ES2229491T3 - Procedimientos y composiciones para la sintesis de acidos grasos de cadena larga poliinsaturados. - Google Patents

Procedimientos y composiciones para la sintesis de acidos grasos de cadena larga poliinsaturados.

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ES2229491T3 ES98918175T ES98918175T ES2229491T3 ES 2229491 T3 ES2229491 T3 ES 2229491T3 ES 98918175 T ES98918175 T ES 98918175T ES 98918175 T ES98918175 T ES 98918175T ES 2229491 T3 ES2229491 T3 ES 2229491T3
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Abstract

Polipéptido purificado o aislado que tiene actividad delta 5-desaturasa, polipéptido que es capaz de desaturar una molécula de ácido graso en el carbono 5 a partir del extremo carboxilo de dicho ácido graso, teniendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60% de homología con la secuencia de 446 aminoácidos de la SEC. Nº ID. 2.

Description

Procedimientos y composiciones para la síntesis de ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados.
Solicitud relacionada
Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud con Número de Serie 08/833.610 registrada el 11 de abril de 1997.
Introducción Campo de la invención
Esta invención se refiere a la modulación de niveles de enzimas y/o a componentes de enzimas relacionados con la producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (PUFA) en un microorganismo o animal.
Antecedentes
Los ácidos grasos \omega3, ejemplificados por el ácido eicosapentaenoico (EPA), y los ácidos grasos \omega6, ejemplificados por el ácido araquidónico (ARA) son dos familias principales de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA). Los PUFA son componentes importantes de la membrana plasmática de las células, en donde podrían hallarse en formas tales como los fosfolípidos. Los PUFA son necesarios para un correcto desarrollo, particularmente en el cerebro en desarrollo de los niños, y para la formación y reparación de tejidos. Los PUFA también sirven como precursores de otras moléculas importantes en los seres humanos y animales, incluyendo las prostaciclinas, los eicosanoides, los leucotrienos, y las prostaglandinas.
Los cuatro PUFA de cadena larga principales incluyen el ácido docosahexaenoico (DHA) y el EPA, los cuales se hallan primordialmente en diferentes tipos de aceites de pescado, el ácido gamma-linolénico (GLA), el cual se halla en las semillas de un cierto número de plantas, incluyendo la onagra (Oenothera biennis), la borraja (Borago officinalis) y el grosellero negro (Ribes nigrum), y el ácido estearidónico (SDA), el cual se encuentra en aceites marinos y semillas de plantas. Tanto el GLA como otro importante PUFA de cadena larga, ácido araquidónico (ARA), se hallan en los hongos filamentosos. El ARA puede purificarse a partir de tejidos animales, incluyendo el hígado y la glándula adrenal. El GLA, el ARA, el EPA y el SDA son por sí mismos, o son precursores en la dieta, de importante ácidos grasos de cadena larga implicados en la síntesis de prostaglandinas, en el tratamiento de enfermedades cardíacas, y en el desarrollo del tejido cerebral.
Los ácidos grasos poliinsaturados tienen un cierto número de aplicaciones médicas y farmacéuticas, incluyendo el tratamiento de enfermedades cardíacas, del cáncer y de la artritis.
Para el DHA, existen un cierto número de fuentes para su producción comercial, incluyendo una variedad de organismos marinos, aceites obtenidos a partir de peces marinos de aguas frías, y fracciones de la yema del huevo. Para el ARA, pueden usarse microorganismos, incluyendo el género Mortierella, Entomophthora, Phytium y Porphyridium, para su producción comercial. Las fuentes comerciales de SDA incluyen los géneros Trichodesma y Echium. Las fuentes comerciales de GLA incluyen la onagra, el grosellero negro, y la borraja. Sin embargo, hay varias desventajas asociadas con la producción comercial de PUFA a partir de fuentes naturales. Las fuentes naturales de PUFA, tales como los animales y plantas, tienden a tener composiciones de aceites altamente heterogéneas. Los aceites obtenidos a partir de estas fuentes pueden por tanto requerir una purificación dilatada para separar uno o más PUFA deseados, o para producir un aceite que esté enriquecido en uno o más PUFA. Las fuentes naturales están sometidas también a fluctuaciones y disponibilidad incontrolables. Las reservas de peces pueden experimentar variaciones naturales o podrían agotarse por sobrepesca. Los aceites de peces tiene gustos y olores desagradables, los cuales podrían ser imposibles de separar económicamente del producto deseado, y pueden hacer tales productos inaceptables como suplementos nutricionales. Los aceites animales, y particularmente los aceites de peces, pueden acumular contaminantes medioambientales. El tiempo y las enfermedades pueden causar fluctuaciones en los rendimientos de ambas fuentes, peces y plantas. La tierra cultivable disponible para la producción de cultivos alternativos productores de aceite está sometida a la competición procedente de la continua expansión de las poblaciones humanas y de la creciente necesidad asociada para la producción de alimentos en las tierras arables restantes. Los cultivos que sí producen PUFA, tales como la borraja, no han sido adaptados al crecimiento comercial y podrían no comportarse bien en monocultivo. El crecimiento de tales cultivos es por tanto económicamente no competitivo cuando pueden cultivarse cultivos más provechosos y mejor establecidos. La fermentación a gran escala de organismos tales como Mortierella también es cara. Los tejidos animales naturales contienen cantidades bajas de ARA y son difíciles de procesar. Los microorganismos tales como Porphyridium y Mortierella son difíciles de cultivar a escala comercial.
Los suplementos dietarios y las formulaciones farmacéuticas que contienen PUFA puede retener las desventajas de la fuente de PUFA. Los suplementos tales como las cápsulas de aceite de pescado pueden contener niveles bajos del componente concreto deseado y, por tanto, requerir dosis elevadas. Las dosis elevadas pueden resultar en la ingestión de niveles elevados de componentes no deseados, incluyendo contaminantes. Los sabores y olores desagradables de los suplementos pueden hacer indeseables tales regímenes, y podrían inhibir su cumplimiento por parte del paciente. Debe tenerse cuidado al proporcionar suplementos de ácidos grasos, puesto que la sobre adición podría resultar en la supresión de las vías biosintéticas endógenas y conducir a una competición con otros ácidos grasos necesarios en varias fracciones de lípidos in vivo, conduciendo a resultados no deseables. Por ejemplo, los esquimales que tienen una dieta elevada en ácidos grasos \omega3 tienen una tendencia incrementada a sangrar (Patente estadounidense nº 4.874.603).
Un cierto número de enzimas están implicados en la biosíntesis de los PUFA. El ácido linolénico (LA; 18:2 \Delta9, 12) se produce a partir del ácido oleico (18:1 \Deltaº) mediante una \Delta12-desaturasa. El GLA (18:3 \Delta6, 9, 12) se produce a partir del ácido linoleico (LA, 18:2 \Delta9, 12) mediante una \Delta6-desaturasa. La producción del ARA (20:4 \Delta5, 8, 11, 14) a partir del ácido dihomo-gamma-linolénico (DGLA; 20:3 \Delta8, 11, 14) está catalizada por una \Delta5-desaturasa. Sin embargo, ciertos animales no pueden desaturar más allá de la posición \Delta9 y por tanto no pueden convertir el ácido oleico (18:1 \Delta9) en ácido linolénico (18:2 \Delta9, 12). De igual forma, el ácido \alpha-linoleico (ALA, 18:3 \Delta9, 12, 15) no puede ser sintetizado por los mamíferos. Otros eucariotas, incluyendo los hongos y plantas, tienen enzimas que desaturan en las posiciones \Delta12 y \Delta15. Por tanto, los principales ácidos grasos poliinsaturados de los animales se derivan de la dieta y/o de la desaturación y elongación del ácido linoleico (18:2 \Delta9, 12) o del ácido \alpha-linolénico (18:3 \Delta9, 12, 15). Por tanto, tiene interés obtener material genético implicado en la biosíntesis de los PUFA, a partir de especies que producen naturalmente estos ácidos grasos, y expresar el material aislado en un sistema microbiano o animal que pueda manipularse para proporcionar la producción de cantidades comerciales de uno o más PUFA. Por tanto, hay una necesidad de desaturasas de ácidos grasos, de genes que las codifican, y de procedimientos recombinantes para producirlas. Existe una necesidad adicional de aceites que contengan proporciones relativas mayores de, y/o enriquecidos en, PUFA. También existe una necesidad de procedimientos económicos fiables para producir PUFA específicos.
Literatura relevante
La producción de ácido gamma-linolénico mediante una \Delta6-desaturasa se describe en la USPN 5.552.306. La producción de ácido 8, 11-eicosadienoico usando Mortierella alpina se descubren en la USPN 5.376.541. La producción de ácido docosahexaenoico por parte de dinoflagelados se describe en la USPN 5.407.957. La clonación de un desaturasa de \Delta6-palmitoilacil-proteína portadora se describe en la publicación del PCT WO-96/13.591 y en la USPN 5.614.400. La clonación de una \Delta6-desaturasa procedente de borraja se describe en la publicación del PCT WO-96/21.022. La clonación de \Delta9-desaturasas se describe en las solicitudes de patentes publicadas del PCT WO-91/13.972, EP-0.550.162-A1, EP-0.561.569-A2, EP-0.644.263.A2, y EP-0.736.598-A1, y en la USPN 5.057.419. La clonación de \Delta12-desaturasas procedentes de varios organismos se describe en la publicación del PCT WO-94/11.516 y en la USPN 5.443.974. La clonación de \Delta15-desaturasas procedentes de varios organismos se describe en la publicación del PCT WO-93/11.245. Todas las publicaciones y patentes o solicitudes estadounidenses son mencionadas en ésta y de ese modo se incorporan en su totalidad por referencia.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a nuevas composiciones y procedimientos para la preparación de ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados o PUFA. Las composiciones incluyen ácidos nucleicos que codifican una \Delta5-desaturasa y/o polipéptidos que tienen actividad \Delta5-desaturasa, los polipéptidos, y las sondas para aislar y detectar a los mismos. Los procedimientos implican el cultivo de un microorganismo o animal huésped, los cuales contienen y expresan uno o más transgenes que codifican una \Delta5-desaturasa y/o un polipéptido que tiene actividad \Delta5-desaturasa. La expresión del polipéptido de desaturasa proporciona un incremento relativo en PUFA \Delta5-desaturados, o en un progenie metabólica de los mismos, a resultas de unas concentraciones alteradas de enzimas y sustratos implicados en la biosíntesis de los PUFA. Esta invención haya uso, por ejemplo, en la producción a gran escala de aceites que contienen PUFA, los cuales incluyen, por ejemplo, el ARA, EPA y/o DHA.
La presente invención proporciona un polipéptido purificado o aislado que tiene actividad \Delta5-desaturasa, polipéptido que es capaz de desaturar una molécula de ácido graso en el carbono 5 a partir del extremo carboxilo de dicho ácido graso, teniendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60%, preferiblemente al menos un 80%, y más preferiblemente al menos un 90% de homología con la secuencia de 446 aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 2.
La invención proporciona además un polipéptido purificado o aislado que tiene actividad \Delta5-desaturasas, polipéptido que es un mutante de supresión de la SEC. Nº ID. 2, siendo capaz dicho polipéptido de desaturar una molécula de ácido graso en el carbono 5 a partir del extremo carboxilo de dicho ácido graso.
El polipéptido de la invención podría incluir un motivo aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en los residuos 30-38, 41-44, 171-175, 203-212 y 387-394 de la SEC. Nº ID. 2. El polipéptido de la invención podría comprender los residuos 30-38, 41-44, 171-175, 203-212 y 387-394 de la SEC. Nº ID. 2. El polipéptido de la invención podría comprender la SEC. Nº ID. 2.
La invención proporciona además un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de la invención. Es ácido nucleico asilado podría comprender la SEC. Nº ID. 1.
El ácido nucleico se deriva preferiblemente a partir de una célula eucariota, tal como una célula de hongo, o una célula de hongo del género Mortierella, o del género/especie Mortierella alpina. También se prefiere un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que se empareja con una secuencia de nucleótidos ilustrada en las Figuras 3A-3D (SEC. Nº ID. 1). También se proporciona una secuencia de ácido nucleico aislado que se hibrida con una secuencia de nucleótidos ilustrada en las Figuras 3A-D (SEC. Nº ID. 1).
La invención proporciona además una construcción de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico de la invención unido operativamente a un promotor. La presente invención incluye una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos ilustrada en las Figuras 3A-D (SEC. Nº ID. 1) unida a un ácido nucleico heterólogo; una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos ilustrada en las Figuras 3A-D (SEC. Nº ID. 1) operativamente unida a un promotor; y una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos ilustrada en las Figuras 3A-D (SEC. Nº ID. 1) operativamente unida a un promotor, el cual es funcional en una célula microbiana. En una realización preferida, la célula microbiana es una célula de levadura, y la secuencia de nucleótidos se deriva de un hongo, tal como un hongo del género Mortierella, particularmente un hongo de la especie Mortierella alpina.
En otra realización de la invención se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos, la cual corresponde a una secuencia de aminoácidos ilustrada en las Figuras 3A-D (SEC. Nº ID. 2), en donde la secuencia de nucleótidos está operativamente unida a un promotor, el cual es funcional en una célula huésped, y en donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 5 a partir del extremo carboxilo de la molécula de ácido graso. Adicionalmente, la invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una \Delta5-desaturasa funcionalmente activa, en donde la desaturasa incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a la totalidad o a una porción de una secuencia de aminoácidos ilustrada en las Figuras 3A-D (SEC. Nº ID. 2), en donde la secuencia de nucleótidos está operativamente unida a un promotor funcional en una célula huésped.
La invención también incluye una célula huésped que comprende una construcción de ácido nucleico de la invención. La invención proporciona una célula huésped recombinante transformada con un ácido nucleico de la invención o con una construcción de ácido nucleico de la invención. La célula huésped podría ser una célula huésped microbiana. La célula huésped podría ser una célula de levadura.
En una realización preferida, se proporciona una célula huésped recombinante que comprende al menos una copia de una secuencia de ADN que codifica una desaturasa de ácidos grasos de Mortierella alpina funcionalmente activa, que tiene una secuencia de aminoácidos tal como la ilustrada en las Figuras 3A-D (SEC. Nº ID. 2), en donde la célula o un ancestro de la célula se transformó con un vector que comprendía dicha secuencia de ADN, y en donde la secuencia de ADN está operativamente unida a un promotor. La célula huésped es eucariota o procariota. Las células huéspedes eucariotas preferidas son aquéllas seleccionadas a partir del grupo consistente en una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de hongo, y una célula de alga. Las células de mamífero preferidas incluyen una célula de ave, una célula de hongo tal como una levadura, y una célula de alga marina. Las células procariotas preferidas incluyen aquéllas seleccionadas del grupo consistente en una bacteria, una cianobacteria, células que contienen una bacteriófago y/o un virus. La secuencia de ADN de la célula huésped recombinante preferiblemente contiene un promotor que es funcional en la célula huésped.
Las células huésped de la invención que contienen la secuencia de ADN de la invención están enriquecidas en ácidos grasos, tales como los ácidos grasos 20:3. La invención proporciona una célula huésped que está enriquecida en los ácidos grasos 20:3, 20:4 u \omega-3 20:4 en comparación con una célula no transformada con una construcción de ácido nucleico de la invención o un ácido nucleico de la invención. Una célula huésped recombinante de la invención podría comprender un ácido graso seleccionado del grupo consistente en un ácido dihomo-gamma-linoleico, ácido n-6 eicosatrienoico, ácido 20:3n-6 y ácido 20:3 (8, 11, 14).
La presente invención también incluye un procedimiento para la producción del ácido graso ácido araquidónico, procedimiento que comprende: cultivar una célula huésped de la invención en presencia de ácido dihomo-\gamma-linolénico, en condiciones en las que dicho ácido es convertido a ácido araquidónico mediante la expresión de un polipéptido de la invención; y recuperar el ácido graso ácido araquidónico del cultivo.
El polipéptido de la invención es un enzima que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 5 a partir del extremo carboxilo de la molécula de ácido graso. En las realizaciones preferidas de la invención, el ácido nucleico se deriva de Mortierella sp.; y el sustrato para dicho polipéptido se suministra exógenamente. Las células microbianas usadas en los procedimientos pueden ser, bien células eucariota o células procariotas. Las células eucariotas preferidas son aquéllas seleccionadas del grupo consistente en una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de hongo, y una célula de alga. Las células de mamífero preferidas incluyen una célula de ave, una célula de hongo preferida es una levadura, y la célula de alga preferida es una célula de alga marina. Las células procariotas preferidas incluyen aquéllas seleccionadas del grupo consistente en una bacteria, una cianobacteria, células que contienen un bacteriófago y/o un virus. La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la célula microbiana preferiblemente contiene un promotor que es funcional en la célula huésped, el cual opcionalmente es un promotor inducible, por ejemplo, por componentes del caldo de cultivo. Las células microbianas preferidas usadas en los procedimientos son células de levadura, tales como células de Saccharomyces.
Una célula de levadura recombinante de la invención podría convertir más de aproximadamente el 5% del sustrato de ácido graso 20:3 en el producto de ácido graso 20:4.
Hay una aceite que comprende uno o más PUFA que puede obtenerse mediante los procedimientos de la invención. La cantidad de dichos uno o más PUFA es aproximadamente del 0,3-30% de ácido araquidónico (ARA), aproximadamente del 0,2-30% de ácido dihomo-gamma-linoleico (DGLA), y aproximadamente del 0,2-30% de ácido gamma-linoleico (GLA). El aceite podría tener una proporción de ARA:DGLA:GLA que es aproximadamente del 1,0:19,0:0,30 al 6,0:1,0:0,2.
Los procedimientos de la invención podrían comprender adicionalmente la formulación del ácido graso en un producto seleccionado del grupo: composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable; una formula nutricional; una fórmula infantil; un suplemento dietario; una sustituto dietario; un cosmético; y un alimento para animales. En una realización preferida, las composiciones nutricionales de la invención están en una forma líquida o en una forma sólida. Las composiciones nutricionales de la invención preferiblemente se administran a un huésped mamífero parenteral o internamente.
Los procedimientos y materiales de la presente invención podrían usarse para desaturar un ácido graso, cultivando células microbianas de la invención en condiciones apropiadas para la expresión de un polipéptido codificado por el ácido nucleico, en donde la célula huésped comprende además un sustrato de ácido graso del polipéptido. El ácido graso desaturado mediante los procedimientos de la invención podría formularse en un aceite.
En las SEC. Nº ID. 1-34 se presentan secuencias purificadas de nucleótidos y péptido relacionadas con ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención. Las secuencias presentadas en las SEC. Nº ID. 1-34 podrían usarse como sondas para identificar secuencias relacionadas, como componentes de sistemas de expresión y como componentes de sistemas útiles para producir aceite transgénico.
La presente invención se dirige además a procedimientos para obtener biosistemas de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga alterados, mediante el cultivo de microbios transgénicos que codifican el productos de expresión de transgenes, los cuales desaturan una molécula de ácido graso en el carbono 5 a partir del extremo carboxilo de la molécula de ácido graso.
Los procedimientos de la presente invención podrían proporcionar fórmulas, suplementos dietarios, o suplementos dietarios en la forma de un líquido o sólido que contiene los ácidos grasos de cadena larga tal como se definen en las reivindicaciones. Estas fórmulas y suplementos podrían administrarse a un humano o a un animal.
Las fórmulas y suplementos producidos mediante procedimientos de la invención podrían comprender además al menos un macronutriente seleccionado del grupo consistente en aceite de coco, aceite de soja, aceite de colza, mono- y diglicéridos, glucosa, lactosa comestible, suero electrodializado, leche desnatada electrodializada, suero de leche, proteína de soja, y otros hidrolizados de proteína.
Las fórmulas producidas mediante procedimientos de la presente invención podrían comprender además al menos una vitamina seleccionada del grupo consistente en complejos de las Vitaminas A, C, D, E y B; y al menos un mineral seleccionado del grupo consistente en calcio, magnesio, zinc, manganeso, sodio, potasio, fósforo, cobre, cloro, yodo, selenio y hierro.
La presente invención proporciona también usos de la célula huésped de la invención tal como se establece en las reivindicaciones.
La presente invención podría usarse en un procedimiento para tratar un paciente que tiene una condición causada por una ingesta o producción insuficiente de ácidos grasos poliinsaturados, comprendiendo la administración al paciente de un sustituto dietario de la invención en una cantidad suficiente para efectuar el tratamiento del paciente.
La presente invención podría usarse para preparar cosméticos y composiciones farmacéuticas del material de la invención.
Las secuencias que tienen regiones con similitudes con las secuencias de nucleótidos de la presente invención se muestran en el grupo consistente en: SEC. Nº ID. 13; SEC. Nº ID. 15; SEC. Nº ID. 17; SEC. Nº ID. 19; SEC. Nº ID. 21; SEC. Nº ID. 22; SEC. Nº ID. 24; SEC. Nº ID. 25; SEC. Nº ID. 26; y SEC. Nº ID. 27.
Las secuencias que tienen regiones con similitudes con los polipéptidos de la presente invención se muestran en el grupo consistente en: SEC. Nº ID. 14; SEC. Nº ID. 16; SEC. Nº ID. 18; SEC. Nº ID. 20; SEC. Nº ID. 28; SEC. Nº ID. 29; SEC. Nº ID. 30; SEC. Nº ID. 31; SEC. Nº ID. 32; SEC. Nº ID. 33; y SEC. Nº ID. 34.
Los procedimientos de la presente invención podrían usarse para producir aceites transgénicos en portadoresfarmacéuticamente aceptables, y suplementos nutricionales, agentes cosméticos, y fórmulas infantiles que contienen aceites transgénicos.
La presente invención podría usarse en un procedimiento para obtener la biosíntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga que incluyera los pasos de: cultivar un microbio que tiene células que contienen un transgén que codifica un polipéptido de la invención, en donde el transgén está operativamente asociado con una secuencia de control de la expresión, en condiciones en las cuales se expresa el transgén, por lo cual la biosíntesis del ácido graso poliinsaturados de cadena larga en las células está alterada.
La presente invención también se refiere a la preparación de un ácido graso poliinsaturado seleccionado del grupo consistente en ARA, DGLA y EPA.
Los procedimientos de la presente invención podrían producir composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un nutriente seleccionado de entre el grupo consistente en una vitamina, un mineral, una carbohidrato, un azúcar, un aminoácido, un ácido graso libre, un fosfolípido, un antioxidante, y un compuesto fenólico.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra las posibles vías para la síntesis del ácido araquidónico (20:4 \Delta 5, 8, 11, 14) y el ácido estearidónico (18:4 \Delta6, 9, 12, 15) a partir de ácido palmítico (C_{16}) en una variedad de organismos, incluyendo las algas, Mortierella y humanos. Estos PUFA pueden servir como precursores de otras moléculas importantes para los humanos y otros animales, incluyendo las prostaciclinas, los leucotrienos, y las prostaglandinas, algunas de las cuales se muestran.
La Figura 2 muestra las posibles vías para la producción de PUFA además del ARA, incluyendo el EPA y el DHA, para una variedad de organismos.
La Figura 3A-D muestra la secuencia de ADN de la \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina y la secuencia de aminoácidos deducida.
La Figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos deducida del fragmento de PCR (ver Ejemplo 1).
Las Figuras 5A y 5B muestran el alineamiento de la secuencia de proteína de la \Delta5-desaturasa con \Delta6-desaturasas.
Las Figuras 6A y 6B muestran el efecto del momento exacto de adición del sustrato respecto la inducción sobre la conversión de sustrato a producto en SC334 que contienen el gen de la \Delta5-desaturasa.
Las Figuras 7A y 7B muestran el efecto de la concentración de inductor sobre la expresión de la \Delta5-desaturasa en SC334.
Las Figuras 8A y 8B muestran el efecto de la temperatura de inducción sobre la actividad de la \Delta5-desaturasa en SC334.
Las Figuras 9A y 9B muestra el efecto de la cepa huésped sobre la conversión del sustrato a producto en cepas que expresan el gen de la \Delta5-desaturasa a 15ºC.
Las Figuras 10A y 10B muestra el efecto de la cepa huésped sobre la conversión del sustrato a producto en cepas que expresan el gen de la \Delta5-desaturasa a 30ºC.
La Figura 11 muestra el efecto de una cepa huésped que expresa la transferasa de colina, así como el gen de la \Delta5-desaturasa, sobre la conversión del sustrato a producto.
Las Figuras 12A y 12B muestran el efecto de la composición del medio y de la temperatura sobre la conversión del sustrato a producto en dos cepas huéspedes que expresan el gen de la \Delta5-desaturasa.
La Figura 13 muestra el alineamiento de la secuencia de proteína de Ma 29 y contig 253538a.
La Figura 14 muestra el alineamiento de la secuencia de proteína de Ma 524 y contig 253538a.
Breve descripción de los listados de secuencias
La SEC. Nº ID. 1 muestra una secuencia de ADN de la \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina.
La SEC. Nº ID. 2 muestra una secuencia deaminoácidos de la \Delta5- desaturasa de Mortierella alpina.
La SEC. Nº ID. 3 muestra una secuencia de aminoácido deducida del fragmento de PCR de Mortierella alpina (ver Ejemplo 1).
Las SEC. Nº ID. 4 - SEC. Nº ID. 7 muestran las secuencias de aminoácidos deducidas de varias \Delta6-desaturasas.
Las SEC. Nº ID. 8 y SEC. Nº ID. 9 muestran las secuencias de cebadores de PCR para las \Delta6-desaturasas.
La SEC. Nº ID. 10 muestra un cebador para las transcripción inversa del ARN total.
Las SEC. Nº ID. 11 y SEC. Nº ID. 12 muestran motivos de aminoácidos para secuencias de desaturasas.
Las SEC. Nº ID. 13 y SEC. Nº ID. 14 muestran las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de una secuencia de desaturasa de Dictyostelium discoideum.
Las SEC. Nº ID. 15 y SEC. Nº ID. 16 muestran las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de una secuencia de desaturasa de Phaeodactylum tricornutum.
Las SEC. Nº ID. 17-20 muestran las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducida de un clon de cADN de Schizochytrium.
Las SEC. Nº ID. 21-27 muestran las secuencias de nucleótidos de desaturasas humanas.
Las SEC. Nº ID. 27-SEC. Nº ID. 34 muestran las secuencias peptídicas de desaturasas humanas.
Descripción detallada de la invención
Con objeto de asegurar una completa comprensión de la invención, se proporcionan las siguientes definiciones:
\Delta5-Desaturasa: la \Delta5 desaturasa es un enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 5 y 6 a partir del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso.
\Delta6-Desaturasa: la \Delta6 desaturasa es un enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 6 y 7 a partir del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso.
\Delta9-Desaturasa: la \Delta9 desaturasa es un enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 9 y 10 a partir del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso.
\Delta12-Desaturasa: la \Delta12 desaturasa es un enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 12 y 13 a partir del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso.
Ácido graso: los ácidos grasos son una clase de compuestos que contienen una cadena hidrocarbonada larga y un grupo carboxilato terminal. Los ácidos grasos incluyen los siguientes:
Ácidos grasos
12:0 ácido láurico
16:0 ácido palmítico
16:1 ácido palmitoleico
18:0 ácido esteárico
18:1 ácido oleico \Delta9-18:1
18:2 \Delta5,9 ácido taxoleico \Delta5,9-18:2
18:2 \Delta6,9 ácido 6,9-octadecadienoico \Delta6,9-18:2
18:2 ácido linoleico \Delta9,12-18:2 (LA)
18:3 \Delta6,9,12 ácido gamma-linoleico \Delta6,9,12-18:3 (GLA)
18:3 \Delta5,9,12 ácido pinolénico \Delta5,9,12-18:3
18:3 ácido alfa-linoleico \Delta6,9,12-18:3 (ALA)
18:4 ácido estearidónico \Delta6,9,12,15-18:4 (SDA)
20:0 ácido araquidónico
20:1 ácido eicosenoico
22:0 ácido behénico
22:1 ácido erúcico
22:2 ácido docosadienoico
20:4 \omega6 ácido araquidónico \Delta5,8,11,14-20:4 (ARA)
20:3 \omega6 \omega6-eicosatrienoico (dihomo-gamma-linolénico) \Delta8,11,14-20:3 (DGLA)
20:5 \omega3 eicosapentanoico (ácido timnodónico) \Delta5,8,11,14,17-20:5 (EPA)
20:3 \omega3 \omega3-eicosatrienoico \Delta11,16,17-20:3
20:4 \omega3 \omega3-eicosatetraenoico \Delta8,11,14,17-20:4
22:5 \omega3 docosapentaenoico \Delta7,10,13,16,19-22:5 (\omega3DPA)
22:6 \omega3 docosahexaenoico (ácido cervónico) \Delta4,7,10,13,16,19-22:6 (DHA)
24:0 ácido lignocérico
Tomando en consideración estas definiciones, la presente invención se dirige a nuevas secuencias de ADN, se proporcionan construcciones de ADN, procedimientos y composiciones que permiten la modificación del contenido en ácido graso de cadena larga poliinsaturado de, por ejemplo, células microbianas o animales. Las células huéspedes se manipulan para expresar un transcrito con sentido o antisentido de un ADN que codifica un(os) polipéptido(s) el(los) cual(es) cataliza(n) la conversión de un DGLA a ARA. El(los) sustrato(s) para el enzima expresado podrían ser producidos por la célula huésped o podrían suministrarse exógenamente. Para conseguir la expresión, el ADN transformado está operativamente asociado con regiones de iniciación de la transcripción o de la traducción y de terminación que son funcionales en la célula huésped. Las construcciones que comprenden el gen a ser expresado pueden proporcionar los medios para su integración en el genoma de la célula huésped, o pueden replicarse autónomamente en la célula huésped. Para la producción de ARA, los cassettes de expresión generalmente usados incluyen un cassette que proporciona actividad \Delta5-desaturasa, particularmente en una célula huésped que produce o puede captar DGLA. La producción de ácidos grasos insaturados del tipo \omega6, tales como el ARA, está favorecida en un microorganismo huésped o un animal que está sustancialmente libre de ALA. El huésped se selecciona u obtiene suprimiendo o inhibiendo la actividad de una desaturasa del tipo \Delta15 u \omega3 (ver Figura 2). La actividad desaturasa endógena puede afectarse proporcionando un cassette de expresión para un transcrito \Delta15 u \omega3 antisentido, alterando un gen diana de \Delta15- u \omega3-desaturasa a través de la inserción, sustitución y/o supresión de la totalidad o parte del gen diana, o mediante la adición de un inhibidor de \Delta15- u \omega3-desaturasa. La producción de LA puede incrementarse también proporcionando cassettes de expresión para desaturasas \Delta9 y/o \Delta12, en donde sus respectivas actividades enzimáticas son limitantes.
Producción microbiana de ácidos grasos
La producción microbiana de ácidos grasos tiene varias ventajas respecto a la purificación a partir de fuentes naturales tales como los peces o plantas. Se conocen muchos microbios con composiciones de aceites enormemente simplificadas en comparación con aquéllas de organismos superiores, haciendo más fácil la purificación de los componentes deseados. La producción microbiana no está sujeta a fluctuaciones causadas por variables externas tales como el tiempo y el aporte de nutrientes. El aceite producido microbianamente está sustancialmente libre de contaminación por parte de contaminantes medioambientales. Adicionalmente, los microbios pueden proporcionar PUFA en formas particulares que podrían tener usos específicos. Por ejemplo, Spirullina puede proporcionar PUFA predominantemente en las posiciones primera y tercera de los triglicéridos; la digestión mediante lipasas pancreáticas preferentemente libera ácidos grasos en estas posiciones. A continuación de la ingestión humana o animal de triglicéridos derivados de Spirullina, estos PUFA son liberados por las lipasas pancreáticas como ácidos grasos libres y, por tanto, están directamente disponibles para, por ejemplo, el desarrollo cerebral de los niños. Adicionalmente, la producción de aceites microbiana puede manipularse mediante el control de las condiciones de cultivo, notablemente mediante el suministro de sustratos particulares para enzimas expresados microbianamente, o mediante la adición de compuestos que suprimen vías bioquímicas no deseadas. Además de estas ventajas, la producción de ácidos grasos a partir de microbios recombinantes proporciona la capacidad de alterar el perfil de ácidos grasos que ocurre de forma natural mediante la aportación de nuevas vías sintéticas en el huésped, o mediante la supresión de vías no deseadas, incrementando de ese modo los niveles de PUFA deseados, o formas conjugadas de los mismos, y disminuyendo los niveles de PUFA no deseados.
Producción de ácidos grasos en animales
La producción de ácidos grasos en animales también presenta varias ventajas. La expresión de genes de desaturasas en animales puede producir niveles enormemente incrementados de PUFA deseados en tejidos animales, haciendo la recuperación a partir de estos tejidos más económica. Por ejemplo, cuando los PUFA deseados se expresan en la leche materna de animales, los procedimientos para aislar PUFA a partir de la leche del animal están bien establecidos. Además de proporcionar una fuente para la purificación de los PUFA deseados, la leche materna de animales puede manipularse a través de la expresión de genes de desaturasas, bien sólos o en combinación con otros genes humanos, para proporcionar leches de animales con una composición de PUFA sustancialmente similar a la leche materna humana durante las diferentes etapas de desarrollo infantil. Las leches de animales humanizadas podrían servir como fórmulas para bebés cuando la lactancia humana es imposible o no deseada, o en los casos de malnutrición o enfermedad.
Dependiendo de la célula huésped, la disponibilidad de sustrato, y de los producto(s) final(es) deseado(s), son de interés varios polipéptidos, particularmente desaturasas. Por "desaturasa" se pretende indicar un polipéptido que puede desaturar uno o más ácidos grasos para producir un ácido graso mono- o poliinsaturado de interés, o un precursor del mismo. Son particularmente interesantes los polipéptidos que pueden catalizar la conversión de DGLA para producir ARA, lo cual incluye enzimas que desaturan en la posición \Delta5. Por "polipéptido" se quiere indicar cualquier cadena de aminoácidos, con independencia de la longitud o modificación posterior a la traducción, por ejemplo, glicosilación o fosforilación. Las consideraciones para escoger un polipéptido específico que tenga actividad desaturasa incluyen el pH óptimo del polipéptido, si el polipéptido o un componente del mismo es un enzima limitante de la velocidad, si la desaturasa usada es esencial para la síntesis de un ácido graso poliinsaturado deseado, y/o los cofactores requeridos por el polipéptido. El polipéptido expresado preferiblemente tiene parámetros compatibles con el entorno bioquímico de su lugar en la célula huésped. Por ejemplo, el polipéptido podría tener que competir por el sustrato con otros enzimas en la célula huésped. Los análisis de la K_{m} y de la actividad específica del polipéptido en cuestión se consideran, por tanto, a la hora de determinar la conveniencia de un determinado polipéptido para modificar la producción de PUFA en una célula huésped determinada. El polipéptido usado en una situación particular es uno que puede funcionar en las condiciones presentes en la célula huésped deseada, pero, por otra parte, puede ser cualquier polipéptido que tenga actividad desaturasa que tenga las características deseadas de ser capaz de modificar la producción relativa de un PUFA deseado.
Para la producción de ARA, la secuencia de ADN usada codifica un polipéptido que tiene actividad \Delta5-desaturasa. En casos concretos, ésta puede acoplarse con un cassette de expresión que proporciona los medios para la producción de un polipéptido que tiene actividad \Delta6-desaturasa, y la célula huésped puede vaciarse opcionalmente de cualquier actividad \Delta15-desaturasa presente, por ejemplo, proporcionando un cassette de transcripción para la producción de secuencias antisentido contra el producto de la transcripción de la \Delta15-desaturasa, mediante la alteración del gen de la \Delta15-desaturasa, o usando un célula huésped que tiene de forma natural, o ha sido mutada para tener, una actividad \Delta15-desaturasa baja. La inhibición de las vías de desaturasas no deseadas puede conseguirse también a través del uso de inhibidores de desaturasas específicos, tales como aquéllos descritos en la patente estadounidense nº 4.778.630. La elección de la combinación de cassettes usados puede depender en parte del perfil de PUFA de la célula huésped. Cuando la actividad \Delta15-desaturasa de la célula huésped es limitante, sólo la sobreexpresión de la \Delta5-desaturasa será generalmente suficiente para proporcionar una producción de ARA mejorada en presencia de un sustrato apropiado tal como el DGLA. La producción de ARA también puede incrementarse proporcionando cassettes de expresión para los genes de las \Delta9- y \Delta12-desaturasas cuando las actividades de estas desaturasas sean limitantes. En la Figura 1 se muestra un esquema para la síntesis de ácido araquidónico (20:4 \Delta^{5,8,11,14}) a partir de ácido palmítico. Un enzima clave en esta vía es una \Delta5-desaturasa que convierte el ácido DH-\gamma-linolénico (DGLA, ácido eicosatrienoico) en ARA. También se muestra la conversión de ácido \alpha-linolénico (ALA) en ácido estearidónico por parte de una \Delta6-desaturasa. La producción de PUFA además del ARA, incluyendo el EPA y DHA, se muestra en la Figura 2.
Fuentes de polipéptidos que tienen actividad desaturasa
Los organismos que producen un ácido graso poliinsaturado deseado son una fuente de polipéptidos que tienen actividad desaturasa y de oligonucleótidos que codifican tales polipéptidos. Como ejemplo, los microorganismos que tienen la capacidad de producir ARA pueden usarse como una fuente de actividad \Delta5-desaturasa. Tales microorganismos incluyen, por ejemplo, aquéllos que pertenecen al género Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophathora, Penicillium, Porphyridium, Coidosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula, y Entomophthora. Dentro del género Porphyridium, es de especial interés Porphyridium cruentum. Dentro del género Mortierella, es de especial interés Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila, Mortierella ramanniana, var. angulispora, y Mortierella alpina. Dentro del género Mucor, es de especial interés Mucor circinelloides y Mucor javanicus.
Los ADN que codifican las desaturasas deseadas pueden identificarse de diversas formas. Como ejemplo, una fuente de la desaturasa deseada, por ejemplo, las bibliotecas genómicas o de cADN de Mortierella, se examinan con sondas sintetizadas enzimática o químicamente, las cuales pueden construirse a partir de ADN, ARN, o de nucleótidos que no ocurren de forma natural, o mezclas de los mismos. Las sondas podrían sintetizarse enzimáticamente a partir de ADN de desaturasas conocidas para procedimientos de hibridación con rigurosidad normal o reducida. Las sondas de oligonucleótidos pueden usarse también para examinar fuentes, y pueden basarse en secuencias de desaturasas conocidas, incluyendo secuencias conservadas entre las desaturasas conocidas, o en secuencias de péptidos obtenidas a partir de la proteína deseada purificada. Las sondas de oligonucleótidos basadas en secuencias de aminoácidos pueden hacerse degenerar para abarcar la degeneración del código genético, o pueden predisponerse en favor de los codones preferidos del organismo fuente. Los oligonucleótidos pueden usarse también como cebadores para PCR a partir de ARNm transcrito a la inversa procedente de una fuente conocida o sospechosa; el producto de la PCR puede ser el cADN de longitud completa o puede usarse para generar una sonda para obtener el cADN de longitud completa deseado. Alternativamente, podría secuenciarse completamente una proteína deseada y realizarse la síntesis total de un ADN que codifica ese polipéptido.
Una vez se ha aislado el ADN genómico o cADN deseado, éste puede secuenciarse mediante procedimientos conocidos. Se sabe en la técnica que tales procedimientos están sujetos a errores, de tal forma que la múltiple secuenciación de la misma región es práctica rutinaria y todavía se espera que conduzca a frecuencias de errores medibles en la secuencia deducida resultante, particularmente en regiones que tienen dominios repetidos, extensa estructura secundaria, o composiciones de bases inusuales, tales como regiones con un contenido elevado en bases GC. Cuando surgen discrepancias, puede realizarse el secuenciado de nuevo y pueden emplearse procedimientos especiales. Tales procedimientos especiales pueden incluir alterar las condiciones de secuenciación mediante el uso de: temperaturas diferentes; enzimas diferentes; proteínas que alteran la capacidad de los oligonucleótidos para formar estructuras de orden superior; nucleótidos alterados tales como ITP o dGTP metilado; composiciones de gel diferentes, por ejemplo, añadiendo formamida; cebadores diferentes o cebadores ubicados a diferentes distancias de la región problema; o plantillas diferentes tales como ADN de hebra única. También puede emplearse la secuenciación del ARNm.
En la mayor parte de los casos, parte o toda la secuencia codificante del polipéptido que tiene actividad desaturasa procede de una fuente natural. No obstante, en algunas situaciones, es deseable modificar toda o una porción de los codones, por ejemplo, para potenciar la expresión, mediante el empleo de codones preferidos del huésped. Los codones preferidos del huésped pueden determinarse a partir de los codones con la frecuencia más elevada en las proteínas expresadas en la cantidad más elevada en una especies de huésped concreta de interés. De ese modo, la secuencia codificante para un polipéptido que tiene actividad desaturasa puede sintetizarse completamente o en parte. Pueden sintetizarse también la totalidad o porciones del ADN para suprimir cualesquiera secuencias o regiones de estructura secundaria desestabilizantes que estarían presentes en el ARNm transcrito. Pueden sintetizarse también la totalidad o porciones del ADN para alterar la composición de bases a una más preferible en la célula huésped deseada. Los procedimientos para sintetizar secuencias y agrupar las secuencias juntas están bien establecidos en la literatura. Pueden emplearse la mutagénesis in vitro y la selección, la mutagénesis dirigida a un sitio, u otros medios, para obtener mutaciones de genes de desaturasas que ocurren de forma natural, para producir un polipéptido que tenga actividad desaturasa in vivo con parámetros cinéticos y físicos más deseables para su función en la célula huésped, tales como una vida media más larga o una velocidad de producción más elevada de un ácido graso poliinsaturado deseado.
Desaturasa de Mortierella alpina
Es de particular interés la \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina, la cual tiene 446 aminoácidos; la secuencia de aminoácidos se muestra en la Figura 3. El gen que codifica la \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina puede expresarse en microorganismos transgénicos o animales para efectuar una síntesis mayor de ARA a partir de DGLA. También pueden usarse otros ADN que son sustancialmente idénticos al ADN de la \Delta5-desaturasa, o que codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos al polipéptido de la \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina. Por sustancialmente idéntico se quiere indicar una secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico que presentan, en orden de preferencia creciente, al menos un 60%, 80%, 90% o 95% de homología con la secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina. Para los polipéptidos, la longitud de las secuencias de comparación es de al menos 16 aminoácidos, preferiblemente al menos 20 aminoácidos, o más preferiblemente 35 aminoácidos. Para los ácidos nucleicos, la longitud de las secuencias de comparación es generalmente de al menos 50 nucleótidos, preferiblemente al menos 60 nucleótidos, y más preferiblemente al menos 75 nucleótidos, y los más preferiblemente, 110 nucleótidos. La homología se mide típicamente usando un programa de análisis de secuencias, por ejemplo, el paquete de programas de Análisis de Secuencias del Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wisconsin 53715), y MacVector (Oxford Molecular Group, 2105 S. Bascom Avenue, Suite 200, Campbell, California 95008). Tales programas emparejan secuencias similares mediante la asignación de grados de homología a varias sustituciones, supresiones y otras modificaciones. Las sustituciones conservadores típicamente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Las sustituciones podrían hacerse también en base a la hidrofobicidad o hidrofilicidad conservada (Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)), o en base a la capacidad de asumir una estructura secundaria de polipéptido similar (Chou y Fasman, Adv. Enzymol. 47:45-148 (1978)).
Otras desaturasas
Abarcadas por la presente invención, están las desaturasas relacionadas procedentes del mismo u otros organismos, tal como se define en las reivindicaciones. Tales desaturasas relacionadas incluyen variantes de la \Delta5-desaturasa descrita, que ocurren de forma natural en la misma o diferentes especies de Mortierella, así como los homólogos de la \Delta5-desaturasa descrita procedentes de otras especies. También se incluyen desaturasas que, aunque no son sustancialmente idénticas a la \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina, desaturan una molécula de ácido graso en el carbono 5 respecto el extremo carboxilo de una molécula de ácido graso. Las desaturasas relacionadas pueden identificarse por su capacidad para funcionar sustancialmente lo mismo que las desaturasas descritas; es decir, que son capaces todavía de convertir efectivamente el DGLA en ARA. Las desaturasas relacionadas pueden identificarse también mediante búsqueda en bases de datos de secuencias de secuencias homólogas a la desaturasa descrita, mediante hibridación de una sonda basada en la desaturasa descrita con una biblioteca construida a partir del organismo fuente, o mediante RT-PCR usando ARNm procedente del organismo fuente y cebadores basados en la desaturasa descrita. Tales desaturasas incluyen aquéllas procedentes de humanos, Dictyostelium discoideum y Phaeodactylum tricornutum.
Las regiones de un polipéptido de desaturasa importantes para la actividad desaturasa pueden determinarse a través de mutagénesis de rutina, expresión de los polipéptidos mutantes resultantes, y determinación de sus actividades. Los mutantes podrían incluir supresiones, inserciones, y mutaciones en un punto, o combinaciones de las mismas. Un análisis de función típico empieza con la mutagénesis de supresión para determinar los límites N- y C-terminales de la proteína necesaria para la función, y a continuación se hacen supresiones, inserciones o mutaciones en un punto para determinar además otras regiones necesarias para la función. También pueden usarse otras técnicas tales como la mutagénesis en cassette o la síntesis total. La mutagénesis de supresión se consigue, por ejemplo, usando exonucleasas para suprimir secuencialmente las regiones codificantes 5' y 3'. Hay equipos disponibles para tales técnicas. Después de la supresión, la región codificante se completa mediante la ligación de oligonucleótidos, que contienen respectivamente codones de inicio o detención, a la región codificante suprimida después de la supresión 5' o 3'. Alternativamente, los oligonucleótidos que contienen codones de inicio o detención se insertan en la región codificante mediante una variedad de procedimientos que incluyen la mutagénesis dirigida a un sitio, la PCR mutagénica, o mediante ligación en ADN digerido en sitios de restricción existentes. Las supresiones internas pueden hacerse de forma similar a través de un variedad de procedimientos, incluyendo el uso de sitios de restricción existentes en el ADN, mediante el uso de cebadores mutagénicos a través de la mutagénesis dirigida o la PCR mutagénica. Las inserciones se hacen a través de procedimientos tales como la mutagénesis de barrido con engarce, la mutagénesis dirigida a un sitio, o la PCR mutagénica. Las mutaciones en un punto se hacen a través de técnicas tales como la mutagénesis dirigida a un sitio o la PCR mutagénica.
También puede usarse la mutagénesis química para identificar regiones de un polipéptido desaturasa que sonimportantes para su actividad. Se expresa una construcción mutada, y se analiza la capacidad de la proteína alterada resultante para funcionar como una desaturasa. Tal análisis estructura-función puede determinar qué regiones podrían suprimirse, qué regiones toleran inserciones, y que mutaciones en punto permiten que la proteína mutante funcione sustancialmente de la misma forma que la desaturasa nativa. La totalidad de tales proteínas mutantes y secuencias de nucleótidos que las codifican se hallan dentro del ámbito de la presente invención.
Expresión de genes de desaturasas
Una vez se ha obtenido el ADN que codifica un polipéptido desaturasa, es coloca en un vector capaz de replicación en una célula huésped, o se propaga in vitro por medio de técnicas tales como la PCR o la PCR larga. Los vectores de replicación pueden incluir plásmidos, fagos, virus, cósmidos, y similares. Los vectores deseables incluyen aquéllos útiles para la mutagénesis del gen de interés o para la expresión del gen de interés en las células huéspedes. La técnica de la PCR larga ha hecho posible la propagación de construcciones grandes, de forma que las modificaciones del gen de interés, tales como la mutagénesis o la adición de señales de expresión, y la propagación de las construcciones resultantes puedan efectuarse in vitro sin el uso de un vector de replicación o una célula huésped.
Para la expresión de una polipéptido desaturasa, se unen regiones funcionales de iniciación y terminación de la transcripción y traducción al ADN que codifica el polipéptido desaturasa. La expresión de la región que codifica el polipéptido puede tener lugar in vitro o en una célula huésped. Las regiones de iniciación o terminación de la transcripción o traducción se derivan de una variedad de especies no exclusivas. incluyendo el ADN a expresar, genes conocidos o sospechosos de ser capaces de expresarse en el sistema deseado, vectores de expresión, síntesis química, o a de un locus endógeno en una célula huésped.
Expresión in vitro
La expresión in vitro puede conseguirse, por ejemplo, colocando la región codificante del polipéptido desaturasa en un vector de expresión diseñado para su uso in vitro, y añadiendo lisado de reticulocito de conejo y cofactores; si se desea pueden incorporarse aminoácidos aislados. Tales vectores de expresión in vitro podrían proporcionar algunas o todas las señales de expresión necesarias en el sistema usado. Estos procedimientos son bien conocidos en la técnica y los componentes del sistema están disponible comercialmente. La mezcla de reacción puede ensayarse entonces directamente en busca del polipéptido, por ejemplo, determinando su actividad, o el polipéptido sintetizado puede purificarse y ensayarse a continuación.
Expresión en una célula huésped
La expresión en una célula huésped puede conseguirse de forma transitoria o estable. La expresión transitoria puede ocurrir a partir de construcciones introducidas que contienen señales de expresión funcionales en la célula huésped, construcciones que sin embargo no se replican y raramente se integran en la célula huésped, o en donde la célula huésped no se está proliferando. La expresión transitoria puede conseguirse también induciendo la actividad de un promotor regulable unido operativamente al gen de interés, aunque tales sistemas inducible frecuentemente exhiben un nivel de expresión basal bajo. La expresión estable puede conseguirse mediante la introducción de una construcción que puede integrarse en el genoma del huésped o que se replica autónomamente en la célula huésped. La expresión estable del gen de interés puede seleccionarse a través del uso de un marcador seleccionable ubicado en o transfectado con la construcción de expresión, seguida por la selección de células que expresan el marcador. Cuando la expresión estable es el resultado de la integración, la integración de las construcciones puede ocurrir aleatoriamente dentro del genoma huésped, o puede dirigirse a través del uso de construcciones que contienen regiones con homología suficiente con el genoma huésped como para apuntar la recombinación al locus del huésped. Cuando las construcciones se apuntan hacia un locus endógeno, todas o algunas de las regiones reguladoras de la transcripción y traducción pueden se proporcionas por el locus endógeno.
Cuando se desea la expresión incrementada del polipéptido desaturasa en el organismo fuente, pueden emplearse varios procedimientos. Pueden introducirse en el organismo huésped genes adicionales que codifiquen el polipéptido desaturasa. La expresión a partir del locus de la desaturasa nativo puede incrementarse también a través de la recombinación homóloga, por ejemplo, insertando un promotor más fuerte en el genoma huésped para causar una expresión incrementada, suprimiendo secuencias desestabilizadoras bien del ARNm o de la proteína codificada mediante la supresión de esa información del genoma del huésped, o añadiendo secuencias estabilizadoras al ARNm (USPN 4.910.141).
Cuando es deseable expresar más de un gen diferente, las regiones reguladoras apropiadas y los procedimientos de expresión introducidos en genes pueden propagarse en la célula huésped a través del uso de vectores de replicación o mediante integración en el genoma huésped. Cuando dos o más genes se expresan a partir de vectores de replicación separados, es deseable que cada vector tenga un medio de replicación diferente. Cada construcción introducida, esté integrada o no, debería tener medios de selección diferentes y debería carecer de homología con las otras construcciones para mantener la expresión estable e impedir la reordenación de elementos entre construcciones. Las elecciones juiciosas de regiones reguladoras, medios de selección, y procedimientos de propagación de la construcción introducida pueden determinarse experimentalmente, de forma que todos los genes introducidos se expresen con los niveles necesarios para proporcionar la síntesis de los productos deseados.
Como un ejemplo, cuando la célula huésped es una levadura, se proporcionan regiones de transcripción y traducción que son funcionales en células de levadura, particularmente procedentes de las especies huésped. Las regiones reguladoras del inicio de la transcripción pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de genes en la vía glicolítica, tales como el de la deshidrogenasa de alcohol, la deshidrogenasa del gliceraldehído-3-fosfato (GDP), la fosfoglucoisomerasa, la quinasa de fosfoglicerato, etc, o de genes regulables tales como el de la fosfatasa ácida, el de la lactasa, el de la metalotioneína, el de la glucoamilasa, etc. En una situación concreta, puede usarse una cualquiera de un cierto número de secuencias reguladoras, dependiendo de si se desea la transcripción constitutiva o inducida, de la eficiencia concreta del promotor conjuntamente con la pauta de lectura abierta de interés, la capacidad para unir un promotor fuerte con una región de control procedente de un promotor diferente que permite la transcripción inducible, la facilidad de construcción, y similares. Son de particular interés los promotores que se activan en presencia de galactosa. Los promotores inducible con galactosa (GAL1, GAL7, y GAL10) se han usado ampliamente para la expresión con elevados niveles y regulada en levaduras (Lue et al., Mol. Cell Biol. 7:3446 (1987); Johnson, Microbiol. Rev. 51:458 (1987), La transcripción a partir de los promotores GAL es activada por la proteína GAL4, la cual se une a la región promotora y activa la transcripción cuando la galactosa está presente. En ausencia de galactosa, el antagonista GAL80 se une al GAL4 e impide que el GAL4 active la transcripción. La adición de galactosa impide que el GAL80 inhiba la activación de la GAL4.
Se ha hallado que las secuencias de nucleótidos que roden el codon ATG de iniciación de la transcripción afectan la expresión en células de levadura. Si el polipéptido deseado se expresa pobremente en levadura, las secuencias de nucleótidos de genes exógenos pueden modificarse para incluir una secuencia de iniciación de la traducción en levadura eficiente para obtener una expresión óptima del gen. Para la expresión en Saccharomyces, esto puede hacerse mediante la mutagénesis dirigida a un sitio de un gen expresado ineficientemente, fusionándolo en pauta con un gen endógeno de Saccharomyces, preferiblemente un gen muy expresado, tal como el gen de la lactasa.
La región de terminación puede derivarse de la región 3' del gen a partir del cual se obtuvo la región de iniciación o a partir de un gen diferente. Se conocen un gran número de regiones de terminación y se ha hallado que son satisfactorias en una variedad de huéspedes del mismo y diferentes géneros y especies. La región de terminación usualmente se selecciona más por una cuestión de conveniencia que a causa de una propiedad concreta. Preferiblemente, la región de terminación se deriva de un gen de levadura, particularmente de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida o Kluyveromyces. Se sabe también que las regiones 3' de dos genes de mamíferos, del \gamma-interferón y \alpha2-interferón, funcionan en levaduras.
Introducción de construcciones en células huéspedes
Las construcciones que comprenden el gen de interés podrían introducirse en una célula huésped mediante técnicas estándares. Estas técnicas incluyen la transformación, la fusión con protoplastos, la lipofección, la transfección, la transducción, la conjugación, la infección, el impacto con bolas (bolistic impact), la electroporación, la microinyección, el raspado, o cualquier otro procedimiento que introduzca el gen de interés dentro de la célula huésped. Los procedimientos de transformación que se usan incluyen la transformación con acetato de litio (Methods in Enzymology, 194:186-187 (1991)). Por conveniencia, una célula huésped que ha sido manipulada mediante cualquier procedimiento para captar una secuencia o construcción de ADN se denominará en ésta como "transformada" o "recombinante".
El huésped sujeto tendrá al menos una copia de la construcción de expresión y podría tener dos o más, dependiendo de si el gen está integrado en el genoma, amplificado, o si está presente en un elemento extracromosómico que tiene múltiples números de copias. Cuando el huésped sujeto es una levadura, pueden usarse cuatro tipos principales de vectores plasmídicos para lavaduras: los plásmidos de integración en levadura (YIp), los plásmidos de replicación en levadura (YRp), los plásmidos del centrómero de levadura (YCp), y los plásmidos episomales de levadura (YEp). Los YIp carecen de un origen de replicación de levadura y deben propagarse como elementos integrados en el genoma de levadura. Los YRp tienen una secuencia de replicación autónoma derivada del cromosoma y se propagan como plásmidos que se segregan de forma inestable, replicándose autónomamente, con un número de copias medio (20 a 40). Los YCp tiene tanto una región de origen de la replicación como una secuencia de centrómero, y se propagan como plásmidos que se segregan establemente, se replican autónomamente, con un número de copias bajo (10 a 20). Los YEp tienen un origen de replicación procedente del plásmido de 2 \mum y se propagan como plásmidos que se segregan irregularmente, replicándose autónomamente, con un número de copias elevado. La presencia de los plásmidos en las levaduras puede asegurarse manteniendo la selección para un marcador en el plásmido. Son de particular interés los vectores de levadura pYES2 (un plásmido YEp disponible de Invitrogen, confiere prototrofía para el uracilo y un promotor inducible con galactosa, GAL1, para la expresión), pRS425-pG1 (un plásmido YEp obtenido del Dr. T.H. Chang, profesor agregado de Genética Molecular, Ohio State University, que contiene un promotor GDP constitutivo y confiere prototrofía para la leucina), y el pYX424 (un plásmido YEp que tiene un promotor TP1 constitutivo y confiere prototrofía para la leucina; Alber, T. y Kawasaki, G., J. Mol. & Appl. Genetics 1:419 (1982)).
La célula huésped transformada puede identificarse mediante la selección para un marcador contenido en la construcción introducida. Alternativamente, podría introducirse una construcción marcadora separada con la construcción deseada, puesto que muchas técnicas de transformación introducen muchas moléculas de ADN en las células huésped. Típicamente, las células transformadas se seleccionan por su capacidad para crecer en un medio selectivo. Los medios selectivos podrían incorporar un antibiótico o carecer de un factor necesario para el crecimiento de los huéspedes no transformados, tal como un nutriente o un factor de crecimiento. Por consiguiente, un gen marcador introducido podría conferir resistencia al antibiótico, o codifica un factor de crecimiento o enzima esencial, y permitir el crecimiento en medio selectivo cuando se expresa en el huésped transformado. La selección de un huésped transformado puede ocurrir también cuando la proteína marcadora expresada puede detectarse, bien directa o indirectamente. La proteína marcadora podría expresarse sola o como una fusión con otra proteína. La proteína marcadora podría detectarse mediante su actividad enzimática; por ejemplo, la \beta-galactosidasa puede convertir el sustrato X-gal en un producto coloreado, y la luciferasa podría convertir la luciferina en un producto emisor de luz. La proteína marcadora puede detectarse por sus características productoras de luz o modificantes; por ejemplo, la proteína fluorescente verde de Aequorea victoria fluoresce cuando se ilumina con luz azul. Pueden usarse anticuerpos para detectar la proteína marcadora o una marca molecular sobre, por ejemplo, una proteína de interés. Las células que expresan la proteína marcadora o la etiqueta pueden seleccionarse, por ejemplo, visualmente, o mediante técnicas tales como el FACS o el cribado usando anticuerpos. Para la selección de transformantes de levadura, podría usarse cualquier marcador que funcione en levaduras. Deseablemente, son de interés la resistencia a la kanamicina y al aminoglicósido G418, así como la capacidad de crecer en medio que carece de uracilo, leucina, lisina o triptófano.
La producción mediada por \Delta5-desaturasa de PUFA puede realizarse tanto en células huésped procariotas como en eucariotas. Las células procariotas de interés incluyen Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, cianbocaterias, y similares. Las células eucariotas incluyen las células de mamíferos, tales como aquéllas procedentes de animales lactantes, de células de aves como los pollos, y otras células susceptibles de manipulación genética, incluyendo las células de insectos, hongos y algas. Las células podrían cultivarse o formarse como una parte o totalidad de un organismo huésped, incluyendo un animal. Los virus y los bacteriófagos podrían usarse también con las células en la producción de PUFA, particularmente para la transferencia de genes, marcaje celular, y selección. En una realización preferida, el huésped es cualquier microorganismo o animal que produce DGLA y/o puede asimilar DGLA suministrado exógenamente, y preferiblemente produce grandes cantidades de DGLA. Los ejemplos de tales animales huéspedes incluyen los ratones, las ratas, los conejos, los pollos, la codorniz, los pavos, los bovinos, las ovejas, los cerdos, las cabras, los yak, etc., los cuales son susceptibles de manipulación genética y clonación para la expansión rápida de la población que expresa el transgén. Para los animales, el transgén de la \Delta5-desaturasa puede adaptarse para su expresión en orgánulos, tejidos, y fluidos corporales deseados, a través de la modificación de las regiones reguladoras del gen. Es de especial interés la producción de PUFA en la leche de lactancia del animal huésped.
Expresión en levadura
Los ejemplos de microorganismos huéspedes incluyen Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, u otros tipos de levaduras tales como Candida, Kluyveromyces, u otros hongos, por ejemplo, hongos filamentosos tales como Aspergillus, Neurospora, Penicillium, etc. Las características deseables de un microorganismo huésped son, por ejemplo, que esté bien caracterizado genéticamente, que pueda usarse para niveles elevados de expresión del producto usando fermentación a densidad ultra-alta, y que esté en la lista GRAS (generalmente reconocido como seguro) puesto que el producto final propuesto está destinado a ingestión por parte de humanos. Es de particular interés el uso de una levadura, más particularmente de la levadura de panadería (S. cerevisiae), como una célula huésped en la presente invención. Las cepas de particular interés son SC334 (Mat \alpha pep4-3 prb-1-1122 ura3-52 leu2-3, 112 reg1-501 gal1; Hovland et al., Gene 83:57-64 (1989)), YTC34 (\alpha ade2-101 his3\Delta200 lys2-801 ura3-52; obtenida del Dr. T.H. Chang, profesor agregado de Genética Molecular, Ohio State University), YTC41 (a/\alpha ura3-52/ura3-52 lys2-801/lys2-801 ade2-101/ade2-101 trp1-\Delta1/trp1-\Delta1/ his3\Delta200/ his3\Delta200 leu2\Delta1/leu2\Delta1; obtenida del Dr. T.H. Chang, profesor agregado de Genética Molecular, Ohio State University), BJ1995 (obtenida del Yeast Genetic Stock Centre, 1021 Donner Laboratory, Berkeley, CA 94720), INVSC1 (Mat \alpha hiw3\Delta1 leu2 trp1-289 ura3-52; obtenida de Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA 92008) e INVSC2 (Mat \alpha hiw3\Delta200 ura3-167; obtenida de Invitrogen).
Expresión en especies de aves
Para producir PUFA en especies y células de aves, tales como pollos, pavos, codornices y patos, la transferencia del gen puede realizarse introduciendo una secuencia de ácido nucleico que codifica una \Delta5-desaturasa en las células siguiendo procedimientos conocidos en la técnica. Si se desea un animal transgénico, pueden proporcionarse células madres pluripotentes de embriones con un vector portador de un transgén que codifica la \Delta5-desaturasa, y desarrollarlas hasta un animal adulto (USPN 5.162.215; Ono et al. Comparative Biochemistry and Physiology A 113(3):287-292 (1996); WO-96/12.793; WO-96/06.160). En la mayoría de los casos, el transgén se modificará para expresar niveles elevados de la desaturasa con objeto de incrementar la producción de PUFA. El transgén puede modificarse, por ejemplo, proporcionando regiones reguladoras de la transcripción y/o traducción que funcionan en células de aves, tales como promotores que dirigen la expresión en tejidos concretos y partes del huevo tales como la yema. Las regiones reguladoras del gen pueden obtenerse a partir de una variedad de fuentes, incluyendo los virus de la anemia de los pollos o de la leucosis aviar, o genes de aves tales como el gen de la ovoalbúmina del pollo.
Expresión en células de insectos
La producción de PUFA en células de insectos puede realizarse usando vectores de expresión de baculovirus que alberguen un transgén de \Delta5-desaturasa. Los vectores de expresión de baculovirus están disponibles a partir de varias fuentes comerciales tales como Clonetech. También se proporcionan procedimientos para producir cepas transgénicas e híbridas de algas, tales como las algas marinas, que contienen y expresan un transgén de desaturasa. Por ejemplo, podrían prepararse algas marinas transgénicas tal como se describe en la USPN 5.426.040. Al igual que con los otros sistemas de expresión descritos más arriba, el momento, la extensión de la expresión, y la actividad del transgén de desaturasa pueden regularse ajustando la secuencia codificante del polipéptido con las regiones reguladoras de la transcripción y traducción apropiadas seleccionadas para un uso particular. Son de especial interés las regiones promotoras que pueden inducirse bajo condiciones de crecimiento preseleccionadas. Por ejemplo, puede usarse para este propósito la introducción de mutaciones sensibles a la temperatura y/o que responden a metabolitos en las secuencias codificantes del transgén de desaturasa, sus regiones reguladoras, y/o el genoma de las células en las que se introduce el transgén.
Expresión en plantas
La producción de PUFA en plantas puede realizarse usando varios sistemas de transformación en plantas tales como el uso de Agrobacterium tumefaciens, de virus de plantas, de la transformación de células con partículas, y similares, los cuales se descubren en las solicitudes del solicitante relacionadas Solicitudes Estadounidenses con Números de Serie 08/834.033 y 08/956.985, y las solicitudes de continuación en parte registradas simultáneamente con esta solicitud, la totalidad de las cuales se incorporan en esta por referencia.
La célula huésped transformada se cultiva en condiciones apropiadas adaptadas para un resultado final deseado. Para células huéspedes hechas crecer en cultivo, las condiciones están típicamente optimizadas para producir el rendimiento mayor o más económico de PUFA, el cual se relaciona con la actividad desaturasa seleccionada. Las condiciones de medio que podrían optimizarse incluyen: la fuente de carbono, la fuente de nitrógeno, la adición de sustrato, la concentración final de sustrato añadido, la forma del sustrato añadido, el crecimiento aeróbico o anaeróbico, la temperatura de crecimiento, el agente inductor, la temperatura de inducción, la fase de crecimiento en el momento de la inducción, la fase de crecimiento en el momento de la recolección, el pH, la densidad, y el mantenimiento de la selección. Por ejemplo, los microorganismos tales como las levaduras preferiblemente se cultivan usando el medio seleccionado de interés, el cual incluye caldo de peptona de levadura (YPB) y medio mínimo (contiene aminoácidos, bases nitrogenadas de levadura, y sulfato amónico, y carece de un componente para la selección, por ejemplo, uracilo). Deseablemente, los sustratos a añadir se disuelven primero en etanol. Cuando fuera necesario, podría inducirse la expresión del polipéptido de interés, por ejemplo, incluyendo o añadiendo galactosa para inducir la expresión a partir de un promotor GAL.
Expresión en un animal
La expresión en células de un huésped animal puede conseguirse igualmente de manera estable o transitoria. La expresión transitoria puede conseguirse mediante procedimientos conocidos, por ejemplo, la infección o lipofección, y puede repetirse con objeto de mantener los niveles de expresión deseados de la construcción introducida (ver, Ebert, publicación del PCT WO-94/05.782). La expresión estable puede conseguirse a través de la integración de una construcción en el genoma del huésped, que resulta en un animal transgénico. La construcción puede introducirse, por ejemplo, mediante microinyección de la construcción en el pronúcleo de un huevo fertilizado, o mediante transfección, infección retroviral, u otras técnicas mediante las cuales se introduce la construcción en una línea celular que podría formar o incorporarse en un animal adulto (patente estadounidense nº 4.873.191; patente estadounidense nº 5.530.177; patente estadounidense nº 5.565.362; patente estadounidense nº 5.366.894; Wilmut et al., Nature 385:810 (1997)). Los huevos o embriones recombinantes se transfieren a una madre sustituta (patente estadounidense nº 4.873.191; patente estadounidense nº 5.530.177; patente estadounidense nº 5.565.362; patente estadounidense nº 5.366.894; Wilmut et al. (ver más arriba)).
Después del nacimiento, se identifican los animales transgénicos, por ejemplo, mediante la presencia de un gen marcador introducido, tal como para el color de la cubierta, o mediante PCR o transferencia Southern a partir de una muestra de sangre, leche o tejido, para detectar la construcción introducida, o mediante un ensayo inmunológico o enzimológico para detectar la proteína expresada o los productos producidos a partir de la misma (patente estadounidense nº 4.873.191; patente estadounidense nº 5.530.177; patente estadounidense nº 5.565.362; patente estadounidense nº 5.366.894; Wilmut et al. (ver más arriba)). Los animales transgénicos resultantes podrían ser completamente transgénico o podrían ser mosaicos, teniendo los transgenes sólo en un subconjunto de sus células. El advenimiento de la clonación de mamíferos, conseguida fusionando una célula nucleada con un huevo enucleado, seguida por la transferencia a una madre sustituta, presenta la posibilidad de producción rápida y a gran escala a partir de la obtención de un animal o célula "fundador" que comprenda la construcción introducida; antes de esto, era necesario que el transgén estuviera presente en al línea germinal del animal para su propagación (Wilmut et al. (ver más arriba)).
La expresión en un animal huésped presenta ciertas eficiencias, particularmente cuando el huésped es un animal doméstico. Para la producción de PUFA en un fluido fácilmente obtenible a partir del animal huésped, tal como la leche, el transgén de la desaturasa puede expresarse en células de mamífero procedentes de un huésped hembra, y alterarse el contenido de las células huéspedes. El transgén de la desaturasa puede adaptarse para su expresión de forma que ésta esté retenida en las células de mamífero, o sea secretada hacia la leche, para localizar en la leche los productos de reacción PUFA (publicación del PCT WO-95/24.488). La expresión puede dirigirse para su expresión en tejido mamario usando secuencias reguladoras específicas, tales como las de la \alpha-lactoalbúmina bovina, \alpha-caseína, \beta-caseína, \gamma-caseína, \kappa-caseína, \beta-lactoglobulina, o proteína ácida del suero, y podría incluir opcionalmente uno o más intrones y/o secuencias de señales secretoras (patente estadounidense nº 5.530.177; Rosen, patente estadounidense nº 5.565.362; Clark et al., patente estadounidense nº 5.366.894; Garner et al., publicación del PCT WO-95/23.868). La expresión de transgenes de desaturasa, o transcritos de desaturasa antisentido, adaptada de esta manera, puede usarse para alterar los niveles de PUFA específicos, o derivados de los mismos, hallados en la leche de los animales. Adicionalmente, el transgén de la \Delta5-desaturasa puede expresarse bien por sí mismo o con otros transgenes, con objeto de producir una leche de animal que contenga proporciones más elevadas de los PUFA deseados, o proporciones de PUFA y concentraciones que se parezcan a la leche mamaria humana (Prieto et al., publicación del PCT WO-95/24.494).
Purificación de los ácidos grasos
Los ácidos grasos desaturados en la posición \Delta5 podrían hallarse en el microorganismo o animal huésped como ácidos grasos libres o en formas conjugadas tales como acilgliceroles, fosfolípidos, sulfolípidos o glicolípidos, y podrían extraerse a partir de la célula huésped a través de una variedad de medios bien conocidos en la técnica. Tales medios podrían incluir la extracción con solventes orgánicos, la sonicación, la extracción con fluidos supercrítica usando por ejemplo dióxido de carbono, y medios físicos tales como las prensas, o las combinaciones de los mismos. Es de particular interés la extracción con metanol y cloroformo. Cuando sea deseable, la capa acuosa puede acidificarse para protonar los grupos cargados negativamente e incrementar de ese modo el reparto de los productos deseados en la capa orgánica. Después de la extracción, los solventes orgánicos pueden suprimirse mediante evaporación bajo una corriente de nitrógeno. Cuando se aislan en formas conjugadas, los productos podrían descomponerse enzimática o químicamente para liberar el ácido graso libre o un conjugado menos complejo de interés, y pueden someterse a continuación a manipulaciones adicionales para producir un producto final deseado. Deseablemente, las formas conjugadas de los ácidos grasos se descomponen con hidróxido potásico.
Si es necesaria la purificación adicional, pueden emplearse procedimientos estándares. Tales procedimientos podrían incluir la extracción, el tratamiento con urea, la cristalización fraccionaria, la HPLC, la destilación fraccionaria, la cromatografía sobre gel de sílice, la centrifugación a alta velocidad, o la destilación, o combinaciones de estas técnicas. La protección de los grupos reactivos, tales como los grupos ácidos o alquenilos, podría hacerse en cualquier paso a través de técnicas conocidas, por ejemplo, alquilación o yodación. Los procedimientos usados incluyen la metilación de los ácidos grasos para producir metilésteres. Similarmente, los grupos protectores podrían retirarse en cualquier paso. Deseablemente, la purificación de fracciones que contienen ARA, DHA y EPA podría conseguirse mediante tratamiento con urea y/o destilación fraccionaria.
Usos de los ácidos grasos
Hay varios usos para los ácidos grasos producidos por la presente invención. Las sondas basadas en los ADN de la invención podrían hallar uso en procedimientos para aislar moléculas relacionadas o en procedimientos para detectar organismos que expresan desaturasas. Cuando se usan como sondas, los ADN u oligonucleótidos deben ser detectables. Esto se consigue usualmente uniendo una marca bien en un sitio interno, por ejemplo a través de la incorporación de un residuo modificado, o en los extremos 5' o 3'. Tales marcas deben ser directamente detectables, pueden unirse a una molécula secundaria que está marcada detectablemente, o pueden unirse a una molécula secundaria no marcada y a una molécula terciaria marcada detectablemente; este proceso puede extenderse tan lejos como sea práctico para conseguir una señal detectable satisfactoriamente sin niveles inaceptables de señal de fondo. Los sistemas secundarios, terciario, o de puente pueden incluir el uso de anticuerpos dirigidos contra cualquier otra molécula, incluyendo marcas u otros anticuerpos, o pueden implicar cualesquiera moléculas que se unan entre ellas, por ejemplo, un sistema biotina-estreptoavidina/avidina. Las marcas detectables típicamente incluyen los isótopos radiactivos, las moléculas que química o enzimáticamente producen o alteran la luz, los enzimas que producen productos de reacción detectables, las moléculas magnéticas, las moléculas fluorescentes o moléculas cuya fluorescencia o características de emisión de luz cambian a partir de la unión. Pueden hallarse ejemplos de procedimientos de marcado en la USPN 5.011.770. Alternativamente, la unión de moléculas diana puede detectarse directamente midiendo el cambio en el calor de solución, a partir de la unión de la sonda a la diana, a través de la calorimetría de valoración isotérmica, o recubriendo una superficie con la sonda o diana y detectando el cambio en la dispersión de la luz a partir de la superficie producido por la unión de la diana o sonda, respectivamente, tal como podría hacerse con el sistema BIAcore.
Los PUFA producidos mediante medios recombinantes hallan aplicaciones en una amplia variedad de áreas. El suplemento de humanos o animales con PUFA en varias formas puede resultar en niveles incrementados, no sólo de los PUFA añadidos, sino también de su progenie metabólica. Por ejemplo, cuando la vía inherente de la \Delta5-desaturasa es disfuncional en un individuo, el tratamiento con ARA puede resultar no sólo en niveles incrementados de ARA, sino también de los productos cadena abajo del ARA, tales como las prostaglandinas (ver Figura 1). Los complejos mecanismos reguladores pueden hacer deseable la combinación de varios PUFA, o la adición de diferentes conjugados de PUFA, con objeto de prevenir, controlar, o superar tales mecanismos para conseguir los niveles deseados de PUFA específicos en un individuo.
Composiciones nutricionales
Los procedimientos de la presente invención podrían proporcionar composiciones nutricionales. Tales composiciones, para los propósitos de la presente invención, incluyen cualquier alimento o preparación para consumo humano, incluyendo para consumo entérico o parenteral, el cual, cuando se toma en el cuerpo (a) sirve para nutrir o construir tejidos o aportar energía, y/o (b) mantener, restablecer, o apoyar el estado nutricional o función metabólica adecuados.
Las composiciones nutricionales comprenden al menos un aceite o ácido producido de acuerdo con la presente invención, y podría estar en una forma sólida o líquida. Adicionalmente, la composición podría incluir macronutrientes comestibles, vitaminas y minerales en cantidades deseadas para un uso particular. La cantidad de tales ingredientes variará dependiendo de si la composición se destina a un uso con criaturas sana, normales, o niños o adultos que tengan necesidades especializadas tales como aquéllas que acompañan ciertas condiciones metabólicas (por ejemplo, alteraciones metabólicas).
Los ejemplos de macronutrientes que podrían añadirse a la composición incluyen, pero no se limitan a, las grasas comestibles, los carbohidratos y las proteínas. Los ejemplos de tales grasas comestibles incluyen, pero no se limitan a, el aceite de coco, el aceite de soja, y los mono- y diglicéridos. Los ejemplos de tales carbohidratos incluyen, pero no se limitan a, la glucosa, la lactosa comestible, y el almidón hidrolizado. Adicionalmente, los ejemplos de proteínas que podrían utilizarse en la composición nutricional de la invención incluyen, pero no se limitan a, las proteínas de la soja, el suero electrodializado, la leche desnatada eletrodializada, el suero de leche, o los hidrolizados de estas proteínas.
Con respecto a las vitaminas y minerales, podrían añadirse los siguientes a las composiciones nutricionales de la presente invención: calcio, fósforo, potasio, sodio, cloro, magnesio, manganeso, hierro, cobre, zinc, selenio, yodo, y las Vitaminas A, E, D, C, y el complejo de B. También podrían añadirse otras vitaminas y minerales parecidos.
Los componentes utilizados en las composiciones nutricionales será de origen semi-purificado o purificado. Por semi-purificado o purificado se entiende un material que ha sido preparado mediante purificación de un material natural o por síntesis.
Los ejemplos de composiciones nutricionales de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, las fórmulas para niños, los suplementos dietéticos, y las composiciones para rehidratación. Las composiciones nutricionales de particular interés incluyen, pero no se limitan a, aquéllas utilizadas para el suplemento entérico o parenteral de niños, las fórmulas para niños de especialista, los suplementos para los ancianos, y los suplementos para aquéllos con dificultades gastrointestinales y/o malabsorción.
Composiciones nutricionales
Una composición nutricional típica producida por la invención contendrá macronutrientes comestibles, vitaminas y minerales en las cantidades deseadas para un uso particular.Las cantidades de tales ingredientes variarán dependiendo de si la formulación está destinada a un uso con individuos sanos, normales, temporalmente expuestos a estrés, o a sujetos que tienen necesidades especiales debido a a ciertos estados morbosos crónicos o agudos (por ejemplo, alteraciones metabólicas). Las personas formadas en la técnica entenderán que los componentes utilizados en la formulación nutricional son de origen semi-purificado o purificado. Por semi-purificado o purificado se quiere indicar un material que se ha preparado mediante la purificación de un material natural o mediante síntesis. Estas técnicas son bien conocidas en técnica (Ver, por ejemplo, Code of Federal Regulations for Food Ingredients and Food Processing; Recommended Dietary Allowances, 10ª edición, National Academy Press, Washington, D.C., 1989).
La formulación nutricional podría ser un producto nutricional enteral; más preferiblemente un producto de nutricional enteral de adultos o niños. La fórmula podría comprender, además de los PUFA de la invención; macronutrientes, vitaminas y minerales en cantidades diseñadas para proporcionar los requisitos nutricionales diarios de los adultos.
Los componentes macronutricionales incluyen las grasas comestibles, los carbohidratos y las proteínas. Son ejemplos de grasas comestibles el aceite de coco, el aceite de soja, y los mono- y diglicéridos, y los aceites de PUFA producidos por la invención. Los ejemplos de carbohidratos la glucosa, la lactosa comestible, y el almidón hidrolizado de maíz. Una fuente típica de proteína sería la proteína de soja, el suero electrodializado o la leche desnatada electrodializada o el suero de leche, o los hidrolizados de estas proteínas, aunque también hay disponibles otras fuentes de proteínas y podrían usarse. Estos macronutrientes se añadirían en forma de compuestos nutricionales comúnmente aceptados en cantidad equivalente a las presentes en la leche humana o en base a la energía, es decir, en base a las calorías.
Los procedimientos para formular fórmulas nutricionales líquidas y enterales son bien conocidos en la técnica, y se describen en detalle en los ejemplos.
La fórmula enteral puede esterizilarse y usarse subsiguientemente de forma lista-para-alimentar (RTF) o almacenarse en un líquido concentrado o en un polvo. El polvo puede prepararse mediante secado por atomización de la fórmula enteral preparada tal como se ha indicado más arriba, y reconstituirse la fórmula mediante rehidratación del concentrado. Las fórmulas nutricionales para adultos y niños son bien conocidas en la técnica y están disponibles comercialmente (por ejemplo, Similac®, Ensure®, Jevity® y Alimentum® procedentes de la Ross Products Division, Abbot Laboratories). Un aceite o ácido de la presente invención puede añadirse a cualquiera de estas fórmulas en las cantidades descritas más arriba.
La densidad de energía de las composiciones nutricionales cuando están en forma líquida, puede oscilar típicamente desde aproximadamente 0,6 kcal hasta 3,0 kcal por ml. Cuando está en forma sólida o pulverizada, el suplemento nutricional puede contener desde aproximadamente 1,2 hasta más de 9 kcal por g, preferiblemente de 3 a 7 kcal por g. En general, la osmolalidad de un producto líquido debería ser inferior a 700 mOsm y más preferiblemente inferior a 660 mOsm.
La fórmula nutricional típicamente incluiría vitaminas y minerales, además de los PUFA de la invención, con objeto de ayudar a la ingestión individual de los requerimientos diarios de estas sustancias. Además de los PUFA listados más arriba, podría ser deseable suplir la composición nutricional con zinc, cobre, y ácido fólico además de antioxidantes. Se cree que estas sustancias también proporcionaran un impulso al sistema inmune estresado, y de esté modo proporcionarán beneficios adicionales al individuo. La presencia de zinc, cobre, o ácido fólico es opcional y no se requiere con objeto de ganar los efectos beneficiosos sobre la supresión inmune. De igual forma, una composición farmacéutica se puede suplir también con estas mismas sustancias.
En una realización más preferida, la composición nutricional contiene, además del sistema antioxidante y del componente PUFA, una fuente de carbohidratos, en donde al menos el 5% de dicho carbohidrato es un oligosacárido no digerible. En aún una realización más preferida, la composición nutricional contiene adicionalmente proteína, taurina y carnitina.
Los PUFA, o derivados de los mismos, preparados mediante el procedimiento descubierto pueden usarse como sustitutos o suplementos dietéticos, particularmente en las fórmulas para niños, para pacientes que experimentan alimentación intravenosa o para prevenir o tratar la malnutrición. Típicamente, la leche para lactancia humana tiene un perfil de ácidos grasos que comprende desde aproximadamente el 0,15% hasta aproximadamente el 0,36% como DHA, desde aproximadamente el 0,03% hasta aproximadamente el 0,13% como EPA, desde aproximadamente el 0,30% hasta aproximadamente el 0,88% como ARA, desde aproximadamente el 0,22% hasta aproximadamente el 0,67% como DGLA, y desde aproximadamente el 0,27% hasta aproximadamente el 1,04% como GLA. Adicionalmente, se ha descrito que el triglicérido predominante en la leche humana es el 1,3-di-oleoil-2-palmitoil, informándose que los 2-palmitoil glicéridos son mejor absorbidos que los 2-oleoil o 2-lineoil glicéridos (USPN 4.876.107). Por tanto, los ácidos grasos tales como el ARA, DGLA, GLA y/o EPA producidos por la invención pueden usarse para alterar la composición de la fórmulas para niños para replicar mejor la composición en PUFA de la leche para lactancia humana. En particular, una composición de aceite para uso en un suplemento farmacológico o alimentario, particularmente un sustituto o suplemento de la leche para lactancia, preferiblemente comprenderá uno o más de ARA, DGLA o GLA. Más preferiblemente, el aceite comprenderá desde aproximadamente un 0,3 hasta un 30% de ARA, desde aproximadamente un 0,2 hasta un 30% de DGLA, y desde aproximadamente un 0,2 hasta aproximadamente un 30% de GLA.
Además de la concentración, las proporciones de ARA, DGLA y GLA pueden adaptarse para un determinado uso final. Cuando se formula como un suplemento o sustituto de leche para lactancia, una composición de aceite que contenga dos o más de ARA, DGLA y GLA se proporcionará respectivamente en una proporción de desde 1:19:30 hasta aproximadamente 6:1:0,2. Por ejemplo, la leche para lactancia de animales puede variar en proporciones de ARA:DGLA:DGL que oscilan desde 1:19:30 hasta 6:1:0,2, las cuales incluyen proporciones intermedias que preferiblemente son 1:1:1, 1:2:1, 1:1:4. Cuando se producen juntos en una célula huésped, el ajuste de la proporción y porcentaje de conversión de un sustrato precursor, tal como GLA y DGLA a ARA, puede usarse para controlar precisamente las proporciones de PUFA. Por ejemplo, un 5% a 10% de velocidad de conversión de DLGA a ARA puede usarse para producir una proporción de ARA respecto DGLA de aproximadamente 1:19, mientras que una velocidad de conversión de aproximadamente el 75% a 80% puede usarse para producir una proporción de ARA respecto DGLA de aproximadamente 6:1. Por tanto, sea en un sistema de cultivo de células o en un animal huésped, la regulación del momento, extensión y especificidad de la expresión de la desaturasa tal como se describe, puede usarse para modular los niveles y proporciones de PUFA. Dependiendo del sistema de expresión usado, por ejemplo, un cultivo de células o un animal que expresa aceite(s) en su leche, los aceite también pueden aislarse y combinarse de nuevo en las concentraciones y proporciones deseadas. La cantidades de aceites que proporcionan estas proporciones de PUFA pueden determinarse siguiendo protocolos estándares. Los PUFA, o las células huéspedes que los contienen, pueden usarse también como suplementos alimentarios para animal para alterar la composición en ácidos grasos de un tejido o la leche del animal hacia una más deseable para consumo humano o animal.
Para el suplemento dietético, los PUFA purificados, o los derivados de los mismos, podrían incorporarse en los aceites, grasas o margarinas de cocción, formulados de tal forma que el receptor recibiría la cantidad deseada con un uso normal. Los PUFA también podrían incorporarse en fórmulas para niños, suplementos nutricionales u otros productos alimentarios, y podría hallar un uso como agentes antiinflamatorios o reductores del colesterol.
Composiciones farmacéuticas
Podría producirse una composición farmacéutica comprendiendo uno o más de los ácidos y/o aceites resultantes de acuerdo con los procedimientos descritos en ésta. Más específicamente, una composición farmacéutica podría comprender uno o más de los ácidos y/o aceites, así como un portador estándar, bien conocido, no tóxico, y farmacéuticamente aceptable, un adyuvante o vehículo, tal como, por ejemplo, la solución salina tamponada con fosfato, el agua, el etanol, los polioles, los aceites vegetales, un agente humectativo, o una emulsión tal como una emulsión agua/aceite. La composición podría estar en una forma líquida o sólida. Por ejemplo, la composición podría estar en forma de un tableta, cápsula, líquido o polvo ingerible, inyectable, pomada tópica o crema.
Las posibles rutas de administración incluyen, por ejemplo, la oral, la rectal y la parenteral. La ruta de administración dependerá, por supuesto, del efecto deseado. Por ejemplo, si la composición se está utilizando para tratar una piel rugosa, seca o envejecida, para tratar piel lesionada o quemada, o para tratar piel o cabello afectados por una enfermedad o condición, tal vez se aplicaría tópicamente.
La dosificación de la composición a administrar al paciente podría ser determinada por alguien con formación ordinaria en la técnica, y depende de varios factores, tales como el peso del paciente, la edad del paciente, el estado inmune del paciente, etc.
En relación a la forma, la composición podría ser, por ejemplo, una solución, una dispersión, una suspensión, una emulsión, o un polvo estéril que se reconstituye a continuación.
Adicionalmente, la composición podría utilizarse con propósitos cosméticos. Podría añadirse a composiciones cosméticas pre-existentes, de modo que se forme una mezcla, o podría usarse como una composición sola.
Las composiciones farmacéuticas podrían utilizarse para administrar el componente PUFA a un individuo. Las composiciones farmacéuticas podrían comprender soluciones acuosas o no acuosas fisiológicamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, y polvos estériles para su reconstitución en soluciones o dispersiones estériles para su ingestión. Los ejemplos de portadores, diluyentes, solventes o vehículos acuosos y no acuosos apropiados incluyen el agua, el etanol, los polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, y similares), mezclas apropiadas de los mismos, aceites vegetales (tales como el aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como el etiloleato. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido, en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos. También podría ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro sódico y similares. Aparate de tales diluyentes inertes, la composición podría incluir también adyuvantes, tales como agentes humectativos, agentes emulsionantes y de suspension, agentes edulcorantes, de condimento y fragancias.
Las suspensiones, además de los compuestos activos, podrían contener agentes de suspensión, como por ejemplo, los alcoholes isostearilos etoxilados, el los ésteres de sorbitol y sorbitán con polioxietileno, la celulosa microcristalina, el metahidróxido de aluminio, la bentonita, el agar-agar, y el tragacanto, o mezclas de estas sustancias, y similares.
Las formas de dosificación sólidas, tales como las tabletas y cápsulas, pueden prepararse usando técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los PUFA de la invención pueden formularse en tabletas con bases de tabletas convencionales, tales como la lactosa, la sacarosa, y el almidón de maíz, en combinación con unidores tales como acacia, almidón de maíz, o gelatina, agentes desintegradores tales como el almidón de patata o el ácido algínico, y un lubricante tal como el ácido esteárico o el estearato magnésico. Las cápsulas pueden prepararse incorporando estos excipientes en una cápsula de gelatina junto con los antioxidantes y el componente PUFA. La cantidad de los antioxidantes y del componente PUFA que debería incorporarse en la formulación farmacéutica debería hallarse dentro de las directrices discutidas más arriba.
Tal como se usa en esta solicitud, el término "tratar" se refiere, bien a prevenir, o a reducir la incidencia del acontecimiento no deseada. Por ejemplo, tratar la supresión inmune se refiere a prevenir la ocurrencia de esta supresión o a reducir la cantidad de tal supresión. Los términos "paciente" e "individuo" se usan de forma intercambiable, y ambos de refieren a un animal. El término "animal", tal como se usa en esta solicitud, se refiere a cualquier mamífero de sangre caliente, incluyendo, pero no limitándose a, perros, humanos, monos y simios. Tal como se usa en la solicitud, el término "aproximadamente" se refiere a una cantidad que varía respecto el rango o número indicado en una cantidad razonable dependiendo del contexto de uso. Cualquier número o rango numérico especificado en la especificación debería considerarse que está modificado por el término "aproximadamente".
"Dosis" y "servicio" se usan de forma intercambiable, y se refieren a la cantidad de composición nutricional o farmacéutica ingerida por el paciente en un composición única y diseñada para proporcionar cantidades efectivas de los antioxidantes y el triglicérido estructurado. Como será fácilmente evidente a los especialistas en la técnica, una única dosis o servicio del polvo nutricional líquido debería proporcionar la cantidad de antioxidantes y PUFA discutida más arriba. La cantidad de la dosis o servicio debería tener un volumen tal que un adulto típico lo pueda consumir de una vez. Esta cantidad puede variar ampliamente dependiendo de la edad, peso, sexo o condición médica del paciente. No obstante, como pauta general, un servicio o dosis única de un producto nutricional líquido debería considerarse que abarca desde 100 hasta 600 ml, más preferiblemente desde 125 hasta 500 ml, y lo más preferiblemente desde 125 hasta 300 ml.
Los PUFA también podrían añadirse a los alimentos, incluso cuando no se requieren suplementos de la dieta. Por ejemplo, la composición podría añadirse a alimentos de cualquier tipo, incluyendo, pero no limitándose a, margarinas, mantequillas modificadas, quesos, leche, yogures, chocolate, golosinas, tentempiés, aceites para ensaladas, aceites de cocción, grasas de cocción, pescados y bebidas.
Aplicaciones farmacéuticas
Para un uso farmacéutico (humano o veterinario), las composiciones se administran generalmente de forma oral, pero pueden administrarse por cualquier ruta por la que podría ser exitosamente absorbida, por ejemplo, parenteralmente (es decir, subcutánea, intramuscular o intravenosamente), rectalmente o vaginalmente o tópicamente, por ejemplo, como una pomada o loción para la piel. Los PUFA producidos mediante los procedimientos de la presente invención podrían administrarse solos o en combinación con otro portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Cuando están disponibles, las cápsulas de gelatina son al forma de administración oral preferida. El suplemento dietético, tal como se ha establecido más arriba, puede proporcionar también una ruta oral de administración. Los ácidos insaturados de la presente invención podrían administrarse en formas conjugadas, o como sales, ésteres, amidas o prodrogas de los ácidos grasos. Las sales farmacéuticamente aceptables preferidas son las sales de sodio, potasio o litio. También se abarcan las sales de N-alquilpolihidroxamina, tales como la N-metilglucamina, halladas en la publicación del PCT WO-96/33.155. Los ésteres preferidos son los etilésteres. Como sales sólidas, los PUFA pueden administrarse también en forma de tableta. Para la administración intravenosa, los PUFA o derivados de los mismos podrían incorporarse en formulaciones comerciales tales como Intralipids. El perfil típico de ácidos grasos en adultos normales comprende del 6,64 al 9,46% de ARA, del 1,45 al 3,11% de DGLA, y del 0,02 al 0,08% de GLA. Estos PUFA o sus precursores metabólicos pueden administrarse, bien sólos o en mezclas con otros PUFA, para conseguir un perfil de ácidos grasos normal en un paciente. Cuando se desee, los componentes individuales de las formulaciones podrían proporcionarse individualmente en forma de equipo, para uso único o múltiple. Una dosificación típica para un ácido graso particular va desde 0,1 mg hasta 20 g, o incluso 100 g, diarios, y preferiblemente es de 10 mg hasta 1, 2, 5 ó 10 g diarios según se requiera, o cantidades molares equivalentes de formas derivadas del mismo. Las composiciones de nutrición parenteral producidas mediante procedimientos de la invención podrían comprender desde aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 30 por ciento en peso de ácidos grasos, calculados como triglicéridos; la preferida es una composición que tiene desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente el 25 por ciento de la composición de PUFA total como GLA (USPN 5.196.198). Opcionalmente podrían añadirse otras vitaminas, y particularmente vitaminas solubles en grasas, tales como las vitaminas A, D, E y la L-carnitina. Cuando se desee, podría añadirse un conservante tal como el \alpha-tocoferol, típicamente a aproximadamente el 0,1% en peso.
Las composiciones farmacéuticas apropiadas podrían comprender soluciones acuosas o no acuosas, dispersiones, suspensiones o emulsiones estériles y fisiológicamente aceptables, o polvos estériles para su reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles. Los ejemplos de portadores, diluyentes, solventes o vehículos acuosos y no acuosos incluyen el agua, el etanol, los polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, y similares), mezclas apropiadas de los mismos, aceites vegetales (tales como el aceite de oliva), y ésteres orgánicos inyectables tales como el etiloleato. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula, en el caso de las dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos. También podría ser deseable la inclusión de agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro sódico, y similares. Aparte de tales diluyentes inertes, la composición puede incluir también adyuvantes, tales como agentes humectativos, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, de condimento y fragancias.
Las suspensiones, además de los compuestos activos, podrían contener agentes de suspensión, como por ejemplo, los alcoholes de isostearilo etoxilados, el polioxietilen sorbitol y los ésteres de sorbitán, la celulosa microcristalina, el metahidróxido de aluminio, la bentonita, el agar-agar, y el tragacanto, o mezclas de estas sustancias y las similares.
Una composición farmacéutica especialmente preferida contiene ésteres del ácido diacetiltartárico con mono- y diglicéridos disueltos en un medio acuoso o solvente. Los ésteres del ácido diacetiltartárico con mono- y diglicéridos tienen un valor de HLB de aproximadamente 9-12, y son significativamente más hidrofílicos que los lípidos antimicrobianos existentes, que tienen valores de HLB de 2-4. Esos lípidos hidrofílicos existentes no pueden formularse en soluciones acuosas. Tal como se descubre en ésta, esos lípidos pueden solubilizarse ahora en medio acuoso en combinación con ésteres del ácido diacetiltartárico con mono- y diglicéridos. De acuerdo con esta realización, los ésteres del ácido diacetiltartárico con mono- y diglicéridos (por ejemplo, DATEM-C12:0) se funden con otros lípidos antimicrobianos activos (por ejemplo, monoglicéridos de 18:2 y 12:0) y se mezclan para obtener una mezcla homogénea. La homogeneidad permite una actividad antimicrobiana incrementada. La mezcla puede dispersarse completamente en agua. Esto no es posible sin la adición de ésteres del ácido diacetiltartárico con mono- y diglicéridos, y mezclando previamente con otros monoglicéridos antes de su introducción en agua. Las composición acuosa puede mezclarse a continuación en condiciones estériles con diluyentes, conservantes, tampones o propulsores, tal como podría requerirse para formar un aerosol o inhalante, fisiológicamente aceptables.
El suplemento con PUFA producido usando los procedimientos de la presente invención puede usarse para tratar la reestenosis posterior a la angioplastia. Los síntomas de inflamación, de la artritis reumatoide, y del asma y psoriasis pueden tratarse con los PUFA de la presente invención. La evidencia indica que los PUFA podrían estar implicados en el metabolismo del calcio, sugiriendo que los PUFA de la presente invención podrían usarse en el tratamiento o prevención de la osteoporosis y de los cálculos renales o urinarios.
Los PUFA pueden usarse en el tratamiento del cáncer. Se ha observado que las células malignas tienen una composición de ácidos grasos alterada; se ha observado que la adición de ácidos grasos retrasa su crecimiento y causa la muerte celular, y para incrementar su susceptibilidad a los agentes quimioterapéuticos. Se ha mostrado que el GLA causa la expresión de nuevo en células cancerosas de las moléculas de adhesión celular E-cadherinas, la pérdida de las cuales está asociada con las metástasis agresivas. El ensayo clínico de la administración intravenosa de sales de litio de GLA solubles en agua a pacientes con cáncer de páncreas produjeron incrementos estadísticamente significativos en su supervivencia. El suplemento con PUFA podría ser útil también para tratar la caquexia asociada con el cáncer.
Los PUFA se han usado también para tratar la diabetes (USPN 4.826.877; Horrobin et al., Am. J. Clin. Nutr. 57 (supl): 732S-737S). Se ha demostrado el metabolismo y composición alterados de ácidos grasos en animales diabéticos. Se ha sugerido que estas alteraciones están implicadas en alguna de las complicaciones a largo plazo resultantes de la diabetes, incluyendo la retinopatía, la neuropatía, la nefropatía, y el daño del sistema reproductor. Se ha mostrado que el aceite de onagra, el cual contiene GLA, previene e invierte la lesión diabética del nervio.
Los PUFA se han usado para tratar eczemas, reducir la presión sanguínea, y mejorar las notas en matemáticas. Se ha sugerido que la deficiencia en ácidos grasos esenciales está implicada en el eczema, y hay estudios que han mostrado efectos beneficiosos sobre el eczema a partir del tratamiento con GLA. Se ha observado también que el GLA reduce los incrementos en la presión sanguínea asociados con el estrés, y para mejorar los resultados en los exámenes de aritmética. Se ha mostrado que GLA y DGLA inhiben la agregación de las plaquetas, causan vasodilatación, disminuyen los niveles de colesterol, e inhiben la proliferación del tejido fibroso y muscular liso de las paredes de los vasos (Brenner et al., Adv. Exp. Med. Biol. 83:85-101 (1976)). La administración de GLA o DGLA, solos o en combinación con EPA, se ha mostrado que reduce o previene el sangrado gastrointestinal y otros efectos secundarios causados por fármacos antiinflamatorios no esteroideos (USPN 4.666.701). También se ha mostrado que el GLA y DGLA previenen o tratan la endometriosis y el síndrome pre-menstrual (USPN 4.758.592), y que tratan la encefalomielitis miálgica y la fatiga crónica después de las infecciones virales (USPN 5.116.871).
Los usos adicionales de los PUFA producidos mediante los procedimientos de la invención incluyen su uso en el tratamiento del SIDA, de la esclerosis múltiple, del síndrome respiratorio agudo, de la hipertensión, y de los desarreglos de la piel. Los PUFA pueden usarse también en fórmulas para la salud en general así como para tratamientos geriátricos.
Aplicaciones veterinarias
Debería destacarse que las composiciones farmacéuticas y nutricionales antes descritas podrían utilizarse en relación con animales, así como con humanos, puesto que los animales experimentan las mismas necesidades y condiciones que los humanos. Por ejemplo, el aceite o ácidos de la presente invención podrían utilizarse como suplementos de alimentación animal.
Los siguientes ejemplos se presentan a modo de ilustración y no de limitación.
Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de una secuencia de \Delta5-desaturasa a partir de Mortierella alpina Ejemplo 2 Expresión de los clones de \Delta5-desaturasa de M. alpina en levadura de panadería Ejemplo 3 Optimización inicial de las condiciones de cultivo Ejemplo 4 Distribución de los PUFA en las fracciones lipídicas de levadura Ejemplo 5 Optimización adicional del cultivo Ejemplo 6 Identificación de homólogos con las desaturasas \Delta5 y \Delta6 de M. alpina Ejemplo 7 Identificación de homólogos de \Delta5 y \Delta6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFA Ejemplo 8 Identificación de homólogos de \Delta5 y \Delta6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFA Ejemplo 9 Secuencias de desaturasas humanas Ejemplo 10 Composiciones nutricionales 
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Ejemplo 1 Aislamiento de una secuencia de nucleótidos de \Delta5-desaturasa a partir de Mortierella alpina
Mortierella alpina produce ácido araquidónico (ARA) a partir del precursor 20:3 mediante una \Delta5-desaturasa. Se obtuvo una secuencia de nucleótidos que codificaba la \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina a través de la amplificación con PCR usando cADN de la 1ª hebra de M. alpina y cebadores de oligonucleótidos degenerados correspondientes a las secuencias de aminoácidos conservadas entre las \Delta6-desaturasas de Synechocystis y Spirulina. El procedimiento fue como sigue:
Se aisló el ARN total a partir de un cultivo productor PUFA de 3 días de Mortierella alpina usando el protocolo de Hoge et al. Experimental Mycology 6:225-232 (1982). El ARN se usó para preparar un cADN de doble hebra usando el sistema lambda-ZipLox de BRL, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se empaquetaron por separado fracciones de varios tamaños del cADN de M. alpina para rendir bibliotecas con insertos con diferentes tamaños promedio. La biblioteca de "longitud completa" contiene aproximadamente 3 \times 10^{6} clones con un tamaño de inserto promedio de 1,77 kb. La biblioteca "con grado para secuenciación" contiene aproximadamente 6 \times 10^{5} clones con un tamaño de inserto promedio de 1,1 kb.
Se transcribieron a la inversa 5 \mug de ARN usando el RTasa Superscript de BRL y el cebador TSyn
(5'-CCAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT-3'), SEC. Nº ID. 10. Se diseñaron oligonucleótidos degenerados para las regiones conservadas entre las dos secuencias de \Delta6-desaturasa cianobacterianas. Los cebadores específicos usados fueron D6DESAT-F3 (SEC. Nº ID. 8) (5'-CUACUACUACUACAYCAYACOTAYACOAAYAT-3') y D6DESAT-R3 (SEC. Nº ID. 9) (5'-CAUCAUCAUCAUOGGRAAOARRTGRTG-3'), en donde Y=C+T, R=A+G, y O=I+C. La amplificación mediante PCR se realizó en un volumen de 25 \mul que contenía: plantilla derivada 40 ng del ARN total, 2 pM de cada cebador, 200 \muM de cada trifosfato de desoxirribonucleótido, Tris-Cl 60 mM, pH 8,5, 
\hbox{(NH _{4} ) _{2} }
SO_{4} 15 mM, MgCl_{2} 2 mM. Las muestras se sometieron a un paso de desnaturalización inicial a 95 grados (todas las temperaturas en Celsius) durante 5 minutos, y mantenidas a continuación a 72 grados mientras se añadían 0,2 Y de la polimerasa Taq. Las condiciones de termociclado de la PCR fueron como sigue: 94 grados durante 1 minuto, 45 grados durante 1,5 minutos, 72 grados durante 2 minutos. La PCR se continuó durante 35 ciclos. La PCR usando estos cebadores sobre el cADN de la primera hebra de M. alpina produjo un producto de reacción de 550 p.b. La comparación de la secuencia de aminoácidos deducida de la SEC. Nº ID. 3 del fragmento de PCR de M. alpina reveló regiones con homología por las \Delta6-desaturasas (ver Figura 5). Sin embargo, sólo había aproximadamente un 28% de identidad a lo largo de la región comparada.
El producto de la PCR se usó como una sonda para aislar los clones de cADN correspondientes a partir de una biblioteca de M. alpina. El clon de cADN más largo, Ma29, se denominó pCGN5521 y se ha secuenciado completamente en ambas hebras. El cADN está contenido como un inserto de 1481 p.b. en el vector pZL1 (Bethesda Research Laboratories) y, empezando con el primer ATG, contiene una pauta de lectura abierta que codifica 446 aminoácidos. La pauta de lectura contiene la secuencia deducida del fragmentos de la PCR. Se halló que la secuencia del inserto de cADN contenía regiones con homología con las \Delta6-desaturasas (ver Figura 5). Por ejemplo, se encontró que tres "cajas de histidina" conservadas (que se han observado en desaturasas unidas a membrana (Okuley et al., The Plan Cell 6:147-158 (1994)) estaban presentes en la secuencia de Mortierella en las posiciones de aminoácidos 171-175, 202-212, y 387-391 (ver Figura 3). Sin embargo, se halló que el típico motivo de aminoácidos "HXXH" era, en la tercera caja de histidina de la desaturasa de Mortierella, QXXHH, SEC. Nº ID. 11-12. Sorprendentemente, el extremo amino-terminal de la proteína codificada, mostró una homología significativa con la proteína del citocromo b5. Por tanto, el clon de cADN de Mortierella parece representar una proteína de fusión entre un citocromo b5 y una desaturasa de ácido graso. Puesto que se cree que el citocromo b5 funciona como un donante de electrones para enzimas desaturasa unidos a membrana, es posible que el dominio de citocromo b5 N-terminal de esta proteína desaturasa esté implicado en su función. Esto podría ser una ventaja cuando se expresa la desaturasa en sistemas heterólogos para la producción de PUFA.
Ejemplo 2 Expresión de los clones de \Delta5-desaturasa de M. alpina en levadura de panadería Transformación de la levadura
La transformación de las levaduras con acetato de litio se realizó de acuerdo con protocolos estándares (Methods in Enzymology 194:186-187 (1991)). En resumen, se cultivaron las levaduras en YPD a 30ºC. Se recolectaron las células mediante centrifugación, se resuspendieron en TE, se recolectaron de nuevo mediante centrifugación, y se resuspendieron en TE que contenía acetato de litio 100 mM, se recolectaron de nuevo mediante centrifugación, y se resuspendieron en TE/acetato de litio. Las levaduras resuspendidas se incubaron a 30ºC durante 60 minutos con agitación. Se añadió el ADN portador, y se alicuotaron las levaduras en tubos. Se añadió el ADN transformante, y se incubaron los tubos durante 30 minutos a 30ºC. Se añadió una solución de PEG, PEG 400 (35% p/p), acetato de litio 100 mM, TE pH 7,5) seguida por una incubación de 50 minutos a 30ºC. Se realizó un choque térmico de 5 minutos a 42ºC, se precipitaron las células, se lavaron con TE, se precipitaron de nuevo, y se resuspendieron en TE. A continuación, las células resuspendidas se sembraron sobre medio selectivo.
Expresión de la desaturasa en levaduras transformadas
Los clones de cADN de Mortierella alpina seexaminaron en busca de actividad desaturasa en levadura de panadería. Como control positivo se usó una \Delta15-desaturasa de colza (obtenida mediante PCR usando la primera hebra del cADN procedente de semillas Cultivar 212/86 de Brassica napus usando cebadores basados en la secuencia publicada (Arondel et al., Science 258:1353-1355)). El gen de la \Delta15-desaturasa y el gen procedente del clon mA29 de cADN se insertaron en el vector de expresión pYES2 (Invitrogen), resultando respectivamente en los plásmidos pCGR-2 y pCGR-4. Estos plásmidos se transfectaron en la cepa 334 de la levadura S. cerevisiae y se expresaron después de la inducción con galactosa y en presencia de sustratos que permitían la detección de la actividad desaturasa específica. La cepa control fue la cepa 334 de S. cerevisiae que contenía el vector pYES2 inalterado. Los sustratos usados, los productos producidos, y las actividad desaturasa indicada fueron: el DGLA (la conversión a ARA indicaría actividad \Delta5-desaturasa), el ácido linolénico (la conversión a GLA indicaría actividad \Delta6-desaturasa; la conversión a ALA indicaría actividad \Delta15-desaturasa), el ácido oleico (un sustrato endógeno sintetizado por S. cerevisiae, la conversión a ácido linolénico indicaría actividad \Delta12-desaturasa; de la cual carece S. cerevisiae), o el ARA (la conversión a EPA indicaría actividad \Delta17-desaturasa). Los resultados se proporcionan más abajo en la TABLA 1. Las fracciones lipídicas se extrajeron como sigue. Se dejaron crecer los cultivos durante 48-52 horas a 15ºC. La células se precipitaron mediante centrifugación, se lavaron una vez con ddH_{2}O estéril, y se precipitaron de nuevo. Los precipitados se agitaron con metanol; se añadió cloroformo junto con tritridecanoína (como estándar interno). Las mezclas se incubaron durante al menos una hora a temperatura ambiente o a 4ºC durante la noche. Se extrajo la capa de cloroformo y se filtró a través de un filtro Whatman con un gramo de sulfato sódico anhidro para suprimir las partículas y el agua residual. Los solventes orgánicos se evaporaron a 40ºC bajo una corriente de nitrógeno. Los lípidos extraídos se derivatizaron a continuación a metilésteres de ácidos grasos (FAME) para su análisis mediante cromatografía de gases (GC) mediante la adición de 2 ml de hidróxido potásico 0,5 N en metanol en un tubo cerrado. Las muestras se calentaron hasta los 95ºC a 100ºC durante 30 minutos y se enfriaron hasta temperatura ambiente. Se añadieron aproximadamente 2 ml de trifluoruro de boro al 14% en metanol y se repitió el calentamiento. Después de enfriada la mezcla de lípidos extraída, se añadieron 2 ml de agua y 1 ml de hexano a los FAME extraídos para su análisis mediante GC. El porcentaje de conversión se calculó dividiendo el producto producido por la suma de (el producto producido y el sustrato añadido) y se multiplicó a continuación por 100. Para calcular el porcentaje de conversión del ácido oleico, puesto que no se añadió ningún sustrato, el ácido linolénico producido se dividió por la suma de (ácido oleico y ácido linolénico producidos), y se multiplicó a continuación por 100.
TABLA 1 Expresión de la desaturasa de M. alpina en levadura de panadería
Clon Tipo de actividad enzimática % De conversión de sustrato
pCGR-2 (\Delta15 desaturasa de colza) \Delta6 0 (18:2 a 18:3\omega6)
\Delta15 16,3 (18:2 a 18:3\omega3)
\Delta5 2,0 (20:3 a 20:4\omega6)
\Delta7 2,0 (20:3 a 20:4\omega6)
\Delta12 2,0 (20:3 a 20:4\omega6)
pCGR-4 (Ma29 de M. alpina) \Delta6 0
\Delta15 0
\Delta5 15,3
\Delta7 0,3
\Delta12 3,3
El clon control de la \Delta15-desaturasa exhibió un 16,3% de conversión del sustrato. El clon pCGR-4 que expresaba el cADN del Ma29 convirtió el 15,3% del sustrato 20:3 a 20:4\omega6, indicando que el gen codifica una \Delta5-desaturasa. El valor de fondo (conversión no específica de sustrato) estuvo entre 0-3% en estos casos. También hallamos inhibición de la actividad por sustrato usando diferentes concentraciones del sustrato. Cuando el sustrato se añadía a 100 \muM, el porcentaje de conversión a producto disminuía en comparación a cuando el sustrato se añadía a 25 \muM (ver más abajo). Adicionalmente, variando las concentraciones del sustrato DGLA, entre aproximadamente 5 \muM hasta aproximadamente 200 \muM, el porcentaje de conversión de DGLA a ARA osciló desde aproximadamente el 5% hasta el 75% con la \Delta5-desaturasa de M. alpina.
Estos datos muestran que pueden expresarse desaturasas con diferentes especificidades de sustrato en un sistema heterólogo, y usarse para producir ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados.
La Tabla 2 representa los ácidos grasos de interés como porcentaje del lípido total extraído de la levadura huésped S. cerevisiae S334 con el plásmido indicado. No había glucosa presente en el medio de cultivo. Se usó la cromatografía de gas de afinidad para separar los respectivos lípidos. Se empleó GC/MS para verificar la identidad del (de los) producto(s). El producto esperado para la \Delta15-desaturasa de B. napus, el ácido \alpha-linolénico, se detectó cuando su sustrato, el ácido linolénico, se añadía exógenamente al cultivo de levaduras inducido. Este hallazgo demuestra que la expresión en levadura de un gen de desaturasa puede producir un enzima funcional y cantidades detectables del producto en las condiciones de cultivo actuales. Ambos sustratos añadidos exógenamente fueron captados por la levadura, aunque se incorporó algo menos del PUFA de cadena más larga, ácido dihomo-\gamma-linolénico (20:3), que del ácido linolénico (18:2) cuando cualquiera de ellos se añadía en forma libre a los cultivos de levaduras inducidos. El ácido araquidónico se detectó como un PUFA nuevo en levadura cuando se añadía ácido dihomo-\gamma-linolénico como sustrato a S. cerevisiae 334 (pCGR-4). Esto identifica a la pCGR-4 (MA29) como la \Delta5-desaturasa de M. alpina. Antes de esto, no se había descrito ningún aislamiento y expresión de una \Delta5-desaturasa a partir de ninguna fuente.
TABLA 2 Ácidos grasos como porcentaje de los lípidos totales extraídos de levadura
1
Claves para las Tablas
18:1 = ácido oleico
18:2 = ácido linolénico
\alpha-18:3 = ácido \alpha-linolénico
\gamma-18:3 = ácido \gamma-linolénico
18:4 = ácido estearidónico
20:3 = ácido dihomo-\gamma-linolénico
20:4 = ácido araquidónico
Ejemplo 3 Optimización de las condiciones de cultivo
La Tabla 3A muestra el efecto de la concentración de sustrato de ácido graso sobre la captación y conversión en levadura a producto de ácido graso como un porcentaje del lípido total de levadura extraído. En todos los casos, las cantidades pequeñas de sustrato exógeno (1-10 \muM) resultaron en una baja captación de ácido graso sustrato y formación de producto. Una concentración de ácido graso libre en el medio de cultivo e inducción entre 25 y 50 \muM rindió el porcentaje más elevado de producto de ácido graso formado, mientras que una concentración de 100 \muM y una captación subsiguiente más elevada en levadura parecía disminuir o inhibir la actividad desaturasa. La retroinhibición de la concentración elevada de sustrato de ácido graso se ilustró claramente cuando se compararon en la TABLA 3B las velocidades de porcentaje de conversión de los respectivos ácidos graso sustrato en sus respectivos productos. En todos los casos, la concentración de sustrato 100 \muM en el medio de cultivo disminuyó el porcentaje de conversión en producto. El efecto de la composición del medio fue también evidente cuando la glucosa estaba presente en el medio de cultivo para la \Delta5-desaturasa, puesto que el porcentaje de captación de sustrato disminuyó a 25 \muM (TABLA 3A). Sin embargo, el porcentaje de conversión por parte de la \Delta5-desaturasa aumentó el 18% y el porcentaje de producto formado permaneció el mismo en presencia de glucosa en el medio de cultivo.
TABLA 3A Efecto del sustrato añadido sobre el porcentaje de sustrato incorporado y producto formado en los extractos de levaduras
Plásmido en las levaduras pCGR-2 (\Delta15) pCGR-4 (\Delta5)
sustrato/producto 18:2/\alpha-18:3 20:3/20:4
1 \muM sub. N.D. 0,5/1,7
10 \muM sub. N.D. 3,3/4
25 \muM sub. N.D. 5,1/6,1
25 \muM \lozenge sub. 36,6/7,2 \lozenge 9,3/5,4 \lozenge
50 \muM sub. 53,1/6,5 \lozenge N.D.
100 \muM sub. 60,1/5,7 \lozenge 32,3/5,8 \lozenge
TABLA 3B Efecto de la concentración de sustrato en el medio sobre el porcentaje de conversión del sustrato de ácido graso a producto en los extractos de levaduras
Plásmido en las levaduras pCGR-2 (\Delta15) pCGR-4 (\Delta5)
sustrato/producto 18:2\rightarrow\alpha-18:3 20:3\rightarrow20:4
1 \muM sub. N.R. 0,5/1,7
10 \muM sub. N.R. 3,3/4
25 \muM sub. N.R. 5,1/6,1
25 \muM \lozenge sub. 16,4 36,7
50 \muM sub. 10,90 N.R.
100 \muM sub. 8,70 15,2 \lozenge
\lozenge sin glucosa en el medio
+ caldo de peptona de levadura (YPD)
*18:1 es un lípido de levadura endógeno
sub. es la concentración de sustrato
N.R. no se ha realizado
La Tabla 4 muestra la cantidad de ácido graso producido por una desaturasa recombinante a partir de cultivos de levaduras inducidos cuando se usaron diferentes cantidades sustrato de ácido graso libre. Se determinó el peso de ácido graso puesto que la cantidad total de lípido varió dramáticamente cuando se cambiaron las condiciones de cultivo, tales como la presencia de glucosa en el medio de cultivo e inducción de levaduras. Para determinar mejor las condiciones en las que la desaturasa recombinante produciría el máximo de producto PUFA, se examinó la cantidad de ácidos grasos individuales. La ausencia de glucosa redujo a la mitad la cantidad de ácido araquidónico producido por la \Delta5-desaturasa. Para la \Delta5-desaturasa, la cantidad de lípidos de levadura totales disminuyó en casi la mitad en ausencia de glucosa.
TABLA 4 Ácido graso producido en \mug a partir de los extracto de levaduras
Plásmido en las levaduras (enzima) pCGR-4 (\Delta5) pCGR-7 (\Delta12)
producto 20:04:00 18:2*
1 \muM sub. 8,3 N.R.
10 \muM sub. 19,2 N.R.
25 \muM sub. 31,2 115,7
25 \muM \lozenge sub. 16,8 39 \lozenge
\lozenge sin glucosa en el medio
sub. es la concentración de sustrato
*18:1, el sustrato, es un lípido de levadura endógeno
N.R. no se ha realizado
Ejemplo 4 Distribución de los PUFA en las fracciones lipídicas de levaduras
La Tabla 5 ilustra la captación de ácidos grasos libres y sus nuevos productos formados en los lípidos de levaduras tal como están distribuidos en las principales fracciones lipídicas. Se preparó un extracto lipídico total como se describió más arriba. El extracto lipídico se separó sobre placas de TLC, y las fracciones se identificaron mediante comparación con estándares. Las bandas se recogieron rascando, y se añadieron estándares internos. A continuación, se saponificaron las fracciones y se metilaron como más arriba, y se sometieron a cromatografía en gas. La cromatografía en gas calculó la cantidad de ácido graso por comparación con un estándar. Parecería que los sustratos son accesibles en la forma de fosfolípido a las desaturasas.
TABLA 5 Distribución de ácidos grasos en varias fracciones lipídicas de levadura en \mug
2
Ejemplo 5 Optimización adicional del cultivo
Se evaluaron las condiciones de crecimiento e inducción para las actividades óptimas de las desaturasas en Saccharomyces cerevisiae. Las varias condiciones de cultivo que se manipularon para la actividad óptima fueron: I) temperatura de inducción. ii) concentración del inductor; III) momento de la adición del sustrato, IV) concentración de sustrato, V) fuente de azúcar, VI) fase de crecimiento en la inducción. Estos estudios se realizaron usando el gen de la \Delta5-desaturasa procedente de Mortierella alpina (MA 29). Además, también se determinó el efecto de cambiar la cepa huésped sobre la expresión del gen de la \Delta5-desaturasa.
Tal como se ha descrito más arriba, la mejor velocidad de conversión de sustrato a ARA se observó con una concentración de sustrato de 1 \muM, no obstante, el porcentaje de ARA en los ácidos grasos totales fue máximo a una concentración de sustrato de 25 \muM. Para determinar si era necesario modificar el sustrato a una forma fácilmente asequible antes de que pudiera ser utilizado por la desaturasa, se añadió el sustrato bien 15 horas antes de la inducción o de forma concomitante con la adición del inductor (indicado como "después" en la Figura 6A). Tal como puede observarse en la Figura 6A, la adición del sustrato antes de la inducción no causó un efecto significativo sobre la actividad de la \Delta5-desaturasa. De hecho, la adición del sustrato junto con el inductor fue ligeramente mejor para la expresión/actividad de la \Delta5-desaturasa, puesto que los niveles de ARA en los ácidos grasos totales fueron superiores. No obstante, la velocidad de conversión de sustrato a producto fue ligeramente inferior.
El efecto de la concentración de inductor sobre la expresión/actividad de la \Delta5-desaturasa de Mortierella se examinó induciendo las SC334/pCGR5 con 0,5 ó 2% (p/v) de galactosa. Tal como se muestra en las Figuras 7A y 7B, la expresión de la \Delta5-desaturasa fue mayor cuando se indujo con 0,5% de galactosa. Más aún, la velocidad de conversión de sustrato a producto fue también mejor cuando las SC334/pCGR5 se indujeron con 0,5% de galactosa en comparación con 2% de galactosa.
Para determinar el efecto de la temperatura sobre la actividad \Delta5-desaturasa, la cepa huésped SC334, transformada con pCGR5 (SC334/pCGR5) se cultivó e indujo a 15ºC, 25ºC, 30ºC y 37ºC. La cantidad de ARA (20:4n6) producido en cultivos de SC334/pCGR5, suplementados con 20:3n6 de sustrato, se midió mediante análisis de los ácidos grasos. La Figura 8A ilustra la cantidad de 20:3n6 y 20:4n6, expresada como porcentaje de los ácidos grasos totales. La Figura 8B ilustra la velocidad de conversión de sustrato a producto. El cultivo e inducción de SC334/pCGR5 a 25ºC fue el mejor para la expresión de la \Delta5-desaturasa, tal como se evidencia por los niveles máximos de ácido araquidónico en los ácidos grasos totales. Adicionalmente, la máxima velocidad de conversión de sustrato a producto también ocurrió a 25ºC. El cultivo e inducción a 15ºC dio la expresión más baja de ARA, mientras que a 37ºC dio la conversión más baja de sustrato a producto.
El efecto de la cepa de levadura sobre la expresión del gen de la \Delta5-desaturasa se estudió en 5 cepas huéspedes diferentes; INVSC1, INVSC2, YTC34, YTC41 y SC334, a 15ºC y 30ºC. A 15ºC, SC334 tuvo el porcentaje más elevado de ARA en los ácidos grasos totales, sugiriendo una mayor actividad de la \Delta5-desaturasa en SC334. Sin embargo, la velocidad de conversión de sustrato a producto es la más baja en SC334 y la más elevad en INVSC1 (Figuras 9A y B). A 30ºC, el porcentaje más elevado de producto (ARA) en los ácidos grasos totales se observó en INVSC2, aunque la velocidad de conversión de sustrato a producto en INVSC2 fue ligeramente inferior a la de INVSC1 (Figuras 10A y B).
ARA, el producto de la \Delta5-desaturasa, es almacena en la fracción fosfolipídica (Ejemplo 4). Por tanto, la cantidad de ARA producido en levaduras está limitada por la cantidad que puede almacenarse en la fracción fosfolipídica. Si ARA pudiera almacenarse también en otras fracciones, tales como la fracción de triglicéridos, la cantidad de ARA producido en levadura podría incrementarse. Para ensayar esta hipótesis, se expresó el gen de la \Delta5-desaturasa en la cepa huésped DBY746 de levadura (obtenida del Yeast Genetic Stock Centre, 1021 Donner Laboratory, Berkeley, CA 94720. El genotipo de la cepa DBY746 es Mat\alpha, his3-\Delta1, leu2-3, leu2-112, ura3-32, trp1-289, gal). La cepa DBY746 tiene un gen endógeno para la colina transferasa. La presencia de este enzima podría capacitar a la cepa DBY746 para convertir el exceso de fosfolípidos en fracción de triglicéridos. Los resultados en la Figura 11 no muestra un incremento en la conversión de sustrato a producto en comparación con la SC334, la cual no tiene el gen de la colina transferasa.
Para estudiar el efecto del medio sobre la expresión de la \Delta5-desaturasa, se cultivó la pCGR4/SC334 en cuatro medios diferentes, a dos temperaturas diferentes (15ºC y 30ºC), y en dos cepas huéspedes diferentes (SC334 e INVSC1). La composición de los medios fue como sigue:
Medio A: mm-Ura + 2% de galactosa + 2% de glucosa.
Medio B: mm-Ura + 20% de galactosa + 2% de glucosa + sorbitol 1 M (pH 5,8).
Medio C: mm-Ura + 2% de galactosa + 2% de rafmosa.
Medio D: mm-Ura + 2% de galactosa + 2% de rafinosa + sorbitol 1 M (pH 5,8).
mm = medio mínimo
Los resultados muestran que la velocidad de conversión más elevada de sustrato a producto a 15ºC en SC334 se observaba en el medio A. La velocidad de conversión más elevada conjunta para la \Delta5-desaturasa en SC334 fue a 30ºC en medio D. La velocidad de conversión más elevada de la \Delta5-desaturasa en INVSC1 ocurrió también a 30ºC en medio D (Figuras 12A y 12B).
Estos datos muestran que puede aislarse a partir de Mortierella alpina un ADN que codifica una desaturasa que puede convertir DGLA en ARA, y que puede expresarse en una sistema heterólogo y usarse parar producir ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados. Se muestra como ejemplo la producción de ARA A partir del precursor DGLA mediante la expresión de una \Delta5-desaturasa en levaduras.
Ejemplo 6 Identificación de homólogos con las desaturasas \Delta5 y \Delta6 de M. alpina
Se identificó una secuencia de ácido nucleico que codifica una \Delta5-desaturasa putativa a través de una búsqueda con TBLASTN de las bases de datos EST a través del NCBI usando los aminoácidos 100-446 de Ma29 como pregunta. Se usó la porción truncada de la secuencia Ma29 para evitar seleccionar homologías basadas en la porción del citocromo b5 en el extremo N-terminal de la desaturasa. La secuencia de aminoácidos deducida de una EST procedente de Dictyostelium discoideum (código de acceso #C25549) muestra una homología muy significativa con la Ma29 y una menor homología, pero aún significativa, con Ma524. La secuencia de ADN se presenta como SEC. Nº ID. 13. La secuencia de aminoácidos se presenta como SEC. Nº ID. 14.
Ejemplo 7 Identificación de homólogos de \Delta5 y \Delta6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFA
Para buscar desaturasas implicada en la producción de PUFA, se construyó una biblioteca de cADN a partir del ARN total aislado de Phaeodactylum tricornutum. Se construyó un plásmido basado en la biblioteca de cADN en pSPORT1 (GIBCO-BRL) siguiendo las instrucciones del fabricante y usando un equipo disponible comercialmente (GIBCO-BRL). Se secuenciaron clones de cADN aleatorios y se identificaron secuencias de ácidos nucleicos que codifican desaturasas \Delta5 y \Delta6 putativas a través de la búsqueda BLAST de las bases de datos y de la comparación con las secuencias de Ma29 y Ma524.
Se identificó un clon procedente de la biblioteca de Phaeodactylum tricornutum con homología por Ma29 y Ma524; se denominó 144-011-B12. La secuencia de ADN se presenta como SEC. Nº ID. 15. La secuencia de aminoácidos se presenta como SEC. Nº ID. 16.
Ejemplo 8 Identificación de homólogos de \Delta5 y \Delta6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFA
Para buscar desaturasas implicada en la producción de PUFA, se construyó una biblioteca de cADN a partir del ARN total aislado de especies de Schizochytrium. Se construyó un plásmido basado en la biblioteca de cADN en pSPORT1 (GIBCO-BRL) siguiendo las instrucciones del fabricante y usando un equipo disponible comercialmente (GIBCO-BRL). Se secuenciaron clones de cADN aleatorios y se identificaron secuencias de ácidos nucleicos que codifican desaturasas \Delta5 y \Delta6 putativas a través de la búsqueda BLAST de las bases de datos y de la comparación con las secuencias de Ma29 y Ma524.
Se identificó un clon procedente de la biblioteca de Schizochytrium con homología por Ma29 y Ma524; se denominó 81-23-C7. Este clon contiene un inserto de \sim1 kb. Se obtuvo la secuencia parcial a partir de cada extremo del clon usando los cebadores de secuenciación hacia adelante y hacia atrás universales. La secuencia de ADN procedente del primer cebador hacia adelante se presenta como SEC. Nº ID. 17. La secuencia peptídica se presenta como SEC. Nº ID. 18. La secuencia de ADN procedente del primer cebador hacia atrás se presenta como SEC. Nº ID. 19. La secuencia de aminoácidos procedente del cebador hacia atrás se presenta como SEC. Nº ID. 20.
Ejemplo 9 Secuencias de desaturasas humanas
Las secuencias de genes de desaturasas humanas potencialmente implicadas en la biosíntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga se aislaron en base a la homología entre las secuencias de cADN humanas y la secuencias del gen de la desaturasa de Mortierella alpina. Se hallaron tres "cajas de histidina" conservadas que se sabe que están conservadas entre las desaturasas unidas a membrana. Al igual que con algunas otras desaturasas unidas a membrana, se halló que el motivo de caja de histidina HXXHH final era QQXHH. La secuencia de aminoácidos de las desaturasas humanas putativas exhibió homología con las desaturasas \Delta5, \Delta6, \Delta9 y \Delta12 de M. alpina.
Las secuencias de cADN de la \Delta5-desaturasa y \Delta6-desaturasa de M. alpina se usaron para buscar la base de datos LifeSeq de Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, California, 94304. La secuencia de la \Delta5-desaturasa se dividió en fragmentos; 1) aminoácidos nº 1-150, 2) aminoácidos 151-300, y 3) aminoácidos 301-446. La secuencia de \Delta6-desaturasa se dividió en tres fragmentos; 1) aminoácidos nº 1-150, 2) aminoácidos 151-300, y 3) aminoácidos 301-457. Estos fragmentos polipeptídicos se buscaron en la base de datos usando el algoritmos "tblastn". Este algoritmo compara una secuencia pregunta de proteína contra una base de datos de secuencias de nucleótidos dinámicamente traducida en la totalidad de las seis pautas de lectura (ambas hebras).
Los fragmentos polipeptídicos 2 y 3 de la \Delta5 y \Delta6 de M. alpina tienen homologías con las secuencias con CloneID tal como se esboza en la TABLA 6. El CloneID representa una secuencia individual procedente de la base de datos LifeSeq de Incyte. Una vez se hubieron revisados los resultados del "tblastn", se buscó la Información del Clone con los ajustes por defecto de Rigurosidad >= 50 (Stringency), y Puntuación del Producto <= 100 (Productscore) para diferentes números de CloneID. Los Resultados de Información del Clon mostraron la información, incluyendo el ClusterID, CloneID, Biblioteca, HitID, Descripción del Acierto (Hit Description). Cuando se selecciona, el número del ClusterID muestra la información de clon para todos los clones que pertenecen a ese ClusterID. La instrucción "Assemble" agrupa la totalidad de los CloneID que comprende el ClusterID. Se usaron los siguientes ajustes por defecto para el Assembly del GCG (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Bioctechnology Center, Madison, Wisconsin 53705):
Tamaño de palabra 7
Solapamiento mínimo 14
Rigurosidad 0,8
Identidad mínima 14
Hueco máximo 10
Peso del hueco 8
Peso de la longitud 2
Los resultados del Assembly del GCG mostraron los "contig" generados en base a la información de secuencia dentro del CloneID. Un "contig" es un alineamiento de secuencias de ADN basado en áreas de homología entre estas secuencias. Se generó una nueva secuencia (secuencia consenso) en base a las secuencias de ADN alineadas dentro del contig. Se identificó el contig que contiene el CloneID, y los sitios ambiguos de la secuencia consenso se editaron en base al alineamiento del CloneID (ver SEC. Nº ID. 21 - SEC. Nº ID. 25) para generar la mejor secuencia posible. El procedimiento se repitió para la totalidad de los seis CloneID listados en la TABLA 6. Esto produjo cinco contig únicos. Las secuencias consensos editadas de los cinco contig se importaron en el programa informático Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Harbor, Michigan 48105). Estas secuencias consenso se ensamblaron. El contig 2511785 se solapa con el contig 3506132, y este nuevo contig se denominó 2535 (SEC. Nº ID. 27). Los contig del programa Sequencher se copiaron en el paquete informático Sequence Analysis del GCG.
Cada contig se tradujo en la totalidad de las seis pautas de lectura en secuencias proteicas. Se compararon las secuencias \Delta5 (MA29) y \Delta6 (MA524) se M. alpina con cada uno de los contig traducidos usando la búsqueda FastA (una búsqueda según Pearson y Lipman de similitudes entre una secuencia pregunta y un grupo de secuencias del mismo tipo (ácido nucleico o proteína)). La homología entre estas secuencias sugiere las pautas de lectura abierta de cada contig. La homología entre la \Delta5 y \Delta6 de M. alpina con los contig 2535 y 3854933 se utilizó para crear el contig final denominado 253538a. La Figura 13 es el emparejamiento FastA del contig final 253538a y el MA29, y la Figura 14 es el emparejamiento del contig final 253538a y el MA524. Las secuencias de ADN de los varios contig se presentan en las SEC. Nº ID. 21 - SEC. Nº ID. 27. Las varias secuencias peptídicas se muestran en las SEC. Nº ID. 
\hbox{18 -}
SEC. Nº ID. 34.
Aunque la pauta de lectura abierta se generó mezclando los dos contig, el contig 2535 muestra que hay una única secuencia al inicio de este contig que no se empareja con el contig 3854933. Por tanto, es posible que estos contig se generaran a partir de genes humanos independientes parecidos a desaturasas.
El contig 253538a contiene una pauta de lectura abierta que codifica 432 aminoácidos. Empieza con Gln (CAG) y termina con el codón de paro (TGA). El contig 253538a se alinea con ambas secuencias, \Delta5 y \Delta6, de M. alpina, sugiriendo que podría ser cualquiera de ambas desaturasas, así como con otras desaturasas conocidas que comparten homología entre ellas. Los contig individuales listados en la Tabla 6, así como el contig 2535 intermedio y el contig 253538 final, pueden utilizarse para aislar los genes completos para las desaturasas humanas.
Usos de las desaturasas humanas
Estas secuencias humanas pueden expresarse en levaduras y plantas utilizando los procedimientos descritos en los ejemplos precedentes. Para la expresión en células de mamíferos y en animales transgénicos, estos genes podrían proporcionar un sesgo del codón superior. Estas secuencias humanas pueden usarse también para identificar secuencias de desaturasas relacionadas.
TABLA 6
Secciones de las desaturasas ID del clon en la base de datos LifeSeq Palabra clave
151-300 \Delta5 3808675 Desaturasa de ácido graso
301-446 \Delta5 354535 \Delta6
151-300 \Delta6 3448789 \Delta6
151-300 \Delta6 1362863 \Delta6
151-300 \Delta6 2394760 \Delta6
301-457 \Delta6 3350263 \Delta6
Ejemplo 10 Composiciones nutricionales
Los PUFA de los ejemplos previos pueden utilizarse en varios suplementos nutricionales, formulaciones para bebés, sustitutos nutricionales, y otras soluciones para nutrición.
Formulaciones para bebés A. Fórmula de Soja Isomil® con hierro
Uso: como bebida para bebés, niños y adultos con alergia o sensibilidad a la leche de vaca. Un alimento para pacientes con desórdenes para los que debería evitarse la lactosa: deficiencia de lactasa, intolerancia a la lactosa y galactosemia.
Características:
\bullet Aislado de proteína de soja para evitar los síntomas de la alergia o sensibilidad a las proteína de la leche de vaca.
\bullet Formulación libre de lactosa para evitar la diarrea asociada con la lactosa.
\bullet Baja osmolalidad (240 mOsm/kg de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmótica.
\bullet Carbohidratos duales (jarabe de maíz y sacarosa) diseñados para potenciar la absorción de carbohidratos y reducir el riesgo de exceder la capacidad absortiva del intestino dañado.
\bullet 1,8 mg de hierro (como sulfato ferroso) por cada 100 calorías, para ayudar a prevenir la deficiencia en hierro.
\bullet Niveles recomendados de vitaminas y minerales.
\bullet Aceites vegetales para proporcionar los niveles recomendados de ácidos grasos esenciales.
\bullet Color blanco-leche, consistencia parecida a la de la leche, y aroma agradable.
Ingredientes: (Pareve, (OU)) 85% de agua, 4,9% de jarabe de maíz, 2,6% de azúcar (sacarosa), 2,1% de aceite de soja, 1,9% de aislado de proteína de soja, 1,4% de aceite de coco, 0,15% de citrato cálcico, 0,11% de fosfato cálcico tribásico, citrato potásico, fosfato potásico monobásico, cloruro potásico, mono- y diglicéridos, lecitina de soja, carragenato, ácido ascórbico, L-metionina, cloruro magnésico, fosfato potásico dibásico, cloruro sódico, cloruro de colina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, riboflavina, hidrocloruro de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro potásico, filoquinona, biotina, selenito sódico, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
B. Fórmula de soja Isomil® DF para la diarrea
Uso: como un alimento durante breve tiempo para la gestión dietética de la diarrea en bebés y niños que empiezan a andar.
Características:
\bullet Primera fórmula para bebés que contiene fibra dietética añadida procedente de la fibra de soja específicamente para la gestión de la diarrea.
\bullet Se ha mostrado clínicamente que reduce la duración de las deposiciones blandas, acuosas, durante la diarrea suave a grave en bebés.
\bullet Nutricionalmente completa para cubrir las necesidades nutricionales del bebé.
\bullet El aislado de proteína de soja con L-metionina añadida cumple o supera los requisitos del bebé para todos los aminoácidos esenciales.
\bullet Formulación libre de lactosa para evitar la diarrea asociada con la lactosa.
\bullet Baja osmolalidad (240 mOsm/kg de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmótica.
\bullet Carbohidratos duales (jarabe de maíz y sacarosa) diseñados para potenciar la absorción de carbohidratos y reducir el riesgo de exceder la capacidad absortiva del intestino dañado.
\bullet Cumple o supera los niveles de vitaminas y minerales recomendados por el Comité sobre Nutrición de la American Academy of Pediatrics y los requeridos por la Infant Formula Act.
\bullet 1,8 mg de hierro (como sulfato ferroso) por cada 100 calorías, para ayudar a prevenir la deficiencia en hierro.
\bullet Aceites vegetales para proporcionar los niveles recomendados de ácidos grasos esenciales.
Ingredientes: (Pareve, (OU)) 86% de agua, 4,8% de jarabe de maíz, 2,5% de azúcar (sacarosa), 2,1% de aceite de soja, 2,0% de aislado de proteína de soja, 1,4% de aceite de coco, 0,77% de fibra de soja, 0,12% de citrato cálcico, 0,11% de fosfato cálcico tribásico, 0,10% de citrato potásico, cloruro potásico, fosfato potásico monobásico, mono- y diglicéridos, lecitina de soja, carragenato, cloruro magnésico, ácido ascórbico, L-metionina, fosfato potásico dibásico, cloruro sódico, cloruro de colina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, riboflavina, hidrocloruro de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro potásico, filoquinona, biotina, selenito sódico, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
C. Fórmula de soja libre de sacarosa Isomil® SF con hierro
Uso: como bebida para bebés, niños y adultos con alergia o sensibilidad a la leche de vaca, o una intolerancia a la sacarosa. Un alimento para pacientes con desórdenes para los que debería evitarse la lactosa y sacarosa.
Características:
\bullet Aislado de proteína de soja para evitar los síntomas de la alergia o sensibilidad a las proteína de la leche de vaca.
\bullet Formulación libre de lactosa para evitar la diarrea asociada con la lactosa (la fuente de carbohidratos son los polímeros de glucosa Polycose®).
\bullet Libre de sacarosa para los pacientes que no pueden tolerar la sacarosa.
\bullet Baja osmolalidad (240 mOsm/kg de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmótica.
\bullet 1,8 mg de hierro (como sulfato ferroso) por cada 100 calorías, para ayudar a prevenir la deficiencia en hierro.
\bullet Niveles recomendados de vitaminas y minerales.
\bullet Aceites vegetales para proporcionar los niveles recomendados de ácidos grasos esenciales.
\bullet Color blanco-leche, consistencia parecida a la de la leche, y aroma agradable.
Ingredientes: (Pareve, (OU)) 75% de agua, 11,8% de almidón de maíz hidrolizado, 4,1% de aceite de soja, 4,1% de aislado de proteína de soja, 2,8% de aceite de coco, 1,0% de almidón de maíz modificado, 0,38% de fosfato cálcico tribásico, 0,17% de citrato potásico, 0,13% de cloruro potásico, mono- y diglicéridos, lecitina de soja, ácido ascórbico, L-metionina, carbonato cálcico, cloruro sódico, cloruro de colina, carragenato, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, riboflavina, hidrocloruro de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro potásico, filoquinona, biotina, selenito sódico, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
D. Fórmula de soja Isomil® 20 con hierro, lista para tomar, 20 calorías/onza líquida
Uso: cuando se desea una alimentación con soja.
Ingredientes: (Pareve, (OU)) 85% de agua, 4,9% de jarabe de maíz, 2,6% de azúcar (sacarosa), 2,1% de aceite de soja, 1,9% de aislado de proteína de soja, 1,4% de aceite de coco, 0,15% de citrato cálcico, 0,11% de fosfato cálcico tribásico, citrato potásico, fosfato potásico monobásico, cloruro potásico, mono- y diglicéridos, lecitina de soja, carragenato, ácido ascórbico, L-metionina, cloruro magnésico, fosfato potásico dibásico, cloruro sódico, cloruro de colina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, riboflavina, hidrocloruro de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro potásico, filoquinona, biotina, selenito sódico, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
E. Fórmula para bebés Similac®
Uso: Cuando se necesita una fórmula para bebés: si se ha tomado la decisión de interrumpir la lactancia materna antes de 1 año de edad, si se necesita un suplemento para la lactancia materna, o como alimentación rutinaria si no se ha adoptado la lactancia materna.
Características:
\bullet Proteína con la cualidad y cantidad apropiada para un buen crecimiento; desnaturalizada con calor, lo cual reduce el riesgo de pérdida de sangre entérica asociada con la leche.
\bullet Grasa procedente de una mezcla de aceites vegetales (doblemente homogeneizada), proporcionando el ácido linolénico esencial que es fácilmente absorbido.
\bullet Carbohidratos en forma de lactosa en proporción similar a la de la leche humana.
\bullet Carga de soluto renal baja para minimizar el estrés en los órganos en desarrollo.
\bullet En formas de polvo, líquido concentrado y lista para tomar.
Ingredientes: ((OU)-D) Agua, leche descremada, lactosa, aceite de soja, aceite de coco, mono- y diglicéridos, lecitina de soja, ácido ascórbico, carragenato, cloruro de colina, taurina, m-inositol, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, niacinamida, sulfato ferroso, pantotenato cálcico, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, riboflavina, hidrocloruro de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, biotina, selenito sódico, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
F. Fórmula para bebés prematuros Similac® NeoCare con hierro
Uso: Para las especiales necesidades nutricionales de los bebés prematuros después de su alta hospitalaria. Similac NeoCare es una fórmula nutricionalmente completa desarrollada para proporcionar a los bebés prematuros con las calorías, proteínas, vitaminas y minerales extras necesarios para promocionar la recuperación del retraso en el crecimiento y apoyar su desarrollo.
Características:
\bullet Reduce la necesidad de suplemento calórico y de vitaminas. Más calorías (22 calorías/onza fluida) que las fórmulas para embarazos estándares (20 calorías/onza fluida).
\bullet Mezcla de grasas altamente absorbida, con triglicéridos de cadena media (aceite MCT) para ayudar a cubrir las especiales necesidades digestivas de los bebés prematuros.
\bullet Mayores niveles de proteínas, vitaminas y minerales por 100 calorías para prolongar el apoyo nutricional iniciado en el hospital.
\bullet Más calcio y fósforo para una mineralización ósea mejorada.
Ingredientes: (OU)-D Sólidos de jarabe de maíz, leche descremada, concentrado de proteína de soja, aceite de soja, aceite de "safflower" alto en oleico, aceite de coco fraccionado (triglicéridos de cadena media), aceite de coco, citrato potásico, fosfato cálcico tribásico, carbonato cálcico, ácido ascórbico, cloruro magnésico, cloruro potásico, cloruro sódico, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, ascorbil palmitato, L-carnitina, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, niacinamida, tocoferoles mezclados, citrato sódico, pantotenato cálcico, sulfato cúprico, cloruro hidrocloruro de tiamina, palmitato de vitamina A, beta-caroteno, riboflavina, hidrocloruro de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, biotina, selenito sódico, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
G. Vigorizante de la leche humana bajo en hierro Similac Natural Care, listo para tomar, 24 calorías/onza fluida
Uso: Diseñado para ser mezclado con la leche humana o para ser tomado de forma alternativa con la leche humana, para bebés con bajo peso al nacer.
Ingredientes:
Varios PUFA de esta invención podrían sustituirse en y/o añadirse a las fórmulas para bebés descritas más arriba y a otras fórmulas para bebés conocidas por los especialistas en la técnica.
II. Formulaciones nutricionales A. ENSURE®
Uso: ENSURE es un alimento líquida bajo en residuos diseñado principalmente como un suplemento nutricional oral a ser usado con o entre comidas o, en las cantidades apropiadas, como un sustituto de la comida. ENSURE carece de lactosa y gluten, y es apropiado para su uso en dietas modificadas, incluyendo las dietas bajas en colesterol. Aunque es principalmente un suplemento oral, puede ser alimentado por tubo.
Condiciones del paciente
\bullet Para pacientes con dietas modificadas.
\bullet Para pacientes ancianos con riesgo de nutrición.
\bullet Para pacientes con pérdida de peso involuntaria.
\bullet Para pacientes que se recuperan de una operación o enfermedad.
\bullet Para pacientes que necesitan una dieta baja en residuos.
Ingredientes
(OU)-D. Agua, azúcar (sacarosa), maltodextrina (maíz), caseinatos de calcio y sodio, aceite de "safflower" alto en oleico, aislado de proteína de soja, aceite de soja, aceite de colza, citrato potásico, fosfato cálcico tribásico, citrato sódico, cloruro magnésico, fosfato magnésico dibásico, aroma artificial, cloruro sódico, lecitina de soja, cloruro de colina, ácido ascórbico, carragenato, sulfato de zinc, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, goma Gellan, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato de manganeso, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, ácido fólico, molibdato sódico, cloruro de cromo, yoduro potásico, selenato sódico.
B. ENSURE® BARS
Uso: Las ENSURE BARS son una nutrición completa y equilibrada para uso como suplemento entre o con las comidas. Proporcionan una alternativa deliciosa y rica en nutrientes a otros tentempiés. Las barritas ENSURE BARS contienen < 1 g de lactosa/barrita, y el sabor Chocolate Fudge Brownie carece de gluten (El sabor a Honey Graham Crunch contiene gluten).
Condiciones del paciente
\bullet Para pacientes que necesitan calorías, proteínas, vitaminas y minerales extras.
\bullet Especialmente útil para gente que no toman bastantes calorías y nutrientes.
\bullet Para gente que tiene la capacidad de mascar y tragar.
\bullet No debe ser usada por nadie con alergia al cacahuete o cualquier otro tipo de alergia a las nueces.
Ingredientes
Honey Graham Crunch - Jarabe de maíz alto en fructosa, aislado de proteína de soja, azúcar moreno, miel, maltodextrina (maíz), arroz crujiente (arroz molido, azúcar [sacarosa], sal [cloruro sódico], y malta), salvado de avena, aceites de soja y de semillas de algodón parcialmente hidrogenados, glicerina, concentrado de proteína del suero, polidextrosa, fructosa, caseinato cálcico, polvo de coco, aromas artificiales, aceite de colza, aceite de "safflower" alto en oleico, leche en polvo descremada, polvo de suero, lecitina de soja, y aceite de maíz. Manufacturado en una instalación que procesa nueces.
Vitaminas y minerales
Fosfato cálcico tribásico, fosfato potásico dibásico, óxido de magnesio, sal (cloruro sódico), cloruro potásico, ácido ascórbico, ortofosfato férrico, alfa-tocoferil acetato, niacinamida, óxido de zinc, pantotenato cálcico, gluconato de cobre, sulfato de manganeso, riboflavina, beta-caroteno, hidrocloruro de piridoxina, mononitrato de tiamina, ácido fólico, biotina, cloruro crómico, yoduro potásico, selenato de sodio, molibdato de sodio, filoquinona, vitamina D_{3}, y cianocobalamina.
Proteína
Honey Graham Crunch - La fuente de proteínas es una mezcla de aislado de proteína de soja y proteínas de la leche.
Aislado de proteína de soja 74%
Proteínas de la leche 26%
Grasas
Honey Graham Crunch - La fuente de grasas en una mezcla de aceites de soja y semillas de algodón parcialmente hidrogenados, de colza, de "safflower" alto en oleico, y de maíz, y de lecitina de soja.
aceites de soja y semillas de algodón parcialmente hidrogenados 76%
Aceite de colza 8%
Aceite de "safflower" alto en oleico 8%
Aceite de maíz 4%
Lecitina de soja 4%
Carbohidratos
Honey Graham Crunch - La fuente de carbohidratos es una combinación de jarabe de maíz alto en fructosa, azúcar moreno, maltodextrina, miel, arroz crujiente, glicerina, polisacáridos de soja, y salvado de avena.
Jarabe de maíz alto en fructosa 24%
Azúcar moreno 21%
Maltodextrina 12%
Miel 11%
Arroz crujiente 9%
Glicerina 9%
Polisacáridos de soja 7%
Salvado de avena 7%
C. ENSURE® HIGH PROTEIN
Uso: ENSURE HIGH PROTEIN es un alimento líquido, concentrado, alto en proteínas, diseñado para gente que requieren calorías, proteínas, vitaminas y minerales adicionales en sus dietas. Puede usarse como un suplemento nutricional oral con o entre comidas o, en las cantidades apropiadas, como un sustituto de la comida. ENSURE HIGH PROTEIN carece de lactosa y gluten, y es apropiado para su uso por parte de gente recuperándose de cirugía general, o de fracturas de cadera, y por parte de pacientes con riesgo de padecer úlceras por presión.
Condiciones del paciente
\bullet Para pacientes que requieren calorías, proteínas, vitaminas y minerales adicionales, tales como los pacientes que se recuperan de cirugía general, o de fracturas de cadera, pacientes con riesgo de padecer úlceras por presión, y pacientes con dietas bajas en colesterol.
Características
\bullet Bajo en grasas saturadas.
\bullet Contiene 6 g de grasa total y < 5 mg de colesterol por servicio.
\bullet Sabor rico, cremoso.
\bullet Excelente fuente de proteínas, calcio y otras vitaminas y minerales esenciales.
\bullet Para dietas bajas en colesterol.
\bullet Carece de lactosa, fácilmente digerible.
Ingredientes
Vanilla Supreme: -(OU)-D. Agua, azúcar (sacarosa), maltodextrina (maíz), caseinatos de calcio y sodio, aceite de "safflower" alto en oleico, aislado de proteína de soja, aceite de soja, aceite de colza, citrato potásico, fosfato cálcico tribásico, citrato sódico, cloruro magnésico, fosfato magnésico dibásico, aroma artificial, cloruro sódico, lecitina de soja, cloruro de colina, ácido ascórbico, carragenato, sulfato de zinc, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, goma Gellan, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato de manganeso, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, ácido fólico, molibdato sódico, cloruro de cromo, biotina, yoduro potásico, selenato sódico, filoquinona, vitamina D_{3}, y cianocobalamina.
Proteínas
La fuente de proteínas es una mezcla de dos proteína con elevado valor biológico: la caseína y la soja.
Caseinatos sódico y cálcico 85%
Aislado de proteína de soja 15%
Grasas
La fuente de grasas en una mezcla de tres aceites: de "safflower" alto en oleico, de colza, y de soja.
Aceite de "safflower" alto en oleico 40%
Aceite de colza 30%
Aceite de soja 30%
El nivel de grasa en ENSURE HIGH PROTEIN cumple las directrices de la American Heart Association (AHA). Los 6 gramos de grasa en ENSURE HIGH PROTEIN representan el 24% de las calorías totales, siendo el 2,6% de las grasas saturadas y procediendo el 7,9% de ácidos grasos poliinsaturados. Estos valores se hallan dentro de las líneas maestras de la AHA, que \leq30% de las calorías totales procedan de la grasa, que <10% de las calorías procedan de ácidos grasos saturados, y que \leq10% de las calorías totales procedan de ácidos grasos poliinsaturados.
Carbohidratos
ENSURE HIGH PROTEIN contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. La dulzura moderada y la variedad de sabores ("Vanille Supreme", "Chocolate Royal", "Wild Cherry", y "Banana"), más lotes de sabores VARI-FLAVORS® en pacana, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a prevenir el cansancio del sabor y ayudan al cumplimiento del paciente.
Vainilla y otros sabores distintos del chocolate
Sacarosa 60%
Maltodextrina 40%
Chocolate
Sacarosa 70%
Maltodextrina 30%
D. ENSURE® LIGHT
Uso: ENSURE LIGHT es un alimento líquido bajo en grasas diseñado para su uso como suplemento nutricional oral con o entre comidas. ENSURE LIGHT carece de lactosa y de gluten, y es apropiado para su uso en dietas modificadas, incluyendo dietas bajas en colesterol.
Condiciones del paciente
\bullet Para pacientes con peso normal o sobrepeso que necesitan una nutrición extra en un suplemento que contiene un 50% menos de grasa y un 20% menos de calorías que ENSURE.
\bullet Para adultos sanos que no comen correctamente y necesitan nutrición extra.
Características
\bullet Bajo en grasas saturadas.
\bullet Contiene 3 g de grasa total por servicio y < 5 mg de colesterol.
\bullet Sabor rico, cremoso.
\bullet Excelente fuente de calcio y otras vitaminas y minerales esenciales.
\bullet Para dietas bajas en colesterol.
\bullet Carece de lactosa, fácilmente digerible.
Ingredientes
Vanilla French: -(OU)-D. Agua, maltodextrina (maíz), azúcar (sacarosa), caseinato de calcio, aceite de "safflower" alto en oleico, aceite de colza, cloruro magnésico, citrato sódico, citrato potásico, fosfato potásico dibásico, fosfato magnésico dibásico, aromas naturales y artificiales, fosfato cálcico tribásico, gel de celulosa, cloruro de colina, lecitina de soja, carragenato, sal (cloruro sódico), ácido ascórbico, goma de celulosa, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, niacinamida, sulfato de manganeso, pantotenato cálcico, sulfato cúprico, cloruro hidrocloruro de tiamina, palmitato de vitamina A, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, cloruro de cromo, ácido fólico, molibdato sódico, yoduro potásico, selenato sódico, filoquinona, vitamina D_{3}, y cianocobalamina.
Proteínas
La fuente de proteínas es el caseinato cálcico.
Caseinato cálcico 100%
Grasas
La fuente de grasas en una mezcla de dos aceites: de "safflower" alto en oleico y de colza.
Aceite de "safflower" alto en oleico 70%
Aceite de colza 30%
El nivel de grasa en ENSURE LIGHT cumple las directrices de la American Heart Association (AHA). Los 3 gramos de grasa en ENSURE LIGHT representan el 13,5% de las calorías totales, procediendo el 1,4% de las grasas de ácidos grasos saturados y el 2,6% de ácidos grasos poliinsaturados. Estos valores se hallan dentro de las líneas maestras de la AHA: \leq30% de las calorías totales proceden de la grasa, <10% de las calorías proceden de ácidos grasos saturados, y \leq10% de las calorías totales proceden de ácidos grasos poliinsaturados.
Carbohidratos
ENSURE LIGHT contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. El sabor a chocolate contiene también jarabe de maíz. La dulzura moderada y la variedad de sabores ("French Vanilla", "Chocolate Supreme", "Strawberry Swirl"), más lotes de sabores VARI-FLAVORS® en pacana, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a prevenir el cansancio del sabor y ayudan al cumplimiento del paciente.
Vainilla y otros sabores distintos del chocolate
Sacarosa 51%
Maltodextrina 49%
Chocolate
Sacarosa 47,0%
Jarabe de maíz 26,5%
Maltodextrina 26,5%
Vitaminas y minerales
Un servicio de 8 onzas fluidas de ENSURE LIGHT proporciona al menos el 25% de las Dosis Diarias Recomendadas para 24 vitaminas y minerales claves.
Cafeína
El sabor a chocolate contiene 2,1 mg de cafeína/8 onzas fluidas.
E. ENSURE PLUS®
Uso: ENSURE PLUS es un alimento líquido alto en calorías y bajo en residuos, para uso cuando se necesitan calorías y nutrientes extras pero una concentración normal de proteínas. Esta diseñado principalmente como un suplemento nutricional oral a usar con o entre comidas, o, en cantidades apropiadas, como sustituto de las comidas. ENSURE PLUS carece de lactosa y de gluten. Aunque es principalmente un suplemento nutricional oral, puede suministrarse mediante tubo.
Condiciones del paciente
\bullet Para pacientes que requieren calorías y nutrientes extras, pero una concentración normal de proteína, en un volumen limitado.
\bullet Para pacientes que necesitan ganar o mantener un peso saludable.
Características
\bullet Sabor rico, cremoso.
\bullet Buena fuente de vitaminas y minerales esenciales.
Ingredientes
Vainilla: (OU)-D. Agua, jarabe de maíz, maltodextrina (maíz), aceite de maíz, caseinatos cálcico y sódico, azúcar (sacarosa), aislado de proteína de soja, cloruro magnésico, citrato potásico, fosfato cálcico tribásico, lecitina de soja, aromas naturales y artificiales, citrato sódico, cloruro potásico, cloruro de colina, ácido ascórbico, carragenato, sulfato de zinc, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato de manganeso, sulfato cúprico, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, palmitato de vitamina A, ácido fólico, biotina, cloruro de cromo, ácido fólico, molibdato sódico, yoduro potásico, selenato sódico, filoquinona, cianocobalamina y vitamina D_{3}.
Proteínas
La fuente de proteínas es una mezcla de dos proteínas de elevado valor biológico: la caseína y la soja.
Caseinatos sódico y cálcico 84%
Aislado de proteína de soja 16%
Grasas
La fuente de grasas es el aceite de maíz.
Aceite de maíz 100%
Carbohidratos
ENSURE PLUS contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. La dulzura moderada y la variedad de sabores (vainilla, chocolate, fresa, café, manteca de pacana, y yema), más lotes de sabores VARI-FLAVORS® en pacana, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a prevenir el cansancio del sabor y ayudan al cumplimiento del paciente.
Sabores a vainilla, fresa, manteca de pacana, y café
Jarabe de maíz 39%
Maltodextrina 38%
Sacarosa 23%
Sabores a chocolate y yema
Jarabe de maíz 36%
Maltodextrina 34%
Sacarosa 30%
Vitaminas y minerales
Un servicio de 8 onzas fluidas de ENSURE PLUS proporciona al menos el 15% de las Dosis Diarias Recomendadas para 25 vitaminas y minerales claves.
Cafeína
El sabor a chocolate contiene 3,1 mg de cafeína/8 onzas fluidas. El sabor a café contiene una cantidad traza de cafeína.
F. ENSURE PLUS® HN
Uso: ENSURE PLUS HN es un alimento líquido nutricionalmente completo, alto en calorías y alto en nitrógeno, diseñado para gente con necesidades más elevadas de calorías y proteínas o con tolerancia de volumen limitada. Podría usarse para suplemento oral o para apoyo nutricional total mediante tubo. ENSURE PLUS NH carece de lactosa y de gluten.
Condiciones del paciente
\bullet Para pacientes con necesidades incrementadas de calorías y proteínas, tales como después de cirugía o una lesión.
\bullet Para pacientes con una tolerancia de volumen limitada y saciedad temprana.
Características
\bullet Para nutricional suplementaria o total.
\bullet Para alimentación oral o mediante tubo.
\bullet 1,5 calorías/ml.
\bullet Alto en nitrógeno.
\bullet Calóricamente denso.
Ingredientes
Vanilla: (OU)-D. Agua, maltodextrina (maíz), caseinatos cálcico y sódico, aceite de maíz, azúcar (sacarosa), aislado de proteína de soja, cloruro magnésico, citrato potásico, fosfato cálcico tribásico, lecitina de soja, aromas naturales y artificiales, citrato sódico, cloruro de colina, ácido ascórbico, taurina, L-carnitina, sulfato de zinc, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato de manganeso, sulfato cúprico, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, palmitato de vitamina A, ácido fólico, biotina, cloruro de cromo, ácido fólico, molibdato sódico, yoduro potásico, selenito sódico, filoquinona, cianocobalamina y vitamina D_{3}.
G. ENSURE® POWDER
Uso: ENSURE POWDER (reconstituido con agua) es un alimento líquido bajo en residuos diseñado principalmente como un suplemento nutricional oral a usar con o entre comidas. ENSURE POWDER carece de lactosa y de gluten, y es apropiado para uso en dietas modificadas, incluyendo las dietas bajas en colesterol.
Condiciones del paciente
\bullet Para pacientes con dietas modificadas.
\bullet Para pacientes ancianos con riesgo nutricional.
\bullet Para pacientes que están recuperándose de enfermedad/intervenciones quirúrgicas.
\bullet Para pacientes que necesitan una dieta baja en residuos.
Características
\bullet Apropiado, fácil de mezclar.
\bullet Bajo en grasas saturadas.
\bullet Contiene 9 g de grasa total y <5 mg de colesterol por servicio.
\bullet Alto en vitaminas y minerales.
\bullet Para dietas bajas en colesterol.
\bullet Carece de lactosa, fácilmente digerible.
Ingredientes
(OU)-D. Jarabe de maíz, maltodextrina (maíz), azúcar (sacarosa), aceite de maíz, caseinatos cálcico y sódico, aislado de proteína de soja, aroma artificial, citrato potásico, cloruro magnésico, citrato sódico, fosfato cálcico tribásico, cloruro potásico, lecitina de soja, ácido ascórbico, cloruro de colina, sulfato de zinc, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato de manganeso, cloruro hidrocloruro de tiamina, sulfato cúprico, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, palmitato de vitamina A, ácido fólico, biotina, molibdato sódico, cloruro de cromo, yoduro potásico, selenato sódico, filoquinona, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
Proteínas
La fuente de proteínas es una mezcla de dos proteínas de elevado valor biológico: la caseína y la soja.
Caseinatos sódico y cálcico 84%
Aislado de proteína de soja 16%
Grasas
La fuente de grasas es el aceite de maíz.
Aceite de maíz 100%
Carbohidratos
ENSURE POWDER contiene una combinación de jarabe de maíz, maltodextrina y sacarosa. La dulzura moderada de ENSURE POWDER, más los lotes de sabores VARI-FLAVORS® en pacana, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a prevenir el cansancio del sabor y ayudan al cumplimiento del paciente.
Vainilla
Jarabe de maíz 35%
Maltodextrina 35%
Sacarosa 30%
H. ENSURE® PUDDING Condiciones del paciente
\bullet Para pacientes con dietas de consistencia modificada (por ejemplo, blandas, en forma de purés, o completamente líquidas).
\bullet Para pacientes con dificultades para tragar.
Características
\bullet Rico y cremoso, buen sabor.
\bullet Buena fuente de vitaminas y minerales esenciales. De forma conveniente no necesita refrigeración.
\bullet Carece de gluten.
Perfil nutritivo cada 5 onzas: 250 Calorías, 10,9% de proteínas, 34,9% de grasas totales, 54,2% de carbohidratos.
Ingredientes
(OU)-D. Leche descremada, agua, azúcar (sacarosa), aceite de soja parcialmente hidrogenado, almidón para alimentos modificado, sulfato magnésico, esteraoil lactilato sódico, fosfato sódico dibásico, aroma artificial, ácido ascórbico, sulfato de zinc, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, cloruro de colina, niacinamida, sulfato de manganeso, pantotenato cálcico, FD&C Amarillo #5, citrato potásico, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, FD&C Amarillo #6, ácido fólico, biotina, filoquinona, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
Proteínas
La fuente de proteínas es la leche descremada.
Leche descremada 100%
Grasas
La fuente de grasas es el aceite de soja hidrogenado.
Aceite de soja hidrogenado 100%
Carbohidratos
ENSURE PUDDING contiene una combinación de sacarosa y almidón alimentario modificado. La dulzura moderada y la variedad de sabores (vainilla, chocolate, dulce de azúcar terciado con mantequilla, y tapioca) ayudan a prevenir la fatiga del sabor. El producto contiene 9,2 gramos de lactosa por servicio.
Vainilla y otros sabores distintos del chocolate
Sacarosa 56%
Lactosa 27%
Almidón alimentario modificado 17%
Chocolate
Sacarosa 58%
Lactosa 26%
Almidón alimentario modificado 16%
I. ENSURE® CON FIBRA
Uso: ENSURE CON FIBRA es una alimento líquido que contiene fibra, nutricionalmente completo, diseñado para gente que puede beneficiarse de fibra y nutrientes incrementados en la dieta. ENSURE CON FIBRA es apropiado para gente que no requieren una dieta pobre en residuos. Puede alimentarse oralmente o mediante tubo, y puede usarse como un suplemento nutricional para una dieta regular, o, en cantidades apropiadas, como un sustituto de la comida. ENSURE CON FIBRA carece de lactosa y de gluten, y es apropiado para su uso en dietas modificadas, incluyendo las dietas bajas en colesterol.
Condiciones del paciente
\bullet Para pacientes que pueden beneficiarse de fibras y nutrientes incrementados en la dieta.
Características
\bullet Nueva fórmula avanzada baja en grasas saturadas, más alta en vitaminas y minerales.
\bullet Contiene 6 g de grasa total y < 5 mg de colesterol por servicio.
\bullet Sabor rico, cremoso.
\bullet Buena fuente de fibra.
\bullet Fuente excelente de vitaminas y minerales esenciales.
\bullet Para dietas bajas en colesterol.
\bullet Carece de lactosa y gluten.
Ingredientes
Vainilla: (OU)-D. Agua, maltodextrina (maíz), azúcar (sacarosa), caseinatos cálcico y sódico, fibra de avena, aceite de "safflower" alto en oleico, aceite de colza, aislado de proteína de soja, aceite de maíz, fibra de soja, fosfato cálcico tribásico, cloruro magnésico, citrato potásico, gel de celulosa, lecitina de soja, fosfato potásico dibásico, citrato sódico, aromas naturales y artificiales, cloruro de colina, fosfato magnésico, ácido ascórbico, goma de celulosa, cloruro potásico, carragenato, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, niacinamida, sulfato de manganeso, pantotenato cálcico, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, ácido fólico, biotina, cloruro de cromo, biotina, molibdato sódico, yoduro potásico, selenato sódico, filoquinona, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
Proteína
La fuente de proteínas es una mezcla de dos proteínas de elevado valor biológico: la caseína y la soja.
Caseinatos sódico y cálcico 80%
Aislado de proteína de soja 20%
Grasas
La fuente de grasas es una mezcla de tres aceites: de "safflower" alto en oleico, de colza, y de maíz.
Aceite de "safflower" alto en oleico 40%
Aceite de colza 40%
Aceite de maíz 20%
El nivel de grasa en ENSURE CON FIBRA cumple las directrices de la American Heart Association (AHA). Los 6 gramos de grasa en ENSURE CON FIBRA representan el 22% de las calorías totales, procediendo el 2,01% de las grasas de ácidos grasos saturados y el 6,7% de ácidos grasos poliinsaturados. Estos valores se hallan dentro de las líneas maestras de la AHA, de que \leq30% de las calorías totales procedan de la grasa, <10% de las calorías procedan de ácidos grasos saturados, y \leq10% de las calorías totales procedan de ácidos grasos poliinsaturados.
Carbohidratos
ENSURE CON FIBRA contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. La dulzura moderada y la variedad de sabores (vainilla, chocolate, y manteca de pacana), más los lotes de sabores VARI-FLAVORS® en pacana, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a prevenir el cansancio del sabor y ayudan al cumplimiento del paciente.
Vainilla y otros sabores distintos del chocolate
Maltodextrina 66%
Sacarosa 25%
Fibra de avena 7%
Fibra de soja 2%
Chocolate
Maltodextrina 55%
Sacarosa 36%
Fibra de avena 7%
Fibra de soja 2%
Fibra
La mezcla de fibras usada en ENSURE CON FIBRA consiste en fibra de avena y polisacáridos de soja. Esta mezcla resulta en aproximadamente 4 gramos de fibra dietética total por lata de 8 onzas fluidas. La proporción de fibra insoluble respecto la soluble es 95:5.
Los varios suplementos nutricionales descritos más arriba y conocidos por otros con formación en la técnica pueden sustituirse y/o suplementarse con los PUFA de esta invención.
J. Producto nutricional Oxepa™
Oxepa es un producto nutricional enteral, calóricamente denso, bajo en carbohidratos, diseñado para la gestión dietética de pacientes con, o con riesgo de padecer ARDS. Tiene una combinación única de ingredientes, incluyendo una mezcla de aceites patentada que contiene ácido eicosapentaenoico (EPA procedente del aceite de pescado), ácido \gamma-linolénico (GLA procedente del aceite de borraja), y niveles elevados de antioxidantes.
Distribución calórica
\bullet La densidad calórica es elevada, de 1,5 calorías/ml (355 calorías/8 onzas fluidas), para minimizar el volumen requerido para cubrir las necesidades energéticas.
\bullet La distribución de calorías en Oxepa se muestra en la Tabla 7.
TABLA 7 Distribución calórica de Oxepa
por 8 onzas fluidas por litro % de calorías
Calorías 355 1500 - - -
Grasas (g) 22,2 93,7 55,2
Carbohidratos (g) 25 105,5 28,1
Proteínas (g) 14,8 62,5 16,7
Agua (g) 186 785 - - -
Grasas
\bullet Oxepa contiene 22,2 g de grasa por servicio de 8 onzas fluidas (93,7 g/l).
\bullet La fuente de grasas es una mezcla de aceites, con el 38,1% de aceites de colza, el 25% de triglicéridos de cadena media (MCT), el 20% de aceite de borraja, el 20% de aceite de pescado, y el 3,2% de lecitina de soja. El perfil típico de ácidos grasos de Oxepa se muestra en la Tabla 8.
\bullet Oxepa proporciona una cantidad equilibrada de ácidos grasos poliinsaturados, monoinsaturados, y saturados, tal como se muestra en la Tabla 10.
\bullet Los triglicéridos de cadena media (MCT) - - -25% de la mezcla de grasas- - - ayudan al vaciado gástrico porque son absorbidos por el tracto intestinal sin emulsión por parte de los ácidos biliares.
Los varios ácidos grasos componentes del producto nutricional Oxepa™ pueden sustituirse y/o suplementarse con los PUFA de esta invención.
TABLA 8 Perfil típico de ácidos grasos
3
TABLA 9 Perfil de grasas de Oxepa
% de las calorías proveniente de las grasas 55,2
Ácidos grasos poliinsaturados 31,44 g/l
Ácidos grasos monoinsaturados 25,53 g/l
Ácidos grasos saturados 32,38 g/l
Proporción n-6 respecto n-3 1,75:1
Colesterol 9,49 mg/8 onzas fluidas o 40,1 mg/l
Carbohidratos
\bullet El contenido en carbohidratos es de 25,0 g por cada servicio de 8 onzas fluidas (105,5 g/l).
\bullet Las fuentes de carbohidratos son: 45% de maltodextrina (un carbohidrato completo) y 55% de sacarosa (un azúcar sencillo), ambos de los cuales se digieren y absorben fácilmente.
\bullet El elevado contenido en grasas y bajo en carbohidratos de Oxepa está diseñado para minimizar la producción de dióxido de carbono (CO_{2}). Los niveles elevados de CO_{2} pueden complicar la ablactación en pacientes dependientes del ventilador. Los niveles bajos de carbohidratos podrían ser útiles también para aquellos pacientes que han desarrollado hiperglicemia inducida por estrés.
\bullet Oxepa carece de lactosa.
Los carbohidrato dietéticos, los aminoácidos procedentes de proteínas, y el grupo glicerol de las grasas pueden convertirse en glucosa en el cuerpo. A través de este proceso, se satisfacen los requisitos de carbohidratos de los tejidos dependientes de glucosa (tales como el sistema nervioso central y los hematíes). Sin embargo, una dieta carente de carbohidratos puede conducir a cetosis, catabolismo excesivo de las proteínas de los tejidos, y pérdida de fluido y electrólitos. Estos efectos pueden prevenirse mediante la ingestión diaria de 50 a 100 g de carbohidratos digeribles, si la ingesta de calorías es la adecuada. En nivel de carbohidratos en Oxepa es también suficiente para minimizar la gluconeogénesis, si se satisfacen las necesidades energéticas.
Proteínas
\bullet Oxepa contiene 14,8 g de proteína por cada servicio de 8 onzas fluidas (62,5 g/l).
\bullet La proporción de calorías totales:nitrógeno (150:1) satisface las necesidades de los pacientes estresados.
\bullet Oxepa proporciona proteína suficiente para promover el anabolismo y el mantenimiento de una masa de cuerpo magro sin precipitar los problemas respiratorios. Las ingestas elevadas de proteínas son una preocupación en pacientes con insuficiencia respiratoria. Aunque la proteína tiene poco efecto en la producción de CO_{2}, una dieta elevada en proteínas incrementara el estímulo ventilatorio.
\bullet Las fuentes de proteínas en Oxepa son: 86,8% de caseinato sódico y 13,2% de caseinato cálcico.
Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta solicitud son indicativas del nivel de capacitación de aquellos especialistas en la técnica a los que corresponde esta invención.
Ahora que se ha descrito completamente la invención, será evidente para alguien con la formación ordinaria en la técnica que pueden hacérsele muchos cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu o ámbito de las reivindicaciones anexas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: KNUTZON, DEBORAH
\vskip0.800000\baselineskip
MURKERJI, PRADIP
\vskip0.800000\baselineskip
HUANG, YUNG-SHENG
\vskip0.800000\baselineskip
THURMOND, JENNIFER
\vskip0.800000\baselineskip
CHAUDHARY, SUNITA
\vskip0.800000\baselineskip
LEONARD, AMANDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA LA SÍNTESIS DE ÁCIDOS GRASOS POLIINSATURADOS DE CADENA LARGA.
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 34
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: LIMBACH & LIMBACH LLP
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
DIRECCIÓN: 2001 FERRY BUILDING
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: SAN FRANCISCO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: CALIFORNIA
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAIS: ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
(ZIP): 94111
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: Compatible con PC de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: Patent In Release #1.0,
\vskip0.500000\baselineskip
Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: MICHAEL R. WARD
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 38.651
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA: CGAB-110
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (415) 433-4150
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (415) 433-8716
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TÉLEX: N/D
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1483 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 446 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
5
6 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 186 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 457 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
9
10 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 446 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
11
100
101 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 359 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
12
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 365 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
14
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN:/desc= "Oligonucleótido sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 21
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /número= 1/nota= "N=inosina o citosina"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 27
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /número= 2/nota= "N=inosina o citosina"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CUACUACUAC UACAYCAYAC NTAYACNAAY AT 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN:/desc= "Oligonucleótido sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /número= 1/nota= "N=inosina o citosina"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 19
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /número= 2/nota= "N=inosina o citosina"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAUCAUCAUC AUNGGRAANA RRTGRTG 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAAGCTTCT GCAGGAGCTC TTTTTTTTTT TTTTT 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Xaa His His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Xaa Xaa His His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 13
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 746 ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 227 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 494 ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 87 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 520 ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 153 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 18:
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 429 ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 125 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 20:
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1219 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig 2692004 editado)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Secuencia pasa a página siguiente)
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 655 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig 2153526 editado)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 22:
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 304 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig 3506132 editado)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 918 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig 3854933 editado)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 24:
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1686 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig 2511785 editado)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Secuencia pasa a página siguiente)
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1843 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig 2535)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2257 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig 253538a editado)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
31
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 411 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido (traducción del Contig 2692004)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
33
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 218 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido (traducción del Contig 2153526)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 29:
35
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 71 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido (traducción del Contig 3506132)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
37 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 306 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido (traducción del Contig 3854933)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 31:
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 566 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido (traducción del Contig 2511785)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 32:
39
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 619 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido (traducción del Contig 2535)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
41
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 757 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido (traducción del Contig 253538a)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 34:
43
44

Claims (23)

1. Polipéptido purificado o aislado que tiene actividad \Delta5-desaturasa, polipéptido que es capaz de desaturar una molécula de ácido graso en el carbono 5 a partir del extremo carboxilo de dicho ácido graso, teniendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60% de homología con la secuencia de 446 aminoácidos de la SEC. Nº ID. 2.
2. Polipéptido acorde con la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de homología con la secuencia de 446 aminoácidos de la SEC. Nº ID. 2.
3. Polipéptido acorde con la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de homología con la secuencia de 446 aminoácidos de la SEC. Nº ID. 2.
4. Polipéptido purificado o aislado que tiene actividad \Delta5-desaturasa, polipéptido que es una mutación por supresión de la secuencia de 446 aminoácidos de la SEC. Nº ID. 2, siendo capaz dicho polipéptido de desaturar una molécula de ácido graso en el carbono J del extremo carboxilo de dicho ácido graso.
5. Polipéptido acorde con la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, en donde dicho polipéptido incluye una motivo de aminoácidos seleccionado del grupo consistente en los residuos 30-38, 41-44, 171-175, 203-212, y 387-394 de la SEC. Nº ID. 2.
6. Polipéptido acorde con la reivindicación 5, en donde dicho polipéptido comprende los residuos 30-38, 41-44, 171-175, 203-212, y 387-394 de la SEC. Nº ID. 2.
7. Polipéptido acorde con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende la SEC. Nº ID. 2.
8. Ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Ácido nucleico aislado acorde con la reivindicación 8 que comprende la SEC. Nº ID. 1.
10. Construcción de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 8 ó 9 unido a un ácido nucleico heterólogo.
11. Construcción de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 10 unido operativamente a un promotor.
12. Célula huésped recombinante transformada con la construcción de ácido nucleico de la reivindicación 10 u 11.
13. Célula huésped acorde con la reivindicación 12, la cual es una célula huésped microbiana.
14. Célula huésped acorde con la reivindicación 13, la cual es una célula de levadura.
15. Célula huésped acorde con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, la cual está enriquecida en los ácidos grasos 20:3, 20:4 u \omega-3 20:4 en comparación con una célula no transformada con dicha construcción de ácido nucleico de la reivindicación 10 u 11.
16. Procedimiento para la producción del ácido graso ácido araquidónico, procedimiento que comprende:
cultivar la célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 en presencia de ácido dihomo-\gamma-linolénico, en condiciones en las que dicho ácido graso es convertido en ácido araquidónico mediante la expresión del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;
recuperar el ácido graso ácido araquidónico del cultivo.
17. Procedimiento para obtener un ácido graso poliinsaturado de cadena larga, procedimiento que comprende:
cultivar la célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 en presencia de ácido dihomo-\gamma-linolénico, en condiciones en las que se produce el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, lo que resulta en la biosíntesis de un ácido graso poliinsaturado de cadena larga; y
recuperar el ácido graso del cultivo.
18. Procedimiento acorde con la reivindicación 17, en donde dicho ácido graso se selecciona del grupo que consiste en ARA, DGLA o EPA.
19. Procedimiento acorde con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, el cual además comprende la formulación del ácido grasos en un producto seleccionado del grupo:
una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable;
una fórmula nutricional;
una fórmula para bebés;
un suplemento dietético;
un sustituto dietético;
un cosmético; y
un alimento para animales.
20. Procedimiento acorde con la reivindicación 19, en donde la fórmula nutricional, la fórmula para bebés, el suplemento dietético, o el sustituto dietético contienen al menos un macronutriente seleccionado del grupo que consiste en: aceite de coco, aceite de soja, aceite de colza, mono- y diglicéridos, glucosa, lactosa comestible, suero electrodializado, leche descremada electrodializada, suero de leche, proteína de soja, y otros hidrolizados de proteínas.
21. Procedimiento acorde con la reivindicación 20, en donde dicha fórmula nutricional, fórmula para bebés, suplemento dietético, o sustituto dietético contiene al menos una vitamina seleccionada del grupo que consiste en: vitaminas A, C, D, E y complejo B; y al menos un mineral seleccionado del grupo que consiste en: calcio, magnesio, zinc, manganeso, sodio, potasio, fósforo, cobre, cloro, yodo, selenio y hierro.
22. Utilización de una célula huésped microbiana de la reivindicación 13 ó 14 para la producción de un ácido graso.
23. Utilización acorde con la reivindicación 22 para la producción de un producto que comprende dicho ácido graso, seleccionándose dicho producto del grupo:
una composición farmacéutica que comprende dicho ácido graso y un portador farmacéuticamente aceptable;
una fórmula nutricional;
una fórmula para bebés;
un suplemento dietético;
un sustituto dietético;
un cosmético; y
un alimento para animales.
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