sulfate in the medium, but the sulfate concentration in the medium is always below that
  • the sulfate saturation limit or sulfate saturation concentration of the cells is defined as the amount of sulfate released from the cells of the biomass under the given
  • Conditions can be completely assimilated immediately.
  • cells from the family of the Thraustochytriaceae are used, the sulfate saturation limit of which is approximately 5 g per kg of lipid-free biomass.
  • a preferred subject of the present invention is therefore also a method for producing a biomass containing PUFAs, characterized in that for the production of the biomass a cultivation of cells of the family of the Thraustochytriaceae in one
  • Fermentation medium takes place, the sulfate content being adjusted so that in the last phase of the fermentation the sulfate concentration in the medium is always between 0.005 and 5 grams of sulfate per kg of lipid-free biomass, preferably between 0.01 and 4, particularly preferably between 0, 01 and 3, 2 or 1 gram of sulfate per kg of lipid-free biomass, especially between 0.01 and 0.05, grams of sulfate per kg of lipid-free biomass.
  • Methods according to the invention preferably comprise a growth phase and a subsequent oil production phase in order to optimize oil production.
  • the cultivation and the increase in the biomass of the cells producing PUFAs contained in the fermentation medium are carried out first - as far as possible
  • the “last phase of the fermentation” preferably means the oil production phase.
  • Methods according to the invention are therefore preferably characterized in that at least during 50% of the time in the oil production phase, preferably at least during 75 or 85% of the time in the oil production phase, particularly preferably at least during 90 or 95% of the time in the oil production phase, especially during the entire oil production phase , Sulfate is present in the medium, but the sulfate concentration is always below the saturation limit of the cells contained in the medium.
  • Preferred methods are characterized in that at least 50% of the remaining time in the oil production phase, preferably at least 75 or 85% of the remaining time in the oil production phase, particularly preferably at least 90 or 95% of the remaining time in the oil production phase, especially during the complete oil production phase,
  • sulfate is present in the medium, the sulfate concentration is always below the saturation limit of cells contained in the medium, that is to say that the sulfate concentration may also be above the saturation limit of the cells during the corresponding complementary starting time of the oil production phase.
  • the present invention accordingly also relates to a method for producing a biomass containing PUFAs, characterized in that for the production of the biomass, cells of the family of the Thraustochytriaceae are cultivated in a fermentation medium, the sulfate content being adjusted so that at least during 50 % of the time of the oil production phase, preferably at least during 75 or 85% of the time of the
  • Oil production phase particularly preferably at least 90 or 95% of the time in the oil production phase, especially during the complete oil production phase, the sulfate concentration in the medium always between 0.005 and 5 grams of sulfate per kg of lipid-free biomass, preferably between 0.01 and 4, particularly preferred is between 0.01 and 3, 2 or 1 gram of sulfate per kg of lipid-free biomass, especially between 0.01 and 0.05, gram of sulfate per kg of lipid-free biomass.
  • Another object of the present invention is accordingly also a method for producing a biomass containing PUFAs, characterized in that for the production of the biomass a cultivation of cells of the family of the Thraustochytriaceae in one
  • Fermentation medium takes place, the sulfate content being adjusted such that at least 50% of the remaining time in the oil production phase, preferably at least 75 or 85% of the remaining time in the oil production phase, particularly preferably at least 90 or 95% of the remaining time in the oil production phase, especially during the complete oil production phase, the sulfate concentration in the medium always between 0.005 and 5 grams of sulfate per kg of lipid-free biomass, preferably between 0.01 and 4, particularly preferably between 0.01 and 3, 2 or 1 gram of sulfate per kg of lipid-free biomass everything is between 0.01 and 0.05 grams of sulfate per kg of lipid-free biomass.
  • the present invention furthermore relates to biomasses, preferably those which contain cells of the family of the Thraustochytriaceae, which can be obtained by methods according to the invention.
  • biomasses with a sulfate content of 12 to 20 g sulfate per kg biomass, preferably 12 to 16 g sulfate per kg biomass are obtained.
  • Another object of the present invention is therefore in particular a biomass containing PUFAs which has a sulfate content of 12 to 20 g sulfate per kg biomass, preferably 12 to 18 g sulfate per kg biomass, in particular 12 to 16 g sulfate per kg
  • Biomass wherein the biomass preferably comprises cells of the family of the Thraustochytriaceae.
  • sulfate content is understood to mean the total content of sulfate, ie the content of free and bound, in particular organically bound, sulfate in relation to the biomass. It can be assumed that the majority of the sulfate contained in the biomass is present as a component of exopolysaccharides that contribute to the formation of the cell wall
  • Microorganisms are involved.
  • the sulfate content is preferably determined by determining the sulfur content of the biomass obtained, since the majority of the sulfur contained in the biomass can be attributed to the sulfate contained. Sulfur, which can be traced to other sources, is negligible due to the amount of sulfate contained. The amount of sulfate contained can thus be readily determined from the amount of sulfur found.
  • the sulfur content of the biomass is preferably determined by elemental analysis in accordance with DIN EN ISO 1 1885. For the analysis of the sulfur content of the biomass
  • bio-dry mass of PUFAs producing cells is generally to be understood as the determinable bio-dry mass.
  • the amount of dry biomass contained in a sample is preferably determined as follows: A homogeneous sample is taken and for the purpose of separating the liquid
  • Bio dry mass after drying and initial mass of the examined sample also includes the oil formed by the biomass.
  • lipid-free biomass lipid-free bio-dry matter
  • lipid-free biomass of PUFAs producing cells lipid-free biomass of PUFAs producing cells
  • lipid-free bio-dry matter producing cells is to be understood according to the invention as the previously determined bio-dry matter minus the fat content contained in the bio-dry matter.
  • the fat content contained in the dry biomass is preferably determined by taking up the dry biomass in a methanol / chloroform solution and subsequent ultrasound treatment of the sample thus obtained. - The sample thus obtained is then saponified with potassium hydroxide and acidified using hydrochloric acid. The free fatty acids are then methylated using BF3 (30% boron trifluoride in methanol) and by partition chromatography using a
  • the biomass content is now determined according to the invention by subtracting the fat content determined in this way from the previously determined bio-dry matter content.
  • lipid-free dry biomass is used according to the invention because the sulfate saturation limit of the cells is independent of the lipid content of the cells, but the lipid content of the cells increases considerably in the course of the oil production phase, so that to determine the The amount of sulfate to be added should not be based on the total content of dry organic matter, but on the total content of lipid-free dry organic matter. Since after the initiation of the
  • Bio-dry matter can usually not be determined again after the start of the oil production phase.
  • the desired sulfate concentration in the medium can be set in different ways.
  • sulfate must always be metered in in the last phase of the fermentation, preferably at the end of the oil production phase (so-called fed-batch process).
  • the start of sulfate addition is determined by whether and how much sulfate is contained in the batch medium at the start of the fermentation.
  • the amount of sulfate in the batch medium can be chosen arbitrarily, so that the need to add sulfate can arise at different times in the course of the fermentation.
  • the amount of sulfate in the set medium is selected such that the sulfate concentration changes at least during the first 30% of the time in the growth phase of the cells, preferably at least during the first 40, 50 or 60%, in particular during the first 70, 80 or 90%, the time of the growth phase of the cells, is above the saturation concentration of the cells.
  • the sulfate concentration is preferably at least 5 g sulfate per kg lipid-free biomass during the specified phase.
  • Sulphate is preferably only added when the sulphate concentration in the medium is below 2 g sulphate per kg biomass, in particular below 1 g sulphate per kg biomass, particularly preferably only when the sulphate concentration in the medium is below 0 .5 g of sulfate per kg of lipid-free biomass has fallen, which according to the invention takes place shortly before the transition to the oil production phase in order to optimize oil production.
  • the sulfate concentration in the medium therefore drops only shortly before the start of the oil production phase, preferably up to 3 hours, in particular up to 2 hours, especially up to one hour before the start of the oil production phase
  • Oil production phase below 2 g, in particular below 1 g, particularly preferably below 0.5 g sulfate per kg lipid-free biomass.
  • sulfate can alternatively already be added during the growth phase of the cells.
  • the addition of sulfate in the growth phase takes place accordingly such that the amount of sulfate is always above the at least during the first phase of the growth phase Saturation concentration of the cells, preferably at least 5 g sulfate per kg biomass.
  • the sulfate metering is reduced accordingly, so that the sulfate concentration in the oil production phase or shortly before entering the oil production phase is below the saturation concentration of the cells, preferably below 5 g of sulfate per kg of lipid-free biomass, particularly preferably below 3. 2 or 1 g sulfate per kg lipid-free biomass, especially below 0.5 g sulfate per kg lipid-free biomass.
  • sulfate is specified in an amount such that the sulfate concentration during the entire fermentation process or at least for the majority of the entire fermentation process is always below the saturation concentration of the cells, preferably below 5 g of sulfate per kg of lipid-free biomass, in particular below 4, 3, 2 or 1 g sulfate per kg lipid-free biomass.
  • Adjustment of the amount of sulfate added ensures that the sulfate concentration does not drop to zero.
  • sulfate is used in a small amount, preferably during at least 50, 60 or 70% of the time of the oil production phase, particularly preferably at least during the last 50, 60 or 70% of the time of the oil production phase metered continuously into the fermentation medium at a rate of 5 to 100 mg, preferably 10 to 50 mg, per kg of fermentation medium.
  • sodium sulfate, ammonium sulfate or magnesium sulfate and mixtures thereof are preferably used as the sulfate salt.
  • the sulfate can alternatively or additionally also be introduced by using technical
  • Raw materials are made that are contaminated or supplemented with sulfate.
  • the low sulfate concentration can also be combined with low chloride concentrations, so that the biomass can be produced with a non-corrosive fermentation medium.
  • a method according to the invention is therefore preferably further characterized in that the fermentation medium used according to the invention has a chloride concentration of less than 1 g / l, in particular less than 500 mg / l, preferably less than 250 mg / l, during the entire fermentation.
  • Biomasses according to the invention preferably have a chloride content of at most 2 grams per kg of biomass, in particular 0.5 to 1.8 g, particularly preferably 0.5 to 1.5 g, per kg of biomass.
  • chloride content means the amount of determinable chlorine.
  • the amount of chlorine present can be determined, for example, by elemental analysis according to DIN EN ISO 11885.
  • Chlorine is present in the biomass in the form of salts called “chlorides”.
  • chlorides or “chloride ions” are mentioned in the present application, this means only the amount of chloride or detectable chlorine, not the amount of chloride salts, which always include cationic counterions in addition to the chloride ion.
  • the cells that produce PUFAs are preferably cells that already naturally produce PUFAs, but it can also be cells that have been enabled to produce PUFAs by appropriate genetic engineering methods.
  • the production can be autotrophic, mixotrophic or heterotrophic.
  • the biomass according to the invention accordingly comprises such cells and preferably consists essentially of such cells.
  • the cells are preferably those which produce PUFAs heterotrophically.
  • the cells are preferably algae, fungi, in particular yeasts, or protists.
  • the cells are particularly preferably microorganisms, in particular microbial algae or fungi.
  • Strains of Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon and Lipomyces are particularly suitable as cells of oil-producing yeasts.
  • the cells are preferably those of the taxon Labyrinthulomycetes
  • Thraustochytriaceae The genera Althornia, Aplanochytrium, Elnia, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium and Ulkenia belong to the family of Thraustochytriaceae. It is particularly preferably cells of the genera Thraustochytrium, Schizochytrium, Aurantiochytrium or Oblongichytrium, especially those of the genus Aurantiochytrium.
  • the trunk is a particularly preferred trunk
  • Aurantiochytrium limacinum SR21 (IFO 32693).
  • the biomass according to the invention is preferably the product of a fermentative cultivation process.
  • the biomass can be used in addition to
  • cells to be digested also contain constituents of the fermentation medium. These components can in particular be salts, anti-foaming agents and unreacted carbon sources and / or nitrogen sources.
  • the cell content in this biomass is preferably at least 70% by weight, preferably at least 75% by weight.
  • the cell content in the biomass can, if necessary, be carried out before the cell disruption process is carried out
  • corresponding washing steps can be increased, for example, to at least 80 or at least 90% by weight.
  • the biomass obtained can also be used directly in the cell disruption process.
  • the cells of the biomass are preferably distinguished by the fact that they have a PUFA content of at least 20% by weight, preferably at least 30% by weight, in particular at least 40% by weight, in each case based on the dry cell mass.
  • most of the lipids are in the form of triglycerides, preferably at least 50% by weight, in particular at least 75% by weight and in a particularly preferred embodiment at least 90% by weight of the lipids contained in the cell Form of triglycerides are present.
  • Preferably at least 10% by weight, in particular at least 20% by weight, particularly preferably 20 to 60% by weight, in particular 20 to 40% by weight, of the fatty acids contained in the cell are PUFAs.
  • polyunsaturated fatty acids are understood to mean fatty acids which have at least two C-C double bonds.
  • highly unsaturated fatty acids are preferred among the PUFAs.
  • HUFAs are according to the invention
  • the PUFAs can be present in the cell in free form or in bound form.
  • Examples of the presence in bound form are phospholipids and esters of PUFAs, in particular monoacyl, diacyl and triacylglycerides.
  • a majority of the PUFAs are in the form of triglycerides, preferably at least 50% by weight, in particular at least 75% by weight and in a particularly preferred embodiment at least 90% by weight of the PUFAs contained in the cell Form of triglycerides are present.
  • Preferred PUFAs are omega-3 fatty acids and omega-6 fatty acids, omega-3 fatty acids being particularly preferred.
  • Preferred omega-3 fatty acids are the
  • Eicosapentaenoic acid (EPA, 20: 5w-3), in particular the (5Z, 8Z, 1 1 Z, 14Z, 17Z) eicosa-5,8, 1 1, 14, 17-pentaenoic acid, and the docosahexaenoic acid (DHA, 22: 6w-3), especially the
  • Docosahexaenoic acid is particularly preferred.
  • Thraustochytriales are described in detail in the prior art (see e.g. WO91 / 07498, WO94 / 08467, WO97 / 37032, W097 / 36996, W001 / 54510).
  • the production is usually carried out by culturing cells in the presence of a carbon source and a nitrogen source in a fermenter. Biomass densities of more than 100 grams per liter and production rates of more than 0.5 grams of lipid per liter per hour can be achieved.
  • the process is preferably carried out as a so-called fed-batch process, i.e. that the carbon source and possibly also the nitrogen and phosphate sources are fed incrementally during the fermentation.
  • lipid production can be induced by various measures, for example by limiting the nitrogen source, the phosphate source or the oxygen content or combinations thereof.
  • Both alcoholic and non-alcoholic carbon sources can be considered as carbon sources.
  • alcoholic carbon sources are methanol, ethanol and isopropanol.
  • non-alcoholic carbon sources are fructose, glucose, sucrose, molasses, starch and corn syrup, as well as organic acids such as acetic acid, propionic acid and medium and long chain fatty acids and their salts.
  • Processes which are preferred according to the invention are distinguished in that at least one carbon source is metered into the medium continuously during the complete fermentation process.
  • inorganic and organic nitrogen sources can be considered as nitrogen sources.
  • inorganic nitrogen sources are nitrates and ammonium salts, especially ammonium sulfate and ammonium hydroxide.
  • organic nitrogen sources are amino acids, especially glutamate, and urea.
  • the oil production phase is preferably initiated according to the invention, as described in WO 01/54510, by limiting at least one limiting nutrient component, preferably by limiting at least one nitrogen source.
  • the chloride content of the fermentation medium is preferably throughout the fermentation, but at least during the oil production phase, preferably always below 2 g / l, in particular below 1 g / l, preferably below 500 mg / l, particularly preferably below 250 mg / l.
  • salts in particular selected from sodium carbonate, can optionally also be used in the fermentation.
  • Sodium bicarbonate, soda ash or inorganic phosphorus compounds can be used. If further salts are used, these are preferably used in each case in an amount of less than 12 g / l, in particular less than 8 g / l, particularly preferably less than 5 g / l.
  • the total salt content in the fermentation medium is at the beginning of the
  • Main fermentation preferably 5 to 30 g / l, in particular 10 to 20 g / l.
  • organic phosphorus compounds and / or known ones
  • growth-stimulating substances such as yeast extract or corn steep liquor, can be added to positively influence the fermentation.
  • the cells are preferably fermented at a pH of 3 to 11, in particular 4 to 10, and preferably at a temperature of at least 20 ° C., in particular 20 to 40 ° C., particularly preferably at least 30 ° C.
  • a typical fermentation process takes up to about 100 hours.
  • the cells are preferably up to a biomass density of at least 50, 60 or 70 g / l, in particular 50 to 250 g / l or 60 to 220 g / l, preferably at least 80 or 90 g / l, in particular 80 to 200 g / l, particularly preferably at least 100 g / l, in particular 100 to 180 g / l, fermented.
  • the information here relates to the dry matter content in relation to the total volume of the fermentation broth after the end of the fermentation. The dry matter content is determined by filtering the biomass from the
  • Fermentation broth then washing with water, then drying completely - for example in the microwave - and finally determining the dry weight.
  • the sulfate concentration shortly before the start of the oil production phase preferably after a biomass density of at least 50 g, particularly preferably at least 80, 100, 120 or 140 g per liter of fermentation medium, falls below 5 g of sulfate per kg of lipid-free biomass , preferably below 4, 3, 2 or 1 g of sulfate per kg of lipid-free biomass, in particular below 0.5, 0.1 or 0.05 g of sulfate per kg of lipid-free biomass, and preferably also remains below this concentration for the rest of the fermentation.
  • the cells are preferably pasteurized after the cells have been harvested or, if appropriate, even shortly before the cells are harvested, in order to kill the cells and inactivate enzymes which could promote the breakdown of the lipids.
  • the fermentation broth obtained can be subjected to an oil isolation process immediately or, if appropriate, after prior concentration, in order to recover the oil contained.
  • oil insulation processes are described, for example, in WO 01/53512 and WO 201 1/153246.
  • the biomass containing PUFAs can also be harvested after the end of the fermentation.
  • the fermentation broth is preferably first concentrated.
  • the fermentation broth is preferably concentrated by centrifugation, filtration, decanting and / or solvent evaporation in order to first separate a large part of the fermentation medium from the biomass.
  • Solvent evaporation is preferably carried out using a drum dryer, a tunnel dryer, spray drying or vacuum evaporation.
  • Solvent evaporation can in particular also be carried out using a rotary evaporator, a thin-film evaporator or a falling film evaporator.
  • a rotary evaporator a thin-film evaporator or a falling film evaporator.
  • Solvent evaporation can also be used, for example, in reverse osmosis to narrow down the fermentation broth.
  • the concentrated fermentation broth thus obtained is preferably further dried, preferably by fluid bed granulation.
  • the subsequent drying preferably reduces the moisture content of the biomass to below 15% by weight, in particular below 10% by weight, particularly preferably below 5% by weight.
  • the biomass is dried in a fluidized bed granulation process or in a
  • Nozzle spray drying processes as described for example in WO 2015/052048.
  • silica can be added to the biomass as an anti-caking agent during drying in order to convert it into a more manageable state.
  • the fermentation broth containing biomass and the silica are preferably sprayed into the respective drying zone for this purpose.
  • the biomass is preferably mixed with the silica only after drying.
  • patent application WO 2015/052048 is also made in particular to patent application WO 2015/052048.
  • a biomass to be used according to the invention has a concentration of silica, in particular hydrophilic or hydrophobic silica, of 0.2 to 10% by weight, in particular 0.5 to 5% by weight, especially 0.5 up to 2% by weight.
  • Drying preferably gives a free-flowing, finely divided or coarse-grained product, preferably granules. If necessary, a product with the desired grain size can be obtained from the granules obtained by sieving or dust removal.
  • Feed processing can be used as a binding, gelling or thickening agent.
  • free-flowing is to be understood as meaning a powder that consists of a series of
  • Glass outlet vessels with differently sized outlet openings can at least flow freely out of the vessel with the opening 5 millimeters (small: soaps, oils, fats, waxes 94, 12 (1968)).
  • finely divided means a powder with a predominant proportion (> 50%) of a grain size of 20 to 100 micrometers in diameter.
  • “coarse-grained” means a powder with a predominant proportion (> 50%) of a grain size of 100 to 2500 micrometers in diameter.
  • dust-free is to be understood as a powder which contains only small proportions ( ⁇ 10%, preferably ⁇ 5%) of particle sizes below 100 micrometers.
  • the grain or particle sizes are preferably determined by methods of laser diffraction spectrometry.
  • the methods to be used are described in the textbook "Particle size measurement in laboratory practice” by R.H. Müller and R. Schuhmann,
  • the products obtained by drying processes according to the invention preferably have a proportion of at least 80% by weight, in particular at least 90% by weight, particularly preferably at least 95% by weight, of particles with a particle size of 100 to 3500
  • Microns preferably 100 to 3000 microns, especially 100 to 2500 microns.
  • the products of a fluidized bed granulation process obtained according to the invention preferably have a proportion of at least 80% by weight, in particular at least 90% by weight, particularly preferably at least 95% by weight, of particles with a particle size of 200 to 3500 micrometers, preferably 300 to 3000 microns, especially 500 to 2500 microns.
  • the products of a spray drying process obtained according to the invention preferably have a proportion of at least 80% by weight, in particular at least 90% by weight, particularly preferably at least 95% by weight, of particles with a particle size of 100 to 500 micrometers, preferably 100 to 400 microns, especially 100 to 300 microns.
  • the products obtained according to the invention of a spray drying process and subsequent granulation process preferably have a proportion of at least 80% by weight, in particular at least 90% by weight, particularly preferably at least 95% by weight, of particles with a particle size of 100 to 1000 micrometers.
  • the proportion of dust, ie particles with a grain size of less than 100 micrometers, is preferably at most 10% by weight, in particular at most 8% by weight, particularly preferably at most 5% by weight, especially at most 3% by weight .
  • the bulk density of the products according to the invention is preferably 400 to 800 kg / m 3 , particularly preferably 450 to 700 kg / m 3 .
  • Another object of the present invention is therefore also a feed that comprises a biomass according to the invention and further feed ingredients.
  • the further feed ingredients are preferably selected from protein-containing, carbohydrate-containing, nucleic acid-containing and lipid-soluble components and optionally further fat-containing components and further from other additives such as minerals, vitamins, pigments and amino acids.
  • it can also contain structuring substances, for example to improve the texture or appearance of the feed.
  • binders can also be used, for example, to influence the consistency of the feed.
  • a preferred component that is both a nutritional substance and a structuring substance is starch.
  • composition used according to the invention is preferably characterized in that it contains a biomass according to the invention in an amount of 1 to 25% by weight, preferably 2 to 20% by weight, in particular 3 to 15% by weight, especially 4 to 12 % By weight.
  • This feed or the composition used to produce the feed preferably further has at least one, preferably all, of the following properties: a) a total protein content of 33 to 67% by weight, preferably 39 to 61% by weight , in particular 44 to 55% by weight;
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • omega-3 fatty acids 1 to 7% by weight, preferably 1.5 to 5.5% by weight, in particular 2 to 5% by weight, especially 2.5 to 4.5 % By weight;
  • a preferred object according to the invention is therefore also a feed or a composition suitable for producing the feed, which has at least one, preferably all, of the following properties:
  • omega-3 fatty acids 1 to 7% by weight, preferably 1.5 to 5.5% by weight, in particular 2 to 5% by weight, especially 2.5 to 4.5 % By weight;
  • a preferred object according to the invention is therefore also a feed or a composition suitable for producing the feed, which has at least one, preferably all, of the following properties:
  • a content of biomass according to the invention in particular a labyrinthulea biomass according to the invention, preferably a Thraustochytriaceae biomass according to the invention, of 2 to 24% by weight, preferably 4 to 22% by weight, in particular 9 to 20% by weight all 11 to 18% by weight;
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • omega-3 fatty acids 1 to 7% by weight, preferably 1.5 to 5.5% by weight, in particular 2 to 5% by weight, especially 2.5 to 4.5 % By weight;
  • a preferred object according to the invention is therefore also a feed or a composition suitable for producing the feed, which has at least one, preferably all, of the following properties:
  • an aurantiochytrium or schizochytrium biomass according to the invention preferably an aurantiochytrium limacinum biomass according to the invention, especially an aurantiochytrium limacinum SR21 biomass according to the invention, of 1 to 25% by weight, preferably 2 to 20% by weight, in particular 3 to 15% by weight, especially 4 to 12% by weight;
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • omega-3 fatty acids preferably 1 to 7% by weight, preferably 1.5 to 5.5% by weight, in particular 2 to 5% by weight, especially 2.5 to 4.5 % By weight;
  • a DHA content of 0.5 to 3% by weight, preferably 0.8 to 2.8% by weight, in particular 1 to 2.8% by weight, especially 1.3 to 2.4 % By weight, in particular 1.3 to 2.2% by weight.
  • An extrudate can be obtained by extruding the aforementioned compositions. These extrudates represent a preferred subject of the present invention.
  • the feed is preferably extruded with an energy input of 12-28 Wh / kg, in particular 14-26 Wh / kg, particularly preferably 16-24 Wh / kg, especially 18- 22 Wh / kg.
  • a screw or twin-screw extruder is preferably used in the extrusion process.
  • the extrusion process is preferably carried out at a temperature of 80-220 ° C, in particular 80-130 ° C, especially 95-110 ° C, a pressure of 10-40 bar, and a shaft rotation speed of 100-1000 rpm, in particular 300- 700 rpm.
  • the residence time of the introduced mixture is preferably 5 to 30 seconds, in particular 10 to 20 seconds.
  • the extrusion process can optionally be a compacting and / or
  • Compression step include.
  • the components are preferably intimately mixed with one another. This is preferably done in a drum equipped with blades. In a preferred embodiment, this mixing step is carried out by water vapor injection, in particular in order to cause the starch preferably contained to swell.
  • the steam injection is preferably carried out at a pressure of 1 to 5 bar, particularly preferably at a pressure of 2 to 4 bar.
  • the other feed ingredients are preferably comminuted - if necessary - before mixing with the Aigen biomass to ensure that a homogeneous mixture is obtained in the mixing step.
  • the other feed ingredients can be comminuted, for example, using a hammer mill.
  • the extrudate produced preferably has a diameter of 1 to 14 mm, preferably 2 to 12 mm, in particular 2 to 6 mm, and preferably also has a length of 1 to 14 mm, preferably 2 to 12 mm, in particular 2 to 6 mm .
  • the length of the extrudate is adjusted by using a cutting tool during extrusion.
  • the length of the extrudate is preferably chosen so that it approximately corresponds to the diameter of the extrudate.
  • the diameter of the extrudate is determined by the choice of the sieve diameter.
  • the extrusion process is followed by the loading of the extrudate obtained with oil.
  • the extrudate is preferably first dried to a moisture content of at most 5% by weight. The loading of the extrudate
  • Extrusion product with oil can be carried out according to the invention, for example by placing the extrudate in oil or spraying the extrudate with oil, but it is carried out according to the invention
  • Feedstuffs are obtained in this way, the biomasses according to the invention preferably in an amount of 1 to 25% by weight, in particular 2 to 20% by weight, particularly preferably 3 to 15% by weight, especially 4 to 12% by weight. %, contain.
  • these feeds preferably furthermore have at least one, preferably all, of the following properties:
  • omega-3 fatty acids 1 to 6% by weight, preferably 1.5 to 5% by weight, in particular 2 to 4.5% by weight, especially 2.5 to 4% by weight. -%;
  • a preferred object according to the invention is therefore also a feed, in particular an extrudate, which has at least one, preferably all, of the following properties: a) a total protein content of 30 to 60% by weight, preferably 35 to 55% by weight , in particular 40 to 50 wt .-%;
  • omega-3 fatty acids 1 to 6% by weight, preferably 1.5 to 5% by weight, in particular 2 to 4.5% by weight, especially 2.5 to 4% by weight. -%;
  • a preferred object according to the invention is therefore also a feed, in particular an extrudate, which has at least one, preferably all, of the following properties: a) a total protein content of 30 to 60% by weight, preferably 35 to 55% by weight , in particular 40 to 50 wt .-%;
  • Labyrinthulea biomass according to the invention preferably one according to the invention
  • Thraustochytriaceae biomass from 1 to 25% by weight, preferably 2 to 20% by weight, in particular 3 to 15% by weight, especially 4 to 12% by weight;
  • omega-3 fatty acids 1 to 6% by weight, preferably 1.5 to 5% by weight, in particular 2 to 4.5% by weight, especially 2.5 to 4% by weight. -%;
  • a preferred object according to the invention is therefore also a feed, in particular an extrudate, which has at least one, preferably all, of the following properties: a) a total protein content of 30 to 60% by weight, preferably 35 to 55% by weight. -%, in particular 40 to 50 wt .-%;
  • an aurantiochytrium or schizochytria biomass according to the invention preferably an aurantiochytrium limacinum biomass according to the invention, especially an aurantiochytrium limacinum SR21 biomass according to the invention, of 1 to 25% by weight, preferably 2 to 20% by weight, in particular 3 to 15% by weight, especially 4 to 12% by weight;
  • omega-3 fatty acids 1 to 6% by weight, preferably 1.5 to 5% by weight, in particular 2 to 4.5% by weight, especially 2.5 to 4% by weight. -%;
  • a DHA content of 0.5 to 3% by weight, preferably 0.8 to 2.5% by weight, in particular 1 to 2.5% by weight, especially 1.2 to 2.2% % By weight, in particular 1.2 to 2.0% by weight.
  • fats in particular oils, animal and also of vegetable origin can be used as fat-containing component according to the invention.
  • vegetable oils for example soybean oil, rapeseed oil, sunflower seed oil, flaxseed oil or palm oil and mixtures thereof, are particularly suitable as the fatty component.
  • fish oil can optionally also be used in small quantities as a fatty component.
  • the protein-containing component can be, for example, soy protein,
  • Pea protein, wheat gluten or corn gluten and mixtures thereof can be used.
  • Fish protein, krill meal, mussel meal, squid meal or shrimp shells can be used, for example, as a protein-containing component which additionally contains fats. These are summarized below under the term "marine flour”. In a preferred one
  • Embodiment comprises a feed according to the invention, marine flour, preferably Fish meal, in an amount of 3 to 18% by weight, in particular 5 to 15% by weight, especially 7 to 13% by weight.
  • wheat flour for example, wheat flour, sunflower flour or soy flour and mixtures thereof can be used as the carbohydrate-containing component.
  • animal feed according to the invention in particular an oil-coated extrudate according to the invention
  • animal breeding it has been found that this promotes the growth of the animals to a particular extent and improves the stress state of the animals.
  • Another object of the present invention is also a method for breeding animals, characterized in that a feed according to the invention is administered to them.
  • the present invention relates in particular to a method for increasing the growth of animals, characterized in that a feed according to the invention is administered to them.
  • Another object of the present invention is in particular also a method for increasing the proportion of omega-3 fatty acids, in particular DHA, in the muscle tissue of animals, characterized in that a feed according to the invention is administered to them.
  • the feed is preferably administered at least every two days, preferably at least once a day.
  • Another object of the present invention is also the use of a
  • Animal feed according to the invention for increasing the growth in animals for increasing the growth in animals.
  • Another object of the present invention is also the use of a
  • Another object of the present invention is also the use of a
  • Animal feed according to the invention for improving the health status of animals, in particular for improving the stress status of animals.
  • Another object of the present invention is also the use of a
  • Animal feed according to the invention to enable stress-reduced breeding of the animals.
  • the bred animals which are fed with a feed according to the invention are preferably poultry, pigs or cattle.
  • the bred animals are particularly preferably marine animals, particularly preferably finfish or crustaceans. These include carp, tilapia, catfish, tuna, salmon, trout, baramundi, bream, perch, cod, shrimp, lobster, crab, shrimp and crayfish.
  • the animals bred are particularly preferably salmon.
  • Preferred types of salmon are the Atlantic salmon, the sockeye salmon, the masu salmon, the king salmon, the ketal salmon, the silver salmon, the Danube salmon, the Pacific salmon and the humpback salmon.
  • the bred animals can in particular also be fish, which are subsequently processed into fish meal or fish oil.
  • the fish are preferably herring, pollack, menhaden, anchovies, capelin or cod. That so Fish meal or fish oil obtained can in turn be used in aquaculture to breed edible fish or crustaceans.
  • the bred animals can also be small organisms that are used as feed in aquaculture. These small creatures can be, for example, nematodes, crustaceans or rotifers.
  • the marine animals can be grown in ponds, tanks, basins or in delimited areas in the sea or in lakes, in particular in cages or net pens.
  • the cultivation can serve to breed the finished edible fish, but can also be used to breed juveniles, which are then released to the
  • the feed according to the invention is accordingly preferably a feed for use in the breeding of the aforementioned animals.
  • Example 1 Production of the biomass by fermentation of Aurantiochytrium limacinum SR21 in a medium with a high sulfate content and subsequent drying of the
  • the cells were cultivated for approx. 70 h in a feed process using a steel fermenter with a fermenter volume of 2 liters and a total starting mass of approx. 700 g and a total final mass of approx. 1.5 kg.
  • a glucose solution (570 g / kg glucose) was metered in during the process (“fed-batch process”)
  • composition of the starting medium was as follows:
  • Medium 1 20 g / kg glucose; 4 g / kg yeast extract; 2 g / kg ammonium sulfate; 12 or 16 g / kg sodium sulfate; 2.46 g / kg magnesium sulfate (heptahydrate); 0.45 g / kg potassium chloride; 4.5 g / kg potassium dihydrogen phosphate; 0.1 g / kg thiamine (HCl); 5 g / kg trace element solution.
  • the composition of the trace element solution was as follows: 35 g / kg hydrochloric acid (37%); 1.86 g / kg manganese chloride (tetrahydrate); 1.82 g / kg zinc sulfate (heptahydrate); 0.818 g / kg sodium EDTA; 0.29 g / kg boric acid; 0.24 g / kg sodium molybdate (dihydrate); 4.58 g / kg calcium chloride (dihydrate); 17.33 g / kg iron sulfate (heptahydrate); 0.15 g / kg copper chloride (dihydrate).
  • the cultivation was carried out under the following conditions: cultivation temperature 28 ° C;
  • the fermentation took place up to a biomass density of 80 g / l before the oil production phase was initiated by limiting phosphate and nitrogen.
  • the sulfate concentration is due to the high sulfate content in the starting medium until the end of the fermentation, that is also until the end of Oil production phase, always above the saturation limit of the cells, which is around 5 g per kg of dry biomass.
  • biomass obtained is referred to below as “biomass 1” (12 g / kg sodium sulfate in the starting medium) or “biomass 2” (16 g / kg sodium sulfate in the starting medium).
  • Example 2 Production of the biomass by fermentation of Aurantiochytrium limacinum SR21 in a medium with a low sulfate content and subsequent drying of the biomass
  • the cells were cultivated for approx. 70 h in a feed process using a steel fermenter with a fermenter volume of 2 liters with a total starting mass of 712 g and a total final mass of approx. 1.5 kg.
  • a glucose solution (570 g / kg glucose) was metered in during the process (“fed-batch process”)
  • composition of the starting medium was as follows:
  • the composition of the trace element solution was as follows: 35 g / kg hydrochloric acid (37%); 1.86 g / kg manganese chloride (tetrahydrate); 1.82 g / kg zinc sulfate (heptahydrate); 0.818 g / kg sodium EDTA; 0.29 g / kg boric acid; 0.24 g / kg sodium molybdate (dihydrate); 4.58 g / kg calcium chloride (dihydrate); 17.33 g / kg iron sulfate (heptahydrate); 0.15 g / kg copper chloride (dihydrate).
  • the cultivation was carried out under the following conditions: cultivation temperature 28 ° C;
  • the fermentation took place up to a biomass density of 80 g / l before the oil production phase was initiated by limiting phosphate and nitrogen.
  • the sulfate concentration is already at the initiation of the
  • Oil production phase fell below the detection limit of 0.05 g per kg fermentation medium and the sulfate concentration was accordingly below the detection limit during the entire oil production phase. And since no sulfate was added, the sulfate concentration fell to zero in the course of the oil production phase.
  • the biomass obtained is referred to below as “Biomass 3”.
  • Example 3 Production of the biomass by fermentation of Aurantiochytrium limacinum SR21 in a medium with a low sulfate content with simultaneous addition of sulfate during the fermentation and subsequent drying of the biomass
  • the cells were cultivated for approx. 70 h in a feed process using a steel fermenter with a fermenter volume of 2 liters with a total starting mass of 712 g and a total final mass of approx. 1.5 kg.
  • a glucose solution 570 g / kg glucose
  • ammonium sulfate solutions of different concentrations ( 6.8, 13.6 or 20.4 g / kg Ammonium sulfate) metered in at a constant feed rate of 3 g / h (“fed-batch process”).
  • the feed rates of the sulfate solutions were chosen so that the sulfate content in the storage phase remains below the detection limit (0.05 g / l) for sulfate.
  • composition of the starting medium was as follows:
  • the composition of the trace element solution was as follows: 35 g / kg hydrochloric acid (37%); 1.86 g / kg manganese chloride (tetrahydrate); 1.82 g / kg zinc sulfate (heptahydrate); 0.818 g / kg sodium EDTA; 0.29 g / kg boric acid; 0.24 g / kg sodium molybdate (dihydrate); 4.58 g / kg calcium chloride (dihydrate); 17.33 g / kg iron sulfate (heptahydrate); 0.15 g / kg copper chloride (dihydrate).
  • the cultivation was carried out under the following conditions: cultivation temperature 28 ° C;
  • the fermentation took place up to a biomass density of 50 g / l before the oil production phase was initiated by limiting phosphate and nitrogen.
  • the sulfate concentration fell below the detection limit of 0.05 g per kg fermentation medium when the oil production phase was initiated, and the sulfate concentration was accordingly below the detection limit during the entire oil production phase. Due to the continuous metering of sulfate, however, the sulfate concentration in the medium is prevented from falling to zero.
  • biomass 3, 4 or 5 the biomasses with the ammonium sulfate feed “biomass 6, 7 or 8”.
  • Example 4 Processing and comparison of the biomass or process obtained
  • the fermentation broths were heated to 60 ° C for 20 minutes to prevent further cell activity.
  • the biomass was then dried in two stages: first, the fermentation broth was evaporated to a dry matter of about 20% by weight. The concentrated solution was then spray dried
  • Biomasses 1 and 2 are the biomasses obtained by fermentation with a high sulfate content according to Example 1
  • biomass 3 is the biomass obtained by fermentation with a low sulfate content according to Example 2 was while the biomass 4 to 9 by fermentation at low sulfate and
  • biomasses 4 to 9 provided a significantly higher yield of DHA and more and a purer product than the process which, with a low sulfate content and without continuous addition of sulfate ( Biomass 3) or as those processes that were carried out with a high sulfate content (Biomass 1 and 2).
  • the biomasses preferred according to the invention which were obtained by the processes according to Example 3, contained sulfate in an amount of 12 to 16 grams per kg of biomass.

Abstract

Erfindungsgemäßwurde gefunden, dass wenn bei der Kultivierung von PUFAs produzierenden Zellen die eingesetzte Sulfat-Menge so gewählt wird, dass die Sulfat-Konzentration in der letzten Phase der Fermentation stets oberhalb null, jedoch zugleich stets unterhalb der Sättigungsgrenze der Zellen liegt, eine Biomasse erhalten wird, die einen erhöhten Massen-Anteil an polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) im finalen Produkt aufweist, wobei das Verfahren zugleich eine hohe Produkt/Substrat-und Raum/Zeit-Ausbeute aufweist.

Description

Verfahren zur Herstellung einer Biomasse mit erhöhtem Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Biomasse mit erhöhtem Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren sowie eine durch dieses Verfahren erhältliche Biomasse. Verfahren zur Herstellung von polyungesättigte Fettsäuren (PUFAs) enthaltender Biomasse sind im Stand der Technik bereits beschrieben. Häufig werden hierbei Netzschleimpilze eingesetzt, die natürlicherweise polyungesättigte Fettsäuren als Speicherlipide in größerer Menge in der Zelle akkumulieren.
Natürlicherweise wachsen diese Mikroalgen in Meerwasser, so dass anfangs eine Kultivierung der Mikroalgen in Medien mit hohem Chlorid-Gehalt erfolgte. Hohe Chlorid-Gehalte sind jedoch für die Kultivierung in Stahl-Bioreaktoren ungeeignet, da sie die Korrosion des Metalls herbeiführen. Als alternative Fermentationsmedien sind daher solche mit niedrigem Chlorid-Gehalt und stattdessen hohem Sulfat-Gehalt im Stand der Technik beschrieben.
Die erhaltene Biomasse weist hierbei jedoch in der Regel einen begrenzten Gehalt an PUFAs auf, wohl nicht zuletzt, weil aufgrund der hohen Sulfat-Menge der Anteil an ausgebildeter Zellwand im finalen Produkt auf Kosten der Menge an enthaltenen PUFAs relativ hoch ist.
Experimente mit sehr niedrigem Sulfat-Gehalt in der letzten Phase der Fermentation haben gezeigt, dass durch Einstellung der Sulfat-Zugabe in der letzten Phase der Fermentation der relative Anteil an gebildeten PUFAs im finalen Produkt deutlich gesteigert werden kann, gleichzeitig jedoch die Zellen relativ stark destabilisiert werden, so dass es bereits im Verlauf der Fermentation zu einer teilweisen Freisetzung des enthaltenen Öls in das Fermentationsmedium kommen kann. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ausgehend von diesen Kenntnissen ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, bei welchem die erhaltene Biomasse einen erhöhten Massen-Anteil an PUFAs im finalen Produkt aufweist. Gleichzeitig soll bei dem Verfahren vorzugsweise ein nichtkorrosives Fermentationsmedium eingesetzt und eine hohe Produkt- sowie Raum/Zeit-Ausbeute erzielt werden und eine vorzeitige Freisetzung des Öls in das Fermentationsmedium möglichst verhindert werden.
Die erfindungsgemäße Aufgabe konnte gelöst werden durch ein Verfahren, bei welchem der Sulfat-Gehalt im Medium so eingestellt wird, dass in der letzten Phase der Fermentation Sulfat stets im Medium vorhanden ist, die Sulfat-Konzentration jedoch stets unterhalb der
Sättigungskonzentration der Zellen liegt, so dass das vorhandene Sulfat sofort vollständig durch die Zellen assimiliert wird.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer PUFAs enthaltenden Biomasse, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung der Biomasse eine Kultivierung der PUFAs produzierenden Zellen in einem Fermentationsmedium erfolgt, wobei der Sulfat-Gehalt so eingestellt wird, dass in der letzten Phase der Fermentation zwar stets Sulfat im Medium vorhanden ist, die Sulfat-Konzentration im Medium jedoch stets unterhalb der
Sättigungsgrenze der Zellen liegt. Die Sulfat-Sättigungsgrenze bzw. Sulfat-Sättigungskonzentration der Zellen ist erfindungsgemäß definiert als die Menge an Sulfat, die von den Zellen der Biomasse unter den gegebenen
Bedingungen unmittelbar komplett assimiliert werden kann. In einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Zellen der Familie der Thraustochytriaceae verwendet, deren Sulfat-Sättigungsgrenze bei ca. 5g pro kg lipidfreier Biomasse liegt.
Ein bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer PUFAs enthaltenden Biomasse, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung der Biomasse eine Kultivierung von Zellen der Familie der Thraustochytriaceae in einem
Fermentationsmedium erfolgt, wobei der Sulfat-Gehalt so eingestellt wird, dass in der letzten Phase der Fermentation die Sulfat-Konzentration im Medium stets zwischen 0,005 und 5 Gramm Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse, vorzugsweise zwischen 0,01 und 4, besonders bevorzugt zwischen 0,01 und 3, 2 oder 1 Gramm Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse, vor allem zwischen 0,01 und 0,05, Gramm Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse liegt.
Erfindungsgemäße Verfahren umfassen vorzugsweise zwecks Optimierung der Ölproduktion eine Wachstumsphase und eine sich daran anschließende Ölproduktionsphase. In der vorangehenden Wachstumsphase erfolgt zunächst die Anzucht sowie die Erhöhung der Biomasse der in dem Fermentationsmedium enthaltenen PUFAs produzierenden Zellen - bei weitestgehender
Unterdrückung der Ölproduktion -, so dass eine möglichst hohe Biomassendichte im Medium eingestellt wird, während in der sich anschließenden Ölproduktionsphase, die in der Regel durch spezielle Maßnahmen eingeleitet wird, überwiegend die Ölproduktion durch die Zellen der Biomasse erfolgt, wobei das Wachstum der Zellen zumindest weitestgehend angehalten ist. D.h., dass in der Ölproduktionsphase die Erhöhung der Biomasse zumindest primär nicht auf eine Vermehrung der Zellzahl, sondern auf die Akkumulation von Lipiden im Zellinnern der vorhandenen Zellen zurückzuführen ist. - Das Wachstum der Zellen in der Wachstumsphase wird durch Bereitstellung optimaler Wachstumsbedingungen ermöglicht, während der Übergang in die Ölproduktionsphase durch Limitierung einzelner oder mehrerer limitierender Faktoren,
insbesondere Nährstoffkomponenten wie beispielsweise Stickstoffquellen, eingeleitet werden kann. Mit„letzter Phase der Fermentation“ ist erfindungsgemäß vorzugsweise die Ölproduktionsphase gemeint.
Erfindungsgemäße Verfahren zeichnen sich somit vorzugsweise dadurch aus, dass zumindest während 50 % der Zeit der Ölproduktionsphase, vorzugsweise mindestens während 75 oder 85 % der Zeit der Ölproduktionsphase, besonders bevorzugt mindestens während 90 oder 95 % der Zeit der Ölproduktionsphase, vor allem während der kompletten Ölproduktionsphase, Sulfat zwar im Medium vorhanden ist, die Sulfat-Konzentration aber stets unterhalb der Sättigungsgrenze der im Medium enthaltenen Zellen liegt.
Bevorzugte Verfahren zeichnen sich hierbei dadurch aus, dass zumindest während 50 % der Restzeit der Ölproduktionsphase, vorzugsweise mindestens während 75 oder 85 % der Restzeit der Ölproduktionsphase, besonders bevorzugt mindestens während 90 oder 95 % der Restzeit der Ölproduktionsphase, vor allem während der kompletten Ölproduktionsphase, Sulfat zwar im Medium vorhanden ist, die Sulfat-Konzentration jedoch stets unterhalb der Sättigungsgrenze der im Medium enthaltenen Zellen liegt, d.h. dass gegebenenfalls während der entsprechend komplementären Anfangszeit der Ölproduktionsphase die Sulfat-Konzentration auch noch oberhalb der Sättigungsgrenze der Zellen liegen kann.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist entsprechend auch ein Verfahren zur Herstellung einer PUFAs enthaltenden Biomasse, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung der Biomasse eine Kultivierung von Zellen der Familie der Thraustochytriaceae in einem Fermentationsmedium erfolgt, wobei der Sulfat-Gehalt so eingestellt wird, dass zumindest während 50 % der Zeit der Ölproduktionsphase, vorzugsweise mindestens während 75 oder 85 % der Zeit der
Ölproduktionsphase, besonders bevorzugt mindestens während 90 oder 95 % der Zeit der Ölproduktionsphase, vor allem während der kompletten Ölproduktionsphase, die Sulfat- Konzentration im Medium stets zwischen 0,005 und 5 Gramm Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse, vorzugsweise zwischen 0,01 und 4, besonders bevorzugt zwischen 0,01 und 3, 2 oder 1 Gramm Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse, vor allem zwischen 0,01 und 0,05, Gramm Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse liegt.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist entsprechend auch ein Verfahren zur Herstellung einer PUFAs enthaltenden Biomasse, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung der Biomasse eine Kultivierung von Zellen der Familie der Thraustochytriaceae in einem
Fermentationsmedium erfolgt, wobei der Sulfat-Gehalt so eingestellt wird, dass zumindest während 50 % der Restzeit der Ölproduktionsphase, vorzugsweise mindestens während 75 oder 85 % der Restzeit der Ölproduktionsphase, besonders bevorzugt mindestens während 90 oder 95 % der Restzeit der Ölproduktionsphase, vor allem während der kompletten Ölproduktionsphase, die Sulfat-Konzentration im Medium stets zwischen 0,005 und 5 Gramm Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse, vorzugsweise zwischen 0,01 und 4, besonders bevorzugt zwischen 0,01 und 3, 2 oder 1 Gramm Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse, vor allem zwischen 0,01 und 0,05, Gramm Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse liegt.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Biomassen, vorzugsweise solche, die Zellen der Familie der Thraustochytriaceae enthalten, die durch erfindungsgemäße Verfahren erhältlich sind.
In erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsformen werden Biomassen mit einem Sulfat-Gehalt von 12 bis 20 g Sulfat pro kg Biomasse, vorzugsweise 12 bis 16 g Sulfat pro kg Biomasse, erhalten.
Weiterer Gegentand der vorliegenden Erfindung ist daher insbesondere auch eine PUFAs enthaltende Biomasse, die einen Sulfat-Gehalt von 12 bis 20 g Sulfat pro kg Biomasse, vorzugsweise 12 bis 18 g Sulfat pro kg Biomasse, insbesondere 12 bis 16 g Sulfat pro kg
Biomasse, aufweist, wobei die Biomasse vorzugsweise Zellen der Familie der Thraustochytriaceae umfasst.
Unter„Sulfat-Gehalt“ ist erfindungsgemäß in Bezug auf die Biomasse der Gesamtgehalt an Sulfat, also der Gehalt an freiem und gebundenem, insbesondere organisch gebundenem, Sulfat zu verstehen. Es ist davon auszugehen, dass der Großteil des in der Biomasse enthaltenen Sulfats als Bestandteil von Exopolysacchariden vorliegt, die an der Ausbildung der Zellwand der
Mikroorganismen beteiligt sind.
Die Bestimmung des Sulfat-Gehalts erfolgt erfindungsgemäß vorzugsweise durch Ermittlung des Schwefel-Gehalts der erhaltenen Biomasse, da der Großteil des in der Biomasse enthaltenen Schwefels auf das enthaltene Sulfat zurückzuführen ist. Schwefel, der auf andere Quellen zurückzuführen ist, ist aufgrund der Menge des enthaltenen Sulfats zu vernachlässigen. Aus der Menge des ermittelten Schwefels kann somit ohne weiteres die Menge an enthaltenem Sulfat ermittelt werden.
Der Schwefel-Gehalt der Biomasse wird hierbei vorzugsweise durch Elementaranalyse gemäß DIN EN ISO 1 1885 bestimmt. Für die Analyse des Schwefelgehalts der Biomasse werden
entsprechende Aliquote der Probe vor der Analyse vorzugsweise mit Salpetersäure und
Wasserstoffperoxid bei 240°C unter Druck aufgeschlossen, um die freie Zugänglichkeit des enthaltenen Schwefels sicherzustellen.
Unter„Biomasse“,„Biotrockenmasse“,„Biomasse PUFAs produzierender Zellen“ oder
„Biotrockenmasse PUFAs produzierender Zellen“ ist erfindungsgemäß generell die bestimmbare Biotrockenmasse zu verstehen.
Die Menge an in einer Probe enthaltenen Biotrockenmasse wird hierbei vorzugsweise wie folgt bestimmt: Eine homogene Probe wird entnommen und zwecks Abtrennung der flüssigen
Bestandteile zentrifugiert. Anschließend wird die durch Zentrifugation erhaltene Biomasse mit Wasser gewaschen, um Salze und ggf. weitere lösliche Bestandteile in Lösung zu bringen, und danach erneut zentrifugiert. - Die so erhaltene Biotrockenmasse wird abschließend im
Trockenschrank über Nacht getrocknet. Der prozentuale Anteil an in der Probe enthaltener Biotrockenmasse ergibt sich hierbei aus dem Quotienten zwischen Masse an bestimmter
Biotrockenmasse nach Trocknung und Ausgangsmasse der untersuchten Probe. Die somit ermittelte Biotrockenmasse umfasst auch noch das durch die Biomasse gebildete Öl.
Unter„lipidfreier Biomasse“,„lipidfreier Biotrockenmasse“,„lipidfreier Biomasse PUFAs produzierender Zellen“ oder„lipidfreie Biotrockenmasse PUFAs produzierender Zellen“ ist erfindungsgemäß entsprechend die wie zuvor ermittelte Biotrockenmasse abzüglich des in der Biotrockenmasse enthaltenen Fettanteils zu verstehen.
Der in der Biotrockenmasse enthaltene Fettanteil wird vorzugsweise bestimmt durch Aufnahme der Biotrockenmasse in einer Methanol/Chloroform-Lösung und anschließende Ultraschall-Behandlung der so erhaltenen Probe. - Die so erhaltene Probe wird anschließend mit Kaliumhydroxid verseift und mittels Salzsäure sauer gestellt. Anschließend werden die freien Fettsäuren mittels BF3 (30% Bortrifluorid in Methanol) methyliert und durch Verteilungschromatographie mit einem
Temperaturgradienten aufgetrennt. Die Detektion erfolgt anschließend mittels Flammenionisations- Detektion (FID). Der Gehalt an Biomasse wird nun erfindungsgemäß bestimmt durch Subtraktion des so bestimmten Gehalts an Fett von dem zuvor bestimmten Gehalt an Biotrockenmasse.
Der Begriff der lipidfreien Biotrockenmasse wir erfindungsgemäß verwendet, weil die Sulfat- Sättigungsgrenze der Zellen unabhängig vom Lipid-Gehalt der Zellen ist, der Lipid-Gehalt der Zellen jedoch im Verlauf der Ölproduktionsphase erheblich zunimmt, so dass zur Ermittlung der hinzuzugebenen Menge an Sulfat nicht auf den Gesamtgehalt an Biotrockenmasse, sondern auf den Gesamtgehalt an lipidfreier Biotrockenmasse abzustellen ist. Da nach Einleitung der
Ölproduktionsphase aufgrund der weitestgehenden Unterdrückung der Zellvermehrung der Gehalt an lipidfreier Biotrockenmasse praktisch stabil bleibt, muss der Gehalt an lipidfreier
Biotrockenmasse nach Einleitung der Ölproduktionsphase in der Regel nicht nochmals bestimmt werden.
Die Einstellung der gewünschten Sulfat-Konzentration im Medium kann erfindungsgemäß auf unterschiedliche Weise erfolgen.
Erfindungsgemäß ist wesentlich, dass stets eine Zudosierung von Sulfat in der letzten Phase der Fermentation, vorzugsweise am Ende der Ölproduktionsphase erfolgen muss (sog. Fed-Batch- Verfahren). Der Beginn der Zudosierung von Sulfat bestimmt sich danach, ob und wie viel Sulfat zu Beginn der Fermentation im Satzmedium enthalten ist. Die Menge an Sulfat im Satzmedium kann prinzipiell beliebig gewählt werden, so dass das Erfordernis der Zudosierung von Sulfat sich zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Verlauf der Fermentation ergeben kann.
Aus dem Erfordernis, dass Sulfat in der letzten Phase der Fermentation im Fermentationsmedium enthalten sein muss, sich die Sulfat-Konzentration hier jedoch unterhalb der Sättigungsgrenze der Zellen befinden muss, ergibt sich für die Sulfat-Konzentration im Satz-Medium eine Obergrenze, die entsprechend eingehalten werden muss und einfach zu berechnen ist. - In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Sulfatmenge im Satzmedium so gewählt, dass sich die Sulfat- Konzentration zumindest während der ersten 30 % der Zeit der Wachstumsphase der Zellen, vorzugsweise zumindest während der ersten 40, 50 oder 60 %, insbesondere während der ersten 70, 80 oder 90 %, der Zeit der Wachstumsphase der Zellen, oberhalb der Sättigungskonzentration der Zellen befindet. - Die Sulfat-Konzentration beträgt hierbei während der angegebenen Phase vorzugsweise mindestens 5 g Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse.
Die Zudosierung von Sulfat muss spätestens dann beginnen, bevor die Sulfat-Konzentration auf null sinkt. - Dies wird dadurch gewährleistet, dass die Sulfat-Konzentration im Medium
kontinuierlich bestimmt wird. Vorzugsweise erfolgt eine Zudosierung von Sulfat erst dann, wenn die Sulfat-Konzentration im Medium auf unter 2 g Sulfat pro kg Biomasse, insbesondere auf unter 1 g Sulfat pro kg Biomasse, besondere bevorzugt erst dann, wenn die Sulfat-Konzentration im Medium auf unter 0,5 g Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse gefallen ist, was erfindungsgemäß zwecks Optimierung der Ölproduktion erst kurz vor dem Übergang in die Ölproduktionsphase erfolgt. In einer erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausführungsform fällt daher die Sulfat- Konzentration im Medium erst kurz vor Beginn der Ölproduktionsphase, vorzugsweise bis zu 3 Stunden, insbesondere bis zu 2 Stunden, vor allem bis zu einer Stunde, vor Beginn der
Ölproduktionsphase auf unter 2 g, insbesondere auf unter 1 g, besonders bevorzugt unter 0,5 g Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse.
Anstatt eine größere Menge an Sulfat im Satzmedium vorzulegen, kann alternativ auch bereits während der Wachstumsphase der Zellen eine Zudosierung von Sulfat erfolgen. Die Zudosierung von Sulfat in der Wachstumsphase erfolgt hierbei entsprechend so, dass die Menge an Sulfat zumindest während der ersten Phase der Wachstumsphase stets oberhalb der Sättigungskonzentration der Zellen, vorzugsweise bei mindestens 5 g Sulfat pro kg Biomasse, liegt. In der anschließenden Ölproduktionsphase wird die Sulfat-Zudosierung entsprechend gedrosselt, so dass die Sulfat-Konzentration in der Ölproduktionsphase bzw. kurz vor Eintritt in die Ölproduktionsphase unter die Sättigungskonzentration der Zellen, vorzugsweise unter 5 g Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse, besonders bevorzugt unter 3, 2 oder 1 g Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse, vor allem unter 0,5 g Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse fällt.
In einer weiterer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird Sulfat in einer Menge vorgegeben, so dass die Sulfat-Konzentration während des gesamten Fermentationsverfahrens oder zumindest während der überwiegenden Zeit des gesamten Fermentationsverfahrens stets unter der Sättigungskonzentration der Zellen, vorzugsweise unter 5 g Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse, insbesondere unter 4, 3, 2 oder 1 g Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse liegt.
Da es für das Verfahren wesentlich ist, dass die Sulfatkonzentration nicht auf null fällt, kann insbesondere dann, wenn sich im Verlauf der Fermentation herausstellt, dass die Menge an produzierter Biomasse den ursprünglich kalkulierten Wert übertrifft, durch entsprechende
Anpassung der Menge an zudosiertem Sulfat sichergestellt werden, dass ein Abfallen der Sulfat- Konzentration auf null vermieden wird.
In einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform wird Sulfat während der überwiegenden Zeit der Ölproduktionsphase, vorzugsweise mindestens während 50, 60 oder 70 % der Zeit der Ölproduktionsphase, besonders bevorzugt mindestens während der letzten 50, 60 oder 70 % der Zeit der Ölproduktionsphase, in geringer Menge, vorzugsweise in einer Rate von 5 bis 100 mg, vorzugsweise 10 bis 50 mg, pro kg Fermentationsmedium, dem Fermentationsmedium kontinuierlich zudosiert.
Als Sulfat-Salz wird erfindungsgemäß vorzugsweise Natriumsulfat, Ammoniumsulfat oder Magnesiumsulfat sowie Mischungen davon eingesetzt. Die Zuführung des Sulfats kann erfindungsgemäß alternativ oder zusätzlich auch durch den Einsatz von technischen
Rohmaterialien erfolgen, die mit Sulfat verunreinigt oder supplementiert sind.
Es hat sich erfindungsgemäß weiterhin überraschenderweise herausgestellt, dass die niedrige Sulfat-Konzentration auch mit niedrigen Chlorid-Konzentrationen kombiniert werden kann, so dass die Biomasse mit einem nicht-korrosiven Fermentationsmedium hergestellt werden kann.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zeichnet sich daher vorzugsweise weiterhin dadurch aus, dass das erfindungsgemäß eingesetzte Fermentationsmedium während der gesamten Fermentation eine Chlorid-Konzentration von weniger als 1 g/l, insbesondere weniger als 500 mg/l, bevorzugt weniger als 250 mg/l, aufweist.
Erfindungsgemäße Biomassen weisen vorzugsweise einen Chlorid-Gehalt von maximal 2 Gramm pro kg Biomasse, insbesondere 0,5 bis 1 ,8 g, besonders bevorzugt 0,5 bis 1 ,5 g pro kg Biomasse, auf.
Mit "Chlorid-Gehalt" ist erfindungsgemäß die Menge an bestimmbarem Chlor gemeint. Die Menge an vorhandenem Chlor kann beispielsweise durch Elementaranylse gemäß DIN EN ISO 11885 bestimmt werden. Chlor liegt in der Biomasse in Form von Salzen vor, die“Chloride” genannt werden. Wenn in der vorliegenden Anmeldung von„Chloriden“ oder„Chlorid-Ionen“ die Rede ist, so ist stets nur die Menge an Chlorid bzw. nachweisbarem Chlor gemeint, nicht die Menge an Chlorid-Salzen, welche neben dem Chlorid-Ion stets auch kationische Gegenionen umfassen.
Bei den PUFAs produzierenden Zellen handelt es sich vorzugsweise um Zellen, die bereits natürlicherweise PUFAs produzieren, es kann sich jedoch auch um Zellen handeln, die durch entsprechende gentechnische Verfahren dazu in die Lage versetzt wurden, PUFAs zu produzieren. Die Produktion kann hierbei autotroph, mixotroph oder heterotroph erfolgen.
Die erfindungsgemäße Biomasse umfasst entsprechend solche Zellen und besteht vorzugsweise im Wesentlichen aus solchen Zellen.
Bevorzugt handelt es sich bei den Zellen um solche, die PUFAs heterotroph produzieren. Es handelt sich bei den Zellen erfindungsgemäß vorzugsweise um Algen, Pilze, insbesondere Hefen, oder Protisten. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den Zellen um Mikroorganismen, insbesondere um mikrobielle Algen oder Pilze.
Als Zellen von öl-produzierenden Hefen kommen insbesondere Stämme von Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon und Lipomyces in Betracht.
Bei den Zellen handelt es sich vorzugsweise um solche des Taxons Labyrinthulomycetes
(Labyrinthulea, Netzschleimpilze, Schleimnetze), insbesondere solche der Familie der
Thraustochytriaceae. Zu der Familie der Thraustochytriaceae gehören die Gattungen Althornia, Aplanochytrium, Elnia, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium und Ulkenia. Besonders bevorzugt handelt es sich um Zellen der Gattungen Thraustochytrium, Schizochytrium, Aurantiochytrium oder Oblongichytrium, vor allem um solche der Gattung Aurantiochytrium. Ein besonders bevorzugter Stamm stellt der Stamm
Aurantiochytrium limacinum SR21 (IFO 32693) dar.
Bei der erfindungsgemäßen Biomasse handelt es sich vorzugsweise um das Produkt eines fermentativen Kultivierungsverfahrens. Die Biomasse kann entsprechend neben den
aufzuschließenden Zellen auch noch Bestandteile des Fermentationsmediums enthalten. Bei diesen Bestandteilen kann es sich insbesondere um Salze, Antischaummittel und nicht umgesetzte Kohlenstoffquelle und/oder Stickstoffquelle handeln. Der Zellgehalt in dieser Biomasse beträgt vorzugsweise mindestens 70 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 75 Gew.-%. Der Zellgehalt in der Biomasse kann gegebenenfalls vor Durchführung des Zellaufschlussverfahrens durch
entsprechende Waschschritte beispielsweise auf mindestens 80 oder mindestens 90 Gew.-% erhöht werden. Die erhaltene Biomasse kann jedoch auch direkt in dem Zellaufschlussverfahren eingesetzt werden.
Die Zellen der Biomasse zeichnen sich vorzugsweise dadurch aus, dass sie einen PUFA-Gehalt von mindestens 20 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 30 Gew.-%, insbesondere mindestens 40 Gew.-%, jeweils bezogen auf die Zelltrockenmasse, aufweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt ein Großteil der Lipide in Form von Triglyceriden vor, wobei vorzugsweise mindestens 50 Gew.-%, insbesondere mindestens 75 Gew.-% und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform mindestens 90 Gew.-% der in der Zelle enthaltenen Lipide in Form von Triglyceriden vorliegen. Vorzugsweise handelt es sich bei mindestens 10 Gew.-%, insbesondere mindestens 20 Gew.-%, besonders bevorzugt 20 bis 60 Gew.-%, insbesondere 20 bis 40 Gew.-%, der in der Zelle enthaltenen Fettsäuren um PUFAs.
Unter polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) werden erfindungsgemäß Fettsäuren verstanden, die mindestens zwei C-C-Doppelbindungen aufweisen. Unter den PUFAs sind erfindungsgemäß hochungesättigte Fettsäuren (HUFAs) bevorzugt. Unter HUFAs werden erfindungsgemäß
Fettsäuren verstanden, die mindestens vier C-C-Doppelbindungen aufweisen.
Die PUFAs können in der Zelle in freier Form oder in gebundener Form vorliegen. Beispiele für das Vorliegen in gebundener Form sind Phospholipide und Ester der PUFAs, insbesondere Monoacyl-, Diacyl- und Triacylglyceride. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt ein Großteil der PUFAs in Form von Triglyceriden vor, wobei vorzugsweise mindestens 50 Gew.-%, insbesondere mindestens 75 Gew.-% und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform mindestens 90 Gew.-% der in der Zelle enthaltenen PUFAs in Form von Triglyceriden vorliegen.
Bevorzugte PUFAs stellen omega-3-Fettsäuren und omega-6-Fettsäuren dar, wobei omega-3- Fettsäuren besonders bevorzugt sind. Bevorzugte omega-3-Fettsäuren stellen hierbei die
Eicosapentaensäure (EPA, 20:5w-3), insbesondere die (5Z,8Z,1 1 Z, 14Z,17Z)-Eicosa-5,8, 1 1 , 14, 17- pentaensäure, und die Docosahexaensäure (DHA, 22:6w-3), insbesondere die
(4Z,7Z,10Z, 13Z, 16Z, 19Z)-Docosa-4,7, 10, 13, 16, 19-hexaensäure, dar, wobei die
Docosahexaensäure besonders bevorzugt ist.
Verfahren zur Herstellung der PUFAs enthaltenden Zellen insbesondere der Ordnung
Thraustochytriales sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben (siehe z.B. WO91/07498, WO94/08467, WO97/37032, W097/36996, W001/54510). Die Herstellung erfolgt in der Regel dadurch, dass Zellen in Anwesenheit einer Kohlenstoffquelle und einer Stickstoffquelle in einem Fermenter kultiviert werden. Es können hierbei Biomasse-Dichten von mehr als 100 Gramm pro Liter und Produktionsraten von mehr als 0,5 Gramm Lipid pro Liter pro Stunde erreicht werden.
Das Verfahren wird vorzugsweise als sogenanntes Fed-Batch-Verfahren durchgeführt, d.h. dass die Kohlenstoffquelle und gegebenenfalls auch die Stickstoff- und Phosphatquellen inkrementeil während der Fermentation zugeführt werden. Die Lipid-Produktion kann nach Erreichen der gewünschten Biomasse durch unterschiedliche Maßnahmen induziert werden, beispielsweise durch Limitierung der Stickstoffquelle, der Phopsphatquelle oder des Sauerstoffgehalts oder Kombinationen davon.
Als Kohlenstoffquelle kommen sowohl alkoholische als auch nicht-alkoholische Kohlenstoffquellen in Betracht. Beispiele für alkoholische Kohlenstoffquellen sind Methanol, Ethanol und Isopropanol. Beispiele für nicht-alkoholische Kohlenstoffquellen sind Fructose, Glucose, Saccharose, Molassen, Stärke und Maissirup, sowie organische Säuren wie Essigsäure, Propionsäure sowie mittel- und langkettige Fettsäuren sowie deren Salze. Erfindungsgemäß bevorzugte Verfahren zeichnen sich dadurch aus, dass mindestens eine Kohlenstoffquelle kontinuierlich während des kompletten Fermentationsverfahrens dem Medium zudosiert wird.
Als Stickstoffquelle kommen sowohl anorganische als auch organische Stickstoffquellen in Betracht. Beispiele für anorganische Stickstoffquellen sind Nitrate und Ammoniumsalze, insbesondere Ammoniumsulfat und Ammoniumhydroxid. Beispiele für organische Stickstoffquellen sind Aminosäuren, insbesondere Glutamat, und Harnstoff.
Die Einleitung der Ölproduktionsphase erfolgt erfindungsgemäße vorzugsweise, wie in WO 01/54510 beschrieben, durch Limitierung mindestens einer limitierenden Nährstoffkomponente, vorzugsweise durch Limitierung mindestens einer Stickstoffquelle.
Der Chlorid-Gehalt des Fermentationsmediums liegt vorzugsweise während der gesamten Fermentation, zumindest aber während der Ölproduktionsphase, vorzugsweise stets unter 2 g/l, insbesondere unter 1 g/l, bevorzugt unter 500 mg/l, besonders bevorzugt unter 250 mg/l.
Neben Sulfaten und gegebenenfalls eingesetzten Chloriden können bei der Fermentation gegebenenfalls auch weitere Salze, insbesondere ausgewählt aus Natriumcarbonat,
Natriumhydrogencarbonat, Sodaasche oder anorganischen Phosphorverbindungen, eingesetzt werden. Sofern weitere Salze eingesetzt werden, werden diese vorzugsweise jeweils in einer Menge von weniger als 12 g/l, insbesondere weniger als 8 g/l, besonders bevorzugt weniger als 5 g/l eingesetzt. Der Gesamtsalzgehalt im Fermentationsmedium beträgt zu Beginn der
Hauptfermentation vorzugsweise 5 bis 30 g/l, insbesondere 10 bis 20 g/l.
Zusätzlich können auch organische Phosphorverbindungen und/oder bekannte
wachstumsstimulierende Stoffe, wie etwa Hefeextrakt oder Maisquellwasser, hinzugegeben werden, um die Fermentation positiv zu beeinflussen.
Die Fermentation der Zellen erfolgt vorzugsweise bei einem pH-Wert von 3 bis 11 , insbesondere 4 bis 10, sowie vorzugsweise bei einer Temperatur von mindestens 20°C, insbesondere 20 bis 40°C, besonders bevorzugt mindestens 30 °C. Ein typisches Fermentationsverfahren dauert bis zu etwa 100 Stunden.
Die Zellen werden erfindungsgemäß vorzugsweise bis zu einer Biomassendichte von mindestens 50, 60 oder 70 g/l, insbesondere 50 bis 250 g/l oder 60 bis 220 g/l, bevorzugt mindestens 80 oder 90 g/l, insbesondere 80 bis 200 g/l, besonders bevorzugt mindestens 100 g/l, insbesondere 100 bis 180 g/l, fermentiert. Die Angaben beziehen sich hierbei auf den Gehalt an Biotrockenmasse in Bezug auf das Gesamtvolumen der Fermentationsbrühe nach Beendigung der Fermentation. Der Gehalt an Biotrockenmasse wird bestimmt durch Abfiltrieren der Biomasse aus der
Fermentationsbrühe, anschließendes Waschen mit Wasser, danach vollständige Trocknung - beispielsweise in der Mikrowelle - und schließlich Feststellung des Trockengewichts.
In einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform fällt die Sulfat-Konzentration kurz vor Beginn der Ölproduktionsphase, vorzugsweise nachdem eine Biomassendichte von mindestens 50 g, besonders bevorzugt mindestens 80, 100, 120 oder 140 g pro Liter Fermentationsmedium erreicht wurde, unter 5 g Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse, vorzugsweise unter 4, 3, 2 oder 1 g Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse, insbesondere unter 0,5, 0,1 oder 0,05 g Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse, und verbleibt vorzugsweise auch für den Rest der Fermentation unterhalb dieser Konzentration.
Vorzugsweise erfolgt nach der Ernte der Zellen oder gegebenenfalls auch schon kurz vor der Ernte der Zellen eine Pasteurisierung der Zellen, um die Zellen abzutöten und Enzyme, die den Abbau der Lipide befördern könnten, zu inaktivieren. Nach Beendigung der Fermentation kann die erhaltene Fermentationsbrühe unmittelbar oder gegebenenfalls nach vorheriger Aufkonzentrierung einem Ölisolationsverfahren unterzogen werden, um das enthaltene Öl zu gewinnen. Derartige Ölisolationsverfahren werden beispielsweise in WO 01/53512 und WO 201 1/153246 beschrieben.
Alternativ kann nach Beendigung der Fermentation auch die Ernte der PUFAs enthaltenden Biomasse erfolgen. Hierzu erfolgt vorzugsweise auch zunächst eine Aufkonzentrierung der Fermentationsbrühe.
Die Aufkonzentrierung der Fermentationsbrühe erfolgt erfindungsgemäß vorzugsweise durch Zentrifugation, Filtration, Dekantieren und/oder Lösungsmittelverdampfung, um zunächst einen Großteil des Fermentationsmediums von der Biomasse abzutrennen. Die
Lösungsmittelverdampfung erfolgt vorzugsweise unter Einsatz eines Trommeltrockners, eines Tunneltrockners, durch Sprühtrocknung oder Vakuumverdampfung. Die
Lösungsmittelverdampfung kann insbesondere auch unter Einsatz eines Rotationsverdampfers, eines Dünnschichtverdampfers oder eines Fallfilmverdampfers erfolgen. Alternativ zur
Lösungsmittelverdampfung kommt beispielsweise auch die Umkehrosmose zur Einengung der Fermentationsbrühe in Betracht.
Um die Biomasse zu erhalten, wird die so erhaltene konzentrierte Fermentationsbrühe vorzugswiese weiter getrocknet, vorzugsweise durch Fließbettgranulation. Vorzugsweise wird durch das anschließende Trocknen der Feuchtigkeitsgehalt der Biomasse auf unter 15 Gew.-%, insbesondere auf unter 10 Gew.-%, besonders bevorzugt auf unter 5 Gew.-%, reduziert.
Die erfindungsgemäße Trocknung der Biomasse erfolgt in einer erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausführungsform in einem Wirbelschichtgranulationsverfahren oder einem
Düsensprühtrocknungsverfahren, wie beispielsweise in WO 2015/052048 beschrieben.
Der Biomasse kann während der Trocknung gegebenenfalls Kieselsäure als Antibackmittel zugesetzt werden, um sie in einen besser handhabbaren Zustand zu überführen. Die Biomasse enthaltende Fermentationsbrühe sowie die Kieselsäure werden hierzu vorzugsweise in die jeweilige Trocknungszone eingesprüht. Alternativ wird die Biomasse vorzugsweise erst nach der Trocknung mit der Kieselsäure vermischt. Es wird diesbezüglich insbesondere auch auf die Patentanmeldung WO 2015/052048 verwiesen.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist eine erfindungsgemäß einzusetzende Biomasse nach der Trocknung eine Konzentration an Kieselsäure, insbesondere hydrophiler oder hydrophober Kieselsäure, von 0,2 bis 10 Gew.-%, insbesondere 0,5 bis 5 Gew.-%, vor allem 0,5 bis 2 Gew.-%, auf.
Durch die Trocknung wird vorzugweise ein rieselfähiges, feinteiliges oder grobkörniges Produkt, vorzugsweise Granulat, erhalten. Gegebenenfalls kann aus dem erhaltenen Granulat durch Sieben oder Staubabtrennung ein Produkt mit der gewünschten Korngröße erhalten werden.
Sofern ein rieselfähiges feinteiliges Pulver erhalten wurde, kann dieses gegebenenfalls durch geeignete Kompaktier- oder Granulierverfahren in ein grobkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überführt werden. Bei dieser anschließenden Granulation oder Kompaktierung können gegebenenfalls übliche organische oder anorganische Hilfsstoffe beziehungsweise Träger wie Stärke, Gelatine,
Cellulosederivate oder ähnliche Stoffe, die üblicherweise in der Lebensmittel- oder
Futterverarbeitung als Binde-, Gelier- oder Verdickungsmittel Verwendung finden, eingesetzt werden.
Unter„rieselfähig“ ist erfindungsgemäß ein Pulver zu verstehen, das aus einer Serie von
Glasauslaufgefäßen mit verschieden großen Auslassöffnungen mindestens aus dem Gefäß mit der Öffnung 5 Millimeter ungehindert auslaufen kann (Klein: Seifen, Öle, Fette, Wachse 94, 12 (1968)). Unter„feinteilig“ ist erfindungsgemäß ein Pulver mit einem überwiegenden Anteil (> 50 %) einer Korngröße von 20 bis 100 Mikrometer Durchmesser zu verstehen.
Unter„grobkörnig“ ist erfindungsgemäß ein Pulver mit einem überwiegenden Anteil (>50 %) einer Korngröße von 100 bis 2500 Mikrometer Durchmesser zu verstehen.
Unter„staubfrei“ ist erfindungsgemäß ein Pulver zu verstehen, das lediglich geringe Anteile (< 10 %, vorzugsweise < 5 %) an Korngrößen unter 100 Mikrometer enthält.
Die Bestimmung der Korn- bzw. Teilchengrößen erfolgt erfindungsgemäß vorzugsweise durch Methoden der Laserbeugungsspektrometrie. Die anzuwendenden Methoden sind im Lehrbuch „Teilchengrößenmessung in der Laborpraxis“ von R.H. Müller und R. Schuhmann,
Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) sowie im Lehrbuch„Introduction to Particle Technology“ von M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons (1998) beschrieben. Sofern unterschiedliche Methoden anwendbar sind, wird bevorzugt die zuerst genannte anwendbare Methode aus dem Lehrbuch von R.H. Müller und R. Schuhmann zur Teilchengrößenmessung angewendet.
Die durch erfindungsgemäße Trocknungsverfahren erhaltenen Produkte besitzen vorzugsweise einen Anteil von mindestens 80 Gew.-%, insbesondere mindestens 90 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 95 Gew.-%, an Partikeln mit einer Korngröße von 100 bis 3500
Mikrometern, vorzugsweise 100 bis 3000 Mikrometern, vor allem 100 bis 2500 Mikrometern.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Produkte eines Wirbelschichtgranulationsverfahrens besitzen hierbei vorzugsweise einen Anteil von mindestens 80 Gew.-%, insbesondere mindestens 90 Gew.- %, besonders bevorzugt mindestens 95 Gew.-%, an Partikeln mit einer Korngröße von 200 bis 3500 Mikrometern, vorzugsweise 300 bis 3000 Mikrometern, vor allem 500 bis 2500 Mikrometern. Die erfindungsgemäß erhaltenen Produkte eines Sprühtrocknungsverfahrens besitzen hingegen vorzugsweise einen Anteil von mindestens 80 Gew.-%, insbesondere mindestens 90 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 95 Gew.-%, an Partikeln mit einer Korngröße von 100 bis 500 Mikrometern, vorzugsweise 100 bis 400 Mikrometern, vor allem 100 bis 300 Mikrometern.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Produkte eines Sprühtrocknungsverfahrens und anschließenden Granulationsverfahrens besitzen vorzugsweise einen Anteil von mindestens 80 Gew.-%, insbesondere mindestens 90 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 95 Gew.-%, an Partikeln mit einer Korngröße von 100 bis 1000 Mikrometern.
Der Anteil an Staub, d.h. Teilchen mit einer Korngröße von kleiner 100 Mikrometern, liegt vorzugsweise bei maximal 10 Gew.-%, insbesondere maximal 8 Gew.-%, besonders bevorzugt maximal 5 Gew.-%, vor allem maximal 3 Gew.-%. Das Schüttgewicht der erfindungsgemäßen Produkte liegt vorzugsweise bei 400 bis 800 kg/m3, besonders bevorzugt bei 450 bis 700 kg/m3.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Futtermittel, das eine erfindungsgemäße Biomasse sowie weitere Futtermittelinhaltsstoffe umfasst.
Die weiteren Futtermittelinhaltsstoffe sind hierbei vorzugsweise ausgewählt aus proteinhaltigen, kohlenhydrathaltigen, nukleinsäurehaltigen und lipidlöslichen Komponenten sowie gegebenenfalls weiteren fetthaltigen Komponenten und weiterhin aus anderen Zusatzstoffen wie Mineralien, Vitaminen, Pigmente und Aminosäuren. Daneben können neben Nährsubstanzen auch strukturgebende Substanzen enthalten sein, um etwa die Textur oder das Erscheinungsbild des Futtermittels zu verbessern. Weiterhin können beispielsweise auch Bindemittel eingesetzt werden, um die Konsistenz des Futtermittels zu beeinflussen. Eine bevorzugt eingesetzte Komponente, die sowohl eine Nährsubstanz als auch eine strukturgebende Substanz darstellt, ist Stärke.
Ein erfindungsgemäßes Futtermittel bzw. eine zur Herstellung eines erfindungsgemäßen
Futtermittels verwendete Zusammensetzung zeichnet sich erfindungsgemäß vorzugsweise dadurch aus, dass es eine erfindungsgemäße Biomasse in einer Menge von 1 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 20 Gew.-%, insbesondere 3 bis 15 Gew.-%, vor allem 4 bis 12 Gew.-%, enthält. Dieses Futtermittel bzw. die zur Herstellung des Futtermittels verwendete Zusammensetzung weist vorzugsweise weiterhin mindestens eine, vorzugsweise alle, der folgenden Eigenschaften auf: a) einen Gesamt-Protein-Gehalt von 33 bis 67 Gew.-%, vorzugsweise 39 bis 61 Gew.-%, insbesondere 44 bis 55 Gew.-%;
b) einen Gesamt-Fettghalt von 5 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise 8 bis 22 Gew.-%,
insbesondere 10 bis 20 Gew.-%, vor allem 12 bis 18 Gew.-%;
c) einen Gesamt-Stärkegehalt von maximal 25 Gew.-%, insbesondere maximal 20 Gew.-%, vorzugsweise 6 bis 17 Gew.-%, besonders bevorzugt 8 bis 14 Gew.-%;
d) einen Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) von 2 bis 13 Gew.-%,
vorzugsweise 3 bis 1 1 Gew.-%, insbesondere 4 bis 10 Gew.-%, vor allem 5,5 bis 9 Gew.-%;
e) einen Gehalt an omega-3-Fettsäuren von 1 bis 7 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,5 bis 5,5 Gew.- %, insbesondere 2 bis 5 Gew.-%, vor allem 2,5 bis 4,5 Gew.-%;
f) einen Gehalt an DHA von 0,5 bis 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,8 bis 2,8 Gew.-%, insbesondere 1 bis 2,8 Gew.-%, vor allem 1 ,3 bis 2,4 Gew.-%, insbesondere 1 ,3 bis 2,2 Gew.-%. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Gegenstand ist daher auch ein Futtermittel bzw. eine zur Herstellung des Futtermittels geeignete Zusammensetzung, die über mindestens eine, vorzugsweise alle, der folgenden Eigenschaften verfügt:
a) einen Gesamt-Proteingehalt von 33 bis 67 Gew.-%, vorzugsweise 39 bis 61 Gew.-%, insbesondere 44 bis 55 Gew.-%;
b) einen Gesamt-Fettgehalt von 5 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise 8 bis 22 Gew.-%, insbesondere 10 bis 20 Gew.-%, vor allem 12 bis 18 Gew.-%;
c) einen Gesamt-Stärkegehalt von maximal 25 Gew.-%, insbesondere maximal 20 Gew.-%, vorzugsweise 6 bis 17 Gew.-%, besonders bevorzugt 8 bis 14 Gew.-%; d) einen Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) von 2 bis 13 Gew.-%,
vorzugsweise 3 bis 1 1 Gew.-%, insbesondere 4 bis 10 Gew.-%, vor allem 5,5 bis 9 Gew.-%;
e) einen Gehalt an omega-3-Fettsäuren von 1 bis 7 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,5 bis 5,5 Gew.- %, insbesondere 2 bis 5 Gew.-%, vor allem 2,5 bis 4,5 Gew.-%;
f) einen Gehalt an DHA von 0,5 bis 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,8 bis 2,8 Gew.-%, insbesondere 1 bis 2,8 Gew.-%, vor allem 1 ,3 bis 2,4 Gew.-%, insbesondere 1 ,3 bis 2,2 Gew.-%. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Gegenstand ist daher auch ein Futtermittel bzw. eine zur Herstellung des Futtermittels geeignete Zusammensetzung, die über mindestens eine, vorzugsweise alle, der folgenden Eigenschaften verfügt:
a) einen Gesamt-Proteingehalt von 33 bis 67 Gew.-%, vorzugsweise 39 bis 61 Gew.-%, insbesondere 44 bis 55 Gew.-%,
b) einen Gesamt-Fettgehalt von 5 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise 8 bis 22 Gew.-%, insbesondere 10 bis 20 Gew.-%, vor allem 12 bis 18 Gew.-%;
c) einen Gesamt-Stärkegehalt von maximal 25 Gew.-%, insbesondere maximal 20 Gew.-%, vorzugsweise 6 bis 17 Gew.-%, besonders bevorzugt 8 bis 14 Gew.-%;
d) einen Gehalt an erfindungsgemäßer Biomasse, insbesondere einer erfindungsgemäßen Labyrinthulea-Biomasse, bevorzugt einer erfindungsgemäßen Thraustochytriaceae-Biomasse, von 2 bis 24 Gew.-%, vorzugsweise 4 bis 22 Gew.-%, insbesondere 9 bis 20 Gew.-%, vor allem 11 bis 18 Gew.-%;
e) einen Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) von 2 bis 13 Gew.-%,
vorzugsweise 3 bis 11 Gew.-%, insbesondere 4 bis 10 Gew.-%, vor allem 5,5 bis 9 Gew.-%;
f) einen Gehalt an omega-3-Fettsäuren von 1 bis 7 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,5 bis 5,5 Gew.- %, insbesondere 2 bis 5 Gew.-%, vor allem 2,5 bis 4,5 Gew.-%;
g) einen Gehalt an DHA von 0,5 bis 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,8 bis 2,8 Gew.-%, insbesondere 1 bis 2,8 Gew.-%, vor allem 1 ,3 bis 2,4 Gew.-%, insbesondere 1 ,3 bis 2,2 Gew.-%. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Gegenstand ist daher auch ein Futtermittel bzw. eine zur Herstellung des Futtermittels geeignete Zusammensetzung, die über mindestens eine, vorzugsweise alle, der folgenden Eigenschaften verfügt:
a) einen Gesamt-Protein-Gehalt von 33 bis 67 Gew.-%, vorzugsweise 39 bis 61 Gew.-%, insbesondere 40 bis 50 Gew.-%;
b) einen Gesamt-Fett-Gehalt von 5 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise 8 bis 22 Gew.-%, insbesondere 10 bis 20 Gew.-%, vor allem 12 bis 18 Gew.-%;
c) einen Gesamt-Stärkegehalt von maximal 25 Gew.-%, insbesondere maximal 20 Gew.-%, vorzugsweise 6 bis 17 Gew.-%, besonders bevorzugt 8 bis 14 Gew.-%;
d) einen Gehalt an einer erfindungsgemäßen Aurantiochytrien oder Schizochytrien-Biomasse, bevorzugt einer erfindungsgemäßen Aurantiochytrium limacinum-Biomasse, vor allem einer erfindungsgemäßen Aurantiochytrium limacinum SR21 -Biomasse, von 1 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 20 Gew.-%, insbesondere 3 bis 15 Gew.-%, vor allem 4 bis 12 Gew.-%;
e) einen Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) von 2 bis 13 Gew.-%,
vorzugsweise 3 bis 1 1 Gew.-%, insbesondere 4 bis 10 Gew.-%, vor allem 5,5 bis 9 Gew.-%; f) einen Gehalt an omega-3-Fettsäuren von 1 bis 7 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,5 bis 5,5 Gew.- %, insbesondere 2 bis 5 Gew.-%, vor allem 2,5 bis 4,5 Gew.-%;
g) einen Gehalt an DHA von 0,5 bis 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,8 bis 2,8 Gew.-%, insbesondere 1 bis 2,8 Gew.-%, vor allem 1 ,3 bis 2,4 Gew.-%, insbesondere 1 ,3 bis 2,2 Gew.-%. Durch Extrusion der zuvor genannten Zusammensetzungen lässt sich ein Extrudat erhalten. Diese Extrudate stellen einen bevorzugten Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar. Die Extrusion des Futtermittels erfolgt hierbei vorzugsweise bei einem Energieeintrag von 12 - 28 Wh/kg, insbesondere 14 - 26 Wh/kg, besonders bevorzugt 16 - 24 Wh/kg, vor allem 18 - 22 Wh/kg.
Im Extrusionsverfahren wird hierbei vorzugsweise ein Schnecken- oder Doppelschneckenextruder eingesetzt. Das Extrusionsverfahren wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 80 - 220° C, insbesondere 80 - 130 °C, vor allem 95 - 1 10°C, einem Druck von 10 - 40 Bar, und einer Wellenumlaufgeschwindigkeit von 100 - 1000 rpm, insbesondere 300 - 700 rpm, durchgeführt. Die Verweilzeit des eingebrachten Gemisches beträgt vorzugsweise 5 - 30 Sekunden, insbesondere 10 - 20 Sekunden.
Das Extrusionsverfahren kann gegebenenfalls einen Kompaktierungs- und/oder einen
Kompressionsschritt umfassen.
Vor der Durchführung des Extrusionsverfahrens werden die Komponenten vorzugsweise innig miteinander vermischt. Dies geschieht vorzugsweise in einer Trommel, die mit Schaufeln ausgestattet ist. Bei diesem Mischungsschritt erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform eine Wasserdampfinjektion, insbesondere um die Quellung der vorzugsweise enthaltenen Stärke zu bewirken. Die Wasserdampfinjektion wird hierbei vorzugsweise bei einem Druck von 1 bis 5 bar, besonders bevorzugt bei einem Druck von 2 bis 4 bar, durchgeführt.
Die weiteren Futtermittelinhaltsstoffe werden vor dem Vermischen mit der Aigen-Biomasse - soweit erforderlich - vorzugsweise zerkleinert, um sicherzustellen, dass bei dem Mischungsschritt ein homogenes Gemisch erhalten wird. Das Zerkleinern der weiteren Futtermittelinhaltsstoffe kann beispielsweise unter Verwendung einer Hammer-Mühle erfolgen.
Das erzeugte Extrudat hat vorzugsweise einen Durchmesser von 1 bis 14 mm, vorzugsweise 2 bis 12 mm, insbesondere 2 bis 6 mm, und weist vorzugsweise auch eine Länge von 1 bis 14 mm, vorzugsweise 2 bis 12 mm, insbesondere 2 bis 6 mm, auf. Die Länge des Extrudats wird durch Einsatz eines Schneidwerkzeugs während der Extrusion eingestellt. Die Länge des Extrudats wird vorzugsweise so gewählt, dass es dem Durchmesser des Extrudats in etwa entspricht. Der Durchmesser des Extrudats wird durch Wahl des Siebdurchmessers festgelegt.
In einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform schließt sich an das Extrusionsverfahren die Beladung des erhaltenen Extrudats mit Öl an. Hierzu wird das Extrudat vorzugsweise zunächst auf einen Feuchtigkeitsgehalt von maximal 5 Gew.-% getrocknet. Die Beladung des
Extrusionsprodukts mit Öl kann erfindungsgemäß beispielsweise durch Einlegen des Extrudats in Öl oder Besprühen des Extrudats mit Öl erfolgen, sie erfolgt erfindungsgemäß jedoch
vorzugsweise durch Vakuumbeschichtung. Auf diese Weise werden Futtermittel erhalten, die erfindungsgemäße Biomassen vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 25 Gew.-%, insbesondere 2 bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt 3 bis 15 Gew.-%, vor allem 4 bis 12 Gew.-%, enthalten.
Diese Futtermittel weisen entsprechend vorzugsweise weiterhin mindestens eine, vorzugsweise alle, der folgenden Eigenschaften auf:
a) einen Gesamt-Proteingehalt von 30 bis 60 Gew.-%, vorzugsweise 35 bis 55 Gew.-%, insbesondere 40 bis 50 Gew.-%;
b) einen Gesamt-Fettgehalt von 15 bis 35 Gew.-%, vorzugsweise 18 bis 32 Gew.-%, insbesondere 20 bis 30 Gew.-%, vor allem 22 bis 28 Gew.-%;
c) einen Gesamt-Stärkegehalt von maximal 25 Gew.-%, insbesondere maximal 20 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 15 Gew.-%, besonders bevorzugt 7 bis 13 Gew.-%;
d) einen Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) von 2 bis 12 Gew.-%,
vorzugsweise 3 bis 10 Gew.-%, insbesondere 4 bis 9 Gew.-%, vor allem 5 bis 8 Gew.-%;
e) einen Gehalt an omega-3-Fettsäuren von 1 bis 6 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,5 bis 5 Gew.-%, insbesondere 2 bis 4,5 Gew.-%, vor allem 2,5 bis 4 Gew.-%;
f) einen Gehalt an DHA von 0,5 bis 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,8 bis 2,5 Gew.-%, insbesondere 1 bis 2,5 Gew.-%, vor allem 1 ,2 bis 2,2 Gew.-%, insbesondere 1 ,2 bis 2,0 Gew.-%. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Gegenstand ist daher auch ein Futtermittel, insbesondere ein Extrudat, das über mindestens eine, vorzugsweise alle, der folgenden Eigenschaften verfügt: a) einen Gesamt-Proteingehalt von 30 bis 60 Gew.-%, vorzugsweise 35 bis 55 Gew.-%, insbesondere 40 bis 50 Gew.-%;
b) einen Gesamt-Fettgehalt von 15 bis 35 Gew.-%, vorzugsweise 18 bis 32 Gew.-%, insbesondere 20 bis 30 Gew.-%, vor allem 22 bis 28 Gew.-%;
c) einen Gesamt-Stärkegehalt von maximal 25 Gew.-%, insbesondere maximal 20 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 15 Gew.-%, besonders bevorzugt 7 bis 13 Gew.-%;
d) einen Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) von 2 bis 12 Gew.-%,
vorzugsweise 3 bis 10 Gew.-%, insbesondere 4 bis 9 Gew.-%, vor allem 5 bis 8 Gew.-%;
e) einen Gehalt an omega-3-Fettsäuren von 1 bis 6 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,5 bis 5 Gew.-%, insbesondere 2 bis 4,5 Gew.-%, vor allem 2,5 bis 4 Gew.-%;
f) einen Gehalt an DHA von 0,5 bis 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,8 bis 2,5 Gew.-%, insbesondere 1 bis 2,5 Gew.-%, vor allem 1 ,2 bis 2,2 Gew.-%, insbesondere 1 ,2 bis 2,0 Gew.-%. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Gegenstand ist daher auch ein Futtermittel, insbesondere ein Extrudat, das über mindestens eine, vorzugsweise alle, der folgenden Eigenschaften verfügt: a) einen Gesamt-Proteingehalt von 30 bis 60 Gew.-%, vorzugsweise 35 bis 55 Gew.-%, insbesondere 40 bis 50 Gew.-%;
b) einen Gesamt-Fettgehalt von 15 bis 35 Gew.-%, vorzugsweise 18 bis 32 Gew.-%, insbesondere 20 bis 30 Gew.-%, vor allem 22 bis 28 Gew.-%;
c) einen Gesamt-Stärkegehalt von maximal 25 Gew.-%, insbesondere maximal 20 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 15 Gew.-%, besonders bevorzugt 7 bis 13 Gew.-%; d) einen Gehalt an einer erfindungsgemäßen Biomasse, insbesondere einer
erfindungsgemäßen Labyrinthulea-Biomasse, vorzugsweise einer erfindungsgemäßen
Thraustochytriaceae-Biomasse, von 1 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 20 Gew.-%, insbesondere 3 bis 15 Gew.-%, vor allem 4 bis 12 Gew.-%;
e) einen Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) von 2 bis 12 Gew.-%,
vorzugsweise 3 bis 10 Gew.-%, insbesondere 4 bis 9 Gew.-%, vor allem 5 bis 8 Gew.-%;
f) einen Gehalt an omega-3-Fettsäuren von 1 bis 6 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,5 bis 5 Gew.-%, insbesondere 2 bis 4,5 Gew.-%, vor allem 2,5 bis 4 Gew.-%;
g) einen Gehalt an DHA von 0,5 bis 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,8 bis 2,5 Gew.-%, insbesondere 1 bis 2,5 Gew.-%, vor allem 1 ,2 bis 2,2 Gew.-%, insbesondere 1 ,2 bis 2,0 Gew.-%. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Gegenstand ist daher auch ein Futtermittel, insbesondere ein Extrudat, das über mindestens eine, vorzugsweise alle, der folgenden Eigenschaften verfügt: a) einen Gesamt-Protein-Gehalt von 30 bis 60 Gew.-%, vorzugsweise 35 bis 55 Gew.-%, insbesondere 40 bis 50 Gew.-%;
b) einen Gesamt-Fett-Gehalt von 15 bis 35 Gew.-%, vorzugsweise 18 bis 32 Gew.-%, insbesondere 20 bis 30 Gew.-%, vor allem 22 bis 28 Gew.-%;
c) einen Gesamt-Stärkegehalt von maximal 25 Gew.-%, insbesondere maximal 20 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 15 Gew.-%, besonders bevorzugt 7 bis 13 Gew.-%;
d) einen Gehalt an einer erfindungsgemäßen Aurantiochytrien- oder Schizochytrien- Biomasse, bevorzugt einer erfindungsgemäßen Aurantiochytrium limacinum-Biomasse, vor allem einer erfindungsgemäßen Aurantiochytrium limacinum SR21 -Biomasse, von 1 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 20 Gew.-%, insbesondere 3 bis 15 Gew.-%, vor allem 4 bis 12 Gew.-%;
e) einen Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) von 2 bis 12 Gew.-%,
vorzugsweise 3 bis 10 Gew.-%, insbesondere 4 bis 9 Gew.-%, vor allem 5 bis 8 Gew.-%;
f) einen Gehalt an omega-3-Fettsäuren von 1 bis 6 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,5 bis 5 Gew.-%, insbesondere 2 bis 4,5 Gew.-%, vor allem 2,5 bis 4 Gew.-%;
g) einen Gehalt an DHA von 0,5 bis 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,8 bis 2,5 Gew.-%, insbesondere 1 bis 2,5 Gew.-%, vor allem 1 ,2 bis 2,2 Gew.-%, insbesondere 1 ,2 bis 2,0 Gew.-%. Als fetthaltige Komponente können erfindungsgemäß neben der erfindungsgemäß einzusetzenden Biomasse Fette, insbesondere Öle, tierischen als auch solche pflanzlichen Ursprungs eingesetzt werden. Als fetthaltige Komponente kommen erfindungsgemäß insbesondere Pflanzenöle in Betracht, beispielsweise Sojabohnenöl, Rapssamenöl, Sonnenblumenkernöl, Flachssamenöl oder Palmöl sowie Mischungen davon. Daneben kann gegebenenfalls auch Fischöl als fetthaltige Komponente in geringen Mengen eingesetzt werden.
Als proteinhaltige Komponente können erfindungsgemäß beispielsweise Sojaprotein,
Erbsenprotein, Weizengluten oder Maisgluten sowie Mischungen davon eingesetzt werden.
Als proteinhaltige Komponente, die zusätzlich Fette enthält, können beispielsweise eingesetzt werden Fischmehl, Krillmehl, Muschelmehl, Kalmarmehl oder Schrimpsschalen. Diese werden im Folgenden unter dem Begriff„marines Mehl“ zusammengefasst. In einer bevorzugten
Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes Futtermittel marines Mehl, vorzugsweise Fischmehl, in einer Menge von 3 bis 18 Gew.-%, insbesondere 5 bis 15 Gew.-%, vor allem 7 bis 13 Gew.-%.
Als kohlenhydrathaltige Komponente können beispielsweise Weizenmehl, Sonnenblumenmehl oder Sojamehl sowie Mischungen davon eingesetzt werden.
Beim Einsatz erfindungsgemäßer Futtermittel, insbesondere eines erfindungsgemäßen ölbeschichteten Extrudats, in der Tierzucht, hat sich herausgestellt, dass dieses in besonderem Maße das Wachstum der Tiere fördert sowie den Stress-Zustand der Tiere verbessert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Anzucht von Tieren, dadurch gekennzeichnet, dass diesen ein erfindungsgemäßes Futtermittel verabreicht wird. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist hierbei insbesondere ein Verfahren zur Steigerung des Wachstums von Tieren, dadurch gekennzeichnet, dass diesen ein erfindungsgemäßes Futtermittel verabreicht wird.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ebenso ein Verfahren zur Erhöhung des Anteils an omega-3-Fettsäuren, insbesondere DHA, im Muskelgewebe von Tieren, dadurch gekennzeichnet, dass diesen ein erfindungsgemäßes Futtermittel verabreicht wird.
Verzugsweise wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren das Futtermittel mindestens alle zwei Tage, vorzugsweise mindestens einmal täglich, verabreicht.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenso die Verwendung eines
erfindungsgemäßen Futtermittels zur Steigerung des Wachstums bei Tieren.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls die Verwendung eines
erfindungsgemäßen Futtermittels zur Erhöhung des Anteils an omega-3-Fettsäuren im
Muskelgewebe bei Tieren.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls die Verwendung eines
erfindungsgemäßen Futtermittels zur Verbesserung des Gesundheitszustands von Tieren, insbesondere zur Verbesserung des Stress-Zustands von Tieren.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls die Verwendung eines
erfindungsgemäßen Futtermittels zur Ermöglichung einer stress-reduzierten Anzucht der Tiere.
Bei den angezüchteten Tieren, die mit einem erfindungsgemäßen Futtermittel gefüttert werden, handelt es sich vorzugsweise um Geflügel, Schweine oder Rinder.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei den angezüchteten Tieren jedoch um marine Tiere, besonders bevorzugt um Flossenfische oder Crustaceen. Hierzu zählen insbesondere Karpfen, Tilapia, Welse, Thunfisch, Lachs, Forellen, Baramundi, Brassen, Barsche, Kabeljau, Schrimps, Hummer, Krabben, Garnelen und Krebse. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den angezüchteten Tieren um Lachse. Bevorzugte Lachsarten stellen hierbei der Atlantische Lachs, der Rotlachs, der Masu-Lachs, der Königslachs, der Ketalachs, der Silberlachs, der Donaulachs, der Pazifische Lachs und der Buckellachs dar.
Bei den angezüchteten Tieren kann es sich insbesondere auch um Fische handeln, die anschließend zu Fischmehl oder Fischöl verarbeitet werden. Bei den Fischen handelt es sich hierbei vorzugsweise um Hering, Pollack, Menhaden, Anchovis, Kapelan oder Kabeljau. Das so erhaltene Fischmehl oder Fischöl kann wiederum in der Aquakultur zur Zucht von Speisefischen bzw. Crustaceen eingesetzt werden.
Es kann sich bei den angezüchteten Tieren jedoch auch um Kleinlebewesen handeln, die in der Aquakultur als Futtermittel eingesetzt werden. Bei diesen Kleinlebewesen kann es sich beispielsweise um Nematoden, Crustaceen oder Rotiferen handeln.
Die Anzucht der marinen Tiere kann in Teichen, Tanks, Becken oder auch in abgegrenzten Arealen im Meer oder in Seen, hierbei insbesondere in Käfigen oder Netzpferchen, erfolgen. Die Anzucht kann dazu dienen, den fertigen Speisefisch heranzuzüchten, jedoch auch eingesetzt werden, um Jungfische heranzuzüchten, die anschließend freigesetzt werden, um den
Wildfischbestand aufzustocken.
Bei der Lachszucht erfolgt vorzugsweise zunächst die Heranzucht bis zum Junglachs in
Süßwasser-Tanks oder künstlichen Wasserströmen und anschließend die weitere Zucht im Meer in schwimmenden Käfigen bzw. Netzpferchen, die vorzugsweise in Buchten oder Fjorden verankert sind.
Bei dem erfindungsgemäßen Futtermittel handelt es sich entsprechend vorzugsweise um ein Futtermittel zum Einsatz bei der Anzucht der zuvor genannten Tiere.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1 : Herstellung der Biomasse durch Fermentation von Aurantiochytrium limacinum SR21 in einem Medium mit hohem Sulfat -Gehalt und anschließende Trocknung der
Biomasse
Die Kultivierung der Zellen erfolgte für ca. 70 h in einem Zulaufverfahren unter Verwendung eines Stahlfermenters mit einem Fermentervolumen von 2 Litern bei einer Gesamt-Startmasse von ca. 700 g und einer erreichten Gesamt-Endmasse von ca. 1 ,5 kg. Während des Verfahrens wurde eine Glucose-Lösung (570 g/kg Glucose) zudosiert („Fed-batch Verfahren“)
Die Zusammensetzung des Startmediums war wie folgt:
Medium 1 : 20 g/kg Glukose; 4 g/kg Hefe-Extrakt; 2 g/kg Ammoniumsulfat; 12 bzw. 16 g/kg Natriumsulfat; 2,46 g/kg Magnesiumsulfat (Heptahydrat); 0,45 g/kg Kaliumchlorid; 4,5 g/kg Kaliumdihydrogenphosphat; 0, 1 g/kg Thiamin (HCl); 5 g/kg Spurenelementlösung.
Die Zusammensetzung der Spurenelementlösung war wie folgt: 35 g/kg Salzsäure (37%); 1 ,86 g/kg Manganchlorid (Tetrahydrat); 1 ,82 g/kg Zinksulfat (Heptahydrat); 0,818 g/kg Natrium-EDTA; 0,29 g/kg Borsäure; 0,24 g/kg Natriummolybdat (Dihydrat); 4,58 g/kg Kalziumchlorid (Dihydrat); 17,33 g/kg Eisensulfat (Heptahydrat); 0,15 g/kg Kupferchlorid (Dihydrat).
Die Kultivierung erfolgte unter folgenden Bedingungen: Kultivierungstemperatur 28°C;
Belüftungsrate 0,5 vvm, Rührergeschwindigkeit 600 - 1950 rpm, Kontrolle das pH-Werts in der Wachstumsphase bei 4,5 mit Hilfe von Ammoniakwasser (25% v/v). Die Fermentation erfolgte bis zu einer Biomassendichte von 80 g/l, bevor durch Limitierung von Phosphat und Stickstoff die Ölproduktionsphase eingeleitet wurde. Die Sulfat-Konzentration ist aufgrund des hohen Sulfat- Gehalts im Ausgangsmedium bis zum Ende der Fermentation, also auch bis zum Ende der Ölproduktionsphase, stets oberhalb der Sättigungsgrenze der Zellen, die bei ca. 5 g pro kg Biotrockenmasse liegt. Die erhaltenen Biomassen werden im Folgenden„Biomasse 1“ (12 g/kg Natriumsulfat im Startmedium) bzw.„Biomasse 2“ (16 g/kg Natriumsulfat im Startmedium) bezeichnet.
Beispiel 2: Herstellung der Biomasse durch Fermentation von Aurantiochytrium limacinum SR21 in einem Medium mit niedrigem Sulfat -Gehalt und anschließende Trocknung der Biomasse
Die Kultivierung der Zellen erfolgte für ca. 70 h in einem Zulaufverfahren unter Verwendung eines Stahlfermenters mit einem Fermentervolumen von 2 Litern bei einer Gesamt-Startmasse von 712 g und einer erreichten Gesamt-Endmasse von ca. 1 ,5 kg. Während des Verfahrens wurde eine Glucose-Lösung (570 g/kg Glucose) zudosiert („Fed-batch Verfahren“)
Die Zusammensetzung des Startmediums war wie folgt:
Medium 1 : 20 g/kg Glukose; 4 g/kg Hefe-Extrakt; 0 g/kg Ammoniumsulfat; 2,46 g/kg
Magnesiumsulfat (Heptahydrat); 0,45 g/kg Kaliumchlorid; 4,5 g/kg Kaliumdihydrogenphosphat; 0,1 g/kg Thiamin (HCl); 5 g/kg Spurenelementlösung.
Die Zusammensetzung der Spurenelementlösung war wie folgt: 35 g/kg Salzsäure (37%); 1 ,86 g/kg Manganchlorid (Tetrahydrat); 1 ,82 g/kg Zinksulfat (Heptahydrat); 0,818 g/kg Natrium-EDTA; 0,29 g/kg Borsäure; 0,24 g/kg Natriummolybdat (Dihydrat); 4,58 g/kg Kalziumchlorid (Dihydrat); 17,33 g/kg Eisensulfat (Heptahydrat); 0,15 g/kg Kupferchlorid (Dihydrat).
Die Kultivierung erfolgte unter folgenden Bedingungen: Kultivierungstemperatur 28°C;
Belüftungsrate 0,5 vvm, Rührergeschwindigkeit 600 - 1950 rpm, Kontrolle das pH-Werts in der Wachstumsphase bei 4,5 mit Hilfe von Ammoniakwasser (25% v/v). Die Fermentation erfolgte bis zu einer Biomassendichte von 80 g/l, bevor durch Limitierung von Phosphat und Stickstoff die Ölproduktionsphase eingeleitet wurde. Die Sulfat-Konzentration ist bereits bei Einleitung der
Ölproduktionsphase unter die Nachweisgrenze von 0,05 g pro kg Fermentationsmedium gefallen und die Sulfat-Konzentration lag entsprechend auch während der gesamten Ölproduktionsphase unterhalb der Nachweisgrenze. Und da keine Zudosierung von Sulfat erfolgte, ist die Sulfat- Konzentration im Verlauf der Ölproduktionsphase auf null gefallen. Die erhaltene Biomasse wird im Folgenden„Biomasse 3“ bezeichnet.
Beispiel 3: Herstellung der Biomasse durch Fermentation von Aurantiochytrium limacinum SR21 in einem Medium mit niedrigem Sulfat-Gehalt bei gleichzeitiger Sulfat-Zugabe während der Fermentation und anschließende Trocknung der Biomasse
Die Kultivierung der Zellen erfolgte für ca. 70 h in einem Zulaufverfahren unter Verwendung eines Stahlfermenters mit einem Fermentervolumen von 2 Litern bei einer Gesamt-Startmasse von 712 g und einer erreichten Gesamt-Endmasse von ca. 1 ,5 kg. Während des Verfahrens wurde eine Glucose-Lösung (570 g/kg Glucose) sowie in sechs unterschiedlichen Ansätzen entweder Natriumsulfat-Lösungen unterschiedlicher Konzentration (7,4; 14,8 oder 22,2 g/kg Natriumsulfat) oder Ammoniumsulfat-Lösungen unterschiedlicher Konzentration (6,8; 13,6 oder 20,4 g/kg Ammoniumsulfat) mit einer konstanten Zulaufrate von 3 g/h zudosiert („Fed-batch Verfahren“). Die Zulaufraten der Sulfat-Lösungen wurden so gewählt das der Sulfat-Gehalt in der Speicherphase unter der Nachweisgrenze (0,05 g/l) für Sulfat bleibt.
Des Weiteren wurde in einem Ansatz Wasser mit selbiger Feedrate (3 g/h) als Negativkontrolle verwendet um einen„Verdünnungseffekt“ auszuschließen.
Die Zusammensetzung des Startmediums war wie folgt:
Medium 1 : 20 g/kg Glukose; 4 g/kg Hefe-Extrakt; 2 g/kg Ammoniumsulfat; 2,46 g/kg
Magnesiumsulfat (Heptahydrat); 0,45 g/kg Kaliumchlorid; 4,5 g/kg Kaliumdihydrogenphosphat; 0,1 g/kg Thiamin (HCl); 5 g/kg Spurenelementlösung.
Die Zusammensetzung der Spurenelementlösung war wie folgt: 35 g/kg Salzsäure (37%); 1 ,86 g/kg Manganchlorid (Tetrahydrat); 1 ,82 g/kg Zinksulfat (Heptahydrat); 0,818 g/kg Natrium-EDTA; 0,29 g/kg Borsäure; 0,24 g/kg Natriummolybdat (Dihydrat); 4,58 g/kg Kalziumchlorid (Dihydrat); 17,33 g/kg Eisensulfat (Heptahydrat); 0,15 g/kg Kupferchlorid (Dihydrat).
Die Kultivierung erfolgte unter folgenden Bedingungen: Kultivierungstemperatur 28°C;
Belüftungsrate 0,5 vvm, Rührergeschwindigkeit 600 - 1950 rpm, Kontrolle das pH-Werts in der Wachstumsphase bei 4,5 mit Hilfe von Ammoniakwasser (25% v/v). Die Fermentation erfolgte bis zu einer Biomassendichte von50 g/l, bevor durch Limitierung von Phosphat und Stickstoff die Ölproduktionsphase eingeleitet wurde. Die Sulfat-Konzentration ist bereits bei Einleitung der Ölproduktionsphase unter die Nachweisgrenze von 0,05 g pro kg Fermentationsmedium gefallen und die Sulfat-Konzentration lag entsprechend auch während der gesamten Ölproduktionsphase unterhalb der Nachweisgrenze. Aufgrund der kontinuierlichen Zudosierung von Sulfat wird jedoch verhindert, dass die Sulfat-Konzentration im Medium auf null fällt. Die Biomassen mit
Natriumsulfat-Feed werden im Folgenden„Biomasse 3, 4 bzw. 5“ genannt, die Biomassen mit dem Ammoniumsulfat-Feed„Biomassen 6, 7 bzw. 8“.
Beispiel 4: Aufarbeitung und Vergleich der erhaltenen Biomassen bzw. Verfahren
Nach der Kultivierung wurden die Fermentationsbrühen für 20 Minuten auf 60°C erhitzt, um eine weitere Aktivität der Zellen zu unterbinden. Anschließend erfolgte eine zweistufige Trocknung der Biomasse: Zunächst wurde die Fermentationsbrühe durch Verdampfung auf eine Trockenmasse von etwa 20 Gew.-% eingeengt. Anschließend erfolgte Sprühtrocknung der eingeengten
Fermentationsbrühe unter Verwendung eines Production MinorTM Spray Dryer (GEA NIRO) bei einer Einlasstemperatur der Trocknungsluft von 340°C. Durch Sprühtrocknung wurde so ein Puder mit einer Trockenmasse von mehr als 95 Gew.-% erhalten. Tabelle 1 : Vergleich der erhaltenen Biomassen
Figure imgf000022_0001
Bei den Biomassen 1 und 2 handelt es sich um die Biomassen, die durch Fermentation bei hohem Sulfat-Gehalt gemäß Beispiel 1 erhalten wurden, bei der Biomasse 3 handelt es sich um die Biomasse, die durch Fermentation bei niedrigem Sulfat-Gehalt gemäß Beispiel 2 erhalten wurde, während die Biomassen 4 bis 9 durch Fermentation bei niedrigem Sulfat-Gehalt und
kontinuierlicher Zuführung von Sulfat mit niedriger Dosierungs-Rate gemäß Beispiel 3 erhalten wurden.
Es ist zu erkennen, dass die Fermentations-Verfahren, die zu den Biomassen 4 bis 9 führten, eine deutlich höhere Ausbeute an DHA sowie mehr und ein reineres Produkt lieferten, als dasjenige Verfahren, das bei niedrigem Sulfat-Gehalt ohne kontinuierliche Zuführung von Sulfat (Biomasse 3) bzw. als diejenigen Verfahren, die bei hohem Sulfat-Gehalt durchgeführt wurden (Biomassen 1 und 2). Die erfindungsgemäß bevorzugten Biomassen, die durch die Verfahren gemäß Beispiel 3 erhalten wurden, enthielten Sulfat in einer Menge von 12 bis 16 Gramm pro kg Biomasse.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung einer PUFAs enthaltenden Biomasse durch Kultivierung von PUFAs produzierenden Zellen in einem Fermentationsmedium, dadurch gekennzeichnet, dass der
Sulfat-Gehalt so eingestellt wird, dass in der letzten Phase der Fermentation zwar stets Sulfat im Medium vorhanden ist, die Sulfat-Konzentration im Medium jedoch stets unterhalb der Sättigungsgrenze der Zellen liegt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das Verfahren eine Wachstumsphase und eine
Ölproduktionsphase umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass Sulfat während der gesamten Zeit der Ölproduktionsphase im Fermentationsmedium vorhanden ist, die Sulfat-Konzentration während der überwiegenden Zeit der Ölproduktionsphase jedoch unterhalb der
Sättigungsgrenze der Zellen liegt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfat-Konzentration
zumindest während der zweiten Hälfte der Ölproduktionsphase, vorzugsweise zumindest während der letzten 70, 80 oder 90 % der Zeit der Ölproduktionsphase, besonders bevorzugt während der gesamten Ölproduktionsphase, unterhalb der Sättigungsgrenze der Zellen liegt.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfat-Konzentration zumindest während der zweiten Hälfte der Ölproduktionsphase, vorzugsweise zumindest während der letzten 70, 80 oder 90 % der Zeit der Ölproduktionsphase, besonders bevorzugt während der gesamten Ölproduktionsphase, zwischen 0,005 und 5 Gramm Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse, vorzugsweise zwischen 0,01 und 4, besonders bevorzugt zwischen 0,01 und 3, 2 oder 1 Gramm Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse, vor allem zwischen 0,01 und 0,05, Gramm Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse liegt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen, vorzugsweise in der Wachstumsphase, bis zu einer Biomassendichte von mindestens
50 g pro Liter Fermentationsmedium, insbesondere 50 bis 250 g pro Liter
Fermentationsmedium, vorzugsweise mindestens 80, 100, 120 oder 140 g pro Liter
Fermentationsmedium, insbesondere 80, 100, 120 oder 140 g bis 200 oder 220 g pro Liter Fermentationsmedium, kultiviert werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ölproduktionsphase durch Limitierung mindestens einer limitierenden Nährstoffkomponente, insbesondere durch Limitierung einer Stickstoff-Guelle, eingeleitet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Sulfat während der überwiegenden Zeit der Ölproduktionsphase in geringer Menge, vorzugsweise in einer Rate von 5 bis 100 mg, vorzugsweise 10 bis 50 mg, pro kg Fermentationsmedium, dem Fermentationsmedium kontinuierlich zudosiert wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass Sulfat während der Ölproduktionsphase in der Zeit, in der die Sulfat-Konzentration unterhalb der
Sättigungsgrenze liegt, in einer Menge kontinuierlich zudosiert wird, so dass sich eine Sulfat- Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze von 0,05 g pro kg Fermentationsmedium einstellt.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass durch das Satz-Medium Sulfat vorgelegt wird und mit der dosierten Sulfat-Zugabe begonnen wird, sobald die Sulfat-Konzentration unter 2 Gramm pro kg Fermentationsmedium, insbesondere unter 1 Gramm pro kg Fermentationsmedium, vor allem unter 0,5 g pro kg
Fermentationsmedium gefallen ist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfat-Konzentration kurz vor Beginn der Ölproduktionsphase, vorzugsweise nachdem eine Biomassendichte von mindestens 50 g, vorzugsweise mindestens 80, 100 oder 120 g pro Liter Fermentationsmedium erreicht wurde, unter 5 g Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse, vorzugsweise unter 4, 3, 2 oder 1 g Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse, insbesondere unter 0,5, 0, 1 oder 0,05 g Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse, fällt und vorzugsweise für den Rest der Fermentation unterhalb dieser Konzentration verbleibt.
1 1. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfat-Konzentration bis zum Beginn der dosierten Sulfat-Zugabe stets unter 0,5 g pro kg Fermentationsmedium beträgt.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das eingesetzte Fermentationsmedium während der gesamten Fermentation eine Chlorid- Konzentration von weniger als 1 g/l, insbesondere weniger als 500 mg/l, bevorzugt weniger als 250 mg/l, aufweist.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Mikroorganismen um solche des Taxons Labyrinthulomycetes (Labyrinthulea, Netzschleimpilze, Schleimnetze) handelt, insbesondere um solche der Familie der
Thraustochytriaceae, vorzugsweise der Gattungen Althornia, Aplanochytrium, Elnia,
Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium oder Ulkenia, vor allem der Spezies Aurantiochytrium limacinum.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den PUFAs um omega-3-Fettsäuren, vorzugsweise um DHA und/oder EPA handelt.
15. PUFAs enthaltende Biomasse, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Sulfat-Gehalt von 12 bis 20 g pro kg Biomasse, vorzugsweise 12 bis 18 g pro kg Biomasse, insbesondere 12 bis 16 g pro kg Biomasse, aufweist und es sich bei den Zellen der Biomasse vorzugsweise um solche des Taxons Labyrinthulomycetes (Labyrinthulea, Netzschleimpilze, Schleimnetze) handelt, insbesondere um solche der Familie der Thraustochytriaceae, besonders bevorzugt der Gattungen Althornia, Aplanochytrium, Elnia, Japonochytrium, Schizochytrium,
Thraustochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium oder Ulkenia, vor allem um solche der Spezies Aurantiochytrium limacinum.
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