ES2245030T3 - Procedimiento y composiciones para la sintesis de acidos grasos poliinsaturados. - Google Patents

Procedimiento y composiciones para la sintesis de acidos grasos poliinsaturados.

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Abstract

La presenta invención se refiere a composiciones y procedimientos para preparar cadenas largas de ácidos grasos poliinsaturados en plantas, partes de planta y células de planta, como son hojas, raíces, frutos y semillas. Las secuencias de ácido nucleico y construcciones que codifican ácidos grasos insaturados, que incluyen insaturados 5, insaturados 6 y insaturados 12, son usadas para generar plantas transgénicas, partes de plantas y células que contienen y expresan uno o más transgénicos que codifican uno o más insaturados. La expresión de los insaturados con específicos sustratos diferentes en el sistema de la planta permite la producción a gran escala de ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados como son el ácido docosahexaenoico, ácido eicosapentaenoico, ácido (al)-linoleico, ácido gamma-linoleico, ácido araquidónico y los similares para la modificación del perfil del ácido graso de plantas, partes de plantas y tejidos. La manipulación de los perfiles de ácidos graso permite la producción de cantidades comerciales de aceites y productos de plantas nuevas.

Description

Procedimientos y composiciones para la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga en plantas.
Referencia cruzada con la solicitud
Esta solicitud es una continuación en parte de la USSN 081834.655, presentada el 11 de Abril de 1997 y una continuación en parte de la USSN 08/833.610, presentada el 11 de Abril de 1997, USSN 08/834.033 presentada el 11 de Abril de 1997 y USSN 08/956.985 presentada el 24 de Octubre de 1997, cuyos contenidos se incluyen en el presente documento por referencia.
Introducción Campo de la invención
Esta invención se relaciona con niveles modulantes de enzimas y/o componentes de enzimas capaces de alterar la producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (PUFAs) en una planta hospedadora. La invención se ejemplifica mediante la producción de PUFAs en plantas.
Antecedentes
Dos familias principales de ácidos grasos poliinsaturados(PUFAs) son los ácidos grasos \omega3, ejemplificados por el ácido eicosapentaenoico. Los PUFA son componentes importantes de la membrana plasmática de la célula, en donde se pueden encontrar en formas tales como fosfolípidos. Los ácidos PUFA también sirven como precursores para otras moléculas de importancia en seres humanos y animales, incluyendo las prostaciclinas, leucotrienos y prostaglandinas. Los PUFA son necesarios para el desarrollo adecuado, particularmente en el desarrollo de cerebro del lactante, y para la formación y reparación de tejidos.
Cuatro grandes ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga de importancia incluyen el ácido docosahexaenoico (DHA) y el ácido eicosapentaenoico (EPA), los cuales principalmente se encuentran en diferentes tipos de aceite de pescado, el ácido gammalinolénico (GLA), el cual se encuentra en las semillas de varias plantas, incluyendo prímula (Oenothera biennis), borraja (Borago officinalis) y grosella negra (Ribes nigrum), y el ácido estearidónico (SDA), el cual se encuentra en aceites marinos y semillas de plantas. Tanto el GLA como otro PUFA de cadena larga importante, el ácido araquidónico (ARA), se encuentran en hongos filamentosos. El ARA se puede purificar a partir de tejidos animales que incluyen el hígado y la glándula adrenal.
Para el DHA, existen varias fuentes para la producción comercial que incluyen una variedad de organismos marinos, aceites obtenidos de peces de agua marina fría, y fracciones de yema de huevo. Se pueden usar para la producción comercial del ARA microorganismos que incluyen los géneros Mortierella, Entomophthora, Phytium y Porphyridium. Fuentes comerciales de ácido SDA incluyen los géneros Trichodesma y Echium. Fuentes comerciales de GLA incluyen prímula, grosella negra y borraja. Sin embargo, existen varias desventajas asociadas con la producción comercial de PUFAs a partir de fuentes naturales. Las fuentes naturales de los PUFA, tales como animales y plantas, tienden a tener composiciones grasas altamente heterogéneas. Los aceites obtenidos a partir de estas fuentes, por lo tanto, pueden requerir una purificación extensa para separar uno o más PUFAs deseados o para producir un aceite que esté enriquecido en uno o más PUFAs. Las fuentes naturales también se someten a fluctuaciones incontroladas en disponibilidad. Las existencias de peces pueden sufrir variación natural o se pueden agotar por sobrepesca. Los aceites de pescado tienen sabores y olores desagradables, los cuales pueden ser imposible separar económicamente, del producto deseado, y pueden volver estos productos inaceptables como complementos alimenticios. Los aceites animales, y particularmente los aceites de pescado, pueden acumular contaminantes ambientales. El clima y las enfermedades pueden causar fluctuación en los rendimientos tanto de las fuentes de peces como de plantas. La tierra de cultivo disponible para la producción de cultivos alternos productores de aceite se somete a competición por la expansión estacionaria de las poblaciones humanas y por la necesidad creciente asociada a la producción de alimentos en el resto de la tierra cultivable. Los cultivos que producen PUFAs, tales como la borraja, no se han adaptado al cultivo comercial y pueden no tener buen rendimiento en monocultivo. De esta manera, el crecimiento de estos cultivos no es económicamente competitivo cuando se pueden cultivar otros cultivos más rentables y mejor establecidos. La fermentación a gran escala de organismos tales como Mortierella también es cara. Los tejidos animales naturales contienen bajas cantidades de ARA y son difíciles de procesar. Microorganismos tales como Porphyridium y Mortierella son difíciles de cultivar a escala comercial.
Los componentes dietéticos y las formulaciones farmacéuticas que contienen PUFAs pueden retener las desventajas de la fuente de PUFA. Complementos tales como las cápsulas de aceite de pescado pueden contener bajos niveles del componente particular deseado y requerir así grandes dosis. Las altas dosis dan como resultado la ingestión de altos niveles de componentes no deseados, incluyendo contaminantes. Se debe tener cuidado al proporcionar complementos con ácidos grasos, ya que la sobreadición puede dar como resultado una supresión de rutas biosintéticas endógenas y conducir a la competición con otros ácidos grasos necesarios en varias fracciones lípidas in vivo, conduciendo a resultados indeseables. Por ejemplo, los esquimales que tienen una dieta alta en ácidos grasos \omega3 tienen una tendencia creciente a sangrar (Patente US Nº 4,874,603). Los sabores y olores desagradables de los complementos pueden hacer estos regímenes indeseables, y pueden inhibir la cooperación del paciente.
En la biosíntesis de los PUFAs están involucradas varias enzimas. El ácido linoleico (LA, 18:2 \Delta9, 12) se produce a partir de ácido oleico (18:1 \Delta9) mediante una \Delta12-desaturasa. GLA (18:3 \Delta6, 9, 12) se produce a partir de ácido linoleico (LA, 18:2 \Delta9, 12) mediante una \Delta6-desaturasa. La producción de ARA (20:4 \Delta5, 8, 11, 14) se produce a partir de DGLA (20:3 \Delta8, 11, 14) catalizada por una \Delta5-desaturasa. Sin embargo, los animales no pueden desaturar más allá de la posición \Delta9 y por lo tanto no pueden convertir el ácido oleico (18:1 \Delta9) en ácido linoleico (18:2 \Delta9, 12). De la misma manera, el ácido \alpha-linolénico (ALA, 18:3 \Delta9, 12, 15) no puede ser sintetizado por los mamíferos. Otros eucariotas, incluyendo hongos y plantas, tienen enzimas que desaturan en las posiciones \Delta21 y \Delta15. Los ácidos grasos poliinsaturados de mayor importancia en animales, por lo tanto, se derivan ya sea de la dieta y/o de la desaturación y alargamiento del ácido linoleico (18:2 \Delta9, 12) o del ácido \alpha-linolénico (18:3 \Delta9, 12, 15).
Los ácidos grasos poliinsaturados se consideran útiles para fines nutricionales, farmacéuticos, industriales, y otros. Un suministro expansivo de ácidos grasos poliinsaturados a partir de fuentes naturales y de síntesis química no es suficiente para las necesidades comerciales. Por lo tanto, es de interés obtener material genético involucrado en la biosíntesis de PUFAs a partir de especies que producen de manera natural estos ácidos grasos y expresar el material aislado solo o en combinación en un sistema heterólogo, el cual se pueda manipular para permitir la producción de cantidades comerciales de los PUFA.
La producción de ácido gama-linóleico mediante una \Delta6-desaturasa se describe en USPN 5,614,393. la producción de ácido 8, 11-eicosadienoico usando Mortierella alpina se describe en USPN 5,376,541. La producción de ácido docosahexaenoico mediante dinoflagelados se describe en USPN 5,407,957. La clonación de una \Delta6-desaturasa a partir de borraja se describe en la PCT WO 96/21022. La clonación de \Delta9-desaturasas se describe en las solicitudes de Patente publicadas PCT WO 91/13972, EP 0 550 162 A1, EP 0561 569 A2, EP 0 644 263 A2, y EP 0 736 598 A1, y en USPN 5,057,419. La clonación de \Delta12-desaturasas a partir de varios organismos se describe en la publicación de PCT WO 94/11516 y en USPN 5,443,974. La clonación de \Delta15-desaturasas a partir de varios organismos se describe en la publicación PCT WO 93/11245. Una desaturasa de proteína portadora \Delta6-palmitoil-acilo de Thumbergia alata y su expresión en E. Coli se describe en USPN 5,614,400. La expresión de una desaturasa estearilo-ACP de soja en embriones transgénicos de soja usando un promotor 35S se describe en USPN 5,443,974.
Descripción resumida de la invención
La presente invención se relaciona con nuevas composiciones y procedimientos para la preparación de ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados y desaturasas en plantas y en células de plantas. Los procedimientos implican cultivar una célula hospedadora de interés transformada con un cassette de expresión funcional en una célula vegetal hospedadora, comprendiendo el cassette de expresión una región reguladora de inicio de la transcripción y traducción, unida en el marco de lectura 5' a una secuencia de ADN que codifica un polipéptido desaturasa capaz de modular la producción de PUFAs. La expresión del polipéptido desaturasa proporciona una alteración en el perfil de PUFA de las células de la planta hospedadora como resultado de concentraciones alteradas de enzimas involucradas en la biosíntesis de PUFA. De particular interés es el control selectivo de la producción de PUFA en tejidos de plantas y/o partes de plantas tales como hojas, raíces, frutas y semillas. La invención se puede usar por ejemplo en la producción a gran escala de DHA, EPA, ARA y GLA y para la modificación del perfil de ácidos grasos de los tejidos y/o partes de plantas comestibles.
La presente invención proporciona, además, una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia funcional de control de la expresión en una célula de una planta unida, operativamente, a una secuencia de ácido nucleico codificante de un polipéptido, siendo dicho polipéptido capaz de desaturar una molécula de ácido graso en el carbono 5 del extremo carboxilo de dicho ácido graso, teniendo dicho polipéptido una secuencia aminoácidica que tiene al menos el 60%, preferiblemente al menos el 88%, y más preferiblemente al menos el 90% de homología respecto a la secuencia de 446 aminoácidos de JEC ID NO: 6. Preferiblemente, la secuencia de control de la expresión puede ser operativa en una célula de una semilla.
La invención proporciona además una célula recombinante de una planta que comprende una construcción de la invención. La célula vegetal se puede seleccionar del grupo que consiste en Brassica, soja, cártamo, maíz, lino y girasol. La célula vegetal puede estar enriquecida en un ácido graso seleccionado del grupo que consiste en 18:1, 18:2, 18:3 y 18:4.
La invención proporciona además una planta transgénica que puede comprender una célula vegetal de la invención.
Las fórmulas y suplementos producidos por los procedimientos de la invención, también, pueden comprender al menos un macronutriente seleccionado del grupo que consiste en aceite de coco, aceite de soja, aceite de canola, mono y diglicéridos, glucosa, lactosa comestible, suero electrodializado, leche descremada electrodializada, suero de leche, proteína de soja, y otros hidrolizados de proteína.
Las fórmulas de la presente invención pueden incluir además al menos una vitamina seleccionada del grupo que consiste en Vitaminas A, C, D, E, y complejo B; y al menos un mineral seleccionado del grupo consistente en calcio, magnesio, zinc, manganeso, sodio, potasio, fósforo, cobre, cloro, yodo, selenio y hierro.
La presente invención se puede utilizar, además, para fabricar composiciones cosméticas y farmacéuticas del material de la invención.
Los procedimientos de la presente invención se pueden utilizar para producir aceites transgénicos en portadores farmacéuticamente aceptables y complementos nutricionales, agentes cosméticos y formulaciones para bebés que contengan aceites transgénicos.
Los procedimientos de la presente invención pueden producir composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un nutriente seleccionado del grupo que consiste en una vitamina, un mineral, un carbohidrato, un azúcar, un aminoácido, un ácido graso libre, un fosfolípido, un antioxidante y un compuesto fenólico.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra posibles rutas para la síntesis de ácido araquidónico (20:4 \Delta5, 8, 11, 14) y ácido estearidónico (18:4 \Delta6, 9, 12, 15) a partir de ácido palmítico (C_{16}) a partir de una variedad de organismos, que incluyen algas, Mortierella y humanos. Estos PUFA pueden servir como precursores de otras moléculas importantes para humanos y otros animales, incluyendo prostaciclinas, leucotrienos, y prostaglandinas, algunas de las cuales se muestran.
La Figura 2 muestra posibles rutas para la producción de PUFAs además del ARA, que incluyen EPA y DHA, de nuevo compilado a partir de una variedad de organismos.
Las Figuras 3A-E muestran la secuencia de ADN (SEC ID NO:1) de la \Delta6-desaturasa de Mortierella alpina y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO:2).
La Figura 4 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de la \Delta6-desaturasa de Mortierella alpina con otras \Delta6-desaturasas y secuencias relacionadas (SEC ID NOS: 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13).
Las Figuras 5A-D muestran la secuencia de ADN (SEC ID NO:3) de la \Delta12-desaturasa de Mortierella alpina y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO:4).
La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO:14) del fragmento de PCR (ver Ejemplo 1).
Las Figuras 7A-D muestran la secuencia de ADN (SEC ID NO:5) de la \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina.
La Figura 8 muestra alineaciones de la secuencia proteica de la \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina (SEC ID NO:6) con \Delta6-desaturasas y secuencias relacionadas (SEC ID NOS: 15, 16, 17, 18).
La Figura 9 muestra alineaciones de la secuencia proteica de Ma 29 y contig 253538a.
La Figura 10 muestra alineaciones de la secuencia proteica de Ma 524 y contig 253538a.
Breve descripción de los listados de secuencias
SEC ID NO:1 muestra la secuencia de ADN de la \Delta6-desaturasa de Mortierella alpina.
SEC ID NO:2 muestra la secuencia de aminoácidos de la \Delta6-desaturasa Mortierella alpina.
SEC ID NO:3 muestra la secuencia de ADN de la \Delta12-desaturasa de Mortierella alpina.
SEC ID NO:4 muestra la secuencia de aminoácidos de la \Delta12-desaturasa de Mortierella alpina.
SEC ID NO:5 muestra la secuencia de ADN de la \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina.
SEC ID NO:6 muestra la secuencia de aminoácidos de la \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina.
SEC ID NO:7-SEC ID NO:13 muestran las secuencias de aminoácidos que se relacionan con \Delta6-desaturasa de Mortierella alpina.
SEC ID NO:14 muestra la secuencia de aminoácidos deducida de un fragmento de PCR del Ejemplo 1.
SEC ID NO:15-SEC ID NO:18 muestran las secuencias de aminoácidos que se relacionan con \Delta5- y \Delta6-desaturasas de Mortierella alpina.
SEC ID NO:19 y SEC ID NO:30 muestran secuencias de cebadores de PCR.
SEC ID NO:31-SEC ID NO:37 muestran secuencias de nucleótidos humanas.
SEC ID NO:38-SEC ID NO:44 muestra secuencias peptídicas.
\newpage
SEC ID NO:45 y SEC ID NO:46 muestran la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de una desaturasa de Dictyostelium discoideum.
SEC ID NO:47-SEC ID NO:50 muestran la secuencia de nucleótidos y aminoácidos deducidas de un clon de ADNc de Schizochytrium.
Descripción de las realizaciones preferidas
Con el fin de asegurar un entendimiento completo de la invención, se proporcionan las siguientes definiciones:
\Delta5-desaturasa: \Delta5-desaturasa es una enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 5 y 6 del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso.
\Delta6-desaturasa: \Delta6-desaturasa es una enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 6 y 7 del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso.
\Delta9-desaturasa: \Delta9-desaturasa es una enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 9 y 10 del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso.
\Delta12-desaturasa: \Delta12-desaturasa es una enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 12 y 13 del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso.
Ácidos Grasos: Los ácidos grasos son una clase de compuestos que contienen una cadena de hidrocarburos larga y un grupo carboxilato terminal. Los ácidos grasos incluyen los siguientes:
Ácido Graso
12:0 Ácido láurico
16:0 Ácido palmítico
16:1 Ácido palmitoleico
18:0 Ácido esteárico
18:1 Ácido oleico \Delta9-18:1
18:2 \Delta5, 9 Ácido taxoleico \Delta5,9-18:2
18:2 \Delta6, 9 Ácido 6,9-octadecadienoico \Delta6,9-18:2
18:2 Ácido linoleico \Delta9,12-18:2 (LA)
18:3 \Delta6, 9, 12 Ácido gamma-linoleico \Delta6,9,12-18:3 (GLA)
18:3 \Delta5, 9, 12 Ácido pinolénico \Delta5,9,12-18:3
18:3 Ácido alfa-linolénico \Delta9,12, 15-18:3 (ALA)
18:4 Ácido estearidónico \Delta6,9,12,15-18:4 (SDA)
20:0 Ácido araquídico
20:1 Ácido eicoscénico
22:0 Ácido behéhico
22:1 Ácido erúcico
22:2 Ácido docasadienoico
20:4 \omega6 Ácido araquidónico \Delta5,8,11,14-20:4 (ARA)
20:3 \omega6 \omega6-eicosatrienoico dihomo-gamma-linolénico \Delta8,11,14-20:3 (DGLA)
(Continuación)
20:5 \omega3 Eicosapentaenoico (ácido timnodónico) \Delta5,8,11,14,17-20:5 (EPA)
20:3 \omega3 \omega3-eicosatrienoico \Delta11,16,17-20:3
20:4 \omega3 \omega3-eicosatrienoico \Delta8,11,14,17-20:4
22:5 \omega3 Docosapentaenoico \Delta7,10,13,16,19-22:5 (\omega3DPA)
22:6 \omega3 Docosahexaenoico (ácido cervónico) \Delta4,7,10,13,16,19-22:6 (DHA)
24:0 Ácido lignocérico
Teniendo en cuenta estas definiciones, los procedimientos de la presente invención pueden proporcionar nuevas secuencias de ADN construcciones de ADN, procedimientos y composiciones que permitan la modificación del contenido de ácido graso de cadena larga poliinsaturado de células de plantas. Las células de plantas se transforman con un cassette de expresión que comprende un ADN que codifica un polipéptido capaz de aumentar la cantidad de uno o más PUFA en una célula vegetal. Deseablemente, las construcciones de integración se pueden preparar para que proporcionen la integración del cassette de expresión en el genoma de una célula hospedadora. Las células hospedadoras se manipulan para expresar un ADN sentido o antisentido que codifica un polipéptido(s) que tiene actividad desaturasa. Por "desaturasa" se entiende un polipéptido que puede desaturar uno o más ácidos grasos para producir ácido graso mono- o poliinsaturado o un precursor del mismo de interés. Por "polipéptido" se entiende cualquier cadena de aminoácidos, independientemente de la longitud o modificación post-traduccional, por ejemplo, glicosilación o fosforilación. El(los) sustrato(s) para la enzima expresada pueden ser producidos por la célula hospedadora o se pueden suministrar exógenamente.
Para lograr la expresión en una célula hospedadora, el ADN transformado se asocia operativamente a regiones reguladoras de iniciación de la transcripción y traducción que son funcionales en la célula hospedadora. Las construcciones que comprenden el gen a ser expresado pueden proporcionar la integración en el genoma de la célula hospedadora o pueden replicarse autónomamente en la célula hospedadora. Para la producción de ARA, los cassettes de expresión generalmente usados proporcionan actividad \Delta12-desaturasa, particularmente en una célula hospedadora que produce o que puede recoger DGLA. La producción de ácidos grasos insaturados tipo \omega6, tales como ARA, se favorece en una planta capaz de producir ALA inhibiendo la actividad de una desaturasa \Delta15 o tipo \omega3; esto se lleva a cabo proporcionando un cassette de expresión para una transcripción \Delta15 o \omega3 antisentido, o interrumpiendo un gen \Delta15 o \omega3-desaturasa.
Producción de ácidos grasos en planta transgénica
La producción de PUFAs en plantas transgénicas ofrece varias ventajas sobre la purificación de fuentes naturales tales como peces o plantas. La producción de ácidos grasos procedentes de plantas recombinantes proporciona la capacidad de alterar el perfil de ácidos grasos que se presentan naturalmente en la planta proporcionando nuevas rutas sintéticas en el hospedador o suprimiendo rutas no deseadas, aumentando de esta manera los niveles de PUFAs deseados, o formas conjugadas de los mismos, y disminuyendo los niveles de PUFAs no deseados. La producción de ácidos grasos en plantas transgénicas también ofrece la ventaja de que la expresión de genes desaturasa en tejidos y/o partes particulares de plantas significa que se pueden lograr niveles muy aumentados de los PUFAs, haciendo la recuperación a partir de estos tejidos más económica. Por ejemplo, los PUFAs deseados se pueden expresar en semilla; procedimientos de aislamiento de los aceites de semilla están bien establecidos. Además, proporcionando una fuente para la purificación de los PUFAs deseados del aceite de semilla se pueden manipular a través de la expresión de genes desaturasa, ya sea solos o en combinación con otros genes tales como elongasas, para proporcionar aceites de semillas que tienen un perfil de PUFAs en forma concentrada. Los aceites de semilla concentrados se pueden añadir a leches animales y/o a leches sintéticas o semisintéticas para servir como fórmulas para lactantes cuando es imposible el amamantamiento humano o no deseado, o en casos de desnutrición o enfermedad tanto de niños como de
adultos.
Son interesantes para la producción de PUFAs varios polipéptidos, en particular desaturasas, incluyendo los polipéptidos que catalizan la conversión del ácido esteárico a ácido oleico, LA a GLA, de ALA a SDA, de ácido oleico a LA, o de LA a ALA, que incluye enzimas que desaturan en las posiciones \Delta6, \Delta9, \Delta12, \Delta15, o \omega3 dependiendo de la célula hospedadora, la disponibilidad de sustrato, y el(los) producto(s) final(es) deseado(s). Las consideraciones para elegir un polipéptido específico que tenga actividad desaturasa incluyen el pH óptimo del polipéptido, ya sea que el polipéptido es una enzima que limita la velocidad o un componente de la misma, o si la desaturasa usada es esencial para la síntesis de un ácido graso poliinsaturado deseado, y/o cofactores requeridos por el polipéptido. El polipéptido expresado, preferiblemente, tiene parámetros compatibles con el ambiente bioquímico de su ubicación en la célula hospedadora. Por ejemplo, el polipéptido puede tener que competir por el sustrato con otras enzimas en la célula hospedadora. Por lo tanto, se consideran los análisis de K_{m}. y la actividad específica del polipéptido en cuestión para determinar la conveniencia de un polipéptido dado para modificar la producción de PUFAs en una determinada célula hospedadora. El polipéptido usado en una situación particular es el que pueda funcionar en las condiciones presentes en la célula hospedadora pretendida, pero, de otra manera, puede ser cualquier polipéptido que tenga actividad desaturasa la cual tenga la característica deseada de ser capaz de modificar la producción relativa de un PUFA deseado. Un esquema para la síntesis del ácido araquidónico (20:4 \Delta5, 8, 11, 14) a partir de ácido palmítico (C_{16}) se muestra en la Figura 1. Una enzima clave en esta ruta es la \Delta5-desaturasa que convierte el ácido DH-\gamma-linolénico (DGLA, ácido eicosatrienoico) en ARA. También se muestra la conversión de ácido \alpha-linolénico (ALA) mediante una \Delta6-desaturasa. La producción de PUFAs, además de ácido araquidónico, incluyendo EPA y DHA se muestra en la Figura 2. Una enzima clave en la síntesis del ácido araquidónico (20:4 \Delta5, 8, 11, 14) a partir de ácido esteárico (C_{18}) es la \Delta6-desaturasa que convierte el ácido linolénico en ácido \gamma-linolénico. También se muestra la conversión de ácido \alpha-linolénico (ALA) en ácido estearidónico mediante una \Delta6-desaturasa. Para la producción de ARA, la secuencia de ADN usada codifica un polipéptido que tiene actividad \Delta5-desaturasa. En casos particulares, esta se puede acoplar a un cassette de expresión que proporciona la producción de un polipéptido que tiene actividad \Delta6-desaturasa y, opcionalmente, un cassette de transcripción para la producción de secuencias antisentido a un producto de transcripción de \Delta15. La elección de la combinación de cassettes usadas depende, en parte, del perfil del PUFA de la célula hospedadora. Cuando la actividad \Delta5-desaturasa de la célula hospedadora es limitante, la sobreexpresión de \Delta5-desaturasa sola, será generalmente suficiente para conseguir la producción de ácido araquidónico aumentada.
Fuentes de polipéptidos que tienen actividad desaturasa
Como fuentes de polipéptidos que tengan actividad desaturasa y oligonucleótidos que codifiquen tales polipéptidos son organismos que producen un ácido graso poliinsaturado deseado. Como ejemplo, los microorganismos que tienen capacidad para producir ARA se pueden usar como una fuente de actividad \Delta5-desaturasa. Dichos microorganismos incluyen, por ejemplo, a los que pertenecen a los géneros Mortierella Conidiobolus, Phytium, Phytophathora, Penicillium, Porphyridium, Coidosporium, Mucor, Fusarium, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula y Entomophthora. Dentro del género Porphyridium, es de particular interés Porphyridium cruentum. Dentro del género Mortierella son de particular interés Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila, Mortierella ramanniana, var. Angulispora, y Mortierella alpina. Dentro del género Mucor son de particular interés Mucor circinelloides y Mucor javanicus.
Los ADN que codifican las desaturasas deseadas se pueden identificar de varias maneras. Como ejemplo, una fuente de la desaturasa deseada, por ejemplo bibliotecas genómicas o de ADNc procedentes de Mortierella, se seleccionan con sondas detectables enzimáticamente o químicamente sintetizadas, que se pueden preparar de ADN, ARN, o nucleótidos que no se encuentran de manera natural o mezclas de los mismos. Las sondas se pueden sintetizar enzimáticamente a partir de ADN de desaturasas conocidas por métodos de hibridación normales o de rigor reducido. Las sondas de oligonucléotidos también se pueden usar para analizar fuentes y se pueden basar en secuencias de desaturasas conocidas, incluyendo las secuencias conservadas entre desaturasas conocidas, o en secuencias de péptidos obtenidas a partir de la proteína purificada deseada. Las sondas de oligonucléotidos basadas en secuencias de aminoácidos se pueden degenerar para abarcar la degeneración del código genético, o pueden inclinarse a favor de los codones preferidos del organismo fuente. También se pueden usar los oligonucléotidos como cebadores para la PCR a partir de ARN_{m} transcrito inverso procedente de una fuente conocida o sospechosa; el producto de PCR puede ser ADNc de longitud completa o se puede usar para generar una sonda para obtener el ADNc de longitud completa deseado. De manera alternativa, se puede secuenciar completamente una proteína deseada y se puede llevar a cabo la síntesis total del ADN que codifica ese polipéptido.
Una vez se ha aislado el ADNc o genómico deseado se puede secuenciar por procedimientos conocidos. Se reconoce en la técnica que dichos procedimientos están sujetos a errores, tales como el secuenciamiento múltiple de la misma región como rutina y se espera todavía conducir a regímenes medibles de errores en la secuencia deducida resultante, particularmente en regiones que tienen dominios repetidos, estructura secundaria extensa, o composiciones de bases inusuales, tales como regiones con alto contenido de bases GC. Cuando surgen discrepancias, se puede hacer el resecuenciamiento y se pueden emplear procedimientos especiales. Los procedimientos especiales pueden incluir alteración de condiciones de secuenciación usando: diferentes temperaturas; diferentes enzimas; proteínas que alteran la capacidad de los oligonucléotidos para formar estructuras de orden superior; nucleótidos alterados tales como ITP o Dgtp metilado; diferentes composiciones de gel, por ejemplo formamida añadida; diferentes cebadores o cebadores localizados a diferentes distancias de la región problema; o diferentes patrones tales como ADN de una sola cadena. También se puede emplear el secuenciamiento de ARN_{m}.
Para la mayor parte, alguna o toda la secuencia de codificación del polipéptido que tiene actividad desaturasa procede de una fuente natural. En algunas situaciones, sin embargo, es deseable modificar toda o una parte de los codones, por ejemplo, para aumentar la expresión, empleando los codones preferidos hospedadores. Los codones preferidos hospedadores se pueden determinar a partir de los codones de mayor frecuencia en las proteínas expresadas en la cantidad más grande en una especie hospedadora particular de interés. De esta manera, se puede sintetizar en todo o en parte, la secuencia de codificación para un polipéptido. Todo o porciones del ADN también se pueden sintetizar para eliminar cualquiera de las secuencias desestabilizantes o regiones de estructura secundaria que estarían presentes en el ARN_{m} transcrito. Todo o porciones del ADN también se pueden sintetizar para alterar la composición de la base a una más preferible en la célula hospedadora deseada. Los procedimientos para sintetizar secuencias y poner las secuencias juntas están muy bien establecidos en la literatura. Se pueden emplear la mutagénesis y la selección in vitro, la mutagénesis dirigida a lugar, u otros elementos para obtener mutaciones de genes desaturasa que se presenten de manera natural para producir un polipéptido que tenga actividad desaturasa in vivo con más parámetros físicos y cinéticos más deseables para funcionar en la célula hospedadora, tales como la vida media más larga o una velocidad mayor de producción de un ácido graso poliinsaturado deseado.
Los ADNc deseables tienen menos del 60% de composición A+T, preferiblemente menos del 50% de composición A+T. En una escala localizada de ventana de deslizamiento de 20 pares de bases, es preferible que no haya regiones localizadas de ADNc con más del 75% de composición A+T; con una ventana de 60 pares de bases, es preferible que no haya regiones localizadas con ADNc mayor del 60%, más preferiblemente ninguna región localizada con más del 55% de composición A+T.
Desaturasas de Mortierella alpina
De particular interés es la \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina. La \Delta5-desaturasa tiene 446 aminoácidos; la secuencia de aminoácidos se muestra en la Figura 7. El gen que codifica la \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina se puede expresar en microorganismos transgénicos para efectuar mayor síntesis de ARA a partir de DGLA. También se pueden usar otros ADN que son sustancialmente idénticos en secuencia al ADN de \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina, o que codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos en secuencia al polipéptido de \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina.
Por sustancialmente idéntica en secuencia se entiende una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácidos nucleicos que exhibe en orden de preferencia creciente al menos el 60%, 80%, 90% o 95% de homología con la secuencia de aminoácidos de \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina o secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos. Para polipéptidos, la longitud de las secuencias de comparación es, generalmente, de al menos 16 aminoácidos, preferiblemente al menos 20 aminoácidos, o más preferiblemente 35 aminoácidos. Para ácidos nucleicos, la longitud de las secuencias de comparación generalmente es de al menos 50 nucleótidos, preferiblemente al menos 60 nucleótidos, y más preferiblemente al menos 75 nucleótidos, y más preferiblemente 110 nucleótidos. La homología típicamente se mide utilizando un software de análisis de secuencia, por ejemplo, el paquete de software de análisis de secuencia de Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wisconsin 53715), y MacVector (Oxford Molecular Group, 2105 S. Bascom Avenue, Suite 200, Campbell, California 95008). Dicho software compara secuencias similares asignando grados de homología con varias sustituciones, deleciones, y otras modificaciones. Las sustituciones conservativas incluyen, típicamente, sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Las sustituciones también se pueden hacer en base a la hidrofobicidad o hidrofilicidad conservada (Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982), o con base a la capacidad para asumir una estructura secundaria de polipéptido similar (Chou y Fasman, Adv. Enzymol. 47:45-148, 1978).
Otras desaturasas
Incluidas en la presente invención están las desaturasas relacionadas del mismo o de otros organismos. Estas desaturasas relacionadas incluyen variantes de las \Delta5-desaturasas descritas que se encuentran de manera natural dentro de la misma o de diferentes especies de Mortierella así como homólogos de la \Delta5-desaturasa descrita a partir de otras especies y de proteínas relacionadas evolutivamente que tienen actividad desaturasa. También se incluyen desaturasas las cuales, aunque no son sustancialmente idénticas a la \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina, desaturan una molécula de ácido graso en el carbono 5, 6 o 12, respectivamente, del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso. Las desaturasas relacionadas se pueden identificar por su capacidad para funcionar sustancialmente igual que las desaturasas descritas; esto es, todavía son capaces de convertir de manera efectiva DGLA en ARA, LA en GLA, ALA en SDA o ácido oleico en LA. Las desaturasas relacionadas también se pueden identificar analizando bases de datos de secuencias para determinar secuencias homólogas a la desaturasa descrita, mediante la hibridación de una sonda basada en la desaturasa descrita en una biblioteca construida a partir del organismo fuente, o mediante RT-PCR usando ARN_{m} del organismo fuente y cebadores basados en la desaturasa descrita. Estas desaturasas incluyen las de humanos, Dictyostelium discoideum y Phaeodactylum tricornum.
Las regiones de un polipéptido desaturasa, importantes para la actividad desaturasa se pueden determinar a través de mutagénesis de rutina, expresión de los polipéptidos mutantes resultantes y determinación de sus actividades. Los mutantes pueden incluir supresiones, inserciones y mutaciones puntuales, o combinaciones de las mismas. Un análisis funcional típico comienza con la mutagénesis de supresión para determinar los límites terminales de N y C de la proteína necesaria para la función, y luego supresiones internas, inserciones o mutantes puntuales se hacen para determinar, además, las regiones necesarias para la función. También se pueden usar otras técnicas tales como mutagénesis de cassette o síntesis total. La mutagénesis de supresión se lleva a cabo, por ejemplo, usando exonucleasas para eliminar secuencialmente las regiones de codificación 5' o 3'. Existen kits disponibles para estas técnicas. Después de la supresión, la región de codificación se completa ligando oligonucléotidos que contienen codones de inicio o de parada con la región de codificación suprimida después de la supresión 5' o 3', respectivamente. De manera alternativa, los oligonucléotidos que codifican codones de inicio o de parada se insertan en la región de codificación mediante una variedad de procedimientos que incluyen mutagénesis dirigida al sitio, PCR o mediante ligación sobre el ADN digerido en sitios de restricción existentes. Las supresiones internas se pueden hacer, de manera similar, a través de una variedad de procedimientos que incluyen el uso de sitios de restricción existentes en el ADN, mediante el uso de cebadores mutagénicos vía mutagénesis dirigida al sitio o PCR mutagénica. Las inserciones se realizan a través de procedimientos tales como mutagénesis de rastreo-enlazador, mutagénesis dirigida al sitio o PCR mutagénica. Las mutaciones puntuales se hacen a través de técnicas tales como mutagénesis dirigida al sitio o PCR mutagénica.
La mutagénesis química también se puede usar para identificar regiones de un polipéptido desaturasa importantes para su actividad. Se expresa una construcción mutada, y se prueba la capacidad de la proteína alterada resultante para funcionar como una desaturasa. Dicho análisis de estructura-función puede determinar qué regiones se pueden suprimir, qué regiones toleran inserciones, y qué mutaciones puntuales permiten que la proteína mutante funcione sustancialmente de la misma manera que la desaturasa nativa. Todas las proteínas mutantes y secuencias de nucleótidos que los codifican están dentro del alcance de la presente invención.
Expresión de genes desaturasa
Una vez se ha obtenido el ADN que codifica un polipéptido desaturasa, se coloca en un vector capaz de replicación en una célula hospedadora, o se propaga in vitro por medio de técnicas tales como PCR o PCR larga. Los vectores replicantes pueden incluir plásmidos, fagos, virus, cósmidos y similares. Los vectores deseables incluyen aquellos útiles para mutagénesis del gen de interés o para la expresión del gen de interés en las células hospedadoras. La técnica de PCR larga ha hecho posible la propagación in vitro de construcciones grandes, de manera que las modificaciones del gen de interés, tales como la mutagénesis o adición de señales de expresión, y la propagación de las construcciones resultantes se puede presentar enteramente in vitro sin el uso de un vector de replicación o en una célula hospeda-
dora.
Para la expresión de un polipéptido desaturasa, las regiones de iniciación y finalización funcionales de la transcripción y traducción funcional están operativamente unidas al ADN que codifica el polipéptido desaturasa. Las regiones de iniciación y finalización de la transcripción y traducción se derivan de una variedad de fuentes no exclusivas, incluyendo el ADN que se va a expresar, genes conocidos o sospechosos que son capaces de expresarse en el sistema deseado, vectores de expresión, síntesis química, o de un lugar endógeno en una célula hospedadora. La expresión en un tejido vegetal y/o parte de planta presenta ciertas eficiencias, particularmente cuando el tejido o la parte es uno que se cosecha fácilmente tal como semilla, hojas, frutos, flores, raíces, etc. La expresión se puede dirigir a la localización dentro de la planta usando secuencias reguladoras específicas, tales como las de USPN 5,943,674, USPN 4,943,674, USPN 5,106,739, USPN 5,175,095, USPN 5,420,034, USPN 5,188,958, Y USPN 5,589,379. Alternativamente, la proteína expresada puede ser una enzima que produce un producto el cual se puede incorporar, ya se de manera directa o después de modificaciones adicionales, en una fracción de fluido de la planta hospedadora. En el presente caso, la expresión de genes desaturasa, o transcritos desaturasa antisentido pueden alterar los niveles de PUFAs específicos, o derivados de los mismos, encontrados en partes de plantas y/o tejidos vegetales. La región de codificación del polipéptido \Delta5-desaturasa se expresa ya sea por sí misma o con otros genes, con el fin de producir partes de tejidos y/o plantas que contienen proporciones más altas de PUFA deseados o en los cuales la composición de PUFA se parecen más estrechamente a la leche materna humana (Prieto et al., TCP publicación WO 95/24494). La región de terminación se puede derivar de la región 3' del gen a partir del cual se obtuvo la región de iniciación o de un gen diferente. Se conoce un gran número de regiones de terminación y se ha encontrado que son satisfactorias en una variedad de hospedadores del mismo y de diferentes géneros y especies. La región de terminación usualmente se selecciona más como asunto de conveniencia que como cualquier propiedad particular.
La elección de una célula hospedadora está influenciada en parte por el perfil de PUFA deseado de la célula transgénica, y el perfil original de la célula hospedadora.
La expresión en una célula hospedadora se puede llevar a cabo de una manera transitoria o estable. La expresión transitoria puede suceder a partir de construcciones introducidas que contienen señales de expresión funcionales en la célula hospedadora, pero dichas construcciones no se replican y raramente se integran en la célula hospedadora, o en donde la célula huésped no prolifera. La expresión transitoria también se puede llevar a cabo induciendo la actividad de un promotor regulable unido operativamente al gen de interés, aunque estos sistemas inducibles frecuentemente exhiben un nivel basal bajo de expresión. La expresión estable se puede lograr mediante la introducción de una construcción que puede integrarse en el genoma del hospedador o que se replica autónomamente en la célula hospedadora. La expresión estable del gen de interés se puede seleccionar a través del uso de un marcador seleccionable localizado o transfectado con la construcción de expresión, seguido de la selección de células que expresan el marcador. Cuando la expresión es resultado de la integración, puede suceder la integración de construcciones aleatoriamente dentro del genoma hospedador o se puede dirigir a través del uso de construcciones que contienen regiones de homología con el genoma hospedador suficientes para dirigir la recombinación con el lugar hospedador. Cuando se dirigen las construcciones a un lugar endógeno, el lugar endógeno puede proporcionar todas o algunas de las regiones reguladoras de transcripción y de traducción.
Cuando se desea una expresión aumentada del polipéptido desaturasa en el organismo fuente, se pueden emplear varios procedimientos. Los genes adicionales que codifican el polipéptido desaturasa se pueden introducir en el organismo hospedador. La expresión del lugar de desaturasa nativa también se puede aumentar a través de la recombinación homóloga, por ejemplo insertando un promotor más fuerte en el genoma hospedador para causar una expresión aumentada, eliminando secuencias desestabilizantes ya sea del ARN_{m} o de la proteína codificada suprimiendo esa información del genoma hospedador, o añadiendo secuencias estabilizantes al ARN_{m} (véase USPN 4,910,141, y USPN 5,500,365).
Cuando se desea expresar más de un gen diferente, regiones reguladoras adecuadas y procedimientos de expresión, se pueden propagar genes introducidos en la célula hospedadora a través del uso de vectores de replicación o mediante la integración en el genoma hospedador. Cuando se expresan dos o más genes de vectores de replicación separados, es deseable que cada vector tenga un medio diferente de réplica. Cada construcción introducida, ya sea integrada o no, deberá tener un medio diferente de selección y deberá carecer de homología con las otras construcciones para mantener estable la expresión y evitar la reclasificación de elementos entre las construcciones. Se pueden determinar experimentalmente elecciones juiciosas de regiones reguladoras, medios de selección y procedimiento de propagación de la construcción introducida, de manera que todos los genes introducidos se expresen en los niveles necesarios para proporcionar la síntesis de los productos deseados.
Las construcciones que comprenden el gen de interés se pueden introducir en una célula hospedadora mediante técnicas estándar. Estas técnicas incluyen transfección, infección, impacto bolístico, electroporación, microinyección, raspado, o cualquier otro procedimiento que introduzca el gen de interés en la célula hospedadora (ver USPN 4,743,548, USPN 4,795,855, USPN 5,068,193, USPN 5,188,958, USPN 5,463,174, USPN 5,565,346 y USPN 5,565,347). Por conveniencia, una célula hospedadora que ha sido manipulada mediante cualquier procedimiento para recoger una secuencia de ADN o una construcción será referida como "transformada" o "recombinante". El hospedador sujeto tendrá al menos una copia de la construcción de expresión y puede tener dos o más, dependiendo de si el gen se integra en el genoma, se amplifica, o está presente en un elemento extracromosomal que tiene múltiples números de copias.
La célula hospedadora se puede identificar por selección con un marcador contenido en la construcción introducida. Alternativamente, se puede introducir una construcción marcador separada con la construcción deseada ya que muchas técnicas de transformación introducen muchas moléculas de ADN en células hospedadoras. Típicamente, los hospedadores transformados se seleccionan por su capacidad para crecer en medios selectivos. Los medios selectivos pueden incorporar un antibiótico o carecer de un factor necesario para el crecimiento del hospedador no transformado, tal como un nutriente o factor de crecimiento. Un gen marcador introducido puede, por lo tanto, conferir resistencia a antibiótico, o codificar un factor de crecimiento o enzima esencial y permitir el crecimiento en medios selectivos cuando se expresan en el hospedador transformado. Deseablemente, son de interés la resistencia a kanamicina y el aminoglicósido G418 (ver la USP No. 5,034,322). También puede ocurrir la selección de un hospedador transformado cuando la proteína marcadora expresada se puede detectar, ya sea directamente o indirectamente. La proteína marcadora se puede expresar sola o como una fusión a otra proteína. La proteína marcadora también se puede detectar por su actividad enzimática; por ejemplo la \beta galactosidasa puede convertir el sustrato X-gal en un producto coloreado, y la luciferaza puede convertir la luciferina en un producto que emite luz. La proteína marcadora se puede detectar por sus características de producir luz o modificar luz; por ejemplo, la proteína verde fluorescente de Aequorea victoria fluoresce cuando se ilumina con luz azul. Se pueden usar anticuerpos para detectar la proteína marcadora o una etiqueta molecular en, por ejemplo, una proteína de interés. Las células que expresan la proteína marcadora o la etiqueta se pueden seleccionar, por ejemplo, visualmente, o por técnicas tales como FACS o lavado usando anticuerpos.
Los PUFAs se pueden encontrar en el tejido vegetal y/o parte de planta hospedadora como ácidos grasos libres o en formas conjugadas tales como acilgliceroles, fosfolípidos, sulfolípidos o glicolípidos, y se pueden extraer de la célula hospedadora a través de una variedad de medios muy conocidos en la técnica. Estos medios pueden incluir extracción con disolventes orgánicos, sonicación, extracción de fluido supercrítico usando por ejemplo dióxido de carbono, y medios físicos tales como prensas, o combinaciones de los mismos. Es de interés particular la extracción con hexano o metanol y cloroformo. Cuando se desee, la capa acuosa se puede acidificar para protonar las fracciones cargadas negativamente y mediante esto aumentar la partición de los productos deseados en la capa orgánica. Después de la extracción, los disolventes orgánicos se pueden extraer mediante evaporación bajo una corriente de nitrógeno. Cuando se aisla en formas conjugadas, los productos se pueden escindir enzimáticamente o químicamente para liberar el ácido graso libre o un conjugado menos complejo de interés, y a continuación se someten a otras manipulaciones para producir un producto final deseado. Deseablemente se escinden formas conjugadas de ácidos grasos con hidróxido de potasio.
Purificación de ácidos grasos
Si es necesaria mayor purificación, se pueden emplear procedimientos estándares. Estos procedimientos pueden incluir extracción, tratamiento con urea, cristalización fraccionada, HPLC, destilación fraccionada, cromatografía en gel de sílice, centrifugación o destilación de alta velocidad, o combinaciones de estas técnicas. La protección de grupos reactivos, tales como grupos ácidos o alquenilos, se puede realizar en cualquier paso a través de técnicas conocidas, por ejemplo alquilación o yodación. Los procedimientos usados incluyen la metilación de los ácidos grasos para producir ésteres metílicos. De manera similar, se pueden eliminar los grupos de protección en cualquier paso. Deseablemente, se puede llevar a cabo la purificación de fracciones que contienen ARA, DHA y EPA mediante tratamiento con urea y/o destilación fraccionada.
Usos de los ácidos grasos
Son varios los usos de los ácidos grasos producidos por el objeto de la presente invención. Se pueden encontrar sondas basadas en los ADN de la presente invención en procedimientos para aislar moléculas relacionadas o en procedimientos para detectar organismos que expresen desaturasas. Cuando se usan como sondas, los ADN o los oligonucléotidos deben ser detectables. Esto usualmente se lleva a cabo uniendo una etiqueta ya sea en un sitio interno, por ejemplo mediante la incorporación de un residuo modificado, o en el término 5' o 3'. Estas etiquetas pueden ser directamente detectables, pueden unirse a una molécula secundaria que se etiquete detectablemente, o pueden unirse a una molécula secundaria no etiquetada y a una molécula terciaria detectablemente etiquetada; este proceso se puede extender en tanto sea práctico para lograr una señal satisfactoriamente detectable sin niveles inaceptables de señal de fondo. Los sistemas secundarios, terciarios o de puente pueden incluir el uso de anticuerpos dirigidos contra cualquier otra molécula, incluyendo etiquetas u otros anticuerpos, o pueden involucrar moléculas que estén unidas entre sí, por ejemplo un sistema de biotina-estreptavidina/avidina. Las etiquetas detectables típicamente incluyen isótopos radioactivos, moléculas que producen químicamente o enzimáticamente o alteran la luz, enzimas que producen productos de reacción detectables, moléculas magnéticas, moléculas fluorescentes o moléculas cuya fluorescencia o características emisoras de luz cambian después de la unión. Ejemplos de procedimientos de etiquetamiento se pueden encontrar en USPN 5,011,770. De manera alternativa, la unión de moléculas objetivo se puede detectar directamente midiendo el cambio en calor de la solución en la unión de una sonda al objeto mediante calorimetría de titulación isotérmica, o recubriendo la sonda o el objetivo en una superficie y detectando el cambio en dispersión de luz de la superficie producida por unir un objetivo o sonda, respectivamente, como se puede hacer con el sistema BIAcore.
Los PUFA producidos mediante recombinación encuentran aplicaciones en una gran variedad de áreas. La complementación de humanos o animales con PUFAs en varias formas puede dar como resultado niveles crecientes no solo de los PUFAs añadidos, sino también en su progenie metabólica. Por ejemplo, cuando la ruta \Delta6-desaturasa inherente no funciona en un individuo, el tratamiento con GLA puede no dar únicamente como resultado un aumento de los niveles de GLA, sino también de los productos corriente abajo del GLA tales como prostaglandinas (véase la Figura 1). Los complejos mecanismos reguladores pueden hacer deseable combinar varios PUFAs, o añadir diferentes conjugados de PUFAs, con el fin de evitar, controlar o superar estos mecanismos para lograr los niveles deseados de PUFAs específicos en un individuo.
Los PUFAs, o derivados de los mismos, hechos por el procedimiento descrito se pueden usar como complementos dietéticos, particularmente en fórmulas para lactantes, para pacientes que sufren alimentación intravenosa o para evitar o tratar la desnutrición. Ácidos grasos particulares como el EPA se utilizan para alterar la composición de las fórmulas para lactantes, para replicar mejor la composición en PUFAs de la leche humana. El triglicérido predominante en la leche human se ha indicado que es el 1,3-di-oleoilo-2-palmitoilo, con 2-palmitoiloglicéridos indicados absorbente mejor que el 2-oleoilo o el 2-lineoiloglicéridos (USPN 4,876,107). Típicamente, la leche materna humana tiene un perfil de ácidos grasos que comprende desde aproximadamente 0,15% a aproximadamente 0,36% como DHA, desde aproximadamente 0,03% a aproximadamente 0,13% como EPA, desde aproximadamente 0,30% hasta aproximadamente 0,88% como ARA, desde aproximadamente 0,22% hasta aproximadamente 0,67% como ácido DGLA, y desde aproximadamente 0,27% hasta aproximadamente 1,04% como ácido GLA. Una proporción preferida de GLA: DGLA: ARA en fórmulas para lactantes es de aproximadamente 1:1:4 a 1:1:1, respectivamente. Las cantidades de aceites que proporcionan estas proporciones de PUFAs se pueden determinar sin indebida experimentación por parte de los expertos en la materia. Los PUFAs o las células hospedadoras que los contienen, también se pueden usar como complementos alimenticios para animales para alterar un tejido animal o composición de ácidos grasos en la leche a uno más deseable para el consumo humano o animal.
Composiciones nutricionales
La presente invención también incluye composiciones nutricionales. Estas composiciones, para propósitos de la presente invención, incluyen cualquier alimento o preparación para consumo humano, incluyendo el consumo enteral o parenteral, el cual cuando se toma en el cuerpo (a) sirve para nutrir o construir tejidos o suministrar energía y/o (b) mantener, restaurar o soportar el estado nutricional adecuado o la función metabólica.
La composición nutricional de la presente invención comprende al menos un aceite o ácido producido de acuerdo con la presente invención y puede estar ya sea en forma sólida o líquida. Adicionalmente, la composición puede incluir macronutrientes comestibles, vitaminas y minerales en cantidades deseadas para un uso particular. La cantidad de estos ingredientes variará dependiendo de si la composición se pretende para uso en lactantes, niños o adultos normales sanos que tengan necesidades especializadas tales como las que acompañan a ciertas condiciones metabólicas (por ejemplo, desórdenes metabólicos).
Los ejemplos de macronutrientes que se pueden añadir a la composición incluyen pero no se limitan a grasas comestibles, carbohidratos y proteínas. Ejemplos de estas grasas comestibles incluyen pero no se limitan a aceite de coco, aceite de soja, y mono y diglicéridos. Ejemplos de estos carbohidratos incluyen pero no se limitan a glucosa, lactosa comestible y almidón de maíz hidrolizado. Adicionalmente, ejemplos de proteínas que se pueden utilizar en la composición nutricional de la invención incluyen pero no se limitan a proteínas de soja, suero electrodializado, leche descremada electrodializada, suero de leche, o hidrolizados de estas proteínas.
Con respecto a las vitaminas y minerales, se pueden añadir los siguientes a las composiciones nutricionales de la presente invención: calcio, fósforo, potasio, sodio, cloro, magnesio, manganeso, hierro, cobre, zinc, selenio, yodo y vitaminas A, E, D, C y el complejo B. También se pueden añadir otras vitaminas y minerales.
Los componentes utilizados en las composiciones nutricionales serán de origen semipurificado o purificado. Por semipurificado o purificado se entiende un material que ha sido preparado mediante la purificación de un material natural o por síntesis.
Ejemplos de composiciones nutricionales de la presente invención incluyen pero no se limitan a fórmulas para lactantes, complementos dietéticos, y composiciones rehidratantes. Las composiciones nutricionales de particular interés incluyen pero no se limitan a las utilizadas para la complementación enteral o parenteral en lactantes, fórmulas especializadas en lactantes, complementos para geriatría, y complementos para aquellos con dificultades gastrointestinales y/o mala absorción.
Composiciones nutricionales
Una composición nutricional típica de la presente invención contendrá macronutrientes comestibles, vitaminas y minerales en cantidades deseadas para un uso particular. Las cantidades de estos ingredientes variarán dependiendo de si la formulación se pretende para su uso en individuos normales, sanos, temporalmente expuestos a estrés, o a sujetos que tienen necesidades específicas debidas a ciertos estados de enfermedad crónicos o agudos (por ejemplo, desórdenes metabólicos). Una persona experta en la técnica entenderá que los componentes utilizados en una formulación nutricional de la presente invención son de origen semipurificado o purificado. Por semipurificado o purificado se entiende un material que ha sido preparado por purificación de un material natural o por síntesis. Estas técnicas son muy conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Code of Federal Regulations for Food Ingredients and Food Processing; Recommended Dietary Allowances (Código de Reglamentos Federales para Ingredientes de Alimentos y Procesamiento de Alimentos; cantidades dietéticas recomendadas), décima edición, National Academy Press, Washington, D.C., 1989).
La formulación nutricional puede ser un producto nutricional entérico, más preferiblemente un producto nutricional entérico para adulto o niño. La formulación nutricional puede comprender, además, los PUFA de la invención, macronutrientes, vitaminas y minerales en cantidades diseñadas para proporcionar los requerimientos nutricionales diarios de adultos.
Los componentes macronutricionales incluyen grasas comestibles, carbohidratos y proteínas. Las grasas comestibles ejemplificativas incluyen aceite de coco, aceite de soja, mono y diglicéridos y aceites PUFA producidos por la invención. Ejemplos de carbohidratos son la glucosa, lactosa comestible y almidón de maíz hidrolizado. Una fuente de proteína típica sería la proteína de soja, el suero electrodializado o la leche descremada electrodializada o el suero de leche, o los hidrolizados de estas proteínas, aunque también están disponibles otras fuentes de proteínas y se pueden usar. Estos macronutrientes se añadirían en forma de compuestos nutricionales comúnmente aceptados en una cantidad equivalente a los de la leche humana o una base de energía, es decir, con base por caloría.
Los procedimientos para fórmulas nutritivas líquidas y entéricas son muy conocidos en la técnica y se describen con detalle en los ejemplos.
La fórmula entérica se puede esterilizar y utilizar posteriormente en una base lista para alimentar o almacenar en un líquido o polvo concentrado. El polvo se puede preparar por rociado secando la fórmula enteral preparada como se indica anteriormente, y la fórmula se puede reconstruir rehidratando el concentrado. Las fórmulas nutricionales para adultos y lactantes son muy conocidas en la técnica y están comercialmente disponibles (v.gr., Similac®, Ensure®, Jevity® y Alimentum® de Ross Products División, Abbot Laboratories). Se puede añadir a cualquiera de estas fórmulas un aceite o ácido de la presente invención, en las cantidades descritas más adelante.
La densidad de energía de la composición nutricional cuando está en forma líquida, puede variar típicamente desde aproximadamente 0,6 kilocalorías a 3 kilocalorías por mL. Cuando está en forma sólida o en polvo, el complemento nutricional puede contener desde aproximadamente 1,2 hasta más de 9 kilocalorías por gm, preferiblemente de 3 a 7 kilocalorías por gm. En general, la osmolalidad de un producto líquido deberá ser menor de 700 mOsm y más preferiblemente inferior a 660 mOsm.
La fórmula nutricional incluirá, típicamente, vitaminas y minerales, además de los PUFA de la invención, con el fin de ayudar en la ingestión individual de los requerimientos diarios mínimos de estas sustancias. Además de los PUFA de la lista anterior, también puede ser deseable complementar la composición nutricional con zinc, cobre, y ácido fólico además de antioxidantes. Se cree que estas sustancias también proporcionarán una elevación del sistema inmunológico estresado y, de esta manera, proporcionará otros beneficios al individuo. La presencia de zinc, cobre o ácido fólico es opcional y no es necesaria para conseguir los efectos beneficiosos de la supresión inmunológica. Igualmente, una composición farmacéutica se puede complementar con estas mismas sustancias.
En una realización más preferida, la fórmula nutricional contiene, además del sistema antioxidante y del componente PUFA, una fuente de carbohidrato en donde el menos el 5% en peso del carbohidrato es un oligosacárido indigerible. Todavía en una realización más preferida, la composición nutricional contiene, adicionalmente, proteína, taurina y carnitina.
Los PUFA, o derivados de los mismos, preparados por el procedimiento se pueden usar como complementos o sustitutos dietéticos, particularmente en fórmulas para lactantes, para pacientes que sufren alimentación intravenosa o para evitar o tratar la desnutrición. Típicamente, la leche materna humana tiene un perfil de ácidos grasos que comprende desde aproximadamente 0,15% hasta aproximadamente 0,36% como DHA, desde aproximadamente 0,03% hasta aproximadamente 0,13% como EPA, desde aproximadamente 0,30% hasta aproximadamente 0,88% como ARA, desde aproximadamente 0,22% hasta aproximadamente 0,67% como DGLA, y desde aproximadamente 0,27% hasta aproximadamente 1,04% como GLA. Adicionalmente, el triglicérido predominante en la leche humana se ha indicado que es 1,3-di-oleoil-2-palmitoilo, con 2-palmitoiloglicéridos reportados como mejor absorbidos que el 2-oleoilo o los 2-lineoiloglicéridos (USPN 4,876,107). De esta manera, los ácidos grasos tales como ARA, DGLA, GLA y/o EPA producidos por la invención se pueden usar para alterar la composición de fórmulas para lactantes para replicar mejor la composición en PUFAs de la leche materna humana. En particular, una composición oleosa para su uso en complemento farmacológico o alimentario, particularmente un sustituto o complemento de leche materna comprenderá, preferiblemente, uno o más de ARA, DGLA, GLA. Más preferiblemente, el aceite comprenderá desde aproximadamente 0,3 hasta 30% de ARA, desde aproximadamente 0,2 hasta 30% de DGLA, y desde aproximadamente 0,2 hasta aproximadamente 30% de GLA.
Además de la concentración, las proporciones de ARA, DGLA y GLA se pueden adaptar para un uso final particularmente determinado. Cuando se formula como complemento o sustituto de la leche materna, se proporcionará una composición oleosa que contiene dos o más de ARA, DGLA y GLA en una proporción de aproximadamente 1:19:30 a aproximadamente 6:1:0.2, respectivamente. Por ejemplo, la leche materna de animales puede variar en proporciones de ARA:DGLA:GLA en el rango de 1:19:30 a 6:1:0,2 lo cual incluye proporciones intermedias que preferiblemente son de aproximadamente 1:1:1, 1:2:1, 1:1:4. Cuando se producen juntos en una célula hospedadora, el ajuste de la velocidad y el porcentaje de conversión de un sustrato precursor tal como GLA, DGLA a ARA se puede usar para controlar, con precisión, las proporciones de PUFAs. Por ejemplo, se puede usar una velocidad de conversión del 5% al 10% de DGLA en ARA para producir una proporción de ARA respecto DGLA de aproximadamente 1:19, mientras que se puede usar una velocidad de conversión de aproximadamente el 75% al 80% para producir una proporción de ARA respecto DGLA de aproximadamente 6:1. Por lo tanto, ya sea en un sistema de cultivo celular o en un animal hospedador, la regulación del tiempo, la extensión y la especificidad de expresión de desaturasa como se ha descrito se puede usar para modular los niveles y proporciones de PUFAs. Dependiendo del sistema de expresión usado, p.e., cultivo celular o un animal que expresa aceite(s) en su leche, también se pueden aislar y recombinar los aceites en las concentraciones y proporciones deseadas. Las cantidades de aceites que proporcionan estas proporciones de PUFAs se pueden determinar siguiendo protocolos estándares. Los PUFA, o las células hospedadoras que los contienen, también se pueden utilizar como complementos alimenticios para animales para alterar un tejido animal o composición de ácido graso de leche a uno más deseable para el consumo humano o animal.
Para complemento dietético, los PUFA o los derivados de los mismos, se pueden incorporar en aceites para cocinar, grasas o margarinas formuladas de manera que en el uso normal el receptor reciba la cantidad deseada. Los PUFA también se pueden incorporar en fórmulas para lactantes, complementos nutricionales u otros productos alimenticios, y pueden encontrar uso como agentes antiinflamatorios o que rebajen el colesterol.
Aplicaciones farmacéuticas
Se puede producir, de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento, una composición farmacéutica que comprenda uno o más de los ácidos y/o aceites. Más específicamente, esta composición farmacéutica puede comprender uno o más de los ácidos y/o aceites así como un portador adyuvante o vehículo estándar, bien conocido, no tóxico farmacéuticamente aceptable, tal como, por ejemplo, solución salina tamponada de fosfato, agua, etanol, polioles, aceites vegetales, un agente humectante o una emulsión tal como emulsión de agua/aceite. La composición puede estar en forma líquida o sólida. Por ejemplo, la composición puede estar en forma de una pastilla, cápsula, líquido o polvo ingerible, inyectable, o ungüento o crema tópico.
Las posibles rutas de administración incluyen, por ejemplo, la oral, rectal y parenteral. La ruta de administración, desde luego, dependerá del efecto deseado. Por ejemplo, si la composición se utiliza para tratar piel áspera, seca o envejecida, para tratar piel lastimada o quemada, o para tratar piel o cabello afectado por una enfermedad o condición, tal vez se pueda aplicar tópicamente.
La dosis de la composición que se va a administrar al paciente puede ser determinada por un experto ordinario en la materia y depende de varios factores tales como el peso del paciente, edad del paciente, estado inmunológico del paciente, etc.
Con respecto a la forma, la composición puede ser, por ejemplo, una solución, dispersión, suspensión, emulsión o un polvo estéril que se reconstituye.
Adicionalmente, la composición de la presente invención se puede utilizar para propósitos cosméticos. Se puede añadir a composiciones cosméticas preexistentes de manera que se forme una mezcla o se pueda usar como una composición sola.
Las composiciones farmacéuticas se pueden utilizar para administrar el componente PUFA a un individuo. Las composiciones farmacéuticas adecuadas pueden comprender soluciones acuosas o no acuosas estériles fisiológicamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones y polvos estériles para su reconstitución en soluciones estériles o dispersiones para ingestión. Ejemplos de portadores, diluyentes, disolventes o vehículos acuosos y no acuosos convenientes incluyen agua, etanol, polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, y similares), mezclas convenientes de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y utilizando tensioactivos. Puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, cloruro de sodio y similares. Además de estos diluyentes inertes, la composición puede incluir también adyuvantes, tales como agentes humectantes, emulsificantes y sustancias suspensoras, edulcorantes, sustancias saborizantes y perfumantes.
Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener sustancias suspensoras, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto o mezclas de estas sustancias, y similares.
Las formas de dosis sólidas tales como pastillas y cápsulas se pueden preparar usando técnicas muy conocidas en la materia. Por ejemplo, los PUFA de la invención se pueden preparar en pastillas con bases de pastillas convencionales tales como lactosa, sacarosa, y almidón de maíz en combinación con aglutinantes tales como acacia, almidón de maíz o gelatina, sustancias desintegrantes tales como almidón de patata o ácido algínico y un lubricante tal como ácido esteárico o estearato de magnesio. Las cápsulas se pueden preparar incorporando estos excipientes en una cápsula de gelatina junto con antioxidantes y el componente PUFA. La cantidad de antioxidantes y el componente PUFA que deberá incorporarse en la formulación farmacéutica deberá ajustarse dentro de los límites discutidos anteriormente.
Tal y como se utiliza en esta solicitud, el término "tratar" se refiere ya sea a prevenir, o reducir la incidencia de, la ocurrencia no deseada. Por ejemplo, tratar la supresión inmunológica se refiere ya sea a prevenir la ocurrencia de esta supresión o a reducir la cantidad de esta supresión. Los términos "paciente" e "individuo" se están usando intercambiablemente y ambos se refieren a un animal. El término "animal" como se usa en esta solicitud se refiere a cualquier mamífero de sangre caliente incluyendo, pero sin limitarse a perros, humanos, monos, y simios. Tal y como se usa en la solicitud el término "aproximadamente" se refiere a una cantidad que varia desde el rango o número establecido en una cantidad razonable dependiente del contexto de uso. Cualquier número o rango numérico especificado en la memoria descriptiva deberá considerarse que está modificado por el término aproximadamente.
"Dosis" y "ración" se usan intercambiablemente y se refieren a la cantidad de composición nutricional o farmacéutica ingerida por el paciente en una sola toma y diseñada para administrar cantidades efectivas de antioxidantes y triglicérido estructurado. Como será fácilmente aparente para los expertos en la materia, una sola dosis o ración del polvo líquido nutricional deberá suministrar la cantidad de antioxidantes y PUFAs mencionados anteriormente. La cantidad de dosis o ración deberá estar en un volumen que un adulto típico pueda consumir de una vez. Esta cantidad puede variar ampliamente dependiendo de la edad, peso, sexo o estado médico del paciente. Sin embargo como requisito general, una sola ración o dosis del producto nutricional líquido deberá considerarse que abarca un volumen de 100 a 600 mililitros, más preferiblemente de 125 a 500 mililitros y más preferiblemente de 125 a 300 milili-
tros.
Los PUFAs de la presente invención también se pueden añadir a los alimentos aún cuando no se requiera la complementación de la dieta. Por ejemplo, la composición se puede añadir a comida de cualquier tipo incluyendo pero sin limitarse a margarinas, mantequillas modificadas, quesos, leche, yogurt, chocolate, dulces, refrigerios, aceites para ensaladas, aceites para cocinar, grasas para cocinar, carnes, pescado y bebidas.
Aplicaciones farmacéuticas
Para uso farmacéutico (humano o veterinario), las 20 composiciones se administran generalmente por vía oral pero se pueden administrar por cualquier ruta a través de la cual se puedan absorber con éxito, por ejemplo, por vía parenteral (es decir subcutánea, intramuscular o intravenosa), rectal o vaginal o tópica, por ejemplo, como ungüento o loción para la piel. Los PUFAs producidos por la presente invención se pueden administrar solos o en combinación con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Cuando estén disponibles, las cápsulas de gelatina son la forma preferida para la administración oral. La complementación dietética como se ha descrito anteriormente también puede proporcionar una ruta de administración oral. Los ácidos insaturados de la presente invención se pueden administrar en formas conjugadas, o como sales, ésteres, amidas o profármacos de los ácidos grasos.
Sales farmacéuticamente aceptables preferidas son las sales de sodio, potasio o litio. También están incluidas las sales N-alquilpolihidroxamina, tales como N-metil glucamina, encontrada en la publicación del PCT WO 96/33155. Los ésteres preferidos son los ésteres etílicos. Como sales sólidas, los ácidos también los PUFAs se pueden administrar en forma de pastilla. Para administración intravenosa, los PUFAs o derivados de los mismos se pueden incorporar en formulaciones comerciales tales como intralípidos. El perfil de ácidos grasos en plasma de un adulto típico normal comprende de 6,64 a 9,46% de ARA, de 1,45 a 3,11% de DGLA, y de 0,02 a 0,08% de GLA. Estos PUFAs o sus precursores metabólicos se pueden administrar, ya sea solos o en mezclas con otros PUFAs, para alcanzar un perfil de ácidos grasos normal en un paciente. Cuando se desee, los componentes individuales de las formulaciones se pueden proporcionar individualmente en forma de kit, para uso único o múltiple. Una dosis típica de un ácido graso particular es de 0,1 miligramos a 20 gramos, o hasta 100 gramos diariamente, y es preferiblemente de 10 miligramos a 1, 2, 5 ó 10 gramos diariamente conforme se requiera, o cantidades molares equivalentes de formas derivadas de los mismos. Las composiciones de nutrición parenteral producidas por los procedimientos de aproximadamente 2 a aproximadamente 30% peso de ácidos grasos calculados como triglicéridos; se prefiere una composición que tenga de aproximadamente 1 a aproximadamente 25% en peso de la composición de PUFA total como GLA(USPN: 5,196,198). Se pueden incluir, opcionalmente, otras vitaminas, y particularmente vitaminas solubles en grasa tales como las vitaminas A, D, E Y L-carnitina. Cuando se desee, se puede añadir un conservante tal como el \alpha-tocoferol, típicamente a aproximadamente el 0,1% en peso.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas pueden comprender soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles fisiológicamente aceptables y polvos estériles para su reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles. Ejemplos de portadores, diluyentes, solventes o vehículos acuosos y no acuosos convenientes incluyen agua, etanol, polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, y similares), mezclas convenientes de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, manteniendo el tamaño de partícula requerido en casos de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, cloruro de sodio y similares. Además de estos diluyentes inertes, la composición puede también incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, emulsificantes y suspensores, edulcorantes, saborizantes y
perfumantes.
Las suspensiones además de los compuestos activos, pueden contener sustancias suspensoras, como por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, o mezclas de estas sustancias y similares.
Las composiciones farmacéuticas especialmente preferidas pueden contener ésteres de ácido diacetiltartárico de mono y diglicéridos disueltos en un medio o solvente acuoso. Los ésteres de ácidos diacetiltartáricos de mono y diglicéridos tienen un valor de HLB de aproximadamente 9-12 y son significativamente más hidrofílicos que los lípidos antimicrobianos existentes que tienen valores de HLB de 2-4. Esos lípidos hidrofóbicos existentes no se pueden formular en composiciones acuosas. Como se describe en el presente documento, los lípidos ahora se pueden solubilizar en medio acuoso en combinación con ésteres de ácidos diacetiltartáricos de mono y diglicéridos. De acuerdo con esta realización, los ésteres de ácidos diacetiltartáricos de mono y diglicéridos (p.e., DATEM- C12:0) se combinan con otros lípidos antimicrobianos activos (p.e., 18:2 y 12:0 monoglicéridos) y se mezclan para obtener una mezcla homogénea. La homogeneidad permite una actividad antimicrobiana aumentada. La mezcla se puede dispersar completamente en agua. Esto no es posible sin la adición de ésteres de ácidos diacetiltartáricos de mono y diglicéridos y el premezclado con otros monoglicéridos antes de la introducción en agua. La composición acuosa se puede mezclar bajo condiciones estériles con diluyentes, conservantes, tampones o propelentes fisiológicamente aceptables cuando sea requerido para la preparación de un spray o un rocío o un inhalador.
La complementación con los PUFAs producidos utilizando procedimientos de la presente invención se puede usar para tratar la restenosis después de una angioplastia. Se pueden tratar con los PUFA de la presente invención los síntomas de inflamación, artritis reumatoide, y asma y psoriasis. La evidencia indica que los PUFAs pueden estar involucrados en el metabolismo del calcio, sugiriendo que los PUFA de la presente invención se puedan usar en el tratamiento o prevención de la osteoporosis y de cálculos en el riñón o en vías urinarias.
Los PUFA se pueden usar en el tratamiento del cáncer. Se ha demostrado que las células malignas tienen composiciones de ácidos grasos alteradas; la adición de ácidos grasos ha demostrado disminuir su crecimiento y causar muerte celular, e incrementar su susceptibilidad a las sustancias quimioterapéuticas. El GLA ha demostrado que causa reexpresión en células cancerígenas de las moléculas de adhesión celular E-cadherina, la pérdida de la cual está asociada con metástasis agresiva. Las pruebas clínicas en la administración intravenosa de sal de litio soluble en agua del GLA a pacientes con cáncer pancreático produjo aumentos estadísticamente significativos en su supervivencia. La complementación con PUFAs también puede ser útil para tratar la caquexia asociada con cáncer.
Los PUFAs de la presente invención también se pueden usar para tratar diabetes (USPN: 4,826,877; Horrobin y colaboradores, Am. J. Clin. Nutr. Vol. 57 (Supl.), 732S-737S). Se ha demostrado el metabolismo y composición de ácidos grasos alterados en animales diabéticos. Estas alteraciones han sugerido que están involucradas en algunas de las complicaciones a largo plazo resultantes de la diabetes, incluyendo la retinopatía, neuropatía, nefropatía y daño al sistema reproductor. El aceite de prímula, que contiene GLA, ha demostrado que previene e invierte el daño nervioso en el diabético.
Los PUFAs se pueden usar para tratar eczema, reducir la presión sanguínea y mejorar las calificaciones en matemáticas. Se ha sugerido que la deficiencia en ácidos grasos esenciales está implicada en los eczemas, y algunos estudios han mostrado efectos beneficiosos sobre el eczema a partir del tratamiento con GLA. El GLA también ha demostrado reducir los aumentos de presión sanguínea asociados con estrés, y mejorar el desempeño en pruebas aritméticas. El GLA y el DGLA han mostrado inhibir la agregación de plaquetas, causar vasodilatación, niveles más bajos de colesterol e inhibir la proliferación del músculo liso de la pared de los vasos y del tejido fibroso (Brenner y colaboradores, Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 83, p. 85-101, 1976). La administración de GLA o DGLA, solo o en combinación con EPA, ha mostrado reducir o prevenir el sangrado gastrointestinal y otros efectos secundarios causados por fármacos antiinflamatorios no esteroides (USPN: 4,666,701). GLA y DGLA también han mostrado que previenen o tratan la endometriosis y el síndrome premenstrual (USPN: 4,758,592) y tratar encefalomielitis miálgica y fatiga crónica después de infecciones virales (USPN: 5,116,871).
Otros usos de los PUFAs producidos por los procedimientos de esta invención incluyen el uso en el tratamiento de SIDA, esclerosis múltiple, síndrome respiratorio agudo, hipertensión y desórdenes inflamatorios de la piel. Los PUFAs de la invención también se pueden usar en fórmulas para la salud general así como para tratamientos geriátricos.
Aplicaciones veterinarias
Deberá notarse que las composiciones farmacéuticas y nutricionales descritas anteriormente se pueden utilizar en animales, así como en humanos, ya que los animales experimentan muchas de las mismas necesidades y condiciones que el humano. Por ejemplo, el aceite o ácidos de la presente invención se pueden utilizar en complementos alimenticios para animales o como sustitutos alimenticios para animales.
Los siguientes ejemplos se presentan a modo ilustrativo y no limitativo.
Ejemplos
Ejemplo 1
Aislamiento de una secuencia de nucleótidos de \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina.
Ejemplo 2
Aislamiento de una secuencia de nucleótidos de \Delta6-desaturasa de Mortierella alpina.
Ejemplo 3
Identificación de \Delta6-desaturasa a la \Delta6-desaturasa homólogos de M. alpina.
Ejemplo 4
Aislamiento de una secuencia de nucleótidos de \Delta12-desaturasa de Mortierella alpina.
Ejemplo 5
Aislamiento de la Secuencia de nucleótidos de citocromo b5 reductasa a partir de Mortierella alpina.
Ejemplo 6
Expresión de clones de desaturasa de M. alpina en levadura de transformación de panificación.
Ejemplo 7
Expresión de la \Delta5-desaturasa en plantas.
Ejemplo 8
Expresión de \Delta6 desaturasa de M. alpina en Brassica napus.
Ejemplo 9
Expresión de \Delta12 desaturasa de M. alpina en Brassica napus.
Ejemplo 10
Expresión simultánea de \Delta6 y \Delta12 desaturasas de M. alpina en Brassica napus.
Ejemplo 11
Expresión simultánea de \Delta5 y \Delta6 desaturasas de M. alpina en Brassica napus.
Ejemplo 12
Expresión simultánea de \Delta5, \Delta6 y \Delta12 desaturasas de M. alpina en Brassica napus.
Ejemplo 13
Distribución estereoespecífica de aceites \Delta6-desaturados.
Ejemplo 14
Composiciones de ácidos grasos de plantas transgénicas.
Ejemplo 15
Expresión combinada de \Delta6 y \Delta12-desaturasas en B. napus lograda mediante cruzamiento.
Ejemplo 16
Expresión de desaturasas de M. alpina en soja.
Ejemplo 17
Secuencias de genes de desaturasa humana.
Ejemplo 18
Identificación de homólogos de las desaturasas \Delta5 y \Delta6 de M. alpina.
Ejemplo 19
Identificación de homólogos de \Delta5 y \Delta6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFAs.
Ejemplo 20
Identificación de homólogos de \Delta12 y \Delta12 de M. alpina en otros organismos productores de PUFAs.
Ejemplo 21
Composiciones nutricionales.
Ejemplo 1 Aislamiento de una secuencia de nucleótidos de \Delta5-desaturasa a partir de Mortierella alpina
La Mortierella alpina produce ácido araquinódico (AAR, 20:4) a partir del precursor 20:3 mediante una \Delta5-desaturasa. Se obtuvo una secuencia de nucleótidos que codifica la \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina (ver la Figura 7) mediante amplificación por PCR usando la primera cadena de ADNc de M. alpina y cebadores de oligonucleótidos degenerados correspondientes a secuencias de aminoácidos conservadas entre \Delta6-desaturasas de Synechocystis y Spirulina. El procedimiento usado fue el siguiente:
Se aisló el ARN total de un cultivo que produce PUFAs de tres días de edad de Mortierella alpina usando el protocolo de Hoge et al.(1982), Experimental Mycology 6:225-232. Se usó el ARN para preparar ADNc de cadena doble usando el sistema Lambda-ZipLox de BRL, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se empaquetaron las fracciones de varios tamaños de ADNc de M. alpina por separado para producir bibliotecas con insertos de diferente tamaño promedio. La biblioteca de "longitud completa" contiene aproximadamente 3 x 10^{6} clones con un tamaño de inserto promedio de 1,77 kb. La biblioteca de "grado de secuenciamiento" contiene aproximadamente 6 x 10^{5} clones con un tamaño de inserto promedio de 1,1 kb.
Se transcribieron a la inversa 5 \mug del ARN total usando el SuperscriptRTasa de BRL y el cebador TSyn
5'-CCAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT-3', (SEC ID NO:19). Se diseñaron oligonucleótidos degenerados para las regiones conservadas entre las dos secuencias de \Delta6-desaturasa cianobacterianas. Los cebado res específicos usados fueron:
D6DESAT-F3 (SEQ ID NO:20)
5'-CUACUACUACUACAYCAYACOTAYACOAAYAT-3'
D6DESAT-R3 (SEQ ID NO:21)
5'-CAUCAUCAUCAUOGGRAAOARRTGRTG-3',
en donde Y=C+T, R=A+G, y O=I+C. Se llevó a cabo la amplificación por PCR en un volumen de 25 \muL que contenía: templado derivado de 40 ng del ARN total, 2 pM de cada cebador, 200 \muM de cada desoxirribonucleótido trifosfato, Tris-Cl 60 mM, pH 8,5, (NH_{4})_{2}SO_{4} 15 mM, MgCl_{2} 2 mM. Las muestras se sometieron a una etapa de desaturación inicial a 95 grados (todas las temperaturas en Celsius) durante 5 minutos, a continuación se mantuvieron a 72 grados mientras se añadían 0,2 U de Taq polimerasa. Las condiciones de termociclado de la PCR fueron las siguientes: 94 grados durante 1 minuto, 45 grados durante 1,5 minutos, 72 grados durante 2 minutos. La PCR continuó durante 35 ciclos. La PCR usando estos cebadores en la primera cadena del ADNc de M. alpina produjo un producto de reacción de 550 pares de bases. La comparación de la secuencia de aminoácidos deducida del fragmento de la PCR de M. alpina reveló regiones de homología con \Delta6-desaturasas (véase la Figura 4). Sin embargo, sólo hubo aproximadamente un 28% de identidad respecto a la región comparada. La secuencia de aminoácidos deducida se presenta en SEC ID NO:14.
El producto de PCR se usó como sonda para aislar los correspondientes clones de ADNc de una biblioteca de M. alpina. El clon de ADNc más largo, Ma29, fue designado como pCGN5521 y ha sido completamente secuenciado en ambas cadenas. El ADNc está contenido como un inserto de 1481 pares de bases en el vector pZL1 (Bethesda Research Laboratories) y, comenzando con el primer ATG, contiene un marco de lectura abierto que codifica 446 aminoácidos. El marco de lectura contiene la secuencia deducida del fragmento de la PCR. Se encontró que la secuencia del inserto de ADNc contenía regiones de homología para \Delta6-desaturasas (véase la Figura 8). Por ejemplo, se encontró en la secuencia de Mortierella que estaban presentes tres "cajas de histidina" conservadas (que han sido observadas en desaturasas unidas a membrana (Okuley y colaboradores, (1994) The Plant Cell 6:147-158)) en las posiciones aminoacídicas 171-175, 207-212, Y 387-391 (véase la Figura 5A-5D). Sin embargo, se encontró que el motivo aminoacídico típico "HXXHH" para la tercera caja de histidinas de la desaturasa de Mortierella era QXXHH. El amino terminal de la proteína codificada, mostró homología significativa con las proteínas citocromo b5. De esta manera, el clon de ADNc de Mortierella parece representar una fusión entre un citocromo b5 y una desaturasa de ácido graso. Puesto que se cree que el citocromo b5 funciona como donador de electrones para las enzimas desaturasas unidas a membrana, es posible que el dominio terminal N del citocromo b5 de esta proteína desaturasa esté involucrada en su función. Esto puede ser ventajoso cuando se expresa la desaturasa en sistemas heterólogos para la producción de ácidos grasos poliinsaturados.
Ejemplo 2 Aislamiento de una secuencia de nucleótidos de \Delta6-desaturasa a partir de Mortierella alpina
Se obtuvo una secuencia de ácido nucleico procedente de un clon de ADNc parcial, Ma524, que codifica una desaturasa de ácido graso \Delta6 de Mortierella alpina mediante secuenciación aleatoria de clones procedentes de la biblioteca ADNc de M. alpina descrita en el Ejemplo 1. Los plásmidos que contenían ADNc se separaron como sigue:
Se combinaron cinco \mul de fago con 100 \mul de E. coli DH10B(ZIP) cultivados en ECLB más 10 \mug/ml de canamicina, 0,2% de maltosa, y Mgso_{4} 10 mM, y se incubaron a 37 grados durante 15 minutos. Se añadieron 0,9 ml SOC y 100 \mul de la bacteria inmediatamente plaqueada en cada una de las placas de 10 ECLB + 50 \mug de Pen. No fue necesario un tiempo de recuperación de 45 minutos. Las placas se incubaron durante la noche a 37ºC. Las colonias se recogieron en medio ECLB + 50 \mug Pen para cultivos durante la noche para ser usados en la preparación de suministros de glicerol y ADN miniprep. Se almacenó una alícuota del cultivo usado para la miniprep como un suministro de glicerol. El plaqueo sobre ECLB + 50 \mug Pen/ml dio como resultado más colonias y una mayor proporción de colonias que contenían insertos que el plaqueo en 100 \mug/ml pen.
Se recogieron colonias aleatorias y se purificó el ADN plásmico usando kits de miniprep Qiagen. Se obtuvo la secuencia de ADN del extremo 5' del inserto de ADNc y se comparó con las bases de datos usando el algoritmo BLAST. Se identificó el Ma524 como una presunta desaturasa basada en la homología de secuencia de ADN con las desaturasas identificadas previamente. Se aisló un clon de ADNc de longitud completa de la biblioteca de M. alpina. La abundancia de este clon parece ser ligeramente menor (2X) que la de Ma29. Ma524 exhibe una homología significativa a una porción de un cósmido de Caenorhabditis elegans, WO6D2.4, una proteína de fusión de citocromo b5/desaturasa de girasol, y las 2 \Delta6-desaturasas en los bancos de datos públicos de Synechocystis y Spirulina.
Además, Ma524 muestra una homología significativa con la secuencia de \Delta6-desaturasa de borraja (publicación de PCT WO96/21022). De este modo, parece que Ma524 codifica una A6-desaturasa que está relacionada con las \Delta6-desaturasas de borraja y algas. Deberá indicarse que, aunque las secuencias de aminoácidos de Ma524 y de la \Delta6 de borraja son similares, la composición en bases del ADNc es bastante diferente: el ADNc de borraja tiene una composición global en bases del 60% A/T, con algunas regiones que exceden el 70%, mientras que Ma524 tiene un promedio del 44% A+T de composición en bases, sin regiones que excedan el 60%. Esto puede tener implicaciones para expresar los ADNc en microorganismos o animales que favorezcan diferentes composiciones de base. Se sabe que puede tener lugar una pobre expresión de genes recombinantes cuando el hospedador tiene una composición en bases muy diferente de la del gen introducido. Los mecanismos especulados para esta pobre expresión incluyen la estabilidad disminuida o la posibilidad de traducción del ARN_{m}.
Ejemplo 3 Identificación de las \Delta6-desaturas homólogas a la \Delta6-desaturasa de Mortierella alpina
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican presuntas \Delta6-desaturasa se identificaron mediante una búsqueda BLASTX de las bases de datos de EST a través de NCBI usando la secuencia de aminoácidos de Ma524. Varias secuencias mostraron homología significativa. En particular, la secuencia de aminoácidos deducida de dos secuencias de Arabidopsis thaliana,(números de acceso F13728 y T42806) mostraron homología con dos regiones diferentes de la secuencia de aminoácidos deducida de Ma524. Se diseñaron los siguientes cebadores de PCR: ATTS4723-FOR (complementario a F13728) SEC ID NO:22: 5' CUACUACUACUAGGAGTCCTCTACGGTGTTTTG y T42806-REV (complementaria a T42806) SEC ID NO:23: 5' CAUCAUCAUCAUATGATGCTCAAGCTGAAACTG. Se transcribieron a la inversa cinco \mug del ARN total aislado de los siliques en desarrollo de Arabidogsis thaliana usando Supercript RTase de BRL y el cebador TSyn 5'-CCAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT-3' (SEC ID NO:24). Se llevó a cabo la PCR en un volumen de 50 \mul que contenía: un templado derivado de 25 ng de ARN total, 2 pM de cada cebador, 200 \muM de cada desoxirribonucleótido trifosfato, Tris-Cl 60 mM, pH 8,5, (NH_{4})_{2}SO_{4} 15 mM, MgCl_{2} 2 mM, 0,2 U Taq Polimerasa. Las condiciones de ciclado fueron las siguientes: 94 grados durante 30 segundos, 50 grados durante 30 segundos, 72 grados durante 30 segundos. Se continuó la PCR durante 35 ciclos seguido de una extensión adicional a 72 grados durante 7 minutos. La PCR dio como resultado un fragmento de \sim750 pares de bases el cual, subsiguientemente se subclonó, se nombró 12-5, y se secuenció. Cada extremo de este fragmento corresponde a EST de Arabidopsis de la cual se derivaron cebadores de PCR. Esta es la secuencia denominada 12-5. la secuencia de aminoácidos deducida de 12-5 se comparó con la de Ma524, y los EST de humano (W28140), ratón (W53753), y C. elegans (R05219) en la figura 4. Basándose en la homología, estas secuencias representan polipéptidos desaturasas. Los genes de longitud completa se pueden clonar usando sondas basadas en las secuencias EST. Los genes se pueden colocar a continuación, en vectores de expresión y ser expresados en células hospedadoras, y su actividad específica de \Delta6- u otra desaturasa se puede determinar tal y como se describe más adelante.
Ejemplo 4 Aislamiento de una secuencia de nucleótidos de una \Delta12-desaturasa procedente de Mortierella alpina
Basándose en los ácidos grasos que acumula, parece probable que la Mortierella alpina tenga una desaturasa tipo \omega6. La \omega6-desaturasa es responsable de la producción de ácido linóleico (18:2) a partir de ácido oleico (18:1). El ácido linóleico (18:2) es un sustrato para una \Delta6-desaturasa. Este experimento se diseñó para determinar si Mortierella alpina tiene un polipéptido \Delta12-desaturasa, y si es así, identificar la correspondiente secuencia de nucleótidos. Se secuenció una colonia aleatoria de 1 biblioteca de grado de secuenciación de M. alpina, Ma648, y se identificó como una presunta desaturasa en base a una homología en secuencia de ADN con respecto a desaturasas identificadas previamente, como se describe para Ma524 (ver el Ejemplo 2). La secuencia de aminoácidos deducida del extremo 5' del ADNc de MA648 exhibe una homología significativa con la desaturasa microsomal de \omega6 (\Delta12)desaturasa de soja (número de acceso L43921) así como con un oleato 12-hidroxilasa de semilla de ricino (número de acceso U22378). Además, se observó homología cuando se comparó con una variedad de otras secuencias de desaturasas de ácidos grasos \omega6 (\Delta12) y \omega3 (\Delta15).
Ejemplo 5 Aislamiento de la Secuencia de Nucleótidos de la citromo b5 reductasa a partir de Mortierella alpina
Se obtuvo una secuencia de ácido nucleico que codifica una de citocromo b5 reductasa de Mortierella alpina como sigue. Se construyó una biblioteca de ADNc basada en el ARN total aislado de Mortierella alpina tal y como se ha descrito en el ejemplo 1. La secuencia de ADN se obtuvo de los extremos 5' y 3' de uno de los clones, M12-27. Una búsqueda en bancos de datos públicos con la secuencia de aminoácidos deducida del extremo 3' de M12-27 (ver Figura 5) reveló homología significativa con secuencias de citocromo b5 reductasa conocidas. Específicamente, sobre una región de 49 aminoácidos, el clon de Mortierella comparte 55% de identidad (73% de homología) con una citocromo b5 reductasa de cerdo (ver Figura 4).
Ejemplo 6 Expresión de clones de desaturasa de M. alpina en levaduras de transformación de panificación
La transformación de acetato de litio de la levadura se realizó de acuerdo con protocolos estándares (Methods in Enzymology, Vol. 194, p. 186-187, 1991). Brevemente, se cultivó la levadura en YPD a 30ºC. Las células se centrifugaron, se resuspendieron en TE, se centrifugaron de nuevo, se volvieron a suspender en TE que contenía 100 mM de acetato de litio, se centrifugaron de nuevo, y se volvieron a suspender en TE/acetato de litio. La levadura resuspendida se incubó a 30ºC durante 60 minutos con agitación. Se añadió el ADN portador y la levadura se dividió en tubos. Se añadió ADN transformante y los tubos se incubaron durante 30 minutos a 30ºC. Se añadió solución PEG (35% (p/v) PEG 4000, 100 mM de acetato de litio, TE pH 7,5) seguido de 50 minutos de incubación a 30ºC. Se llevó a cabo un choque de calor de 5 minutos a 42ºC, las célula se aglomeraron, se lavaron con TE, se aglomeraron de nuevo y se volvieron a suspender en TE. Las células resuspendidas se plaquearon sobre medios selectivos.
Expresión de desaturasas en levadura transformada
Los clones de ADNc de Mortierella alpina se seleccionaron para determinar la actividad desaturasa en la levadura de panificación. Se usó como control positivo una \Delta15-desaturasa de canola (obtenida mediante PCR usando la primera cadena de ADNc de semillas de cultivo 212/86 de Brassica napus usando cebadores basados en la secuencia publicada (Arondel y colaboradores Science 258:1353-1355)). El gen \Delta15-desaturasa y el gen del clon de ADNc Ma29 se insertaron en el vector de expresión pYES2 (Invitrogen), dando como resultado los plásmidos pCGR-2 y pCGR-4, respectivamente. Estos plásmidos se transfectaron en la cepa 334 de levadura S. Cerevisiae y se expresaron después de la inducción con galactosa y en la presencia de sustratos que permitieron la detección de actividad desaturasa específica. La cepa de control fue la cepa 334 de S. cerevisiae que contenía al vector pYES2 inalterado. Los sustratos usados, los productos producidos y la actividad desaturasa indicada fueron: DGLA (conversión a ARA indicaría actividad \Delta5-desaturasa), ácido linoleico (conversión a GLA indicaría actividad \Delta6-desaturasa; la conversión a ALA indicaría actividad \Delta15-desaturasa), ácido oleico (un sustrato endógeno hecho por S. cerevisiae, la conversión a ácido linoleico indicaría actividad \Delta12-desaturasa, de la cual carece S. cerevisiae), o ARA(conversión en EPA indicaría actividad \Delta17-desaturasa). Los resultados se proporcionan en la Tabla 1 de más abajo. Las fracciones de lípidos se extrajeron como sigue: Se hicieron crecer los cultivos durante 48-52 horas a 15ºC. Las células se aglomeraron mediante centrifugación, se lavaron una vez con ddH_{2}O estéril, y se volvieron a aglomerar. El aglomerado se agitó con metanol; se añadió cloroformo junto con tritridecanoína (como un estándar interno). Las mezclas se incubaron durante al menos 1 hora a temperatura ambiente o a 4ºC durante la noche. Se extrajo la capa de cloroformo y se filtró a través de un filtro Whatman con un gramo de sulfato de sodio anhidro para eliminar las partículas de agua residual. Se evaporaron los disolventes orgánicos a 40ºC bajo una corriente de nitrógeno. Los lípidos extraídos se derivaron en ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) para el análisis de cromatografía en gas (CG) añadiendo 2 mililitros de hidróxido de potasio 0,5 N en metanol a un tubo cerrado. Las muestras se calentaron de 95ºC a 100ºC durante 30 minutos y se enfriaron a temperatura ambiente. Se añadieron aproximadamente 2 mL de trifluoruro de boro al 14% en metanol y se repitió el calentamiento. Después de enfriar la mezcla de lípidos extraída, se añadieron 2 mL de agua y 1 mL de hexano para extraer los FAME para analizarlos mediante cromatografía en gas. Se calculó la conversión porcentual dividiendo el producto producido por la suma de (el producto producido y el sustrato añadido) y luego se multiplicó por 100. Para calcular la conversión porcentual de ácido oleico, como no se añadió sustrato, el ácido linolénico total producido se dividió por la suma de (ácido oleico y el ácido linoleico producido), y luego se multiplicó por 100.
TABLA 1
Expresión de Desaturasa de M. alpina en Levadura de Panadero
Clona Actividad de enzima % Conversión de sustrato
pCGR-2 (\Delta15 \Delta6 0 (18:2 en 18:3\omega6)
desaturasa de canola) \Delta15 16,3 (18:2 en 18:3\omega3)
\Delta5 2,0 (20:3 en 20:4\omega6)
\Delta17 2,8 (20:4 en 20:5\omega3)
\Delta12 1,8 (18:1 en 18:2\omega6)
pCGR-4 (M. alpina \Delta6 0
\Delta6-parecida, Ma29) \Delta15 0
\Delta5 15,3
\Delta17 0,3
\Delta12 3,3
pCGR-7 (M. alpina \Delta6 0
\Delta12-parecida, Ma648) \Delta15 3,8
\Delta5 2,2
\Delta17 0
\Delta12 63,4
El clon control \Delta15-desaturasa exhibió un 16.3% de conversión del sustrato. El clon pCGR-4 que expresa el ADNc de Ma29 convirtió el 15,3% del sustrato de 20:3 a 20:4\omega6, lo que indica que el gen codifica una \Delta5-desaturasa. El fondo (conversión no especifica de sustrato) fue de entre el O y el 3% en estos casos. El clon pCGR-5 que expresa el ADNc de Ma524 mostró el 6% de conversión del sustrato en GLA, lo que indica que el gen codifica una \Delta6 desaturasa. El clon pCGR-7 que expresa el ADNc de Ma648 convirtió el 63,4% de conversión del sustrato en ALA, lo que indica que el gen codifica una \Delta12-desaturasa. Se observó, también, inhibición de actividad sobre el sustrato usando diferentes concentraciones del sustrato. Cuando se añadió sustrato a 100 \muM, la conversión porcentual en producto bajó en comparación a cuando el sustrato se añadió a 25 \muM (véase más adelante). Estos datos muestran que desaturasas con diferentes especificidades de sustrato se pueden expresar en un sistema heterólogo y usar para producir ácidos grasos poliinsaturados.
La Tabla 2 representa los ácidos grasos de interés como un porcentaje de los lípidos totales extraídos de la levadura hospedadora S. cerevisiae 334 con el plásmido indicado. No hubo glucosa presente en el medio de crecimiento. Se usó cromatografía de afinidad en gas para separar los respectivos lípidos. Se empleó CG/MS para verificar la identidad de los productos. El producto esperado para la \Delta15-desaturasa de B. napus, ácido \alpha-linolénico se detectó cuando su sustrato, ácido linoleico, se añadió exógenamente al cultivo de levadura inducido. Este hallazgo demuestra que la expresión de levadura de un gen desaturasa puede producir enzima funcional y cantidades detectables de producto bajo las condiciones de cultivo ordinarias. Ambos sustratos añadidos exógenamente fueron recogidos por la levadura, aunque se incorporó ligeramente menos del PUFA de cadena más larga, el ácido dihomo-\gamma-linolénico (20:3), en la levadura que el ácido linoleico (18:2) cuando cualquiera de los dos se añadió en forma libre a los cultivos de levadura inducidos. Se detectó ácido \gamma-linolénico cuando el ácido linoleico estaba presente durante la inducción y expresión de S. cerevisiae 334 (pCGR-5). La presencia de este PUFA demuestra actividad de \Delta6-desaturasa a partir del pCGR-5 (Ma524). El ácido linoleico, identificado en los lípidos extraídos de la expresión del S. cerevisiae 334 (pCGR-7), clasifica el ADNc de Ma648 de M. alpina como la \Delta12-desaturasa.
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(Tabla pasa a página siguiente)
1
Ejemplo 7 Expresión de \Delta5-desaturasa en plantas Expresión en hojas
Este experimento se diseñó para determinar si las hojas que expresan Ma29 (determinado mediante Northern) eran capaces de convertir el DGLA (20:3) exógenamente aplicado en ARA (20:4).
El ADNc de la desaturasa Ma29 se modificó mediante PCR para introducir sitios de restricción convenientes para la clonación. La región de codificación desaturasa ha sido insertada en un cassette d35 bajo el control del promotor doble 35S para la expresión en hojas de Brassica(pCGN5525) siguiendo protocolos estándares (véase USPN: 5,424,200 y USPN: 5,106,739). Las plantas de Brassica transgénicas que contienen pCGN5525 se generaron siguiendo protocolos estándares (véase USPN: 5,188,958 y USPN: 5,463,174).
En el primer experimento, se usaron tres plantas: un control, LPO04-1, y dos transgénicas, 5525-23 y 5525-29. LPO04 es una variedad de Brassica con bajo contenido de linolénico. Se eligieron hojas de cada una para uno de tres tratamientos: agua, GLA o DGLA. El "GLA" y el DGLA se compraron como sales de sodio en NuChek Prep y se disolvieron en agua a 1 mg/mL. Se cubrieron alícuotas con N_{2} Y se almacenaron a -70ºC. Las hojas se trataron aplicando una gota de 50 \muL a la superficie superior y se extendió suavemente con un guante enguantado para cubrir la superficie entera. Se realizaron las aplicaciones aproximadamente 30 minutos antes del término del ciclo de luz para minimizar cualquier fotooxidación de los ácidos grasos aplicados. Después de 6 días de tratamiento, se cosechó una hoja de cada tratamiento y se cortó por la mitad a través de la vena central. Una mitad se lavó con agua para intentar eliminar el ácido graso no incorporado. Las muestras de hojas se liofilizaron durante la noche, y se determinó la composición de ácidos grasos mediante cromatografía en gas (CG). Los resultados se muestran en la Tabla 3.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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Las hojas tratadas con ácido GLA contenían de 1,56 a 2,4% en peso de GLA. El análisis de ácidos grasos mostró que la composición de lípidos de las hojas de control y transgénicas fue esencialmente la misma. Las hojas de las plantas de control tratadas con DGLA contenían 1,2-1,9% en peso de DGLA y cantidades de fondo de ARA (0,26-0,27% en peso). Las hojas transgénicas contenían solamente 0,2-0,7% en peso de ácido dihomo-gama-linolénico, pero los niveles de ácido araquidónico aumentaron (0.74-1.1 por ciento en peso) indicando que el ácido dihomo-gama-linolénico se convirtió en ácido araquidónico en estas hojas.
Expresión en semilla
El propósito de este experimento fue determinar si una construcción con el promotor napin específico de semilla habilitaría la expresión en la semilla.
El ADNc de Ma29 fue modificado por PCR para introducir sitios de clonación XhoI dirección corriente arriba y corriente abajo de los codones de inicio y de detención, respectivamente, usando los siguientes cebadores:
Madxho-hacia adelante:
5'-CUACUACUACUACTCGAGCAAGATGGGAACGGACCAAGG (SEC ID NO:25)
Madxho-hacia atrás:
5'-CAUCAUCAUCAUCTCGAGCTACTCTTCCTTGGGACGGAG (SEC ID NO: 26).
El producto de la PCR se subclonó en pAMPl (GIBCOBRL) usando el sistema CloneAmp (GIBCO-BRL) para crear pCGN5522 y la secuencia de \Delta5 desaturasa se verificó secuenciando ambas cadenas.
Para la expresión específica de semilla, la región de codificación de Ma29 se separó de pCGN5522 como un fragmento XhoI y se insertó en el sitio SalI del cassette de expresión napin, pCGN3223, para crear pCGN5528. El fragmento HindIII del pCGN5528 que contiene la región reguladora 5' napin, la región de codificación Ma29, y la región reguladora de 3' napin se insertó en el sitio HindIII de pCGN1557 para crear pCGN5531. Se insertaron dos copias de la unidad de transcripción napin en tándem. Esta construcción en tándem puede permitir mayor expresión de las desaturasas por lugares genéticos. Se introdujo pCGN5531 en Brassica napus cv.LPOO4 vía la transformación mediada por Agrobacterium.
Se analizó la composición de ácidos grasos de criaderos de 20 semillas de las semillas T2 maduras mediante cromatografía en gas. La Tabla 4 muestra los resultados obtenidos con líneas transformadas independientes en comparación con la semilla LPOO4 no transformada. Las semillas transgénicas que contenían pCGN5531 contienen dos ácidos grasos que no están presentes en las semillas control, tentativamente identificados como ácido taxoleico (5,9-18:2) y ácido pinolénico (5,9,12-18:3), basándose en su elución relativa al ácido oleico y al ácido linoleico. Estos serían los productos esperados de la \Delta5 desaturación de los ácidos oleico y linoleico. No se observaron otras diferencias en la composición de ácidos grasos en las semillas transgénicas.
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1001
Se realizó un análisis Northern en plantas para identificar las que expresan Ma29. Se aislaron embriones en desarrollo aproximadamente 25 días después de la antesis o cuando se indujo el promotor napin, y se pusieron a flotar en una solución que contenía GLA o DGLA como se describe en el Ejemplo 7. Se realizó a continuación el análisis de ácidos grasos de los embriones mediante cromatografía en gas para determinar la cantidad de conversión de DGLA en ARA, siguiendo el protocolo adaptado para las hojas en el Ejemplo 7. La cantidad de ARA incorporada en triglicéridos mediante las acilotransferasas de Brassica endógenas se evaluó entonces mediante análisis de cromatografía en gas como en el Ejemplo 7.
Ejemplo 8 Expresión de \Delta6 Desaturasa de M. alpina en Brassica napus
El ADNc de Ma524 se modificó mediante PCR para introducir sitios de clonación usando los siguientes cebadores:
Ma524PCR-1 (SEC ID NO:27)
5'-CUACUACUACUATCTAGACTCGAGACCATGGCTGCTGCTCCAGTGTG
Ma524PCR-2 (SEC ID NO:28)
5'-CAUCAUCAUCAUAGGCCTCGAGTTACTGCGCCTTACCCAT
Estos cebadores permitieron la amplificación de la región de codificación entera y añadieron los sitios XbaI y XhoI en el extremo 5' y los sitios XhoI y StuI en el extremo 3'. El producto de PCR se subclonó en pAMP1 (GIBCO-BRL) usando el sistema CloneAmp (GIBCO-BRL) para crear pCGN5535 y la secuencia de \Delta6 desaturasa se verificó secuenciando2 (SEC ID NO:28) ambas cade ambas cadenas.
Para la expresión específica de semilla, la región de codificación de Ma524 se separó de pCGN5535 como un fragmento XhoI y se insertó en el sitio SalI del cassette de expresión napin, pCGN3223, para crear pCGN5536. El fragmento NotI del pCGN5536 que contiene la región reguladora 5', la región de codificación Ma524, y la región reguladora de 3' napin se insertó en el sitio NotI de pCGN1557 para crear pCGN5538. Se introdujo pCGN5538 en Brassica napus cv.LPOO4 mediante la transformación mediada por Agrobacterium.
Se recolectaron semillas maduras T2 de 6 eventos de transformación independientes en el invernadero. La composición de ácidos grasos de semillas únicas se analizó mediante cromatografía en gas. La Tabla 5 muestra los resultados de las semillas control LPOO4 y 6 líneas 5538. Todas las líneas 5538 excepto la número 8 produjeron semillas que contenían GLA. La presencia de GLA segregado en estas semillas es como se esperaba para la población de semillas T2 coloreada. Además del GLA, la \Delta6 desaturasa de M. alpina es capaz de producir ácido 18:4 (estearidónico) y otro ácido graso que se cree que es el 6,9-18:2.
Los resultados anteriores muestran que las desaturasas con tres especificidades de sustrato diferentes se pueden expresar en un sistema heterólogo y usar para producir ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga. Se ejemplificó la producción de ARA (20:4) a partir del precursor 20:3 (DGLA), y la producción de GLA (18:3) a partir del sustrato 18:2, y la conversión de 18:1 sustrato en 18:2, el cual es el precursor para GLA.
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1003
3
4
5 
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Ejemplo 9 Expresión de \Delta12 Desaturasa de M. alpina en Brassica napus
El ADNc de Ma648 se modificó mediante PCR para introducir sitios de clonación usando los siguientes cebadores:
Ma648PCR-hacia adelante (SEC ID NO:29)
5'-CUACUACUACUAGGATCCATGGCACCTCCCAACAACT
Ma648PCR-hacia atrás (SEC ID NO:30)
5'-CAUCAUCAUCAUGGTACCTCGAGTTACTTCTTGAAAAAGAC
Estos cebadores permitieron la amplificación de la región de codificación entera y añadieron un sitio BamHI en el extremo 5' y los sitios KpnI y XhoI al extremo 3'. El producto de la PCR se subclonó en Pamp1 (GIBCO-BRL) usando el sistema CloneAmp (GIBCO-BRL) para crear pCGN5540 y la secuencia de \Delta12 desaturasa se verificó secuenciando ambas cadenas.
Para la expresión específica de semilla, la región de codificación de Ma648 se separó de pCGN5540 como un fragmento BamHI/XhoI y se insertó entre el sitio BglII y XhoI del cassette de expresión napin, pCGN3223, para crear pCGN5542. El fragmento Asp718 del pCGN5541 que contiene la región reguladora 5' del napin, la región de codificación Ma648, y la región reguladora de 3' napin se insertó en el sitio Asp718 de pCGN5138 para crear pCGN5542. Se introdujo pCGN5542 en dos variedades de Brassica napus mediante la transformación mediada por Agrobacterium. Se usaron la variedad comercial de canola, SP30021, y la línea con bajo contenido de linolénico, LP30108.
Se recolectaron las semillas T2 coloreadas maduras de los 19 eventos independientes de transformación de LP30108 y un control no transformado cultivado en el invernadero. Estas semillas se esperaba que se segregaran para el trasgén \Delta12 desaturasa. La composición de ácidos grasos de los criaderos de 20 semillas se analizó mediante cromatografía en gas. Los resultados se muestran en la Tabla 6. Todas las líneas transformadas contenían niveles aumentados de 18:2, el producto de la \Delta12 desaturasa. Los niveles de 18:3 no se aumentaron significativamente en estas plantas. Los eventos número 11 y 16 mostraron la mayor acumulación de 18:2 en las semillas criadas. Para investigar la segregación de los niveles de 18:2 en las semillas T2 y para identificar las plantas individuales que se tomaran en las generaciones posteriores, se realizó un análisis de la mitad de la semilla. Las semillas germinaron durante la noche en la oscuridad a 30 grados sobre papel filtro remojado en agua. El cotiledón externo se separó para el análisis por cromatografía en gas y el resto del cultivo se plantó en tierra. Los resultados de algunos de estos análisis se muestran en la Tabla 7. Las semillas T2 individuales que contenían la \Delta12 desaturasa de M. alpina acumularon hasta el 60% de 18:2 en las semillas. La muestra 97xx1116 #59 es un ejemplo de un segregante nulo. Aún en los acumuladores más altos de 18:2, los niveles de 18:3 solo aumentaron ligeramente. Estas y otras plantas T2 seleccionadas individualmente se cultivaron en el invernadero y en el campo para producir la semilla T3.
Se recolectaron semillas T2 coloreadas maduras a partir de 20 eventos independientes de transformación SP30021 y un control no transformado cultivado en el invernadero. Estas semillas se esperaba que se segregaran para el transgen \Delta12 desaturasa. La composición de ácidos grasos de criaderos de 20 semillas se analizó mediante cromatografía de gas. Los datos se presentaron en la Tabla 8. Todas las líneas transformadas contenían niveles aumentados de 18:2, el producto de la \Delta12 desaturasa. Como en la línea LP30108 de bajo contenido en linolénico, los niveles de 18:3 no aumentaron significativamente. Los eventos número 4 y 12 mostraron la mayor acumulación de 18:2 en la semillas criadas. Para investigar la segregación de los niveles de 18:2 en las semillas T2 y para identificar plantas individuales para ser tomadas para generaciones posteriores, se realizó análisis alf-semilla. Las semillas germinaron durante la noche en la oscuridad a 30 grados en papel filtro remojado en agua. El cotiledón externo se separó para análisis por cromatografía de gas y el resto de las semillas se plantaron en tierra. Los resultados de estos análisis se muestran en la Tabla 9. Las muestras 97xx1157 # 88 y #18 son ejemplos de segregantes nulos para 5542-SSP30021-4 y 5542-SP30021-12 respectivamente. Estas y otras plantas T2 seleccionadas individualmente se cultivaron en el invernadero y en el campo para producir la semilla T3.
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14 
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Ejemplo 10 Expresión simultánea de 6 y 11.12 desaturasas de M. alpina en Brassica napus
Con el fin de expresar la \Delta6 y \Delta12 desaturasas de M. alpina a partir del mismo ADN-T, se realizó la siguiente construcción para la expresión específica de semilla.
El fragmento NotI de pCGN5536 contenido en la región reguladora 5' napin, la región de codificación Ma524 y la región reguladora 3' napin se insertó en el sitio NotI de pCGN5542 para crear pCGN5544. Los modelos de expresión se orientaron de manera que la dirección de transcripción de Ma524 y Ma648 y el marcador nptII es el mismo.
Se introdujo el pCGN5544 en Brassica napus cv.LP30108 mediante transformación mediada por Agrobacterium. Se recolectaron las semillas T2 coloreadas maduras de 16 eventos de transformación LP30108 independientes y un control no transformado que se cultivó en el invernadero. Estas semillas se esperaba que segregaran para el transgén desaturasas \Delta6+\Delta12. La composición de ácidos grasos de criaderos de 20 semillas se analizó mediante cromatografía de gas. Los resultados se presentan en la Tabla 10. Todas menos una de las líneas (5544-LP30108-3) muestra una composición de aceite alterada en comparación con los controles. Se produjo GLA en todas las líneas menos en 3 (-3, -4, -11); dos de las tres sin GLA (-4, -11) mostraron 18:2 aumentado indicador de la expresión de la \Delta12 desaturasa. Como un grupo, los niveles de GLA observados en plantas contenían la construcción doble \Delta6 + \Delta12 (pCGN5544) fueron mayores que los de las plantas que contenían pCGN5538 (\Delta6 solo). Además, los niveles del \Delta^{6\text{.}9} 18:2 son muy reducidos en las plantas que contienen la \Delta12 + \Delta6 en comparación con \Delta6 sola. De este modo, la combinación de las \Delta6 y \Delta12 desaturasas en un ADN-T conduce a la acumulación de más GLA y menos productos secundarios que la expresión de la \Delta6 desaturasa sola. Para investigar la segregación de los niveles de GLA en las semillas T2 y para identificar plantas individuales que se tomarán en las generaciones posteriores, se realizaron análisis de media semilla. Las semillas germinaron durante la noche en la oscuridad a 30 grados en papel filtro remojado en agua. El cotiledón externo se separó para análisis por cromatografía de gas y el resto de las semillas se plantaron en tierra. Los resultados de algunos de estos análisis se muestran en la Tabla 11. Como se esperaba para la población T2, los niveles de GLA y 18:2 son segregantes en las semillas individuales. Se observó un contenido de GLA de hasta el 60% del total de ácidos grasos en semillas individuales. Los eventos individuales se seleccionaron para cultivarse en el invernadero y en el campo para producir semilla T3.
Las plantas transgénicas que incluyen Brassica, soja, cártamo, maíz, linaza y girasol que expresan las construcciones de esta invención pueden ser una buena fuente de GLA.
Las fuentes típicas de GLA tales como la borraja producen como mucho un 25% de GLA. En cambio las plantas de la Tabla 10 contienen hasta un 30% de GLA. Además, las semillas individuales mostradas en la Tabla 11 contienen hasta un 60% de GLA.
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15
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1004
Ejemplo 11 Expresión simultánea de \Delta5 y \Delta6 desaturasas de M. alpina en Brassica napus
Con el fin de producir ácido araquidónico (AAR) en aceite de canola transgénico es necesario introducir las actividades \Delta5 y \Delta6 desaturasas. Con el fin de facilitar la caracterización corriente abajo y su cruce, puede ser ventajoso hacer que varias actividades sean codificadas por un solo ADN-T. El siguiente ejemplo ilustra la expresión simultánea de \Delta5 y \Delta6 desaturasas.
El fragmento Asp718 de pCGN5528 que contenía la región reguladora 5' napin, la región de codificación Ma29, y la región reguladora 3' napin se insertó en el sitio Asp718 de pCGN5138 para crear el pCGN5545. El fragmento NotI de pCGN5536 que contenía la región reguladora 5' napin, la región de codificación Ma524 y la región reguladora 3' napin se insertó en el sitio NotI de pCGN5545 para crear el pCGN5546. Los módulos de expresión se orientaron de manera que la dirección de la transcripción de Ma524 y Ma29 y el marcador nptII sea la misma.
Se introdujo el pCGN5546 se introdujo en Brassica napus cv.LP30108 mediante transformación mediada por Agrobacterium. Se recolectaron semillas T2 coloreadas maduras a partir de 30 eventos de transformación LP30108 independientes que se cultivaron en el invernadero. La composición de ácidos grasos de criaderos de 20 semillas se analizó mediante cromatografía de gas. Los resultados se muestran en la Tabla 12. Todas las líneas muestran la expresión de ambas desaturasas como se hace evidente por la presencia de \Delta^{5\text{.}9} 18:2 (como se ve en plantas pCGN5531) y \Delta^{6\text{.}9} 18:2 y GLA (como se observa en plantas de pCGN5538).
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Ejemplo 12 Expresión simultánea de \Delta5, \Delta6 y \Delta12 desaturasas de M. alpina en Brassica napus
Con el fin de lograr la producción óptima de ARA en aceite de canola transgénico pueden ser necesarias que estén presentes, tanto la actividad de \Delta6 como de \Delta12 además de la actividad \Delta5. Con el fin de facilitar la caracterización y la cruza corriente abajo puede ser ventajoso tener todas estas actividades codificadas por un solo ADN-T. El siguiente ejemplo ilustra la expresión simultánea de \Delta5, \Delta6 y \Delta12 desaturasas.
El fragmento HindIII de pCGN5528 que contenía la región reguladora 5' napin, la región de codificación Ma29, y la región reguladora 3' napin se insertó en el sitio HindIII de pCGN5544 para crear el pCGN5547. Los módulos de expresión se orientaron de manera que la orientación de la transcripción de Ma29, Ma524, Ma648 y el marcador nptII sea la misma.
Se introdujo el pCGN5547 en Brassica napus cv.LP30108 mediante transformación mediada por Agrobacterium. Se recolectaron semillas T2 coloreadas maduras a partir de 30 eventos de transformación LP30108 independientes que se cultivaron en el invernadero. Se analizó mediante cromatografía de gas la composición en ácidos grasos de criaderos de 20 semillas. Los resultados se muestran en la Tabla 13. Veintisiete de las líneas muestran acumulación significativa de GLA y en general los niveles de GLA observados son mayores que los vistos en las plantas 5546 que no contenían la \Delta12 desaturasa. La \Delta12 desaturasa parece ser activa en la mayoría de las líneas tal y como se evidencia por la falta de A6,9 18:2 detectable y los niveles elevados de 18:2 en la mayoría de las plantas. Cantidades pequeñas de \Delta5, 9 18:2 se ven en las plantas 5547, aunque los niveles generalmente son inferiores a los observados en las plantas 5546. Esto puede deberse a la presencia de la \Delta12 desaturasa, la cual convierte eficientemente el 18:1 en 18:2 antes de que se pueda desaturar en la posición \Delta5.
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1005
1006
Ejemplo 13 Distribución estereoespecífica de aceites \Delta6-desaturados
Este experimento se diseñó para investigar la distribución estereoespecífica de los aceites \Delta6 de saturados en semillas que expresan pCGN5538 (Ma524 ADNc). Se usaron tres muestras de semillas:
1)
Semillas cv. LP004 de B. napus no transformadas (control)
2)
Semillas T2 segregantes de pCGN5538-LP004-19
3)
Semillas T2 segregantes de pCGN5538-LP004-29
El siguiente protocolo se usó para el análisis:
1. Extracción de aceite de semilla
Se colocaron 50 semillas en un frasco de 12 x 32 mm y se trituraron con una varilla de vidrio. Se añadieron 1,25 mL de hexano y se licuó la mezcla. Las semillas se extrajeron durante la noche en un agitador. El extracto se filtró, a continuación, a través de un filtro de 0,2 micras unido a una jeringa de 1 cc. El extracto se secó bajo nitrógeno. El aceite resultante se usó para la digestión y la derivación de la muestra entera de aceite.
2. Digestión A. Digestión de aceite líquido
La lipasa fuente (procedente de Rhizopus arrhizus, Sigma, L4384) se diluyó a aproximadamente 600,000 unidades/mL con el objetivo de obtener la digestión al 50% de TAG. La lipasa fuente se mantuvo a 4ºC y se colocó sobre hielo. La cantidad de reactivos se puede ajustar de acuerdo con la cantidad de aceite que se va a digerir.
Las siguientes cantidades se basan en una muestra de aceite extraído de 2,0 mg. En un frasco de tapa roscable de 12 x 32 mm se añadió lo siguiente: 2,0 mg de aceite, 200 \muL de 0,1M tris HCl pH 7,40 gL de CaCl_{2} 2H_{2}O de 2,2% p/v de y 100 \muL de sales biliares al 0,05% p/v. El material se centrifugó y se sonicó para dispersar el aceite. Veinte \muL de lipasa diluida se añadió y la mezcla se centrifugó continuamente durante 1,0 minuto a temperatura ambiente. Se formó un precipitado blanco. La reacción se detuvo con 100 uL HCl 6M y se licuó. Se añadió quinientos uL de CHCl_{3}:CH_{3}OH (2:1) y la mezcla se licuó y se mantuvo sobre hielo al mismo tiempo que se llevaron a cabo las digestiones restantes. Las muestras se centrifugaron de nuevo y brevemente para afinar las capas. Se extrajo la capa inferior que contenía productos de la digestión con una pipeta pasteur y se colocó en un frasco de tapa ajustable de 12 x 32 mm. El material se volvió a extraer con 300 \muL de CHCl_{3}, se agitó, se centrifugó, y se combinó con las capas inferiores. Los productos de digestión se mantuvieron en hielo tanto como fue posible. La separación de cromatografía líquida de alto rendimiento se realizó tan pronto como fue posible después de la digestión para minimizar la migración de acilo.
B. Digestión de grasa sólida
Se siguió el procedimiento para la digestión de aceite líquido descrito anteriormente excepto que se añadieron 20 \muL de éster metílico 11:0 a 2,0 mg de grasa sólida.
3. Separación por cromatografía líquida de alto rendimiento
Los productos de la digestión se secaron en cloroformo hasta aproximadamente 200 \muL. Cada muestra se transfirió, a continuación, en un inserto en un frasco de concha de 8 x 40 mm y se inyectaron 30 \muL para análisis por cromatografía liquida de alto rendimiento.
El sistema cromatográfico líquido de alto rendimiento se equipó con un detector de dispersión de luz evaporativo Varex ELSD IIA con una temperatura de tubo a 105ºC y flujo de gas nitrógeno a 40 mL/min: un automuestrador Waters 712 Wisp, tres módulos de administración de disolvente Beckman 114M: un controlador Beckman 421A, un separador de corriente activado neumáticamente Rheodyne: y un microfraccionador Gilson. La columna de cromatografía es un cartucho de fase de silica normal de 5 micras de 220 x 4,6 mm hecho por Brownlee.
Los tres disolventes usados fueron:
A = hexano: tolueno 1:1
B = tolueno: acetato de etilo 3:1
C = 5% de ácido fórmico en acetato de etilo
El perfil gradiente fue como sigue:
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Tiempo (min) Función Valor Duración
Flujo 0 2,0 mL/min
0% B 10
0% C 2
2% C 25 6 min
14,0% C 2 1 min
15,0 Fin del programa 
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Una mezcla cromatográfica estándar se prepara en hexano:tolueno 1:1 conteniendo lo siguiente:
0,2 mg/mL de triglicérido 16:0
2,0 mg/mL de 16:0 ácido graso libre 0,2 mg/mL de di16:0 isómeros mezclados (1,2-diacilglicerol y 1,3-diacilglicerol)
0,2 mg/mL de 3-mono acilglicerol 16:0
0,2 mg/mL de 2-mono acilglicerol 16:0
Se recolectó automáticamente para cada muestra la fracción que contenía el pico de 2-mag mediante el método de relevos de eventos de tiempo controlado. Se usa un retardo de tiempo para sincronizar el detector con el emisor del recolector. Los picos de 2-mag se recolectan y las fracciones se evaporan a temperatura ambiente durante la
noche.
La composición sn-2 da como resultado el relevo en la minimización de la migración de acilo. La aparición de picos de 1-monoacilglicerol y/o 3-monoacilglicerol en el cromatógrafo significan que ha tenido lugar la migración acilo.
4. Derivación
Para derivar el aceite entero, se pesó 1,0 mg del aceite entero extraído en un frasco con tapa ajustada de 12 x 32 mm. A continuación, se añadió un mL de tolueno. La muestra se agitó y se extrajo una alícuota de 50 \muL para su derivación. A las muestras secas de 2-mag, se añadieron 50 \muL de tolueno. Tanto al aceite entero como a las fracciones 2-mag se añadieron 105 uL de H_{2}SO_{4}/CH_{3}OH @ 8,76% p. La tapa se ajustó herméticamente y la muestra se puso en reflujo durante una hora a 95ºC. La muestra se dejó enfriar y se añadieron 500 uL de NaCl al 10% p/v en agua y 60 uL de heptano. Se extrajo la capa orgánica y se colocó en un vial de tapa ajustable de 12 x 32 milímetros.
5. Análisis GLC.
Se preparó un cromatógrafo en gas Hewlett Packard modelo 6890 equipado con una entrada capilar de separador/sin separador, detector FID, automuestreador serie 6890 y un integrador Alfa Omega 3392A para la columna capilar como sigue:
A. Supelco Omegawax 250, 30 metros de longitud, 0,25 mm de diámetro interior, 0,25 um de espesor de película.
\newpage
puerto de inyección 260ºC
detector 270ºC
temperatura inicial 170 gc
tiempo inicial 1,5 minuto
velocidad 30 grados por minuto
temperatura final 245ºC
tiempo final 6,5 minutos
volumen de inyección 1,5 Ul
presión de cabeza 25 psi
velocidad de separación 30
gas portador He
gas de reemplazo N_{2}
gas del FID H + aire
Las composiciones porcentuales de ésteres metílicos de ácidos grasos se calculan como porcentajes molares. Para las longitudes de cadena de carbono menores de 12, es deseable el uso de factores de respuesta teóricos o empíricos en el cálculo porcentual del área.
6. Cálculos
Se calculó la distribución media de cada grupo acilo en cada posición sn-1 y sn-3.
composición media de sn-1 y sn-3 = (3 WO comp -MAG comp)/2
WO = aceite entero
MAG = monoacilglicerol
Los resultados de este análisis se presentan en la Tabla 14. El GLA y el \Delta^{6.9} 18:2 se distribuyen de manera uniforme entre las posiciones sn-2 y sn-1,3. Este análisis no puede discriminar entre ácidos grasos en las posiciones de sn-1 contra sn-3.
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1007
Ejemplo 14 Composiciones de ácidos grasos de plantas transgénicas
Se analizaron plantas transgénicas \Delta5 y \Delta6 para determinar su contenido en ácidos grasos.
Se usó el siguiente protocolo para la extracción de aceite:
1.
Se pesaron aproximadamente 400 mg de semillas por duplicado para cada muestra.
2.
Las semillas se trituraron en un mortero y su mano. El mortero y la mano se enjuagaron dos veces con 3 mL (2:1) (v:v) de CHCl_{3}:CH_{3}OH/MeOH. Se añadieron 6 mL adicionales (2:1) al frasco de vidrio de 20 mL (aceite extraído en un total de 12 mL 2:1).
3.
Las muestras se agitaron y se colocaron en un agitador orbital durante 2 horas con agitación ocasional.
4.
Se añadieron 5 mL de NaCl 1M a cada muestra. La muestra se revolvió, a continuación, se centrifugó en una centrífuga a 2000 rpm durante 5 minutos. La fase inferior se extrajo usando una pipeta pasteur.
5.
La fase superior se volvió a extraer con 5 mL adicionales. La muestra se revolvió, a continuación, se centrifugó en una centrífuga a 2000 rpm durante 5 minutos. La fase inferior se extrajo usando pipeta de pasteur y se añadió a la anterior fase inferior.
6.
Se evaporó el CHCl_{3}:CH_{3}OH/MeOH bajo nitrógeno usando enfriamiento evaporativo. El frasco que contenía el aceite extraído se selló bajo nitrógeno. Se extrajeron entre 120 mg y 160 mg para cada muestra.
Para el análisis de GC-MS, los ésteres metílicos de ácidos grasos se disolvieron en un volumen adecuado de hexano y se analizaron usando un cromatógrafo de gas Hewlett Packard 5890 Serie II Plus (Hewlett Packard, Palo Alto, California) equipado con una columna capilar de silicio fundido Omegawax 320 y de 30 m x 0,32 mm de diámetro interno (Supelco, Bellefonte, PA) y un detector selectivo de masa Hewlett Packard serie 5972. Se interpretó el espectro de masa mediante comparación con el espectro de masa de la base de datos de estructura química NIST/EPA/NIH usando la estación MS Chem (#G1036A) (Hewlett Packard).
Se analizó la línea transgénica 5531-6 por duplicado (A,B) y se comparó con la línea de control LP004-6. Los resultados del perfil de ácidos grasos se muestran en la Tabla 15.
La línea transgénica 5538-19 se analizó por duplicado (A,B) y se comparó con la línea de control LP004-6. Los resultados del perfil de ácidos grasos se muestran en la Tabla 16.
TABLA 15
Perfil de Ácidos Grasos
Control Control Transgénico Transgénico
LP004-6A LP004-6B 5531-6A 5531-6B
LRL-2043 LRL-2044 LRL-2042 LRL-2045
001 f0102.d 001 f0103.d 001 f0101.d 001 f0104.d
C12:0
C13:0
C14:0 0,053 0,061
C14:1
C15:0 isómero
C15:0
C16:0 4,107 4,034 4,257 4,224
TABLA 15 (continuación)
Control Control Transgénico Transgénico
LP004-6A LP004-6B 5531-6A 5531-6B
LRL-2043 LRL-2044 LRL-2042 LRL-2045
001 f0102.d 001 f0103.d 001 f0101.d 001 f0104.d
C16:1 0,181 0,173 0,200 0,199
C16:2 0,061 0,065 0,081 0,060
C17:0
C16:3 0,244 0,246 0,155 0,151
C16:4
C18:0 2,608 2,714 3,368 3,417
C18:1w9 65,489 66,454 59,529 59,073
C18:1w7 2,297 2,185 2,388 2,393
C18:2 5,9 6,144 6,269
C18:2w6 19,828 18,667 18,872 19,059
C18:3 5,9,12 0,469 0,496
C18:3w6 0,060
C18:3w3 1,587 1,587 1,428 1,418
C18:4w6
C18:4w3
C20:0 0,962 0,998 1,009 1,022
C20:1w11 1,336 1,335 1,058 1,065
C20:1.w9
C20:1w7 0,076 0,080
C20:2w6 0,073 0,073 0,052
C20:3w6
C20:4w6
C20:3w3
C20:4w3
C20:5w3
C22:0(1,000) 0,542 0,558 0,463 0,467
C22:1w11 0,038
TABLA 15 (continuación)
Control Control Transgénico Transgénico
LP004-6A LP004-6B 5531-6A 5531-6B
LRL-2043 LRL-2044 LRL-2042 LRL-2045
001 f0102.d 001 f0103.d 001 f0101.d 001 f0104.d
C22:1w9
C22:1w7 0,034
C21:5
C23:0 0,029
C22:4w6
C22:5w6
C22:5w3
C24:0 0,373 0,391 0,280 0,283
C22:6w3 0,314 0,317 0,223 0,212
C24:1w9
Total 100,000 100,000 100,000 100,000 
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TABLA 16
Perfil de Ácidos Grasos
5538-19A 5538-19B LP004-6A LP004-6B
Transgénico Transgénico Control Control
LRL-2166 LRL-2167 LRL-2168 LRL-2169
C6:0 0,004 0,005
C8:0 0,007 0,007 0,004 0,005
C10:0 0,012 0,012 0,008 0,008
C12:0 0,020 0,020 0,011 0,012
C13:0
C14:0 0,099 0,108 0,050 0,050
C14:1w5
C15:0 0,059 0,068 0,017 0,019
C16:0 5,272 5,294 4,049 4,057
TABLA 16 (continuación)
5538-19A 5538-19B LP004-6A LP004-6B
Transgénico Transgénico Control Control
LRL-2166 LRL-2167 LRL-2168 LRL-2169
C16:1 0,350 0,417 0,197 0,208
C16:2 0,199 0,187 0,076 0,077
C17:0 0,092 0,089 0,078 0,077
C12:0 0,020 0,020 0,011 0,012
C13:0
C14:0 0,099 0,108 0,050 0,050
C14:1w5
C15:0 0,059 0,068 0,017 0,019
C16:0 5,272 5,294 4,049 4,057
C16:1 0,350 0,417 0,197 0,208
C18:3w6 12,565 12,595 0,013 0,015
C18:3w3 1,084 1,137 1,501 1,542
C18:4 0,017 0,013 0,011 0,008
C18:4 0,028 0,024
C20:0 1,138 1,104 0,937 0,943
C20:1 1,115 1,085 1,330 1,327
C20:2w6 0,150 0,143 0,068 0,071
C20:3w6 0,026 0,025 0,014 0,012
C20:4w6
C20:3w3
C20:4w3
C20:5w3
C22:0 0,506 0,484 0,535 0,539
C22:1 0,017 0,020 0,032 0,032
C21:5 0,040 0,030 0,031
C22:4w6 0,038 0,064 0,015 0,014
C22:5w6
C22:5w3 0,023 0,018 0,021 0,017
C24:0 0,352 0,321 0,353 0,362
TABLA 16 (continuación)
5538-19A 5538-19B LP004-6A LP004-6B
Transgénico Transgénico Control Control
LRL-2166 LRL-2167 LRL-2168 LRL-2169
C22:6w3 0,009
C24:1w9 0,129 0,121 0,260 0,255
Total 100,000 100,000 100,000 100,000
Ejemplo 15 Expresión combinada de \Delta6 y \Delta12 desaturasas en B. Napus lograda por cruce
Las plantas que contenían la \Delta6 o \Delta12 desaturasa se cruzaron y se analizaron medias semillas individuales F1 para determinar la composición de ácidos grasos mediante GC. Los datos de uno de estos cruces se dan en la Tabla 17. Los padres para el cruce fueron 5538-LP004-25-2-25 (expresa \Delta6) y 5542-SP30021-10-16 (expresa \Delta12). Se hicieron cruces recíprocos y se muestran en la tabla los resultados de 25 semillas F1 individuales de cada uno. Los cruces se describen de manera que el primer padre indicado es el femenino. Ambos conjuntos de cruces dieron aproximadamente los mismos resultados. En comparación con los padres, el \Delta^{6.9} 18:2 disminuyó, y el GLA aumentó. Los niveles de \Delta^{9.12} 18:2 aumentaron en la mayoría de las F1. Nótese que éstas eran semillas F1 y sólo contienen un conjunto de cada desaturasa. En generaciones futuras y selección de eventos homocigotos para desaturasa, los niveles obtenidos de GLA en F2 pueden ser todavía mayores.
Puede ser en algunas situaciones preferible combinar rasgos mediante cruce a combinar rasgos en un ADN-T. Particularmente, si ambos genes se extraen del mismo 5 promotor (en este caso napin), surge el promotor de silenciamiento que puede favorecer esta aproximación al sobreponer múltiples ADNc en una construcción.
De manera alternativa, en algunos casos, combinar múltiples ADNc en un AON-T puede ser el método de elección. Los resultados se muestran en la Tabla 17.
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(Tabla pasa a página siguiente)
1008
1009
1010
Ejemplo 16 Expresión de desaturasas de M. alpina en semilla de soja
Las desaturasas de M. alpina se pueden usar para conducir la producción de GLA y otros PUFA en semilla de soja mediante el uso de las siguientes construcciones de expresión. Dos medios mediante los cuales el ADN exógeno se puede insertar en el genoma de la semilla de soja son la infección de Agrobacterium o el cañón de partículas. La transformación por cañón de partículas se describe en la P US 5,503,998. Las plantas se pueden seleccionar usando un marcador de resistencia a glifosfato (4,971,908). La transformación por Agrobacterium de la semilla de soja está bien establecida para una persona con experiencia ordinaria en la materia.
Para la expresión específica de la semilla, las regiones de codificación de los ADNc desaturasa se colocan bajo el control de la región reguladora 5' del gen de proteína de almacenamiento de la conglicina beta tipo alfa Glycine max. La región específica que se puede usar son los nucleótidos 78-921 de gi 1.69928 (Doyle, J.J., Schuler, M.A., Godette, W.D., Zenger, V., Beachy, R.N., y Slightom J.L., 1986 J. Biol. Chem. 261 (20), 9228-9238). La región reguladora 3' que se puede usar procede del gen de la subunidad menor de la ribulosa 1,5 bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (rbcS) de guisante. Las secuencias específicas que se van a usar son los nucleótidos 1-645 de gi 169145 (Hunt, A.G. 1998 ADN 7:329-336).
Ya que las semillas de soja contienen más 18:2, y tal vez más actividad \Delta12 desaturasa endógena que Brassica, el efecto de la \Delta12 desaturasa de Mortierella en alcanzar niveles óptimos de GLA se puede probar como sigue. Una construcción que contiene el ADNc \Delta6 se puede usar para ver si \Delta^{6\text{.}9} 18:2 se produce junto con GLA. Una construcción que contiene la \Delta12 desaturasa se puede usar para ver si la cantidad de 18:2 se puede aumentar en soja. Una construcción que contiene tanto la desaturasa \Delta6 como la \Delta12 se puede usar para producir niveles óptimos GLA. De manera alternativa, las plantas que contienen cada una de las desaturasas solas se pueden cruzar, si es necesario, para combinar los genes.
Se pueden hacer construcciones similares para expresar la \Delta5 desaturasa sola, o en combinación con \Delta12 y/o \Delta6 desaturasas.
Ejemplo 17 Secuencias de gen de desaturasa humana
Se aislaron las secuencias de genes desaturasa humanas, potencialmente involucradas en la biosíntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga basándose en la homología entre las secuencias de ADNc humano y las secuencias del gen de desaturasa de Mortierella alpina Se encontraron las tres "cajas de histidina" conservadas que se sabe que se conservan entre las desaturasas unidas a la membrana. Como con otras desaturasas unidas a la membrana, se encontró que el motivo final de la caja de histidina HXXHH era QXXHH. La secuencia de aminoácidos de las desaturasas humanas presuntas exhibieron homología con las \Delta5, \Delta6, \Delta9, y \Delta12 desaturasas de M. alpina.
Las secuencias de ADNc de \Delta5 desaturasa y \Delta6 desaturasa de M. alpina se usaron para consultar la base de datos Lifeseq de Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, California 94304. La secuencia de \Delta5 desaturasa se dividió en fragmentos: (1) aminoácidos números 1-150; (2) aminoácidos números 151-300; y (3) aminoácidos números 301-446. La secuencia de \Delta6 desaturasa se dividió en tres fragmentos: (1) aminoácidos números 1-150; (2) aminoácidos números 151-300; y (3) aminoácidos números 301-457. Estos fragmentos de polipéptido se investigaron en la base de datos usando el algoritmo "tblastn". Este algoritmo compara una secuencia de consulta de proteína con una base de datos de secuencias de nucleótidos dinámicamente traducidas en los seis marcos de lectura (ambas cadenas).
Los fragmentos polipeptídicos 2 y 3 de \Delta5 y \Delta6 de M. alpina tienen homologías con las secuencias del CloneID como se presenta en la Tabla 18. El ClonID representa una secuencia individual a partir de la base de datos LifeSeq de Incyte. Después de que se revisaran los resultados de "tblastn", se buscó información del clon con los valores de referencia por omisión de rigor de 50, y Productscore 100 para diferentes números de CloneID. Los resultados de información de clon desplegaron la información que incluye ClusterID, CloneID, Biblioteca, HitID, Descripción de Hit (golpe). Cuando se seleccionaron, el número ClusterID desplegó la información de clon de todos los clones que pertenecían a ese ClusterID. El comando de Assemble (ensamblar) ensambla todos los CloneID que comprenden el ClusterID. Se usaron los siguientes valores de referencia por omisión para el ensamble GCG (Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin 53705):
\newpage
Tamaño de palabra 7
Solapamiento mínimo 14
Rigor 0,8
Identidad mínima 14
Hueco máximo 10
Peso del hueco: 8
Peso de longitud: 2
Los resultados del ensamblaje GCG desplegaron los contigs generados en base a la información de secuencia dentro de la CloneID. Un "contig" es una alineación de secuencia de ADN basada en áreas de homología entre estas secuencias. Se generó una nueva secuencia (secuencia de consenso) basándose en las secuencias de ADN alineadas en un contig. Se identificó el contig que contenía la CloneID, y se editaron los sitios ambiguos de la secuencia de consenso basándose en la alineación de las CloneIDs (véase SEC ID NO:31-SEC ID NO:35) para generar la mejor secuencia posible. El procedimiento se repitió para los seis CloneID listados en la Tabla 18. Esto produjo cinco contigs únicos. Las secuencias consenso editadas de los 5 contigs se importaron al programa de software Sequencher (Gene Codes Corporation, A,nn Arbor, Michigan 48 105). Estas secuencias consenso se ensamblaron. El contig 2511785 se solapa con el contig 3506132, y este nuevo contig se denominó 2535 (SEC ID NO:37). Los contigs del programa Sequencher se copiaron en el paquete de software de análisis de secuencias del GCG.
Cada contig se tradujo en los seis marcos de lectura en secuencias de proteínas. Las secuencias \Delta5 (Ma29) y \Delta6 (Ma524) de M. alpina se compararon con cada uno de los contigs traducidos usando la búsqueda FastA (una búsqueda de Pearson y Lipman para determinar la similitud entre una secuencia de consulta y un grupo de secuencias del mismo tipo (ácido nucleico o proteína)). La homología entre estas secuencias sugiere los marcos de lectura abiertos de cada contig. La homología entre \Delta5 y \Delta6 de M. alpina con los contigs 2535 y 3854933 se utilizó para crear el contig final denominado 253538a. La Figura 9 es la selección por comparación FastA del contig final 253538a y Ma29, y la Figura 10 es la selección por comparación FastA del contig final 253538a. y Ma524. Las secuencias de ADN para los distintos contigs se presentan en SEC ID NO:31-SEC ID NO:37 Las distintas secuencias de péptidos se muestran en SEQ ID NO:38-SEC ID NO:44.
Aunque el marco de lectura abierta se generó combinando los dos contigs, el contig 2535 muestra que existe una única secuencia en el inicio de este contig que no coincide con el contig 3854933. Por lo tanto, es posible que estos contigs se generaran a partir de genes humanos similares a desaturasa independientes.
El contig 253538a contiene un marco de lectura abierto que codifica 432 aminoácidos. Comienza con Gln (CAG) y termina con el codón de parada (TGA). El contig 253538a se alinea tanto con la secuencia \Delta5 como \Delta6 de M. alpina, sugiriendo que podría ser cualquiera de las dos desaturasas, así como otras desaturasas conocidas que comparten homología entre sí. Los contigs individuales listados en la Tabla 18, así como el contig intermedio 2535 y el contig final 253538a se pueden utilizar para aislar los genes completos de desaturasas humanas.
Usos de las desaturasas humanas
Estas secuencias humanas se pueden expresar en levaduras y plantas que utilizan los procedimientos descritos en los ejemplos anteriores. Para la expresión en células de mamíferos y animales transgénicos, estos genes pueden proporcionar una desviación de codón superior. Además, estas secuencias se pueden usar para aislar genes desaturasa relacionados con otros organismos.
TABLA 18
Secciones de las CloneID de la Base Palabra clave
Desaturasas de Datos LifeSeq
151-300 \Delta5 3808675 Desaturasa de ácido graso
301-446 \Delta5 354535 \Delta6
151-300 \Delta6 3448789 \Delta6
151-300 \Delta6 1362863 \Delta6
151-300 \Delta6 2394760 \Delta6
301-457 \Delta6 3350263 \Delta6
Ejemplo 18 Identificación de Homólogos a las \Delta5 y \Delta6 desaturasas de M. alpina
Se identificó una secuencia de ácido nucleico que codifica una presunta \Delta5-desaturasa a través de la búsqueda de TBLASTN de las bases de datos de secuencias tag expresadas a través de NCBI usando los aminoácidos 100-446 de Ma29 como consulta. La porción truncada de la secuencia Ma29 se usó para evitar recoger homologías basadas en la porción de citocromo b5 en el término N de la desaturasa. La secuencia de aminoácidos deducida de un est de Dictyostelium discoideum (número de acceso C25549) muestra una homología muy significativa con Ma29 y una menor, aunque todavía homología significativa, con Ma524. La secuencia de ADN se presenta como SEC ID NO:45. La secuencia de aminoácidos se presenta como SEC ID NO:46.
Ejemplo 19 Identificación de Homólogos de \Delta5 y \Delta6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFAs
Para buscar las desaturasas involucradas en la producción de PUFA, se construyó una biblioteca de ADNc a partir del ARN total aislado de Phaeodactylum tricornutum. Se construyó una biblioteca de ADNc basada en plásmido en pSPORT1 (GIBCO-BRL) siguiendo las instrucciones del fabricante usando un kit comercialmente disponible (GIBCO-BRL). Se secuenciaron clones de ADNc aleatorios y se identificaron las secuencias de ácido nucleico que codifican presuntas \Delta5 o \Delta6 desaturasas a través de la búsqueda BLAST de las bases de datos y la comparación con las secuencias de Ma29 y Ma524.
Se identificó un clon de la biblioteca del Phaeodactylum con homología con Ma29 y Ma524; se denomina 144-011-B12. La secuencia de ADN se presenta como SEC ID NO:47. La secuencia de aminoácidos se presenta como SEC ID NO:48.
Ejemplo 20 Identificación de homólogos de \Delta5 y \Delta6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFAs
Para buscar las desaturasas involucradas en la producción de PUFA, se construyó una biblioteca de ADNc a partir de ARN total aislado de la especie Schizochytrium. Se construyó una biblioteca de ADNc basada en plásmido en pSPORT1 (GIBCO-BRL) siguiendo las instrucciones del fabricante usando un kit disponible comercialmente (GIBCO-SRL). Se secuenciaron clones de ADNc aleatorios y se identificaron secuencias de ácido nucleico que codifica presuntas \Delta5 o \Delta6 desaturasas a través de la búsqueda BLAST de las bases de datos y la comparación con las secuencias de Ma29 y Ma524.
Se identificó un clon de la biblioteca de Schizochytrium con homología con Ma29 y Ma524; se denominó 81-23-C7. Este clon contenía un inserto de aproximadamente 1 kb. Se obtuvo la secuencia parcial a partir de cada extremo del clon usando los cebadores de secuenciamiento universales hacia adelante y hacia atrás. La secuencia de ADN procedente del cebador delantero se presenta como SEC ID NO:49. La secuencia del péptido se presenta como SEC ID NO:50. La secuencia de ADN procedente del cebador inverso se presenta como SEC ID NO:51. La secuencia de aminoácidos del cebador inverso se presenta como SEC ID NO:52.
Ejemplo 21 Composiciones Nutricionales
Los PUFA de los ejemplos previos se pueden usar en varios complementos nutricionales, formulaciones para lactantes, sustitutos nutricionales y otras soluciones nutricionales.
I. Formulaciones para niños A. Isomil® Fórmula de Soja con Hierro
Uso: Como bebida para lactantes, niños y adultos con una alergia o sensibilidad a la leche de vaca. Una alimentación para pacientes con desórdenes para los cuales se debe evitar la lactosa: deficiencia de lactasa, intolerancia a la lactosa y galactosemia.
Características:
Aislado de proteína de soja para evitar los síntomas de alergia o sensibilidad a la proteína de la leche de vaca;
Formulación sin lactosa para evitar diarrea asociada con lactosa;
Osmolalidad baja (240 mOsm/kilogramos de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmótica;
Carbohidratos duales (jarabe de maíz y sacarosa) designadas para aumentar la absorción de carbohidratos y reducir el riesgo de exceder la capacidad de absorción del intestino dañado;
1,8 mg de hierro (como sulfato terroso) por 100 calorías para ayudar a prevenir la deficiencia de hierro;
Niveles recomendados de vitaminas y minerales;
Aceites vegetales para proporcionar los niveles recomendados de ácidos grasas esenciales.
Color blanco de leche, consistencia similar a la leche y aroma placentero.
Ingredientes: (Pareve, 10000) 85% de agua, 4,9% de jarabe de maíz, 2,6% de azúcar (sacarosa), 2,1% de aceite de soja, 1,9% de aislado de proteína de soja, 1,4% de aceite de coco, 0,15% de citrato de calcio, 0,11% de fosfato de calcio tribásico, citrato de potasio, fosfato de potasio monobásico, cloruro de potasio, mono y diglicéridos, lecitina de soja, carragenina, ácido ascórbico, L-metionina, cloruro de magnesio, fosfato de potasio dibásico, cloruro de sodio, cloruro de colina, taurina, sulfato terroso, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro de potasio, filoquinona, biotina, selenita de sodio, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
B. Isomil® DF Fórmula de Soja para Diarrea
Uso: Como alimentación a corto plazo para el manejo dietético de diarrea en lactantes y bebés.
Características:
Primera fórmula para lactantes en contener fibra dietética añadida a partir de fibra de soja específicamente para el manejo de la diarrea.
Clínicamente muestra reducir la duración de producción de heces flojas, aguadas, durante diarrea de ligera a severa en niños.
Nutricionalmente completa para satisfacer las necesidades nutrimentales del lactante.
Aislado de proteína de soja con L-metionina añadida que satisface o excede los requerimientos de todos los aminoácidos esenciales del lactante.
Formulación sin lactosa para evitar diarrea asociada con lactosa;
Osmolalidad baja (240 mOsm/kilogramo de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmótica.
Carbohidratos duales (jarabe de maíz y sacarosa) designadas para aumentar la absorción de carbohidrato y reducir el riesgo de exceder la capacidad de absorción del intestino dañado;
Satisface o excede los niveles de vitaminas o minerales recomendados por el Comité sobre Nutrición de la Academia Norteamericana de Pediatría y los requeridos por la Ley de Fórmula para Lactantes.
1,8 miligramos de hierro (como sulfato ferroso) por 100 calorías para ayudar a prevenir la deficiencia de hierro.
Aceites vegetales para proporcionar los niveles recomendados de ácidos grasos esenciales.
Ingredientes: (Pareve, 10000) 86% de agua, 4,8% de jarabe de maíz, 2,5% de azúcar (sacarosa), 2,1% de aceite de soja, 2,0% de aislado de proteína de soja, 1,4% de aceite de coco, 0,77% de fibra de soja, 0,12% de citrato de calcio, 0,11% de fosfato de calcio tribásico, 0,10% de citrato de potasio, cloruro de potasio, fosfato de potasio monobásico, mono y diglicéridos, lecitina de soja, carragenina, cloruro de magnesio, ácido ascórbico, L-metionina, fosfato de potasio dibásico, cloruro de sodio, cloruro de colina, taurina, sulfato terroso, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro de potasio, filoquinona, biotina, selenita de sodio, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
C. Isomil® SF Fórmula de Soja sin Sacarosa con Hierro
Uso: Como bebida para lactantes, niños y adultos con alergia o sensibilidad a la proteína de la leche de vaca o una intolerancia a la sacarosa. Una alimentación para pacientes con desórdenes para los cuales debería evitarse la lactosa y la sacarosa.
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Características:
Aislado de proteína de soja para evitar síntomas de alergia o sensibilidad a la proteína de la leche de vaca;
Formulación sin lactosa para evitar diarrea asociada a lactosa;
Libre de sacarosa para el paciente que no puede tolerar la sacarosa;
Osmolalidad baja (180 mOsm/kilogramo de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmótica;
1,8 miligramos de hierro (como sulfato ferroso) por 100 calorías para ayudar a prevenir la deficiencia de hierro;
Niveles recomendados de vitaminas y minerales;
Aceites vegetales para proporcionar los niveles recomendados de ácidos grasos esenciales;
Color blanco de leche, consistencia parecida a la leche y aroma agradable.
Ingredientes: (Pareve, 10000) 75% de agua, 11,8% de almidón de maíz hidrolizado, 4,1% de aceite de soja, 4,1% de aislado de aislado de proteína de soja, 2,8% de aceite de coco, 1,0% de almidón de maíz modificado, 0,38% de fosfato de calcio tribásico, 0,17% de citrato de potasio, 0,13% de cloruro de potasio, mono y diglicéridos, lecitina de soja, cloruro de magnesio, ácido ascórbico, L-metionina, carbonato de calcio, cloruro de sodio, cloruro de colina, carragenina, taurina, sulfato terroso, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro de potasio, filoquinona, biotina, selenita de sodio, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
D. Isomil® 20 Fórmula de Soja con Hierro lista para alimento, 20 calorías/fl oz
Uso: Cuando se desea una alimentación con soja.
Ingredientes: (Pareve, 10000) 85% de agua, 4,9% de jarabe de maíz, 2,6% de azúcar (sacarosa), 2,1% de aceite de soja, 1,9% de aislado de proteína de soja, 1,4% de aceite de coco, 0,15% de citrato de calcio, 0,11% de fosfato de calcio tribásico, citrato de potasio, fosfato de potasio monobásico, cloruro de potasio, mono y diglicéridos, lecitina de soja, carragenina, ácido ascórbico, L-metionina, cloruro de magnesio, fosfato de potasio dibásico, cloruro de sodio, cloruro de colina, taurina, sulfato terroso, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro de potasio, filoquinona, biotina, selenita de sodio, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
E. Similac® Fórmula para lactante
Uso: Cuando se necesita una fórmula para lactante: si se toma la decisión de descontinuar la alimentación con pecho antes de la edad del año de edad, si se necesita un suplemento a la alimentación al pecho o como alimentación de rutina si no se adopta la alimentación al pecho.
Características:
Proteína de calidad y cantidad adecuada para el buen desarrollo; desnaturalizada por calor, lo que reduce el riesgo de pérdida de sangre entérica asociada con la leche;
Grasa de una mezcla de aceites vegetales (doblemente homogeneizados), que proporciona ácido linoleico esencial que se absorbe fácilmente;
Carbohidrato como lactosa en proporción similar a la de la leche humana;
Carga de soluto renal bajo para minimizar la tensión en los órganos que se desarrollan;
Formas en polvo, líquido concentrado y listo para tomarse.
Ingredientes: (10000-D) agua, leche descremada, lactosa, aceite de soja, aceite de coco, mono y diglicéridos, lecitina de soja, ácido ascórbico, carragenina, cloruro de colina, taurina, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, niacinamida, sulfato terroso, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, biotina, selenita de sodio, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
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F. Similac® NeoCare Fórmula con hierro para lactantes prematuros
Uso: Para las necesidades nutricionales especiales del lactante prematuro después de la salida del hospital. Similac NeoCare es una fórmula nutricionalmente completa desarrollada para proporcionar a los lactantes prematuros calorías, proteínas, vitaminas y minerales extraordinarios necesarios para promover la ganancia de peso y apoyar su desarrollo.
Características:
Reduce la necesidad de complementación calórica y de vitaminas. Más calorías (22 calorías/fl oz) que las fórmulas para el término estándar (20 calorías/fl oz);
Mezcla de grasas altamente absorbidas, con triglicéridos de cadena media (aceite MCT) para ayudar a satisfacer las necesidades digestivas especiales de los lactantes prematuros;
Altos niveles de proteínas, vitaminas y minerales cada 100 calorías para extender el soporte nutricional iniciado en el hospital.
Más calcio y fósforo para mejorar la mineralización de los huesos.
Ingredientes: 10000-D sólidos de jarabe de maíz, leche descremada, lactosa, concentrado de proteína de suero de leche, aceite de soja, aceite de cártamo con alto contenido oleico, aceite de coco fraccionado (triglicéridos de cadena media), aceite de coco, citrato de potasio, fosfato de calcio tribásico, carbonato de calcio, ácido ascórbico, cloruro de magnesio, cloruro de potasio, cloruro de sodio, taurina, sulfato terroso, m-inositol, cloruro de colina, palmitato de ascorbilo, L-carnitina, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, niacinamida, tocoferoles mezclados, citrato de sodio, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, clorhidrato de cloruro de tiamina, palmitato de vitamina A, beta caroteno, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, biotina, selenita de sodio, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
G. Similac Natural Fortificador de leche humana baja en hierro de cuidado natural lista para su uso, 24 calorías/fl oz
Uso: Diseñada para mezclarse con leche humana o para alimentarse alternativamente con leche humana para lactantes de bajo peso al nacer.
Ingredientes: 10000-D agua, leche descremada, almidón de maíz hidrolizacto, lactosa, aceite de coco fraccionado (triglicéridos de cadena media), concentrado de proteína 10 de suero de leche, aceite de soja, aceite de coco, fosfato de calcio tribásico, citrato de potasio, cloruro de magnesio, citrato de sodio, ácido ascórbico, carbonato de calcio, mono y diglicéridos, lecitina de soja, carragenina, cloruro de colina, m-inositol, taurina, niacinamida, L-carnitina, acetato de alfa tocoferilo, sulfato de zinc, cloruro de potasio, pantotenato de calcio, sulfato terroso, sulfato cúprico, riboflavina, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, biotina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, vitamina D_{3}, selenita de sodio y cianocobalamina.
Se pueden sustituir y/o añadir varios PUFA de esta invención a las fórmulas para lactante s descritas anteriormente y a otras fórmulas para lactantes conocidas para los expertos en la técnica.
II. Formulaciones nutritivas A. ENSURE®
Uso: ENSURE es un alimento líquido de bajo contenido en residuos diseñado principalmente como un complemento nutricional oral para ser usado con o entre comidas o, en cantidades adecuadas como sustituto de una comida. ENSURE está libre de lactosa y de gluten, y es conveniente para su uso en dietas modificadas, incluyendo dietas bajas en colesterol. Aunque principalmente es un suplemento oral, se puede alimentar por tubo.
Condiciones del Paciente
Para pacientes con dietas modificadas;
Para pacientes ancianos con riesgo de nutrición;
Para pacientes con pérdida de peso involuntaria;
Para pacientes que se recuperan de una enfermedad o cirugía;
Para pacientes que necesitan una dieta de bajo contenido en residuos.
Ingredientes: 10000-D, Agua, azúcar (sacarosa), maltodextrina (maíz), caseinatos de calcio y de sodio, aceite de cártamo con alto contenido en oleico, aislado de proteína de soja, aceite de soja, aceite de canola, citrato de potasio, fosfato de calcio tribásico, citrato de sodio, cloruro de 20 magnesio, fosfato de magnesio dibásico, sabor artificial, cloruro de sodio, lecitina de soja, cloruro de colina, ácido ascórbico, carragenina, sulfato de zinc, sulfato ferroso, acetato de alfa-tocoferilo, goma de gelan, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato de manganeso, 25 sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, ácido fólico, molibdato de sodio, cloruro de cromo, biotina, yoduro de potasio, selenato de sodio.
B. ENSURE® BARRAS
Uso: ENSURE BARRAS es una nutrición equilibrada, completa para uso complementario entre o con las comidas. Proporciona una alternativa deliciosa, rica en nutrientes 35 a otros refrigerios. ENSURE BARS contiene menos de 1 gramo de lactosa/por barra, y el sabor a Brownie de chocolate está libre de gluten. (El sabor Honey Graham Crunch contiene gluten).
Condiciones del Paciente
Para pacientes que necesitan calorías, proteínas, vitaminas y minerales extras.
Especialmente útil para personas que no toman suficientes calorías y nutrientes;
Para personas que tienen la capacidad de masticar y deglutir;
No para ser usado por personas con alergia a los cacahuetes o a cualquier tipo de alergia a las nueces.
Ingredientes
Honey Graham Crunch-Jarabe de maíz con alto contenido en fructuosa, aislado de proteína de soja, azúcar moreno, miel, maltodextrina (maíz), arroz inflado (arroz molido, azúcar [sacarosa], sal [cloruro de sodio] y malta), salvado de avena, aceites de semilla de algodón y de soja parcialmente hidrogenados, polisacárido de soja, glicerina, concentrado de proteína de suero de leche, polidextrosa, fructosa, caseinato de calcio, polvo de cacao, sabores artificiales, aceite de canola, aceite de cártamo con alto contenido oleico, leche seca desgrasada, polvo de suero de leche, lecitina de soja y aceite de maíz. Fabricado en unas instalaciones que procesan nueces.
Vitaminas y minerales
Fosfato de calcio tribásico, fosfato de potasio dibásico, óxido de magnesio, sal (cloruro de sodio), cloruro de potasio, ácido ascórbico, ortofosfato férrico, acetato de alfa-tocoferilo, niacinamida, óxido de zinc, pantotenato de calcio, gluconato de cobre, sulfato de manganeso, caroteno, clorhidrato de piridoxina, mononitrato de tiamina, ácido fólico, biotina, cloruro de cromo, yoduro de potasio, selenato de sodio, molibdato de sodio, filoquinona, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
Proteína
Honey Graham Crunch -La fuente de proteína es una mezcla de aislado de proteína de soja y proteínas de leche.
Aislado de proteína de soja 74%
Proteínas de leche 26%
Grasas
Honey Graham Crunch -La fuente de grasa es una mezcla de aceites parcialmente hidrogenados de semilla de algodón y de soja, aceites de canola (semilla de colza), cártamo con alto oleico, y de maíz y lecitina de soja.
Aceites semilla de maíz y de soja hidrogenadas parcialmente 76%
Aceite de canola 8%
Aceite de cártamo con alto oleico 8%
Aceite de maíz 4%
Lecitina de soja 4%
Carbohidratos
Honey Graham Crunch -La fuente de carbohidratos es una combinación de jarabe de maíz alto en fructosa, azúcar moreno, maltodextrina, miel, arroz inflado, glicerina, polisacárido de soja, y salvado de avena.
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Jarabe de maíz alto en fructosa 24%
Azúcar moreno 21%
Maltodextrina 12%
Miel 11%
Arroz inflado 9%
Glicerina 9%
Polisacárido de soja 7%
Salvado de avena 7%
C. ENSURE ALTA PROTEINA
Uso: ENSURE ALTA PROTEÍNA es un concentrado alto en proteínas de alimento líquido diseñado para personas que requieren calorías, proteínas, vitaminas y minerales adicionales en sus dietas. Se puede usar como complemento nutricional oral o entre comidas o en cantidades adecuadas como sustituto de una comida. ENSURE ALTA PROTEÍNA está libre de lactosa y de gluten, y es conveniente para su uso por personas que se recuperan de cirugía general o fracturas de cadera y por pacientes con riesgo de úlceras por presión.
Condiciones del Paciente
Para pacientes que requieren calorías, proteínas vitaminas y minerales adicionales, tales como los pacientes que se recuperan de cirugía general o de fracturas de cadera, pacientes con riesgo de úlceras por presión, y pacientes en dietas bajas en colesterol.
Características
Bajo en grasas saturadas;
Contiene 6 gramos de grasa total y menos de miligramos de colesterol por ración;
Sabor rico cremoso;
Excelente fuente de proteína, calcio, y otras vitaminas y minerales esenciales para dietas bajas en colesterol;
Libre de lactosa, fácilmente digerido.
Ingredientes
Supremo de Vainilla: Agua 10000-O, azúcar (sacarosa), maltodextrina (maíz), caseinatos de calcio y de sodio, aceite de cártamo con alto contenido oleico, aislado de proteína de soja, aceite de soja, aceite de canola, citrato de potasio, fosfato de calcio tribásico, citrato de sodio, cloruro de magnesio, fosfato de magnesio dibásico, sabor artificial, cloruro de sodio, lecitina de soja, cloruro de colina, ácido ascórbico, carragenina, sulfato de zinc, sulfato ferroso, acetato de alfa-tocoferilo, goma de Gellan, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato de manganeso, sulfato de cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, ácido fólico, molibdato de sodio, cloruro de cromo, biotina, yoduro de potasio, selenato de sodio, filoquinona, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
Proteína
La fuente de proteína es una mezcla de dos proteínas de alto valor biológico: caseína y soja.
Caseinatos de sodio y calcio 85%
Aislado de proteína de soja 15%
Grasas
La fuente de grasa es una mezcla de tres aceites: cártamo con alto contenido oleico, canola, y soja.
Aceite de cártamo alto en oleico 40%
Aceite de canola 30%
Aceite de soja 30%
El nivel de grasa en ENSURE ALTA PROTEINA satisface los requisitos de la American Heart Association (AHA). Los 6 gramos de grasa en ENSURE ALTA PROTEINA representan el 24% de las calorías totales, con un 2,6% de grasa procedente de ácidos grasos saturados y 7,9% de ácidos grasos poliinsaturados. Estos valores están dentro de los requisitos de la American Heart Association de 30% de calorías totales de grasa, <10% de calorías de ácidos grasos saturados, y 10 de calorías totales de ácidos grasos poliinsaturados.
Carbohidratos
ENSURE ALTA PROTEINA contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. La dulzura suave Y la variedad de sabores (supremo de vainilla, chocolate royal, mora silvestre y plátano), más VARI-FLAVORSO® Flavor pacs en nuez, cereza, fresa, limón y naranja ayudan a evitar la fatiga de sabor y ayudan a satisfacer el gusto del paciente.
Sabores vainilla y otros sin chocolate
Sacarosa 60%
Maltodextrina 40%
Chocolate
Sacarosa 70%
Maltodextrina 30%
D. ENSURES LIGHT
Uso: ENSURE LIGHT es un alimento líquido bajo en grasas diseñado para usarse como complemento nutricional oral con o entre comidas. ENSURE LIGHT está libre de lactosa y de gluten, y es conveniente para su uso en dietas modificadas, que incluyen dietas bajas en colesterol.
Condiciones del Paciente
Para pacientes de peso normal o con sobrepeso que necesitan nutrición extra en un suplemento que contiene un 50% menos de grasa y un 20% menos de calorías que ENSURE. Para adultos sanos que no comen correctamente y necesitan nutrición extra.
Características
Bajo en grasas y grasas saturadas;
Contiene 3 gramos de grasa total por ración y <5 miligramos de colesterol;
Sabor rico, cremoso
Excelente fuente de calcio y otras vitaminas y minerales esenciales;
Para dietas bajas en colesterol;
Libre de lactosa, fácilmente digerido.
Ingredientes
Vainilla a la francesa: Agua 10000-D, maltodextrina (maíz), azúcar (sacarosa), caseinato de calcio, aceite de cártamo con alto contenido oleico, aceite de canola, cloruro de magnesio, citrato de sodio, citrato de potasio, fosfato de potasio dibásico, fosfato de magnesio dibásico, sabor natural y artificial, fosfato de calcio tribásico, gel de celulosa, cloruro de colina, lecitina de soja, carragenina, sal (cloruro de sodio), ácido ascórbico, goma de celulosa, sulfato terroso, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, niacinamida, sulfato de manganeso, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, clorhidrato de cloruro de tiamina, palmitato de vitamina A, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, cloruro de cromo, ácido fólico, molibdato de sodio, biotina, yoduro de potasio, selenato de sodio, filoquinona, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
Proteínas
La fuente de proteína es el caseinato de calcio
Caseinato de calcio al 100%
Grasas
La fuente de grasa es una mezcla de dos aceites: cártamo con alto contenido oleico y canola.
Aceite de cártamo con alto contenido oleico 70%
Aceite de canola 30%
El nivel de grasa en ENSURE LIGHT satisface los requisitos de la American Heart Association (AHA). Los 3 gramos de grasa en ENSURE LIGHT representan el 13,5% del total de calorías, siendo el 1,4% de la grasa de ácidos grasos saturados y el 2,6% de ácidos grasos poliinsaturados. Estos valores están dentro de los requisitos de la American Heart Association de 30% de calorías totales de grasa, <10% de calorías de ácidos grasos saturados, y 10% de calorías totales de ácidos grasos poliinsaturados.
Carbohidrato
ENSURE LIGHT contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. El sabor chocolate contiene también jarabe de maíz. La dulzura suave y la variedad de sabores (vainilla a la francesa, chocolate supremo, batido de fresa), más VARI-FLAVORS® Flavor Pacs de nuez, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a evitar la fatiga de sabor y favorecen la cooperación del paciente.
Vainilla y otros sabores que no son chocolate
Sacarosa 51%
Maltodextrina 49%
Chocolate
Sacarosa 47,0%
Jarabe de maíz 26,5%
Maltodextrina 26,5%
Vitaminas y Minerales
Una ración de 8 fl-oz de ENSURE LIGHT proporciona al menos un 25% de los RDI de las 24 vitaminas y minerales claves.
Cafeína
El sabor chocolate contiene 2,1 mg de cafeína/ 8 fl oz.
E. ENSURE PLUS®
Uso: ENSURE PLUS es un alimento líquido de bajo contenido en residuos y alto contenido en calorías para su uso cuando se necesitan nutrientes y calorías extras pero una concentración normal de proteína. Se diseña principalmente como complemento nutricional oral para ser usado con o entre comidas o, en cantidades adecuadas, como un sustituto de comida. ENSURE PLUS no tiene lactosa ni gluten. Aunque principalmente es un complemento nutricional oral, se puede alimentar por tubo.
Condiciones del Paciente
Para pacientes que requieren calorías y nutrientes extras, pero una concentración normal de proteína, en un volumen limitado;
Para pacientes que necesitan ganar o mantener peso saludable.
Características
Sabor rico, cremoso;
Buena fuente de vitaminas y minerales esenciales.
Ingredientes
Vainilla: Agua 10000-O, jarabe de maíz, maltodextrina (maíz), aceite de maíz, caseinatos de sodio y calcio, azúcar (sacarosa), aislado de proteína de soja, cloruro de magnesio, citrato de potasio, fosfato de calcio tribásico, lecitina de soja, sabor natural y artificial, citrato de sodio, cloruro de potasio, cloruro de colina, ácido ascórbico, carragenina, sulfato de zinc, sulfato terroso, acetato de alfa-tocoferilo, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato de manganeso, sulfato cúprico, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, palmitato de vitamina A, ácido fólico, biotina, cloruro de cromo, molibdato de sodio, yoduro de potasio, selenita de sodio, filoquinona, cianocobalamina y vitamina D_{3}.
Proteína
La fuente de proteína es una mezcla de dos proteínas de alto valor biológico: caseína y soja.
Caseinatos de sodio y de calcio 84%
Aislado de proteína de soja 16%
Grasa
La fuente de grasa es aceite de maíz.
Aceite de maíz 100%
Carbohidrato
ENSURE PLUS contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. La dulzura suave y la variedad de sabores (vainilla, chocolate, fresa, café, crema de nueces y batido de huevo), más VARI-FLAVORS® Flavor Pacs de nueces, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a evitar la fatiga de sabor y ayudan a la cooperación del paciente.
Sabores de vainilla, fresa, crema de nueces, y café
Jarabe de maíz 39%
Maltodextrina 38%
Sacarosa 23%
Sabores chocolate y batido de huevo
Jarabe de maíz 36%
Maltodextrina 34%
Sacarosa 30%
Vitaminas y minerales
Una ración de 8 fl-oz de ENSURE PLUS proporciona al menos un 15% de los RDI de 25 vitaminas y minerales clave.
Cafeína
El sabor a chocolate contiene 3,1 mg de cafeína/8 fl-oz. El sabor café contiene una cantidad traza de cafeína.
F. ENSURE PLUS® HN
Uso: ENSURE PLUS HN es un alimento líquido nutricionalmente completo de altas calorías, alto contenido en nitrógeno diseñado para personas con necesidades elevadas de calorías y proteínas o tolerancia de volumen limitado. Se puede usar para complemento oral o para soporte nutricional total por tubo. ENSURE PLUS HN carece de lactosa y de gluten.
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Condiciones del Paciente
Para pacientes con necesidades crecientes de calorías y proteínas, como después de cirugía o lesiones;
Para pacientes con tolerancia de volumen limitado y saciedad pronta.
Características
Para nutrición complementaria o total;
Para alimentación oral o por tubo;
1,5 CaVmL;
Alto nitrógeno;
Calóricamente denso.
Ingredientes
Vainilla: Agua 10000-D, maltodextrina (maíz), caseinatos de sodio y calcio, aceite de maíz, azúcar (sacarosa), aislado de proteína de soja, cloruro de magnesio, citrato de potasio, fosfato de calcio tribásico, lecitina de soja, sabor natural y artificial, citrato de sodio, cloruro de colina, ácido ascórbico, taurina, L-carnitina, sulfato de zinc, sulfato terroso, acetato de alfa-tocoferilo, niacinamida, carraqenina, pantotenato de calcio, sulfato de manganeso, sulfato cúprico, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, palmitato de vitamina A, ácido fólico, biotina, cloruro de cromo, molibdato de sodio, yoduro de potasio, selenita de sodio, filoquinona, cianocobalamina y vitamina D_{3}.
G. ENSURE® POLVO
Uso: ENSURE POLVO (reconstituido con agua) es un alimento liquido de bajo contenido en residuos diseñado principalmente como un complemento nutricional oral para ser usado con o entre comidas. ENSURE POLVO carece de lactosa y de gluten, y es conveniente para su uso en dietas modificadas, incluyendo dietas bajas en colesterol.
Condiciones del paciente
Para pacientes con dietas modificadas;
Para pacientes ancianos con riesgo de nutrición;
Para pacientes que se recuperan de enfermedad/cirugía;
Para pacientes que necesitan una dieta de bajo contenido en residuos.
Características
Conveniente, fácil de mezclar;
Bajo en grasa saturada;
Contiene 9 gramos de grasa total y <5 miligramos de colesterol por ración;
Alto contenido en vitaminas y minerales;
Para dietas de bajo contenido de colesterol;
Sin lactosa, fácilmente digerido.
Ingredientes: Vainillas 10000-D jarabe de maíz, maltodextrina (maíz), azúcar (sacarosa), aceite de maíz, caseinatos de sodio y calcio, aislado de proteína de soja, sabor artificial, citrato de potasio, cloruro de magnesio, citrato de sodio, fosfato de calcio tribásico, cloruro de potasio, lecitina de soja, ácido ascórbico, cloruro de colina, sulfato de zinc, sulfato terroso, acetato de alfa-tocoferilo, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato de manganeso, clorhidrato de cloruro de tiamina, sulfato cúprico, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, palmitato de vitamina A, ácido fólico, biotina, molibdato de sodio, cloruro de cromo, yoduro de potasio, selenita de sodio, filoquinona, y vitamina D_{3} y cianocobalamina.
Proteína
La fuente de proteína es una mezcla de dos proteínas de alto valor biológico: caseína y soja.
Caseinatos de sodio y calcio 84%
Aislado de proteína de soja 16%
Grasa
La fuente de grasa es aceite de maíz.
Aceite de maíz 100%
Carbohidrato
ENSURE POLVO contiene una combinación de jarabe de maíz, maltodextrina, y sacarosa. La dulzura suave de ENSURE POLVO, más VARI-FLAVORS® Flavor Pacs en nuez, cereza, fresa, limón y naranja, ayuda a evitar la fatiga de sabor y favorece la cooperación del paciente.
Vainilla
Jarabe de maíz 35%
Maltodextrina 35%
Sacarosa 30%
H. ENSURE® BUDIN
Uso: ENSURE PUDDING es un complemento denso nutritivo que proporciona un balance nutricional en forma no líquida para ser usada con o entre comidas. Es adecuado para dietas con consistencia modificada (v.gr., suave, en puré, o completamente líquida) o para personas con problemas para deglutir. ENSURE BUDIN no tiene gluten.
Condiciones del Paciente
Para pacientes con dietas de consistencia modificada (por ejemplo, suave, en puré, o completamente líquidas);
Para pacientes con problemas para deglutir.
Características
Buen sabor rico y cremoso.
Buena fuente de vitaminas y minerales esenciales.
Ventaja: no necesita refrigeración.
Sin gluten.
Perfil de nutrientes por 5 oz: Calorías 250, proteína 10,9%, grasa total 34,9%, carbohidratos 54,2%
Ingredientes
Vainilla: Leche descremada 10000-D, agua, azúcar (sacarosa), aceite de soja parcialmente hidrogenado, almidón alimenticio modificado, sulfato de magnesio, estearoilo lactilato de sodio, fosfato de sodio dibásico, sabor artificial, ácido ascórbico, sulfato de zinc, sulfato ferroso, acetato de alfa-tocoferilo, cloruro de colina, niacinamida, sulfato de manganeso, pantotenato de calcio, amarillo número 5 FD&C, citrato de potasio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, amarillo número 6 FD&C, ácido fólico, biotina, filoquinona, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
Proteína
La fuente de proteína es leche descremada.
Leche descremada 100%
Grasa
La fuente de grasa es aceite de soja hidrogenado.
Aceite de soja hidrogenado 100%
Carbohidrato
ENSURE BUDIN contiene una combinación de sacarosa y de almidón alimentario modificado. La dulzura suave y la variedad de sabor (vainilla, chocolate, mantequilla, y tapioca) ayuda a evitar la fatiga por sabor. El producto contiene 9,2 gramos de lactosa por ración.
Vainilla y otros sabores que no son de chocolate
Sacarosa 56%
Lactosa 27%
Almidón alimenticio modificado 17%
Chocolate
Sacarosa 58%
Lactosa 26%
Almidón alimenticio modificado 16%
I. ENSURE® CON FIBRA
Uso: ENSURE CON FIBRA es un alimento líquido nutricionalmente completo que contiene fibra diseñado para personas que se pueden beneficiar de fibras y nutrientes dietéticos aumentados. ENSURE CON FIBRA es conveniente para personas que no requieren una dieta de bajo contenido en residuos. Se puede administrar oralmente o por tubo, y se puede usar como complemento nutricional a una dieta regular o, en cantidades adecuadas, como reemplazo de una comida. ENSURE CON FIBRA no tiene lactosa ni gluten, y es conveniente para su uso en dietas modificadas, incluyendo dietas bajas en colesterol.
Condiciones del Paciente
Para pacientes que se pueden beneficiar de fibra y nutrientes dietéticos aumentados.
Características
Nueva fórmula avanzada baja en grasas saturadas, y más alta en vitaminas y minerales;
Contiene 6 gramos de grasa total y <5 miligramos de colesterol por ración.
Sabor rico, cremoso;
Buena fuente de fibra;
Excelente fuente de vitaminas y minerales esenciales;
Para dietas bajas en colesterol;
Sin lactosa ni gluten.
Ingredientes
Vainilla: 10000-D Agua, maltodextrina (maíz), azúcar (sacarosa), caseinatos de sodio y de calcio, fibra de avena, aceite de cártamo con alto contenido oleico, aceite de canola, aislado de proteína de soja, aceite de maíz, fibra de soja, fosfato de calcio tribásico, cloruro de magnesio, citrato de potasio, gel de celulosa, lecitina de soja, fosfato de potasio dibásico, citrato de sodio, sabores naturales y artificiales, cloruro de colina, fosfato de magnesio, ácido ascórbico, goma de celulosa, cloruro de potasio, carragenina, sulfato terroso, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, niacinamida, sulfato de manganeso, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, ácido fólico, cloruro de cromo, biotina, molibdato de sodio, yoduro de potasio, selenato de sodio, filoquinona, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
Proteína
La fuente de proteína es una mezcla de dos proteínas de alto valor biológico caseína y soja.
Caseinatos de sodio y calcio 80%
Aislado de proteína de soja 20%
Grasa
La fuente de grasa es una mezcla de tres aceites: de cártamo con alto contenido oleico, canola y maíz.
Aceite de cártamo alto en oleico 40%
Aceite de canola 40%
Aceite de maíz 20%
El nivel de grasa en ENSURE CON FIBRA satisface los requisitos de la American Heart Association (AHA). Los 6 gramos de grasa en ENSURE CON FIBRA representan el 22% del total de calorías, con 2,01% de la grasa de los ácidos grasos siendo saturados y un 6,7% de ácidos grasos poliinsaturados. Estos valores están dentro de los requisitos de la American Heart Association de 30% del total de calorías de grasa, <10% de calorías de ácidos grasos saturados, y 10% de calorías totales a partir de ácidos grasos poliinsaturados.
Carbohidrato
ENSURE CON FIBRA contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. La dulzura suave y la variedad de sabor (vainilla, chocolate, y crema de nueces), más VARI-FLAVORS® Flavor Pacs en nuez, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a evitar la fatiga de sabor y favorecen la cooperación del paciente.
Sabor vainilla y otros que no sean de chocolate
Maltodextrina 66%
Sacarosa 25%
Fibra de avena 7%
Fibra de soja 2%
Chocolate
Maltodextrina 55%
Sacarosa 36%
Fibra de avena 7%
Fibra de soja 2%
Fibra
La mezcla de fibras usada en ENSURE CON FIBRA consiste en fibras de avena y polisacárido de soja. Esta mezcla da como resultado aproximadamente 4 gramos de la fibra dietética total por lata de 8 fl-oz. La proporción de fibra insoluble a soluble es 95:5.
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Los distintos complementos nutricionales descritos anteriormente y conocidos para otros con experiencia en la técnica se pueden sustituir y/o complementar con los PUFA de esta invención.
J. Oxepa® Producto Nutritivo
Oxepa es un producto nutricional entérico calóricamente denso, bajo en carbohidratos, diseñado para el manejo dietético de pacientes con ARDS o con riesgo de ARDS. Tiene una combinación exclusiva de ingredientes, que incluyen una mezcla de aceites patentados que contienen ácido eicosapentaenoico (EPA a partir de aceite de pescado), ácido gama-linolénico (GLA de aceite de borraja), y niveles elevados de antioxidantes.
Distribución calórica
La densidad calórica es alta a 1,5 Cal/mL (355 Cal/8 fl oz), para minimizar el volumen requerido para satisfacer las necesidades de energía.
La distribución de calorías en Oxepa se muestra en la Tabla 7.
TABLA 7
Distribución de Calorías de Oxepa
Por 8 fl oz. Por litro % de caloría
Calorías 355 1,500 -
Grasa (g) 22,2 93,7 55,2
Carbohidrato (g) 25 105,5 28,1
Proteína 14,8 62,5 16,7
Agua (g) 186 785 -
Grasa
Oxepa contiene 22,2 gramos de grasa por ración de 8-fl oz (93,7 gramos por litro).
La fuente de grasa es una mezcla de aceites de 31,8% de aceite de canola, 25% de triglicéridos de cadena media (MCTs), 20% de aceite de borraja, 20% de aceite de pescado, y 3,2% de lecitina de soja.
El perfil típico de ácido graso de Oxepa se muestra en la Tabla 8.
Oxepa proporciona una cantidad equilibrada de ácidos grasos poliinsaturados, monoinsaturados y saturados, como se muestra en la Tabla 10.
Los triglicéridos de cadena media (MCTs) -25% de la mezcla de grasas - ayuda al vaciamiento gástrico debido a que se absorben en el tracto intestinal sin emulsificación por los ácidos biliares.
Los distintos componentes de ácidos grasos del producto nutricional Oxepa® se pueden sustituir y/o complementar con los PUFA de esta invención.
TABLA 8
Perfil típico de ácidos grasos
% total ácidos G/8 fl oz G/L
Caproico (6:0) 0,2 0,04 0,18
Caprílico (8:0) 14,69 3,1 13,07
Cáprico (10:0) 11,06 2,33 9,87
Palmítico (16:0) 5,59 1,18 4,98
TABLA 8 (continuación)
% total ácidos G/8 fl oz G/L
Palmitoleico (16:1n-7) 1,82 0,38 1,62
Esteárico (18:0) 1,84 0,39 1,64
Oleico (18:1n-9) 24,44 5,16 21,75
Linoleico (18:2n-6) 16,28 3,44 14,49
\alpha-Linolénico (18:3n-3) 3,47 0,73 3,09
\gamma-Linolénico (18:3n-6) 4,82 1,02 4,29
Eicosapentaenoic (20:5n-3)o 5,11 1,08 4,55
n-3-Docosapentaenoico (22:5n-3) 0,55 0,12 0,49
Docosahexaenoico (22:6n-3) 2,27 0,48 2,02
otros 7,55 1,52 6,72
*Los ácidos grasos igualan aproximadamente el 95% del total de grasas.
TABLA 9
Perfil de grasas de Oxepa
% de calorías totales de grasas 55,2
Ácidos grasos poliinsaturados 31,44 g/L
Ácidos grasos monoinsaturados 25,53 g/L
Ácidos grasos saturados 32,38 g/L
Proporción de n-6 a n-3 1,75:1
Colesterol 9,49 mg/8 fl oz
40,1 mg/L
Carbohidratos
El contenido de carbohidratos es 25,0 gramos por ración de 8-fl-oz (105,5 gramos por litro).
Las fuentes de carbohidrato son 45% maltodrextina (un carbohidrato complejo) y 55% de sacarosa (un azúcar simple), ambas fácilmente digeridas y absorbidas.
El alto contenido en grasa y bajo contenido de carbohidratos de Oxepa se diseña para minimizar la producción de dióxido de carbono (CO_{2}). Los niveles altos de CO_{2} pueden complicar la desconexión en pacientes dependientes de ventilación. El bajo nivel de carbohidratos también puede ser útil para los pacientes que han desarrollado hiperglicemia inducida por tensión.
Oxepa no tiene lactosa.
El carbohidrato dietético, los aminoácidos a partir de proteína, y la fracción glicerol de las grasas se pueden convertir en glucosa dentro del cuerpo. A través de este proceso, se satisfacen los requisitos de carbohidrato de los tejidos que dependen de glucosa (tales como el sistema nervioso central y los glóbulos rojos). Sin embargo, una dieta sin carbohidratos puede conducir a cetosis, excesivo catabolismo de proteína del tejido, y pérdida de fluido y de electrólitos. Estos efectos se pueden evitar mediante la ingestión diaria de 50 a 100 gramos de carbohidrato digerible, si es adecuada la ingesta calórica. El nivel de carbohidratos en Oxepa también es suficiente para minimizar la gluconeogénesis, si se están satisfaciendo las necesidades de energía.
Proteína
Oxepa contiene 14,8 gramos de proteína por ración de 8-fl-oz (62,5 g/L).
La proporción de caloría/nitrógeno total (150:1) 25 satisface la necesidad de los pacientes estresados.
Oxepa proporciona suficiente proteína para promover el anabolismo y el mantenimiento de masa magra corporal sin crear problemas respiratorios.
Las altas ingestas de proteína son una preocupación en pacientes con insuficiencia respiratoria. Aunque la proteína tenga poco efecto en la producción de dióxido de carbono, una dieta alta en proteínas aumentará el problema de ventilación.
Las fuentes de proteína de Oxepa son 86,8% de caseinato de sodio y 13,2% de caseinato de calcio.
Como se demuestra en la Tabla 11, el perfil de aminoácidos del sistema proteico en Oxepa cumple o sobrepasa el estándar de la proteína de alta calidad por la National Academy of Sciences;
Oxepa está libre de gluten.
Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta memoria descriptiva son indicadoras del nivel de experiencia de los expertos de la materia a los cuales pertenece esta invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Knutzon, Deborah
\hskip3.9cm
Murkerji, Pradip 
\hskip3.9cm
Huang, Yung-Sheng 
\hskip3.9cm
Thurmond, Jennifer 
\hskip3.9cm
Chaudhary, Sunita 
\hskip3.9cm
Leonard, Amanda 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Procedimientos y composiciones para la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga en plantas.
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 52
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DIRECCIÓN: LIMBACH & LIMBACH L.L.P.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 2001 FERRY BUILDING
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 94111
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA DE LECTURA PARA ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: Microsoft Word
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US08/833.610
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE SOLICITUD: 11 Abril 1997
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN AGENTE/ATTORNEY
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Michael R. Ward
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 38.351
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/LISTA: CGAB-320
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN TELECOMUNICACIONES
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (415)433-4150
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (415)433-8716
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TELEX: N/A
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1617 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 457 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:
24
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1448 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:3:
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 399 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:
27
28 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1483 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:
\vskip1.000000\baselineskip
29
30 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 446 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:6:
\vskip1.000000\baselineskip
31
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 355 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:7:
33
34 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 104 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:8:
\vskip1.000000\baselineskip
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 252 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:9:
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 125 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:10:
37 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 131 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:11:
\vskip1.000000\baselineskip
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 87 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:12:
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 143 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:13:
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 186 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:14:
41
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Xaa His His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 446 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:16:
43
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 359 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:17:
45
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 365 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:18:
\vskip1.000000\baselineskip
47
48 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCAAGCTTCT GCAGGAGCTC TTTTTTTTTT TTTTT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LUGAR: 21
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /número=1
\hskip6.5cm
/nota= "N=Inosina o citosina" 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LUGAR: 27
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /número=2
\hskip6.5cm
/nota= "N=Inosina o citosina" 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CUACUACUAC UACAYCAYAC NTAYACNAAY AT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc= "oligonucleótido sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LUGAR: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /número=1
\hskip6.5cm
/nota= "N=Inosina o citosina" 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LUGAR: 19
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /número=2
\hskip6.5cm
/nota= "N=Inosina o citosina" 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAUCAUCAUC AUNGGRAANA RRTGRTG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CUACUACUAC UAGGAGTCCT CTACGGTGTT TTG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAUCAUCAUC AUATGATGCT CAAGCTGAAA CTG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Xaa Xaa His His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CUACUACUAC UACTCGAGCA AGATGGGAAC GGACCAAGG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAUCAUCAUC AUCTCGAQGCCT ACTCTTCCTT GGGACGGAC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CUACUACUAC UATCTAGACT CGAGACCATG GCTGCTGCTC CAGTGTG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAUCAUCAUC AUAGGCCTCG AGTTACTCCG CCTTACCCAT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CUACUACUA CUAGGATCCA TGGCACCTCC CAACACT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAUCAUCAU CAUGGTACCT CGAGTTACTT CTTGAAAAAG AC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1219 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig Editado 2692004)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:31:
49 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 655 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig Editado 2153526)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:32:
50 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 304 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig Editado 3506132)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:33:
51 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 918 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig Editado 3854933)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:34:
52 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1686 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig Editado 2511785)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:35:
53 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1843 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig 2535)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:36:
55 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:37:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2257 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig Editado 253538ª)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:37:
57 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:38:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 411 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido (Traducción de Contig 2692004)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:38:
\vskip1.000000\baselineskip
59 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:39:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 218 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido (Traducción de Contig 2153526)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:39:
\vskip1.000000\baselineskip
61 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:40:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 71 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido (Traducción de Contig 3506132)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:40:
\vskip1.000000\baselineskip
63 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:41:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 306 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido (Traducción de Contig 3854933)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:41:
\vskip1.000000\baselineskip
64 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:42:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 566 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido(Traducción de Contig 2511785)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:42:
65
66 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:43:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD:619 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido(Traducción de Contig 2535)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:43:
\vskip1.000000\baselineskip
67
68 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:44:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 757 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido(Traducción de Contig.253538)
\vskip0.800000\baselineskip
(Xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:44:
69
70 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:45:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 746 ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:45:
71 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:46:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 227 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:46:
72
73 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:47:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 494 ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:47:
\vskip1.000000\baselineskip
74 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:48:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 87 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:48:
\vskip1.000000\baselineskip
75 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:49:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 520 ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:49:
\vskip1.000000\baselineskip
76 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:50:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 153 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:50:
\vskip1.000000\baselineskip
77 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:51:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 429 ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:51:
\vskip1.000000\baselineskip
78 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:52:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 125 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:52:
\vskip1.000000\baselineskip
79

Claims (15)

1. Construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia control de la expresión funcional en una célula de una planta unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, siendo dicho polipéptido un polipéptido capaz de desaturar una molécula de ácido graso en el carbono 5 del extremo carboxilo de dicho ácido graso, teniendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60% de homología con la secuencia de 446 aminoácidos de la SEC ID Nº: 6.
2. Construcción de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de homología con la secuencia de 446 aminoácidos de la SEC ID Nº: 6.
3. Construcción de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de homología con la secuencia de 446 aminoácidos de la SEC ID Nº: 6.
4. Construcción de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3 en donde dicha secuencia de control de la expresión es operativa en una célula de semilla.
5. Célula recombinante de una planta que comprende una construcción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Célula de una planta de acuerdo con la reivindicación 5 en donde dicha célula vegetal se selecciona del grupo que consiste en Brassica, soja, cártamo, maíz, lino y girasol.
7. Célula de una planta de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6 la cual está enriquecida en un ácido graso seleccionado del grupo que consiste en 18:1, 18:2, 18:3 y 18:4.
8. Planta transgénica que comprende una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.
9. Procedimiento de producción de un aceite vegetal que comprende recuperar el aceite de una planta de la reivindicación 8 o de su semilla.
10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9 que comprende, además, formular el ácido graso en un producto seleccionado del grupo:
una composición farmacéutica que comprende dicho aceite y un portador farmacéuticamente aceptable;
una fórmula nutricional;
una fórmula para lactantes;
un complemento dietético;
un sustituto dietético;
un cosmético; y
un alimento para animales.
11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 en donde dicha fórmula para lactantes, complemento dietético o sustituto dietético está en forma líquida o 20 sólida.
12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11 en donde la fórmula nutricional, fórmula para lactantes, complemento dietético o sustituto dietético contiene al menos un macronutriente seleccionado del grupo que consiste en aceite de coco, aceite de soja, aceite de canola, mono- y diglicéridos, glucosa, lactosa comestible, suero electrodializado, leche descremada electrodializada, suero de leche, proteína de la soja y otros hidrosilatos
proteicos.
13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12 en donde dicha fórmula nutricional, fórmula para lactantes, complemento dietético o sustituto dietético contiene al menos una vitamina seleccionada del grupo que consiste en vitaminas A, C, D, E y complejo B; y al menos un mineral seleccionado del grupo que consiste en calcio, magnesio, zinc, manganeso, sodio, potasio, fósforo, cobre, cloro, yodo, selenio y hierro.
14. Utilización de la planta de la reivindicación 8 para la producción de un ácido graso.
\newpage
15. Utilización de acuerdo con la reivindicación 14 para la producción de un producto que comprende dicho ácido graso, siendo seleccionado dicho producto del grupo:
una composición farmacéutica que comprende dicho aceite y un portador farmacéuticamente aceptable;
una fórmula nutricional;
una fórmula para lactantes;
un complemento dietético;
un sustituto dietético;
un cosmético; y
un alimento para animales.
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