ES2403154T3 - Métodos y composiciones para la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga en plantas - Google Patents

Métodos y composiciones para la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga en plantas Download PDF

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Abstract

Construcción de ácido nucleico que comprende una sConstrucción de ácido nucleico que comprende una secuencia de control de la expresión funcional en uecuencia de control de la expresión funcional en una célulade una planta unida operativamente a una na célulade una planta unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipésecuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, siendo dichopolipéptido un polipéptido capaptido, siendo dichopolipéptido un polipéptido capaz de desaturar una molécula de ácido graso en los z de desaturar una molécula de ácido graso en los carbonos 6 y 7 enumerados desdeel extremo carboxilcarbonos 6 y 7 enumerados desdeel extremo carboxilo de dicho ácido graso, comprendiendo dicho polipéo de dicho ácido graso, comprendiendo dicho polipéptido la secuencia de 457 aminoácidosrepresentada ptido la secuencia de 457 aminoácidosrepresentada en la SEC ID Nº: 2. en la SEC ID Nº: 2.

Description

Métodos y composiciones para la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga en plantas
INTRODUCCIÓN
Campo de la Invención
0001 Esta invención se relaciona con niveles modulantes de enzimas y/o componentes de enzimas capaces de alterar la producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (PUFAs) en una planta hospedadora. La invención se ejemplifica mediante la producción de PUFAs en plantas.
Antecedentes
0002 Dos familias principales de ácidos grasos poliinsaturados(PUFAs) son los ácidos grasos ω3, ejemplificados por el ácido eicosapentaenoico. Los PUFA son componentes importantes de la membrana plasmática de la célula, en donde se pueden encontrar en formas tales como fosfolípidos. Los ácidos PUFA también sirven como precursores para otras moléculas de importancia en seres humanos y animales, incluyendo las prostaciclinas, leucotrienos y prostaglandinas. Los PUFA son necesarios para el desarrollo adecuado, particularmente en el desarrollo de cerebro del lactante, y para la formación y reparación de tejidos.
0003 Cuatro grandes ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga de importancia incluyen el ácido docosahexaenoico (DHA) y el ácido eicosapentaenoico (EPA), los cuales principalmente se encuentran en diferentes tipos de aceite de pescado, el ácido gammalinolénico (GLA), el cual se encuentra en las semillas de varias plantas, incluyendo prímula (Oenothera biennis), borraja (Borago officinalis) y grosella negra (Ribes nigrum), y el ácido estearidónico (SDA), el cual se encuentra en aceites marinos y semillas de plantas. Tanto el GLA como otro PUFA de cadena larga importante, el ácido araquidónico (ARA), se encuentran en hongos filamentosos. El ARA se puede purificar a partir de tejidos animales que incluyen el hígado y la glándula adrenal.
0004 Para el DHA, existen varias fuentes para la producción comercial que incluyen una variedad de organismos marinos, aceites obtenidos de peces de agua marina fría, y fracciones de yema de huevo. Se pueden usar para la producción comercial del ARA microorganismos que incluyen los géneros Mortierella, Entomophthora, Phytium y Porphyridium. Fuentes comerciales de ácido SDA incluyen los géneros Trichodesma y Echium. Fuentes comerciales de GLA incluyen prímula, grosella negra y borraja. Sin embargo, existen varias desventajas asociadas con la producción comercial de PUFAs a partir de fuentes naturales. Las fuentes naturales de los PUFA, tales como animales y plantas, tienden a tener composiciones grasas altamente heterogéneas. Los aceites obtenidos a partir de estas fuentes, por lo tanto, pueden requerir una purificación extensa para separar uno o más PUFAs deseados o para producir un aceite que esté enriquecido en uno o más PUFAs. Las fuentes naturales también se someten a fluctuaciones incontroladas en disponibilidad. Las existencias de peces pueden sufrir variación natural o se pueden agotar por sobrepesca. Los aceites de pescado tienen sabores y olores desagradables, los cuales pueden ser imposible separar económicamente, del producto deseado, y pueden volver estos productos inaceptables como complementos alimenticios. Los aceites animales, y particularmente los aceites de pescado, pueden acumular contaminantes ambientales. El clima y las enfermedades pueden causar fluctuación en los rendimientos tanto de las fuentes de peces como de plantas. La tierra de cultivo disponible para la producción de cultivos alternos productores de aceite se somete a competición por la expansión estacionaria de las poblaciones humanas y por la necesidad creciente asociada a la producción de alimentos en el resto de la tierra cultivable. Los cultivos que producen PUFAs, tales como la borraja, no se han adaptado al cultivo comercial y pueden no tener buen rendimiento en monocultivo. De esta manera, el crecimiento de estos cultivos no es económicamente competitivo cuando se pueden cultivar otros cultivos más rentables y mejor establecidos. La fermentación a gran escala de organismos tales como Mortierella también es cara. Los tejidos animales naturales contienen bajas cantidades de ARA y son difíciles de procesar. Microorganismos tales como Porphyridium y Mortierella son difíciles de cultivar a escala comercial.
0005 Los componentes dietéticos y las formulaciones farmacéuticas que contienen PUFAs pueden retener las desventajas de la fuente de PUFA. Complementos tales como las cápsulas de aceite de pescado pueden contener bajos niveles del componente particular deseado y requerir así grandes dosis. Las altas dosis dan como resultado la ingestión de altos niveles de componentes no deseados, incluyendo contaminantes. Se debe tener cuidado al proporcionar complementos con ácidos grasos, ya que la sobreadición puede dar como resultado una supresión de rutas biosintéticas endógenas y conducir a la competición con otros ácidos grasos necesarios en varias fracciones lípidas in vivo, condiciendo a resultados indeseables. Por ejemplo, los esquimales que tienen una dieta alta en ácidos grasos ω3 tienen una tendencia creciente a sangrar (Patente US Nº 4,874,603). Los sabores y olores desagradables de los complementos pueden hacer estos regímenes indeseables, y pueden inhibir la cooperación del paciente.
0006 En la biosíntesis de los PUFAs están involucradas varias enzimas. El ácido linoleico (LA, 18:2 Δ9, 12) se produce a partir de ácido oleico (18:1 Δ9) mediante una Δ12-desaturasa. GLA (18:3 Δ6, 9, 12) se produce a partir de ácido linoleico (LA, 18:2 Δ9, 12) mediante una Δ6-desaturasa. La producción de ARA (20:4 Δ5, 8, 11, 14) se produce a partir de DGLA (20:3 Δ8, 11, 14) catalizada por una Δ5-desaturasa. Sin embargo, los animales no pueden desaturar más allá de la posición Δ9 y por lo tanto no pueden convertir el ácido oleico (18:1 Δ9)en ácido linoleico
(18:2 Δ9, 12). De la misma manera, el ácido α-linolénico (ALA, 18:3 Δ9, 12, 15)no puede ser sintetizado por los mamíferos. Otros eucariotas, incluyendo hongos y plantas, tienen enzimas que desaturan en las posiciones Δ21 y Δ15. Los ácidos grasos poliinsaturados de mayor importancia en animales, por lo tanto, se derivan ya sea de la dieta y/o de la desaturación y alargamiento del ácido linoleico (18:2 Δ9, 12) o del ácido α-linolénico (18:3 Δ9, 12, 15).
0007 Los ácidos grasos poliinsaturados se consideran útiles para fines nutricionales, farmacéuticos, industriales, y otros. Un suministro expansivo de ácidos grasos poliinsaturados a partir de fuentes naturales y de síntesis química no es suficiente para las necesidades comerciales. Por lo tanto, es de interés obtener material genético involucrado en la biosíntesis de PUFAs a partir de especies que producen de manera natural estos ácidos grasos y expresar el material aislado solo o en combinación en un sistema heterólogo, el cual se pueda manipular para permitir la producción de cantidades comerciales de los PUFA.
0008 La producción de ácido gama-linóleico mediante una Δ6-desaturasa se describe en USPN 5,614,393. la producción de ácido 8, 11-eicosadienoico usando Mortierella alpina se describe en USPN 5,376,541. La producción de ácido docosahexaenoico mediante dinoflagelados se describe en USPN 5,407,957. La clonación de una Δ6desaturasa a partir de borraja se describe en la PCT WO 96/21022. La clonación de Δ9-desaturasas se describe en las solicitudes de Patente publicadas PCT WO 91/13972, EP 0 550 162 A1, EP 0561 569 A2, EP 0 644 263 A2, y EP 0 736 598 A1, y en USPN 5,057,419. La clonación de Δ12-desaturasas a partir de varios organismos se describe en la publicación de PCT WO 94/11516 y en USPN 5,443,974. La clonación de Δ15-desaturasas a partir de varios organismos se describe en la publicación PCT WO 93/11245. Una desaturasa de proteína portadora Δ6-palmitoilacilo de Thumbergia alata y su expresión en E. Coli se describe en USPN 5,614,400. La expresión de una desaturasa estearilo-ACP de soja en embriones transgénicos de soja usando un promotor 35S se describe en USPN 5,443,974.
DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN
0009 La presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia funcional de control de la expresión en una célula de una planta unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, siendo dicho polipéptido capaz de desaturar una molécula de ácido graso en los carbonos 6 y 7 desde el extremo carboxilo de dicho ácido graso, comprendiendo dicho polipéptido la secuencia de 457 aminoácidos representada en la SEC ID NO: 2.
[0010] Realizaciones adicionales de la invención se establecen en las reivindicaciones que se acompañan.
0011 La presente invención se puede utilizar en la producción de fórmulas, suplementos alimenticios o suplementos alimenticios en forma de un líquido o sólido que contiene los ácidos grasos de cadena larga de la invención. Estas fórmulas y suplementos se pueden administrar a un humano o un animal.
0012 Las fórmulas y suplementos también pueden comprender al menos un macronutriente seleccionado del grupo que consiste en aceite de coco, aceite de soja, aceite de canola, monoglicéridos y diglicéridos, glucosa, lactosa comestible, suero electrodializado, leche descremada electrodializada, suero de leche, proteína de soja, y otros hidrolizados de proteína.
0013 Las fórmulas pueden incluir además al menos una vitamina seleccionada del grupo que consiste en Vitaminas A, C, D, E, y complejo B; y al menos un mineral seleccionado del grupo consistente en calcio, magnesio, zinc, manganeso, sodio, potasio, fósforo, cobre, cloro, yodo, selenio y hierro.
0014 La presente invención puede ser útil en métodos que se relacionan con el tratamiento de un paciente que tiene una patología causada por una ingesta o producción insuficiente de ácidos grasos poliinsaturados que comprenden la administración al paciente de un sustituto alimenticio de la invención en una cantidad suficiente para realizar un tratamiento del paciente.
0015 La presente invención se puede utilizar además para fabricar composiciones cosméticas y farmacéuticas.
0016] La presente invención se puede utilizar en la producción de aceites transgénicos en portadores farmacéuticamente aceptables. La presente invención se refiere además a suplementos nutricionales, agentes cosméticos y fórmulas para bebés que contienen aceites transgénicos.
[0017] La presente invención también puede ser útil en métodos para obtener una biosíntesis alterada de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga, que comprende las etapas de: crecer un microbio que tiene células que contienen un transgén que codifica un producto de expresión transgénica que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6 desde el extremo carboxilo de dicha molécula de ácido graso, en el que el transgén está asociado operativamente con una secuencia de control de la expresión, bajo condiciones en las que se expresa el transgén, mediante lo cual se altera la biosíntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga en las células.
[0018] La presente invención también es útil en la producción de composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un nutriente seleccionado del grupo que consiste en una vitamina, un mineral, un carbohidrato, un azúcar, un aminoácido, un ácido graso libre, un fosfolípido, un antioxidante y un compuesto fenólico.
[0019] En el presente documento se describen composiciones y métodos nuevos para la preparación de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga y desaturasas en plantas y células vegetales. Los métodos implican el crecimiento de una célula vegetal hospedadora de interés transformada con un cassette de expresión funcional en una célula vegetal hospedadora, comprendiendo el cassette de expresión una región reguladora del inicio de la transcripción y la traducción, unida en el marco de lectura 5’ a la secuencia de ADN que codifica un polipéptido desaturasa capaz de modular la producción de PUFA. La expresión del polipéptido desaturasa proporciona una alteración en el perfil de PUFA de células vegetales hospedadoras como resultado de concentraciones alteradas de enzimas implicadas en la biosíntesis de PUFA.
[0020] De particular interés es el control selectivo de la producción de PUFA en tejidos vegetales y/o partes de plantas, tales como hojas, raíces, frutos y semillas. La presente invención es útil, por ejemplo, en la producción a gran escala de DHA, EPA, ARA y GLA y para la modificación del perfil de ácidos grasos de tejidos vegetales y/o partes de plantas comestibles.
[0021] La presente memoria también establece una secuencia de nucleótidos o secuencia de polipéptido purificada que está sustancialmente relacionada o es homóloga a las secuencias de nucleótidos y péptidos presentadas en las SEC ID No: 1 – SEC ID No. 52. La presente memoria también establece métodos de utilización de las secuencias presentadas en SEC ID No: 1 a SEC ID No: 40 como sondas para identificar secuencias relacionadas, como componentes de sistemas de expresión y como componentes de sistemas útiles para la producción de aceite transgénico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
0022
La figura 1 muestra posibles rutas para la síntesis de ácido araquidónico (20:4 Δ5, 8, 11, 14) y ácido estearidónico (18:4 Δ6, 9, 12, 15) a partir de ácido palmítico (C16) a partir de una variedad de organismos, que incluyen algas, Mortierella y humanos. Estos PUFA pueden servir como precursores de otras moléculas importantes para humanos y otros animales, incluyendo prostaciclinas, leucotrienos, y prostaglandinas, algunas de las cuales se muestran.
La Figura 2 muestra posibles rutas para la producción de PUFAs además del ARA, que incluyen EPA y DHA, de nuevo compilado a partir de una variedad de organismos.
Las Figuras 3A-E muestran la secuencia de ADN (SEC ID NO:1) de la Δ6-desaturasa de Mortierella alpina y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO:2).
La Figura 4 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de la Δ6-desaturasa de Mortierella alpina con otras Δ6-desaturasas y secuencias relacionadas (SEC ID NOS: 7, 8, 9, 10, 11, 12 Y 13).
Las Figuras 5A-D muestran la secuencia de ADN (SEC ID NO:3) de la Δ12-desaturasa de Mortierella alpina y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO:4).
La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO:14) del fragmento de PCR (ver Ejemplo 1).
Las Figuras 7A-D muestran la secuencia de ADN (SEC ID NO:5) de la Δ5-desaturasa de Mortierella alpina.
La Figura 8 muestra alineaciones de la secuencia proteica de la Δ5-desaturasa de Mortierella alpina (SEC ID NO:6) con Δ6-desaturasas y secuencias relacionadas (SEC ID NOS: 15, 16, 17, 18).
La Figura 9 muestra alineaciones de la secuencia proteica de Ma 29 y contig 253538a.
La Figura 10 muestra alineaciones de la secuencia proteica de Ma 524 y contig 253538a.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS LISTADOS DE SECUENCIAS
0023 SEC ID NO:1 muestra la secuencia de ADN de la Δ6-desaturasa de Mortierella alpina. 0024 SEC ID NO:2 muestra la secuencia de aminoácidos de la Δ6-desaturasa Mortierella alpina. 0025 SEC ID NO:3 muestra la secuencia de ADN de la Δ12-desaturasa de Mortierella alpina. 0026 SEC ID NO:4 muestra la secuencia de aminoácidos de la Δ12-desaturasa de Mortierella alpina. 0027 SEC ID NO:5 muestra la secuencia de ADN de la Δ5-desaturasa de Mortierella alpina. 0028 SEC ID NO:6 muestra la secuencia de aminoácidos de la Δ5-desaturasa de Mortierella alpina. 0029 SEC ID NO:7 – SEC ID NO:13 muestran las secuencias de aminoácidos que se relacionan con Δ6desaturasa de Mortierella alpina. 0030 SEC ID NO:14 muestra la secuencia de aminoácidos deducida de un fragmento de PCR del Ejemplo 1. 0031 SEC ID NO:15 – SEC ID NO:18 muestran las secuencias de aminoácidos que se relacionan con Δ5- y Δ6
desaturasas de Mortierella alpina. 0032 SEC ID NO:19 y SEC ID NO:30 muestran secuencias de cebadores de PCR. 0033 SEC ID NO:31 – SEC ID NO:37 muestran secuencias de nucleótidos humanas. 0034 SEC ID NO:38 – SEC ID NO:44 muestra secuencias peptídicas.
5 0035 SEC ID NO:45 y SEC ID NO:46 muestran la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de una desaturasa de Dictyostelium discoideum. 0036 SEC ID NO:47 – SEC ID NO:50 muestran la secuencia de nucleótidos y aminoácidos deducidas de un clon de ADNc de Schizochytrium.
10 DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS
0037 Con el fin de asegurar un entendimiento completo de la invención, se proporcionan las siguientes definiciones: 5-desaturasa: Δ5-desaturasa es una enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 5 y 6 del 15 extremo carboxilo de una molécula de ácido graso. 6-desaturasa: Δ6-desaturasa es una enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 6 y 7 del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso. 9-desaturasa: Δ9-desaturasa es una enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 9 y 10 del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso. 20 12-desaturasa: Δ12-desaturasa es una enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 12 y 13 del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso. Ácidos Grasos: Los ácidos grasos son una clase de compuestos que contienen una cadena de hidrocarburos larga y un grupo carboxilato terminal. Los ácidos grasos incluyen los siguientes:
ÁcidoGraso
12:0
Ácido láurico
16:0
Ácido palmítico
16:1
Ácido palmitoleico
18:0
Ácido esteárico
18:1
Ácido oleico Δ9-18:1
18:2 Δ5, 9
Ácido taxoleico Δ5,9-18:2
18:2 Δ6, 9
Ácido 6,9-octadecadie-noico Δ6,9-18:2
18:2
Ácido linoleico Δ9,12-18:2 (LA)
18:3 Δ6, 9, 12
Ácido gamma-linoleico Δ6,9,12-18:3 (GLA)
18:3 Δ5, 9, 12
Ácido pinolénico Δ5,9,12-18:3
18:3
Ácido alfa-linolénico Δ9, 12, 15-18:3 (ALA)
18:4
Ácido estearidónico Δ6,9,12,15-18:4 (SDA)
20:0
Ácido araquídico
20:1
Ácido eicoscénico
22:0
Ácido behéhico
22:1
Ácido erúcico
22:2
Ácido docasadienoico
20:4 ω6
Ácido araquidónico Δ5,8,11,14-20:4 (ARA)
20:3 ω6
ω6-eicosatrienoico dihomo-gamma-linolénico Δ8,11,14-20:3 (DGLA)
20:5 ω3
Eicosapentaenoico (ácido timnodónico) Δ5,8,11,14,17-20:5 (EPA)
20:3 ω3
ω3-eicosatrienoico Δ11,16,17-20:3
20:4 ω3
ω3-eicosatrienoico Δ8,11,14,17-20:4
22:5 ω3
Docosapentaenoico Δ7,10,13,16,19-22:5 (ω3DPA)
22:6 ω3
Docosahexaenoico (ácido cervónico) Δ4,7,10,13,16,19-22:6 (DHA)
24:0
Ácido lignocérico
Teniendo en cuenta estas definiciones, la presente invención se refiere a nuevas construcciones de ADN, métodos y composiciones que permiten la modificación del contenido de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga de 30 células de plantas. Las células de plantas se transforman con un cassette de expresión que comprende un ADN que codifica un polipéptido capaz de aumentar la cantidad de uno o más PUFA en una célula vegetal. Deseablemente, las construcciones de integración se pueden preparar para que proporcionen la integración del cassette de expresión en el genoma de una célula hospedadora. Las células hospedadoras se manipulan para expresar un ADN sentido o antisentido que codifica un polipéptido o polipéptidos que tiene actividad desaturasa. Por “desaturasa” se 35 entiende un polipéptido que comprende la secuencia de 457 aminoácidos representada en la SEC ID NO:2 que
puede desaturar uno o más ácidos grasos para producir un ácido graso mono-o poliinsaturado o un precursor del mismo de interés. Por “polipéptido” se entiende cualquier cadena de aminoácidos que comprende la secuencia de 457 aminoácidos representada en la SEC ID NO:2, independientemente de la longitud o modificación posttraduccional, por ejemplo, glicosilación o fosforilación. El sustrato o sustratos para la enzima expresada pueden ser producidos por la célula hospedadora o se pueden suministrar exógenamente.
0038 Para lograr la expresión en una célula hospedadora, el ADN transformado se asocia operativamente con regiones reguladoras de iniciación y terminación de la transcripción y traducción que son funcionales en la célula hospedadora. Las construcciones que comprenden el gen a expresar pueden proporcionar la integración en el genoma de la célula hospedadora o pueden replicarse autónomamente en la célula hospedadora. Para la producción de ácido linoleico (LA), los cassettes de expresión utilizados generalmente incluyen un cassette que proporciona actividad de Δ12-desaturasa, particularmente en una célula huésped que produce o puede captar ácido oleico. Para la producción de ALA, los cassettes de expresión utilizados generalmente incluyen un cassette que proporciona actividad de desaturasa Δ15 o ω3, particularmente en una célula huésped que produce o puede captar LA. Para la producción de GLA o SDA, los cassettes de expresión utilizados generalmente incluyen un cassette que proporciona actividad de desaturasa Δ6, particularmente en una célula huésped que produce o puede captar LA o ALA, respectivamente. La producción de ácido grasos insaturados del tipo ω6, tales como LA o GLA, se favorece en una planta capaz de producir ALA mediante la inhibición de la actividad de una desaturasa del tipo Δ15 o ω3; esto se consigue proporcionando un cassette de expresión para un transcrito Δ15 o ω3 antisentido o mediante la alteración de un gen de la desaturasa Δ15 o ω3. De forma similar, la producción de LA o ALA está favorecida en una planta que tiene actividad desaturasa Δ6 mediante la disposición de un cassette de expresión para un transcrito Δ6 antisentido o mediante la alteración de un gen de Δ6 desaturasa. La producción de ácido oleico está favorecida asimismo en una planta que tiene actividad Δ12 desaturasa mediante la disposición de un cassette de expresión para un transcrito Δ12 antisentido o mediante la alteración de un gen de Δ12 desaturasa. Para la producción de ARA, el cassette de expresión utilizado generalmente proporciona actividad de Δ5-desaturasa, particularmente en una célula hospedadora que produce o que puede captar DGLA. La producción de ácidos grasos insaturados tipo ω6, tales como ARA, se favorece en una planta capaz de producir ALA inhibiendo la actividad de una desaturasa Δ15 o tipo ω3; esto se lleva a cabo proporcionando un cassette de expresión para un transcrito Δ15 o ω3 antisentido,
o alterando un gen de Δ15 o ω3-desaturasa.
PRODUCCIÓN DE ÁCIDOS GRASOS EN PLANTA TRANSGÉNICA
0039 La producción de PUFAs en plantas transgénicas ofrece varias ventajas sobre la purificación de fuentes naturales tales como peces o plantas. La producción de ácidos grasos procedentes de plantas recombinantes proporciona la capacidad de alterar el perfil de ácidos grasos que se presentan naturalmente en la planta proporcionando nuevas rutas sintéticas en el hospedador o suprimiendo rutas no deseadas, aumentando de esta manera los niveles de PUFAs deseados, o formas conjugadas de los mismos, y disminuyendo los niveles de PUFAs no deseados. La producción de ácidos grasos en plantas transgénicas también ofrece la ventaja de que la expresión de genes desaturasa en tejidos y/o partes particulares de plantas significa que se pueden lograr niveles muy aumentados de los PUFAs, haciendo la recuperación a partir de estos tejidos más económica. Por ejemplo, los PUFAs deseados se pueden expresar en semilla; procedimientos de aislamiento de los aceites de semilla están bien establecidos. Además, proporcionando una fuente para la purificación de los PUFAs deseados del aceite de semilla se pueden manipular a través de la expresión de genes desaturasa, ya sea solos o en combinación con otros genes tales como elongasas, para proporcionar aceites de semillas que tienen un perfil de PUFAs en forma concentrada. Los aceites de semilla concentrados se pueden añadir a leches animales y/o a leches sintéticas o semisintéticas para servir como fórmulas para lactantes cuando es imposible el amamantamiento humano o no deseado, o en casos de desnutrición o enfermedad tanto de niños como de adultos.
0040 Son interesantes para la producción de PUFAs varios polipéptidos, en particular desaturasas, incluyendo los polipéptidos que catalizan la conversión del ácido esteárico a ácido oleico, LA a GLA, de ALA a SDA, de ácido oleico a LA, o de LA a ALA, que incluye enzimas que desaturan en las posiciones Δ6, Δ9, Δ12, Δ15, o ω3 dependiendo de la célula hospedadora, la disponibilidad de sustrato, y el (los) producto(s) final(es) deseado(s). Las consideraciones para elegir un polipéptido específico que tenga actividad desaturasa incluyen el pH óptimo del polipéptido, ya sea que el polipéptido es una enzima que limita la velocidad o un componente de la misma, o si la desaturasa usada es esencial para la síntesis de un ácido graso poliinsaturado deseado, y/o cofactores requeridos por el polipéptido. El polipéptido expresado, preferiblemente, tiene parámetros compatibles con el ambiente bioquímico de su ubicación en la célula hospedadora. Por ejemplo, el polipéptido puede tener que competir por el sustrato con otras enzimas en la célula hospedadora. Por lo tanto, se consideran los análisis de Km. y la actividad específica del polipéptido en cuestión para determinar la conveniencia de un polipéptido dado para modificar la producción de PUFAs en una determinada célula hospedadora. El polipéptido usado en una situación particular es el que pueda funcionar en las condiciones presentes en la célula hospedadora pretendida, pero, de otra manera, puede ser cualquier polipéptido que tenga actividad desaturasa la cual tenga la característica deseada de ser capaz de modificar la producción relativa de un PUFA deseado. Un esquema para la síntesis del ácido araquidónico (20:4 Δ5, 8, 11, 14) a partir de ácido palmítico (C16) se muestra en la Figura 1. Una enzima clave en esta ruta es la Δ5-desaturasa que convierte el ácido DH-γ-linolénico (DGLA, ácido eicosatrienoico) en ARA. También se muestra la conversión de ácido α-linolénico (ALA) mediante una Δ6-desaturasa. La producción de PUFAs, además de ácido araquidónico, incluyendo EPA y DHA se muestra en la Figura 2. Una enzima clave en la síntesis del ácido araquidónico (20:4 Δ5, 8, 11, 14) a partir de ácido esteárico (C18) es la Δ6-desaturasa que convierte el ácido linolénico en ácido γ-linolénico. También se muestra la conversión de ácido α-linolénico (ALA) en ácido estearidónico mediante una Δ6-desaturasa. Para la producción de ARA, la secuencia de ADN usada codifica un polipéptido que tiene actividad Δ5-desaturasa. En casos particulares, esta se puede acoplar a un cassette de expresión que proporciona la producción de un polipéptido que tiene actividad Δ6-desaturasa y, opcionalmente, un cassette de transcripción para la producción de secuencias antisentido a un producto de transcripción de Δ15. La elección de la combinación de cassettes usadas depende, en parte, del perfil del PUFA de la célula hospedadora. Cuando la actividad Δ5-desaturasa de la célula hospedadora es limitante, la sobreexpresión de Δ5-desaturasa sola, será generalmente suficiente para conseguir la producción de ácido araquidónico aumentada.
FUENTES DE POLIPÉPTIDOS QUE TIENEN ACTIVIDAD DESATURASA
0041 Como fuentes de polipéptidos que tengan actividad desaturasa y oligonucleótidos que codifiquen tales polipéptidos están organismos que producen un ácido graso poliinsaturado deseado. Como ejemplo, los microorganismos que tienen capacidad para producir ARA se pueden usar como una fuente de genes de Δ5desaturasa; microorganismos que tienen capacidad para producir GLA o SDA se pueden utilizar como fuente de genes de Δ6-desaturasa y/o Δ12-desaturasa. Dichos microorganismos incluyen, por ejemplo, los que pertenecen a los géneros Mortierella Conidiobolus, Phytium, Phytophathora, Penicillium, Porphyridium, Coidosporium, Mucor, Fusarium, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula y Entomophthora. Dentro del género Porphyridium, es de particular interés Porphyridium cruentum. Dentro del género Mortierella son de particular interés Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila, Mortierella ramanniana, var. Angulispora, y Mortierella alpina. Dentro del género Mucor son de particular interés Mucor circinelloides y Mucor javanicus.
0042 Los ADN que codifican las desaturasas deseadas se pueden identificar de varias maneras. Como ejemplo, una fuente de la desaturasa deseada, por ejemplo bibliotecas genómicas o de ADNc procedentes de Mortierella, se seleccionan con sondas detectables enzimáticamente o químicamente sintetizadas, que se pueden preparar de ADN, ARN, o nucleótidos que no se encuentran de manera natural o mezclas de los mismos. Las sondas se pueden sintetizar enzimáticamente a partir de ADN de desaturasas conocidas por métodos de hibridación normales o de rigor reducido. Las sondas de oligonucléotidos también se pueden usar para analizar fuentes y se pueden basar en secuencias de desaturasas conocidas, incluyendo las secuencias conservadas entre desaturasas conocidas, o en secuencias de péptidos obtenidas a partir de la proteína purificada deseada. Las sondas de oligonucléotidos basadas en secuencias de aminoácidos se pueden degenerar para abarcar la degeneración del código genético, o pueden inclinarse a favor de los codones preferidos del organismo fuente. También se pueden usar los oligonucléotidos como cebadores para la PCR a partir de ARNm transcrito inverso procedente de una fuente conocida o sospechosa; el producto de PCR puede ser ADNc de longitud completa o se puede usar para generar una sonda para obtener el ADNc de longitud completa deseado. De manera alternativa, se puede secuenciar completamente una proteína deseada y se puede llevar a cabo la síntesis total del ADN que codifica ese polipéptido.
0043 Una vez se ha aislado el ADNc o genómico deseado se puede secuenciar por procedimientos conocidos. Se reconoce en la técnica que dichos procedimientos están sujetos a errores, tales como el secuenciamiento múltiple de la misma región como rutina y se espera todavía conducir a regímenes medibles de errores en la secuencia deducida resultante, particularmente en regiones que tienen dominios repetidos, estructura secundaria extensa, o composiciones de bases inusuales, tales como regiones con alto contenido de bases GC. Cuando surgen discrepancias, se puede hacer el resecuenciamiento y se pueden emplear procedimientos especiales. Los procedimientos especiales pueden incluir alteración de condiciones de secuenciación usando: diferentes temperaturas; diferentes enzimas; proteínas que alteran la capacidad de los oligonucléotidos para formar estructuras de orden superior; nucleótidos alterados tales como ITP o Dgtp metilado; diferentes composiciones de gel, por ejemplo formamida añadida; diferentes cebadores o cebadores localizados a diferentes distancias de la región problema; o diferentes patrones tales como ADN de una sola cadena. También se puede emplear el secuenciamiento de ARNm.
0044 Para la mayor parte, alguna o toda la secuencia de codificación del polipéptido que tiene actividad desaturasa procede de una fuente natural. En algunas situaciones, sin embargo, es deseable modificar toda o una parte de los codones, por ejemplo, para aumentar la expresión, empleando los codones preferidos hospedadores. Los codones preferidos hospedadores se pueden determinar a partir de los codones de mayor frecuencia en las proteínas expresadas en la cantidad más grande en una especie hospedadora particular de interés. De esta manera, se puede sintetizar en todo o en parte, la secuencia de codificación para un polipéptido. Todo o porciones del ADN también se pueden sintetizar para eliminar cualquiera de las secuencias desestabilizantes o regiones de estructura secundaria que estarían presentes en el ARNm transcrito. Todo o porciones del ADN también se pueden sintetizar para alterar la composición de la base a una más preferible en la célula hospedadora deseada. Los procedimientos para sintetizar secuencias y poner las secuencias juntas están muy bien establecidos en la literatura. Se pueden emplear la mutagénesis y la selección in vitro, la mutagénesis dirigida a locus, u otros elementos para obtener mutaciones de genes desaturasa que se presenten de manera natural para producir un polipéptido que tenga actividad desaturasa in vivo con más parámetros físicos y cinéticos más deseables para funcionar en la célula hospedadora, tales como la vida media más larga o una velocidad mayor de producción de un ácido graso poliinsaturado deseado.
0045 Los ADNc deseables tienen menos del 60% de composición A+T, preferiblemente menos del 50% de composición A+T. En una escala localizada de ventana de deslizamiento de 20 pares de bases, es preferible que no haya regiones localizadas de ADNc con más del 75% de composición A+T; con una ventana de 60 pares de bases, es preferible que no haya regiones localizadas con ADNc mayor del 60%, más preferiblemente ninguna región localizada con más del 55% de composición A+T.
Desaturasas de Mortierella alpina
0046 De particular interés es la Δ5-desaturasa, Δ6-desaturasa y Δ12-desaturasa de Mortierella alpina. La Δ5desaturasa tiene 446 aminoácidos; la secuencia de aminoácidos se muestra en la Figura 7. El gen que codifica la Δ5-desaturasa de Mortierella alpina se puede expresar en microorganismos transgénicos para efectuar una mayor síntesis de ARA a partir de DGLA. También se pueden usar otros ADN que son sustancialmente idénticos en secuencia al ADN de Δ5-desaturasa de Mortierella alpina, o que codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos en secuencia al polipéptido de Δ5-desaturasa de Mortierella alpina. La Δ6-desaturasa de Mortierella alpina tiene 457 aminoácidos y un peso molecular predicho de 51,8 kD; la secuencia de aminoácidos se muestra en la figura 3. El gen que codifica la Δ6-desaturasa de Mortierella alpina se puede expresar en plantas o animales transgénicos para efectuar una mayor síntesis de GLA a partir de ácido linoleico o de ácido estearidónico (SDA) a partir de ALA. También se pueden usar otros ADN que son sustancialmente idénticos en secuencia al ADN de Δ6desaturasa de Mortierella alpina, o que codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos en secuencia al polipéptido de Δ6-desaturasa de Mortierella alpina.
[0047] La Δ12-desaturasa de Mortierella alpina tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 5. El gen que codifica la Δ12-desaturasa de Mortierella alpina se puede expresar en plantas o animales transgénicos para efectuar una mayor síntesis de LA a partir de ácido oleico. También se pueden usar otros ADN que son sustancialmente idénticos al ADN de Δ12-desaturasa de Mortierella alpina, o que codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos al polipéptido de Δ12-desaturasa de Mortierella alpina.
0048 Por sustancialmente idéntica en secuencia se entiende una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácidos nucleicos que exhibe en orden de preferencia creciente al menos el 60%, 80%, 90% o 95% de homología con la secuencia de aminoácidos de Δ5-desaturasa de Mortierella alpina o secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos. Para polipéptidos, la longitud de las secuencias de comparación es, generalmente, de al menos 16 aminoácidos, preferiblemente al menos 20 aminoácidos, o más preferiblemente 35 aminoácidos. Para ácidos nucleicos, la longitud de las secuencias de comparación generalmente es de al menos 50 nucleótidos, preferiblemente al menos 60 nucleótidos, y más preferiblemente al menos 75 nucleótidos, y más preferiblemente 110 nucleótidos. La homología típicamente se mide utilizando un software de análisis de secuencia, por ejemplo, el paquete de software de análisis de secuencia de Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wisconsin 53715), y MacVector (Oxford Molecular Group, 2105 S. Bascom Avenue, Suite 200, Campbell, California 95008). Dicho software compara secuencias similares asignando grados de homología con varias sustituciones, deleciones, y otras modificaciones. Las sustituciones conservativas incluyen, típicamente, sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Las sustituciones también se pueden hacer en base a la hidrofobicidad o hidrofilicidad conservada (Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982), o con base a la capacidad para asumir una estructura secundaria de polipéptido similar (Chou y Fasman, Adv. Enzymol. 47:45148, 1978).
Otras desaturasas
0049 En el presente documento se describen desaturasas relacionadas del mismo o de otros organismos. Estas desaturasas relacionadas incluyen variantes de las Δ-, Δ6- y Δ12-desaturasas descritas que se encuentran de manera natural dentro de la misma o de diferentes especies de Mortierella, así como homólogos de la Δ5-desaturasa descrita a partir de otras especies y de proteínas relacionadas evolutivamente que tienen actividad desaturasa. También se incluyen desaturasas que, aunque no son sustancialmente idénticas a la Δ5-desaturasa de Mortierella alpina, desaturan una molécula de ácido graso en el carbono 5, 6 ó 12, respectivamente, del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso. Las desaturasas relacionadas se pueden identificar por su capacidad para funcionar sustancialmente igual que las desaturasas descritas; es decir, todavía son capaces de convertir de manera efectiva DGLA en ARA, LA en GLA, ALA en SDA o ácido oleico en LA. Las desaturasas relacionadas también se pueden identificar analizando bases de datos de secuencias para determinar secuencias homólogas a la desaturasa descrita, mediante la hibridación de una sonda basada en la desaturasa descrita a una biblioteca construida a partir del organismo fuente, o mediante RT-PCR usando ARNm del organismo fuente y cebadores basados en la desaturasa descrita. Estas desaturasas incluyen las de humanos, Dictyostelium discoideum y Phaeodactylum
tricornum.
0050 Las regiones de un polipéptido desaturasa, importantes para la actividad desaturasa se pueden determinar a través de mutagénesis de rutina, expresión de los polipéptidos mutantes resultantes y determinación de sus actividades. Los mutantes pueden incluir supresiones, inserciones y mutaciones puntuales, o combinaciones de las mismas. Un análisis funcional típico comienza con la mutagénesis de supresión para determinar los límites terminales de N y C de la proteína necesaria para la función, y luego supresiones internas, inserciones o mutantes puntuales se hacen para determinar, además, las regiones necesarias para la función. También se pueden usar otras técnicas tales como mutagénesis de cassette o síntesis total. La mutagénesis de supresión se lleva a cabo, por ejemplo, usando exonucleasas para eliminar secuencialmente las regiones de codificación 5’ o 3’. Existen kits disponibles para estas técnicas. Después de la supresión, la región de codificación se completa ligando oligonucléotidos que contienen codones de inicio o de parada con la región de codificación suprimida después de la supresión 5’ o 3’, respectivamente. De manera alternativa, los oligonucléotidos que codifican codones de inicio o de parada se insertan en la región de codificación mediante una variedad de procedimientos que incluyen mutagénesis dirigida al sitio, PCR o mediante ligación sobre el ADN digerido en sitios de restricción existentes. Las supresiones internas se pueden hacer, de manera similar, a través de una variedad de procedimientos que incluyen el uso de sitios de restricción existentes en el ADN, mediante el uso de cebadores mutagénicos vía mutagénesis dirigida al sitio o PCR mutagénica. Las inserciones se realizan a través de procedimientos tales como mutagénesis de rastreoenlazador, mutagénesis dirigida al sitio o PCR mutagénica. Las mutaciones puntuales se hacen a través de técnicas tales como mutagénesis dirigida al sitio o PCR mutagénica.
0051 La mutagénesis química también se puede usar para identificar regiones de un polipéptido desaturasa importantes para su actividad. Se expresa una construcción mutada, y se prueba la capacidad de la proteína alterada resultante para funcionar como una desaturasa. Dicho análisis de estructura-función puede determinar qué regiones se pueden suprimir, qué regiones toleran inserciones, y qué mutaciones puntuales permiten que la proteína mutante funcione sustancialmente de la misma manera que la desaturasa nativa. Todas las proteínas mutantes y secuencias de nucleótidos que los codifican están dentro del alcance de la presente invención.
EXPRESIÓN DE GENES DE DESATURASA
0052 Una vez se ha obtenido el ADN que codifica un polipéptido desaturasa, se coloca en un vector capaz de replicación en una célula hospedadora, o se propaga in vitro por medio de técnicas tales como PCR o PCR larga. Los vectores replicantes pueden incluir plásmidos, fagos, virus, cósmidos y similares. Los vectores deseables incluyen aquellos útiles para mutagénesis del gen de interés o para la expresión del gen de interés en las células hospedadoras. La técnica de PCR larga ha hecho posible la propagación in vitro de construcciones grandes, de manera que las modificaciones del gen de interés, tales como la mutagénesis o adición de señales de expresión, y la propagación de las construcciones resultantes se puede presentar enteramente in vitro sin el uso de un vector de replicación o en una célula hospedadora.
0053 Para la expresión de un polipéptido desaturasa, las regiones de iniciación y finalización funcionales de la transcripción y traducción funcional están operativamente unidas al ADN que codifica el polipéptido desaturasa. Las regiones de iniciación y finalización de la transcripción y traducción se derivan de una variedad de fuentes no exclusivas, incluyendo el ADN que se va a expresar, genes conocidos o sospechosos que son capaces de expresarse en el sistema deseado, vectores de expresión, síntesis química, o de un locus endógeno en una célula hospedadora. La expresión en un tejido vegetal y/o parte de planta presenta ciertas eficiencias, particularmente cuando el tejido o la parte es uno que se cosecha fácilmente tal como semilla, hojas, frutos, flores, raíces, etc. La expresión se puede dirigir a la localización dentro de la planta usando secuencias reguladoras específicas, tales como las de USPN 5,943,674, USPN 4,943,674, USPN 5,106,739, USPN 5,175,095, USPN 5,420,034, USPN 5,188,958, Y USPN 5,589,379. Alternativamente, la proteína expresada puede ser una enzima que produce un producto el cual se puede incorporar, ya se de manera directa o después de modificaciones adicionales, en una fracción de fluido de la planta hospedadora. En el presente caso, la expresión de genes desaturasa, o transcritos desaturasa antisentido pueden alterar los niveles de PUFAs específicos, o derivados de los mismos, encontrados en partes de plantas y/o tejidos vegetales. La región de codificación del polipéptido Δ5-desaturasa se expresa ya sea por sí misma o con otros genes, con el fin de producir partes de tejidos y/o plantas que contienen proporciones más altas de PUFA deseados o en los cuales la composición de PUFA se parecen más estrechamente a la leche materna humana (Prieto et al., TCP publicación WO 95/24494). La región de terminación se puede derivar de la región 3’ del gen a partir del cual se obtuvo la región de iniciación o de un gen diferente. Se conoce un gran número de regiones de terminación y se ha encontrado que son satisfactorias en una variedad de hospedadores del mismo y de diferentes géneros y especies. La región de terminación usualmente se selecciona más como asunto de conveniencia que como cualquier propiedad particular.
0054 La elección de una célula hospedadora está influenciada en parte por el perfil de PUFA deseado de la célula transgénica, y el perfil original de la célula hospedadora. Como ejemplo, para la producción de ácido linoleico a partir de ácido oleico, la secuencia de ADN utilizada codifica un polipéptido que tiene actividad de Δ12-desaturasa y para la producción de GLA a partir de ácido linoleico, la secuencia de ADN utilizada codifica un polipéptido que tiene actividad de Δ6-desaturasa. Se puede utilizar una célula huésped que expresa actividad de Δ12-desaturasa y carece
o no presenta actividad de Δ15-desaturasa, con un cassette de expresión que proporciona la sobreexpresión de Δ6desaturasa sola generalmente es suficiente para proporcionar una mayor producción de GLA en la célula transgénica. Cuando la célula hospedadora expresa actividad de Δ9-desaturasa, la expresión de una Δ12desaturasa y una Δ6-desaturasa puede proporcionar una mayor producción de GLA. En casos particulares en los que la expresión de actividad de Δ6-desaturasa está acoplada con la expresión de la actividad de Δ12-desaturasa, es deseable que la célula huésped tenga de forma natural, o se mute para tener, una actividad de Δ12-desaturasa baja. Alternativamente, una célula huésped para la expresión de Δ6-desaturasa puede tener, o se puede mutar para tener, una actividad elevada de Δ12-desaturasa.
0055 La expresión en una célula hospedadora se puede llevar a cabo de una manera transitoria o estable. La expresión transitoria puede suceder a partir de construcciones introducidas que contienen señales de expresión funcionales en la célula hospedadora, pero dichas construcciones no se replican y raramente se integran en la célula hospedadora, o en donde la célula huésped no prolifera. La expresión transitoria también se puede llevar a cabo induciendo la actividad de un promotor regulable unido operativamente al gen de interés, aunque estos sistemas inducibles frecuentemente exhiben un nivel basal bajo de expresión. La expresión estable se puede lograr mediante la introducción de una construcción que puede integrarse en el genoma del hospedador o que se replica autónomamente en la célula hospedadora. La expresión estable del gen de interés se puede seleccionar a través del uso de un marcador seleccionable localizado o transfectado con la construcción de expresión, seguido de la selección de células que expresan el marcador. Cuando la expresión es resultado de la integración, puede suceder la integración de construcciones aleatoriamente dentro del genoma hospedador o se puede dirigir a través del uso de construcciones que contienen regiones de homología con el genoma hospedador suficientes para dirigir la recombinación con el locus hospedador. Cuando se dirigen las construcciones a un locus endógeno, el locus endógeno puede proporcionar todas o algunas de las regiones reguladoras de transcripción y de traducción.
0056 Cuando se desea una expresión aumentada del polipéptido desaturasa en el organismo fuente, se pueden emplear varios procedimientos. Los genes adicionales que codifican el polipéptido desaturasa se pueden introducir en el organismo hospedador. La expresión del locus de desaturasa nativa también se puede aumentar a través de la recombinación homóloga, por ejemplo insertando un promotor más fuerte en el genoma hospedador para causar una expresión aumentada, eliminando secuencias desestabilizantes ya sea del ARNm o de la proteína codificada suprimiendo esa información del genoma hospedador, o añadiendo secuencias estabilizantes al ARNm (véase USPN 4,910,141, y USPN 5,500,365).
0057 Cuando se desea expresar más de un gen diferente, regiones reguladoras adecuadas y procedimientos de expresión, se pueden propagar genes introducidos en la célula hospedadora a través del uso de vectores de replicación o mediante la integración en el genoma hospedador. Cuando se expresan dos o más genes de vectores de replicación separados, es deseable que cada vector tenga un medio diferente de réplica. Cada construcción introducida, ya sea integrada o no, deberá tener un medio diferente de selección y deberá carecer de homología con las otras construcciones para mantener estable la expresión y evitar la reclasificación de elementos entre las construcciones. Se pueden determinar experimentalmente elecciones juiciosas de regiones reguladoras, medios de selección y procedimiento de propagación de la construcción introducida, de manera que todos los genes introducidos se expresen en los niveles necesarios para proporcionar la síntesis de los productos deseados.
0058 Las construcciones que comprenden el gen de interés se pueden introducir en una célula hospedadora mediante técnicas estándar. Estas técnicas incluyen transfección, infección, impacto bolístico, electroporación, microinyección, raspado, o cualquier otro procedimiento que introduzca el gen de interés en la célula hospedadora (ver USPN 4,743,548, USPN 4,795,855, USPN 5,068,193, USPN 5,188,958, USPN 5,463,174, USPN 5,565,346 y USPN 5,565,347). Por conveniencia, una célula hospedadora que ha sido manipulada mediante cualquier procedimiento para recoger una secuencia de ADN o una construcción será referida como “transformada” o “recombinante”. El hospedador sujeto tendrá al menos una copia de la construcción de expresión y puede tener dos
o más, dependiendo de si el gen se integra en el genoma, se amplifica, o está presente en un elemento extracromosomal que tiene múltiples números de copias.
0059 La célula hospedadora se puede identificar por selección con un marcador contenido en la construcción introducida. Alternativamente, se puede introducir una construcción marcador separada con la construcción deseada ya que muchas técnicas de transformación introducen muchas moléculas de ADN en células hospedadoras. Típicamente, los hospedadores transformados se seleccionan por su capacidad para crecer en medios selectivos. Los medios selectivos pueden incorporar un antibiótico o carecer de un factor necesario para el crecimiento del hospedador no transformado, tal como un nutriente o factor de crecimiento. Un gen marcador introducido puede, por lo tanto, conferir resistencia a antibiótico, o codificar un factor de crecimiento o enzima esencial y permitir el crecimiento en medios selectivos cuando se expresan en el hospedador transformado. Deseablemente, son de interés la resistencia a kanamicina y el aminoglicósido G418 (ver la USP No. 5,034,322). También puede ocurrir la selección de un hospedador transformado cuando la proteína marcadora expresada se puede detectar, ya sea directamente o indirectamente. La proteína marcadora se puede expresar sola o como una fusión a otra proteína. La proteína marcadora también se puede detectar por su actividad enzimática; por ejemplo la β galactosidasa puede convertir el sustrato X-gal en un producto coloreado, y la luciferaza puede convertir la luciferina en un producto que emite luz. La proteína marcadora se puede detectar por sus características de producir luz o modificar luz; por ejemplo, la proteína verde fluorescente de Aequorea victoria fluoresce cuando se ilumina con luz azul. Se pueden usar anticuerpos para detectar la proteína marcadora o una etiqueta molecular en, por ejemplo, una proteína de interés. Las células que expresan la proteína marcadora o la etiqueta se pueden seleccionar, por ejemplo, visualmente, o por técnicas tales como FACS o adsorción usando anticuerpos.
0060 Los PUFAs producidos utilizando los métodos y composiciones de la invención se pueden encontrar en el tejido vegetal y/o parte de planta hospedadora como ácidos grasos libres o en formas conjugadas tales como acilgliceroles, fosfolípidos, sulfolípidos o glicolípidos, y se pueden extraer de la célula hospedadora a través de una variedad de medios muy conocidos en la técnica. Estos medios pueden incluir extracción con disolventes orgánicos, sonicación, extracción de fluido supercrítico usando por ejemplo dióxido de carbono, y medios físicos tales como prensas, o combinaciones de los mismos. Es de interés particular la extracción con hexano o metanol y cloroformo. Cuando se desee, la capa acuosa se puede acidificar para protonar las fracciones cargadas negativamente y mediante esto aumentar la partición de los productos deseados en la capa orgánica. Después de la extracción, los disolventes orgánicos se pueden extraer mediante evaporación bajo una corriente de nitrógeno. Cuando se aisla en formas conjugadas, los productos se pueden escindir enzimáticamente o químicamente para liberar el ácido graso libre o un conjugado menos complejo de interés, y a continuación se someten a otras manipulaciones para producir un producto final deseado. Deseablemente se escinden formas conjugadas de ácidos grasos con hidróxido de potasio.
PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS
0061 Si es necesaria mayor purificación, se pueden emplear procedimientos estándares. Estos procedimientos pueden incluir extracción, tratamiento con urea, cristalización fraccionada, HPLC, destilación fraccionada, cromatografía en gel de sílice, centrifugación o destilación de alta velocidad, o combinaciones de estas técnicas. La protección de grupos reactivos, tales como grupos ácidos o alquenilos, se puede realizar en cualquier paso a través de técnicas conocidas, por ejemplo alquilación o yodación. Los procedimientos usados incluyen la metilación de los ácidos grasos para producir ésteres metílicos. De manera similar, se pueden eliminar los grupos de protección en cualquier paso. Deseablemente, se puede llevar a cabo la purificación de fracciones que contienen ARA, DHA y EPA mediante tratamiento con urea y/o destilación fraccionada.
USOS DE LOS ÁCIDOS GRASOS
0062 Son varios los usos de los ácidos grasos de la presente invención. Se pueden encontrar sondas basadas en los ADN de la presente invención en procedimientos para aislar moléculas relacionadas o en procedimientos para detectar organismos que expresen desaturasas. Cuando se usan como sondas, los ADN o los oligonucléotidos deben ser detectables. Esto usualmente se lleva a cabo uniendo una etiqueta ya sea en un sitio interno, por ejemplo mediante la incorporación de un residuo modificado, o en el término 5’ o 3’. Estas etiquetas pueden ser directamente detectables, pueden unirse a una molécula secundaria que se etiquete detectablemente, o pueden unirse a una molécula secundaria no etiquetada y a una molécula terciaria detectablemente etiquetada; este proceso se puede extender en tanto sea práctico para lograr una señal satisfactoriamente detectable sin niveles inaceptables de señal de fondo. Los sistemas secundarios, terciarios o de puente pueden incluir el uso de anticuerpos dirigidos contra cualquier otra molécula, incluyendo etiquetas u otros anticuerpos, o pueden involucrar moléculas que estén unidas entre sí, por ejemplo un sistema de biotina-estreptavidina/avidina. Las etiquetas detectables típicamente incluyen isótopos radioactivos, moléculas que producen químicamente o enzimáticamente o alteran la luz, enzimas que producen productos de reacción detectables, moléculas magnéticas, moléculas fluorescentes o moléculas cuya fluorescencia o características emisoras de luz cambian después de la unión. Ejemplos de procedimientos de etiquetamiento se pueden encontrar en USPN 5,011,770. De manera alternativa, la unión de moléculas objetivo se puede detectar directamente midiendo el cambio en calor de la solución en la unión de una sonda al objeto mediante calorimetría de titulación isotérmica, o recubriendo la sonda o el objetivo en una superficie y detectando el cambio en dispersión de luz de la superficie producida por unir un objetivo o sonda, respectivamente, como se puede hacer con el sistema BIAcore.
0063 Los PUFA de la presente invención producidos mediante medios recombinantes son aplicables en una gran variedad de áreas. La complementación de humanos o animales con PUFAs en varias formas puede dar como resultado niveles crecientes no solo de los PUFAs añadidos, sino también en su progenie metabólica. Por ejemplo, cuando la ruta Δ6-desaturasa inherente no funciona en un individuo, el tratamiento con GLA puede no dar únicamente como resultado un aumento de los niveles de GLA, sino también de los productos corriente abajo del GLA tales como prostaglandinas (véase la Figura 1). Los complejos mecanismos reguladores pueden hacer deseable combinar varios PUFAs, o añadir diferentes conjugados de PUFAs, con el fin de evitar, controlar o superar estos mecanismos para lograr los niveles deseados de PUFAs específicos en un individuo.
0064 Los PUFAs, o derivados de los mismos, hechos por el procedimiento descrito se pueden usar como complementos dietéticos, particularmente en fórmulas para lactantes, para pacientes que sufren alimentaciónintravenosa o para evitar o tratar la desnutrición. Ácidos grasos particulares como el EPA se utilizan para alterar la composición de las fórmulas para lactantes, para replicar mejor la composición en PUFAs de la leche humana. El triglicérido predominante en la leche human se ha indicado que es el 1,3-di-oleoilo-2-palmitoilo, con 2palmitoiloglicéridos indicados absorbente mejor que el 2-oleoilo o el 2-lineoiloglicéridos (USPN 4,876,107). Típicamente, la leche materna humana tiene un perfil de ácidos grasos que comprende desde aproximadamente 0,15% a aproximadamente 0,36% como DHA, desde aproximadamente 0,03% a aproximadamente 0,13% como EPA, desde aproximadamente 0,30% hasta aproximadamente 0,88% como ARA, desde aproximadamente 0,22% hasta aproximadamente 0,67% como ácido DGLA, y desde aproximadamente 0,27% hasta aproximadamente 1,04% como ácido GLA. Una proporción preferida de GLA: DGLA: ARA en fórmulas para lactantes es de aproximadamente
1:1:4 a 1:1:1, respectivamente. Las cantidades de aceites que proporcionan estas proporciones de PUFAs se pueden determinar sin indebida experimentación por parte de los expertos en la materia. Los PUFAs o las células hospedadoras que los contienen, también se pueden usar como complementos alimenticios para animales para alterar un tejido animal o composición de ácidos grasos en la leche a uno más deseable para el consumo humano o animal.
COMPOSICIONES NUTRICIONALES
0065 La presente invención también se refiere a la producción de composiciones nutricionales. Dichas composiciones, para los objetivos de la presente memoria incluyen cualquier alimento o preparación para el consumo humano incluyendo el consumo enteral o parenteral, el cual cuando se toma en el cuerpo (a) sirve para nutrir o construir tejidos o suministrar energía y/o (b) mantener, restaurar o soportar el estado nutricional adecuado o la función metabólica.
0066 Las composiciones nutricionales comprenden al menos un aceite o ácido producido de acuerdo con la presente invención y puede estar en forma sólida o líquida. Adicionalmente, la composición puede incluir macronutrientes comestibles, vitaminas y minerales en cantidades deseadas para un uso particular. La cantidad de estos ingredientes variará dependiendo de si la composición se pretende para uso en lactantes, niños o adultos normales sanos que tengan necesidades especializadas tales como las que acompañan a ciertas patologías metabólicas (por ejemplo, trastornos metabólicos).
0067 Los ejemplos de macronutrientes que se pueden añadir a la composición incluyen pero no se limitan a grasas comestibles, carbohidratos y proteínas. Ejemplos de estas grasas comestibles incluyen pero no se limitan a aceite de coco, aceite de soja, y mono y diglicéridos. Ejemplos de estos carbohidratos incluyen pero no se limitan a glucosa, lactosa comestible y almidón de maíz hidrolizado. Adicionalmente, ejemplos de proteínas que se pueden utilizar en la composición nutricional de la invención incluyen pero no se limitan a proteínas de soja, suero electrodializado, leche descremada electrodializada, suero de leche, o hidrolizados de estas proteínas.
0068 Con respecto a las vitaminas y minerales, se pueden añadir los siguientes a las composiciones nutricionales de la presente invención: calcio, fósforo, potasio, sodio, cloro, magnesio, manganeso, hierro, cobre, zinc, selenio, yodo y vitaminas A, E, D, C y el complejo B. También se pueden añadir otras vitaminas y minerales.
0069 Los componentes utilizados en las composiciones nutricionales de la presente invención serán de origen semipurificado o purificado. Por semipurificado o purificado se entiende un material que ha sido preparado mediante la purificación de un material natural o por síntesis.
0070 Ejemplos de composiciones nutricionales producidas según la presente invención incluyen pero no se limitan a fórmulas para lactantes, complementos dietéticos, y composiciones rehidratantes. Las composiciones nutricionales de particular interés incluyen pero no se limitan a las utilizadas para la complementación enteral o parenteral en lactantes, fórmulas especializadas en lactantes, complementos para geriatría, y complementos para aquellos con dificultades gastrointestinales y/o mala absorción.
Composiciones nutricionales
0071 Una composición nutricional típica de la presente invención contendrá macronutrientes comestibles, vitaminas y minerales en cantidades deseadas para un uso particular. Las cantidades de dichos ingredientes variarán dependiendo de si la formulación se pretende para su uso en individuos normales, sanos, temporalmente expuestos a estrés, o a sujetos que tienen necesidades específicas debidas a ciertos estados de enfermedad crónicos o agudos (por ejemplo, trastornos metabólicos). Una persona experta en la materia entenderá que los componentes utilizados en una formulación nutricional de la presente invención son de origen semipurificado o purificado. Por semipurificado o purificado se entiende un material que ha sido preparado por purificación de un material natural o por síntesis. Estas técnicas son muy conocidas en el sector (véase, por ejemplo, Code of Federal Regulations for Food Ingredients and Food Processing; Recommended Dietary Allowances (Código de Reglamentos Federales para Ingredientes de Alimentos y Procesamiento de Alimentos; cantidades dietéticas recomendadas), décima edición, National Academy Press, Washington, D.C., 1989).
0072 En una realización preferida, una formulación nutricional de la presente invención es un producto nutricional entérico, más preferiblemente un producto nutricional entérico para adulto o niño. Por consiguiente, en un aspecto adicional de la invención, se da a conocer una formulación nutricional que es adecuada para aliemntar adultos o niños que experimentan estrés. La fórmula comprende, además de los PUFA de la invención, macronutrientes, vitaminas y minerales en cantidades diseñadas para proporcionar los requerimientos nutricionales diarios de adultos.
0073 Los componentes macronutricionales incluyen grasas comestibles, carbohidratos y proteínas. Las grasas comestibles de ejemplo incluyen aceite de coco, aceite de soja, mono y diglicéridos y aceites PUFA producidos por la invención. Ejemplos de carbohidratos son la glucosa, lactosa comestible y almidón de maíz hidrolizado. Una fuente de proteína típica sería la proteína de soja, el suero electrodializado o la leche descremada electrodializada o el suero de leche, o los hidrolizados de estas proteínas, aunque también están disponibles otras fuentes de proteínas y se pueden usar. Estos macronutrientes se añadirían en forma de compuestos nutricionales comúnmente aceptados en una cantidad equivalente a los de la leche humana o una base de energía, es decir, con base por caloría.
0074 Los procedimientos para fórmulas nutritivas líquidas y entéricas son muy conocidos en la técnica y se describen con detalle en los ejemplos.
0075 La fórmula entérica se puede esterilizar y utilizar posteriormente en una base lista para alimentar o almacenar en un líquido o polvo concentrado. El polvo se puede preparar por rociado secando la fórmula enteral preparada como se indica anteriormente, y la fórmula se puede reconstruir rehidratando el concentrado. Las fórmulas nutricionales para adultos y lactantes son muy conocidas en la técnica y están comercialmente disponibles (v.gr., Similac®, Ensure®, Jevity® y Alimentum® de Ross Products División, Abbot Laboratories). Se puede añadir a cualquiera de estas fórmulas un aceite o ácido de la presente invención, en las cantidades descritas más adelante.
0076 La densidad de energía de la composición nutricional cuando está en forma líquida, puede variar típicamente desde aproximadamente 0,6 kilocalorías a 3 kilocalorías por mL. Cuando está en forma sólida o en polvo, el complemento nutricional puede contener desde aproximadamente 1,2 hasta más de 9 kilocalorías por gm, preferiblemente de 3 a 7 kilocalorías por gm. En general, la osmolalidad de un producto líquido deberá ser menor de 700 mOsm y más preferiblemente inferior a 660 mOsm.
0077 La fórmula nutricional incluirá, típicamente, vitaminas y minerales, además de los PUFA de la invención, con el fin de ayudar en la ingestión individual de los requerimientos diarios mínimos de estas sustancias. Además de los PUFA de la lista anterior, también puede ser deseable complementar la composición nutricional con zinc, cobre, y ácido fólico además de antioxidantes. Se cree que estas sustancias también proporcionarán una elevación del sistema inmunológico estresado y, de esta manera, proporcionará otros beneficios al individuo. La presencia de zinc, cobre o ácido fólico es opcional y no es necesaria para conseguir los efectos beneficiosos de la supresión inmunológica. Igualmente, una composición farmacéutica se puede complementar con estas mismas sustancias.
0078 En una realización más preferida, la fórmula nutricional contiene, además del sistema antioxidante y del componente PUFA, una fuente de carbohidrato en donde el menos el 5% en peso del carbohidrato es un oligosacárido indigerible. Todavía en una realización más preferida, la composición nutricional contiene, adicionalmente, proteína, taurina y carnitina.
0079 Los PUFA, o derivados de los mismos, preparados por el procedimiento se pueden usar como complementos
o sustitutos dietéticos, particularmente en fórmulas para lactantes, para pacientes que sufren alimentación intravenosa o para evitar o tratar la desnutrición. Típicamente, la leche materna humana tiene un perfil de ácidos grasos que comprende desde aproximadamente 0,15% hasta aproximadamente 0,36% como DHA, desde aproximadamente 0,03% hasta aproximadamente 0,13% como EPA, desde aproximadamente 0,30% hasta aproximadamente 0,88% como ARA, desde aproximadamente 0,22% hasta aproximadamente 0,67% como DGLA, y desde aproximadamente 0,27% hasta aproximadamente 1,04% como GLA. Adicionalmente, el triglicérido predominante en la leche humana se ha indicado que es 1,3-di-oleoil-2-palmitoilo, con 2-palmitoiloglicéridos reportados como mejor absorbidos que el 2-oleoilo o los 2-lineoiloglicéridos (USPN 4,876,107). De esta manera, los ácidos grasos tales como ARA, DGLA, GLA y/o EPA producidos por la invención se pueden usar para alterar la composición de fórmulas para lactantes para replicar mejor la composición en PUFAs de la leche materna humana. En particular, una composición oleosa para su uso en complemento farmacológico o alimentario, particularmente un sustituto o complemento de leche materna comprenderá, preferiblemente, uno o más de ARA, DGLA, GLA. Más preferiblemente, el aceite comprenderá desde aproximadamente 0,3 hasta 30% de ARA, desde aproximadamente 0,2 hasta 30% de DGLA, y desde aproximadamente 0,2 hasta aproximadamente 30% de GLA.
0080 Además de la concentración, las proporciones de ARA, DGLA y GLA se pueden adaptar para un uso final particularmente determinado. Cuando se formula como complemento o sustituto de la leche materna, se proporcionará una composición oleosa que contiene dos o más de ARA, DGLA y GLA en una proporción de aproximadamente 1:19:30 a aproximadamente 6:1:0.2, respectivamente. Por ejemplo, la leche materna de animales puede variar en proporciones de ARA:DGLA:GLA en el rango de 1:19:30 a 6:1:0,2 lo cual incluye proporciones intermedias que preferiblemente son de aproximadamente 1:1:1, 1:2:1, 1:1:4. Cuando se producen juntos en una célula hospedadora, el ajuste de la velocidad y el porcentaje de conversión de un sustrato precursor tal como GLA, DGLA a ARA se puede usar para controlar, con precisión, las proporciones de PUFAs. Por ejemplo, se puede usar una velocidad de conversión del 5% al 10% de DGLA en ARA para producir una proporción de ARA respecto DGLA de aproximadamente 1:19, mientras que se puede usar una velocidad de conversión de aproximadamente el 75% al 80% para producir una proporción de ARA respecto DGLA de aproximadamente 6:1. Por lo tanto, ya sea en un sistema de cultivo celular o en un animal hospedador, la regulación del tiempo, la extensión y la especificidad de expresión de desaturasa como se ha descrito se puede usar para modular los niveles y proporciones de PUFAs. Dependiendo del sistema de expresión usado, p.e., cultivo celular o un animal que expresa aceite(s) en su leche, también se pueden aislar y recombinar los aceites en las concentraciones y proporciones deseadas. Las cantidades de aceites que proporcionan estas proporciones de PUFAs se pueden determinar siguiendo protocolos estándares. Los PUFA, o las células hospedadoras que los contienen, también se pueden utilizar como complementos alimenticios para animales para alterar un tejido animal o composición de ácido graso de leche a uno más deseable para el consumo humano o animal.
0081 Para complemento dietético, los PUFA o los derivados de los mismos, se pueden incorporar en aceites para cocinar, grasas o margarinas formuladas de manera que en el uso normal el receptor reciba la cantidad deseada. Los PUFA también se pueden incorporar en fórmulas para lactantes, complementos nutricionales u otros productos alimenticios, y pueden encontrar uso como agentes antiinflamatorios o que rebajen el colesterol.
Composiciones farmacéuticas
0082 La presente invención también comprende una composición farmacéutica que comprende uno o más de los ácidos y/o aceites resultantes producidos según los métodos descrits en el presente documento. Más específicamente, esta composición farmacéutica puede comprender uno o más de los ácidos y/o aceites así como un portador adyuvante o vehículo estándar, bien conocido, no tóxico farmacéuticamente aceptable, tal como, por ejemplo, solución salina tamponada de fosfato, agua, etanol, polioles, aceites vegetales, un agente humectante o una emulsión tal como emulsión de agua/aceite. La composición puede estar en forma líquida o sólida. Por ejemplo, la composición puede estar en forma de una pastilla, cápsula, líquido o polvo ingerible, inyectable, o ungüento o crema tópico.
0083 Las posibles rutas de administración incluyen, por ejemplo, la oral, rectal y parenteral. La ruta de administración, desde luego, dependerá del efecto deseado. Por ejemplo, si la composición se utiliza para tratar piel áspera, seca o envejecida , para tratar piel lastimada o quemada, o para tratar piel o cabello afectado por una enfermedad o condición, tal vez se pueda aplicar tópicamente.
0084 La dosis de la composición que se va a administrar al paciente puede ser determinada por un experto ordinario en la materia y depende de varios factores tales como el peso del paciente, edad del paciente, estado inmunológico del paciente, etc.
0085 Con respecto a la forma, la composición puede ser, por ejemplo, una solución, dispersión, suspensión, emulsión o un polvo estéril que se reconstituye.
0086 Adicionalmente, la composición de la presente invención se puede utilizar para fines cosméticos. Se puede añadir a composiciones cosméticas preexistentes de manera que se forme una mezcla o se pueda usar como una composición sola.
0087 Las composiciones farmacéuticas se pueden utilizar para administrar el componente PUFA a un individuo. Las composiciones farmacéuticas adecuadas pueden comprender soluciones acuosas o no acuosas estériles fisiológicamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones y polvos estériles para su reconstitución en soluciones estériles o dispersiones para ingestión. Ejemplos de portadores, diluyentes, disolventes o vehículos acuosos y no acuosos convenientes incluyen agua, etanol, polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, y similares), mezclas convenientes de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y utilizando tensioactivos. Puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, cloruro de sodio y similares. Además de estos diluyentes inertes, la composición puede incluir también adyuvantes, tales como agentes humectantes, emulsificantes y sustancias suspensoras, edulcorantes, sustancias saborizantes y perfumantes.
0088 Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener sustancias suspensoras, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto o mezclas de estas sustancias, y similares.
0089 Las formas de dosis sólidas tales como pastillas y cápsulas se pueden preparar usando técnicas muy conocidas en la materia. Por ejemplo, los PUFA de la invención se pueden preparar en pastillas con bases de pastillas convencionales tales como lactosa, sacarosa, y almidón de maíz en combinación con aglutinantes tales como acacia, almidón de maíz o gelatina, sustancias desintegrantes tales como almidón de patata o ácido algínico y un lubricante tal como ácido esteárico o estearato de magnesio. Las cápsulas se pueden preparar incorporando estos excipientes en una cápsula de gelatina junto con antioxidantes y el componente PUFA. La cantidad de antioxidantes y el componente PUFA que deberá incorporarse en la formulación farmacéutica deberá ajustarse dentro de los límites discutidos anteriormente.
0090 Tal y como se utiliza en esta solicitud, el término "tratar" se refiere ya sea a prevenir, o reducir la incidencia de, la ocurrencia no deseada. Por ejemplo, tratar la supresión inmunológica se refiere ya sea a prevenir la ocurrencia de esta supresión o a reducir la cantidad de esta supresión. Los términos "paciente" e "individuo" se están usando intercambiablemente y ambos se refieren a un animal. El término "animal" como se usa en esta solicitud se refiere a cualquier mamífero de sangre caliente incluyendo, pero sin limitarse a perros, humanos, monos, y simios. Tal y como se usa en la solicitud el término "aproximadamente" se refiere a una cantidad que varia desde el rango o número establecido en una cantidad razonable dependiente del contexto de uso. Cualquier número o rango numérico especificado en la memoria descriptiva deberá considerarse que está modificado por el término aproximadamente.
0091 "Dosis" y "ración" se usan intercambiablemente y se refieren a la cantidad de composición nutricional o farmacéutica ingerida por el paciente en una sola toma y diseñada para administrar cantidades efectivas de antioxidantes y triglicérido estructurado. Como será fácilmente aparente para los expertos en la materia, una sola dosis o ración del polvo líquido nutricional deberá suministrar la cantidad de antioxidantes y PUFAs mencionados anteriormente. La cantidad de dosis o ración deberá estar en un volumen que un adulto típico pueda consumir de una vez. Esta cantidad puede variar ampliamente dependiendo de la edad, peso, sexo o estado médico del paciente. Sin embargo como requisito general, una sola ración o dosis del producto nutricional líquido deberá considerarse que abarca un volumen de 100 a 600 mililitros, más preferiblemente de 125 a 500 mililitros y más preferiblemente de 125 a 300 mililitros.
0092 Los PUFAs producidos por la presente invención también se pueden añadir a los alimentos aún cuando no se requiera la complementación de la dieta. Por ejemplo, la composición se puede añadir a comida de cualquier tipo incluyendo pero sin limitarse a margarinas, mantequillas modificadas, quesos, leche, yogurt, chocolate, dulces, refrigerios, aceites para ensaladas, aceites para cocinar, grasas para cocinar, carnes, pescado y bebidas.
Aplicaciones farmacéuticas
0093 Para uso farmacéutico (humano o veterinario), las composiciones se administran generalmente por vía oral pero se pueden administrar por cualquier ruta a través de la cual se puedan absorber de manera satisfactoria, por ejemplo, por vía parenteral (es decir subcutánea, intramuscular o intravenosa), rectal o vaginal o tópica, por ejemplo, como ungüento o loción para la piel. Los PUFAs producidos por la presente invención se pueden administrar solos o en combinación con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Cuando estén disponibles, las cápsulas de gelatina son la forma preferida para la administración oral. La complementación dietética como se ha descrito anteriormente también puede proporcionar una ruta de administración oral. Los ácidos insaturados de la presente invención se pueden administrar en formas conjugadas, o como sales, ésteres, amidas o profármacos de los ácidos grasos. Cualquier sal farmacéuticamente aceptable está comprendida por la presente invención; especialmente preferidas son las sales de sodio, potasio o litio. También están incluidas las sales N-alquilpolihidroxamina, tales como N-metil glucamina, encontrada en la publicación del PCT WO 96/33155. Los ésteres preferidos son los ésteres etílicos. Como sales sólidas, los ácidos también los PUFAs se pueden administrar en forma de pastilla. Para administración intravenosa, los PUFAs o derivados de los mismos se pueden incorporar en formulaciones comerciales tales como intralípidos. El perfil de ácidos grasos en plasma de un adulto típico normal comprende de 6,64 a 9,46% de ARA, de 1,45 a 3,11% de DGLA, y de 0,02 a 0,08% de GLA. Estos PUFAs o sus precursores metabólicos se pueden administrar, ya sea solos o en mezclas con otros PUFAs, para alcanzar un perfil de ácidos grasos normal en un paciente. Cuando se desee, los componentes individuales de las formulaciones se pueden proporcionar individualmente en forma de kit, para uso único o múltiple. Una dosis típica de un ácido graso particular es de 0,1 miligramos a 20 gramos, o incluso 100 gramos diariamente, y es preferiblemente de 10 miligramos a 1, 2, 5 ó 10 gramos diariamente conforme se requiera, o cantidades molares equivalentes de formas derivadas de los mismos. Las composiciones de nutrición parenteral que comprenden de aproximadamente 2 a aproximadamente 30% peso de ácidos grasos calculados como triglicéridos están comprendidas por la presente invención; se prefiere una composición que tenga de aproximadamente 1 a aproximadamente 25% en peso de la composición de PUFA total como GLA(USPN: 5,196,198). Se pueden incluir, opcionalmente, otras vitaminas, y particularmente vitaminas solubles en grasa tales como las vitaminas A, D, E Y L-carnitina. Cuando se desee, se puede añadir un conservante tal como el α-tocoferol, típicamente a aproximadamente el 0,1% en peso.
0094 Las composiciones farmacéuticas adecuadas pueden comprender soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles fisiológicamente aceptables y polvos estériles para su reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles. Ejemplos de portadores, diluyentes, solventes o vehículos acuosos y no acuosos convenientes incluyen agua, etanol, polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, y simi1ares), mezclas convenientes de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, manteniendo el tamaño de partícula requerido en casos de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, cloruro de sodio y similares. Además de estos diluyentes inertes, la composición puede también incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, emulsificantes y suspensores, edulcorantes, saborizantes y perfumantes.
0095 Las suspensiones además de los compuestos activos, pueden contener sustancias suspensoras, como por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, o mezclas de estas sustancias y similares.
0096 Una composición farmacéutica especialmente preferida contiene ésteres de ácido diacetiltartárico de monoglicéridos y diglicéridos disueltos en un medio o disolvente acuoso. Los ésteres de ácidos diacetiltartáricos de monoglicéridos y diglicéridos tienen un valor de HLB de aproximadamente 9-12 y son significativamente más hidrofílicos que los lípidos antimicrobianos existentes que tienen valores de HLB de 2-4. Esos lípidos hidrofóbicos existentes no se pueden formular en composiciones acuosas. Como se describe en el presente documento, los lípidos ahora se pueden solubilizar en medio acuoso en combinación con ésteres de ácidos diacetiltartáricos de monoglicéridos y diglicéridos. De acuerdo con esta realización, los ésteres de ácidos diacetiltartáricos de monoglicéridos y diglicéridos (por ejemplo, DATEM-C12:0) se combinan con otros lípidos antimicrobianos activos (por ejemplo, 18:2 y 12:0 monoglicéridos) y se mezclan para obtener una mezcla homogénea. La homogeneidad permite una actividad antimicrobiana aumentada. La mezcla se puede dispersar completamente en agua. Esto no es posible sin la adición de ésteres de ácidos diacetiltartáricos de monoglicéridos y diglicéridos y el premezclado con otros monoglicéridos antes de la introducción en agua. La composición acuosa se puede mezclar a continuación bajo condiciones estériles con diluyentes, conservantes, tampones o propelentes fisiológicamente aceptables según sea requerido para la preparación de un pulverizador o un inhalador.
0097 La presente invención comprende también el tratamiento de numerosos trastornos con ácidos grasos. La complementación con los PUFAs producidos por de la presente invención se puede usar para tratar la restenosis después de una angioplastia. Se pueden tratar con los PUFA de la presente invención los síntomas de inflamación, artritis reumatoide, y asma y psoriasis. La evidencia indica que los PUFAs pueden estar involucrados en el metabolismo del calcio, sugiriendo que los PUFA de la presente invención se pueden usar en el tratamiento o prevención de la osteoporosis y de cálculos en el riñón o en vías urinarias.
0098 Los PUFA producidos por la presente invención se pueden usar en el tratamiento del cáncer. Se ha demostrado que las células malignas tienen composiciones de ácidos grasos alteradas; la adición de ácidos grasos ha demostrado disminuir su crecimiento y causar muerte celular, e incrementar su susceptibilidad a las sustancias quimioterapéuticas. El GLA ha demostrado que causa reexpresión en células cancerígenas de las moléculas de adhesión celular E-cadherina, la pérdida de la cual está asociada con metástasis agresiva. Las pruebas clínicas en la administración intravenosa de sal de litio soluble en agua del GLA a pacientes con cáncer pancreático produjo aumentos estadísticamente significativos en su supervivencia. La complementación con PUFAs también puede ser útil para tratar la caquexia asociada con cáncer.
0099 Los PUFAs producidos por la presente invención también se pueden usar para tratar diabetes (USPN: 4,826,877; Horrobin y colaboradores, Am. J. Clin. Nutr. Vol. 57 (Supl.), 732S-737S). Se ha demostrado el metabolismo y composición de ácidos grasos alterados en animales diabéticos. Estas alteraciones han sugerido que están involucradas en algunas de las complicaciones a largo plazo resultantes de la diabetes, incluyendo la retinopatía, neuropatía, nefropatía y daño al sistema reproductor. El aceite de prímula, que contiene GLA, ha demostrado que previene e invierte el daño nervioso diabético.
0100 Los PUFAs producidos por la presente invención se pueden usar para tratar eczema, reducir la presión sanguínea y mejorar las calificaciones en matemáticas. Se ha sugerido que la deficiencia en ácidos grasos esenciales está implicada en los eczemas, y algunos estudios han mostrado efectos beneficiosos sobre el eczema a partir del tratamiento con GLA. El GLA también ha demostrado reducir los aumentos de presión sanguínea asociados con estrés, y mejorar el rendimiento en pruebas aritméticas. El GLA y el DGLA han mostrado inhibir la agregación de plaquetas, causar vasodilatación, niveles más bajos de colesterol e inhibir la proliferación del músculo liso de la pared de los vasos y del tejido fibroso (Brenner y colaboradores, Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 83, p. 85-101, 1976). La administración de GLA o DGLA, solo o en combinación con EPA, ha mostrado reducir o prevenir el sangrado gastrointestinal y otros efectos secundarios causados por fármacos antiinflamatorios no esteroidales (USPN: 4,666,701). GLA y DGLA también han mostrado que previenen o tratan la endometriosis y el síndrome premenstrual (USPN: 4,758,592) y tratan la encefalomielitis miálgica y fatiga crónica después de infecciones virales (USPN: 5,116,871).
0101 Otros usos de los PUFAs producidos por la presente invención incluyen el uso en el tratamiento de SIDA, esclerosis múltiple, síndrome respiratorio agudo, hipertensión y trastornos inflamatorios de la piel. Los PUFAs producidos por la invención también se pueden usar en fórmulas para la salud general así como para tratamientos geriátricos.
Aplicaciones veterinarias
0102 Debe indicarse que las composiciones farmacéuticas y nutricionales descritas anteriormente se pueden utilizar en animales, así como en humanos, ya que los animales experimentan muchas de las mismas necesidades y patologías que el ser humano. Por ejemplo, el aceite o ácidos producidos por la presente invención se pueden utilizar en complementos alimenticios para animales o como sustitutos alimenticios para animales.
0103 Los siguientes ejemplos se presentan a modo ilustrativo y no limitativo.
EJEMPLOS
0104
Ejemplo de referencia A Aislamiento de una secuencia de nucleótidos de Δ5-desaturasa de Mortierella alpina. Ejemplo 1 Aislamiento de una secuencia de nucleótidos de Δ6-desaturasa de Mortierella alpina. Ejemplo 2 Identificación de Δ6-desaturasa homóloga a la Δ6-desaturasa de Mortierella Alpina. Ejemplo de referencia B Aislamiento de una secuencia de nucleótidos de Δ12-desaturasa de Mortierella alpina. Ejemplo de referencia C Aislamiento de la Secuencia de Nucleótidos de citocromo b5 reductasa a partir de Mortierella alpina. Ejemplo 3 Expresión de clones de desaturasa de M. alpina en levadura de panadería. Ejemplo de referencia D Análisis de ácidos grasos de hojas de plantas Brassica transgénicas Ma29 Ejemplo 4 Expresión de Δ6 desaturasa de M. alpina en Brassica napus. Ejemplo de referencia E Expresión de Δ12 desaturasa de M. alpina en Brassica napus. Ejemplo 5 Expresión simultánea de Δ6 y Δ12 desaturasas de M. alpina en Brassica napus. Ejemplo 6 Expresión simultánea de Δ5 y Δ6 desaturasas de M. alpina en Brassica napus. Ejemplo 7 Expresión simultánea de Δ5, Δ6 y Δ12 desaturasas de M. alpina en Brassica napus. Ejemplo 8 Distribución estereoespecífica de aceites Δ6-desaturados. Ejemplo 9 Composiciones de ácidos grasos de plantas transgénicas. Ejemplo 10 Expresión combinada de Δ6 y Δ12- desaturasas en B. napus lograda mediante cruzamiento. Ejemplo Expresión de desaturasas de M. alpina en soja. Ejemplo de referencia F Secuencias de genes de desaturasa humana.
[0105]
Ejemplo de referencia G Identificación de homólogos de las Δ5 y Δ6 desaturasas de M. Alpina. Ejemplo de referencia H Identificación de homólogos de Δ5 y Δ6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFAs. Ejemplo de referencia I Identificación de homólogos de Δ5 y Δ6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFAs. Ejemplo 12 Composiciones nutricionales.
Ejemplo de referencia A
Aislamiento de una secuencia de nucleótidos de 5-desaturasa a partir de Mortierella alpina
0106 La Mortierella alpina produce ácido araquinódico (AAR, 20:4) a partir del precursor 20:3 mediante una Δ5desaturasa. Se obtuvo una secuencia de nucleótidos que codifica la Δ5-desaturasa de Mortierella alpina (ver la Figura 7) mediante amplificación por PCR usando la primera cadena de ADNc de M. alpina y cebadores de oligonucleótidos degenerados correspondientes a secuencias de aminoácidos conservadas entre Δ6-desaturasas de Synechocystis y Spirulina. El procedimiento usado fue el siguiente:
0107 Se aisló el ARN total de un cultivo que produce PUFAs de tres días de edad de Mortierella alpina usando el protocolo de Hoge et al.(1982), Experimental Mycology 6:225-232. Se usó el ARN para preparar ADNc de cadena doble usando el sistema Lambda-ZipLox de BRL, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se empaquetaron las fracciones de varios tamaños de ADNc de M. alpina por separado para producir bibliotecas con insertos de diferente tamaño promedio. La biblioteca de “longitud completa” contiene aproximadamente 3 x 106 clones con un tamaño de inserto promedio de 1,77 kb. La biblioteca de “grado de secuenciamiento” contiene aproximadamente 6 x 105 clones con un tamaño de inserto promedio de 1,1 kb.
0108 Se transcribieron a la inversa 5 μg del ARN total usando el SuperscriptRTasa de BRL y el cebador TSyn 5’-CCAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT-3’, (SEC ID NO:19). Se diseñaron oligonucleótidos degenerados para las regiones conservadas entre las dos secuencias de Δ6-desaturasa cianobacterianas. Los cebado res específicos usados fueron:
D6DESAT-F3(SEQ ID NO:20) 5’-CUACUACUACUACAYCAYACOTAYACOAAYAT-3' D6DESAT-R3 (SEQ ID NO:21) 5’-CAUCAUCAUCAUOGGRAAOARRTGRTG-3',
en donde Y=C+T, R=A+G, y O=I+C. Se llevó a cabo la amplificación por PCR en un volumen de 25 μL que contenía: templado derivado de 40 ng del ARN total, 2 pM de cada cebador, 200 μM de cada desoxirribonucleótido trifosfato, Tris-Cl 60 mM, pH 8,5,(NH4)2S04 15 mM, MgCl2 2 mM. Las muestras se sometieron a una etapa de desaturación inicial a 95 grados (todas las temperaturas en Celsius) durante 5 minutos, a continuación se mantuvieron a 72 grados mientras se añadían 0,2 U de Taq polimerasa. Las condiciones de termociclado de la PCR fueron las siguientes: 94 grados durante 1 minuto, 45 grados durante 1,5 minutos, 72 grados durante 2 minutos. La PCR continuó durante 35 ciclos. La PCR usando estos cebadores en la primera cadena del ADNc de M. alpina produjo un producto de reacción de 550 pares de bases. La comparación de la secuencia de aminoácidos deducida del fragmento de la PCR de M. alpina reveló regiones de homología con Δ6-desaturasas (véase la Figura 4). Sin embargo, sólo hubo aproximadamente un 28% de identidad respecto a la región comparada. La secuencia de aminoácidos deducida se presenta en SEC ID NO:14.
0109 El producto de PCR se usó como sonda para aislar los correspondientes clones de ADNc de una biblioteca de M. alpina. El clon de ADNc más largo, Ma29, fue designado como pCGN5521 y ha sido completamente secuenciado en ambas cadenas. El ADNc está contenido como un inserto de 1481 pares de bases en el vector pZL1 (Bethesda Research Laboratories) y, comenzando con el primer ATG, contiene un marco de lectura abierto que codifica 446 aminoácidos. El marco de lectura contiene la secuencia deducida del fragmento de la PCR. Se encontró que la secuencia del inserto de ADNc contenía regiones de homología para Δ6-desaturasas (véase la Figura 8). Por ejemplo, se encontró en la secuencia de Mortierella que estaban presentes tres “cajas de histidina" conservadas (que han sido observadas en desaturasas unidas a membrana (Okuley y colaboradores, (1994) The Plant Cell 6:147-158)) en las posiciones aminoacídicas 171-175, 207-212, Y 387-391 (véase la Figura 5A-5D) .Sin embargo, se encontró que el motivo aminoacídico típico "HXXHH" para la tercera caja de histidinas de la desaturasa de Mortierella era QXXHH. El amino terminal de la proteína codificada, mostró homología significativa con las proteínas citocromo b5. De esta manera, el clon de ADNc de Mortierella parece representar una fusión entre un citocromo b5 y una desaturasa de ácido graso. Puesto que se cree que el citocromo b5 funciona como donador de electrones para las enzimas desaturasas unidas a membrana, es posible que el dominio terminal N del citocromo b5 de esta proteína desaturasa esté involucrada en su función. Esto puede ser ventajoso cuando se expresa la desaturasa en sistemas heterólogos para la producción de ácidos grasos poliinsaturados.
Ejemplo 1
Aislamiento de una secuencia de nucleótidos de 6-desaturasa a partir de Mortierella alpina
0110 Se obtuvo una secuencia de ácido nucleico procedente de un clon de ADNc parcial, Ma524, que codifica una desaturasa de ácido graso Δ6 de Mortierella alpina mediante secuenciación aleatoria de clones procedentes de la biblioteca ADNc de M. alpina descrita en el Ejemplo 1. Los plásmidos que contenían ADNc se separaron como sigue:
0111 Se combinaron cinco μl de fago con 100 μl de E. coli DH10B(ZIP) cultivados en ECLB más 10 μg/ml de canamicina, 0,2% de maltosa, y Mgso4 10 mM, y se incubaron a 37 grados durante 15 minutos. Se añadieron 0,9 ml SOC y 100 μl de la bacteria inmediatamente plaqueada en cada una de las placas de 10 ECLB + 50 μg de Pen. No fue necesario un tiempo de recuperación de 45 minutos. Las placas se incubaron durante la noche a 37°C . Las colonias se recogieron en medio ECLB + 50 μg Pen para cultivos durante la noche para ser usados en la preparación de suministros de glicerol y ADN miniprep. Se almacenó una alícuota del cultivo usado para la miniprep como un suministro de glicerol. El plaqueo sobre ECLB + 50 μg Pen/ml dio como resultado más colonias y una mayor proporción de colonias que contenían insertos que el plaqueo en 100 μg/ml Pen.
0112 Se recogieron colonias aleatorias y se purificó el ADN plasmíco usando kits de miniprep Qiagen. Se obtuvo la secuencia de ADN del extremo 5’ del inserto de ADNc y se comparó con las bases de datos usando el algoritmo BLAST. Se identificó el Ma524 como una presunta desaturasa basada en la homología de secuencia de ADN con las desaturasas identificadas previamente. Se aisló un clon de ADNc de longitud completa de la biblioteca de M. alpina. La abundancia de este clon parece ser ligeramente menor (2X) que la de Ma29. Ma524 exhibe una homología significativa a una porción de un cósmido de Caenorhabditis eleqans, WO6D2.4, una proteína de fusión de citocromo b5/desaturasa de girasol, y las 2 Δ6-desaturasas en los bancos de datos públicos de Synechocystis y Spirulina.
0113 Además, Ma524 muestra una homología significativa con la secuencia de Δ6-desaturasa de borraja (publicación de PCT WO96/21022). De este modo, parece que Ma524 codifica una Δ6-desaturasa que está
relacionada con las Δ6-desaturasas de borraja y algas. Deberá indicarse que, aunque las secuencias de aminoácidos de Ma524 y de la Δ6 de borraja son similares, la composición en bases del ADNc es bastante diferente: el ADNc de borraja tiene una composición global en bases del 60% A/T, con algunas regiones que exceden el 70%, mientras que Ma524 tiene un promedio del 44% A+T de composición en bases, sin regiones que excedan el 60%. Esto puede tener implicaciones para expresar los ADNc en microorganismos o animales que favorezcan diferentes composiciones de base. Se sabe que puede tener locus una pobre expresión de genes recombinantes cuando el hospedador tiene una composición en bases muy diferente de la del gen introducido. Los mecanismos especulados para esta pobre expresión incluyen la estabilidad disminuida o la posibilidad de traducción del ARNm.
Ejemplo 2
Identificación de las 6-desaturasas_homólogas a la A6-desaturasa de Mortierella alpina
0114 Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican presuntas Δ6-desaturasa se identificaron mediante una búsqueda BLASTX de las bases de datos de EST a través de NCBI usando la secuencia de aminoácidos de Ma524. Varias secuencias mostraron homología significativa. En particular, la secuencia de aminoácidos deducida de dos secuencias de Arabidopsis thaliana,(números de acceso F13728 y T42806) mostraron homología con dos regiones diferentes de la secuencia de aminoácidos deducida de Ma524. Se diseñaron los siguientes cebadores de PCR: ATTS4723-FOR (complementario a F13728) SEC ID NO:22: 5’CUACUACUACUAGGAGTCCTCTACGGTGTTTTG y T42806-REV (complementaria a T42806) SEC ID NO:23: 5’CAUCAUCAUCAUATGATGCTCAAGCTGAAACTG. Se transcribieron a la inversa cinco μg del ARN total aislado de los siliques en desarrollo de Arabidogsis thaliana usando Supercript RTase de BRL y el cebador TSyn 5’-CCAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT-3’ (SEC ID NO:24). Se llevó a cabo la PCR en un volumen de 50 μl que contenía: un templado derivado de 25 ng de ARN total, 2 pM de cada cebador, 200 μM de cada desoxirribonucleótido trifosfato, Tris-Cl 60 mM, pH 8,5, (NH4)2SO4 15 mM, MgCl2 2 mM, 0,2 U Taq Polimerasa. Las condiciones de ciclado fueron las siguientes: 94 grados durante 30 segundos, 50 grados durante 30 segundos, 72 grados durante 30 segundos. Se continuó la PCR durante 35 ciclos seguido de una extensión adicional a 72 grados durante 7 minutos. La PCR dio como resultado un fragmento de ∼750 pares de bases el cual, subsiguientemente se subclonó, se nombró 12-5, y se secuenció. Cada extremo de este fragmento corresponde a EST de Arabidopsis de la cual se derivaron cebadores de PCR. Esta es la secuencia denominada 12-5. la secuencia de aminoácidos deducida de 12-5 se comparó con la de Ma524, y los EST de humano (W28140), ratón (W53753), y C. elegans (R05219) en la figura 4. Basándose en la homología, estas secuencias representan polipéptidos desaturasas. Los genes de longitud completa se pueden clonar usando sondas basadas en las secuencias EST. Los genes se pueden colocar a continuación, en vectores de expresión y ser expresados en células hospedadoras, y su actividad específica de Δ6- u otra desaturasa se puede determinar tal y como se describe más adelante.
Ejemplo de referencia B
Aislamiento de una secuencia de nucleótidos de 12-desaturasa de Mortierella alpina
0115 Basándose en los ácidos grasos que acumula, parece probable que la Mortierella alpina tenga una desaturasa tipo ω6. La ω6-desaturasa es responsable de la producción de ácido linóleico (18:2) a partir de ácido oleico (18:1). El ácido linóleico (18:2) es un sustrato para una Δ6-desaturasa. Este experimento se diseñó para determinar si Mortierella alpina tiene un polipéptido Δ12-desaturasa, y si es así, identificar la correspondiente secuencia de nucleótidos. Se secuenció una colonia aleatoria de l biblioteca de grado de secuenciación de M. alpina, Ma648, y se identificó como una presunta desaturasa en base a una homología en secuencia de ADN con respecto a desaturasas identificadas previamente, como se describe para Ma524 (ver el Ejemplo 2). La secuencia de aminoácidos deducida del extremo 5’ del ADNc de MA648 exhibe una homología significativa con la desaturasa microsomal de ω6 (Δ12)desaturasa de soja (número de acceso L43921) así como con un oleato 12-hidroxilasa de semilla de ricino (número de acceso U22378). Además, se observó homología cuando se comparó con una variedad de otras secuencias de desaturasas de ácidos grasos ω6 (Δ12) y ω3 (Δ15).
Ejemplo de referencia C
Aislamiento de la Secuencia de Nucleótidos de la citromo b5 reductasa a partir de Mortierella alpina
0116 Se obtuvo una secuencia de ácido nucleico que codifica una de citocromo b5 reductasa de Mortierella alpina como sigue. Se construyó una biblioteca de ADNc basada en el ARN total aislado de Mortierella alpina tal y como se ha descrito en el ejemplo l. La secuencia de ADN se obtuvo de los extremos 5’ y 3’ de uno de los clones, M12-27. Una búsqueda en bancos de datos públicos con la secuencia de aminoácidos deducida del extremo 3’ de M12-27 (ver Figura 5) reveló homología significativa con secuencias de citocromo b5 reductasa conocidas. Específicamente, sobre una región de 49 aminoácidos, el clon de Mortierella comparte 55% de identidad (73% de homología) con una citocromo b5 reductasa de cerdo (ver Figura 4).
Ejemplo 3
Expresión de clones de desaturasa de M. alpina en levaduras de panadería
5 0117 La transformación de acetato de litio de la levadura se realizó de acuerdo con protocolos estándares (Methods in Enzymology, Vol. 194, p. 186-187, 1991). Brevemente, se cultivó la levadura en YPD a 30°C. Las células se centrifugaron, se resuspendieron en TE, se centrifugaron de nuevo, se volvieron a suspender en TE que contenía 100 mM de acetato de litio, se centrifugaron de nuevo, y se volvieron a suspender en TE/acetato de litio. La
10 levadura resuspendida se incubó a 30°C durante 60 minutos con agitación. Se añadió el ADN portador y la levadura se dividió en tubos. Se añadió ADN transformante y los tubos se incubaron durante 30 minutos a 30°C. Se añadió solución PEG (35% (p/v) PEG 4000, 100 mM de acetato de litio, TE pH 7,5) seguido de 50 minutos de incubación a 30°C. Se llevó a cabo un choque de calor de 5 minutos a 42°C, las célula se aglomeraron, se lavaron con TE, se aglomeraron de nuevo y se volvieron a suspender en TE. Las células resuspendidas se plaquearon sobre medios
15 selectivos.
Expresión de desaturasas en levadura transformada
0118 Los clones de ADNc de Mortierella alpina se seleccionaron para determinar la actividad desaturasa en la
20 levadura de panificación. Se usó como control positivo una Δ15-desaturasa de canola (obtenida mediante PCR usando la primera cadena de ADNc de semillas de cultivo 212/86 de Brassica napus usando cebadores basados en la secuencia publicada (Arondel y colaboradores Science 258:1353-1355)). El gen Δ15-desaturasa y el gen del clon de ADNc Ma29 se insertaron en el vector de expresión pYES2 (Invitrogen), dando como resultado los plásmidos pCGR-2 y pCGR-4, respectivamente. Estos plásmidos se transfectaron en la cepa 334 de levadura S. Cerevisiae y
25 se expresaron después de la inducción con galactosa y en la presencia de sustratos que permitieron la detección de actividad desaturasa específica. La cepa de control fue la cepa 334 de S. cerevisiae que contenía al vector pYES2 inalterado. Los sustratos usados, los productos producidos y la actividad desaturasa indicada fueron: DGLA (conversión a ARA indicaría actividad Δ5-desaturasa), ácido linoleico (conversión a GLA indicaría actividad Δ6desaturasa; la conversión a ALA indicaría actividad Δ15-desaturasa), ácido oleico (un sustrato endógeno hecho por
30 S. cerevisiae, la conversión a ácido linoleico indicaría actividad Δ12-desaturasa, de la cual carece S. cerevisiae), o ARA(conversión en EPA indicaría actividad Δ17-desaturasa). Los resultados se proporcionan en la Tabla 1 de más abajo. Las fracciones de lípidos se extrajeron como sigue: Se hicieron crecer los cultivos durante 48-52 horas a 15°C. Las células se aglomeraron mediante centrifug ación, se lavaron una vez con ddH2O estéril, y se volvieron a aglomerar. El aglomerado se agitó con metanol; se añadió cloroformo junto con tritridecanoína (como un estándar
35 interno). Las mezclas se incubaron durante al menos 1 hora a temperatura ambiente o a 4°C durante la n oche. Se extrajo la capa de cloroformo y se filtró a través de un filtro Whatman con un gramo de sulfato de sodio anhidro para eliminar las partículas de agua residual. Se evaporaron los disolventes orgánicos a 40°C bajo una corri ente de nitrógeno. Los lípidos extraídos se derivaron en ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) para el análisis de cromatografía en gas (CG) añadiendo 2 mililitros de hidróxido de potasio 0,5 N en metanol a un tubo cerrado. Las
40 muestras se calentaron de 95°C a 100°C durante 30 m inutos y se enfriaron a temperatura ambiente. Se añadieron aproximadamente 2 mL de trifluoruro de boro al 14% en metanol y se repitió el calentamiento. Después de enfriar la mezcla de lípidos extraída, se añadieron 2 mL de agua y 1 mL de hexano para extraer los FAME para analizarlos mediante cromatografía en gas. Se calculó la conversión porcentual dividiendo el producto producido por la suma de (el producto producido y el sustrato añadido) y luego se multiplicó por 100. Para calcular la conversión porcentual de
45 ácido oleico, como no se añadió sustrato, el ácido linolénico total producido se dividió por la suma de (ácido oleico y el ácido linoleico producido), y luego se multiplicó por 100.
Tabla 1 Expresión de Desaturasa de M. alpina en Levadura de Panadero.
CLON ACTIVIDAD DE % CONVERSIÓN DE SUSTRATO ENZIMA
pCGR-2 (L15 desaturasa de canola) pCGR-4 (M. alpina parecida, Ma29)
L6- L6 L15 L5 L17 L12 L6 L15 L5 0 (18:2 en 18:3w6) 16,3 (18:2 en 18:3w3) 2,0 (20:3 en 20:4w6) 2,8 (20:4 en 20:5w3) 1,8 (18:1 en 18:2w6) 0 0 15,3
L17
0,3
L12
3,3
pCGR-7 (M. alpina parecida, Ma648)
L12- L6 L15 0 3,8
L5 2,2 L17 0 L12 63,4
0119 El clon control Δ15-desaturasa exhibió un 16.3% de conversión del sustrato. El clon pCGR-4 que expresa el ADNc de Ma29 convirtió el 15,3% del sustrato de 20:3 a 20:4ω6, lo que indica que el gen codifica una Δ55 desaturasa. El fondo (conversión no especifica de sustrato) fue de entre el O y el 3% en estos casos. El clon pCGR5 que expresa el ADNc de Ma524 mostró el 6% de conversión del sustrato en GLA, lo que indica que el gen codifica una Δ6 desaturasa. El clon pCGR-7 que expresa el ADNc de Ma648 convirtió el 63,4% de conversión del sustrato en ALA, lo que indica que el gen codifica una Δ12-desaturasa. Se observó, también, inhibición de actividad sobre el sustrato usando diferentes concentraciones del sustrato. Cuando se añadió sustrato a 100 μM, la conversión
10 porcentual en producto bajó en comparación a cuando el sustrato se añadió a 25 μM (véase más adelante). Estos datos muestran que desaturasas con diferentes especificidades de sustrato se pueden expresar en un sistema heterólogo y usar para producir ácidos grasos poliinsaturados.
0120 La Tabla 2 representa los ácidos grasos de interés como un porcentaje de los lípidos totales extraídos de la
15 levadura hospedadora S. cerevisiae 334 con el plásmido indicado. No hubo glucosa presente en el medio de crecimiento. Se usó cromatografía de afinidad en gas para separar los respectivos lípidos. Se empleó CG/MS para verificar la identidad de los productos. El producto esperado para la Δ15-desaturasa de B. napus, ácido α-linolénico se detectó cuando su sustrato, ácido linoleico, se añadió exógenamente al cultivo de levadura inducido. Este hallazgo demuestra que la expresión de levadura de un gen desaturasa puede producir enzima funcional y
20 cantidades detectables de producto bajo las condiciones de cultivo ordinarias. Ambos sustratos añadidos exógenamente fueron recogidos por la levadura, aunque se incorporó ligeramente menos del PUFA de cadena más larga, el ácido dihomo-γ-linolénico (20:3), en la levadura que el ácido linoleico (18:2) cuando cualquiera de los dos se añadió en forma libre a los cultivos de levadura inducidos. Se detectó ácido γ-linolénico cuando el ácido linoleico estaba presente durante la inducción y expresión de S. cerevisiae 334 (pCGR-5). La presencia de este PUFA
25 demuestra actividad de Δ6-desaturasa a partir del pCGR-5 (Ma524). El ácido linoleico, identificado en los lípidos extraídos de la expresión del S. cerevisiae 334 (pCGR-7), clasifica el ADNc de Ma648 de M. alpina como la Δ12desaturasa.
Tabla 2
Ácido Graso como Porcentaje de Lípido Total Extraído de Levadura
Plásmido en Levadura (enzima)
18:2 Incorporado a-18:3 Producido y-18:3 Producido 20:3 Incorporado 20:4 Producido 18:1* Presente 18:2 Producido
pYES2 (control)
66,9 0 0 58,4 0 4 0
pCGR-2 (L15)
60,1 5,7 0 50,4 0 0,7 0
pCGR-4 (L5)
67 0 0 32,3 5,8 0,8 0
pCGR-5 (L6)
62,4 0 4,0 49,9 0 2,4 0
pCGR-7 (L12)
65,6 0 0 45,7 0 7,1 12,2
100 !M sustrato añadido * 18:1 es un ácido graso endógeno en levadura Clave de las Tablas 18:1 = ácido oleico 18:2 = ácido linoleico a-18:3 = ácido a-linolénico y-18:3 = ácido y-linolénico 18:4 = ácido estearidónico 20:3 = ácido dihomo-y-linolénico
Ejemplo de referencia D Expresión de 5-desaturasa en plantas
Expresión en hojas
0121 Este experimento se diseñó para determinar si las hojas que expresan Ma29 (determinado mediante Northern) eran capaces de convertir el DGLA (20:3) exógenamente aplicado en ARA (20:4).
0122 El ADNc de la desaturasa Ma29 se modificó mediante PCR para introducir sitios de restricción convenientes para la clonación. La región de codificación desaturasa ha sido insertada en un cassette d35 bajo el control del promotor doble 35S para la expresión en hojas de Brassica(pCGN5525) siguiendo protocolos estándares (véase USPN: 5,424,200 y USPN: 5,106,739). Las plantas de Brassica transgénicas que contienen pCGN5525 se generaron siguiendo protocolos estándares (véase USPN: 5,188,958 y USPN: 5,463,174).
0123 En el primer experimento, se usaron tres plantas: un control, LPO04-1, y dos transgénicas, 5525-23 y 5525
29. LPO04 es una variedad de Brassica con bajo contenido de linolénico. Se eligieron hojas de cada una para uno de tres tratamientos: agua, GLA o DGLA. El “GLA y el DGLA se compraron como sales de sodio en NuChek Prep y se disolvieron en agua a 1 mg/mL. Se cubrieron alícuotas con N2 Y se almacenaron a -70°C. Las hojas se trataron aplicando una gota de 50 μL a la superficie superior y se extendió suavemente con un guante enguantado para cubrir la superficie entera. Se realizaron las aplicaciones aproximadamente 30 minutos antes del término del ciclo de luz para minimizar cualquier fotooxidación de los ácidos grasos aplicados. Después de 6 días de tratamiento, se cosechó una hoja de cada tratamiento y se cortó por la mitad a través de la vena central. Una mitad se lavó con agua para intentar eliminar el ácido graso no incorporado. Las muestras de hojas se liofilizaron durante la noche, y se determinó la composición de ácidos grasos mediante cromatografía en gas (CG). Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Las hojas tratadas con ácido GLA contenían de 1,56 a 2,4% en peso de GLA. El análisis de ácidos grasos mostró que la composición de lípidos de las hojas de control y transgénicas fue esencialmente la misma. Las hojas de las plantas de control tratadas con DGLA contenían 1,2-1,9% en peso de DGLA y cantidades de fondo de ARA (0,260,27% en peso). Las hojas transgénicas contenían solamente 0,2-0,7% en peso de ácido dihomo-gama-linolénico, pero los niveles de ácido araquidónico aumentaron (0.74-1.1 por ciento en peso) indicando que el ácido dihomogama-linolénico se convirtió en ácido araquidónico en estas hojas.
Expresión en semilla
0124 El propósito de este experimento fue determinar si una construcción con el promotor napin específico de semilla habilitaría la expresión en la semilla.
0125 El ADNc de Ma29 fue modificado por PCR para introducir sitios de clonación XhoI dirección corriente arriba y corriente abajo de los codones de inicio y de detención, respectivamente, usando los siguientes cebadores:
Madxho-hacia adelante:
5'-CUACUACUACUACTCGAGCAAGATGGGAACGGACCAAGG (SEC ID NO:25)
Madxho-hacia atrás:
5'-CAUCAUCAUCAUCTCGAGCTACTCTTCCTTGGGACGGAG (SEC ID NO: 26) .
0126 El producto de la PCR se subclonó en pAMPl (GIBCOBRL) usando el sistema CloneAmp (GIBCO-BRL) para crear pCGN5522 y la secuencia de Δ5 desaturasa se verificó secuenciando ambas cadenas.
0127 Para la expresión específica de semilla, la región de codificación de Ma29 se separó de pCGN5522 como un fragmento XhoI y se insertó en el sitio SalI del cassette de expresión napin, pCGN3223, para crear pCGN5528. El fragmento HindIII del pCGN5528 que contiene la región reguladora 5’ napin, la región de codificación Ma29, y la región reguladora de 3’ napin se insertó en el sitio HindIII de pCGN1557 para crear pCGN5531. Se insertaron dos copias de la unidad de transcripción napin en tándem. Esta construcción en tándem puede permitir mayor expresión de las desaturasas por locuses genéticos. Se introdujo pCGN5531 en Brassica napus cv.LPOO4 vía la transformación mediada por Agrobacterium.
0128 Se analizó La composición de ácidos grasos de criaderos de 20 semillas de las semillas T2 maduras mediante cromatografía en gas. La Tabla 4 muestra los resultados obtenidos con líneas transformadas independientes en comparación con la semilla LPOO4 no transformada. Las semillas transgénicas que contenían pCGN5531 contienen dos ácidos grasos que no están presentes en las semillas control, tentativamente identificados como ácido taxoleico (5,9-18:2) y ácido pinolénico (5,9,12-18:3), basándose en su elución relativa al ácido oleico y al ácido linoleico. Estos serían los productos esperados de la Δ5 desaturación de los ácidos oleico y linoleico. No se observaron otras diferencias en la composición de ácidos grasos en las semillas transgénicas.
0129 Se realizó un análisis Northern en plantas para identificar las que expresan Ma29. Se aislaron embriones en desarrollo aproximadamente 25 días después de la antesis o cuando se indujo el promotor napin, y se pusieron a flotar en una solución que contenía GLA o DGLA tal como se describe en este Ejemplo. Se realizó a continuación el análisis de ácidos grasos de los embriones mediante cromatografía de gases para determinar la cantidad de conversión de DGLA en ARA, siguiendo el protocolo adaptado para las hojas en este Ejemplo 7. La cantidad de ARA incorporada en triglicéridos mediante las aciltransferasas de Brassica endógenas se evaluó entonces mediante análisis de cromatografía de gases como en este ejemplo.
Ejemplo 4
Expresión de 6 Desaturasa de M.alpina en Brassica napus
0130 El ADNc de Ma524 se modificó mediante PCR para introducir sitios de clonación usando los siguientes cebadores:
Ma524PCR-l (SEC ID NO:27)
5'-CUACUACUACUATCTAGACTCGAGACCATGGCTGCTGCTCCAGTGTG
Ma524PCR-2 (SEC ID NO:28)
5’-CAUCAUCAUCAUAGGCCTCGAGTTACTGCGCCTTACCCAT
0131 Estos cebadores permitieron la amplificación de la región de codificación entera y añadieron los sitios XbaI y XhoI en el extremo 5’ y los sitios XhoI y StuI en el extremo 3’. El producto de PCR se subclonó en pAMP1 (GIBCO-BRL) usando el sistema CloneAmp (GIBCO-BRL) para crear pCGN5535 y la secuencia de Δ6 desaturasa se verificó secuenciando ambas cadenas.
0132 Para la expresión específica de semilla, la región de codificación de Ma524 se separó de pCGN5535 como un fragmento XhoI y se insertó en el sitio SalI del cassette de expresión napin, pCGN3223, para crear pCGN5536. El fragmento NotI del pCGN5536 que contiene la región reguladora 5’, la región de codificación Ma524, y la región reguladora de 3’ napin se insertó en el sitio NotI de pCGN1557 para crear pCGN5538. Se introdujo pCGN5538 en Brassica napus cv.LPOO4 mediante la transformación mediada por Agrobacterium.
0133 Se recolectaron semillas maduras T2 de 6 eventos de transformación independientes en el invernadero. La composición de ácidos grasos de semillas únicas se analizó mediante cromatografía en gas. La Tabla 5 muestra los resultados de las semillas control LPOO4 y 6 líneas 5538. Todas las líneas 5538 excepto la número 8 produjeron semillas que contenían GLA. La presencia de GLA segregado en estas semillas es como se esperaba para la población de semillas T2 coloreada. Además del GLA, la Δ6 desaturasa de M. alpina es capaz de producir ácido
18:4 (estearidónico) y otro ácido graso que se cree que es el 6,9-18:2.
0134 Los resultados anteriores muestran que las desaturasas con tres especificidades de sustrato diferentes se pueden expresar en un sistema heterólogo y usar para producir ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga. Se ejemplificó la producción de ARA (20:4) a partir del precursor 20:3 (DGLA), y la producción de GLA (18:3) a partir del sustrato 18:2, y la conversión de 18:1 sustrato en 18:2, el cual es el precursor para GLA.
Ejemplo de referencia E
Expresión de 12 Desaturasa de M.alpina en Brassica napus
0135 El ADNc de Ma648 se modificó mediante PCR para introducir sitios de clonación usando los siguientes cebadores:
Ma648PCR-hacia adelante (SEC ID NO:29)
5'-CUACUACUACUAGGATCCATGGCACCTCCCAACAACT
Ma648PCR-hacia atrás (SEC ID NO:30)
5'-CAUCAUCAUCAUGGTACCTCGAGTTACTTCTTGAAAAAGAC
0136 Estos cebadores permitieron la amplificación de la región de codificación entera y añadieron un sitio BamHI en el extremo 5’ y los sitios KpnI y XhoI al extremo 3’. El producto de la PCR se subclonó en Pamp1 (GIBCO-BRL) usando el sistema CloneAmp (GIBCO-BRL) para crear pCGN5540 y la secuencia de Δ12 desaturasa se verificó secuenciando ambas cadenas.
0137 Para la expresión específica de semilla, la región de codificación de Ma648 se separó de pCGN5540 como un fragmento BamHI/XhoIy se insertó entre el sitio BglII y XhoI del cassette de expresión napin, pCGN3223, para crear pCGN5542. El fragmento Asp718 del pCGN5541 que contiene la región reguladora 5’ del napin, la región de codificación Ma648, y la región reguladora de 3’ napin se insertó en el sitio Asp718 de pCGN5138 para crear pCGN5542. Se introdujo pCGN5542 en dos variedades de Brassica napus mediante la transformación mediada por Agrobacterium. Se usaron la variedad comercial de canola, SP30021, y la línea con bajo contenido de linolénico, LP30108.
0138 Se recolectaron las semillas T2 coloreadas maduras de los 19 eventos independientes de transformación de LP30108 y un control no transformado cultivado en el invernadero. Estas semillas se esperaba que se segregaran para el trasgén Δ12 desaturasa. La composición de ácidos grasos de los criaderos de 20 semillas se analizó mediante cromatografía en gas. Los resultados se muestran en la Tabla 6. Todas las líneas transformadas contenían niveles aumentados de 18:2, el producto de la Δ12 desaturasa. Los niveles de 18:3 no se aumentaron significativamente en estas plantas. Los eventos número 11 y 16 mostraron la mayor acumulación de 18:2 en las semillas criadas. Para investigar la segregación de los niveles de 18:2 en las semillas T2 y para identificar las plantas individuales que se tomaran en las generaciones posteriores, se realizó un análisis de la mitad de la semilla. Las semillas germinaron durante la noche en la oscuridad a 30 grados sobre papel filtro remojado en agua. El cotiledón externo se separó para el análisis por cromatografía en gas y el resto del cultivo se plantó en tierra. Los resultados de algunos de estos análisis se muestran en la Tabla 7. Las semillas T2 individuales que contenían la Δ12 desaturasa de M. alpina acumularon hasta el 60% de 18:2 en las semillas. La muestra 97xxl116 #59 es un ejemplo de un segregante nulo. Aún en los acumuladores más altos de 18:2, los niveles de 18:3 solo aumentaron ligeramente. Estas y otras plantas T2 seleccionadas individualmente se cultivaron en el invernadero y en el campo para producir la semilla T3.
0139 Se recolectaron semillas T2 coloreadas maduras a partir de 20 eventos independientes de transformación SP30021 y un control no transformado cultivado en el invernadero. Estas semillas se esperaba que se segregaran para el transgén Δ12 desaturasa. La composición de ácidos grasos de criaderos de 20 semillas se analizó mediante cromatografía de gas. Los datos se presentaron en la Tabla 8. Todas las líneas transformadas contenían niveles aumentados de 18:2, el producto de la Δ12 desaturasa. Como en la línea LP30l08 de bajo contenido en linolénico, los niveles de 18:3 no aumentaron significativamente. Los eventos número 4 y 12 mostraron la mayor acumulación de 18:2 en la semillas criadas. Para investigar la segregación de los niveles de 18:2 en las semillas T2 y para identificar plantas individuales para ser tomadas para generaciones posteriores, se realizó análisis alf-semilla. Las semillas germinaron durante la noche en la oscuridad a 30 grados en papel filtro remojado en agua. El cotiledón externo se separó para análisis por cromatografía de gas y el resto de las semillas se plantaron en tierra. Los resultados de estos análisis se muestran en la Tabla 9. Las muestras 97xxl157 # 88 y #18 son ejemplos de segregantes nulos para 5542-SSP30021-4 y 5542-SP30021-12 respectivamente. Estas y otras plantas T2 seleccionadas individualmente se cultivaron en el invernadero y en el campo para producir la semilla T3.
Tabla 6
CICLO ID
MST Nº CEPA ID 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3 20:0 20:1 20:2 22:0
97XX1098
45 5542LP30108-16 7,04 0,43 1,12 18,01 66,36 4,76 0,5 0,84 0,3 0,44
97XX1098
22 5542LP30108-16 5,17 0,29 2,11 22,01 65,18 3,15 0,63 0,75 0,21 0,36
97XX1098
40 5542LP30108-16 4,99 0,2 2,05 23,91 63,13 3,3 0,73 0,85 0,23 0,49
97XX1098
28 5542LP30108-16 4,47 0,19 1,75 26,7 62,39 2,46 0,58 0,85 0,2 0,32
97XX1098
2 5542LP30108-16 4,54 0,21 1,66 26,83 61,89 2,9 0,55 0,82 0,18 0,33
97XX1098
58 5542LP30108-16 6,05 0,31 1,36 24,11 61,36 3,8 0,72 1,13 0,26 0,58
97XX1098
83 5542LP30108-16 5,13 0,17 2,03 27,05 60,93 2,62 0,7 0,71 0,14 0,4
97XX1098
34 5542LP30108-16 4,12 0,19 1,44 29,35 60,54 2,53 0,43 0,89 0,17 0,25
97XX1116
37 5542LP30108-11 4 0,14 2,43 23,29 63,99 2,6 0,58 0,69 0,71 1,11
97XX1116
88 5542LP30108-11 3,8 0,18 2,04 23,59 63,93 2,95 0,54 0,81 0,99 0,82
97XX1116
36 5542LP30108-11 4,15 0,2 1,51 25,94 62,14 2,74 0,47 0,87 0,79 0,81
97XX1116
31 5542LP30108-11 6,29 0,35 1,04 24,14 60,91 4,02 0,55 0,91 0,75 0,72
97XX1116
10 5542LP30108-11 6,97 0,4 3,36 18,9 60,66 4,68 1,2 0,7 0,53 1,71
97XX1116
32 5542LP30108-11 3,96 0,16 2,61 26,73 60,54 3,38 0,66 0,87 0,2 0,62
97XX1116
55 5542LP30108-11 4,26 0,22 0,98 28,57 59,94 3,24 0,4 0,68 0,71 0,75
97XX1116
12 5542LP30108-11 4,17 0,23 1,42 28,61 59,52 3,26 0,51 0,95 0,29 0,67
97XX1116
86 5542LP30108-11 4,23 0,3 1,09 28,34 59,2 3,95 0,48 0,91 0,55 0,71
97XX1116
61 5542LP30108-11 4,13 0,16 1,92 30,18 58,67 2,65 0,56 0,88 0,25 0,41
97XX1116
60 5542LP30108-11 4,42 0,26 1,61 28,77 58,6 3,26 0,53 0,85 0,68 0,75
97XX1116
91 5542LP30108-11 7,82 0,67 2,37 17,97 58,43 4,85 0,94 0,86 3,87 1,71
97XX1116
59 5542LP30108-11 3,56 0,2 1,6 65,5 23,03 2,23 0,52 1,54 0,49 0,69
Tabla 7
5542-LP30108-1 5542-LP30108-2 5542-LP30108-3 5542-LP30108-4 5542-LP30108-5 5542-LP30108-6
16:0 % 4,6 4,63 4,96 4,36 4,45 4,97 16:1 % 0,15 0,17 0,18 0,15 0,14 0,16 18:0 % 1,93 1,78 2,07 1,94 2,19 1,86 18:1 % 50,44 41,11 48,16 46,51 49,54 49,23 18:2 % 38,54 47,53 40,01 42,57 39,13 39,2 18:3 % 2,062,462,17 1,952,142,17 20:0 % 0,65 0,62 0,73 0,64 0,72 0,7 20:1 % 1,111,021,131,061,141,12 20:2 % 0,09 0,14 0,1 0,11 0,11 0,11 22:0 % 0,37 0,38 0,39 0,35 0,38 0,41
34
5542-LP30108-7 4,46 0,13 2,72 39,6 48,65 2,02 0,81 0,96 0,13 0,4 5542-LP30108-8 4,63 0,18 1,78 47,86 41 2,31 0,62 1,09 0,11 0,36 5542-LP30108-9 4,64 0,16 1,75 42,5 46,57 2,2 0,61 1 0,13 0,35 5542-LP30108-10 4,46 0,15 2,37 43,61 45,29 1,77 0,71 1,02 0,12 0,36 5542-LP30108-11 4,58 0,25 1,88 37,08 50,95 2,94 0,64 0,96 0,16 0,42 5542-LP30108-12 4,46 0,18 1,69 43,62 45,36 2,44 0,59 1,09 0,14 0,34 5542-LP30108-13 4,45 0,15 2,33 51 37,71 1,91 0,75 1,12 0,09 0,4 5542-LP30108-14 4,3 0,16 2,04 45,93 42,78 2,46 0,66 1,07 0,14 0,37 5542-LP30108-15 4,18 0,16 2,17 43,79 45,2 2,14 0,68 1,04 0,15 0,36 5542-LP30108-16 5,04 0,18 1,89 32,32 55,78 2,68 0,63 0,84 0,2 0,36 5542-LP30108-18 4,2 0,14 2,23 50,63 38,51 1,79 0,72 1,15 0,1 0,37 5542-LP30108-19 4,63 0,18 1,81 52,51 36,26 2,12 0,68 1,19 0,1 0,4 5542-LP30108-20 4,77 0,15 2,78 39,76 48,06 2,25 0,75 0,91 0,13 0,36
LP30108 control 4,31 0,22 2,05 66,15 22,59 1,87 0,77 1,3 0,07 0,44
Tabla 8
CEPA ID
16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3 20:0 20:1 20:2 22:0
5542-SP30021-1
4,37 0,17 2,17 40,26 39,43 11,06 0,74 1,14 0,14 0,42
5542-SP30021-2
4,33 0,18 1,51 43,07 36,03 12,57 0,57 1,21 0,14 0,33
5542-SP30021-3
5,2 0,22 3,1 43,7 37,04 8,03 0,92 1,06 0,13 0,48
5542-SP30021-4
4,37 0,15 1,94 34,26 45,12 12,04 0,6 0,96 0,17 0,3
5542-SP30021-5
4,15 0,17 1,73 48,98 31,13 11,41 0,63 1,26 0,13 0,35
5542-SP30021-6
4,52 0,17 1,92 38,1 42,39 10,53 0,67 1,04 0,18 0,39
5542-SP30021-7
4,58 0,18 1,66 41,87 37,52 11,8 0,62 1,14 0,15 0,36
5542-SP30021-8
4,46 0,17 1,59 42,69 36,93 11,88 0,59 1,14 0,14 0,35
5542-SP30021-9
4,63 0,19 1,69 39,89 39,75 11,48 0,62 1,09 0,15 0,38
5542-SP30021-10
4,74 0,16 1,79 39,19 40,51 11,42 0,63 0,99 0,13 0,34
5542-SP30021-11
4,57 0,16 1,71 38,13 42 11,15 0,62 1,04 0,18 0,36
5542-SP30021-12
4,05 0,16 2,04 35,44 43,47 12,45 0,62 1,07 0,21 0,33
5542-SP30021-13
4,37 0,15 1,79 38,74 41,28 11,36 0,62 1,04 0,16 0,35
5542-SP30021-14
4,32 0,16 1,47 42,32 37,17 12,3 0,54 1,16 0,16 0,32
5542-SP30021-15
4,25 0,18 1,65 44,96 34,28 12,39 0,59 1,13 0,14 0,32
5542-SP30021-16
4,53 0,17 1,91 42,13 38,32 10,51 0,67 1,12 0,14 0,38
5542-SP30021-17
4,16 0,19 1,7 50,65 29,3 11,4 0,61 1,29 0,11 0,36
5542-SP30021-18
4,24 0,17 1,68 44,47 35,46 11,52 0,6 1,19 0,14 0,34
5542-SP30021-19
4,1 0,18 1,8 46,67 33,87 10,86 0,63 1,24 0,13 0,37
5542-SP30021-20
4,3 0,17 1,64 39,6 40,39 11,53 0,57 1,12 0,16 0,32
SP30021
4,38 0,21 1,47 56,51 22,59 12,04 0,62 1,45 0,11 0,39
Tabla 9
CICLO ID
MS CEPA ID 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3 20:0 20:1 20:2 22:0
T
Nº
97XX1156
96 5542 3,71 0,13 1,36 29,29 51,74 11,57 0,41 0,85 0,18 0,46
SP30021-4
97XX1156
50 5542 2,95 0,11 1,33 28,78 50,97 13,83 0,3 0,99 0,28 0,32
SP30021-4
97XX1158
10 5542 4,05 0,16 2,47 31,18 50,88 8,77 0,67 0,89 0,22 0,33
SP30021-4
97XX1158
32 5542 3,56 0,15 1,44 30,73 50,1 11,86 0,47 0,91 0,21 0,22
SP30021-4
97XX1158
56 5542 4,44 0,19 3,09 30,64 49,71 9,39 0,83 0,79 0,2 0,4
SP30021-4
97XX1157
80 5542 4,05 0,18 1,32 27,41 49,59 14,81 0,53 1,19 0,29 0,4
SP30021-4
97XX1158
39 5542 4,04 0,15 2,98 28,62 49,52 12,28 0,69 0,86 0,31 0,27
SP30021-4
97XX1156
17 5542 3,65 0,15 2,43 29,38 49,42 12,3 0,52 0,92 0,67 0,35
SP30021-4
97XX1156
60 5542 3,75 0,17 1,7 30,03 49,13 12,87 0,51 1,01 0,27 0,35
SP30021-4
97XX1157
83 5542 4,15 0,2 1,77 29,72 49,08 12,22 0,66 1,21 0,16 0,52
SP30021-4
97XX1157
86 5542 3,6 0,14 1,12 27,65 49,01 16,05 0,48 1,21 0,33 0,08
SP30021-4
97XX1158
77 5542 4,14 0,17 1,58 31,98 48,82 10,72 0,65 1 0,28 0,44
SP30021-4
97XX1157
88 5542 3,36 0,15 1,22 56,42 21,63 13,78 0,58 1,85 0,06 0,65
SP30021-4
97XX1157
39 5542 2,84 0,04 1,84 29,6 53,16 9,52 0,57 1,32 0,35 0,48
SP30021
12
97XX1157
55 5542 3,28 0,1 2,18 30,36 52,27 9,26 0,63 1,15 0,22 0,41
SP30021
12
97XX1157
10 5542 3,5 0,06 1,51 29,78 50,98 11,13 0,64 1,45 0,4 0,26
SP30021
12
97XX1157
41 5542 3,31 0,08 1,64 30,18 50,51 11,59 0,57 1,27 0,24 0,41
SP30021
12
97XX1157
35 5542 3,31 0,09 1,57 30,36 50,1 12,17 0,5 1,15 0,23 0,35
SP30021
12
97XX1157
1 5542 3,45 0,11 2,88 32,11 49,45 8,69 0,82 1,22 0,27 0,63
SP30021
12
97XX1157
16 5542 2,91 0,09 1,52 29,35 48,88 14,26 0,58 1,39 0,15 0,3
SP30021
12
97XX1157
50 5542 3,29 0,09 2,13 33,23 48,78 9,87 0,67 1,06 0,18 0,47
SP30021
12
97XX1157
25 5542 2,83 0,05 1,4 33,22 48,52 11,22 0,5 1,33 0,26 0,42
SP30021
12
97XX1157
57 5542 2,94 0,13 1,46 32,85 47,58 12,21 0,57 1,31 0,27 0,47
SP30021
12
97XX1157
56 5542 3,01 0,07 1,63 31,53 47 14,02 0,59 1,31 0,28 0,23
SP30021
12
97XX1157
6 5542 3,9 0,13 1,5 32,43 46,98 12,45 0,52 1,11 0,21 0,49
SP30021
12
97XX1157
18 5542 3,88 0,16 1,73 57,94 22,33 10,51 0,74 1,68 0,11 0,64
SP30021
12
Ejemplo 5
Expresión simultánea de 6 y 12 desaturasas de M. alpina en Brassica napus
0140 Con el fin de expresar la Δ6 y Δ12 desaturasas de M. alpina a partir del mismo ADN-T, se realizó la siguiente construcción para la expresión específica de semilla.
0141 El fragmento NotI de pCGN5536 contenido en la región reguladora 5’ napin, la región de codificación Ma524 y la región reguladora 3’ napin se insertó en el sitio NotI de pCGN5542 para crear pCGN5544. Los modelos de expresión se orientaron de manera que la dirección de transcripción de Ma524 y Ma648 y el marcador nptII es el mismo.
0142 Se introdujo el pCGN5544 en Brassica napus cv.LP30108 mediante transformación mediada por Agrobacterium. Se recolectaron las semillas T2 coloreadas maduras de 16 eventos de transformación LP30108 independientes y un control no transformado que se cultivó en el invernadero. Estas semillas se esperaba que segregaran para el transgén desaturasas Δ6+Δ12. La composición de ácidos grasos de criaderos de 20 semillas se analizó mediante cromatografía de gas. Los resultados se presentan en la Tabla 10. Todas menos una de las líneas (5544-LP30108-3) muestra una composición de aceite alterada en comparación con los controles. Se produjo GLA en todas las líneas menos en 3 (-3, -4, -11); dos de las tres sin GLA (-4, -11) mostraron 18:2 aumentado indicador de la expresión de la Δ12 desaturasa. Como un grupo, los niveles de GLA observados en plantas contenían la construcción doble Δ6 + Δ12 (pCGN5544) fueron mayores que los de las plantas que contenían pCGN5538 (Δ6 solo). Además, los niveles del Δ6.9 18:2 son muy reducidos en las plantas que contienen la Δ12 + Δ6 en comparación con Δ6 sola. De este modo, la combinación de las Δ6 y Δ12 desaturasas en un ADN-T conduce a la acumulación de más GLA y menos productos secundarios que la expresión de la Δ6 desaturasa sola. Para investigar la segregación de los niveles de GLA en las semillas T2 y para identificar plantas individuales que se tomarán en las generaciones posteriores, se realizaron análisis de media semilla. Las semillas germinaron durante la noche en la oscuridad a 30 grados en papel filtro remojado en agua. El cotiledón externo se separó para análisis por cromatografía de gas y el resto de las semillas se plantaron en tierra. Los resultados de algunos de estos análisis se muestran en la Tabla 11. Como se esperaba para la población T2, los niveles de GLA y 18:2 son segregantes en las semillas individuales. Se observó un contenido de GLA de hasta el 60% del total de ácidos grasos en semillas individuales. Los eventos individuales se seleccionaron para cultivarse en el invernadero y en el campo para producir semilla T3.
0143 Las plantas transgénicas que incluyen Brassica, soja, cártamo, maíz, linaza y girasol que expresan las construcciones de esta invención pueden ser una buena fuente de GLA.
0144 Las fuentes típicas de GLA tales como la borraja producen como mucho un 25% de GLA. En cambio las plantas de la Tabla 10 contienen hasta un 30% de GLA. Además, las semillas individuales mostradas en la Tabla 11 contienen hasta un 60% de GLA.
Tabla 10
16:0
16:1 18:0 18:1 18:2 18:2 18:3 18:3 18:4 20:0 20:1 22:0
.6,9
L9,12 .6,9,12 L9,12,
15
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
5544-LP30108
4,54 0,17 1,91 49,96 0 30,98 7,97 1,85 0,11 0,68 1,17 0,41
1
5544-LP30108
4,69 0,19 2,15 38,49 0 33,94 16,21 1,73 0,25 0,72 0,96 0,41
2
5544-LP30108
4,26 0,2 1,97 66,68 0 22,13 0,08 1,96 0,01 0,73 1,33 0,42
3
5544-LP30108
4,59 0,24 1,76 44,21 0 44,54 0,02 2,19 0,01 0,62 1,08 0,4
4
5544-LP30108
4,5 0,18 2,28 47,57 0 26,41 14,42 1,71 0,22 0,78 1,1 0,43
5
5544-LP30108
4,51 0,16 2,12 31,95 0,01 26,94 29,8 1,41 0,05 0,81 1,02 0,51
6
5544-LP30108
4,84 0,21 1,68 38,24 0 32,27 18,21 1,87 0,33 0,66 1,04 0,43
7
5544-LP30108
5 0,28 1,86 41,17 0 46,54 0,36 2,58 0,02 0,6 0,91 0,37
10
5544-LP30108
4,57 0,2 1,74 47,29 0 41,49 0,03 2,22 0,01 0,64 1,17 0,4
11
5544-LP30108
4,87 0,18 2,65 34,53 0 30,37 23,12 1,46 0,36 0,83 0,95 0,45
12
5544-LP30108
4,41 0,16 2,32 40,82 0,11 26,8 21,05 1,53 0,37 0,77 1,06 0,42
13
5544-LP30108
4,38 0,2 2,21 29,91 0,16 28,01 30,62 1,46 0,59 0,76 0,97 0,47
14
5544-LP30108
4,79 0,22 2,23 23,42 0,02 28,73 35,68 1,51 0,77 0,87 0,89 0,56
15
5544-LP30108
4,54 0,18 1,78 40,81 0 35,24 12,83 1,95 0,27 0,68 1,02 0,43
16
5544-LP30108
4,63 0,18 2,28 46,96 0 31,06 10,6 1,7 0,14 0,76 1,06 0,42
17
5544-LP30108
4,87 0,29 1,44 31,81 0,15 23,51 32,85 1,64 0,69 0,89 0,96 0,67
20
LP30108
3,89 0,25 1,19 67,73 0 22,46 0,1 1,97 0 0,54 1,32 0,44
control
Ejemplo 6
Expresión simultánea de 5 y 6 desaturasas de M. alpina en Brassica napus
5 0145 Con el fin de producir ácido araquidónico (AAR) en aceite de canola transgénico es necesario introducir las actividades Δ5 y Δ6 desaturasas. Con el fin de facilitar la caracterización corriente abajo y su cruce, puede ser ventajoso hacer que varias actividades sean codificadas por un solo ADN-T. El siguiente ejemplo ilustra la expresión simultánea de Δ5 y Δ6 desaturasas.
10 0146 El fragmento Asp718 de pCGN5528 que contenía la región reguladora 5’ napin, la región de codificación Ma29, y la región reguladora 3’ napin se insertó en el sitio Asp718 de pCGN5138 para crear el pCGN5545.El fragmento NotI de pCGN5536 que contenía la región reguladora 5’ napin, la región de codificación Ma524 y la región reguladora 3’ napin se insertó en el sitio NotI de pCGN5545 para crear el pCGN5546. Los módulos de expresión se orientaron de manera que la dirección de la transcripción de Ma524 y Ma29 y el marcador nptII sea la misma.
15 0147 Se introdujo el pCGN5546 se introdujo en Brassica napus cv.LP30108 mediante transformación mediada por Agrobacterium. Se recolectaron semillas T2 coloreadas maduras a partir de 30 eventos de transformación LP30108 independientes que se cultivaron en el invernadero. .La composición de ácidos grasos de criaderos de 20 semillas se analizó mediante cromatografía de gas. Los resultados se muestran en la Tabla 12. Todas las líneas muestran la
20 expresión de ambas desaturasas como se hace evidente por la presencia de Δ5.9 18:2 (como se ve en plantas pCGN5531) y. Δ6.9 18:2 y GLA (como se observa en plantas de pCGN5538).
Tabla 12
Análisis de ácidos grasos de grupos de 20 semillas de semillas T2 maduras de los casos 5546-LP30108
25
CEPA ID
16:0 16:1 18:0 18:1 18:2_ 18:2_ 18:2_ 18:3_ 18:3_L9, 18:4 20:0 20:1
.5,
.6, L9, .6, 12,15
9
9
12 9,12
5546
4,88 0,33 2,28 57,2 4,68 6,08 7,36 12,29 1,38 0,85 0,84 1,22
LP30108-1
5546
4,01 0,14 2,22 66,04 2,73 1,33 12,6 6,45 1,41 0,32 0,75 1,2
LP30108-2
5546
4,29 0,15 2,55 68,89 0,44 0,58 16,97 1,66 1,6 0,11 0,88 1,22
LP30108-3
5546
4,24 0,14 2,6 70,48 0,73 0,52 14,28 2,61 1,42 0,14 0,96 1,26
LP30108-4
5546
3,52 0,15 2,01 60,3 1,72 0,95 16,92 9,88 1,66 0,39 0,68 1,26
LP30108-5
5546
4,05 0,17 2,24 61,29 1,98 0,4 18,87 6,28 2 0,34 0,7 1,24
LP30108-6
5546
4,74 0,21 2,49 64,5 2,25 1,18 10,03 9,73 1,35 0,52 0,97 1,28
LP30108-7
5546
4,24 0,14 2,82 63,92 1,9 1,5 11,67 9,29 1,44 0,43 0,89 1,19
LP30108-8
5546
3,8 0,13 2,15 65,75 2,3 0,16 14,92 6,32 1,57 0,24 0,75 1,35
LP30108-9
5546
4,28 0,17 1,55 58,8 1,1 0,12 22,95 5,97 2,24 0,22 0,6 1,35
LP30108-10
5546
4,25 0,15 1,82 63,68 1,01 0,22 19,42 4,96 1,81 0,2 0,67 1,23
LP30108-11
5546
3,95 0,14 2,36 66,9 1,12 0,01 19,42 1,59 1,77 0,04 0,8 1,21
LP30108-12
5546
4,18 0,16 2,17 66,91 1,36 0,02 18,84 1,99 1,74 0,05 0,77 1,15
LP30108-13
5546
4,74 0,26 1,82 65,29 1,25 0,27 16,77 5,3 1,59 0,25 0,71 1,32
LP30108-14
5546
4,3 0,23 2,54 65,65 1,67 0,59 13,15 7,22 1,54 0,36 0,88 1,3
LP30108-15
5546
4,05 0,17 2,75 64,13 2,56 2,8 9,56 9,31 1,34 0,53 0,92 1,28
LP30108-16
5546
4,06 0,13 2,85 65,76 2,09 1,92 9,65 9,1 1,23 0,45 0,92 1,22
LP30108-17
5546
4,16 0,25 2,14 60,68 1,43 0,02 24,02 2,62 2,11 0,09 0,69 1,26
LP30108-18
5546
5,77 0,37 2,15 56,11 1,6 0,33 19,34 9,16 2,37 0,46 0,73 1,05
LP30108-19
5546
5,03 0,36 2,34 61,05 1,55 0,35 17,21 6,96 2,24 0,39 0,77 1,22
LP30108-20
5546
4,52 0,3 2,71 62,14 1,33 0,23 17,62 6,44 1,88 0,28 0,88 1,15
LP30108-21
5546
5,91 0,44 2,15 60,12 1,41 0,36 17,04 7,75 1,97 0,36 0,78 1,07
LP30108-22
5546
4,28 0,22 2,44 66,19 0,93 0,11 17,03 4,37 1,67 0,17 0,82 1,25
LP30108-23
5546
4,92 0,33 2,68 62,6 1,32 0,36 16,89 5,82 2,05 0,3 0,95 1,19
LP30108-24
5546
5,42 0,72 3,15 47,47 2,66 4,21 13,51 16,31 2,14 0,99 1,18 1,37
LP30108-25
5546
3,85 0,22 2,78 65,02 1,05 0,05 18,35 4,36 1,67 0,12 0,82 1,18
LP30108-26
5546
3,86 0,15 2,76 65,17 1,11 0,78 16,24 5,21 1,53 0,25 0,93 1,3
LP30108-27
5546
5,29 0,42 1,81 49,12 1,07 0,09 30,52 5,21 3,57 0,44 0,67 1,23
LP30108-28
5546
4,4 0,2 2,38 65,95 1,05 0,28 16,31 4,85 1,64 0,19 0,85 1,26
LP30108-29
5546
3,99 0,19 2,55 67,47 0,83 0,11 17,02 3,18 1,68 0,13 0,83 1,23
LP30108-30
Ejemplo 7
Expresión simultánea de .5, .6 y .12 desaturasas de M. alpina en Brassica napus
5 0148 Con el fin de lograr la producción óptima de ARA en aceite de canola transgénico pueden ser necesarias que estén presentes, tanto la actividad de Δ6 como de Δ12 además de la actividad Δ5. Con el fin de facilitar la caracterización y la cruza corriente abajo puede ser ventajoso tener todas estas actividades codificadas por un solo ADN-T. El siguiente ejemplo ilustra la expresión simultánea de Δ5, Δ6 Y Δ12 desaturasas.
10 0149 El fragmento HindIII de pCGN5528 que contenía la región reguladora 5’ napin, la región de codificación Ma29, y la región reguladora 3’ napin se insertó en el sitio HindIII de pCGN5544 para crear el pCGN5547. Los módulos de expresión se orientaron de manera que la orientación de la transcripción de Ma29, Ma524, Ma648 y el marcador nptII sea la misma.
15 0150 Se introdujo el pCGN5547 en Brassica napus cv.LP30108 mediante transformación mediada por Agrobacterium. Se recolectaron semillas T2 coloreadas maduras a partir de 30 eventos de transformación LP30108 independientes que se cultivaron en el invernadero. Se analizó mediante cromatografía de gas la composición en ácidos grasos de criaderos de 20 semillas. Los resultados se muestran en la Tabla 13. Veintisiete de las líneas
20 muestran acumulación significativa de GLA y en general los niveles de GLA observados son mayores que los vistos en las plantas 5546 que no contenían la Δ12 desaturasa. La Δ12 desaturasa parece ser activa en la mayoría de las líneas tal y como se evidencia por la falta de Δ6,9 18:2 detectable y los niveles elevados de 18:2 en la mayoría de las plantas. Cantidades pequeñas de Δ5, 9 18:2 se ven en las plantas 5547, aunque los niveles generalmente son inferiores a los observados en las plantas 5546. Esto puede deberse a la presencia de la Δ12 desaturasa, la cual
25 convierte eficientemente el 18:1 en 18:2 antes de que se pueda desaturar en la posición Δ5.
Ejemplo 8
Distribución estereoespecífica de aceites 6-desaturados
0151 Este experimento se diseñó para investigar la distribución estereoespecífica de los aceites Δ6 de saturados
en semillas que expresan pCGN5538 (Ma524 ADNc). Se usaron tres muestras de semillas:
1)Semillas cv. LP004 de B. napus no transformadas (control)
2)Semillas T2 segregantes de pCGN5538-LP004-19
3) Semillas T2 segregantes de pCGN5538-LP004-29
0152 El siguiente protocolo se usó para el análisis: 1
1. Extracción de aceite de semilla
0153 Se colocaron 50 semillas en un frasco de 12 x 32 mm y se trituraron con una varilla de vidrio. Se añadieron 1,25 mL de hexano y se licuó la mezcla. Las semillas se extrajeron durante la noche en un agitador. El extracto se filtró, a continuación, a través de un filtro de 0,2 micras unido a una jeringa de 1 cc. El extracto se secó bajo nitrógeno. El aceite resultante se usó para la digestión y la derivación de la muestra entera de aceite.
2. Digestión
A. Digestión de aceite líquido
0154] La lipasa fuente (procedente de Rhizopus arrhizus, Sigma, L4384) se diluyó a aproximadamente 600,000 unidades/mL con el objetivo de obtener la digestión al 50% de TAG. La lipasa fuente se mantuvo a 4°C y se colocó sobre hielo. La cantidad de reactivos se puede ajustar de acuerdo con la cantidad de aceite que se va a digerir.
0155 Las siguientes cantidades se basan en una muestra de aceite extraído de 2,0 mg. En un frasco de tapa roscable de 12 x 32 mm se añadió lo siguiente: 2,0 mg de aceite, 200 μL de O,lM tris HCl pH 7,40 μL de CaCl2 2H20 de 2,2% p/v de y 100 μL de sales biliares al 0,05% p/v. El material se centrifugó y se sonicó para dispersar el aceite. Veinte μL de lipasa diluida se añadió y la mezcla se centrifugó continuamente durante 1,0 minuto a temperatura ambiente. Se formó un precipitado blanco. La reacción se detuvo con 100 uL HCl 6M y se licuó. Se añadió quinientos uL de CHCl3:CH3OH (2:1) y la mezcla se licuó y se mantuvo sobre hielo al mismo tiempo que se llevaron a cabo las digestiones restantes. Las muestras se centrifugaron de nuevo y brevemente para afinar las capas. Se extrajo la capa inferior que contenía productos de la digestión con una pipeta pasteur y se colocó en un frasco de tapa ajustable de 12 x 32 mm. El material se volvió a extraer con 300 μL de CHCl3, se agitó, se centrifugó, y se combinó con las capas inferiores. Los productos de digestión se mantuvieron en hielo tanto como fue posible. La separación de cromatografía líquida de alto rendimiento se realizó tan pronto como fue posible después de la digestión para minimizar la migración de acilo.
B. Digestión de grasa sólida
0156 Se siguió el procedimiento para la digestión de aceite líquido descrito anteriormente excepto que se añadieron 20 μL de éster metílico 11:0 a 2,0 mg de grasa sólida.
3. Separación por cromatografía líquida de alto rendimiento.
0157 Los productos de la digestión se secaron en cloroformo hasta aproximadamente 200 μL. Cada muestra se transfirió, a continuación, en un inserto en un frasco de concha de 8 x 40 mm y se inyectaron 30 μL para análisis por cromatografía liquida de alto rendimiento.
0158 El sistema cromatográfico líquido de alto rendimiento se equipó con un detector de dispersión de luz evaporativo Varex ELSD IIA con una temperatura de tubo a 105°C y flujo de gas nitrógeno a 40 mL/min: un automuestrador Waters 712 Wisp, tres módulos de administración de disolvente Beckman 114M: un controlador Beckman 421A, un separador de corriente activado neumáticamente Rheodyne: y un microfraccionador Gilson. La columna de cromatografía es un cartucho de fase de sílica normal de 5 micras de 220 x 4,6 mm hecho por Brownlee.
0159 Los tres disolventes usados fueron:
A= hexano: tolueno 1:1
B= tolueno: acetato de eti10 3:1 C= 5% de ácido fórmico en acetato de etilo 0160 El perfil de gradiente fue como sigue:
Tiempo (min)
Función Valor Duración
Flujo 0
2,0 mL/min
0% B
10
0% C
2
2% C
25 6 min
14,0% C
2 1 min
15,0
Fin del programa
0161 Una mezcla cromatográfica estándar se prepara en hexano:tolueno 1:1 conteniendo lo siguiente: 0,2 mg/mL de triglicérido 16:0 2,0 mg/mL de 16:0 ácido graso libre0,2 mg/mL de di16:0 isómeros mezclados (1,2-diacilglicerol y 1,3diacilglicerol)
10 0,2 mg/mL de 3-mono acilglicerol 16:0 0,2 mg/mL de 2-mono acilglicerol 16:0
0162 Se recolectó automáticamente para cada muestra la fracción que contenía el pico de 2-mag mediante el método de relevos de eventos de tiempo controlado. Se usa un retardo de tiempo para sincronizar el detector con el 15 emisor del recolector. Los picos de 2-mag se recolectan y las fracciones se evaporan a temperatura ambiente durante la noche.
0163 La composición sn-2 da como resultado el relevo en la minimización de la migración de acilo. La aparición de picos de 1-monoacilglicerol y/o 3-monoacilglicerol en el cromatógrafo significan que ha tenido locus la migración 20 acilo.
4. Derivación
0164 Para derivar el aceite entero, se pesó 1,0 mg del aceite entero extraído en un frasco con tapa ajustada de 12
25 x 32 mm. A continuación, se añadió un mL de tolueno. La muestra se agitó y se extrajo una alícuota de 50 μL para su derivación. A las muestras secas de 2-mag, se añadieron 50 μL de tolueno. Tanto al aceite entero como a las fracciones 2-mag se añadieron 105 uL de H2S04/CH3OH @ 8,76% p. La tapa se ajustó herméticamente y la muestra se puso en reflujo durante una hora a 95°C. La mues tra se dejó enfriar y se añadieron 500 uL de NaCl al 10% p/v en agua y 60 uL de heptano. Se extrajo la capa orgánica y se colocó en un vial de tapa ajustable de 12 x 32 milímetros.
5. Análisis GLC.
0165 Se preparó un cromatógrafo en gas Hewlett Packard modelo 6890 equipado con una entrada capilar de separador/sin separador, detector FID, automuestreador serie 6890 y un integrador Alfa Omega 3392A para la 35 columna capilar como sigue:
A. Supelco Omegawax 250, 30 metros de longitud, 0,25 mm de diámetro interior, 0,25 um de espesor de película.
puerto de inyección
260 °C
detector
270 °C
temperatura inicial
170 gc
tiempo inicial
1,5 minuto
velocidad
30 grados por minuto
temperatura final
245 ˚C
tiempo final
6,5 minutos
volumen de inyección
1,5 Ul
presión de cabeza
25 psi
velocidad de separación
30
gas portador
He
gas de reemplazo
N2
gas del FID
H + aire
0166 Las composiciones porcentuales de ésteres. metílicos de ácidos grasos se calculan como porcentajes molares. Para las longitudes de cadena de carbono menores de 12, es deseable el uso de factores de respuesta teóricos o empíricos en el cálculo porcentual del área.
6. Cálculos
0167 Se calculó la distribución media de cada grupo acilo en cada posición sn-l y sn-3.
10 composición media de sn-l y sn-3 = (3 WO comp -MAG comp)/2
WO = aceite entero MAG = monoacilglicerol
15 0168 Los resultados de este análisis se presentan en la Tab1a 14. El GLA y el Δ6.9 18:2 se distribuyen de manera uniforme entre las posiciones sn-2 y sn-1,3. Este análisis no puede discriminar entre ácidos grasos en las posiciones de sn-l contra sn-3.
Ejemplo 9
Composiciones de ácidos grasos de plantas transgénicas
5 0169 Se analizaron plantas transgénicas Δ5 y Δ6 para determinar su contenido en ácidos grasos.
[0170] Se usó el siguiente protocolo para la extracción de aceite:
1.
Se pesaron aproximadamente 400 mg de semillas por duplicado para cada muestra.
2.
Las semillas se trituraron en un mortero y su mano. El mortero y la mano se enjuagaron dos veces
10 con 3 mL (2:1) (v:v) de CHCl3:CH3OH/MeOH. Se añadieron 6 mL adicionales (2:1) al frasco de vidrio de 20 mL (aceite extraído en un total de 12 mL 2:1).
3.
Las muestras se agitaron y se colocaron en un agitador orbital durante 2 horas con agitación ocasional.
4.
Se añadieron 5 mL de NaCl 1M a cada muestra. La muestra se revolvió, a continuación, se
15 centrifugó en una centrífuga a 2000 rpm durante 5 minutos. La fase inferior se extrajo usando una pipeta pasteur.
5. La fase superior se volvió a extraer con 5 mL adicionales. La muestra se revolvió, a continuación, se centrifugó en una centrífuga a 2000 rpm durante 5 minutos. La fase inferior se extrajo usando pipeta de pasteur y se añadió a la anterior fase inferior.
20 6. Se evaporó el CHCl3:CH3OH/MeOH bajo nitrógeno usando enfriamiento evaporativo. El frasco que contenía el aceite extraído se selló bajo nitrógeno. Se extrajeron entre 120 mg y 160 mg para cada muestra.
0171 Para el análisis de GC-MS, los ésteres metílicos de ácidos grasos se disolvieron en un volumen adecuado de
25 hexano y se analizaron usando un cromatógrafo de gas Hewlett Packard 5890 Serie II Plus (Hewlett Packard, Palo Alto, California) equipado con una columna capilar de silicio fundido Omegawax 320 y de 30 m x 0,32 mm de diámetro interno (Supelco, Bellefonte, PA) y un detector selectivo de masa Hewlett Packard serie 5972. Se interpretó el espectro de masa mediante comparación con el espectro de masa de la base de datos de estructura química NIST/EPA/NIH usando la estación MS Chem (#G1036A) (Hewlett Packard).
30 0172 Se analizó la línea transgénica 5531-6 por duplicado (A,B) y se comparó con la línea de control LP004-6. Los resultados del perfil de ácidos grasos se muestran en la Tabla 15.
0173 La línea transgénica 5538-19 se analizó por duplicado (A,B) y se comparó con la línea de control LP004-6. 35 Los resultados del perfil de ácidos grasos se muestran en la Tabla 16.
Tabla 15 Tabla 16
Perfil de Ácidos Grasos
CONTROL
CONTROL
TRANSGÉNICO TRANSGÉNICO
LP004-6A
LP004-6B 5531-6A 5531-6B
LRL-2043
LRL-2044 LRL-2042 LRL-2045
001 f0102.d
001 f0103.d 001 f0101.d 001 f0104.d
C12:0
C13:0
C14:0
0,053 0,061
C14:1
C15:0isómero
C15:0
C16:0
4,107 4,034 4,257 4,224
C16:1
0,181 0,173 0,200 0,199
C16:2
0,061 0,065 0,081 0,060
C17:0
C16:3
0,244 0,246 0,155 0,151
C16:4
C18:0
2,608 2,714 3,368 3,417
C18:1w9
65,489 66,454 59,529 59,073
C18:1w7
2,297 2,185 2,388 2,393
C18:2 5,9
6,144 6,269
C18:2w6
19,828 18,667 18,872 19,059
C18:3 5,9,12
0,469 0,496
C18:3w6
0,060
C18:3w3
1,587 1,587 1,428 1,418
C18:4w6
C18:4w3
C20:0
0,962 0,998 1,009 1,022
C20:1w11
1,336 1,335 1,058 1,065
C20:1w9
C20:1w7
0,076 0,080
C20:2w6
0,073 0,073 0,052
C20:3w6
C20:4w6
C20:3w3
C20:4w3
C20:5w3
C22:0(1,000)
0,542 0,558 0,463 0,467
C22:1w11
0,038
C22:1w9
C22:1w7
0,034
C21:5
C23:0
0,029
C22:4w6
C22:5w6
C22:5w3
C24:0
0,373 0,391 0,280 0,283
C22:6w3
0,314 0,317 0,223 0,212
C24:1w9
TOTAL
100,00 100,00 100,00 100,00
Perfil de Ácidos Grasos
5538-19A
5538-19B LP004-6A LP004-6B
TRANSGÉNICO
TRANSGÉNICO
CONTROL CONTROL
LRL-2166
LRL-2167 LRL-2168 LRL-2169
C6:0
0,004 0,005
C8:0
0,007 0,007 0,004 0,005
C10:0
0,012 0,012 0,008 0,008
C12:0
0,020 0,020 0,011 0,012
C13:0
C14:0
0,099 0,108 0,050 0,050
C14:1w5
C15:0
0,059 0,068 0,017 0,019
C16:0
5,272 5,294 4,049 4,057
C16:1
0,350 0,417 0,197 0,208
C16:2
0,199 0,187 0,076 0,077
C17:0
0,092 0,089 0,078 0,077
C12:0
0,020 0,020 0,011 0,012
C13:0
C14:0
0,099 0,108 0,050 0,050
C14:1w5
C15:0
0,059 0,068 0,017 0,019
C16:0
5,272 5,294 4,049 4,057
C16:1
0,350 0,417 0,197 0,208
C18:3w6
12,565 12,595 0,013 0,015
C18:3w3
1,084 1,137 1,501 1,542
C18:4
0,017 0,013 0,011 0,008
C18:4
0,028 0,024
C20:0
1,138 1,104 0,937 0,943
C20:1
1,115 1,085 1,330 1,327
C20:2w6
0,150 0,143 0,068 0,071
C20:3w6
0,026 0,025 0,014 0,012
C20:4w6
C20:3w3
C20:4w3
C20:5w3
C22:0
0,506 0,484 0,535 0,539
C22:1
0,017 0,020 0,032 0,032
C21:5
0,040 0,030 0,031
C22:4w6
0,038 0,064 0,015 0,014
C22:5w6
C22:5w3
0,023 0,018 0,021 0,017
C24:0
0,352 0,321 0,353 0,362
C22:6w3
0,009
C24:1w9
0,129 0,121 0,260 0,255
TOTAL
100,00 100,00 100,00 100,00
Ejemplo 10
Expresión combinada de 6 y 12 desaturasas en B. Napus lograda por cruce.
5 0174 Las plantas que contenían la Δ6 o Δ12 desaturasa se cruzaron y se analizaron medias semillas individuales F1 para determinar la composición de ácidos grasos mediante GC. Los datos de uno de estos cruces se dan en la Tabla 17. Los padres para el cruce fueron 5538-LP004-25-2-25 (expresa Δ6) y 5542-SP30021-10-16 (expresa Δ12). Se hicieron cruces recíprocos y se muestran en la tabla los resultados de 25 semillas F1 individuales de cada uno.
10 Los cruces se describen de manera que el primer padre indicado es el femenino. Ambos conjuntos de cruces dieron aproximadamente los mismos resultados. En comparación con los padres, el Δ6,9 18:2 disminuyó, y el GLA aumentó. Los niveles de Δ9,12 18:2 aumentaron en la mayoría de las F1. Nótese que éstas eran semillas F1 y sólo contienen un conjunto de cada desaturasa. En generaciones futuras y selección de eventos homocigotos para desaturasa, los niveles obtenidos de GLA en F2 pueden ser todavía mayores.
15 0175 Puede ser en algunas situaciones preferible combinar rasgos mediante cruce a combinar rasgos en un ADN-
T. Particularmente, si ambos genes se extraen del mismo promotor (en este caso napin), surge el promotor de silenciamiento que puede favorecer esta aproximación al sobreponer múltiples ADNc en una construcción.
20 0176 De manera alternativa, en algunos casos, combinar múltiples ADNc en un AON-T puede ser el método de elección. Los resultados se muestran en la Tabla 17.
Ejemplo 11
Expresión de desaturasas de M. alpina en soja
0177 Las desaturasas de M. alpina se pueden usar para conducir la producción de GLA y otros PUFA en semilla de soja mediante el uso de las siguientes construcciones de expresión. Dos medios mediante los cuales el ADN exógeno se puede insertar en el genoma de la semilla de soja son la infección de Agrobacterium o el cañón de partículas. La transformación por cañón de partículas se describe en la P US 5,503,998. Las plantas se pueden seleccionar usando un marcador de resistencia a glifosfato (4,971,908). La transformación por Agrobacterium de la semilla de soja está bien establecida para una persona con experiencia ordinaria en la materia.
0178 Para la expresión especifica de la semilla, las regiones de codificación de los ADNc desaturasa se colocan bajo el control de la región reguladora 5' del gen de proteína de almacenamiento de la conglicina beta tipo alfa Glycine max. La región específica que se puede usar son los nucleótidos 78-921 de gi 1.69928 (Doyle, J.J., Schuler, M.A., Godette, W.D., Zenger, V., Beachy, R.N., y Slightom J.L., 1986 J. Biol. Chem. 261 (20), 9228-9238). La región reguladora 3’ que se puede usar procede del gen de la subunidad menor de la ribulosa 1,5 bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (rbcS) de guisante. Las secuencias específicas que se van a usar son los nucleótidos 1-645 de gi 169145 (Hunt, A.G. 1998 ADN 7:329-336).
0179 Dado que las semillas de soja contienen más 18:2, y tal vez más actividad L12 desaturasa endógena que Brassica, el efecto de la L12 desaturasa de Mortierella en alcanzar niveles óptimos de GLA se puede probar como sigue. Una construcción que contiene el ADNc L6 se puede usar para ver si L6.9 18:2 se produce junto con GLA. Una construcción que contiene la L12 desaturasa se puede usar para ver si la cantidad de 18:2 se puede aumentar en soja. Una construcción que contiene tanto la desaturasa L6 como la L12 se puede usar para producir niveles óptimos GLA. De manera alternativa, las plantas que contienen cada una de las desaturasas solas se pueden cruzar, si es necesario, para combinar los genes.
[0180] Se pueden hacer construcciones similares para expresar la L5 desaturasa sola, o en combinación con L12 y/o L6 desaturasas.
Ejemplo de referencia F
Secuencias de gen de desaturasa humana
[0181] Se aislaron las secuencias de genes desaturasa humanas, potencialmente involucradas en la biosíntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga basándose en la homología entre las secuencias de ADNc humano y las secuencias del gen de desaturasa de Mortierella alpina Se encontraron las tres "cajas de histidina" conservadas que se sabe que se conservan entre las desaturasas unidas a la membrana. Como con otras desaturasas unidas a la membrana, se encontró que el motivo final de la caja de histidina HXXHH era QXXHH. La secuencia de aminoácidos de las desaturasas humanas presuntas exhibieron homología con las L5, L6, L9, y L12 desaturasas de
M. alpina.
[0182] Las secuencias de ADNc de L5 desaturasa y L6 desaturasa de M. alpina se usaron para consultar la base de datos Lifeseq de Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, California 94304. La secuencia de L5 desaturasa se dividió en fragmentos: (1) aminoácidos números 1-150; (2) aminoácidos números 151-300; y (3) aminoácidos números 301
446. La secuencia de L6 desaturasa se dividió en tres fragmentos: (1) aminoácidos números 1-150; (2) aminoácidos números 151-300; y (3) aminoácidos números 301-457. Estos fragmentos de polipéptido se investigaron en la base de datos usando el algoritmo "tblastn". Este algoritmo compara una secuencia de consulta de proteína con una base de datos de secuencias de nucleótidos dinámicamente traducidas en los seis marcos de lectura (ambas cadenas).
[0183] Los fragmentos polipeptídicos 2 y 3 de L5 y L6 de M. alpina tienen homologías con las secuencias del CloneID como se presenta en la Tabla 18. El ClonID representa una secuencia individual a partir de la base de datos LifeSeq de Incyte. Después de que se revisaran los resultados de "tblastn", se buscó información del clon con los valores de referencia por omisión de rigor de �50, y productscore :100 para diferentes números de CloneID. Los resultados de información de clon desplegaron la información que incluye ClusterID, CloneID, Biblioteca, HitID, Descripción de Hit (golpe). Cuando se seleccionaron, el número ClusterID desplegó la información de clon de todos los clones que pertenecían a ese ClusterID. El comando de Assemble (ensamblar) ensambla todos los CloneID que comprenden el ClusterID. Se usaron los siguientes valores de referencia por omisión para el ensamble GCG (Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin 53705):
Tamaño de palabra Solapamiento mínimo Rigor Identidad mínima Hueco máximo Peso del hueco: Peso de longitud: 7 14 0,8 14 10 8 2
[0184] Los resultados del ensamblaje GCG desplegaron los contigs generados en base a la información de secuencia dentro de la CloneID. Un “contig” es una alineación de secuencia de ADN basada en áreas de homología entre estas secuencias. Se generó una nueva secuencia (secuencia de consenso) basándose en las secuencias de 5 ADN alineadas en un contigo Se identificó el contig que contenía la CloneID, y se editaron los sitios ambiguos de la secuencia de consenso basándose en la alineación de las CloneIDs (véase SEC ID NO:31 -SEC ID NO:35) para generar la mejor secuencia posible. El procedimiento se repitió para los seis CloneID listados en la Tabla 18. Esto produjo cinco contigs únicos. Las secuencias consenso editadas de los 5 contigs se importaron al programa de software Sequencher (Gene Codes Corporation, A,nn Arbor, Michigan 48 105). Estas secuencias consenso se
10 ensamblaron. El contig 2511785 se solapa con el contig 3506132, y este nuevo contig se denominó 2535 (SEC ID NO:37). Los contigs del programa Sequencher se copiaron en el paquete de software de análisis de secuencias del GCG.
[0185] Cada contig se tradujo en los seis marcos de lectura en secuencias de proteínas. Las secuencias L5 (Ma29)
15 y L6 (Ma524) de M. alpina se compararon con cada uno de los contigs traducidos usando la búsqueda FastA (una búsqueda de Pearson y Lipman para determinar la similitud entre una secuencia de consulta y un grupo de secuencias del mismo tipo (ácido nucleico o proteína)). La homología entre estas secuencias sugiere los marcos de lectura abiertos de cada contig. La homología entre L5 y L6 de M. alpina con los contigs 2535 y 3854933 se utilizó para crear el contig final denominado 253538a. La Figura 9 es la selección por comparación FastA del contig final
20 253538a y Ma29, y la Figura 10 es la selección por comparación FastA del contig final 253538a. y Ma524. Las secuencias de ADN para los distintos contigs se presentan en SEC ID NO:31 -SEC ID NO:37 Las distintas secuencias de péptidos se muestran en SEQ ID NO:38 -SEC ID NO:44.
[0186] Aunque el marco de lectura abierta se generó combinando los dos contigs, el contig 2535 muestra que existe
25 una única secuencia en el inicio de este contig que no coincide con el contig 3854933. Por lo tanto, es posible que estos contigs se generaran a partir de genes humanos similares a desaturasa independientes.
[0187] El contig 253538a contiene un marco de lectura abierto que codifica 432 aminoácidos. Comienza con Gln (CAG) y termina con el codón de parada (TGA). El contig 253538a se alinea tanto con la secuencia L5 como L6 de
30 M. alpina, sugiriendo que podría ser cualquiera de las dos desaturasas, así como otras desaturasas conocidas que comparten homología entre sí. Los contigs individuales listados en la Tabla 18, así como el contig intermedio 2535 y el contig final 253538a se pueden utilizar para aislar los genes completos de desaturasas humanas.
Usos de las desaturasas humanas
35 [0188] Estas secuencias humanas se pueden expresar en levaduras y plantas que utilizan los procedimientos descritos en los ejemplos anteriores. Para la expresión en células de mamíferos y animales transgénicos, estos genes pueden proporcionar una desviación de codón superior. Además, estas secuencias se pueden usar para aislar genes desaturasa relacionados con otros organismos.
Tabla 18
Secciones de las Desaturasas
CloneID de la Base de Datos LifeSeq Palabra clave
151-300 L5
3808675 Desaturasa de ácido graso
301-446 L5
354535 L6
151-300 L6
3448789 L6
151-300 L6
1362863 L6
151-300 L6
2394760 L6
301-457 L6
3350263 L6
Ejemplo de referencia G
Identificación de Homólogos a las .5 y .6 desaturasas de M. alpina
[0189] Se identificó una secuencia de ácido nucleico que codifica una presunta L5-desaturasa a través de la búsqueda de TBLASTN de las bases de datos de secuencias tag expresadas a través de NCBI usando los 50 aminoácidos 100-446 de Ma29 como consulta. La porción truncada de la secuencia Ma29 se usó para evitar recoger
homologías basadas en la porción de citocromo b5 en el término N de la desaturasa. La secuencia de aminoácidos deducida de un est de Dictyostelium discoideum (número de acceso C25549) muestra una homología muy significativa con Ma29 y una menor, aunque todavía homología significativa, con Ma524. La secuencia de ADN se presenta como SEC ID NO:45. La secuencia de aminoácidos se presenta como SEC ID NO:46.
Ejemplo de referencia H
Identificación de Homólogos de .5 y .6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFAs.
[0190] Para buscar las desaturasas involucradas en la producción de PUFA, se construyó una biblioteca de ADNc a partir del ARN total aislado de Phaeodactylum tricornutum. Se construyó una biblioteca de ADNc basada en plásmido en pSPORT1 (GIBCO-BRL) siguiendo las instrucciones del fabricante usando un kit comercialmente disponible (GIBCO-BRL). Se secuenciaron clones de ADNc aleatorios y se identificaron las secuencias de ácido nucleico que codifican presuntas L5 o L6 desaturasas a través de la búsqueda BLAST de las bases de datos y la comparación con las secuencias de Ma29 y Ma524.
[0191] Se identificó un clon de la biblioteca del Phaeodactylum con homología con Ma29 y Ma524; se denomina 144-011-B12. La secuencia de ADN se presenta como SEC ID NO:47. La secuencia de aminoácidos se presenta como SEC ID NO:48.
Ejemplo de referencia I
Identificación de homólogos de .5 y .6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFAs.
[0192] Para buscar las desaturasas involucradas en la producción de PUFA, se construyó una biblioteca de ADNc a partir de ARN total aislado de la especie Schizochytrium. Se construyó una biblioteca de ADNc basada en plásmido en pSPORT1 (GIBCO-BRL) siguiendo las instrucciones del fabricante usando un kit disponible comercialmente (GIBCO-SRL). Se secuenciaron clones de ADNc aleatorios y se identificaron secuencias de ácido nucleico que codifica presuntas L5 o L6 desaturasas a través de la búsqueda BLAST de las bases de datos y la comparación con las secuencias de Ma29 y Ma524.
[0193] Se identificó un clon de la biblioteca de Schizochytrium con homología con Ma29 y Ma524; se denominó 81-23-C7. Este clon contenía un inserto de aproximadamente 1 kb. Se obtuvo la secuencia parcial a partir de cada extremo del clon usando los cebadores de secuenciamiento universales hacia adelante y hacia atrás. La secuencia de ADN procedente del cebador delantero se presenta como SEC ID NO:49. La secuencia del péptido se presenta como SEC ID NO:50. La secuencia de ADN procedente del cebador inverso se presenta como SEC ID NO:51. La secuencia de aminoácidos del cebador inverso se presenta como SEC ID NO:52.
Ejemplo 12
Composiciones Nutricionales
[0194 Los PUFA de los ejemplos previos se pueden usar en varios complementos nutricionales, formulaciones para lactantes, sustitutos nutricionales y otras soluciones nutricionales.
I. FORMULACIONES PARA NIÑOS
A. Isomil® Fórmula de Soja con Hierro.
[0195] Uso: Como bebida para lactantes, niños y adultos con una alergia o sensibilidad a la leche de vaca. Una alimentación para pacientes con desórdenes para los cuales se debe evitar la lactosa: deficiencia de lactasa, intolerancia a la lactosa y galactosemia.
[0196] Características:
Aislado de proteína de soja para evitar los síntomas de alergia o sensibilidad a la proteína de la leche de vaca;
Formulación sin lactosa para evitar diarrea asociada con lactosa;
Osmolalidad baja (240 mOsm/kilogramos de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmótica;
Carbohidratos duales (jarabe de maíz y sacarosa) designadas para aumentar la absorción de carbohidratos y reducir el riesgo de exceder la capacidad de absorción del intestino dañado;
1,8 mg de hierro (como sulfato terroso) por 100 calorías para ayudar a prevenir la deficiencia de hierro;
Niveles recomendados de vitaminas y minerales;
Aceites vegetales para proporcionar los niveles recomendados de ácidos grasas esenciales.
Color blanco de leche, consistencia similar a la leche y aroma placentero.
[0197] Ingredientes: (Pareve, )) 85% de agua, 4,9% de j
de soja, 1,9% de aislado de proteína de soja, 1,4% de aceite de coco, 0,15% de citrato de calcio, 0,11% de fosfato de calcio tribásico, citrato de potasio, fosfato de potasio monobásico, cloruro de potasio, mono y diglicéridos, lecitina de soja, carragenina, ácido ascórbico, L-metionina, cloruro de magnesio, fosfato de potasio dibásico, cloruro de sodio, cloruro de colina, taurina, sulfato terroso, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro de potasio, filoquinona, biotina, selenita de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina.
B. Isomil® DF Fórmula de Soja para Diarrea.
[0198] Uso: Como alimentación a corto plazo para el manejo dietético de diarrea en lactantes y bebés.
[0199] Características:
Primera fórmula para lactantes en contener fibra dietética añadida a partir de fibra de soja específicamente para el manejo de la diarrea.
Clínicamente muestra reducir la duración de producción de heces flojas, aguadas, durante diarrea de ligera a severa en niños.
Nutricionalmente completa para satisfacer las necesidades nutrimentales del lactante.
Aislado de proteína de soja con L-metionina añadida que satisface o excede los requerimientos de todos los aminoácidos esenciales del lactante.
Formulación sin lactosa para evitar diarrea asociada con lactosa;
Osmolalidad baja (240 mOsm/kilogramo de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmótica.
Carbohidratos duales (jarabe de maíz y sacarosa) designadas para aumentar la absorción de carbohidrato y reducir el riesgo de exceder la capacidad de absorción del intestino dañado;
Satisface o excede los niveles de vitaminas o minerales recomendados por el Comité sobre Nutrición de la Academia Norteamericana de Pediatría y los requeridos por la Ley de Fórmula para Lactantes.
1,8 miligramos de hierro (como sulfato ferroso) por 100 calorías para ayudar a prevenir la deficiencia de hierro.
Aceites vegetales para proporcionar los niveles recomendados de ácidos grasos esenciales.
[0200] Ingredientes: (Pareve,®) 86% de agua, 4,8% de jarabe de maíz, 2,5% de azúcar (sacarosa), 2,1% de aceite de soja, 2,0% de aislado de proteína de soja, 1,4% de aceite de coco, 0,77% de fibra de soja, 0,12% de citrato de calcio, 0,11% de fosfato de calcio tribásico, 0,10% de citrato de potasio, cloruro de potasio, fosfato de potasio monobásico, mono y diglicéridos, lecitina de soja, carragenina, cloruro de magnesio, ácido ascórbico, L-metionina, fosfato de potasio dibásico, cloruro de sodio, cloruro de colina, taurina, sulfato terroso, m-inositol, acetato de alfatocoferilo, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro de potasio, filoquinona, biotina, selenita de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina.
C. Isomil® SF Fórmula de Soja sin Sacarosa con Hierro
[0201] Uso: Como bebida para lactantes , niños y adultos con alergia o sensibilidad a la proteína de la leche de vaca
o una intolerancia a la sacarosa. Una alimentación para pacientes con desórdenes para los cuales debería evitarse la lactosa y la sacarosa.
[0202] Características:
Aislado de proteína de soja para evitar síntomas de alergia o sensibilidad a la proteína de la leche de vaca;
Formulación sin lactosa para evitar diarrea asociada a lactosa;
Libre de sacarosa para el paciente que no puede tolerar la sacarosa;
Osmolalidad baja (180 mOsm/kilogramo de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmótica;
1,8 miligramos de hierro (como sulfato ferroso) por 100 calorías para ayudar a prevenir la deficiencia de hierro;
Niveles recomendados de vitaminas y minerales;
Aceites vegetales para proporcionar los niveles recomendados de ácidos grasos esenciales;
Color blanco de leche, consistencia parecida a la leche y aroma agradable.
[0203] Ingredientes: (Pareve, ® ) 75% de agua, 11,8% de almidón de maíz hidrolizado, 4,1% de aceite de soja, 4,1% de aislado de aislado de proteína de soja, 2,8% de aceite de coco, 1,0% de almidón de maíz modificado, 0,38% de fosfato de calcio tribásico, 0,17% de citrato de potasio, 0,13% de cloruro de potasio, mono y diglicéridos, lecitina de soja, cloruro de magnesio, ácido ascórbico, L-metionina, carbonato de calcio, cloruro de sodio, cloruro de colina, carragenina, taurina, sulfato terroso, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro de potasio, filoquinona, biotina, selenita de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina.
D. Isomil® 20 Fórmula de Soja con Hierro lista para alimento, 20 calorías/fl oz.
[0204] Uso: Cuando se desea una alimentación con soja.
[0205] Ingredientes: (Pareve, ®) 85% de agua, 4,9% de jarabe de maíz, 2,6% de azúcar (sacarosa), 2,1% de aceite de soja, 1,9% de aislado de proteína de soja, 1,4% de aceite de coco, 0,15% de citrato de calcio, 0,11% de fosfato de calcio tribásico, citrato de potasio, fosfato de potasio monobásico, cloruro de potasio, mono y diglicéridos, lecitina de soja, carragenina, ácido ascórbico, L-metionina, cloruro de magnesio, fosfato de potasio dibásico, cloruro de sodio, cloruro de colina, taurina, sulfato terroso, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro de potasio, filoquinona, biotina, selenita de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina.
E. Similac® Fórmula para lactante.
[0206] Uso: Cuando se necesita una fórmula para lactante: si se toma la decisión de descontinuar la alimentación con pecho antes de la edad del año de edad, si se necesita un suplemento a la alimentación al pecho o como alimentación de rutina si no se adopta la alimentación al pecho.
[0207] Características:
Proteína de calidad y cantidad adecuada para el buen desarrollo; desnaturalizada por calor, lo que reduce el riesgo de pérdida de sangre entérica asociada con la leche;
Grasa de una mezcla de aceites vegetales (doblemente homogeneizados), que proporciona ácido linoleico esencial que se absorbe fácilmente;
Carbohidrato como lactosa en proporción similar a la de la leche humana;
Carga de soluto renal bajo para minimizar la tensión en los órganos que se desarrollan;
Formas en polvo, líquido concentrado y listo para tomarse.
[0208] Ingredientes: (® -D) agua, leche descremada, lactosa, aceite de soja, aceite de coco, mono y diglicéridos, lecitina de soja, ácido ascórbico, carragenina, cloruro de colina, taurina, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, niacinamida, sulfato terroso, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, biotina, selenita de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina.
F. similac® NeoCare Fórmula con hierro para lactantes prematuros
[0209] Uso: Para las necesidades nutricionales especiales del lactante prematuro después de la salida del hospital. Similac NeoCare es una fórmula nutricionalmente completa desarrollada para proporcionar a los lactantes prematuros calorías, proteínas, vitaminas y minerales extraordinarios necesarios para promover la ganancia de peso y apoyar su desarrollo.
[0210] Características:
Reduce la necesidad de complementación calórica y de vitaminas. Más calorías (22 calorías/fl oz) que las
fórmulas para el término estándar (20 calorías/fl oz);
Mezcla de grasas altamente absorbidas, con triglicéridos de cadena media (aceite MCT) para ayudar a
satisfacer las necesidades digestivas especiales de los lactantes prematuros;
Altos niveles de proteínas, vitaminas y minerales cada 100 calorías para extender el soporte nutricional
iniciado en el hospital.
Más calcio y fósforo para mejorar la mineralización de los huesos.
[0211] Ingredientes: ®-D sólidos de jarabe de maíz, leche descremada, lactosa, concentrado de proteína de suero de leche, aceite de soja, aceite de cártamo con alto contenido oleico, aceite de coco fraccionado (triglicéridos de cadena media), aceite de coco, citrato de potasio, fosfato de calcio tribásico, carbonato de calcio, ácido ascórbico, cloruro de magnesio, cloruro de potasio, cloruro de sodio, taurina, sulfato terroso, m-inositol, cloruro de colina, palmitato de ascorbilo, L-carnitina, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, niacinamida, tocoferoles mezclados, citrato de sodio, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, clorhidrato de cloruro de tiamina, palmitato de vitamina A, beta caroteno, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, biotina, selenita de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina.
G. Simi1ac Natural Fortificador de leche humana baja en hierro de cuidado natural lista para su uso, 24 calorías/fl oz.
[0212] Uso: Diseñada para mezclarse con leche humana o para alimentarse alternativamente con leche humana para lactantes de bajo peso al nacer.
[0213] Ingredientes: ®-D agua, leche descremada, almidón de maíz hidro1izacto, lactosa, aceite de coco fraccionado (triglicéridos de cadena media), concentrado de proteína de suero de leche, aceite de soja, aceite de coco, fosfato de calcio tribásico, citrato de potasio, cloruro de magnesio, citrato de sodio, ácido ascórbico, carbonato de calcio, mono y diglicéridos, lecitina de soja, carragenina, cloruro de colina, m-inositol, taurina, niacinamida, Lcarnitina, acetato de alfa tocoferilo, sulfato de zinc, cloruro de potasio, pantotenato de calcio, sulfato terroso, sulfato cúprico, riboflavina, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, biotina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, vitamina D3, selenita de sodio y cianocobalamina.
[0214] Se pueden sustituir y/o añadir varios PUFA de esta invención a las fórmulas para lactante s descritas anteriormente y a otras fórmulas para lactantes conocidas para los expertos en la técnica.
II.
FORMULACIONES NUTRITIVAS
A.
ENSURE®
[0215] Uso: ENSURE es un alimento líquido de bajo contenido en residuos diseñado principalmente como un complemento nutricional oral para ser usado con o entre comidas o, en cantidades adecuadas como sustituto de una comida. ENSURE está libre de lactosa y de gluten, y es conveniente para su uso en dietas modificadas, incluyendo dietas bajas en colesterol. Aunque principalmente es un suplemento oral, se puede alimentar por tubo.
Condiciones del Paciente:
[0216]
Para pacientes con dietas modificadas; Para pacientes ancianos con riesgo de nutrición; Para pacientes con pérdida de peso involuntaria; Para pacientes que se recuperan de una enfermedad o cirugía; Para pacientes que necesitan una dieta de bajo contenido en residuos. Ingredientes:
[0217] ®-D Agua, azúcar (sacarosa), maltodextrina (maíz), caseinatos de calcio y de sodio, aceite de cártamo con alto contenido en oleico, aislado de proteína de soja, aceite de soja, aceite de canola, citrato de potasio, fosfato de calcio tribásico, citrato de sodio, cloruro de magnesio, fosfato de magnesio dibásico, sabor artificial, cloruro de sodio, lecitina de soja, cloruro de colina, ácido ascórbico, carragenina, sulfato de zinc, sulfato ferroso, acetato de alfatocoferilo, goma de gelan, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato de manganeso, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, ribof1avina, ácido fólico, molibdato de sodio, cloruro de cromo, biotina, yoduro de potasio, selenato de sodio.
B. ENSURE® BARRAS
[0218] Uso: ENSURE BARRAS es una nutrición equilibrada, completa para uso complementario entre o con las comidas. Proporciona una alternativa deliciosa, rica en nutrientes a otros refrigerios. ENSURE BARS contiene menos de 1 gramo de lactosa/por barra, y el sabor a Brownie de chocolate está libre de gluten. (El sabor Honey Graham Crunch contiene gluten).
Condiciones del Paciente:
[0219]
Para pacientes que necesitan calorías, proteínas, vitaminas y minerales extras.
Especialmente útil para personas que no toman suficientes calorías y nutrientes;
Para personas que tienen la capacidad de masticar y deglutir;
No para ser usado por personas con alergia a los cacahuates o a cualquier tipo de alergia a las nueces.
Ingredientes:
[0220] Honey Graham Crunch -Jarabe de maíz con alto contenido en fructuosa, aislado de proteína de soja, azúcar moreno, miel, maltodextrina (maíz), arroz inflado (arroz molido, azúcar [sacarosa], sal [cloruro de sodio] y malta), salvado de avena, aceites de semilla de algodón y de soja parcialmente hidrogenados, polisacárido de soja, glicerina, concentrado de proteína de suero de leche, polidextrosa, fructosa, caseinato de calcio, polvo de cacao, sabores artificiales, aceite de canola, aceite de cártamo con alto contenido oleico, leche seca desgrasada, polvo de suero de leche, lecitina de soja y aceite de maíz. Fabricado en unas instalaciones que procesan nueces.
Vitaminas y minerales:
[0221] Fosfato de calcio tribásico. fosfato de potasio dibásico, óxido de magnesio, sal (cloruro de sodio) , cloruro de potasio, ácido ascórbico, ortofosfato férrico, acetato de alfa- tocoferilo, niacinamida, óxido de zinc, pantotenato de calcio, gluconato de cobre, sulfato de manganeso, caroteno, clorhidrato de piridoxina, mononitrato de tiamina, ácido fólico, biotina, cloruro de cromo, yoduro de potasio, selenato de sodio, molibdato de sodio, filoquinona, vitamina D3 y
cianocobalamina.
Proteína:
5 [0222] Honey Graham Crunch -La fuente de proteína es una mezcla de aislado de proteína de soja y proteínas de
leche.
Aislado de proteína de soja
74%
Proteínas de leche
26%
Grasas:
10
[0223] Honey Graham Crunch -La fuente de grasa es una mezcla de aceites parcialmente hidrogenados de semilla de algodón y de soja, aceites de canola (semilla de colza), cártamo con alto oleico, y de maíz y lecitina de soja.
Aceites semilla de maíz y de soja hidrogenadas parcialmente 76% Aceite de canola 8% Aceite de cártamo con alto oleico 8% Aceite de maíz 4% Lecitina de soja 4%
15 Carbohidratos:
[0224] Honey Graham Crunch -La fuente de carbohidratos es una combinación de jarabe de maíz alto en fructosa, azúcar moreno, maltodextrina, miel, arroz inflado, glicerina, polisacárido de soja, y salvado de avena.
Jarabe de maíz alto en fructosa 24%
Azúcar moreno 21%
Maltodextrina 12%
Miel 11%
Arroz inflado 9%
Glicerina 9%
Polisacárido de soja 7%
Salvado de avena 7%
C. ENSURE ALTA PROTEINA
[0225] Uso: ENSURE ALTA PROTEINA es un concentrado alto en proteínas de alimento líquido diseñado para personas que requieren calorías, proteínas, vitaminas y minerales adicionales en sus dietas. Se puede usar como 25 complemento nutricional oral o entre comidas o en cantidades adecuadas como sustituto de una comida. ENSURE
ALTA PROTEINA está libre de lactosa y de gluten, y es conveniente para su uso por personas que se recuperan de
cirugía general o fracturas de cadera y por pacientes con riesgo de úlceras por presión.
Condiciones del Paciente 30
[0226] Para pacientes que requieren calorías, proteínas vitaminas y minerales adicionales, tales como los pacientes
que se recuperan de cirugía general o de fracturas de cadera, pacientes con riesgo de úlceras por presión, y
pacientes en dietas bajas en colesterol.
35 Características
[0227]
Bajo en grasas saturadas;
Contiene 6 gramos de grasa total y menos de miligramos de colesterol por ración; 40 Sabor rico cremoso;
Excelente fuente de proteína, calcio, y otras vitaminas y minerales esenciales
Para dietas bajas en colesterol
Libre de lactosa, fácilmente digerido
45 Ingredientes:
[0228] Supremo de Vainilla: Agua -O, azúcar (sacarosa), maltodextrina (maíz), caseinatos de calcio y de sodio,
aceite de cártamo con alto contenido o1eico, aislado de proteína de soja, aceite de soja, aceite de canola, citrato de
potasio, fosfato de calcio tribásico, citrato de sodio, cloruro de magnesio, fosfato de magnesio dibásico, sabor 50 artificial, cloruro de sodio, lecitina de soja, cloruro de colina, ácido ascórbico, carragenina, sulfato de zinc, sulfato ferroso, acetato de alfa-tocoferilo, goma de Gellan, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato de manganeso, sulfato de cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, ácido fólico, molibdato de sodio, cloruro de cromo, biotina, yoduro de potasio, selenato de sodio, filoquinona, vitamina D3 y cianocobalamina.
Proteína [0229] La fuente de proteína es una mezcla de dos proteínas de alto valor biológico: caseína y soja.
Caseinatos de sodio y calcio 85%
Aislado de proteína de soja 15%
Grasas:
[0230] La fuente de grasa es una mezcla de tres aceites: cártamo con alto contenido oleico, canola, y soja.
Aceite de cártamo alto en oleico 40% Aceite de canola 30% Aceite de soja 30%
[0231] El nivel de grasa en ENSURE ALTA PROTEINA satisface los requisitos de la American Heart Association (AHA). Los 6 gramos de grasa en ENSURE ALTA PROTEINA representan el 24% de las calorías totales, con un 2,6% de grasa procedente de ácidos grasos saturados y 7,9% de ácidos grasos poliinsaturados. Estos valores están dentro de los requisitos de la American Heart Association de :30% de calorías totales de grasa, <10% de calorías de ácidos grasos saturados, y :10 de calorías totales de ácidos grasos poliinsaturados.
Carbohidratos:
[0232] ENSURE ALTA PROTEINA contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. La dulzura suave Y la variedad de sabores (supremo de vainilla, chocolate royal, mora silvestre y plátano), más VARI-FLAVORSO® Flavor pacs en nuez, cereza, fresa, limón y naranja ayudan a evitar la fatiga de sabor y ayudan a satisfacer el gusto del paciente.
Sabores vainilla y otros sin chocolate [0233]
Sacarosa 60% Maltodextrina 40%
Chocolate
[0234]
Sacarosa 70% Maltodextrina 30%
D. ENSURE® LIGHT
[0235] Uso: ENSURE LIGHT es un alimento líquido bajo en grasas diseñado para usarse como complemento nutricional oral con o entre comidas. ENSURE LIGHT está libre de lactosa y de gluten, y es conveniente para su uso en dietas modificadas, que incluyen dietas bajas en colesterol.
Condiciones del Paciente:
[0236] Para pacientes de peso normal o con sobrepeso que necesitan nutrición extra en un suplemento que contiene un 50% menos de grasa y un 20% menos de calorías que ENSURE. Para adultos sanos que no comen correctamente y necesitan nutrición extra.
Características : [0237]
Bajo en grasas y grasas saturadas; Contiene 3 gramos de grasa total por ración y <5 miligramos de colesterol;
Sabor rico, cremoso Excelente fuente de calcio y otras vitaminas y minerales esenciales; Para dietas bajas en colesterol; Libre de lactosa, fácilmente digerido.
Ingredientes:
[0238] Vainilla a la francesa: Agua ® -D, maltodextrina (maíz), azúcar (sacarosa), caseinato de calcio, aceite de cártamo con alto contenido oleico, aceite de canola, cloruro de magnesio, citrato de sodio, citrato de potasio, fosfato de potasio dibásico, fosfato de magnesio dibásico, sabor natural y artificial, fosfato de calcio tribásico, gel de celulosa, cloruro de colina, lecitina de soja, carragenina, sal (cloruro de sodio) , ácido ascórbico, goma de celulosa, sulfato terroso, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, niacinamida, sulfato de manganeso, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, clorhidrato de cloruro de tiamina, palmitato de vitamina A, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, cloruro de cromo, ácido fólico, molibdato de sodio, biotina, yoduro de potasio, selenato de sodio, filoquinona, vitamina D3 y cianocobalamina.
Proteínas:
[0239] La fuente de proteína es el caseinato de calcio
Caseinato de calcio al 100%
Grasas
[0240] La fuente de grasa es una mezcla de dos aceites: cártamo con alto contenido oleico y canola.
Aceite de cártamo con alto contenido oleico 70% Aceite de canola 30%
[0241] El nivel de grasa en ENSURE LIGHT satisface los requisitos de la American Heart Association (AHA). Los 3 gramos de grasa en ENSURE LIGHT representan el 13,5% del total de calorías, siendo el 1,4% de la grasa de ácidos grasos saturados y el 2,6% de ácidos grasos poliinsaturados. Estos valores están dentro de los requisitos de la American Heart Association de :30% de calorías totales de grasa, <10% de calorías de ácidos grasos saturados, y :10% de calorías totales de ácidos grasos poliinsaturados.
Carbohidrato
[0242] ENSURE LIGHT contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. El sabor chocolate contiene también jarabe de maíz. La dulzura suave y la variedad de sabores (vainilla a la francesa, chocolate supremo, batido de fresa), más VARI-FLAVORS® Flavor Pacs de nuez, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a evitar la fatiga de sabor y favorecen la cooperación del paciente.
Vainilla y otros sabores que no son chocolate
[0243]
Sacarosa
51%
Maltodextrina
49%
Chocolate
[0244]
Sacarosa
47,0%
Jarabe de maíz
26,5%
Maltodextrina
26,5%
Vitaminas y Minerales
[0245] Una ración de 8 fl-oz de ENSURE LIGHT proporciona al menos un 25% de los RDI de las 24 vitaminas y minerales claves.
Cafeína [0246] El sabor chocolate contiene 2,1 mg de cafeína/ 8 fl oz.
E. ENSURE PLUS®
[0247] Uso: ENSURE PLUS es un alimento líquido de bajo contenido en residuos y alto contenido en calorías para su uso cuando se necesitan nutrientes y calorías extras pero una concentración normal de proteína. Se diseña principalmente como complemento nutricional oral para ser usado con o entre comidas o, en cantidades adecuadas, como un sustituto de comida. ENSURE PLUS no tiene lactosa ni gluten. Aunque principalmente es un complemento nutricional oral, se puede alimentar por tubo.
Condiciones del Paciente:
[0248]
Para pacientes que requieren calorías y nutrientes extras, pero una concentración normal de proteína, en un volumen limitado; Para pacientes que necesitan ganar o mantener peso saludable.
Características
[0249]
Sabor rico, cremoso;
Buena fuente de vitaminas y minerales esenciales.
Ingredientes:
[0250] Vainilla: Agua ®-D, jarabe de maíz, maltodextrina (maíz), aceite de maíz, caseinatos de sodio y calcio, azúcar (sacarosa), aislado de proteína de soja, cloruro de magnesio, citrato de potasio, fosfato de calcio tribásico, lecitina de soja, sabor natural y artificial, citrato de sodio, cloruro de potasio, cloruro de colina, ácido ascórbico, carragenina, sulfato de zinc, sulfato terroso, acetato de alfa-tocoferilo, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato de manganeso, sulfato cúprico, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, palmitato de vitamina A, ácido fólico, biotina, cloruro de cromo, molibdato de sodio, yoduro de potasio, selenita de sodio, filoquinona, cianocobalamina y vitamina D3.
Proteína
[0251] La fuente de proteína es una mezcla de dos proteínas de alto valor biológico: caseína y soja.
Caseinatos de sodio y de calcio
84%
Aislado de proteína de soja
16%
Grasa
[0252] La fuente de grasa es aceite de maíz. Aceite de maíz 100%
Carbohidrato
[0253] ENSURE PLUS contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. La dulzura suave y la variedad de sabores (vainilla, chocolate, fresa, café, crema de nueces y batido de huevo), más VARI-FLAVORS® Flavor Pacs de nueces, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a evitar la fatiga de sabor y ayudan a la cooperación del paciente.
Sabores de vainilla, fresa, crema de nueces, y café. [0254]
Jarabe de maíz 39% Maltodextrina 38% Sacarosa 23%
Sabores chocolate y batido de huevo [0255]
Jarabe de maíz 36%
Maltodextrina 34%
Sacarosa 30%
Vitaminas y minerales
[0256] Una ración de 8 fl-oz de ENSURE PLUS proporciona al menos un 15% de los RDI de 25 vitaminas y minerales clave.
Cafeína
[0257] El sabor a chocolate contiene 3,1 mg de cafeína/8 fl-oz. El sabor café contiene una cantidad traza de cafeína.
F. ENSURE PLUS® HN
[0258] Uso: ENSURE PLUS HN es un alimento líquido nutricionalmente completo de altas calorías, alto contenido en nitrógeno diseñado para personas con necesidades elevadas de calorías y proteínas o tolerancia de volumen limitado. Se puede usar para complemento oral o para soporte nutricional total por tubo. ENSURE PLUS HN carece de lactosa y de gluten.
Condiciones del Paciente:
[0259]
Para pacientes con necesidades crecientes de calorías y proteínas, como después de cirugía o lesiones; Para pacientes con tolerancia de volumen limitado y saciedad pronta.
Características
[0260]
Para nutrición complementaria o total; Para alimentación oral o por tubo; 1,5 CaVmL; Alto nitrógeno; Calóricamente denso.
Ingredientes:
[0261] Vainilla: Agua ®-D, maltodextrina (maíz), caseinatos de sodio y calcio, aceite de maíz, azúcar (sacarosa), aislado de proteína de soja, cloruro de magnesio, citrato de potasio, fosfato de calcio tribásico, lecitina de soja, sabor natural y artificial, citrato de sodio, cloruro de colina, ácido ascórbico, taurina, L-carnitina, sulfato de zinc, sulfato terroso, acetato de alfa-tocoferilo, niacinamida, carraqenina, pantotenato de calcio, sulfato de manganeso, sulfato cúprico, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, palmitato de vitamina A, ácido fólico, biotina, cloruro de cromo, molibdato de sodio, yoduro de potasio, selenita de sodio, filoquinona, cianocobalamina y vitamina D3.
G ENSURE® POLVO
[0262] Uso: ENSURE POLVO (reconstituido con agua) es un alimento líquido de bajo contenido en residuos diseñado principalmente como un complemento nutricional oral para ser usado con o entre comidas. ENSURE POLVO carece de lactosa y de gluten, y es conveniente para su uso en dietas modificadas, incluyendo dietas bajas en colesterol.
Condiciones del paciente:
[0263]
Para pacientes con dietas modificadas; Para pacientes ancianos con riesgo de nutrición; Para pacientes que se recuperan de enfermedad/cirugía; Para pacientes que necesitan una dieta de bajo contenido en residuos.
Características.
[0264]
Conveniente, fácil de mezclar; Bajo en grasa saturada; Contiene 9 gramos de grasa total y <5 miligramos de colesterol por ración; Alto contenido en vitaminas y minerales; Para dietas de bajo contenido de colesterol; Sin lactosa, fácilmente digerido.
[0265] Ingredientes: jarabe de maíz ®-D, maltodextrina (maíz), azúcar (sacarosa), aceite de maíz, caseinatos de sodio y calcio, aislado de proteína de soja, sabor artificial, citrato de potasio, cloruro de magnesio, citrato de sodio, fosfato de calcio tribásico, cloruro de potasio, lecitina de soja, ácido ascórbico, cloruro de colina, sulfato de zinc, sulfato terroso, acetato de alfa-tocoferilo, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato de manganeso, clorhidrato de cloruro de tiamina, sulfato cúprico, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, palmitato de vitamina A, ácido fólico, biotina, molibdato de sodio, cloruro de cromo, yoduro de potasio, selenita de sodio, filoquinona, y vitamina D3 y cianocobalamina.
Proteína
[0266] La fuente de proteína es una mezcla de dos proteínas de alto valor biológico: caseína y soja.
Caseinatos de sodio y calcio
84%
Aislado de proteína de soja
16%
Grasa
[0267] La fuente de grasa es aceite de maíz.
Aceite de maíz 100%
Carbohidrato
[0268] ENSURE POLVO contiene una combinación de jarabe de maíz, maltodextrina, y sacarosa. La dulzura suave de ENSURE POLVO, más VARI-FLAVORS® Flavor Pacs en nuez, cereza, fresa, limón y naranja, ayuda a evitar la fatiga de sabor y favorece la cooperación del paciente.
Vainilla [0269]
Jarabe de maíz 35%
Maltodextrina 35%
Sacarosa 30%
H. ENSURE® BUDIN
[0270] Uso: ENSURE PUDDING es un complemento denso nutritivo que proporciona un balance nutricional en forma no líquida para ser usada con o entre comidas. Es adecuado para dietas con consistencia modificada (v.gr., suave, en puré, o completamente líquida) o para personas con problemas para deglutir. ENSURE BUDIN no tiene gluten.
Condiciones del Paciente: [0271]
Para pacientes con dietas de consistencia modificada (por ejemplo, suave, en puré, o completamente líquidas); Para pacientes con problemas para deglutir.
Características [0272]
Buen sabor rico y cremoso. Buena fuente de vitaminas y minerales esenciales. Ventaja: no necesita refrigeración. Sin gluten.
Perfil de nutrientes por 5 oz: Calorías 250, proteína 10,9%, grasa total 34,9%, carbohidratos 54,2%
Ingredientes:
[0273] Vainilla: Leche descremada ®-D, agua, azúcar (sacarosa), aceite de soja parcialmente hidrogenado, almidón alimenticio modificado, sulfato de magnesio, estearoilo lactilato de sodio, fosfato de sodio dibásico, sabor artificial, ácido ascórbico, sulfato de zinc, sulfato ferroso, acetato de alfa-tocoferilo, cloruro de colina, niacinamida, sulfato de manganeso, pantotenato de calcio, amarillo número 5 FD&C, citrato de potasio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, amarillo número 6 FD&C, ácido fólico, biotina, filoquinona, vitamina D3 y cianocobalamina.
Proteína [0274] La fuente de proteína es leche descremada. Leche descremada 100%
Grasa [0275] La fuente de grasa es aceite de soja hidrogenado Aceite de soja hidrogenado 100%
Carbohidrato
[0276] ENSURE BUDIN contiene una combinación de sacarosa y de almidón alimentario modificado. La dulzura suave y la variedad de sabor (vainilla, chocolate, mantequilla, y tapioca) ayuda a evitar la fatiga por sabor. El producto contiene 9,2 gramos de lactosa por ración.
Vainilla y otros sabores que no son de chocolate [0277]
Sacarosa Lactosa Almidón alimenticio modificado
56% 27% 17%
Chocolate
[0278]
Sacarosa Lactosa Almidón alimenticio modificado 58% 26% 16%
I. ENSURE® CON FIBRA
[0279] Uso: ENSURE CON FIBRA es un alimento líquido nutricionalmente completo que contiene fibra diseñado para personas que se pueden beneficiar de fibras y nutrientes dietéticos aumentados. ENSURE CON FIBRA es conveniente para personas que no requieren una dieta de bajo contenido en residuos. Se puede administrar oralmente o por tubo, y se puede usar como complemento nutricional a una dieta regular o, en cantidades adecuadas, como reemplazo de una comida. ENSURE CON FIBRA no tiene lactosa ni gluten, y es conveniente para su uso en dietas modificadas, incluyendo dietas bajas en colesterol.
Condiciones del Paciente
[0280] Para pacientes que se pueden beneficiar de fibra y nutrientes dietéticos aumentados.
Características
[0281]
Nueva fórmula avanzada baja en grasas saturadas, y más alta en vitaminas y minerales; Contiene 6 gramos de grasa total y <5 miligramos de colesterol por ración. Sabor rico, cremoso; Buena fuente de fibra; Excelente fuente de vitaminas y minerales esenciales; Para dietas bajas en colesterol; Sin lactosa ni gluten.
Ingredientes
[0282] Vainilla: ®-D Agua, maltodextrina (maíz), azúcar (sacarosa), caseinatos de sodio y de calcio, fibra de avena, aceite de cártamo con alto contenido oleico, aceite de canola, aislado de proteína de soja, aceite de maíz, fibra de soja, fosfato de calcio tribásico, cloruro de magnesio, citrato de potasio, gel de celulosa, lecitina de soja, fosfato de potasio dibásico, citrato de sodio, sabores naturales y artificiales, cloruro de colina, fosfato de magnesio, ácido ascórbico, goma de celulosa, cloruro de potasio, carragenina, sulfato terroso, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, niacinamida, sulfato de manganeso, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, ácido fólico, cloruro de cromo, biotina, molibdato de sodio, yoduro de potasio, selenato de sodio, filoquinona, vitamina D3 y cianocobalamina.
Proteína
[0283] La fuente de proteína es una mezcla de dos proteínas de alto valor biológico caseína y soja.
Caseinatos de sodio y calcio 80% Aislado de proteína de soja 20%
Grasa
[0284] La fuente de grasa es una mezcla de tres aceites: de cártamo con alto contenido oleico, canola y maíz.
Aceite de cártamo alto en oleico 40% Aceite de canola 40% Aceite de maíz 20%
[0285] El nivel de grasa en ENSURE CON FIBRA satisface los requisitos de la American Heart Association (AHA). Los 6 gramos de grasa en ENSURE CON FIBRA representan el 22% del total de calorías, con 2,01% de la grasa de los ácidos grasos siendo saturados y un 6,7% de ácidos grasos poliinsaturados. Estos valores están dentro de los requisitos de la American Heart Association de :30% del total de calorías de grasa, <10% de calorías de ácidos grasos saturados, y :10% de calorías totales a partir de ácidos grasos poliinsaturados.
Carbohidrato
[0286] ENSURE CON FIBRA contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. La dulzura suave y la variedad de sabor (vainilla, chocolate, y crema de nueces), más VARI-FLAVORS® Flavor Pacs en nuez, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a evitar la fatiga de sabor y favorecen la cooperación del paciente.
Sabor vainilla y otros que no sean de chocolate
[0287]
Maltodextrina 66% Sacarosa 25% Fibra de avena 7% Fibra de soja 2%
Chocolate
[0288]
Maltodextrina 55% Sacarosa 36% Fibra de avena 7% Fibra de soja2%
Fibra
[0289] La mezcla de fibras usada en ENSURE CON FIBRA consiste en fibras de avena y polisacárido de soja. Esta mezcla da como resultado aproximadamente 4 gramos de la fibra dietética total por lata de 8 fl-oz. La proporción de fibra insoluble a soluble es 95:5.
[0290] Los distintos complementos nutricionales descritos anteriormente y conocidos para otros con experiencia en la técnica se pueden sustituir y/o complementar con los PUFA de esta invención.
J. Oxepa® Producto Nutritivo
[0291] Oxepa es un producto nutricional entérico calóricamente denso, bajo en carbohidratos, diseñado para el manejo dietético de pacientes con ARDS o con riesgo de ARDS. Tiene una combinación exclusiva de ingredientes, que incluyen una mezcla de aceites patentados que contienen ácido eicosapentaenoico (EPA a partir de aceite de pescado), ácido gama-linolénico (GLA de aceite de borraja), y niveles elevados de antioxidantes.
Distribución calórica: [0292]
La densidad calórica es alta a 1,5 Cal/mL (355 Cal/8fl oz), para minimizar el volumen requerido para satisfacer las necesidades de energía. La distribución de calorías en Oxepa se muestra en la Tabla 7.
Tabla 7.
Distribución de Calorías de Oxepa
Por 8 fl oz.
Por litro % de caloría
Calorías
355 1,500 -
Grasa (g)
22,2 93,7 55,2
Carbohidrato(g)
25 105,5 28,1
Proteína
14,8 62,5 16,7
Agua (g)
186 785 -
Grasa:
[0293]
Oxepa contiene 22,2 gramos de grasa por ración de 8-fl oz (93,7 gramos por litro). La fuente de grasa es una mezcla de aceites de 31,8% de aceite de canola, 25% de triglicéridos de cadena media (MCTs), 20% de aceite de borraja, 20% de aceite de pescado, y 3,2% de lecitina de
15 soja. El perfil típico de ácido graso de Oxepa se muestra en la Tabla 8. Oxepa proporciona una cantidad equilibrada de ácidos grasos poliinsaturados, monoinsaturados y saturados, como se muestra en la Tabla 10. Los triglicéridos de cadena media (MCTs) –25% de la mezcla de grasas - ayuda al vaciamiento gástrico debido a que se absorben en el tracto intestinal sin emulsificación por los ácidos biliares.
20 [0294] Los distintos componentes de ácidos grasos del producto nutricional Oxepa® se pueden sustituir y/o complementar con los PUFA de esta invención.
Tabla 8
Perfil típico de ácidos grasos
% total ácidos
G/8 fl oz G/L
Caproico (6:0)
0,2 0,04 0,18
Caprílico (8:0)
14,69 3,1 13,07
Cáprico (10:0)
11,06 2,33 9,87
Palmítico (16:0)
5,59 1,18 4,98
Palmitoleico (16:1n-7)
1,82 0,38 1,62
Esteárico (18:0)
1,84 0,39 1,64
Oleico (18:1n-9)
24,44 5,16 21,75
Linoleico (18:2n-6)
16,28 3,44 14,49
a-Linolénico (18:3n-3)
3,47 0,73 3,09
y-Linolénico (18:3n-6)
4,82 1,02 4,29
Eicosapentaenoico (20:5n-3)
5,11 1,08 4,55
n-3-Docosapentaenoico (22:5n-3)
0,55 0,12 0,49
Docosahexaenoico (22:6n-3)
2,27 0,48 2,02
otros
7,55 1,52 6,72
*Los ácidos grasos igualan aproximadamente el 95% del total de grasas. Tabla 9.
Perfil de grasas de Oxepa
% de calorías totales de grasas
55,2
Ácidos grasos poliinsaturados
31,44 g/L
Ácidos grasos monoinsaturados
25,53 g/L
Ácidos grasos saturados
32,38 g/L
Proporción de n-6 a n-3
1,75:1
Carbohidratos:
5 [0295] El contenido de carbohidratos es 25,0 gramos por ración de 8-fl-oz (105,5 gramos por litro). Las fuentes de carbohidrato son 45% maltodrextina (un carbohidrato complejo) y 55% de sacarosa (un azúcar simple), ambas fácilmente digeridas y absorbidas. El alto contenido en grasa y bajo contenido de carbohidratos de Oxepa se diseña para minimizar la
10 producción de dióxido de carbono (CO2). Los niveles altos de CO2 pueden complicar la desconexión en pacientes dependientes de ventilación. El bajo nivel de carbohidratos también puede ser útil para los pacientes que han desarrollado hiperglicemia inducida por tensión. Oxepa no tiene lactosa.
15 [0296] El carbohidrato dietético, los aminoácidos a partir de proteína, y la fracción glicerol de las grasas se pueden convertir en glucosa dentro del cuerpo. A través de este proceso, se satisfacen los requisitos de carbohidrato de los tejidos que dependen de glucosa (tales como el sistema nervioso central y los glóbulos rojos). Sin embargo, una dieta sin carbohidratos puede conducir a cetosis, excesivo catabolismo de proteína del tejido, y pérdida de fluido y de electrólitos. Estos efectos se pueden evitar mediante la ingestión diaria de 50 a 100 gramos de carbohidrato
20 digerible, si es adecuada la ingesta calórica. El nivel de carbohidratos en Oxepa también es suficiente para minimizar la gluconeogénesis, si se están satisfaciendo las necesidades de energía.
Proteína
25 [0297] Oxepa contiene 14,8 gramos de proteína por ración de 8-fl-oz (62,5 g/L). La proporción de caloría/nitrógeno total (150:1) 25 satisface la necesidad de los pacientes estresados. Oxepa proporciona suficiente proteína para promover el anabolismo y el mantenimiento de masa magra corporal sin crear problemas respiratorios. Las altas ingestas de proteína son una preocupación
30 en pacientes con insuficiencia respiratoria. Aunque la proteína tenga poco efecto en la producción de dióxido de carbono, una dieta alta en proteínas aumentará el problema de ventilación. Las fuentes de proteína de Oxepa son 86,8% de caseinato de sodio y 13,2% de caseinato de calcio.
Como se demuestra en la Tabla 11, el perfil de aminoácidos del sistema proteico en Oxepa cumple o sobrepasa el estándar de la proteína de alta calidad por la National Academy of Sciences; 35 Oxepa está libre de gluten.
LISTADO DE SECUENCIAS
(1)INFORMACIÓN GENERAL
(i)SOLICITANTE: Knutzon, Deborah Murkerji, Pradip Huang, Yung-Sheng Thurmond, Jennifer Chaudhary, Sunita Leonard, Amanda
(ii)TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Procedimientos y composiciones para la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga en plantas.
(iii)NÚMERO DE SECUENCIAS: 52 (iv)DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
(A)
DIRECCIÓN: LIMBACH & LIMBACH L.L.P.
(B)
CALLE: 2001 FERRY BUILDING
(C)
CIUDAD: San Francisco
(D)
ESTADO: CA
(E)
PAÍS: USA
(F)
CÓDIGO POSTAL: 94111 (v)FORMA DE LECTURA PARA ORDENADOR:
(A)
TIPO DE MEDIO: disquete
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D)
SOFTWARE: Microsoft Word (vi)DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
(C)
CLASIFICACIÓN: (vii)DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
(A) NÚMERO DE SOLICITUD: US08/833.610
(B)
FECHA DE SOLICITUD: 11 Abril 1997 (viii)INFORMACIÓN AGENTE/ABOGADO
(A)
NOMBRE: Michael R. Ward
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 38.351
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/LISTA: CGAB-320 (ix)INFORMACIÓN TELECOMUNICACIONES
(A)
TELÉFONO: (415)433-4150
(B)
TELEFAX: (415)433-8716
(C) TELEX: N/A (2)INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1
(i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A)LONGITUD: 1617 pares de bases (B)TIPO: ácido nucleico (C)TIPO DE CADENA: sencilla (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:
CGACACTCCT TCCTTCTTCT CACCCGTCCT AGTCCCCTTC AACCCCCCTC TTTGACAAAG 60 ACAACAAACC ATGGCTGCTG CTCCCAGTGT GAGGACGTTT ACTCGGGCCG AGGTTTTGAA 120 TGCCGAGGCT CTGAATGAGG GCAAGAAGGA TGCCGAGGCA CCCTTCTTGA TGATCATCGA 180 CAACAAGGTG TACGATGTCC GCGAGTTCGT CCCTGATCAT CCCGGTGGAA GTGTGATTCT 240 CACGCACGTT GGCAAGGACG GCACTGACGT CTTTGACACT TTTCACCCCG AGGCTGCTTG 300 GGAGACTCTT GCCAACTTTT ACGTTGGTGA TATTGACGAG AGCGACCGCG ATATCAAGAA 360 TGATGACTTT GCGGCCGAGG TCCGCAAGCT GCGTACCTTG TTCCAGTCTC TTGGTTACTA 420 CGATTCTTCC AAGGCATACT ACGCCTTCAA GGTCTCGTTC AACCTCTGCA TCTGGGGTTT 480 GTCGACGGTC ATTGTGGCCA AGTGGGGCCA GACCTCGACC CTCGCCAACG TGCTCTCGGC 540 TGCGCTTTTG GGTCTGTTCT GGCAGCAGTG CGGATGGTTG GCTCACGACT TTTTGCATCA 600 CCAGGTCTTC CAGGACCGTT TCTGGGGTGA TCTTTTCGGC GCCTTCTTGG GAGGTGTCTG 660 CCAGGGCTTC TCGTCCTCGT GGTGGAAGGA CAAGCACAAC ACTCACCACG CCGCCCCCAA 720 CGTCCACGGC GAGGATCCCG ACATTGACAC CCACCCTCTG TTGACCTGGA GTGAGCATGC 780 GTTGGAGATG TTCTCGGATG TCCCAGATGA GGAGCTGACC CGCATGTGGT CGCGTTTCAT 840 GGTCCTGAAC CAGACCTGGT TTTACTTCCC CATTCTCTCG TTTGCCCGTC TCTCCTGGTG 900 CCTCCAGTCC ATTCTCTTTG TGCTGCCTAA CGGTCAGGCC CACAAGCCCT CGGGCGCGCG 960 TGTGCCCATC TCGTTGGTCG AGCAGCTGTC GCTTGCGATG CACTGGACCT GGTACCTCGC 1020 CACCATGTTC CTGTTCATCA AGGATCCCGT CAACATGCTG GTGTACTTTT TGGTGTCGCA 1080 GGCGGTGTGC GGAAACTTGT TGGCGATCGT GTTCTCGCTC AACCACAACG GTATGCCTGT 1140 GATCTCGAAG GAGGAGGCGG TCGATATGGA TTTCTTCACG AAGCAGATCA TCACGGGTCG 1200 TGATGTCCAC CCGGGTCTAT TTGCCAACTG GTTCACGGGT GGATTGAACT ATCAGATCGA 1260 GCACCACTTG TTCCCTTCGA TGCCTCGCCA CAACTTTTCA AAGATCCAGC CTGCTGTCGA 1320 GACCCTGTGC AAAAAGTACA ATGTCCGATA CCACACCACC GGTATGATCG AGGGAACTGC 1380 AGAGGTCTTT AGCCGTCTGA ACGAGGTCTC CAAGGCTGCC TCCAAGATGG GTAAGGCGCA 1440 GTAAAAAAAA AAACAAGGAC GTTTTTTTTC GCCAGTGCCT GTGCCTGTGC CTGCTTCCCT 1500 TGTCAAGTCG AGCGTTTCTG GAAAGGATCG TTCAGTGCAG TATCATCATT CTCCTTTTAC 1560
CCCCCGCTCA TATCTCATTC ATTTCTCTTA TTAAACAACT TGTTCCCCCC TTCACCG 1617
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A)LONGITUD: 457 aminoácidos (B)TIPO: aminoácido (C)TIPO DE CADENA: no relevante (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:
Met Ala Ala Ala pro Ser val Arg Thr phe Thr Arg Ala Glu val Leu 1 5 10 15
Asn Ala Glu Ala Leu Asn Glu Gly Lys Lys Asp Ala Glu Ala pro phe 20 25 30
Leu Met rle rle Asp Asn Lys val Tyr Asp val Arg Glu phe val pro 35 40 45
Asp His pro Gly Gly Ser val rle Leu Thr His val Gly Lys Asp Gly 50 55 60
Thr Asp val phe Asp Thr phe His pro Glu Ala Ala Trp Glu Thr Leu 65 70 75 80
Ala Asn phe Tyr val Gly Asp rle Asp Glu Ser Asp Arg Asp rle Lys 85 90 95
Asn Asp Asp phe Ala Ala Glu val Arg Lys Leu Arg Thr Leu phe Gln 100 105 110
Ser Leu Gly Tyr Tyr Asp Ser Ser Lys Ala Tyr Tyr Ala phe Lys val 115 120 125
Ser phe Asn Leu Cys rle Trp Gly Leu Ser Thr val rle val Ala Lys 130 135 140
Trp Gly Gln Thr Ser Thr Leu Ala Asn val Leu Ser Ala Ala Leu Leu 145 150 155 160
Gly Leu phe Trp Gln Gln Cys Gly Trp Leu Ala His Asp phe Leu His 165 170 175
His Gln val phe Gln Asp Arg phe Trp Gly Asp Leu phe Gly Ala phe 180 185 190
Leu Gly Gly val Cys Gln Gly phe Ser Ser Ser Trp Trp Lys Asp Lys 195 200 205
His Asn Thr His His Ala Ala pro Asn val His Gly Glu Asp pro Asp 210 215 220
rle Asp Thr His pro Leu Leu Thr Trp Ser Glu His Ala Leu Glu Met 225 230 235 240
phe Ser Asp val pro Asp Glu Glu Leu Thr Arg Met Trp Ser Arg phe 245 250 255
Met val Leu Asn Gln Thr Trp phe Tyr phe pro rle Leu Ser phe Ala 260 265 270
Arg Leu Ser Trp Cys Leu Gln Ser rle Leu phe val Leu pro Asn Gly 275 280 285
Gln Ala His Lys pro Ser Gly Ala Arg val pro rle Ser Leu val Glu 290 295 300
Gln Leu Ser Leu Ala Met His Trp Thr Trp Tyr Leu Ala Thr Met phe 305 310 315 320
Leu phe rle Lys Asp pro val Asn Met Leu val Tyr phe Leu val Ser 325 330 335
Gln Ala val Cys Gly Asn Leu Leu Ala rle val phe Ser Leu Asn His 340 345 350
Asn Gly Met pro val rle Ser Lys Glu Glu Ala val Asp Met Asp phe 355 360 365
phe Thr Lys Gln rle rle Thr Gly Arg Asp val His pro Gly Leu phe 370 375 380
Ala Asn Trp phe Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Gln rle Glu His His Leu 385 390 395 400
phe pro Ser Met pro Arg His Asn phe Ser Lys rle Gln pro Ala val 405 410 415
Glu Thr Leu Cys Lys Lys Tyr Asn val Arg Tyr His Thr Thr Gly Met 420 425 430
rle Glu Gly Thr Ala Glu val phe Ser Arg Leu Asn Glu val Ser Lys 435 440 445
Ala Ala Ser Lys Met Gly Lys Ala Gln 450 455
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A)LONGITUD: 1448 pares de bases (B)TIPO: ácido nucleico (C)TIPO DE CADENA: simple (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:3:
GTCCCCTGTC GCTGTCGGCA CACCCCATCC TCCCTCGCTC CCTCTGCGTT TGTCCTTGGC 60 CCACCGTCTC TCCTCCACCC TCCGAGACGA CTGCAACTGT AATCAGGAAC CGACAAATAC 120 ACGATTTCTT TTTACTCAGC ACCAACTCAA AATCCTCAAC CGCAACCCTT TTTCAGGATG 180 GCACCTCCCA ACACTATCGA TGCCGGTTTG ACCCAGCGTC ATATCAGCAC CTCGGCCCCA 240 AACTCGGCCA AGCCTGCCTT CGAGCGCAAC TACCAGCTCC CCGAGTTCAC CATCAAGGAG 300 ATCCGAGAGT GCATCCCTGC CCACTGCTTT GAGCGCTCCG GTCTCCGTGG TCTCTGCCAC 360 GTTGCCATCG ATCTGACTTG GGCGTCGCTC TTGTTCCTGG CTGCGACCCA GATCGACAAG 420 TTTGAGAATC CCTTGATCCG CTATTTGGCC TGGCCTGTTT ACTGGATCAT GCAGGGTATT 480 GTCTGCACCG GTGTCTGGGT GCTGGCTCAC GAGTGTGGTC ATCAGTCCTT CTCGACCTCC 540 AAGACCCTCA ACAACACAGT TGGTTGGATC TTGCACTCGA TGCTCTTGGT CCCCTACCAC 600 TCCTGGAGAA TCTCGCACTC GAAGCACCAC AAGGCCACTG GCCATATGAC CAAGGACCAG 660 GTCTTTGTGC CCAAGACCCG CTCCCAGGTT GGCTTGCCTC CCAAGGAGAA CGCTGCTGCT 720 GCCGTTCAGG AGGAGGACAT GTCCGTGCAC CTGGATGAGG AGGCTCCCAT TGTGACTTTG 780 TTCTGGATGG TGATCCAGTT CTTGTTCGGA TGGCCCGCGT ACCTGATTAT GAACGCCTCT 840 GGCCAAGACT ACGGCCGCTG GACCTCGCAC TTCCACACGT ACTCGCCCAT CTTTGAGCCC 900 CGCAACTTTT TCGACATTAT TATCTCGGAC CTCGGTGTGT TGGCTGCCCT CGGTGCCCTG 960 ATCTATGCCT CCATGCAGTT GTCGCTCTTG ACCGTCACCA AGTACTATAT TGTCCCCTAC 1020
CTCTTTGTCA ACTTTTGGTT
GGTCCTGATC ACCTTCTTGC AGCACACCGA TCCCAAGCTG 1080
CCCCATTACC GCGAGGGTGC
CTGGAATTTC CAGCGTGGAG CTCTTTGCAC CGTTGACCGC 1140
TCGTTTGGCA AGTTCTTGGA
CCATATGTTC CACGGCATTG TCCACACCCA TGTGGCCCAT 1200
CACTTGTTCT CGCAAATGCC
GTTCTACCAT GCTGAGGAAG CTACCTATCA TCTCAAGAAA 1260
CTGCTGGGAG AGTACTATGT
GTACGACCCA TCCCCGATCG TCGTTGCGGT CTGGAGGTCG 1320
TTCCGTGAGT GCCGATTCGT
GGAGGATCAG GGAGACGTGG TCTTTTTCAA GAAGTAAAAA 1380
AAAAGACAAT GGACCACACA
CAACCTTGTC TCTACAGACC TACGTATCAT GTAGCCATAC 1440
CACTTCATAA AAGAACATGA
GCTCTAGAGG CGTGTCATTC GCGCCTCC 1488
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:
(i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)LONGITUD: 399 aminoácidos
(B)TIPO: aminoácido
(C)TIPO DE CADENA: no relevante
(D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:
Met Ala pro pro Asn Thr rle Asp Ala Gly Leu Thr Gln Arg His rle 1 5 10 15
Ser Thr Ser Ala pro Asn Ser Ala Lys pro Ala phe Glu Arg Asn Tyr 20 25 30
Gln Leu pro Glu phe Thr rle Lys Glu rle Arg Glu Cys rle pro Ala 35 40 45
His Cys phe Glu Arg Ser Gly Leu Arg Gly Leu Cys His val Ala rle 50 55 60
Asp Leu Thr Trp Ala Ser Leu Leu phe Leu Ala Ala Thr Gln rle Asp 65 70 75 80
Lys phe Glu Asn pro Leu rle Arg Tyr Leu Ala Trp pro val Tyr Trp 85 90 95
rle Met Gln Gly rle val Cys Thr Gly val Trp val Leu Ala His Glu 100 105 110
Cys Gly His Gln Ser phe Ser Thr Ser Lys Thr Leu Asn Asn Thr val 115 120 125
Gly Trp rle Leu His Ser Met Leu Leu val pro Tyr His Ser Trp Arg 130 135 140
rle Ser His Ser Lys His His Lys Ala Thr Gly His Met Thr Lys Asp 145 150 155 160
Gln val phe val pro Lys Thr Arg Ser Gln val Gly Leu pro pro Lys 165 170 175
Glu Asn Ala Ala Ala Ala val Gln Glu Glu Asp Met Ser val His Leu 180 185 190
Asp Glu Glu Ala pro rle val Thr Leu phe Trp Met val rle Gln phe 195 200 205
Leu phe Gly Trp pro Ala Tyr Leu rle Met Asn Ala Ser Gly Gln Asp 210 215 220
Tyr Gly Arg Trp Thr Ser His phe His Thr Tyr Ser pro rle phe Glu 225 230 235 240
pro Arg Asn phe phe Asp rle rle rle Ser Asp Leu Gly val Leu Ala 245 250 255
Ala Leu Gly Ala Leu rle Tyr Ala Ser Met Gln Leu Ser Leu Leu Thr 260 265 270
val Thr Lys Tyr Tyr rle val pro Tyr Leu phe val Asn phe Trp Leu 275 280 285
val Leu rle Thr phe Leu Gln His Thr Asp pro Lys Leu pro His Tyr 290 295 300
Arg Glu Gly Ala Trp Asn phe Gln Arg Gly Ala Leu Cys Thr val Asp 305 310 315 320
Arg Ser phe Gly Lys phe Leu Asp His Met phe His Gly rle val His 325 330 335
Thr His val Ala His His Leu phe Ser Gln Met pro phe Tyr His Ala 340 345 350
Glu Glu Ala Thr Tyr His Leu Lys Lys Leu Leu Gly Glu Tyr Tyr val 355 360 365
Tyr Asp pro Ser pro rle val val Ala val Trp Arg Ser phe Arg Glu 370 375 380
Cys Arg phe val Glu Asp Gln Gly Asp val val phe phe Lys Lys 385 390 395
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº5: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A)LONGITUD: 1483 pares de bases (B)TIPO: ácido nucleico (C)TIPO DE CADENA: sencilla (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:
GCTTCCTCCA GTTCATCCTC CATTTCGCCA CCTGCATTCT TTACGACCGT TAAGCAAGAT 60 GGGAACGGAC CAAGGAAAAA CCTTCACCTG GGAAGAGCTG GCGGCCCATA ACACCAAGGA 120 CGACCTACTC TTGGCCATCC GCGGCAGGGT GTACGATGTC ACAAAGTTCT TGAGCCGCCA 180 TCCTGGTGGA GTGGACACTC TCCTGCTCGG AGCTGGCCGA GATGTTACTC CGGTCTTTGA 240 GATGTATCAC GCGTTTGGGG CTGCAGATGC CATTATGAAG AAGTACTATG TCGGTACACT 300 GGTCTCGAAT GAGCTGCCCA TCTTCCCGGA GCCAACGGTG TTCCACAAAA CCATCAAGAC 360 GAGAGTCGAG GGCTACTTTA CGGATCGGAA CATTGATCCC AAGAATAGAC CAGAGATCTG 420 GGGACGATAC GCTCTTATCT TTGGATCCTT GATCGCTTCC TACTACGCGC AGCTCTTTGT 480 GCCTTTCGTT GTCGAACGCA CATGGCTTCA GGTGGTGTTT GCAATCATCA TGGGATTTGC 540 GTGCGCACAA GTCGGACTCA ACCCTCTTCA TGATGCGTCT CACTTTTCAG TGACCCACAA 600 CCCCACTGTC TGGAAGATTC TGGGAGCCAC GCACGACTTT TTCAACGGAG CATCGTACCT 660 GGTGTGGATG TACCAACATA TGCTCGGCCA TCACCCCTAC ACCAACATTG CTGGAGCAGA 720 TCCCGACGTG TCGACGTCTG AGCCCGATGT TCGTCGTATC AAGCCCAACC AAAAGTGGTT 780 TGTCAACCAC ATCAACCAGC ACATGTTTGT TCCTTTCCTG TACGGACTGC TGGCGTTCAA 840 GGTGCGCATT CAGGACATCA ACATTTTGTA CTTTGTCAAG ACCAATGACG CTATTCGTGT 900 CAATCCCATC TCGACATGGC ACACTGTGAT GTTCTGGGGC GGCAAGGCTT TCTTTGTCTG 960 GTATCGCCTG ATTGTTCCCC TGCAGTATCT GCCCCTGGGC AAGGTGCTGC TCTTGTTCAC 1020
GGTCGCGGAC ATGGTGTCGT
CTTACTGGCT GGCGCTGACC TTCCAGGCGA ACCACGTTGT 1080
TGAGGAAGTT CAGTGGCCGT
TGCCTGACGA GAACGGGATC ATCCAAAAGG ACTGGGCAGC 1140
TATGCAGGTC GAGACTACGC
AGGATTACGC ACACGATTCG CACCTCTGGA CCAGCATCAC 1200
TGGCAGCTTG AACTACCAGG
CTGTGCACCA TCTGTTCCCC AACGTGTCGC AGCACCATTA 1260
TCCCGATATT CTGGCCATCA
TCAAGAACAC CTGCAGCGAG TACAAGGTTC CATACCTTGT 1320
CAAGGATACG TTTTGGCAAG
CATTTGCTTC ACATTTGGAG CACTTGCGTG TTCTTGGACT 1380
CCGTCCCAAG GAAGAGTAGA
AGAAAAAAAG CGCCGAATGA AGTATTGCCC CCTTTTTCTC 1440
CAAGAATGGC AAAAGGAGAT
CAAGTGGACA TTCTCTATGA AGA 1483
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:
(i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)LONGITUD: 446 aminoácidos
(B)TIPO: aminoácido
(C)TIPO DE CADENA: no relevante
(D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:6:
Met Gly Thr Asp Gln Gly Lys Thr phe Thr Trp Glu Glu Leu Ala Ala 1 5 10 15
His Asn Thr Lys Asp Asp Leu Leu Leu Ala rle Arg Gly Arg val Tyr 20 25 30
Asp val Thr Lys phe Leu Ser Arg His pro Gly Gly val Asp Thr Leu 35 40 45
Leu Leu Gly Ala Gly Arg Asp val Thr pro val phe Glu Met Tyr His 50 55 60
Ala phe Gly Ala Ala Asp Ala rle Met Lys Lys Tyr Tyr val Gly Thr 65 70 75 80
Leu val Ser Asn Glu Leu pro rle phe pro Glu pro Thr val phe His 85 90 95
Lys Thr rle Lys Thr Arg val Glu Gly Tyr phe Thr Asp Arg Asn rle 100 105 110
Asp pro Lys Asn Arg pro Glu rle Trp Gly Arg Tyr Ala Leu rle phe 115 120 125
Gly Ser Leu rle Ala Ser Tyr Tyr Ala Gln Leu phe val pro phe val 130 135 140
val Glu Arg Thr Trp Leu Gln val val phe Ala rle rle Met Gly phe 145 150 155 160
Ala Cys Ala Gln val Gly Leu Asn pro Leu His Asp Ala Ser His phe 165 170 175
Ser val Thr His Asn pro Thr val Trp Lys rle Leu Gly Ala Thr His 180 185 190
Asp phe phe Asn Gly Ala Ser Tyr Leu val Trp Met Tyr Gln His Met 195 200 205
Leu Gly His His pro Tyr Thr Asn rle Ala Gly Ala Asp pro Asp val 210 215 220
Ser Thr Ser Glu pro Asp val Arg Arg rle Lys pro Asn Gln Lys Trp 225 230 235 240
phe val Asn His rle Asn Gln His Met phe val pro phe Leu Tyr Gly 245 250 255
Leu Leu Ala phe Lys val Arg rle Gln Asp rle Asn rle Leu Tyr phe 260 265 270
val Lys Thr Asn Asp Ala rle Arg val Asn pro rle Ser Thr Trp His 275 280 285
Thr val Met phe Trp Gly Gly Lys Ala phe phe val Trp Tyr Arg Leu 290 295 300
rle val pro Leu Gln Tyr Leu pro Leu Gly Lys val Leu Leu Leu phe 305 310 315 320
Thr val Ala Asp Met val Ser Ser Tyr Trp Leu Ala Leu Thr phe Gln 325 330 335
Ala Asn His val val Glu Glu val Gln Trp pro Leu pro Asp Glu Asn 340 345 350
Gly rle rle Gln Lys Asp Trp Ala Ala Met Gln val Glu Thr Thr Gln 355 360 365
Asp Tyr Ala His Asp Ser His Leu Trp Thr Ser rle Thr Gly Ser Leu 370 375 380
Asn Tyr Gln Ala val His His Leu phe pro Asn val Ser Gln His His 385 390 395 400
Tyr pro Asp rle Leu Ala rle rle Lys Asn Thr Cys Ser Glu Tyr Lys 405 410 415
val pro Tyr Leu val Lys Asp Thr phe Trp Gln Ala phe Ala Ser His 420 425 430
Leu Glu His Leu Arg val Leu Gly Leu Arg pro Lys Glu Glu 435 440 445
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A)LONGITUD:355 aminoácidos (B)TIPO: aminoácido (C)TIPO DE CADENA: no relevante (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:7:
Glu val Arg Lys Leu Arg Thr Leu phe Gln Ser Leu Gly Tyr Tyr Asp 1 5 10 15
Ser Ser Lys Ala Tyr Tyr Ala phe Lys val Ser phe Asn Leu Cys rle 20 25 30
Trp Gly Leu Ser Thr val rle val Ala Lys Trp Gly Gln Thr Ser Thr 35 40 45
Leu Ala Asn val Leu Ser Ala Ala Leu Leu Gly Leu phe Trp Gln Gln 50 55 60
Cys Gly Trp Leu Ala His Asp phe Leu His His Gln val phe Gln Asp 65 70 75 80
Arg phe Trp Gly Asp Leu phe Gly Ala phe Leu Gly Gly val Cys Gln 85 90 95
Gly phe Ser Ser Ser Trp Trp Lys Asp Lys His Asn Thr His His Ala 100 105 110
Ala pro Asn val His Gly Glu Asp pro Asp rle Asp Thr His pro Leu 115 120 125
Leu Thr Trp Ser Glu His Ala Leu Glu Met phe Ser Asp val pro Asp 130 135 140
Glu Glu Leu Thr Arg Met Trp Ser Arg phe Met val Leu Asn Gln Thr 145 150 155 160
Trp phe Tyr phe pro rle Leu Ser phe Ala Arg Leu Ser Trp Cys Leu 165 170 175
Gln Ser rle Leu phe val Leu pro Asn Gly Gln Ala His Lys pro Ser 180 185 190
Gly Ala Arg val pro rle Ser Leu val Glu Gln Leu Ser Leu Ala Met 195 200 205
His Trp Thr Trp Tyr Leu Ala Thr Met phe Leu phe rle Lys Asp pro 210 215 220
val Asn Met Leu val Tyr phe Leu val Ser Gln Ala val Cys Gly Asn 225 230 235 240
Leu Leu Ala rle val phe Ser Leu Asn His Asn Gly Met pro val rle 245 250 255
Ser Lys Glu Glu Ala val Asp Met Asp phe phe Thr Lys Gln rle rle 260 265 270
Thr Gly Arg Asp val His pro Gly Leu phe Ala Asn Trp phe Thr Gly 275 280 285
Gly Leu Asn Tyr Gln rle Glu His His Leu phe pro Ser Met pro Arg 290 295 300
His Asn phe Ser Lys rle Gln pro Ala val Glu Thr Leu Cys Lys Lys 305 310 315 320
Tyr Asn val Arg Tyr His Thr Thr Gly Met rle Glu Gly Thr Ala Glu 325 330 335
val phe Ser Arg Leu Asn Glu val Ser Lys Ala Ala Ser Lys Met Gly 340 345 350
Lys Ala Gln 355
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A)LONGITUD: 104 aminoácidos (B)TIPO: aminoácido (C)TIPO DE CADENA: no relevante (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:8:
val Thr Leu Tyr Thr Leu Ala phe val Ala Ala Asn Ser Leu Gly val 1 5 10 15
Leu Tyr Gly val Leu Ala Cys pro Ser val Xaa pro His Gln rle Ala 20 25 30
Ala Gly Leu Leu Gly Leu Leu Trp rle Gln Ser Ala Tyr rle Gly Xaa 35 40 45
Asp Ser Gly His Tyr val rle Met Ser Asn Lys Ser Asn Asn Xaa phe 50 55 60
Ala Gln Leu Leu Ser Gly Asn Cys Leu Thr Gly rle rle Ala Trp Trp 65 70 75 80
Lys Trp Thr His Asn Ala His His Leu Ala Cys Asn Ser Leu Asp Tyr 85 90 95
Gly pro Asn Leu Gln His rle pro 100
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A)LONGITUD: 252 aminoácidos (B)TIPO: aminoácido (C)TIPO DE CADENA: no relevante (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:9:
Gly val Leu Tyr Gly val Leu Ala Cys Thr Ser val phe Ala His Gln 1 5 10 15
rle Ala Ala Ala Leu Leu Gly Leu Leu Trp rle Gln Ser Ala Tyr rle 20 25 30
Gly His Asp Ser Gly His Tyr val rle Met Ser Asn Lys Ser Tyr Asn 35 40 45
Arg phe Ala Gln Leu Leu Ser Gly Asn Cys Leu Thr Gly rle Ser rle 50 55 60
Ala Trp Trp Lys Trp Thr His Asn Ala His His Leu Ala Cys Asn Ser 65 70 75 80
Leu Asp Tyr Asp pro Asp Leu Gln His rle pro val phe Ala val Ser 85 90 95
Thr Lys phe phe Ser Ser Leu Thr Ser Arg phe Tyr Asp Arg Lys Leu 100 105 110
Thr phe Gly pro val Ala Arg phe Leu val Ser Tyr Gln His phe Thr 115 120 125
Tyr Tyr pro val Asn Cys phe Gly Arg rle Asn Leu phe rle Gln Thr 130 135 140
phe Leu Leu Leu phe Ser Lys Arg Glu val pro Asp Arg Ala Leu Asn 145 150 155 160
phe Ala Gly rle Leu val phe Trp Thr Trp phe pro Leu Leu val Ser 165 170 175
Cys Leu pro Asn Trp pro Glu Arg phe phe phe val phe Thr Ser phe 180 185 190
Thr val Thr Ala Leu Gln His rle Gln phe Thr Leu Asn His phe Ala 195 200 205
Ala Asp val Tyr val Gly pro pro Thr Gly Ser Asp Trp phe Glu Lys 210 215 220
Gln Ala Ala Gly Thr rle Asp rle Ser Cys Arg Ser Tyr Met Asp Trp 225 230 235 240
phe phe Gly Gly Leu Gln phe Gln Leu Glu His His 245 250
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 125 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:10:
Gly Xaa Xaa Asn phe Ala Gly rle Leu val phe Trp Thr Trp phe pro 1 5 10 15
Leu Leu val Ser Cys Leu pro Asn Trp pro Glu Arg phe Xaa phe val 20 25 30
phe Thr Gly phe Thr val Thr Ala Leu Gln His rle Gln phe Thr Leu 35 40 45
Asn His phe Ala Ala Asp val Tyr val Gly pro pro Thr Gly Ser Asp 50 55 60
Trp phe Glu Lys Gln Ala Ala Gly Thr rle Asp rle Ser Cys Arg Ser 65 70 75 80
Tyr Met Asp Trp phe phe Cys Gly Leu Gln phe Gln Leu Glu His His 85 90 95
Leu phe pro Arg Leu pro Arg Cys His Leu Arg Lys val Ser pro val 100 105 110
Gly Gln Arg Gly phe Gln Arg Lys Xaa Asn Leu Ser Xaa 115 120 125
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:11: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A)LONGITUD: 131 aminoácidos (B)TIPO: aminoácido (C)TIPO DE CADENA: no relevante (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:11:
pro Ala Thr Glu val Gly Gly Leu Ala Trp Met rle Thr phe Tyr val 1 5 10 15
Arg phe phe Leu Thr Tyr val pro Leu Leu Gly Leu Lys Ala phe Leu 20 25 30
Gly Leu phe phe rle val Arg phe Leu Glu Ser Asn Trp phe val Trp 35 40 45
val Thr Gln Met Asn His rle pro Met His rle Asp His Asp Arg Asn 50 55 60
Met Asp Trp val Ser Thr Gln Leu Gln Ala Thr Cys Asn val His Lys 65 70 75 80
Ser Ala phe Asn Asp Trp phe Ser Gly His Leu Asn phe Gln rle Glu 85 90 95
His His Leu phe pro Thr Met pro Arg His Asn Tyr His Xaa val Ala 100 105 110
pro Leu val Gln Ser Leu Cys Ala Lys His Gly rle Glu Tyr Gln Ser 115 120 125
Lys pro Leu 130
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:12: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A)LONGITUD: 87 aminoácidos (B)TIPO: aminoácido (C)TIPO DE CADENA: no relevante (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:12:
Cys Ser pro Lys Ser Ser pro Thr Arg Asn Met Thr pro Ser pro phe 1 5 10 15
rle Asp Trp Leu Trp Gly Gly Leu Asn Tyr Gln rle Glu His His Leu 20 25 30
phe pro Thr Met pro Arg Cys Asn Leu Asn Arg Cys Met Lys Tyr val 35 40 45
Lys Glu Trp Cys Ala Glu Asn Asn Leu pro Tyr Leu val Asp Asp Tyr 50 55 60
phe val Gly Tyr Asn Leu Asn Leu Gln Gln Leu Lys Asn Met Ala Glu 65 70 75 80
Leu val Gln Ala Lys Ala Ala 85
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:13: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A)LONGITUD: 143 aminoácidos (B)TIPO: aminoácido (C)TIPO DE CADENA: no relevante (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:13:
Arg His Glu Ala Ala Arg Gly Gly Thr Arg Leu Ala Tyr Met Leu val 1 5 10 15
Cys Met Gln Trp Thr Asp Leu Leu Trp Ala Ala Ser phe Tyr Ser Arg 20 25 30
phe phe Leu Ser Tyr Ser pro phe Tyr Gly Ala Thr Gly Thr Leu Leu 35 40 45
Leu phe val Ala val Arg val Leu Glu Ser His Trp phe val Trp rle 50 55 60
Thr Gln Met Asn His rle pro Lys Glu rle Gly His Glu Lys His Arg 65 70 75 80
Asp Trp Ala Ser Ser Gln Leu Ala Ala Thr Cys Asn val Glu pro Ser 85 90 95
Leu phe rle Asp Trp phe Ser Gly His Leu Asn phe Gln rle Glu His 100 105 110
His Leu phe pro Thr Met Thr Arg His Asn Tyr Arg Xaa val Ala pro 115 120 125
Leu val Lys Ala phe Cys Ala Lys His Gly Leu His Tyr Glu val 130 135 140
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:14:
(i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A)LONGITUD: 186 aminoácidos (B)TIPO: aminoácido (C)TIPO DE CADENA: no relevante (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:14:
Leu His His Thr Tyr Thr Asn rle Ala Gly Ala Asp pro Asp val Ser 1 5 10 15
Thr Ser Glu pro Asp val Arg Arg rle Lys pro Asn Gln Lys Trp phe 20 25 30
val Asn His rle Asn Gln His Met phe val pro phe Leu Tyr Gly Leu 35 40 45
Leu Ala phe Lys val Arg rle Gln Asp rle Asn rle Leu Tyr phe val 50 55 60
Lys Thr Asn Asp Ala rle Arg val Asn pro rle Ser Thr Trp His Thr 65 70 75 80
val Met phe Trp Gly Gly Lys Ala phe phe val Trp Tyr Arg Leu rle 85 90 95
val pro Leu Gln Tyr Leu pro Leu Gly Lys val Leu Leu Leu phe Thr 100 105 110
val Ala Asp Met val Ser Ser Tyr Trp Leu Ala Leu Thr phe Gln Ala 115 120 125
Asn Tyr val val Glu Glu val Gln Trp pro Leu pro Asp Glu Asn Gly 130 135 140
rle rle Gln Lys Asp Trp Ala Ala Met Gln val Glu Thr Thr Gln Asp 145 150 155 160
Tyr Ala His Asp Ser His Leu Trp Thr Ser rle Thr Gly Ser Leu Asn 165 170 175
Tyr Gln Xaa val His His Leu phe pro His 180 185
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:15: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A)LONGITUD: 5 aminoácidos (B)TIPO: aminoácido (C)TIPO DE CADENA: no relevante (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:15:
His Xaa Xaa His His 1 5
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:16: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A)LONGITUD: 446 aminoácidos (B)TIPO: aminoácido (C)TIPO DE CADENA: no relevante (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:16:
Met Ala Ala Gln rle Lys Lys Tyr rle Thr Ser Asp Glu Leu Lys Asn 1 5 10 15
His Asp Lys pro Gly Asp Leu Trp rle Ser rle Gln Gly Lys Ala Tyr 20 25 30
Asp val Ser Asp Trp val Lys Asp His pro Gly Gly Ser phe pro Leu 35 40 45
Lys Ser Leu Ala Gly Gln Glu val Thr Asp Ala phe val Ala phe His 50 55 60
pro Ala Ser Thr Trp Lys Asn Leu Asp Lys phe phe Thr Gly Tyr Tyr 65 70 75 80
Leu Lys Asp Tyr Ser val Ser Glu val Ser Lys val Tyr Arg Lys Leu 85 90 95
val phe Glu phe Ser Lys Met Gly Leu Tyr Asp Lys Lys Gly His rle 100 105 110
Met phe Ala Thr Leu Cys phe rle Ala Met Leu phe Ala Met Ser val 115 120 125
Tyr Gly val Leu phe Cys Glu Gly val Leu val His Leu phe Ser Gly 130 135 140
Cys Leu Met Gly phe Leu Trp rle Gln Ser Gly Trp rle Gly His Asp 145 150 155 160
Ala Gly His Tyr Met val val Ser Asp Ser Arg Leu Asn Lys phe Met 165 170 175
Gly rle phe Ala Ala Asn Cys Leu Ser Gly rle Ser rle Gly Trp Trp 180 185 190
Lys Trp Asn His Asn Ala His His rle Ala Cys Asn Ser Leu Glu Tyr 195 200 205
Asp pro Asp Leu Gln Tyr rle pro phe Leu val val Ser Ser Lys phe 210 215 220
phe Gly Ser Leu Thr Ser His phe Tyr Glu Lys Arg Leu Thr phe Asp 225 230 235 240
Ser Leu Ser Arg phe phe val Ser Tyr Gln His Trp Thr phe Tyr pro 245 250 255
rle Met Cys Ala Ala Arg Leu Asn Met Tyr val Gln Ser Leu rle Met 260 265 270
Leu Leu Thr Lys Arg Asn val Ser Tyr Arg Ala Gln Glu Leu Leu Gly 275 280 285
Cys Leu val phe Ser rle Trp Tyr pro Leu Leu val Ser Cys Leu pro 290 295 300
Asn Trp Gly Glu Arg rle Met phe val rle Ala Ser Leu Ser val Thr 305 310 315 320
Gly Met Gln Gln val Gln phe Ser Leu Asn His phe Ser Ser Ser val 325 330 335
Tyr val Gly Lys pro Lys Gly Asn Asn Trp phe Glu Lys Gln Thr Asp 340 345 350
Gly Thr Leu Asp rle Ser Cys pro pro Trp Met Asp Trp phe His Gly 355 360 365
Gly Leu Gln phe Gln rle Glu His His Leu phe pro Lys Met pro Arg 370 375 380
Cys Asn Leu Arg Lys rle Ser pro Tyr val rle Glu Leu Cys Lys Lys 385 390 395 400
His Asn Leu pro Tyr Asn Tyr Ala Ser phe Ser Lys Ala Asn Glu Met 405 410 415
Thr Leu Arg Thr Leu Arg Asn Thr Ala Leu Gln Ala Arg Asp rle Thr 420 425 430
Lys pro Leu pro Lys Asn Leu val Trp Glu Ala Leu His Thr 435 440 445
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:17:
(i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A)LONGITUD: 359 aminoácidos (B)TIPO: aminoácido (C)TIPO DE CADENA: no relevante (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:17:
Met Leu Thr Ala Glu Arg rle Lys phe Thr Gln Lys Arg Gly phe Arg 1 5 10 15
Arg val Leu Asn Gln Arg val Asp Ala Tyr phe Ala Glu His Gly Leu 20 25 30
Thr Gln Arg Asp Asn pro Ser Met Tyr Leu Lys Thr Leu rle rle val 35 40 45
Leu Trp Leu phe Ser Ala Trp Ala phe val Leu phe Ala pro val rle 50 55 60
phe pro val Arg Leu Leu Gly Cys Met val Leu Ala rle Ala Leu Ala 65 70 75 80
Ala phe Ser phe Asn val Gly His Asp Ala Asn His Asn Ala Tyr Ser 85 90 95
Ser Asn pro His rle Asn Arg val Leu Gly Met Thr Tyr Asp phe val 100 105 110
Gly Leu Ser Ser phe Leu Trp Arg Tyr Arg His Asn Tyr Leu His His 115 120 125
Thr Tyr Thr Asn rle Leu Gly His Asp val Glu rle His Gly Asp Gly 130 135 140
Ala val Arg Met Ser pro Glu Gln Glu His val Gly rle Tyr Arg phe 145 150 155 160
Gln Gln phe Tyr rle Trp Gly Leu Tyr Leu phe rle pro phe Tyr Trp 165 170 175
phe Leu Tyr Asp val Tyr Leu val Leu Asn Lys Gly Lys Tyr His Asp 180 185 190
His Lys rle pro pro phe Gln pro Leu Glu Leu Ala Ser Leu Leu Gly 195 200 205
rle Lys Leu Leu Trp Leu Gly Tyr val phe Gly Leu pro Leu Ala Leu 210 215 220
Gly phe Ser rle pro Glu val Leu rle Gly Ala Ser val Thr Tyr Met 225 230 235 240
Thr Tyr Gly rle val val Cys Thr rle phe Met Leu Ala His val Leu 245 250 255
Glu Ser Thr Glu phe Leu Thr pro Asp Gly Glu Ser Gly Ala rle Asp 260 265 270
Asp Glu Trp Ala rle Cys Gln rle Arg Thr Thr Ala Asn phe Ala Thr 275 280 285
Asn Asn pro phe Trp Asn Trp phe Cys Gly Gly Leu Asn His Gln val 290 295 300
Thr His His Leu phe pro Asn rle Cys His rle His Tyr pro Gln Leu 305 310 315 320
Glu Asn rle rle Lys Asp val Cys Gln Glu phe Gly val Glu Tyr Lys 325 330 335
val Tyr pro Thr phe Lys Ala Ala rle Ala Ser Asn Tyr Arg Trp Leu 340 345 350
Glu Ala Met Gly Lys Ala Ser 355
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:18: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A)LONGITUD: 365 aminoácidos (B)TIPO: aminoácido (C)TIPO DE CADENA: no relevante (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:18:
Met Thr Ser Thr Thr Ser Lys val Thr phe Gly Lys Ser rle Gly phe 1 5 10 15
Arg Lys Glu Leu Asn Arg Arg val Asn Ala Tyr Leu Glu Ala Glu Asn 20 25 30
rle Ser pro Arg Asp Asn pro pro Met Tyr Leu Lys Thr Ala rle rle 35 40 45
Leu Ala Trp val val Ser Ala Trp Thr phe val val phe Gly pro Asp 50 55 60
val Leu Trp Met Lys Leu Leu Gly Cys rle val Leu Gly phe Gly val 65 70 75 80
Ser Ala val Gly phe Asn rle Ser His Asp Gly Asn His Gly Gly Tyr 85 90 95
Ser Lys Tyr Gln Trp val Asn Tyr Leu Ser Gly Leu Thr His Asp Ala 100 105 110
rle Gly val Ser Ser Tyr Leu Trp Lys phe Arg His Asn val Leu His 115 120 125
His Thr Tyr Thr Asn rle Leu Gly His Asp val Glu rle His Gly Asp 130 135 140
Glu Leu val Arg Met Ser pro Ser Met Glu Tyr Arg Trp Tyr His Arg 145 150 155 160
Tyr Gln His Trp phe rle Trp phe val Tyr pro phe rle pro Tyr Tyr 165 170 175
Trp Ser rle Ala Asp val Gln Thr Met Leu phe Lys Arg Gln Tyr His 180 185 190
Asp His Glu rle pro Ser pro Thr Trp val Asp rle Ala Thr Leu Leu 195 200 205
Ala phe Lys Ala phe Gly val Ala val phe Leu rle rle pro rle Ala 210 215 220
val Gly Tyr Ser pro Leu Glu Ala val rle Gly Ala Ser rle val Tyr 225 230 235 240
Met Thr His Gly Leu val Ala Cys val val phe Met Leu Ala His val 245 250 255
rle Glu pro Ala Glu phe Leu Asp pro Asp Asn Leu His rle Asp Asp 260 265 270
Glu Trp Ala rle Ala Gln val Lys Thr Thr val Asp phe Ala pro Asn 275 280 285
Asn Thr rle rle Asn Trp Tyr val Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Thr val 290 295 300
His His Leu phe pro His rle Cys His rle His Tyr pro Lys rle Ala 305 310 315 320
pro rle Leu Ala Glu val Cys Glu Glu phe Gly val Asn Tyr Ala val 325 330 335
His Gln Thr phe phe Gly Ala Leu Ala Ala Asn Tyr Ser Trp Leu Lys 340 345 350
Lys Met Ser rle Asn pro Glu Thr Lys Ala rle Glu Gln 355 360 365
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:19:
(i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A)LONGITUD: 35 pares de bases (B)TIPO: ácido nucleico (C)TIPO DE CADENA: sencilla (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:19:
CCAAGCTTCT GCAGGAGCTC TTTTTTTTTT TTTTT 35
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:20:
(i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A)LONGITUD: 32 pares de bases (B)TIPO: ácido nucleico (C)TIPO DE CADENA: sencilla (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
(B)
LOCUS: 21
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /número=1
/nota= “N=Inosina o citosina” (ix)CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
(B)
LOCUS: 27
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /número=2
/nota= “N=Inosina o citosina” (ix)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:20:
C�AC�AC�AC �ACA�CA�AC �TA�AC�AA� AT 32
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:21: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc= ”oligonucleótido
sintético” (ix)CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
(B)
LOCUS: 13
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /número=1
/nota= “N=Inosina o citosina” (ix)CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
(B)
LOCUS: 19
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /número=2
/nota= “N=Inosina o citosina” (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:21:
CA�CA�CA�C A��GG�AA�A ��TG�TG 27
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:22: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:22:
C�AC�AC�AC �AGGAGTCCT CTACGGTGTT TTG 33
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:23: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:23:
CA�CA�CA�C A�ATGATGCT CAAGCTGAAA CTG 33
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:24: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:24:
Gln Xaa Xaa His His 1 5
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:25: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:25:
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:26: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:26:
C�AC�AC�AC �ACTCGAGCA AGATGGGAAC GGACCAAGG 39 CA�CA�CA�C A�CTCGAGCT ACTCTTCCTT GGGACGGAG 39
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:27: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 47 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:27:
C�AC�AC�AC �ATCTAGACT CGAGACCATG GCTGCTGCTC CAGTGTG 47
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:28: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:28:
CA�CA�CA�C A�AGGCCTCG AGTTACTGCG CCTTACCCAT 40
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:29: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 37 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:29:
C�AC�AC�A C�AGGATCCA TGGCACCTCC CAACACT 37
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:30: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:30:
CA�CA�CA� CA�GGTACCT CGAGTTACTT CTTGAAAAAG AC 42
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:31: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 1219 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig Editado 2692004) (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:31:
GCACGCCGAC CGGCGCCGGG AGATCCTGGC AAAGTATCCA GAGATAAAGT CCTTGATGAA 60 ACCTGATCCC AATTTGATAT GGATTATAAT TATGATGGTT CTCACCCAGT TGGGTGCATT 120 TTACATAGTA AAAGACTTGG ACTGGAAATG GGTCATATTT GGGGCCTATG CGTTTGGCAG 180 TTGCATTAAC CACTCAATGA CTCTGGCTAT TCATGAGATT GCCCACAATG CTGCCTTTGG 240 CAACTGCAAA GCAATGTGGA ATCGCTGGTT TGGAATGTTT GCTAATCTTC CTATTGGGAT 300 TCCATATTCA ATTTCCTTTA AGAGGTATCA CATGGATCAT CATCGGTACC TTGGAGCTGA 360 TGGCGTCGAT GTAGATATTC CTACCGATTT TGAGGGCTGG TTCTTCTGTA CCGCTTTCAG 420 AAAGTTTATA TGGGTTATTC TTCAGCCTCT CTTTTATGCC TTTCGACCTC TGTTCATCAA 480 CCCCAAACCA ATTACGTATC TGGAAGTTAT CAATACCGTG GCACAGGTCA CTTTTGACAT 540 TTTAATTTAT TACTTTTTGG GAATTAAATC CTTAGTCTAC ATGTTGGCAG CATCTTTACT 600 TGGCCTGGGT TTGCACCCAA TTTCTGGACA TTTTATAGCT GAGCATTACA TGTTCTTAAA 660 GGGTCATGAA ACTTACTCAT ATTATGGGCC TCTGAATTTA CTTACCTTCA ATGTGGGTTA 720 TCATAATGAA CATCATGATT TCCCCAACAT TCCTGGAAAA AGTCTTCCAC TGGTGAGGAA 780 AATAGCAGCT GAATACTATG ACAACCTCCC TCACTACAAT TCCTGGATAA AAGTACTGTA 840 TGATTTTGTG ATGGATGATA CAATAAGTCC CTACTCAAGA ATGAAGAGGC ACCAAAAAGG 900 AGAGATGGTG CTGGAGTAAA TATCATTAGT GCCAAAGGGA TTCTTCTCCA AAACTTTAGA 960 TGATAAAATG GAATTTTTGC ATTATTAAAC TTGAGACCAG TGATGCTCAG AAGCTCCCCT 1020 GGCACAATTT CAGAGTAAGA GCTCGGTGAT ACCAAGAAGT GAATCTGGCT TTTAAACAGT 1080 CAGCCTGACT CTGTACTGCT CAGTTTCACT CACAGGAAAC TTGTGACTTG TGTATTATCG 1140 TCATTGAGGA TGTTTCACTC ATGTCTGTCA TTTTATAAGC ATATCATTTA AAAAGCTTCT 1200 AAAAAGCTAT TTCGCCAGG 1219
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:32: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 655 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig Editado 2153526) (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:32:
TTACCTTCTA CGTCCGCTTC TTCCTCACTT ATGTGCCACT ATTGGGGCTG AAAGCTTCCT 60 GGGCCTTTTC TTCATAGTCA GGTTCCTGGA AAGCAACTGG TTTGTGTGGG TGACACAGAT 120 GAACCATATT CCCATGCACA TTGATCATGA CCGGAACATG GACTGGGTTT CCACCCAGCT 180 CCAGGCCACA TGCAATGTCC ACAAGTCTGC CTTCAATGAC TGGTTCAGTG GACACCTCAA 240 CTTCCAGATT GAGCACCATC TTTTTCCCAC GATGCCTCGA CACAATTACC ACAAAGTGGC 300 TCCCCTGGTG CAGTCCTTGT GTGCCAAGCA TGGCATAGAG TACCAGTCCA AGCCCCTGCT 360 GTCAGCCTTC GCCGACATCA TCCACTCACT AAAGGAGTCA GGGCAGCTCT GGCTAGATGC 420 CTATCTTCAC CAATAACAAC AGCCACCCTG CCCAGTCTGG AAGAAGAGGA GGAAGACTCT 480 GGAGCCAAGG CAGAGGGGAG CTTGAGGGAC AATGCCACTA TAGTTTAATA CTCAGAGGGG 540 GTTGGGTTTG GGGACATAAA GCCTCTGACT CAAACTCCTC CCTTTTATCT TCTAGCCACA 600 GTTCTAAGAC CCAAAGTGGG GGGTGGACAC AGAAGTCCCT AGGAGGGAAG GAGCT 655
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:33: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 304 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig Editado 3506132) (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:33:
GTCTTTTACT TTGGCAATGG CTGGATTCCT ACCCTCATCA CGGCCTTTGT CCTTGCTACC 60 TCTCAGGCCC AAGCTGGATG GCTGCAACAT GATTATGGCC ACCTGTCTGT CTACAGAAAA 120 CCCAAGTGGA ACCACCTTGT CCACAAATTC GTCATTGGCC ACTTAAAGGG TGCCTCTGCC 180 AACTGGTGGA ATCATCGCCA CTTCCAGCAC CACGCCAAGC CTAACATCTT CCACAAGGAT 240 CCCGATGTGA ACATGCTGCA CGTGTTTGTT CTGGGCGAAT GGCAGCCCAT CGAGTACGGC 300 AAGA 304
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:34: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 918 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig Editado 3854933) (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:34:
CAGGGACCTA CCCCGCGCTA CTTCACCTGG GACGAGGTGG CCCAGCGCTC AGGGTGCGAG 60 GAGCGGTGGC TAGTGATCGA CCGTAAGGTG TACAACATCA GCGAGTTCAC CCGCCGGCAT 120 CCAGGGGGCT CCCGGGTCAT CAGCCACTAC GCCGGGCAGG ATGCCACGGA TCCCTTTGTG 180 GCCTTCCACA TCAACAAGGG CCTTGTGAAG AAGTATATGA ACTCTCTCCT GATTGGAGAA 240 CTGTCTCCAG AGCAGCCCAG CTTTGAGCCC ACCAAGAATA AAGAGCTGAC AGATGAGTTC 300 CGGGAGCTGC GGGCCACAGT GGAGCGGATG GGGCTCATGA AGGCCAACCA TGTCTTCTTC 360 CTGCTGTACC TGCTGCACAT CTTGCTGCTG GATGGTGCAG CCTGGCTCAC CCTTTGGGTC 420 TTTGGGACGT CCTTTTTGCC CTTCCTCCTC TGTGCGGTGC TGCTCAGTGC AGTTCAGGCC 480 CAGGCTGGCT GGCTGCAGCA TGACTTTGGG CACCTGTCGG TCTTCAGCAC CTCAAAGTGG 540 AACCATCTGC TACATCATTT TGTGATTGGC CACCTGAAGG GGGCCCCCGC CAGTTGGTGG 600 AACCACATGC ACTTCCAGCA CCATGCCAAG CCCAACTGCT TCCGCAAAGA CCCAGACATC 660 AACATGCATC CCTTCTTCTT TGCCTTGGGG AAGATCCTCT CTGTGGAGCT TGGGAAACAG 720 AAGAAAAAAT ATATGCCGTA CAACCACCAG CACA�ATACT TCTTCCTAAT TGGGCCCCCA 780 GCCTTGCTGC CTCTCTACTT CCAGTGGTAT ATTTTCTATT TTGTTATCCA GCGAAAGAAG 840 TGGGTGGACT TGGCCTGGAT CAGCAAACAG GAATACGATG AAGCCGGGCT TCCATTGTCC 900 ACCGCAAATG CTTCTAAA 918
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:35: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 1686 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig Editado 2511785) (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:35:
GCCACTTAAA GGGTGCCTCT GCCAACTGGT GGAATCATCG CCACTTCCAG CACCACGCCA 60 AGCCTAACAT CTTCCACAAG GATCCCGATG TGAACATGCT GCACGTGTTT GTTCTGGGCG 120 AATGGCAGCC CATCGAGTAC GGCAAGAAGA AGCTGAAATA CCTGCCCTAC AATCACCAGC 180 ACGAATACTT CTTCCTGATT GGGCCGCCGC TGCTCATCCC CATGTATTTC CAGTACCAGA 240 TCATCATGAC CATGATCGTC CATAAGAACT GGGTGGACCT GGCCTGGGCC GTCAGCTACT 300 ACATCCGGTT CTTCATCACC TACATCCCTT TCTACGGCAT CCTGGGAGCC CTCCTTTTCC 360 TCAACTTCAT CAGGTTCCTG GAGAGCCACT GGTTTGTGTG GGTCACACAG ATGAATCACA 420 TCGTCATGGA GATTGACCAG GAGGCCTACC GTGACTGGTT CAGTAGCCAG CTGACAGCCA 480 CCTGCAACGT GGAGCAGTCC TTCTTCAACG ACTGGTTCAG TGGACACCTT AACTTCCAGA 540 TTGAGCACCA CCTCTTCCCC ACCATGCCCC GGCACAACTT ACACAAGATC GCCCCGCTGG 600 TGAAGTCTCT ATGTGCCAAG CATGGCATTG AATACCAGGA GAAGCCGCTA CTGAGGGCCC 660 TGCTGGACAT CATCAGGTCC CTGAAGAAGT CTGGGAAGCT GTGGCTGGAC GCCTACCTTC 720 ACAAATGAAG CCACAGCCCC CGGGACACCG TGGGGAAGGG GTGCAGGTGG GGTGATGGCC 780 AGAGGAATGA TGGGCTTTTG TTCTGAGGGG TGTCCGAGAG GCTGGTGTAT GCACTGCTCA 840 CGGACCCCAT GTTGGATCTT TCTCCCTTTC TCCTCTCCTT TTTCTCTTCA CATCTCCCCC 900 ATAGCACCCT GCCCTCATGG GACCTGCCCT CCCTCAGCCG TCAGCCATCA GCCATGGCCC 960 TCCCAGTGCC TCCTAGCCCC TTCTTCCAAG GAGCAGAGAG GTGGCCACCG GGGGTGGCTC 1020 TGTCCTACCT CCACTCTCTG CCCCTAAAGA TGGGAGGAGA CCAGCGGTCC ATGGGTCTGG 1080 CCTGTGAGTC TCCCCTTGCA GCCTGGTCAC TAGGCATCAC CCCCGCTTTG GTTCTTCAGA 1140 TGCTCTTGGG GTTCATAGGG GCAGGTCCTA GTCGGGCAGG GCCCCTGACC CTCCCGGCCT 1200 GGCTTCACTC TCCCTGACGG CTGCCATTGG TCCACCCTTT CATAGAGAGG CCTGCTTTGT 1260 TACAAAGCTC GGGTCTCCCT CCTGCAGCTC GGTTAAGTAC CCGAGGCCTC TCTTAAGATG 1320 TCCAGGGCCC CAGGCCCGCG GGCACAGCCA GCCCAAACCT TGGGCCCTGG AAGAGTCCTC 1380 CACCCCATCA CTAGAGTGCT CTGACCCTGG GCTTTCACGG GCCCCATTCC ACCGCCTCCC 1440 CAACTTGAGC CTGTGACCTT GGGACCAAAG GGGGAGTCCC TCGTCTCTTG TGACTCAGCA 1500 GAGGCAGTGG CCACGTTCAG GGAGGGGCCG GCTGGCCTGG AGGCTCAGCC CACCCTCCAG 1560 CTTTTCCTCA GGGTGTCCTG AGGTCCAAGA TTCTGGAGCA ATCTGACCCT TCTCCAAAGG 1620 CTCTGTTATC AGCTGGGCAG TGCCAGCCAA TCCCTGGCCA TTTGGCCCCA GGGGACGTGG 1680 GCCCTG 1686
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:36: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 1843 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig 2535) (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:36:
GTCTTTTACT TTGGCAATGG CTGGATTCCT ACCCTCATCA CGGCCTTTGT CCTTGCTACC 60 TCTCAGGCCC AAGCTGGATG GCTGCAACAT GATTATGGCC ACCTGTCTGT CTACAGAAAA 120 CCCAAGTGGA ACCACCTTGT CCACAAATTC GTCATTGGCC ACTTAAAGGG TGCCTCTGCC 180 AACTGGTGGA ATCATCGCCA CTTCCAGCAC CACGCCAAGC CTAACATCTT CCACAAGGAT 240 CCCGATGTGA ACATGCTGCA CGTGTTTGTT CTGGGCGAAT GGCAGCCCAT CGAGTACGGC 300 AAGAAGAAGC TGAAATACCT GCCCTACAAT CACCAGCACG AATACTTCTT CCTGATTGGG 360 CCGCCGCTGC TCATCCCCAT GTATTTCCAG TACCAGATCA TCATGACCAT GATCGTCCAT 420 AAGAACTGGG TGGACCTGGC CTGGGCCGTC AGCTACTACA TCCGGTTCTT CATCACCTAC 480 ATCCCTTTCT ACGGCATCCT GGGAGCCCTC CTTTTCCTCA ACTTCATCAG GTTCCTGGAG 540 AGCCACTGGT TTGTGTGGGT CACACAGATG AATCACATCG TCATGGAGAT TGACCAGGAG 600 GCCTACCGTG ACTGGTTCAG TAGCCAGCTG ACAGCCACCT GCAACGTGGA GCAGTCCTTC 660 TTCAACGACT GGTTCAGTGG ACACCTTAAC TTCCAGATTG AGCACCACCT CTTCCCCACC 720 ATGCCCCGGC ACAACTTACA CAAGATCGCC CCGCTGGTGA AGTCTCTATG TGCCAAGCAT 780 GGCATTGAAT ACCAGGAGAA GCCGCTACTG AGGGCCCTGC TGGACATCAT CAGGTCCCTG 840 AAGAAGTCTG GGAAGCTGTG GCTGGACGCC TACCTTCACA AATGAAGCCA CAGCCCCCGG 900 GACACCGTGG GGAAGGGGTG CAGGTGGGGT GATGGCCAGA GGAATGATGG GCTTTTGTTC 960 TGAGGGGTGT CCGAGAGGCT GGTGTATGCA CTGCTCACGG ACCCCATGTT GGATCTTTCT 1020 CCCTTTCTCC TCTCCTTTTT CTCTTCACAT CTCCCCCATA GCACCCTGCC CTCATGGGAC 1080 CTGCCCTCCC TCAGCCGTCA GCCATCAGCC ATGGCCCTCC CAGTGCCTCC TAGCCCCTTC 1140 TTCCAAGGAG CAGAGAGGTG GCCACCGGGG GTGGCTCTGT CCTACCTCCA CTCTCTGCCC 1200 CTAAAGATGG GAGGAGACCA GCGGTCCATG GGTCTGGCCT GTGAGTCTCC CCTTGCAGCC 1260 TGGTCACTAG GCATCACCCC CGCTTTGGTT CTTCAGATGC TCTTGGGGTT CATAGGGGCA 1320 GGTCCTAGTC GGGCAGGGCC CCTGACCCTC CCGGCCTGGC TTCACTCTCC CTGACGGCTG 1380 CCATTGGTCC ACCCTTTCAT AGAGAGGCCT GCTTTGTTAC AAAGCTCGGG TCTCCCTCCT 1440 GCAGCTCGGT TAAGTACCCG AGGCCTCTCT TAAGATGTCC AGGGCCCCAG GCCCGCGGGC 1500 ACAGCCAGCC CAAACCTTGG GCCCTGGAAG AGTCCTCCAC CCCATCACTA GAGTGCTCTG 1560 ACCCTGGGCT TTCACGGGCC CCATTCCACC GCCTCCCCAA CTTGAGCCTG TGACCTTGGG 1620 ACCAAAGGGG GAGTCCCTCG TCTCTTGTGA CTCAGCAGAG GCAGTGGCCA CGTTCAGGGA 1680 GGGGCCGGCT GGCCTGGAGG CTCAGCCCAC CCTCCAGCTT TTCCTCAGGG TGTCCTGAGG 1740 TCCAAGATTC TGGAGCAATC TGACCCTTCT CCAAAGGCTC TGTTATCAGC TGGGCAGTGC 1800 CAGCCAATCC CTGGCCATTT GGCCCCAGGG GACGTGGGCC CTG 1843
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:37: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 2257 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig Editado 253538ª) (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:37:
CAGGGACCTA CCCCGCGCTA CTTCACCTGG GACGAGGTGG CCCAGCGCTC AGGGTGCGAG 60 GAGCGGTGGC TAGTGATCGA CCGTAAGGTG TACAACATCA GCGAGTTCAC CCGCCGGCAT 120 CCAGGGGGCT CCCGGGTCAT CAGCCACTAC GCCGGGCAGG ATGCCACGGA TCCCTTTGTG 180 GCCTTCCACA TCAACAAGGG CCTTGTGAAG AAGTATATGA ACTCTCTCCT GATTGGAGAA 240 CTGTCTCCAG AGCAGCCCAG CTTTGAGCCC ACCAAGAATA AAGAGCTGAC AGATGAGTTC 300 CGGGAGCTGC GGGCCACAGT GGAGCGGATG GGGCTCATGA AGGCCAACCA TGTCTTCTTC 360 CTGCTGTACC TGCTGCACAT CTTGCTGCTG GATGGTGCAG CCTGGCTCAC CCTTTGGGTC 420 TTTGGGACGT CCTTTTTGCC CTTCCTCCTC TGTGCGGTGC TGCTCAGTGC AGTTCAGCAG 480 GCCCAAGCTG GATGGCTGCA ACATGATTAT GGCCACCTGT CTGTCTACAG AAAACCCAAG 540 TGGAACCACC TTGTCCACAA ATTCGTCATT GGCCACTTAA AGGGTGCCTC TGCCAACTGG 600 TGGAATCATC GCCACTTCCA GCACCACGCC AAGCCTAACA TCTTCCACAA GGATCCCGAT 660 GTGAACATGC TGCACGTGTT TGTTCTGGGC GAATGGCAGC CCATCGAGTA CGGCAAGAAG 720 AAGCTGAAAT ACCTGCCCTA CAATCACCAG CACGAATACT TCTTCCTGAT TGGGCCGCCG 780 CTGCTCATCC CCATGTATTT CCAGTACCAG ATCATCATGA CCATGATCGT CCATAAGAAC 840 TGGGTGGACC TGGCCTGGGC CGTCAGCTAC TACATCCGGT TCTTCATCAC CTACATCCCT 900 TTCTACGGCA TCCTGGGAGC CCTCCTTTTC CTCAACTTCA TCAGGTTCCT GGAGAGCCAC 960 TGGTTTGTGT GGGTCACACA GATGAATCAC ATCGTCATGG AGATTGACCA GGAGGCCTAC 1020 CGTGACTGGT TCAGTAGCCA GCTGACAGCC ACCTGCAACG TGGAGCAGTC CTTCTTCAAC 1080 GACTGGTTCA GTGGACACCT TAACTTCCAG ATTGAGCACC ACCTCTTCCC CACCATGCCC 1140 CGGCACAACT TACACAAGAT CGCCCCGCTG GTGAAGTCTC TATGTGCCAA GCATGGCATT 1200 GAATACCAGG AGAAGCCGCT ACTGAGGGCC CTGCTGGACA TCATCAGGTC CCTGAAGAAG 1260 TCTGGGAAGC TGTGGCTGGA CGCCTACCTT CACAAATGAA GCCACAGCCC CCGGGACACC 1320 GTGGGGAAGG GGTGCAGGTG GGGTGATGGC CAGAGGAATG ATGGGCTTTT GTTCTGAGGG 1380 GTGTCCGAGA GGCTGGTGTA TGCACTGCTC ACGGACCCCA TGTTGGATCT TTCTCCCTTT 1440 CTCCTCTCCT TTTTCTCTTC ACATCTCCCC CATAGCACCC TGCCCTCATG GGACCTGCCC 1500
TCCCTCAGCC GTCAGCCATC AGCCATGGCC CTCCCAGTGC CTCCTAGCCC CTTCTTCCAA 1560
GGAGCAGAGA GGTGGCCACC GGGGGTGGCT CTGTCCTACC TCCACTCTCT GCCCCTAAAG 1620
ATGGGAGGAG ACCAGCGGTC CATGGGTCTG GCCTGTGAGT CTCCCCTTGC AGCCTGGTCA 1680
CTAGGCATCA CCCCCGCTTT GGTTCTTCAG ATGCTCTTGG GGTTCATAGG GGCAGGTCCT 1740
AGTCGGGCAG GGCCCCTGAC CCTCCCGGCC TGGCTTCACT CTCCCTGACG GCTGCCATTG 1800
GTCCACCCTT TCATAGAGAG GCCTGCTTTG TTACAAAGCT CGGGTCTCCC TCCTGCAGCT 1860
CGGTTAAGTA CCCGAGGCCT CTCTTAAGAT GTCCAGGGCC CCAGGCCCGC GGGCACAGCC 1920
AGCCCAAACC TTGGGCCCTG GAAGAGTCCT CCACCCCATC ACTAGAGTGC TCTGACCCTG 1980
GGCTTTCACG GGCCCCATTC CACCGCCTCC CCAACTTGAG CCTGTGACCT TGGGACCAAA 2040
GGGGGAGTCC CTCGTCTCTT GTGACTCAGC AGAGGCAGTG GCCACGTTCA GGGAGGGGCC 2100
GGCTGGCCTG GAGGCTCAGC CCACCCTCCA GCTTTTCCTC AGGGTGTCCT GAGGTCCAAG 2160
ATTCTGGAGC AATCTGACCC TTCTCCAAAG GCTCTGTTAT CAGCTGGGCA GTGCCAGCCA 2220
ATCCCTGGCC ATTTGGCCCC AGGGGACGTG GGCCCTG 2257
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:38: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 411 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido(Traducción
de Contig 2692004) (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:38:
His Ala Asp Arg Arg Arg Glu rle Leu Ala Lys Tyr pro Glu rle 1 5 10 15 Lys Ser Leu Met Lys pro Asp pro Asn Leu rle Trp rle rle rle
20 25 30 Met Met val Leu Thr Gln Leu Gly Ala phe Tyr rle val Lys Asp 35 40 45 Leu Asp Trp Lys Trp val rle phe Gly Ala Tyr Ala phe Gly Ser 50 55 60 Cys rle Asn His Ser Met Thr Leu Ala rle His Glu rle Ala His 65 70 75 Asn Ala Ala phe Gly Asn Cys Lys Ala Met Trp Asn Arg Trp phe 80 85 90 Gly Met phe Ala Asn Leu pro rle Gly rle pro Tyr Ser rle Ser 95 100 105 phe Lys Arg Tyr His Met Asp His His Arg Tyr Leu Gly Ala Asp 110 115 120 Gly val Asp val Asp rle pro Thr Asp phe Glu Gly Trp phe phe 125 130 135 Cys Thr Ala phe Arg Lys phe rle Trp val rle Leu Gln pro Leu 140 145 150 phe Tyr Ala phe Arg pro Leu phe rle Asn pro Lys pro rle Thr 155 160 165 Tyr Leu Glu val rle Asn Thr val Ala Gln val Thr phe Asp rle 170 175 180 Leu rle Tyr Tyr phe Leu Gly rle Lys Ser Leu val Tyr Met Leu 185 190 195 Ala Ala Ser Leu Leu Gly Leu Gly Leu His pro rle Ser Gly His 200 205 210 phe rle Ala Glu His Tyr Met phe Leu Lys Gly His Glu Thr Tyr 215 220 225 Ser Tyr Tyr Gly pro Leu Asn Leu Leu Thr phe Asn val Gly Tyr 230 235 240 His Asn Glu His His Asp phe pro Asn rle pro Gly Lys Ser Leu 245 250 255 pro Leu val Arg Lys rle Ala Ala Glu Tyr Tyr Asp Asn Leu pro
260 265 270 His Tyr Asn Ser Trp rle Lys val Leu Tyr Asp phe val Met Asp 275 280 285 Asp Thr rle Ser pro Tyr Ser Arg Met Lys Arg His Gln Lys Gly 290 295 300 Glu Met val Leu Glu Xaa rle Ser Leu val pro Lys Gly phe phe 305 310 315 Ser Lys Thr Leu Asp Asp Lys Met Glu phe Leu His Tyr Xaa Thr 320 325 330 Xaa Asp Gln Xaa Cys Ser Glu Ala pro Leu Ala Gln phe Gln Ser 335 340 345 Lys Ser Ser val rle pro Arg Ser Glu Ser Gly phe Xaa Thr val 350 355 360 Ser Leu Thr Leu Tyr Cys Ser val Ser Leu Thr Gly Asn Leu Xaa 365 370 375 Leu val Tyr Tyr Arg His Xaa Gly Cys phe Thr His val Cys His 380 385 390 phe rle Ser rle Ser phe Lys Lys Leu Leu Lys Ser Tyr phe Ala 400 405 410 Arg
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:39: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 218 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido(Traducción de Contig 2153526) (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:39:
Tyr Leu Leu Arg pro Leu Leu pro His Leu Cys Ala Thr rle Gly 1 5 10 15 Ala Glu Ser phe Leu Gly Leu phe phe rle val Arg phe Leu Glu
20 25 30 Ser Asn Trp phe val Trp val Thr Gln Met Asn His rle pro Met 35 40 45 His rle Asp His Asp Arg Asn Met Asp Trp val Ser Thr Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Thr Cys Asn val His Lys Ser Ala phe Asn Asp Trp phe 65 70 75 Ser Gly His Leu Asn phe Gln rle Glu His His Leu phe pro Thr 80 85 90 Met pro Arg His Asn Tyr His Lys val Ala pro Leu val Gln Ser 95 100 105 Leu Cys Ala Lys His Gly rle Glu Tyr Gln Ser Lys pro Leu Leu 110 115 120 Ser Ala phe Ala Asp rle rle His Ser Leu Lys Glu Ser Gly Gln 125 130 135 Leu Trp Leu Asp Ala Tyr Leu His Gln Xaa Gln Gln pro pro Cys 140 145 150 pro val Trp Lys Lys Arg Arg Lys Thr Leu Glu pro Arg Gln Arg 155 160 165 Gly Ala Xaa Gly Thr Met pro Leu Xaa phe Asn Thr Gln Arg Gly 170 175 180 Leu Gly Leu Gly Thr Xaa Ser Leu Xaa Leu Lys Leu Leu pro phe 185 190 195 rle phe Xaa pro Gln phe Xaa Asp pro Lys Trp Gly val Asp Thr 200 205 210
Glu val pro Arg Arg Glu Gly Ala 215
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:40: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 71 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido(Traducción de Contig 3506132) (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:40:
val phe Tyr phe Gly Asn Gly Trp rle pro Thr Leu rle Thr Ala 1 5 10 15 phe val Leu Ala Thr Ser Gln Ala Gln Ala Gly Trp Leu Gln His
20 25 30 Asp Tyr Gly His Leu Ser val Tyr Arg Lys pro Lys Trp Asn His 35 40 45 Leu val His Lys phe val rle Gly His Leu Lys Gly Ala Ser Ala 50 55 60 Asn Trp Trp Asn His Arg His phe Gln His His Ala Lys pro Asn 65 70 75 Leu Gly Glu Trp Gln pro rle Glu Tyr Gly Lys Xaa 80 85
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:41:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A)LONGITUD: 306 aminoácidos (B)TIPO: aminoácido (C)TIPO DE CADENA: sencilla (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido(Traducción de Contig 3854933) (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:41:
Gln Gly pro Thr pro Arg Tyr phe Thr Trp Asp Glu val Ala Gln 1 5 10 15 Arg Ser Gly Cys Glu Glu Arg Trp Leu val rle Asp Arg Lys val 20 25 30 Tyr Asn rle Ser Glu phe Thr Arg Arg His pro Gly Gly Ser Arg 35 40 45 val rle Ser His Tyr Ala Gly Gln Asp Ala Thr Asp pro phe val 50 55 60 Ala phe His rle Asn Lys Gly Leu val Lys Lys Tyr Met Asn Ser 65 70 75 Leu Leu rle Gly Glu Leu Ser pro Glu Gln pro Ser phe Glu pro 80 85 90 Thr Lys Asn Lys Glu Leu Thr Asp Glu phe Arg Glu Leu Arg Ala 95 100 105 Thr val Glu Arg Met Gly Leu Met Lys Ala Asn His val phe phe 110 115 120 Leu Leu Tyr Leu Leu His rle Leu Leu Leu Asp Gly Ala Ala Trp 125 130 135 Leu Thr Leu Trp val phe Gly Thr Ser phe Leu pro phe Leu Leu 140 145 150 Cys Ala val Leu Leu Ser Ala val Gln Ala Gln Ala Gly Trp Leu 155 160 165 Gln His Asp phe Gly His Leu Ser val phe Ser Thr Ser Lys Trp 170 175 180 Asn His Leu Leu His His phe val rle Gly His Leu Lys Gly Ala 185 190 195 pro Ala Ser Trp Trp Asn His Met His phe Gln His His Ala Lys 200 205 210 pro Asn Cys phe Arg Lys Asp pro Asp rle Asn Met His pro phe 215 220 225 phe phe Ala Leu Gly Lys rle Leu Ser val Glu Leu Gly Lys Gln 230 235 240 Lys Lys Lys Tyr Met pro Tyr Asn His Gln His Xaa Tyr phe phe 245 250 255 Leu rle Gly pro pro Ala Leu Leu pro Leu Tyr phe Gln Trp Tyr 260 265 270 rle phe Tyr phe val rle Gln Arg Lys Lys Trp val Asp Leu Ala 275 280 285 Trp rle Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ala Gly Leu pro Leu Ser 290 295 300
Thr Ala Asn Ala Ser Lys 305
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:42: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 566 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido(Traducción de Contig 2511785)
(xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:42:
His Leu Lys
Gly Ala Ser Ala Asn Trp Trp Asn His Arg His phe
1
5 10 15
Gln His His
Ala Lys pro Asn rle phe His Lys Asp pro Asp val
20
25 30
Asn Met Leu
His val phe val Leu Gly Glu Trp Gln pro rle Glu
35
40 45
Tyr Gly Lys
Lys Lys Leu Lys Tyr Leu pro Tyr Asn His Gln His
50
55 60
Glu Tyr phe
phe Leu rle Gly pro pro Leu Leu rle pro Met Tyr
65
70 75
phe Gln Tyr
Gln rle rle Met Thr Met rle val His Lys Asn Trp
80
85 90
val Asp Leu
Ala Trp Ala val Ser Tyr Tyr rle Arg phe phe rle
95
100 105
Thr Tyr rle
pro phe Tyr Gly rle Leu Gly Ala Leu Leu phe Leu
110
115 120
Asn phe rle
Arg phe Leu Glu Ser His Trp phe val Trp val Thr
125
130 135
Gln Met Asn
His rle val Met Glu rle Asp Gln Glu Ala Tyr Arg
140
145 150
Asp Trp phe
Ser Ser Gln Leu Thr Ala Thr Cys Asn val Glu Gln
155
160 165
Ser phe phe
Asn Asp Trp phe Ser Gly His Leu Asn phe Gln rle
170
175 180
Glu His His
Leu phe pro Thr Met pro Arg His Asn Leu His Lys
185
190 195
rle Ala pro
Leu val Lys Ser Leu Cys Ala Lys His Gly rle Glu
200
205 210
Tyr Gln Glu
Lys pro Leu Leu Arg Ala Leu Leu Asp rle rle Arg
215
220 225
Ser Leu Lys
Lys Ser Gly Lys Leu Trp Leu Asp Ala Tyr Leu His
230
235 240
Lys Xaa Ser
His Ser pro Arg Asp Thr val Gly Lys Gly Cys Arg
245
250 255
Trp Gly Asp
Gly Gln Arg Asn Asp Gly Leu Leu phe Xaa Gly val
260
265 270
Ser Glu Arg
Leu val Tyr Ala Leu Leu Thr Asp pro Met Leu Asp
275
280 285
Leu Ser pro
phe Leu Leu Ser phe phe Ser Ser His Leu pro His
290
295 300
Ser Thr Leu
pro Ser Trp Asp Leu pro Ser Leu Ser Arg Gln pro
305
310 315
Ser Ala Met
Ala Leu pro val pro pro Ser pro phe phe Gln Gly
320
325 330
Ala Glu Arg
Trp pro pro Gly val Ala Leu Ser Tyr Leu His Ser
335
340 345
Leu pro Leu
Lys Met Gly Gly Asp Gln Arg Ser Met Gly Leu Ala
350
355 360
Cys Glu Ser
pro Leu Ala Ala Trp Ser Leu Gly rle Thr pro Ala
365
370 375
Leu val Leu
Gln Met Leu Leu Gly phe rle Gly Ala Gly pro Ser
380
385 390
Arg Ala Gly
pro Leu Thr Leu pro Ala Trp Leu His Ser pro Xaa
400
405 410
Arg Leu pro
Leu val His pro phe rle Glu Arg pro Ala Leu Leu
415
420 425
Gln Ser Ser
Gly Leu pro pro Ala Ala Arg Leu Ser Thr Arg Gly
430
435 440
Leu Ser Xaa
Asp val Gln Gly pro Arg pro Ala Gly Thr Ala Ser
445
450 455
pro Asn Leu
Gly pro Trp Lys Ser pro pro pro His His Xaa Ser
460
465 470
Ala Leu Thr
Leu Gly phe His Gly pro His Ser Thr Ala Ser pro
475
480 485
Thr Xaa Ala
Cys Asp Leu Gly Thr Lys Gly Gly val pro Arg Leu
490
495 500
Leu Xaa Leu
Ser Arg Gly Ser Gly His val Gln Gly Gly Ala Gly
505
510 515
Trp pro Gly
Gly Ser Ala His pro pro Ala phe pro Gln Gly val
520
525 530
Leu Arg Ser
Lys rle Leu Glu Gln Ser Asp pro Ser pro Lys Ala
535
540 545
Leu Leu Ser Ala Gly Gln Cys Gln pro rle pro Gly His Leu Ala 550 555 560 pro Gly Asp val Gly pro Xaa 565
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:43: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD:619 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido(Traducción de Contig 2535) (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:43:
val phe Tyr phe Gly Asn Gly Trp rle pro Thr Leu rle Thr Ala 1 5 10 15 phe val Leu Ala Thr Ser Gln Ala Gln Ala Gly Trp Leu Gln His 20 25 30 Asp Tyr Gly His Leu Ser val Tyr Arg Lys pro Lys Trp Asn His 35 40 45 Leu val His Lys phe val rle Gly His Leu Lys Gly Ala Ser Ala 50 55 60 Asn Trp Trp Asn His Arg His phe Gln His His Ala Lys pro Asn 65 70 75 rle phe His Lys Asp pro Asp val Asn Met Leu His val phe val 80 85 90 Leu Gly Glu Trp Gln pro rle Glu Tyr Gly Lys Lys Lys Leu Lys 95 100 105 Tyr Leu pro Tyr Asn His Gln His Glu Tyr phe phe Leu rle Gly 110 115 120 pro pro Leu Leu rle pro Met Tyr phe Gln Tyr Gln rle rle Met 125 130 135 Thr Met rle val His Lys Asn Trp val Asp Leu Ala Trp Ala val 140 145 150 Ser Tyr Tyr rle Arg phe phe rle Thr Tyr rle pro phe Tyr Gly 155 160 165 rle Leu Gly Ala Leu Leu phe Leu Asn phe rle Arg phe Leu Glu 170 175 180 Ser His Trp phe val Trp val Thr Gln Met Asn His rle val Met 185 190 195 Glu rle Asp Gln Glu Ala Tyr Arg Asp Trp phe Ser Ser Gln Leu 200 205 210 Thr Ala Thr Cys Asn val Glu Gln Ser phe phe Asn Asp Trp phe 215 220 225 Ser Gly His Leu Asn phe Gln rle Glu His His Leu phe pro Thr 230 235 240 Met pro Arg His Asn Leu His Lys rle Ala pro Leu val Lys Ser 245 250 255 Leu Cys Ala Lys His Gly rle Glu Tyr Gln Glu Lys pro Leu Leu 260 265 270 Arg Ala Leu Leu Asp rle rle Arg Ser Leu Lys Lys Ser Gly Lys 275 280 285 Leu Trp Leu Asp Ala Tyr Leu His Lys Xaa Ser His Ser pro Arg 290 295 300 Asp Thr val Gly Lys Gly Cys Arg Trp Gly Asp Gly Gln Arg Asn 305 310 315 Asp Gly Leu Leu phe Xaa Gly val Ser Glu Arg Leu val Tyr Ala 320 325 330 Leu Leu Thr Asp pro Met Leu Asp Leu Ser pro phe Leu Leu Ser 335 340 345 phe phe Ser Ser His Leu pro His Ser Thr Leu pro Ser Trp Asp 350 355 360 Leu pro Ser Leu Ser Arg Gln pro Ser Ala Met Ala Leu pro val 365 370 375 pro pro Ser pro phe phe Gln Gly Ala Glu Arg Trp pro pro Gly 380 385 390 val Ala Leu Ser Tyr Leu His Ser Leu pro Leu Lys Met Gly Gly 400 405 410 Asp Gln Arg Ser Met Gly Leu Ala Cys Glu Ser pro Leu Ala Ala 415 420 425 Trp Ser Leu Gly rle Thr pro Ala Leu val Leu Gln Met Leu Leu 430 435 440 Gly phe rle Gly Ala Gly pro Ser Arg Ala Gly pro Leu Thr Leu 445 450 455 pro Ala Trp Leu His Ser pro Xaa Arg Leu pro Leu val His pro 460 465 470 phe rle Glu Arg pro Ala Leu Leu Gln Ser Ser Gly Leu pro pro 475 480 485 Ala Ala Arg Leu Ser Thr Arg Gly Leu Ser Xaa Asp val Gln Gly 490 495 500 pro Arg pro Ala Gly Thr Ala Ser pro Asn Leu Gly pro Trp Lys 505 510 515 Ser pro pro pro His His Xaa Ser Ala Leu Thr Leu Gly phe His 520 525 530 Gly pro His Ser Thr Ala Ser pro Thr Xaa Ala Cys Asp Leu Gly 535 540 545 Thr Lys Gly Gly val pro Arg Leu Leu Xaa Leu Ser Arg Gly Ser 550 555 560 Gly His val Gln Gly Gly Ala Gly Trp pro Gly Gly Ser Ala His 565 570 575 pro pro Ala phe pro Gln Gly val Leu Arg Ser Lys rle Leu Glu 580 585 590 Gln Ser Asp pro Ser pro Lys Ala Leu Leu Ser Ala Gly Gln Cys 595 600 605 Gln pro rle pro Gly His Leu Ala pro Gly Asp val Gly pro Xaa 610 615 620
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:44: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 757 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido(Traducción de Contig.253538) (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:44:
Gln Gly pro Thr pro Arg Tyr phe Thr Trp Asp Glu val Ala Gln 1 5 10 15 Arg Ser Gly Cys Glu Glu Arg Trp Leu val rle Asp Arg Lys val 20 25 30 Tyr Asn rle Ser Glu phe Thr Arg Arg His pro Gly Gly Ser Arg 35 40 45 val rle Ser His Tyr Ala Gly Gln Asp Ala Thr Asp pro phe val 50 55 60 Ala phe His rle Asn Lys Gly Leu val Lys Lys Tyr Met Asn Ser 65 70 75 Leu Leu rle Gly Glu Leu Ser pro Glu Gln pro Ser phe Glu pro 80 85 90 Thr Lys Asn Lys Glu Leu Thr Asp Glu phe Arg Glu Leu Arg Ala 95 100 105 Thr val Glu Arg Met Gly Leu Met Lys Ala Asn His val phe phe 110 115 120 Leu Leu Tyr Leu Leu His rle Leu Leu Leu Asp Gly Ala Ala Trp 125 130 135 Leu Thr Leu Trp val phe Gly Thr Ser phe Leu pro phe Leu Leu 140 145 150 Cys Ala val Leu Leu Ser Ala val Gln Gln Ala Gln Ala Gly Trp 155 160 165 Leu Gln His Asp Tyr Gly His Leu Ser val Tyr Arg Lys pro Lys 170 175 180 Trp Asn His Leu val His Lys phe val rle Gly His Leu Lys Gly 185 190 195 Ala Ser Ala Asn Trp Trp Asn His Arg His phe Gln His His Ala 200 205 210 Lys pro Asn rle phe His Lys Asp pro Asp val Asn Met Leu His 215 220 225 val phe val Leu Gly Glu Trp Gln pro rle Glu Tyr Gly Lys Lys 230 235 240 Lys Leu Lys Tyr Leu pro Tyr Asn His Gln His Glu Tyr phe phe 245 250 255 Leu rle Gly pro pro Leu Leu rle pro Met Tyr phe Gln Tyr Gln 260 265 270 rle rle Met Thr Met rle val His Lys Asn Trp val Asp Leu Ala 275 280 285 Trp Ala val Ser Tyr Tyr rle Arg phe phe rle Thr Tyr rle pro
290 295 300 phe Tyr Gly rle Leu Gly Ala Leu Leu phe Leu Asn phe rle Arg 305 310 315 phe Leu Glu Ser His Trp phe val Trp val Thr Gln Met Asn His 320 325 330 rle val Met Glu rle Asp Gln Glu Ala Tyr Arg Asp Trp phe Ser 335 340 345 Ser Gln Leu Thr Ala Thr Cys Asn val Glu Gln Ser phe phe Asn 350 355 360 Asp Trp phe Ser Gly His Leu Asn phe Gln rle Glu His His Leu 365 370 375 phe pro Thr Met pro Arg His Asn Leu His Lys rle Ala pro Leu 380 385 390 val Lys Ser Leu Cys Ala Lys His Gly rle Glu Tyr Gln Glu Lys 400 405 410 pro Leu Leu Arg Ala Leu Leu Asp rle rle Arg Ser Leu Lys Lys 415 420 425 Ser Gly Lys Leu Trp Leu Asp Ala Tyr Leu His Lys Xaa Ser His 430 435 440 Ser pro Arg Asp Thr val Gly Lys Gly Cys Arg Trp Gly Asp Gly 445 450 455 Gln Arg Asn Asp Gly Leu Leu phe Xaa Gly val Ser Glu Arg Leu 460 465 470 val Tyr Ala Leu Leu Thr Asp pro Met Leu Asp Leu Ser pro phe 475 480 485 Leu Leu Ser phe phe Ser Ser His Leu pro His Ser Thr Leu pro 490 495 500 Ser Trp Asp Leu pro Ser Leu Ser Arg Gln pro Ser Ala Met Ala 505 510 515 Leu pro val pro pro Ser pro phe phe Gln Gly Ala Glu Arg Trp 520 525 530 pro pro Gly val Ala Leu Ser Tyr Leu His Ser Leu pro Leu Lys 535 540 545 Met Gly Gly Asp Gln Arg Ser Met Gly Leu Ala Cys Glu Ser pro 550 555 560 Leu Ala Ala Trp Ser Leu Gly rle Thr pro Ala Leu val Leu Gln 565 570 575 Met Leu Leu Gly phe rle Gly Ala Gly pro Ser Arg Ala Gly pro 580 585 590 Leu Thr Leu pro Ala Trp Leu His Ser pro Xaa Arg Leu pro Leu 595 600 605 val His pro phe rle Glu Arg pro Ala Leu Leu Gln Ser Ser Gly 610 615 620 Leu pro pro Ala Ala Arg Leu Ser Thr Arg Gly Leu Ser Xaa Asp 625 630 635 val Gln Gly pro Arg pro Ala Gly Thr Ala Ser pro Asn Leu Gly 640 645 650 pro Trp Lys Ser pro pro pro His His Xaa Ser Ala Leu Thr Leu 655 660 665 Gly phe His Gly pro His Ser Thr Ala Ser pro Thr Xaa Ala Cys 670 675 680 Asp Leu Gly Thr Lys Gly Gly val pro Arg Leu Leu Xaa Leu Ser 685 690 695 Arg Gly Ser Gly His val Gln Gly Gly Ala Gly Trp pro Gly Gly 700 705 710 Ser Ala His pro pro Ala phe pro Gln Gly val Leu Arg Ser Lys 715 720 725 rle Leu Glu Gln Ser Asp pro Ser pro Lys Ala Leu Leu Ser Ala 730 735 740 Gly Gln Cys Gln pro rle pro Gly His Leu Ala pro Gly Asp val 745 750 755 Gly pro Xaa
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:45: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 746 ácidos nucleicos
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:45:
CGTATGTCAC TCCATTCCAA ACTCGTTCAT GGTATCATAA ATATCAACAC ATTTACGCTC 60 CACTCCTCTA TGGTATTTAC ACACTCAAAT ATCGTACTCA AGATTGGGAA GCTTTTGTAA 120 AGGATGGTAA AAATGGTGCA ATTCGTGTTA GTGTCGCCAC AAATTTCGAT AAGGCCGCTT 180 ACGTCATTGG TAAATTGTCT TTTGTTTTCT TCCGTTTCAT CCTTCCACTC CGTTATCATA 240 GCTTTACAGA TTTAATTTGT TATTTCCTCA TTGCTGAATT CGTCTTTGGT TGGTATCTCA 300 CAATTAATTT CCAAGTTAGT CATGTCGCTG AAGATCTCAA ATTCTTTGCT ACCCCTGAAA 360 GACCAGATGA ACCATCTCAA ATCAATGAAG ATTGGGCAAT CCTTCAACTT AAAACTACTC 420 AAGATTATGG TCATGGTTCA CTCCTTTGTA CCTTTTTTAG TGGTTCTTTA AATCATCAAG 480 TTGTTCATCA TTTATTCCCA TCAATTGCTC AAGATTTCTA CCCACAACTT GTACCAATTG 540 TAAAAGAAGT TTGTAAAGAA CATAACATTA CTTACCACAT TAAACCAAAC TTCACTGAAG 600 CTATTATGTC ACACATTAAT TACCTTTACA AAATGGGTAA TGATCCAGAT TATGTTAAAA 660 AACCATTAGC CTCAAAAGAT GATTAAATGA AATAACTTAA AAACCAATTA TTTACTTTTG 720 ACAAACAGTA ATATTAATAA ATACAA 746
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:46: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 227 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:46:
Tyr val Thr pro phe Gln Thr Arg Ser Trp Tyr His Lys Tyr Gln 1 5 10 15 His rle Tyr Ala pro Leu Leu Tyr Gly rle Tyr Thr Leu Lys Tyr 20 25 30 Arg Thr Gln Asp Trp Glu Ala phe val Lys Asp Gly Lys Asn Gly 35 40 45 Ala rle Arg val Ser val Ala Thr Asn phe Asp Lys Ala Ala Tyr 50 55 60 val rle Gly Lys Leu Ser phe val phe phe Arg phe rle Leu pro 65 70 75 Leu Arg Tyr His Ser phe Thr Asp Leu rle Cys Tyr phe Leu rle 80 85 90 Ala Glu phe val phe Gly Trp Tyr Leu Thr rle Asn phe Gln val 95 100 105 Ser His val Ala Glu Asp Leu Lys phe phe Ala Thr pro Glu Arg 110 115 120 pro Asp Glu pro Ser Gln rle Asn Glu Asp Trp Ala rle Leu Gln 125 130 135 Leu Lys Thr Thr Gln Asp Tyr Gly His Gly Ser Leu Leu Cys Thr 140 145 150 phe phe Ser Gly Ser Leu Asn His Gln val val His His Leu phe 155 160 165 pro Ser rle Ala Gln Asp phe Tyr pro Gln Leu val pro rle val 170 175 180 Lys Glu val Cys Lys Glu His Asn rle Thr Tyr His rle Lys pro 185 190 195 Asn phe Thr Glu Ala rle Met Ser His rle Asn Tyr Leu Tyr Lys 200 205 210 Met Gly Asn Asp pro Asp Tyr val Lys Lys pro Leu Ala Ser Lys 215 220 225
Asp Asp Xaa
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:47: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 494 ácidos nucleicos
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:47:
TTTTGGAAGG �TCCAAGTT� ACCACGGA�T �GGCAAGTT� ACGGGGCGGA AA�CGGTTTT 60 CCCCCCAAGC CTTTTGTCGA CTGGTTCTGT GGTGGCTTCC AGTACCAAGT CGACCACCAC 120 TTATTCCCCA GCCTGCCCCG ACACAATCTG GCCAAGACAC ACGCACTGGT CGAATCGTTC 180 TGCAAGGAGT GGGGTGTCCA GTACCACGAA GCCGACCTCG TGGACGGGAC CATGGAAGTC 240 TTGCACCATT TGGGCAGCGT GGCCGGCGAA TTCGTCGTGG ATTTTGTACG CGACGGACCC 300 GCCATGTAAT CGTCGTTCGT GACGATGCAA GGGTTCACGC ACATCTACAC ACACTCACTC 360 ACACAACTAG TGTAACTCGT ATAGAATTCG GTGTCGACCT GGACCTTGTT TGACTGGTTG 420 GGGATAGGGT AGGTAGGCGG ACGCGTGGGT CG�CCCCGGG AATTCTGTGA CCGGTACCTG 480 GCCCGCGT�A AAGT 494
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:48: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 87 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:48:
phe Trp Lys Xaa pro Ser Xaa pro Arg Xaa Xaa Gln val Xaa Gly 1 5 10 15 Ala Glu Xaa Gly phe pro pro Lys pro phe val Asp Trp phe Cys
20 25 30 Gly Gly phe Gln Tyr Gln val Asp His His Leu phe pro Ser Leu
35 40 45 pro Arg His Asn Leu Ala Lys Thr His Ala Leu val Glu Ser phe
50 55 60 Cys Lys Glu Trp Gly val Gln Tyr His Glu Ala Asp Leu val Asp
65 70 75 Gly Thr Met Glu val Leu His His Leu Gly Ser val Ala Gly Glu
65 70 75 phe val val Asp phe val Arg Asp Gly pro Ala Met
80 85
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:49: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 520 ácidos nucleicos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:49:
GGATGGAGTT CGTCTGGATC GCTGTGCGCT ACGCGACGTG GTTTAAGCGT CATGGGTGCG 60 CTTGGGTACA CGCCGGGGCA GTCGTTGGGC ATGTACTTGT GCGCCTTTGG TCTCGGCTGC 120 ATTTACATTT TTCTGCAGTT CGCCGTAAGT CACACCCATT TGCCCGTGAG CAACCCGGAG 180 GATCAGCTGC ATTGGCTCGA GTACGCGCGG ACCACACTGT GAACATCAGC ACCAAGTCGT 240 GGTTTGTCAC ATGGTGGATG TCGAACCTCA ACTTTCAGAT CGAGCACCAC CTTTTCCCCA 300 CGGCGCCCCA GTTCCGTTTC AAGGAGATCA GCCCGCGCGT CGAGGCCCTC TTCAAGCGCC 360 ACGGTCTCCC TTACTACGAC ATGCCCTACA CGAGCGCCGT CTCCACCACC TTTGCCAACC 420 TCTACTCCGT CGGCCATTCC GTCGGCGACG CCAAGCGCGA CTAGCCTCTT TTCCTAGACC 480 TTAATTCCCC ACCCCACCCC ATGTTCTGTC TTCCTCCCGC 520
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:50: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 153 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:50:
Met Glu phe val Trp rle Ala val Arg Tyr Ala Thr Trp phe Lys 1 5 10 15 Arg His Gly Cys Ala Trp val His Ala Gly Ala val val Gly His
20 25 30 val Leu val Arg Leu Trp Ser Arg Leu His Leu His phe Ser Ala
35 40 45 val Arg Arg Lys Ser His pro phe Ala Arg Glu Gln pro Gly Gly
50 55 60 Ser Ala Ala Leu Ala Arg val Arg Ala Asp His Thr val Asn rle
65 70 75 Ser Thr Lys Ser Trp phe val Thr Trp Trp Met Ser Asn Leu Asn 80 85 90 phe Gln rle Glu His His Leu phe pro Thr Ala pro Gln phe Arg 95 100 105 phe Lys Glu rle Ser pro Arg val Glu Ala Leu phe Lys Arg His 110 115 120 Gly Leu pro Tyr Tyr Asp Met pro Tyr Thr Ser Ala val Ser Thr 125 130 135 Thr phe Ala Asn Leu Tyr Ser val Gly His Ser val Gly Asp Ala 140 145 150
Lys Arg Asp
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:51: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 429 ácidos nucleicos
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:51:
ACGCGTCCGC CCACGCGTCC GCCGCGAGCA ACTCATCAAG GAAGGCTACT TTGACCCCTC 60 GCTCCCGCAC ATGACGTACC GCGTGGTCGA GATTGTTGTT CTCTTCGTGC TTTCCTTTTG 120 GCTGATGGGT CAGTCTTCAC CCCTCGCGCT CGCTCTCGGC ATTGTCGTCA GCGGCATCTC 180 TCAGGGTCGC TGCGGCTGGG TAATGCATGA GATGGGCCAT GGGTCGTTCA CTGGTGTCAT 240 TTGGCTTGAC GACCGGTTGT GCGAGTTCTT TTACGGCGTT GGTTGTGGCA TGAGCGGTCA 300 TTACTGGAAA AACCAGCACA GCAAACACCA CGCAGCGCCA AACCGGCTCG AGCACGATGT 360 AGATCTCAAC ACCTTGCCAT TGGTGGCCTT CAACGAGCGC GTCGTGCGCA AGGTCCGACC 420
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:52: (i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 125 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
(D)
TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi)DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:52:
Arg val Arg pro Arg val Arg Arg Glu Gln Leu rle Lys Glu Gly 1 5 10 15 Tyr phe Asp pro Ser Leu pro His Met Thr Tyr Arg val val Glu 20 25 30 rle val val Leu phe val Leu Ser phe Trp Leu Met Gly Gln Ser 35 40 45 Ser pro Leu Ala Leu Ala Leu Gly rle val val Ser Gly rle Ser 50 55 60 Gln Gly Arg Cys Gly Trp val Met His Glu Met Gly His Gly Ser 65 70 75 phe Thr Gly val rle Trp Leu Asp Asp Arg Leu Cys Glu phe phe 65 70 75 Tyr Gly val Gly Cys Gly Met Ser Gly His Tyr Trp Lys Asn Gln 80 85 90 His Ser Lys His His Ala Ala pro Asn Arg Leu Glu His Asp val 95 100 105 Asp Leu Asn Thr Leu pro Leu val Ala phe Asn Glu Arg val val 110 115 120 Arg Lys val Arg pro

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de control de la expresión funcional en una célula de una planta unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, siendo dicho polipéptido un polipéptido capaz de desaturar una molécula de ácido graso en los carbonos 6 y 7 enumerados desde el extremo carboxilo de dicho ácido graso, comprendiendo dicho polipéptido la secuencia de 457 aminoácidos representada en la SEC ID Nº: 2.
  2. 2.
    Construcción según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de control de la expresión es operativa en una célula de semilla.
  3. 3.
    Célula de planta recombinante, que comprende un polipéptido Δ6 desaturasa capaz de desaturar una molécula de ácido graso en los carbonos 6 y 7 enumerados desde el extremo carboxilo de dicho ácido graso, teniendo dicho polipéptido la secuencia de aminoácidos según la reivindicación 1.
  4. 4.
    Célula de planta recombinante según la reivindicación 3, en la que dicha célula de planta se selecciona del grupo que consiste en Brassica, soja, cártamo, maíz, lino y girasol.
  5. 5.
    Célula de planta recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, en la que dicha célula de planta es una célula de semilla.
  6. 6.
    Célula de planta recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en la que dicha célula de planta recombinante está enriquecida en un ácido graso o una forma conjugada del mismo, en la que dicho ácido graso se selecciona del grupo que consiste en 18:1, 18:2, 18:3 y 18:4.
  7. 7.
    Célula de planta recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 3-6, que comprende además una Δ5 desaturasa recombinante.
  8. 8.
    Célula de planta recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 3-7, que comprende además una Δ12 desaturasa recombinante.
  9. 9.
    Planta transgénica que comprende la célula de planta recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 3-8.
  10. 10.
    Procedimiento de producción de un aceite de planta o una fracción del mismo que comprende recuperar dicho aceite o fracción del mismo de la planta según la reivindicación 9 o la semilla de la misma.
  11. 11.
    Procedimiento según la reivindicación 10, que comprende además formular el aceite recuperado o la fracción del mismo en un producto seleccionado del grupo que consiste en:
    una composición farmacéutica que comprende dicho aceite o fracción del mismo y un portador farmacéuticamente aceptable; una fórmula nutricional; una fórmula para lactantes; un complemento dietético; un sustituto dietético; un cosmético; y un alimento para animales.
  12. 12.
    Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el producto se selecciona entre una fórmula nutricional, fórmula para lactantes, un complemento dietético y un sustituto dietético, y en el que el producto comprende además al menos un macronutriente seleccionado del grupo que consiste en aceite de coco, aceite de soja, aceite de canola, monoglicéridos y diglicéridos, glucosa, lactosa comestible, suero electrodializado, leche descremada electrodializada, suero de leche, proteína de la soja y otros hidrosilatos proteicos.
  13. 13.
    Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el producto comprende además: al menos una vitamina seleccionada del grupo que consiste en las vitaminas A, C, D, E y complejo B; y al menos un mineral seleccionado del grupo que consiste en calcio, magnesio, zinc, manganeso, sodio, potasio, fósforo, cobre, cloro, yodo, selenio y hierro.
  14. 14.
    Utilización de la planta según la reivindicación 9 para la producción de un ácido graso.
  15. 15.
    Utilización según la reivindicación 14 para la producción de un producto que comprende un ácido graso, siendo seleccionado dicho producto del grupo que consiste en:
    una composición farmacéutica que comprende dicho aceite o una fracción del mismo y un portador farmacéuticamente aceptable; una fórmula nutricional; una fórmula para lactantes; un complemento dietético; un sustituto dietético; un cosmético; y un alimento para animales.
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