EP2271223A2 - Pflanzensamenöl - Google Patents

Pflanzensamenöl

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Publication number
EP2271223A2
EP2271223A2 EP09735092A EP09735092A EP2271223A2 EP 2271223 A2 EP2271223 A2 EP 2271223A2 EP 09735092 A EP09735092 A EP 09735092A EP 09735092 A EP09735092 A EP 09735092A EP 2271223 A2 EP2271223 A2 EP 2271223A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
acid
plant seed
seed oil
oil
plant
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP09735092A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Dietrich Rein
Toralf Senger
Jörg BAUER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF Plant Science GmbH
Original Assignee
BASF Plant Science GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF Plant Science GmbH filed Critical BASF Plant Science GmbH
Priority to EP09735092A priority Critical patent/EP2271223A2/de
Publication of EP2271223A2 publication Critical patent/EP2271223A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/158—Fatty acids; Fats; Products containing oils or fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
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    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the invention relates to a plant seed oil comprising arachidonic acid at a level of from about 7 to about 26% by weight of the total fatty acid content, wherein the ratio of the weight percent of arachidonic acid to gamma-linolenic acid is about 1: 1 to about 5: 1 and the ratio of the weight percent of arachidonic acid to dihomo-gamma-linolenic acid is about 1: 1 to about 5: 1.
  • the invention further relates to processes for the preparation of this plant seed oil and to formulations and uses of the plant seed oil. In particular, the invention also provides food and baby food containing the listed plant seed oil.
  • Arachidonic acid is a long-chain, polyunsaturated fatty acid of the omega-6 (n-6) class (C20: 4 5,8,11, 14-eicosatetraenoic acid).
  • polyunsaturated fatty acids are referred to as PUFA, PUFAs, LCPUFA or LCPUFAs (poly unsaturated fatty acids, PUFA, polyunsaturated fatty acids, LCPUFA, long-chain polyunsaturated fatty acids).
  • ARA is the most abundant C20 PUFA in human blood plasma (Siguel and Schaefer (1988) Aging and nutritional requirements of essential fatty acids.) In: Dietary Fat Requirments in Health and Development (Beare-Rogers, ed.) Pp 163-189 , American Oil Chemist's Society, Champaign, IL.). It is mainly present in the organ, muscle and blood tissues, where it fulfills an important function as a structural lipid, which is predominantly associated with phospholipids in the blood, liver, muscles and other important organ systems.
  • ARA In addition to its principal function as a structural lipid, ARA also serves as a direct precursor to a number of circulating eicosanoids such as prostaglandin E2 (PGE2), prostacyclin I2 (PGI2), thromboxane A2 (TxA2), and leukotrienes B4 (LTB4) and C4 (LTC4).
  • PGE2 prostaglandin E2
  • PPI2 prostacyclin I2
  • TxA2 thromboxane A2
  • LTC4 leukotrienes B4
  • C4 leukotrienes B4
  • the concentration of ARA in breast milk generally varies less than that of Docosahexaenoic acid (DHA, 0.1 to more than 1.0% of the total fatty acid content) (Diersen-Schade 2005 LipTech 17: 225; Innis 2007 ProcNutrSoc 66: 397; Brenna et al., 2007 AJCN 85: 1457), indicating a more precise physiological regulation to provide the ARA content necessary for infant feeding.
  • DHA Docosahexaenoic acid
  • the potential health benefits of ARA for pre-, peri-, and postnatal infants are the support of brain development and function, as well as improved eye development (Diersen-Schade et al., 2005 Lipid Technology 17: 225 ).
  • GRAS designates "Generally Recognized as Safe", ie safe for use in foodstuffs, the addition of ARA to the baby milk and thus the ARA market was partly due to Martek's influence and On the other hand, ARA has been increasingly recognized for the development of infants, with the exception of ARA, where DHA (docosahexaenoic acid) is an important fatty acid to be added to infant formula DHA is found in human breast milk It is believed that it affects the development of the brain, nervous tissue and the brain Eyes of the growing infant supported. It has been demonstrated that the addition of DHA at effective concentrations improves cognitive development of visual acuity in both the calculated and premature infants.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • breast milk also contains other highly unsaturated fatty acids, which are less well studied but also play a major role in infant development.
  • fatty acids are, for example, gamma-linolenic acid (GLA, 0.1-0.2% of the total content of fatty acids), dihomo-gamma-linolenic acid (DGLA, 0.2-0.4% of the total content of fatty acids), Stearidonic acid (SDA, up to 0.1% of the total fatty acid content) and eicosapentaenoic acid (EPA, 0.05-0.3% of the total fatty acid content) (Yuhas et al., 2006 Lipids 41: 851-8).
  • GLA gamma-linolenic acid
  • DGLA dihomo-gamma-linolenic acid
  • SDA Stearidonic acid
  • EPA 0.05-0.3% of the total fatty acid content
  • GLA GLA-associated dermatitis
  • atopic dermatitis a common inherited skin disorder
  • a common inherited skin disorder (Demmelmair H., FeIdI F., Horvath I. et al Status in premature infants, Lipids 2001; 36: 555-66, Kitz R., Rose MA., Schonborn H., Aiming S., Bohles HJ. Impact of early dietary gamma-linolenic acid supplementation on atopic eczema in infancy, Pediatric Allergy Immunol., 2006, 17: 112-7).
  • DGLA is a precursor in the synthesis of prostaglandin E1 (PGE1) and also of the series 3 prostaglandins (Das 2008, Lipids in Health and Disease 7: 9).
  • DGLA influences cytokine production in human peripheral blood mononuclear cells independently of cyclo-myogase activation (Dooper et al., 2003 Immunology 110: 348-57). This indicates a strengthening of the immune function by DGLA, which is also crucial for newborns.
  • an increase in the concentration of DGLA and ARA in neonatal nutrition reduces the risk of HIV viral transmission between mother and child (Villamor et al., 2007 Am J Clin Nutr 86: 682-689).
  • a plant seed oil comprising arachidonic acid at a level of from about 7 to about 26% by weight of the total fatty acid content, wherein the ratio of the weight percent of arachidonic acid to gamma-linolenic acid is about 1: 1 to about 5: 1 and the ratio of the weight percentages of Arachidonic acid to dihomo-gamma-linolenic acid is about 1: 1 to about 5: 1.
  • the plant seed oil according to the invention has surprising, new properties.
  • the cited seed oil of the invention has proportions between the fatty acids arachidonic acid (ARA) and gamma-linolenic acid (GLA) and arachidonic acid and dihomo-gamma-linolenic acids (DGLA)) as they are present in breast milk.
  • ARA arachidonic acid
  • GLA gamma-linolenic acid
  • DGLA dihomo-gamma-linolenic acids
  • FIG. 7 gives an overview of the fatty acid ratios in mother's milk.
  • the ratio of the weight percent of arachidonic acid to gamma-linolenic acid is about 1: 1 to about 5: 1 and the ratio of the weight percent of arachidonic acid to dihomo-gamma-linolenic acid is about 1: 1 to about 5: 1.
  • the ratios herein refer to the weight percentages of the respective fatty acids.
  • the plant seed oil according to the invention in addition to a high content of arachidonic acid with its physiologically positive effect, also provides a favorable ratio of arachidonic acid to GLA and arachidonic acid to DGLA.
  • GLA and DGLA are important components of the fat fraction of breast milk in addition to arachidonic acid (Wang et al., Pediatrics International 2000, 42 (1): 14-20, Yuhas et al., 2006 Lipids 41: 851-8).
  • Recent research has also shown that infant n-6 fatty acids compete with each other in physiological integration into human tissue lipids (Geppert et al., 2008, Br. J. Nutrition 99: 360-9). Therefore, only a balanced ratio of fatty acids in baby food allows optimal growth and development of the infant.
  • Linolenic acid is distinguished.
  • Known delta-6 desaturases as used and described, for example, in WO2005 / 083093, use linoleic acid esterified at the sn-2 position with phospholipids, such as phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, or phosphatidylglycol, as a substrate.
  • phospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, or phosphatidylglycol
  • nucleic acid constructs according to the invention for the transformation of oilseed rape (Brassica napus) described below and the examples have now been prepared and transgenic rapeseed plants having this property were produced.
  • seed oils of these plants show low levels of GLA and DGLA ( Figure 3B and Table 3), from which the following synthetic sequence can be derived:
  • Delta 6-desaturase uses linolate CoA as a substrate.
  • the product gamma-linolate-CoA is directly converted from the ⁇ 6 elongase as a substrate into dihomo-gamma-linolenate-CoA.
  • the product of the elongation reaction is converted by acyltransferases into the sn2 position of phospholipids and converted by the delta-5-desaturase into arachidonic acid phosphatidylcholine, or other phospholipids described above.
  • Arachidonic acid is converted into triacylglycerides (ie oil) by acyltransferases and is thus a component of the seed oil.
  • the intermediates of the synthesis can be influenced in their concentration according to the promoter and gene activity.
  • the invention identifies, in the nucleic acid constructs of the invention described herein, promoter-gene combinations for the production of plant seed oils having a fatty acid composition similar to breast milk and therefore of advantage for the production of baby food. This was only possible with the nucleic acid constructs of SEQ ID NOs. 15, 16 and 17 specific promoter-gene combinations can be achieved.
  • the plant seed oil of the present invention may be used in various concentrations for infant formula or other nutritional products for infants. At the concentrations and formulations given herein, the invention
  • Vegetable seed oil has a fatty acid profile closer to that of breast milk than any of the previously used products.
  • the plant seed oil according to the invention allows a direct integration of the highly unsaturated fatty acids in the lipid content of the baby food in order to match the replacement food as well as possible to the breast milk. Due to its favorable proportion of ARA, GLA and DGLA, the inventive
  • Plant Seed Oil especially for the nutrition of premature babies and babies up to the age of about 2 years to ensure a healthy development, especially of nervous system and eyes as well as the immune system, premature baby or baby.
  • a limited number of vegetable and non-vegetable oils such as microbial oils or fish oils
  • an even better approximation of the replacement diet to the fatty acid pattern of the breast milk can be achieved.
  • the plant seed oil according to the invention also has a background fatty acid profile which is similar to rapeseed or canola oil used inter alia for infant formula.
  • the plant seed oil according to the invention is more suitable as an ARA source than the currently most widely used ARA source ARASCO®.
  • ARASCO® contains human alimentary milk largely foreign fatty acids such as C22: 0, C24: 0 and C22: 5n-6 in concentrations up to 3% (Australia New Zealand Food Authority 2002, Proposal P93 - Review Of Infant Formula, Supplementary Final Assessment (Inquiry - p.24), Report, 08/02).
  • the plant seed oil according to the invention is significantly below ARASCO® in these fatty acids and also has large amounts of C18: 1 n-9, which is the most common fatty acid in breast milk (Innis & King, Am J Clin Nutr 1999, 70: 383-90).
  • the plant seed oil according to the invention is distinguished by the fact that arachidonic acid and gamma-linolenic acid as well as arachidonic acid and dihomoenzyme
  • arachidonic acid and gamma-linolenic acid are in a more balanced ratio, which is closest to that of breast milk.
  • Table 4 in the following examples gives an exemplary overview of the stated proportions of fatty acids in the plant seed oil according to the invention in comparison to oils from various organisms which either naturally produce arachidonic acid or have been transferred into the genes for the metabolic pathway.
  • Brassica juncea the ratio between the fatty acids arachidonic acid (ARA) and gamma-linolenic acid (GLA) about 1: 1 and greater 1: 1 (ie more GLA than ARA), and between arachidonic acid and dihomo-gamma-linolenic acids (DGLA) about 1: 5 and less (ie still less DGLA than ARA than 1: 5).
  • ARA arachidonic acid
  • GLA gamma-linolenic acid
  • DGLA dihomo-gamma-linolenic acids
  • the ratio between the fatty acid arachidonic acid (ARA) and gamma-linolenic acid (GLA) is about 1: 4 to 1: 5 and between arachidonic acid and dihomo-gamma-linolenic acids (DGLA) about 1:10 and more ( ie even less DGLA than ARA than in the ratio 1:10).
  • the ratio between the fatty acid arachidonic acid (ARA) and gamma-linolenic acid (GLA) is about 0.1: 1 to 0.15: 1, and between arachidonic acid and dihomo gamma-linolenic acid (DGLA) is about 0, 18: 1 to 0.2: 1.
  • the content of arachidonic acid in the oil of glycine is 2-3%, since the previous methods could not provide commercially useful arachidonic acid levels.
  • the ratio between the fatty acid arachidonic acid (ARA) and gamma-linolenic acid (GLA) is more than 10: 1, and between arachidonic acid and dihomo-gamma-linolenic acid (DGLA) more than 10: 1 ,
  • the ratio between arachidonic acid (ARA) and gamma-linolenic acid (GLA) is about 2: 1 to about 4: 1 and between arachidonic acid and dihomo gamma-linolenic acids (DGLA) about 1: 1 to about 2: 1 ( Yuhas et al., 2006 Lipids 41: 851-8).
  • ARA arachidonic acid
  • GLA gamma-linolenic acid
  • DGLA dihomo gamma-linolenic acids
  • the ratio of the weight percent of arachidonic acid to gamma-linolenic acid is about 1: 1 to about 5: 1 and the ratio of the weight percent of arachidonic acid to dihomo-gamma-linolenic acid is about 1: 1 to about 5: 1 and thus for the first time in the areas that are also present in breast milk.
  • the invention relates to a plant seed oil comprising arachidonic acid at a level of from about 7 to about 26 or 7 to 26% by weight of the total fatty acid content, wherein the ratio of the weight percent of arachidonic acid to gamma-linolenic acid is about 1: 1 to about 5: 1 or 1: 1 to 5: 1 and the ratio of the weight percent of arachidonic acid to dihomo-gamma-linolenic acid is about 1: 1 to about 5: 1 or 1: 1 to 5: 1.
  • the arachidonic acid content in the plant seed oil according to the invention is between about 7 and about 26 percent by weight or between 7 and 26 percent by weight, preferably between about 10 and about 26 percent by weight or between 10 and 26 percent by weight, more preferably between about 12 and about 26 percent by weight or between 12 and 26 percent by weight, or between about 15 and about 26 percent by weight or between 15 and 26 percent by weight of the total fatty acid content.
  • the arachidonic acid content in the plant seed oil according to the invention is 15% by weight of the total fatty acid content.
  • the composition of such an oil is described below and in the examples.
  • the ratio of the weight percents of linoleic acid to alpha-linolenic acid is about 3: 1 to about 12: 1 or 3: 1 to 12: 1, preferably about 4: 1 to about 12: 1 or 4: 1 to 12: 1, more preferably about 5: 1 to about 12: 1 or 5: 1 to 12: 1 or about 6: 1 to about 12: 1 or 6: 1 to 12: 1.
  • the plant seed oil according to the invention like the mother's milk, contains the essential ones
  • the plant seed oil according to the invention supplements the oils mainly used in infant formula products, such as soybean oil or sunflower oil.
  • infant formula products are the linoleic acid to alpha-linolenic acid ratios present in breast milk very close.
  • the ratio is about 7: 1 to 18: 1 (Yuhas et al., 2006 Lipids 41: 851-8).
  • the ratio of the weight percent of arachidonic acid to eicosapentaenoic acid is about 3: 1 to about 7: 1 or 3: 1 to 7: 1, preferably about 4: 1 to about 7: 1 or 4: 1 to 7: 1, and more preferably about 5: 1 to about 7: 1 or 5: 1 to 7: 1, and here also reflects the maternal milk ARA: EPA ratio of about 2: 1 to about 7: 1 again (Yuhas et al., 2006 Lipids 41: 851-8).
  • the plant seed oil of the invention also comprises the
  • stearidonic acid is present at a level of from about 0.1 to about 1 or 0.1 to 1 weight percent of the total fatty acid content (especially when used in infant formula), preferably from about 0.3 to about 1 or 0.3 to 1 weight percent, or from about 0.4 to about 1 or 0.4 to 1 weight percent, more preferably from about 0.5 to about 1 or 0.5 to 1 weight percent.
  • ARA and EPA are precursors of biologically active eicosanoids (Das 2008 Lipids Health Dis. 7: 9). This is of particular importance for Premature babies and newborns whose metabolism is not yet sufficiently mature.
  • ARA and DHA are important components of specific membrane phospholipids and are of great importance for the development of the nervous system, the retina and visual functions. SDA, ARA, EPA and DHA are present in breast milk and are therefore essential components of preterm infants and infant formulas (Yuhas et al., 2006 Lipids 41: 851-8).
  • the plant seed oil according to the invention not only for the first time has a high content of ARA and a more balanced ratio of ARA to GLA and DGLA than all the oils heretofore described in the prior art. It contains the essential fatty acids linoleic acid and alpha-linolenic acid as well as the highly unsaturated fatty acids SDA and EPA, which are also found in breast milk. For example, DHA can be added by mixing with other oils, as described in more detail below. The background fatty acid profile of the oil of the invention thus comes very close to the fatty acid composition of breast milk.
  • the plant seed oil is obtained from a transgenic plant.
  • transgenic is to be understood as meaning that a heterologous polynucleotide, ie a polynucleotide which does not naturally occur in the particular plant, is introduced into the plant, which can be achieved either by random insertion of the polynucleotide or by homologous recombination Methods for introducing polynucleotides or vectors for random insertion or homologous recombination are known in the art and are also described in more detail below Host cells containing the polynucleotide or the vector can also be introduced into a plant However, such a plant is a chimeric plant in which only the cells derived from the introduced cells are transgenic, ie comprising the heterologous polynucleotide e plant a nucleic acid construct according to the invention as in SEQ ID NOs. 15, 16 or 17 shown.
  • the transgenic plants are oil-producing plants, that is, those used for the production of oils.
  • all plants can be used as transgenic plants, i. both dicotyledonous and monocotyledonous plants.
  • they are oilseed crops containing high levels of lipid compounds, such as rapeseed, canola, safflower (safflower, Carthamus tinctoria), flax, or field crops such as corn.
  • the plant seed oil according to the invention is prepared in trangenic oilseed rape, transgenic soybean, transgenic flax, transgenic safflower or transgenic maize, which are reacted with a nucleic acid construct as shown in SEQ ID NOs. 15, 16 or 17 are shown.
  • the transgenic plant of transgenic oilseed rape is very particularly preferred.
  • Table 1 in the following examples shows the preferred genes used to synthesize ARA with the preferred fatty acid composition.
  • the invention also relates to the nucleic acid constructs as in SEQ ID NOs. 15, 16 and 17, and transgenic plants transformed with these nucleic acid constructs and their progeny, which have stably integrated the nucleic acid construct into the genome.
  • the nucleic acid constructs according to the invention contain, in addition to the above-mentioned genes, suitable promoter-gene terminator cassettes, preferably the DNA encoding the delta 5 elongase from Ostreococcus tauri as shown in SEQ ID NO. 18 and or the delta 4-desaturase-encoding DNA from Traustochytrium ssp. as shown in SEQ ID NO. 20 shown.
  • suitable promoter-gene terminator cassettes preferably the DNA encoding the delta 5 elongase from Ostreococcus tauri as shown in SEQ ID NO. 18 and or the delta 4-desaturase-encoding DNA from Traustochytrium ssp. as shown in SEQ ID NO. 20 shown.
  • the mentioned DNAs and suitable cassettes are e.g. in WO2005 / 083093.
  • the invention also relates to a plant seed oil comprising a fatty acid spectrum comprising palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, gamma-linolenic acid, alpha-linolenic acid, stearidonic acid, dihomo-gamma-linolenic acid, arachidonic acid and eicosapentaenoic acid.
  • a fatty acid spectrum is shown in, for example, FIG. 3B.
  • the plant seed oil of the invention comprises about 3.2-5.3% palmitic acid, about 2.2-5.3% stearic acid, about 10-25% oleic acid, about 22-36% linoleic acid, about 4-12% gamma Linolenic acid, about 3-8% alpha-linolenic acid, about 0.2-1% stearidonic acid, about 3-9% dihomo-gamma-linolenic acid, about 12-25% arachidonic acid and about 1-4% eicosapentaenoic acid based on total fatty acid content; or the plant seed oil of the invention comprises 3.2-5.3% palmitic acid, 2.2-5.3% stearic acid, 10-25% oleic acid, 22-36% linoleic acid, 4-12% gamma-linolenic acid, 3-8% Alpha-linolenic acid, 0.2-1% stearidonic acid, 3-9% dihomo-gamma-linolenic acid, 12-25% ar
  • the plant seed oil according to the invention particularly preferably comprises the fatty acids which are important for infant nutrition in the following percentages by weight (mass of the fatty acids in percent of the total fatty acid content)
  • Linoleic acid (18: 2 n-6) ca. 20-25 alpha-linolenic acid (18: 3 n-3) ca. 3-7 Additional fatty acids valuable for the infant:
  • GLA Gamma-linolenic acid
  • DGLA Dihomo-gamma-linolenic acid
  • SDA Stearidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • Linoleic acid (18: 2 n-6) 20-25
  • GLA Gamma-linolenic acid
  • DGLA Dihomo-gamma-linolenic acid
  • SDA Stearidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • the invention further relates to a formulation or a mixed oil comprising a plant seed oil according to the invention and at least one further oil selected from the group vegetable oil, microbial oil and fish oil, wherein the vegetable oil, microbial oil or fish oil contains docosahexaenoic acid.
  • the plant seed oil according to the invention may be mixed with one or more oils, for example to alter the content of one or more fatty acids, ie to increase or decrease them.
  • the admixed oil may be, for example, another naturally occurring or transgenic vegetable or plantseed oil.
  • linseed oil can be mentioned, which has a high content of alpha linolenic acid.
  • It may also be a microbial oil, for example an oil from Mortierella alpina or from Crypthecodinium cohnii. Particularly suitable here are DHASCO® (DHA, Crypthecodinium cohnii) and ARASCO® (ARA, Mortierella alpina) oil mixtures, which are used, for example, in infant formulas.
  • DHASCO® DHA, Crypthecodinium cohnii
  • fish oils are also suitable for formulating the plant seed oil of the invention, for example salmon oil, herring oil, mackerel oil, tuna oil or cod oil (EPA and DHA Content of Fish Species, "Nutrition and Your Health: Dietary Guidelines for Americans") , Data From NDB SR 16-1, see also, for example, GRAS Notifications 94, 109 and 193), in order to change the composition of the fatty acids in the plant seed oil according to the invention, etc.
  • DHASCO® DHA, Crypthecodinium cohnii
  • Fish oils are characterized, inter alia, by a high content of long-chain, polyunsaturated omega
  • the plant seed oil of the invention may be mixed with only one other oil, but also with two, three or even more oils.
  • the one oil or the other admixed oils can originate from the same organism or from different orgsanisms.
  • the plant seed oil according to the invention may be mixed with a microbial oil, for example an oil from Mortierella alpina or from Crypthecodinium cohnii or Schizochytrium sp. (Arterburn et al 2007_Lipids 42-101 1-24), and / or a fish oil (such as salmon oil or tuna oil).
  • Formulations of plant seed oils are described in the prior art.
  • the plant seed oil according to the invention can also be processed in a baby formula with the BASF powder product number 30056967, "Dry n-3® 5:25 C Powder Microencapsulated fish oil in DHA for Infant formula.”
  • DHASCO® docosahexaenoie aeid-rich single-cell oil
  • the plant seed oil according to the invention can first be converted into a microencapsulated powder or applied directly as processed and stabilized plant seed oil.
  • Both of these powders or oils may then be mixed or added individually to desired amounts to the infant formula The addition occurs towards the end of production of the infant formula with protective measures against oxidation
  • Preferred concentrations to which the products of infant formula are added depend on various
  • a preferred amount of addition of the plant seed oil according to the invention to the final product is that amount of the oil which gives a concentration of up to 1 g ARA / 100 g of total fat in the baby food product.
  • a preferred amount of addition of BASF Product Number 30056967 or DHASCO® Oil to the final product is that amount of the powder or oil which results in a concentration of up to 1 g DHA / 100 g of total fat in the infant formula.
  • the preferred levels of the plant seed oil of the present invention and BASF Product Number 30056967 or DHASCO Oil may depend, inter alia, on the national legislation of the individual countries in which the infant formula is distributed, manufacturer product requirements, and customer preferences.
  • the invention also provides foodstuffs comprising a plant seed oil according to the invention.
  • the plant seed oil according to the invention can be used, for example, directly as cold-pressed oil, for example as salad oil. It can also be used, for example, in milk or dairy products such as cheese or yoghurt. It can also be added to margarine, or bread or baked goods. Finally, it is generally suitable as a dietary supplement (supplement). These are products for the increased supply of human metabolism with certain nutrients or active substances in the border area between drugs and food to understand. Legally, this product group of dietary supplements is regulated by EU Directive 2002/46 / EC. In particular, the permissible minerals and vitamins are given.
  • a dietary supplement a food that is destined to the general diet a concentrate of nutrients or other substances having a nutritional or physiological action, alone or in combination, and in dosed form, in particular in the form of capsules, lozenges, tablets, pills, effervescent tablets and other similar pharmaceutical forms, powder sachets, liquid ampoules, bottles with dropping inserts and similar forms of administration of liquids and powders for absorption in measured small quantities on the market.
  • LFGB regulations of the food and feed code
  • the permitted ingredients are in appendix 1 of the Food Supplementary Regulation (NemV) listed.
  • the plant seed oil according to the invention can be used here alone or in combination with an oil or other oils such as, for example, microbial oil, for example from Mortierella alpina or Crypthecodinium cohnii or fish oil for supplementation.
  • oils such as, for example, microbial oil, for example from Mortierella alpina or Crypthecodinium cohnii or fish oil for supplementation.
  • Tocopherols e.g. Vitamin E and tocotrienols and ascorbyl palmitate or plant extracts such as rosemary and plant sterols, or carotenoids such as lutein, zeaxanthin, astaxanthin and lycopene, or coenzymes such as Koenyzm Q may be added.
  • Suitable administration forms are capsules, lozenges, tablets, pills, effervescent tablets and other similar dosage forms, powder pouches, liquid ampoules, bottles with drip inserts and similar dosage forms of liquids and powders for receiving the plant seed oil according to the invention in measured small amounts.
  • the dosage of the fatty acids for nutritional supplementation is well described in the prior art.
  • the invention preferably relates to baby food which comprises the plant seed oil according to the invention.
  • baby food will be used in the first months of life after the birth of the exclusive diet.
  • baby food as used herein includes, for example, premature baby food, infant formula, baby food, or infant formula.
  • Premature baby food means food for newborns born before the calculated date of birth four to six months after birth (that is, from birth to the age of four to six months) and are in line with the nutritional requirements of this group of persons
  • Infants are meant to infants up to about twelve months (birth to the age of 12 months).
  • Infant food refers to food administered to infants through the age of about twenty-four months (birth to 24 months).
  • the LC-PUFA levels for such applications in the diet of babies or toddlers at the age of about 4-6 months to 24 months are in the same range as for
  • the composition of an exemplary infant formula containing the plant seed oil of the present invention is shown in the following examples.
  • the plant seed oils according to the invention can for example, in the mother's milk substitute, in the follow-on milk (for example, after the baby has been weaned from the mother's breast), or as complementary foods, such as baby pulp, baby food, reconstituted dry food, milk and milk substitute drinks, juice and other warm or cold drinks and diet foods ,
  • the plant seed oils of the invention also find applications in the diet of pregnant mothers and nursing mothers, since the LC-PUFAs can enter the breast milk.
  • they can also be used for extra nutritional supplements for children up to 24 months, but also for older children and adults.
  • Nutritional supplements may be administered in any form, for example in the form of milk, juice, porridge, syrup, candy, fermented product, pills, capsules, or dragees.
  • Baby food or baby food as used herein is to be understood as a generic term for all foods that are particularly suitable for feeding infants or toddlers up to 24 months. This includes mother's milk. Industrial baby food is usually made without salt, spices, sugar and usually without coloring and preservatives. In this case, a distinction is made under food law between infant formulas, follow-on formulas and complementary foods (Lebensstoff-Lexikon Dr. Oetker, 4th ed. 2004, Infant Formula).
  • infant formulas are all foods and products intended specifically for use in the first six months of life, containing all the nutrients the infant needs. In some cases, water is added to prepare the finished products.
  • Beikost are all foods and preparations that serve as a supplement to the formula for babies to prepare for the conversion to solid food.
  • the plant seed oil according to the invention is suitable in addition to the above Applications also as complete food.
  • Complete food means a food that covers the complete nutritional needs of an animal or human individual (eg a baby), so that a healthy growth is optimally guaranteed.
  • a complete food to which the plant seed oil of the present invention is added contains arachidonic acid (ARA) in similar concentrations as the mother's milk.
  • the complete diet also contains gamma-linolenic acid (GLA), dihomo-gamma-linolenic acid (DGLA), stearidonic acid (SDA) and eicosapentaenoic acid (EPA), as well as optionally DHA, in similar concentrations as breast milk. It is therefore particularly well suited for the production of baby food.
  • the above-mentioned complete food may be, for example, infant milk, follow-on, toddler, fruit juice, porridge, milk, yogurt or fermented products. It is designed to feed infants and children to support their normal growth and development.
  • the complete product can also be solid baby food, sweets, biscuits or gelatine products.
  • the ARA content in the baby food as shown in the examples was the
  • Baby foods are associated with dietary foods in Europe (see, for example, "Directive 91/321 / EC"). The quality requirements for infant and baby food are therefore very high and strictly regulated worldwide. Europe is guided by the EC Directive 91/321 / EC and the Codex Alimentarius Alinorm 03 / 26a, which have since been transposed into national law within the EC.
  • GMOs genetically modified organisms
  • PCB protein-based proliferative-proliferative-proliferative-proliferative-proliferative-proliferative-proliferative-proliferative-proliferative-proliferative-proliferative-proliferative-proliferative-proliferative-proliferative-proliferative-proliferative-proliferative-proliferative-proliferative .
  • EC genetically modified organisms
  • No 2377/90 / EC concerns the fixing of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin (30.12.2000).
  • the pollutant VO concerns, for example, the maximum permissible dioxin and PCB content.
  • Baby foods can be produced, for example, in powder form. For this they are spray-dried, instantized and agglomerated, for example. The packaging takes place in tinplate cans (gassed with nitrogen / carbon dioxide) or aluminum laminated foil bags (gassed, not fumigated). Baby foods can also be made in liquid and emulsified form. For this purpose, they are, for example terminal sterilized bottled in glass bottles or cans. Also practiced may be aseptic filling in glass (Brikpak) or a filling of the terminally sterilized concentrate in cans.
  • raw materials for the production of baby food for example, the following components can be used:
  • Cow's milk, goat's milk e.g., China, Australia
  • casein / caseinate demineralized.
  • Whey powder amino acids, taurine, carnitine;
  • Vegetable oils palm oil, soybean oil, sunflower oil, high oleic sunflower oil, thistle oil, coconut oil, rapeseed oil
  • milk fat fish oils
  • baby food is produced by spray drying of fat-containing semi-finished products and remixing carbohydrates, vitamins and micronutrients.
  • the production of baby food can also be done by incorporating LC-PUFAs in the fat phase and spraying with the protein and carbohydrate components to a semi-finished product.
  • Figure 5 exemplifies the preparation of infant formula in liquid form
  • Figure 6 gives an example of the preparation of infant formula by complete spray.
  • Stabilization of the LC PUFAs in the plant seed oil according to the invention can be achieved here, for example, by the addition of tocopherols and tocotrenols.
  • the addition of tocopherols, ascorbylpamitate and sodium ascorbate leads to the protection of LC PUFAs and to improve shelf life by increasing product stability and improving fatigue life Rancidity risk is reduced.
  • additives for stabilizing the LC-PUFAs may be plant extracts such as rosemary and plant sterols, or carotenoids such as lutein, zeaxanthin, astaxanthin and lycopene, or coenzymes such as various forms of Koenyzm Q.
  • plant extracts such as rosemary and plant sterols
  • carotenoids such as lutein, zeaxanthin, astaxanthin and lycopene
  • coenzymes such as various forms of Koenyzm Q.
  • the following technologies are suitable.
  • simple dry mixing systems e.g., Lödigemischer
  • semi-finished products e.g., packed in fumigated containers
  • incorporation into fat blends occurs along with emulsifiers and antioxidants. It then follows the preparation of an emulsion with the water phase and drying to a semi-finished product (spray drying). The semi-finished product is then mixed with the remaining formulation components dry to the final product.
  • the preparation of a special fat mixture is carried out together with LC-PUFAs and the further processing as described above for the oil form.
  • LC-PUFAs in powder form in the production of baby food is supported by its ease of use and safe dosage.
  • a disadvantage is that the content of LC-PUFAs is only about 25% and the proportion of microencapsulating substances is about 75%. Work is currently underway on larger oil loadings and loads of well over 50% oil appear commercially feasible.
  • 4% powder 3 g vehicle / 100 g is necessary.
  • the proportion of carriers is significant and must be taken into account in the formulation (especially in premature baby foods).
  • carriers there may be used, for example, gelatin, sucrose, starch, caseinate, lecithin, tricalcium phosphate, vitamin C, vitamin E, or sodium ascorbate.
  • FIG. 6 shows the processing of the plant seed oil according to the invention by an example of the complete spray, which leads to a dry end product
  • FIG. 5 shows an example of the production of a liquid baby food product.
  • the invention additionally relates to a process for producing a plant seed oil according to the invention, comprising the steps: a) Production of a transgenic plant by transformation with the nucleic acid construct as in SEQ ID NOs. 15, 16 or 17 b) cultivation of the transgenic plant from step a) under conditions that allow the biosynthesis of the plant seed oil c) harvesting the plant seeds, extraction and refining of the plant seed oil.
  • the seeds obtained are processed to obtain the plant seed oil of the invention. Processing begins with squeezing the seeds, followed by extraction and subsequent refining of the oil and stabilization. Preferably, the seeds are cold pressed and then filtered vacuum. This process preferably takes place under an inert atmosphere, preferably under nitrogen. About half of the plant seed oil of the invention is obtained by this process.
  • the extraction of the plant seed oil in step c) comprises a hexane extraction.
  • hexane continuous processes (Belitz & Grosch, 1999 "Edible Fats and Oils” In: Food Chemistry, 2nd ed., Springer Verlag) for subsequent removal of the hexane below the prescribed levels Miscible distillation is suitable for food products, then the extracted oil is mixed with the pressed oil under an inert atmosphere and the crude oil is now ready for further processing by refining Hexane extraction is suitable for edible oils, as an additive in margarine, but also for production
  • a disadvantage of hexane extraction is that the extracted oil may contain hexane residues, so that such extracted oil is not equally suitable for all applications, for example in baby food.
  • the extraction of the plant seed oil in step c) therefore comprises a supercritical CO2 extraction.
  • One thus extracted oil advantageously contains no solvent residues, such as a hexane-extracted oil.
  • the extraction of the plant seed oil in step c) of the method according to the invention comprises the following steps: (i) crushing the plant seeds by milling or pressing preferably under an inert atmosphere to a particle size of less than 0.2 mm; and
  • Supercritical carbon dioxide (CO2) extraction is based on the use of carbon dioxide in the subcritical or supercritical state as the extractant, with the extractant being recycled (Barthet and Daun 2002, JAOCS 79: 245-51).
  • the milled seed of the plants described herein becomes direct or by squeezing the vegetable oil of the present invention to partially remove the oily ones
  • the seeds are first comminuted to a defined size and then almost completely extracted.
  • the seed was comminuted by milling or pressing to a particle size of less than 0.2 mm.
  • Particularly advantageous here is the use of a roller press with gap size 0.15 mm.
  • the preferred pressure is at least 300 bar, more preferably 350 bar.
  • the temperature may be maintained between 40 and 60 ° C, preferably with a temperature as low as possible of 40 to 50 ° C, or more preferably 40 to 45 ° C, to reduce oxidative processes in the oil.
  • An optimal yield is achieved in an extraction run of 60 kg of CO2 per hour after 120 min.
  • the optimum CO2 mass flow rate is particularly preferably 80 to 100 times the mass of the substrate in order to achieve a 90% yield of the maximum achievable yield. Shorter extraction times result in less complete extraction.
  • the moisture remaining in the air-dried seed passes into the extraction oil and advantageously increases the total oil yield in the CO2 extraction compared to freeze-dried substrate. Therefore, air drying of the substrate is preferred.
  • a largely constant oil is obtained with regard to its fatty acid composition and its oxidation parameters (acid number, iodine number).
  • the extraction efficiency of the supercritical CO2 extraction at the optimized conditions given here was comparable to the extraction efficiency of a conventional Soxhlet extraction using hexane.
  • the pilot-scale supercritical carbon dioxide (CO2) extraction can be scaled up to the required industrial scale without significant changes For example, 800 tons of oil per year can be increased.
  • the supercritical CO2 extraction by the method described herein is particularly suitable for extraction of the plant seed oil according to the invention, since, in contrast to hexane extraction, it contains no residues of the solvent hexane.
  • extracted plant seed oil according to the invention finds particularly advantageous application in baby food.
  • the oil is recovered via supercritical CO2 extraction according to the procedure given in the examples.
  • FIG. 4 shows by way of example a pilot plant sketch for supercritical CO2 extraction for the plant seed oils according to the invention.
  • the refining of the plant seed oil in step c) comprises an alkali refining technology adapted to the plant seed oil according to the invention, which is used in large plants and will be described in more detail below.
  • Refining is not essential for the oil extracted from supercritical CO2 extraction.
  • SFE Supercritical CO2 Extraction direct use of the oil obtained via SFE Supercritical CO2 Extraction is possible, i. no subsequent refining is necessary for this.
  • These products include milk, juice, porridge, syrup, candy and fermented product for the toddler.
  • a subsequent refining is carried out.
  • the refining of the raw vegetable oil (mixed oil from pressing and extraction oil) and the filling are done completely under vacuum or under nitrogen.
  • the crude oil is hydrated with 10% water (85 ° C, 45 min, 300 rpm).
  • the subsequent degumming with 1, 5% citric acid (20%) also takes place at 85 ° C (45 min, 300 rpm, 10% water).
  • the neutralization is followed by washing with 7% sodium hydroxide solution (90-95 ° C., 20 minutes, 250 rpm, 10% water) and drying at 90 ° C. (11 minutes, 350 rpm to 30 mbar).
  • the bleaching is done with 1% bleaching earth (Tonsil Optimum 214 FF, 90 ° C, 20 minutes, 350 rpm, up to 20 mbar). It is then filtered by means of an acetate filter under pressure and nitrogen. Deodorization is carried out at 220 ° C, 20 minutes, 1 - 2 mbar with deionized and degassed water.
  • 1% bleaching earth Teonsil Optimum 214 FF, 90 ° C, 20 minutes, 350 rpm, up to 20 mbar.
  • Deodorization is carried out at 220 ° C, 20 minutes, 1 - 2 mbar with deionized and degassed water.
  • a cold-pressed vegetable oil according to the invention can also be used directly for nutrition.
  • the extracted vegetable oil of the invention is now stabilized by the precisely metered addition of a variety of stabilizing additives which may include: tocopherols eg vitamin E and tocotrienols, ascorbyl palmitate, plant extracts such as rosemary and plant sterols, carotenoids such as lutein, zeaxanthin, astaxanthin and lycopene , Phospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine and phosphatidylglycol or coenzymes such as coenzyme Q.
  • tocopherols eg vitamin E and tocotrienols, ascorbyl palmitate
  • plant extracts such as rosemary and plant sterols
  • carotenoids such as lutein, zeaxanthin, astaxanthin and lycopene
  • Phospholipids such as phosphatidylcholine,
  • the oil is ready for use as described herein, such as in food products, dietary products, especially baby food and nutritional supplements.
  • Typical values for the biochemical quality parameters are: acid number 0.15; Peroxide value below the detection limit; Color AOCS 0.6 R and 22 Y.
  • the plant seed oil produced by the method according to the invention in a preferred embodiment comprises substances having a structure shown in the following general formula I.
  • R 1 hydroxyl, coenzyme A (thioester), lysophosphatidylcholine,
  • Lysophosphatidylethanolamine lysophosphatidylglycerol, lysodiphosphatidylglycerol, lysophosphatidylserine, lysophosphatidylinositol, sphingolase or a radical of formula II
  • R 2 hydrogen, lysophosphatidylcholine, lysophosphatidylethanolamine,
  • Lysophosphatidylglycerol lysodiphosphatidylglycerol, lysophosphatidylserine, lysophosphatidylinositol or saturated or unsaturated C 2 -C 24 -alkylcarbonyl,
  • R 3 hydrogen, saturated or unsaturated C 2 -C 24 -alkylcarbonyl, or R 2 and R 3 are, independently of one another, a radical of the formula Ia:
  • R 1 in the general formula I denotes hydroxyl, coenzyme A (thioester), lysophosphatidylcholine, lyso-phosphatidylethanolamine, lyso-phosphatidylglycerol, lyso Diphosphatidylglycerol, lyso-phosphatidylserine, lyso-phosphatidylinositol, sphingobase, or a radical of general formula II
  • R 2 in the general formula II denotes hydrogen, lyso-phosphatidylcholine, lysophosphatidylethanolamine, lyso-phosphatidylglycerol, lyso-diphosphatidylglycerol, lysophosphatidylserine, lyso-phosphatidylinositol or saturated or unsaturated C 2 -C 24 -alkylcarbonyl.
  • alkyl radicals are substituted or unsubstituted, saturated or unsaturated C2-C24 alkylcarbonyl chains such as ethylcarbonyl, n-propylcarbonyl, n-butylcarbonyl, n-pentylcarbonyl, n-hexylcarbonyl, n-heptylcarbonyl, n-octylcarbonyl , n-nonylcarbonyl, n-decylcarbonyl, n-undecylcarbonyl, n-dodecylcarbonyl, n-tridecylcarbonyl, n-tetradecylcarbonyl, n-pentadecylcarbonyl, n-hexadecylcarbonyl, n-heptadecylcarbonyl, n-octadecylcarbonyl, , n-nonadecylcarbonyl,
  • C 10 -C 22 -alkylcarbonyl radicals such as n-decylcarbonyl, n-undecylcarbonyl, n-dodecylcarbonyl, n-tridecylcarbonyl, n-tetradecylcarbonyl, n-pentadecylcarbonyl, n-hexadecylcarbonyl, n-heptadecylcarbonyl, n Octadecylcarbonyl, n-nonadecylcarbonyl, n-eicosylcarbonyl, n-docosanylcarbonyl or n-tetracosanylcarbonyl containing one or more double bond (s) are preferred.
  • saturated and / or unsaturated C 10 -C 22 -alkylcarbonyl radicals such as C 1 -C 4 -alkylcarbonyl, C 1 -C 4 -alkylcarbonyl, C 1 2 -alkylcarbonyl, C 13-
  • saturated or unsaturated C 16 -C 22 -alkylcarbonyl radicals such as C 16 -alkylcarbonyl, cis-alkylcarbonyl, C 20 -alkylcarbonyl or C 22 -alkylcarbonyl radicals, which contain one or more double bonds.
  • These advantageous radicals may contain two, three, four, five or six double bonds.
  • the particularly advantageous radicals having 20 or 22 carbon atoms in the fatty acid chain contain up to six double bonds, advantageously three, four, five or six double bonds, more preferably five or six double bonds. All these radicals are derived from the corresponding fatty acids.
  • R 3 in the general formula II denotes hydrogen, saturated or unsaturated C 2 -C 24 -alkylcarbonyl.
  • alkyl radicals are substituted or unsubstituted, saturated or unsaturated C2-C24 alkylcarbonyl chains such as ethylcarbonyl, n-propylcarbonyl, n-butylcarbonyl, n-pentylcarbonyl, n-hexylcarbonyl, n-heptylcarbonyl, n-octylcarbonyl, n-nonylcarbonyl, n-decylcarbonyl, n-undecylcarbonyl, n-dodecylcarbonyl, n-tridecylcarbonyl, n-tetradecylcarbonyl, n-pentadecylcarbonyl, n-hexadecylcarbonyl, n-heptadecylcarbonyl, n-octadecylcarbonyl, n-nonadecylcarbonyl, n-
  • C 10 -C 22 -alkylcarbonyl radicals such as n-decylcarbonyl, n-undecylcarbonyl, n-dodecylcarbonyl, n-tridecylcarbonyl, n-tetradecylcarbonyl, n-pentadecylcarbonyl, n-hexadecylcarbonyl, n-heptadecylcarbonyl, n Octadecylcarbonyl, n-nonadecylcarbonyl, n-eicosylcarbonyl, n-docosanylcarbonyl or n-tetracosanylcarbonyl containing one or more double bonds are preferred.
  • saturated and / or unsaturated C10-C22-alkylcarbonyl radicals such as Cio-alkylcarbonyl, Cn-alkylcarbonyl, Ci2-alkylcarbonyl, C13- alkylcarbonyl, Cu-alkylcarbonyl, C 16 -alkylcarbonyl, C 18 -alkylcarbonyl , C2o-alkylcarbonyl or C22-alkylcarbonyl radicals containing one or more double bonds.
  • saturated or unsaturated C 16 -C 22 -alkylcarbonyl radicals such as C 16 -alkylcarbonyl, C 18 -alkylcarbonyl, C 20 -alkylcarbonyl or C 22 -alkylcarbonyl radicals, which are one or more
  • These advantageous radicals may contain two, three, four, five or six double bonds.
  • the particularly advantageous radicals having 20 or 22 carbon atoms in the fatty acid chain contain up to six double bonds, advantageously three, four, five or six double bonds, more preferably five or six double bonds. All these radicals are derived from the corresponding fatty acids.
  • R 1 , R 2 and R 3 may be substituted by hydroxyl and / or epoxy groups and / or may contain triple bonds.
  • the plant seed oil produced in the following described method according to the invention contains polyunsaturated fatty acids having at least one, two, three, four, five or six double bonds.
  • the fatty acids contain four, five or six double bonds.
  • the fatty acids advantageously have 18, 20 or 22 C atoms in the fatty acid chain, preferably the fatty acids contain 20 or 22 carbon atoms in the fatty acid chain.
  • saturated fatty acids are used with those used in the process
  • Nucleic acid constructs little or no reaction. Little is to be understood that, compared to polyunsaturated fatty acids, the saturated fatty acids having less than 5% of the activity, advantageously less than 3%, more advantageously less than 2%, most preferably less than 1; 0.9; 0.8; 0.7; 0; 6; 0.5; 0.4; 0.3; 0.25 or 0.125% are implemented. These fatty acids prepared by the process according to the invention are present in the plant seed oil in a fatty acid mixture.
  • the substituents R 2 or R 3 I and Il are independently saturated or unsaturated C22-CI8 alkylcarbonyl, particularly advantageously, they are independently unsaturated C 18 in the general formulas -, C20 or C22 alkylcarbonyl with at least two double bonds .
  • the plant seed oil produced in the process contains polyunsaturated fatty acids, which are advantageously bound in membrane lipids and / or triacylglycerides, but they can also occur as free fatty acids or bound in the form of other fatty acid esters in the plants. They are advantageously in the form of mixtures of different fatty acids or mixtures of different glycerides.
  • the different fatty acids bound in the triacylglycerides can thereby be derived from short-chain fatty acids having 4 to 6 C atoms, medium-chain fatty acids having 8 to 12 C atoms or long-chain fatty acids having 14 to 24 C atoms, the long-chain fatty acids being particularly preferred are the long chain fatty acids LCPUFAs of C 18 -, C 20 and / or C22-fatty acids.
  • the plant seed oil produced preferably comprises a fatty acid spectrum containing palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, gamma-linolenic acid, alpha-linolenic acid, stearidonic acid, dihomo-gamma-linolenic acid, arachidonic acid and eicosapentaenoic acid, as shown in Figure 3B.
  • the fatty acid esters with C18, C20 and / or C22 polyunsaturated fatty acid molecules can be prepared from the plants used to produce the fatty acid esters in the form of an oil or lipid, for example in the form of compounds such as sphingolipids, phosphoglycerides, lipids, glycolipids, such as Glycosphingolipids, phospholipids like
  • they are isolated in the form of their diacylglycerides, triacylglycerides and / or in the form of phosphatidylcholine, more preferably in the form of the triacylglycerides.
  • the polyunsaturated fatty acids are also included as free fatty acids or bound in other compounds in the plants.
  • the various compounds mentioned above are present in the plants in an approximate distribution of 80 to 90% by weight (wt.%) Of triglycerides, 2 to 5 wt.% Diglycerides, 5 to 10 wt. Monoglycerides, 1 to 5 wt .-% of free fatty acids, 2 to 8 wt .-% phospholipids ago, wherein the sum of the various compounds to 100 wt .-% complements.
  • the LCPUFAs produced are present in a content of at least 3% by weight, advantageously of at least 5% by weight, preferably of at least 8% by weight, more preferably of at least 10% by weight, very particularly preferably at least 15 wt .-% based on the total fatty acids produced in a transgenic plant.
  • C 18 and / or C 20 fatty acids present in the host organisms are at least 10%, advantageously at least 20%, particularly advantageously at least 30%, very particularly advantageously at least 40% in the corresponding products ARA, EPA, DPA or DHA, to name but a few.
  • the fatty acids are prepared in bound form.
  • these unsaturated fatty acids can be brought to the sn1, sn2 and / or sn3 position of the advantageously prepared triglycerides. Since the starting compounds linoleic acid (C18: 2) or linolenic acid (C18: 3) undergo several reaction steps in the process according to the invention, the products of the process, such as, for example, arachidonic acid (ARA), eicosapentaenoic acid, are precipitated
  • the precursors should advantageously not more than 20 wt .-%, preferably not more than 15 wt .-%, more preferably not more than 10 wt .-%, most preferably not more than 5, 4, 3, 2, 1 or 0 , 5 wt .-% based on the amount of the respective end product.
  • Palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, gamma-linolenic acid, alpha-linolenic acid, stearidonic acid, dihomo-gamma-linolenic acid, arachidonic acid and eicosapentaenoic acid, as also shown in the fatty acid spectrum in FIG. 3B, are advantageously formed in a transgenic plant as described herein ,
  • the fatty acid esters or mixtures of fatty acids contained in the plant seed oil produced by the method of the invention advantageously contain about 3.2-5.3% palmitic acid, about 2.2-5.3% stearic acid, about 10-25% oleic acid, about 22-36% linoleic acid, about 4-12% gamma-linolenic acid, about 3-8% alpha-linolenic acid, about 0.2-1% stearidonic acid, about 3-9% dihomo-gamma-linolenic acid, about 12-25% arachidonic acid and about 1-4% eicosapentaenoic acid, based on the total fatty acid content.
  • the fatty acid esters or fatty acid mixtures contained in the plant seed oil which have been prepared by the process according to the invention, advantageously fatty acids selected from the group of the fatty acids erucic acid (13-docosaic acid), sterculic acid (9,10-methylene octadec-9-enoic acid), malvalic acid (8,9-methylene heptadec-8-enoic acid), chaulmo-gruoic acid (cyclopentenodecanoic acid), furan fatty acid (9,12-epoxy-octadeca-9,1-dienanoic acid), vernonoic acid (9,10-epoxyoctadec-12- enoic acid), taranic acid (6-octadecynoic acid), 6-nonadecynoic acid, santalbic acid (t11-octadecen-9-ynoic acid), 6,9-octadecenynoic acid,
  • fatty acids are generally advantageously present only in traces in the fatty acid esters or fatty acid mixtures prepared by the process according to the invention, that is to say they are less than 30%, preferably less than 25%, 24%, 23%, based on the total fatty acids. , 22% or 21%, more preferably less than 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% or 5%, most preferably less than 4%, 3%, 2% or 1% ago.
  • nucleic acid constructs according to the invention or the nucleic acid constructs used in the method according to the invention, an increase in the yield of polyunsaturated fatty acids of at least 50%, advantageously at least 80%, particularly advantageously at least 100%, very particularly advantageously at least 150% over the non-unsaturated fatty acids.
  • Transgenic starting plant such as oilseed rape, linseed, Därberdiestel or soy, can be achieved in the comparison in the GC analysis.
  • fatty acid compositions can be prepared by the methods described above.
  • the fatty acid compositions are isolated from the plants in a known manner, for example via extraction, distillation, crystallization, chromatography or combinations of these methods.
  • These chemically pure fatty acid compositions are advantageous for applications in the food industry for the production of foods, especially baby food, but also in the cosmetics and pharmaceutical industries.
  • nucleic acid constructs according to the invention are shown in SEQ ID NOs. 15, 16 and 17 and detailed above and in Tables 1 and 2.
  • all genes of the fatty acid or lipid metabolism can advantageously be used in combination with the inventive nucleic acid constructs (in the context of this application, the plural is to include the singular and vice versa) in the process for producing plant seed oil with polyunsaturated fatty acids.
  • a transgenic plant which is transformed with the nucleic acid construct according to the invention can additionally be introduced into the transgenic plant via suitable transformation methods with a further expression vector, by means of which one or more genes of the fatty acid or lipid metabolism can be expressed.
  • genes of the fatty acid or lipid metabolism are selected from the group acyl-CoA- Dehydrogenase (s), acyl-carrier protein-desaturase (s), acyl-ACP-thioesterase (s), fatty acid-acyl-transferase (s), acyl-CoAi-lysophospholipid-acyltransferases, fatty acid synthase (s) , Fatty acid hydroxylase (s), acetyl coenzyme A carboxylase (s), acyl coenzyme A oxidase (s), fatty acid desaturase (s), fatty acid acetylenases, lipoxygenases, triacylglycerol lipases, allene oxide synthases, hydroperoxide Lyases or fatty acid
  • Elongase (s) used. Particular preference is given to using genes selected from the group of ⁇ -5-desaturases, ⁇ -6-desaturases, ⁇ -8-desaturases, ⁇ -12-desaturases, omega-3-desaturases in combination with the nucleic acid constructs according to the invention, individual genes or Several genes can be used in combination. As already mentioned, the ⁇ -6-desaturase with SEQ ID Nos. 5 and 7, the ⁇ -5-desaturase with SEQ ID No. 9, the ⁇ -12-desaturase with SEQ ID Nos. 1 1 and 13, the ⁇ -6 elongase having SEQ ID Nos. 1 and 3, the ⁇ -5 elongase having SEQ ID No. 18, and / or the ⁇ -4-desaturase having SEQ ID NO. 20 are used.
  • the desaturases used in the nucleic acid construct according to the invention convert their respective substrates in the form of the CoA fatty acid esters.
  • the respective desaturation products are thereby synthesized in higher amounts, since the elongation step usually takes place on the CoA fatty acid esters, while the desaturation step takes place predominantly on the phospholipids or on the triglycerides.
  • An exchange reaction that would require further possibly limiting enzyme reaction between the CoA fatty acid esters and the phospholipids or triglycerides is thus not required.
  • the enzymatic activity of the polypeptides encoded by the nucleic acid construct according to the invention makes it possible to produce a wide variety of polyunsaturated fatty acids in the process according to the invention.
  • mixtures of the different fatty acids such as palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, gamma-linolenic acid, alpha-linolenic acid, stearidonic acid, dihomo-gamma-linolenic acid,
  • fatty acids derived from C18: 2 fatty acids such as GLA, DGLA or ARA or those derived from C18: 3 Derive fatty acids, such as SDA, ETA or EPA. Is in the plant used for the process as unsaturated fatty acid only
  • the products of the process can only be GLA, DGLA and ARA, which may be present as free fatty acids or bound.
  • the products of the method can only be SDA, ETA, EPA and / or DHA arise, which may be present as described above as free fatty acids or bound.
  • ⁇ -5-desaturase By modifying the activity of the enzymes involved in the synthesis ⁇ -5-desaturase, ⁇ -6-desaturase, ⁇ -4-desaturase, ⁇ -12-desaturase, ⁇ -5-elongase and / or ⁇ -6-elongase can be in the aforementioned plants targeted plant seed oils with a desired fatty acid composition. Due to the activity of ⁇ -6-desaturase and ⁇ -6 elongase, for example, oils are produced with GLA and DGLA or SDA and ETA, depending on the starting plant and unsaturated fatty acid.
  • ⁇ 5-desaturase, ⁇ 5-elongase and ⁇ 4-desaturase are additionally introduced into the plant, ARA, EPA and / or DHA are additionally produced. Since these are biosynthetic chains, the respective end products are not present as pure substances in the plants. There are always small amounts of precursor compounds in the final product.
  • These small amounts are less than 20 wt .-%, advantageously less than 15 wt .-%, more preferably less than 10 wt .-%, most preferably less than 5, 4, 3, 2 or 1 wt .-% based to the desired end products for example palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, gamma-linolenic acid, alpha-linolenic acid, stearidonic acid, dihomo-gamma-linolenic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid and / or DHA or mixtures thereof.
  • Fatty acids it is advantageous to increase the amount of starting material for fatty acid synthesis, this can be achieved for example by introducing a nucleic acid into the plant encoding a polypeptide with ⁇ -12-desaturase.
  • This is particularly advantageous in oil-producing plants of, for example, the family Brassicaceae such as the genus Brassica e.g. Rapeseed, which have a high oleic acid content. Since these organisms have only a low content of linoleic acid (Mikoklajczak et al., Journal of the American Oil Chemical Society, 38, 1961, 678-681), the use of said ⁇ -12-desaturases for the preparation of the starting product linoleic acid is advantageous.
  • nucleic acid constructs are used in the process according to the invention.
  • the method further comprises the step of obtaining a plant cell or a whole plant containing the nucleic acid constructs used in the method, wherein the cell and / or the plant with a nucleic acid construct according to the invention, as described, alone or in combination with other nucleic acid sequences which code for proteins of the fatty acid or lipid metabolism is transformed.
  • this method further comprises the step of recovering the oils, lipids or free fatty acids from the plant or from the culture.
  • the culture may be, for example, a greenhouse or field crop of a plant.
  • the cell or plant so produced is advantageously a cell of an oil-producing organism, such as an oil crop such as oilseed rape, canola, linseed, soybean, safflower or a crop such as corn.
  • Cultivation is, for example, culturing in the case of plant cells, tissue or organs on or in a nutrient medium or the whole plant on or in a substrate, for example in hydroponics, potting soil or on arable land.
  • Suitable organisms or host cells for the process according to the invention are those which are able to synthesize fatty acids, especially unsaturated fatty acids, or are suitable for the expression of recombinant genes.
  • the plants are preferably rapeseed, canola, linseed, soybean, safflower or maize.
  • Transgenic plants which contain the polyunsaturated fatty acids synthesized in the process according to the invention can advantageously be marketed directly, without the synthesized oils, lipids or fatty acids having to be isolated.
  • Plants in the process according to the invention include whole plants and all plant parts, plant organs or plant parts such as leaves, stems, seeds, roots, tubers, anthers, fibers, root hairs, stems, embryos, callosis, kotelydons, petioles, crop material, plant tissue, reproductive tissue, Cell cultures derived from the transgenic plant and / or used to produce the transgenic plant.
  • the seed includes all seed parts such as the seed shells, epidermis and sperm cells, endosperm or embryonic tissue.
  • the compounds prepared in the process according to the invention can also be isolated from the plants or plant parts such as the seeds in the form of their oils, fat, lipids and / or free fatty acids.
  • Polyunsaturated fatty acids produced by this process can be harvested by harvesting the plants either from the culture in which they grow or from the field. This can be done by pressing or extraction of the plant parts, preferably the plant seeds.
  • the oils, fats, lipids and / or free fatty acids by so-called cold beat or cold pressing can be obtained without supplying heat by pressing.
  • the plant parts, especially the seeds, to be easier to digest they are first crushed, steamed or roasted. The pretreated seeds can then be pressed or extracted with solvents such as warm hexane.
  • the solvent is removed again.
  • plant cells for example, these are harvested directly after harvesting without further operations or, after digestion, extracted by various methods known to the person skilled in the art. In this way, more than 96% of the compounds prepared in the process can be isolated. Subsequently, the products thus obtained are further processed, that is refined. First, for example, the
  • Plant mucus and turbid substances removed The so-called degumming can be carried out enzymatically or, for example, chemically / physically by adding acid, such as phosphoric acid. Subsequently, the free fatty acids are removed by treatment with a base, for example sodium hydroxide solution. The product obtained is thoroughly washed with water to remove the lye remaining in the product and dried. In order to remove the dyes still contained in the product, the products are subjected to bleaching with, for example, bleaching earth or activated carbon. Finally, the product is deodorized, for example, with steam.
  • that produced by the process according to the invention contains
  • Vegetable seed oil PUFAs or LCPUFAs ie Ci ⁇ -, C20 or C22 fatty acid molecules, preferably C18, C20 or C22 fatty acid molecules having at least one double bond in the fatty acid molecule, preferably two, three, four, five or six double bonds.
  • Ci ⁇ -, C20 or C22 fatty acid molecules can be isolated from the plant, especially plant seeds, in the form of an oil or lipid.
  • One embodiment of the invention is therefore vegetable seed oils, lipids or fatty acids or fractions thereof containing arachidonic acid at a level of from about 7 to about 26% by weight of the total fatty acid content, wherein the ratio of the weight percent of arachidonic acid to gamma-linolenic acid is about 1: 1 to about 5: 1 and the ratio of the weight percent of arachidonic acid to dihomo-gamma-linolenic acid is about 1: 1 to about 5: 1.
  • These plant seed oils, lipids or fatty acids or fractions thereof can be prepared by the method described above using transgenic plants containing the nucleic acid constructs of the invention as shown in SEQ ID NOs. 15, 16 or 17 have been integrated into their genome.
  • the plant seed oil according to the invention preferably comprises a fatty acid spectrum with the fatty acids palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, gamma-linolenic acid, alpha-linolenic acid, stearidonic acid, dihomo-gamma-linolenic acid, arachidonic acid and eicosapentaenoic acid, as also shown in the fatty acid spectrum in FIG. 3B.
  • the fatty acid esters or fatty acid mixtures contained in the plant seed oil advantageously contain about 3.2-5.3% palmitic acid, about 2.2-5.3% stearic acid, about 10-25% oleic acid, about 22-36% linoleic acid, about 4 -12% gamma-linolenic acid, about 3-8% alpha-linolenic acid, about 0.2-1% stearidonic acid, about 3-9% dihomo-gamma-linolenic acid, about 12-25% arachidonic acid and about 1-4% eicosapentaenoic acid, based on the total fatty acid content.
  • the said fatty acid esters or fatty acid mixtures preferably fatty acids selected from the group of the fatty acids erucic acid (13-docosaic acid), sterculic acid (9,10-methylene octadec-9-enoic acid), malvalic acid (8,9-methylene heptadec-8-enoic acid ), Chaulmoogric acid (cyclopentenodecanoic acid), furan fatty acid (9,12-epoxy-octadeca-9,1-dienanoic acid), vernonic acid (9,10-epoxyoctadec-12-enoic acid), taric acid (6-octadecynoic acid), 6 Nonadecynoic acid, santalbic acid (t11-octadecen-9-ynoic acid), 6,9-octadecenynoic acid, pyrulic acid (t10-heptadecen-8-ynonic acid),
  • the abovementioned fatty acids are generally advantageously present only in traces in the fatty acid ester or fatty acid mixtures prepared by the process according to the invention, that is to say they are less than 30%, preferably less than 25%, 24%, based on the total fatty acids. 23%, 22% or 21%, more preferably less than 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% or 5%, most preferably less than 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% or 0.1%.
  • the plant seed oils according to the invention contain about 7 to about 26% by weight ARA and at least 1%, 1, 5%, 2%, 3%, 4% or 5%, advantageously at least 6%, or 7%, more preferably at least 8%, 9 % or 10% EPA based on the total fatty acid content of the production organism, advantageously a transgenic plant, particularly advantageously an oil crop plant such as soybean oilseed rape, safflower, flax or maize.
  • the o.a. Plant Seed Oil DHA in the amounts indicated for EPA.
  • Another embodiment of the invention is the use of the plant seed oil of the invention or LC PUFAs extracted therefrom in feeds, foods, preferably baby food, cosmetics or pharmaceuticals.
  • the invention is the use of the plant seed oil of the invention or LC PUFAs extracted therefrom in feeds, foods, preferably baby food, cosmetics or pharmaceuticals.
  • Plant seed oils or LC-PUFAs extracted therefrom can be mixed with other oils, lipids, fatty acids or fatty acid mixtures, for example vegetable (as described above) or microbial (eg from Mortierella alpina or Crythecodinium cohnii) or animal origin (such as fish oils ) be used. These mixtures of oils, lipids, fatty acids or
  • Fatty acid mixtures consisting of (i) vegetable and microbial or (ii) vegetable and animal or (iii) vegetable and microbial and animal components can be used for the production of animal feed, food preferably baby food, cosmetics or pharmaceuticals.
  • oil is understood as meaning a fatty acid mixture which contains unsaturated, saturated, preferably esterified fatty acid (s). It is preferred that the oil, lipid or fat has a high content of monounsaturated and polyunsaturated esterified fatty acid (s). Preferably, the proportion of unsaturated esterified fatty acids is about 30%, more preferred is a proportion of 50%, even more preferred is a proportion of 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% or 99.5%. , For determination, e.g. the proportion of fatty acid after transfer of the fatty acids into the methyl esters can be determined by gas chromatography by transesterification.
  • the oil, lipid or fat may contain various other saturated or unsaturated fatty acids, e.g. Calendulic acid, palmitic, palmitoleic, stearic, oleic acid, etc. included.
  • the proportion of the various fatty acids in the oil or fat may vary depending on the starting plant.
  • the polyunsaturated fatty acids having advantageously at least two double bonds which are produced in the process are, as described above, for example sphingolipids, phosphoglycerides, lipids, glycolipids, phospholipids, monoacylglycerol, diacylglycerol, triacylglycerol or other fatty acid esters.
  • the polyunsaturated fatty acids containing, for example, via an alkali treatment, for example aqueous KOH or NaOH or acid hydrolysis advantageously in the presence of Alcohols such as methanol or ethanol or release via enzymatic cleavage and isolate on, for example, phase separation and subsequent acidification over eg H2SO4.
  • an alkali treatment for example aqueous KOH or NaOH or acid hydrolysis advantageously in the presence of Alcohols such as methanol or ethanol or release via enzymatic cleavage and isolate on, for example, phase separation and subsequent acidification over eg H2SO4.
  • the release of the fatty acids can also be carried out directly without the workup described above.
  • the nucleic acid constructs used in the method can, after introduction into a
  • Plant cell or plant are either on a separate plasmid or advantageously integrated into the genome of the host cell.
  • integration may be at random or by such recombination as to replace the native gene with the incorporated copy, thereby modulating the production of the desired compound by the cell, or by using a gene in "trans" in that the gene is functionally linked to a functional expression unit which contains at least one sequence ensuring the expression of a gene and at least one sequence ensuring the polyadenylation of a functionally transcribed gene
  • the nucleic acids are advantageously delivered via multi-expression cassettes or constructs for multiparallel expression into the plant multiparallel seed-specific expression of genes in the plants.
  • Moose and algae are the only known plant systems that produce significant amounts of polyunsaturated fatty acids, such as arachidonic acid (ARA) and / or eicosapentaenoic acid (EPA) and / or docosahexaenoic acid (DHA).
  • ARA arachidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • Moose contain PUFAs in membrane lipids, while algae, algae-related organisms and some fungi also accumulate significant levels of PUFAs in the triacylglycerol fraction.
  • nucleic acid molecules isolated from strains which also accumulate PUFAs in the triacylglycerol fraction are particularly advantageous for the process of the invention and thus for modification of the lipid and PUFA production system in a host, in particular plants such as oilseed crops, for example oilseed rape. Canola, flax, soy, safflower. They are therefore advantageous for use in the process according to the invention.
  • plants such as oilseed crops, for example oilseed rape. Canola, flax, soy, safflower. They are therefore advantageous for use in the process according to the invention.
  • nucleic acid constructs with the SEQ ID NOs are particularly advantageous for the process of the invention and thus for modification of the lipid and PUFA production system in a host, in particular plants such as oilseed crops, for example oilseed rape. Canola, flax, soy, safflower. They are therefore advantageous for use in the process according to the invention.
  • the polyunsaturated cis-fatty acids must first be desaturated by the enzymatic activity of a desaturase and then extended by at least two carbon atoms via an elongase. After one round of elongation, this enzyme activity leads to C2O fatty acids, and after two rounds of elongation to C22 fatty acids.
  • the desaturases and elongases used in the activity of the processes according to the invention preferably lead to C 16-, C 20- and / or C 22 -fatty acids advantageously having at least one double bond in the fatty acid molecule, preferably having two, three, four, five or six double bonds, particularly preferably to C 18-, C20 and / or C22 fatty acids having at least two double bonds in the fatty acid molecule, preferably three, four, five or six Double bonds, most preferably having five or six double bonds in the molecule.
  • further desaturation and elongation steps such as desaturation at ⁇ -5 and ⁇ -4 positions, may occur.
  • Particularly preferred as products of the method according to the invention are palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, gamma-linolenic acid, alpha-linolenic acid, stearidonic acid, dihomo-gamma-linolenic acid, arachidonic acid and eicosapentaenoic acid.
  • the preferred biosynthesis site of fatty acids, oils, lipids or fats in the advantageously used transgenic plants is, for example, generally the seed or cell layers of the seed, so that a seed-specific expression of the nucleic acids used in the method is useful.
  • the biosynthesis of fatty acids, oils or lipids need not be limited to the seed tissue, but may also be tissue-specific in all other parts of the plant - for example in epidermal cells or in the tubers.
  • the polyunsaturated fatty acids produced in the process by at least 5%, preferably at least 10%, more preferably at least 20%, most preferably at least 50% compared to the wild type of plants that do not recombinantly contain the nucleic acids , increase.
  • the polyunsaturated fatty acids in the plant seed oil produced in the process can in principle be increased in two ways.
  • the pool of free polyunsaturated fatty acids and / or the proportion of esterified polyunsaturated fatty acids produced by the process can be increased.
  • the method according to the invention increases the pool of esterified polyunsaturated fatty acids in the transgenic plants.
  • nucleic acid constructs of the present invention which are involved in the metabolism of lipids and fatty acids, PUFA cofactors and enzymes or in the transport of lipophilic compounds via membranes are used in the process according to the invention for modulating the production of PUFAs in transgenic plants, such as corn, soybean, linum species such as flax, oil or fiber kidney, Brassica species such as oilseed rape, canola and turnip rape, dyer's thistles either directly (eg if overexpression or optimization of a fatty acid biosynthesis protein has a direct impact on the yield, production and / or efficiency of fatty acid production modified plants) and / or may have an indirect effect which nevertheless results in an increase in the yield, production and / or production efficiency of the PUFAs or a decrease in undesired compounds (eg if the modulation of the metabolism of lipids and fatty acids, cofactors and enzymes to change the exuberance ute, production and / or efficiency of the production or composition of the desired
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • the lipid synthesis can be divided into two sections: the synthesis of fatty acids and their attachment to sn-glycerol-3-phosphate and the addition or modification of a polar head group.
  • Common lipids used in membranes include phospholipids, glycolipids, sphingolipids and phosphoglycerides.
  • Fatty acid synthesis begins with the conversion of acetyl-CoA into malonyl-CoA by the acetyl-CoA carboxylase or into acetyl-ACP by the acetyl transacylase.
  • Precursors for the PUFA biosynthesis are, for example, oleic acid, linoleic acid and linolenic acid. These cis-carbon fatty acids must be extended to C20 and C22 to obtain Eicosa and Docosa chain-type fatty acids.
  • the desaturases such as the ⁇ -12 and ⁇ -15, omega-3, ⁇ -12, ⁇ -4, ⁇ -5 and ⁇ -6 desaturases
  • elongases ⁇ -5- and ⁇ -6-elongases
  • Enzymes C20 and / or C22 fatty acids having at least one, preferably at least two, three, four, five or six double bonds in the fatty acid molecule, preferably C20 or C22 fatty acids having advantageously four, five or six double bonds in the fatty acid molecule can be produced.
  • the desaturation can be carried out before or after elongation of the corresponding fatty acid.
  • the products of desaturase activities and possible further desaturation and elongation result in preferred PUFAs having a higher desaturation level, including a further elongation of C20 to C22 fatty acids, to fatty acids such as gamma-linolenic acid, dihomo-gamma-linolenic acid, Arachidonic acid, stearidonic acid, eicosatetraenoic acid or eicosapentaenoic acid.
  • fatty acids such as gamma-linolenic acid, dihomo-gamma-linolenic acid, Arachidonic acid, stearidonic acid, eicosatetraenoic acid or eicosapentaenoic acid.
  • Substrates of the desaturases and elongases used in the process according to the invention are C16, C18 or C20 fatty acids, for example linoleic acid, gamma-linolenic acid, alpha-linolenic acid, dihomo-gamma-linolenic acid, eicosatetraenoic acid or stearidonic acid.
  • Preferred substrates are linoleic acid, gamma-linolenic acid and / or alpha-linolenic acid, dihomo-gamma-linolenic acid or arachidonic acid, eicosatetraenoic acid or eicosapentaenoic acid.
  • the synthesized C20 or C22 fatty acids having at least one, two, three, four, five or six double bonds in the fatty acid are obtained in the process according to the invention in the form of the free fatty acid or in the form of their esters, for example in the form of their glycerides.
  • glycolide is understood to mean a glycerol esterified with one, two or three carboxylic acid residues (mono-, di- or triglyceride).
  • glycolide is also meant a mixture of different glycerides.
  • the glyceride or glyceride mixture may contain other additives, e.g. contain free fatty acids, antioxidants, proteins, carbohydrates, vitamins and / or other substances.
  • glyceride in the sense of the invention
  • Process is also understood to mean derivatives derived from glycerine.
  • these also include glycerophospholipids and glyceroglycolipids.
  • the glycerophospholipids such as lecithin (phosphatidylcholine), cardiolipin, phosphatidylglycerol, phosphatidylserine and alkylacylglycerophospholipids, may be mentioned by way of example here.
  • fatty acids must then be transported to various modification sites and incorporated into the triacylglycerol storage lipid.
  • Another important step in lipid synthesis is the transfer of fatty acids to the polar head groups, for example by glycerol-fatty acid acyltransferase (see Frentzen, 1998, Lipid, 100 (4-5): 161-166).
  • the plant seed oil produced in the process comprises PUFAs, a group of molecules that are no longer able to synthesize higher animals and thus have to ingest or that can no longer sufficiently produce the higher animals themselves and thus additionally absorb them although they are easily synthesized by other organisms, such as bacteria. For example, cats can no longer synthesize arachidonic acid.
  • phospholipids are to be understood as meaning phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol and / or
  • Phosphatidylinositol advantageously phosphatidylcholine.
  • productivity are known in the art and include the concentration of the product (compounds of formula I) formed in a given amount of time and volume (eg, kg of product per hour per liter), and also includes productivity within a plant cell or a plant, that is, the content of the desired fatty acids produced in the process based on the content of all fatty acids in that cell or plant.
  • efficiency of production includes the time necessary to obtain a certain amount of production (eg how long the cell needs to set up a specific throughput rate of a fine chemical).
  • yield or product / carbon yield is known in the art and includes the efficiency of conversion of the carbon source into the product (ie, the fine chemical) .This is usually expressed, for example, as kg of product per kg of carbon source, by increasing yield or production
  • biosynthesis or biosynthetic pathway is known in the art and includes the synthesis of a compound, preferably an organic compound, by a compound of the invention Cell of interconnects, for example in a multi-step and highly regulated process.
  • degradation or degradation pathway involve the cleavage of a compound, preferably an organic compound, by a cell into degradation products (more generally, smaller or less complex molecules), for example in a multi-step and highly regulated process
  • metabolism is known in the art and includes the totality of the biochemical reactions that take place in an organism. The metabolism of a particular compound (e.g., the metabolism of a fatty acid) then comprises all of the biosynthetic, modification, and degradation pathways of that compound in the cell that affect that compound.
  • nucleic acid constructs according to the invention and optionally further polynucleotides which code for enzymes of the lipid or fatty acid metabolism, various advantageous effects can be achieved in the method according to the invention.
  • the yield, production and / or efficiency of the production of polyunsaturated fatty acids in a plant, preferably in an oil crop can be influenced.
  • the number or activity of the polypeptides or polynucleotides can be increased so that larger amounts of the gene products and thus ultimately larger amounts of the compounds of general formula I are produced.
  • a de novo synthesis in an organism lacking the activity and ability to biosynthesize the compounds before introducing the gene (s) of interest is possible.
  • nucleic acid construct according to the invention By introducing a nucleic acid construct according to the invention into a plant, alone or in combination with other genes, not only can the biosynthesis flux be increased to the end product, but also the corresponding triacylglycerol composition can be increased or created de novo. Likewise, the number or activity of other genes necessary for the import of nutrients necessary for the biosynthesis of one or more fatty acids, oils, polar and / or neutral lipids may be increased, such that the concentration of these precursors, cofactors or intermediates within the cells or within the storage compartment, thereby further increasing the ability of the cells to produce PUFAs.
  • the plant seed oil obtained in the process is suitable as a starting material for the chemical synthesis of other valuable products. For example, they may be used in combination with each other or alone for the manufacture of pharmaceuticals, foods, especially infant or baby foods, animal foods or cosmetics.
  • the process according to the invention preferably comprises a further step d) of formulating the plant seed oil as oil. Lipid or fatty acid composition.
  • Lipid or fatty acid composition in the process according to the invention further formulated into a food, preferably to baby food.
  • the oil, lipid or fatty acid composition is further formulated into a medicament, a cosmetic, a food, a dietary supplement, a feed, preferably fish feed or feed for laying hens, or a dietary supplement.
  • the invention generally relates to the use of the nucleic acid construct according to the invention, a transgenic plant cell or a transgenic plant containing these nucleic acid constructs for the preparation of an oil, lipid or fatty acid composition. This is then preferred to use as medicines, cosmetics, foods, especially baby food, feed, preferably fish feed or feed for laying hens, or dietary supplements.
  • the plant seed oil according to the invention may be used in addition to those described above Animal nutrition applications, in particular as a nutritional supplement for feed applications to improve the breeding results.
  • a feed additive for improving stocking results such as trout fishing, cattle, sheep, pigs, chickens, and pet health, such as cats and dogs, contains arachidonic acid (ARA) in
  • the feed product also contains gamma-linolenic acid (GLA), dihomo-gamma-linolenic acid (DGLA), stearidonic acid (SDA) and eicosapentaenoic acid (EPA) in order to obtain a high-quality feed additive.
  • GLA gamma-linolenic acid
  • DGLA dihomo-gamma-linolenic acid
  • SDA stearidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • the plant seed oil according to the invention can also be used for technical purposes, for example in the form of a technical oil.
  • a technical oil contains a uniquely high concentration of unsaturated fatty acids having double bonds as a polymerization component.
  • the plant seed oil according to the invention can be used alone or in combination with a polymerization agent for the following technical applications: 1. Paints and coatings (use as oxidative drying oil)
  • the advantage of the above-described plant seed oil according to the invention lies in its unique polymerization properties.
  • the oil polymerizes faster and more uniformly, forming a firmer three-dimensional structure that makes sense where network strength, durability and elasticity are required (coatings and floor coverings or plastics).
  • FIG. 1 Metabolic pathways for the synthesis of LC-PUFA.
  • Figure 2A-C Plasmid maps of the engineered T plasmids for transformation into Brassica napus. The associated sequences are shown in SEQ ID NOs. 15 ( Figure 2A), 16 ( Figure 2B) and 17 ( Figure 2C).
  • FIG. 3A Chromatogram of the gas chromatographic fatty acid analysis of non-transgenic rapeseed (Brassica napus). The peaks are annotated with the assigned fatty acids, the nomenclature is explained in Table 5.
  • FIG. 3B Chromatogram of the gas chromatographic fatty acid analysis of transgenic oilseed rape (Brassica napus) transformed with the construct VC-LJB913-1qcz (SEQ ID NO. 15). The peaks are annotated with the assigned fatty acids, the nomenclature is explained in Table 5.
  • Figure 4 Pilot plant sketch for supercritical CO2 extraction for oils.
  • FIG. 5 Production of baby food in liquid form.
  • FIG. 6 Production of baby food by complete spraying (total product).
  • Figure 7 Fatty Acid Ratios in Breast Milk: The values were averaged for the individual countries and the respective maximum or minimum of the ratios were shown in the country mean (Yuhas et al., 2006 Lipids 41: 851-8).
  • the cloning methods e.g. Restriction cleavage, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linkage of DNA fragments, transformation of Escherichia coli cells, culture of bacteria and sequence analysis of recombinant DNA were performed as described in Sambrook et al. (1989) (CoId Spring Harbor Laboratory Press).
  • the effect of genetic modification in plants or on the production of a desired compound can be determined by cultivating the modified plant under suitable conditions (such as those described above) and the medium and / or the cellular components are assayed for increased production of the desired product (ie, lipids or a fatty acid).
  • suitable conditions such as those described above
  • the desired product ie, lipids or a fatty acid.
  • analytical techniques are well known to those skilled in the art and include spectroscopy, thin layer chromatography, staining methods of various types, enzymatic and microbiological methods, and analytical chromatography such as high performance liquid chromatography (see, for example, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 89-90 and p.
  • Bioseparations downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F., and Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., and Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. B3; Chapter 1 1, pp. 1-27, VCH: Weinheim; and Dechow, FJ. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
  • fatty acids abbreviations: FAME, fatty acid methyl ester, GC-MS, gas-liquid chromatography-mass spectrometry, TAG, triacylglycerol, TLC, thin-layer chromatography.
  • FAME fatty acid methyl ester
  • GC-MS gas-liquid chromatography-mass spectrometry
  • TAG triacylglycerol
  • TLC thin-layer chromatography
  • the Gateway cloning method (Invitrogen) was used according to the manufacturer's instructions to combine multiple cassettes in pENTR vectors into the binary T-plasmid pSUN.
  • the binary T plasmids VC-LJB913-1 qcz SEQ ID 15
  • VC-LJ B1327-1 qcz SEQ ID 16
  • VC-LJB1328-1 qcz SEQ ID 17
  • DHA polyunsaturated, long-chain fatty acid docosaccharic acid
  • constructs can be transformed into oilseed rape, as described in WO2005 / 083093.
  • the nucleic acid constructs according to the invention preferably contain, in addition to the above-mentioned genes, genes encoding the Delta 5 elongase from Ostreococcus tauri as shown in SEQ ID NO. 18 and the Delta 4 desaturase from Traustochytrium ssp. as shown in SEQ ID NO. 20 illustrated encode.
  • SEQ ID Nos. 22, 24, 26, 28, 30 and 33 are suitable as promoters.
  • SEQ ID Nos. 23, 25, 27, 29, 31, 32 and 34 are suitable as terminators.
  • Petioles or hypocotyls of freshly germinated sterile rape plants were incubated in a Petri dish with a 1:50 Agrobacterium dilution for 5-10 minutes. This was followed by a 3-day co-incubation in darkness at 25 ° C on 3MS medium with 0.8% Bacto agar. Cultivation was continued after 3 days at 16 hours light / 8 hours darkness and at weekly intervals on MS medium containing 500 mg / L claforan (Cefotaxime sodium), 50 mg / L kanamycin, 20 microM benzylaminopurine (BAP) and 1, 6 g / l glucose continued.
  • MS medium containing 500 mg / L claforan (Cefotaxime sodium), 50 mg / L kanamycin, 20 microM benzylaminopurine (BAP) and 1, 6 g / l glucose continued.
  • Regenerated shoots were obtained on 2MS medium with kanamycin and claforan, transferred into soil after rooting and grown in a climatic chamber or greenhouse after cultivation for two weeks, flowered, harvested mature seeds, and expression of the desaturase and elongase genes, respectively analyzed by lipid analysis as exemplified in Qiu et al. 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561-31566. b) Production of transgenic flax plants
  • transgenic flax plants can be carried out, for example, according to the method of Bell et al., 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 35 (6): 456-465 by means of particle bombartment.
  • Agrobacteria-mediated transformations can be carried out, for example, according to Mlynarova et al. (1994), Plant Cell Report 13: 282-285.
  • Example 5 Lipid analysis of transgenic oilseed rape plants transformed with the T-plasmids shown.
  • the plasmids prepared under Example 3 were transformed into oilseed rape (Brassica napus) as described in Example 4. After selection of the transgenic plants by PCR, these were grown to seed maturity (day-to-cycle: 16h, 20OmE, 21 ° C, 8h dark, 19 ° C) and the seeds were harvested.
  • GLA gamma-linolenic acid
  • ARA arachidonic acid
  • DGLA dihomo-gama-linolenic acids
  • Table 4 gives an overview of the ratios compared to various organisms which either naturally produce arachidonic acid or have been transferred into the genes for the corresponding metabolic pathway.
  • GLA and DGLA are important components of the fat fraction of breast milk.
  • the conditions present in the plant seed oil according to the invention are very close to those in breast milk.
  • the fatty acid composition in the plant seed oil according to the invention is very similar to that present in breast milk; compare Figure 7.
  • the seeds obtained were processed to obtain the plant seed oil and the wild-type oil according to the invention.
  • the processing started with the crushing and squeezing of the seeds, followed by an extraction. Extraction was done by hexane and by supercritical CO2 extraction. Subsequently, a refining of the hexane-extracted oil and a stabilization was carried out.
  • the supercritical carbon dioxide (CO2) extraction is based on the use of carbon dioxide in the subcritical or supercritical state as the extractant, with the extractant being recycled (Barthet and Daun 2002, JAOCS 79: 245-51).
  • SFE supercritical fluid extraction
  • the seeds were first comminuted to 0.15 mm or 0.05 mm by means of a pre-pressing (roller press) under a nitrogen atmosphere prior to extraction with SFE.
  • the discontinuous SFE was on the one hand on a laboratory scale by means of "Spe-ed SFE” (25-50 mL, dimension 15.8 cm x 1.4 cm iD, manufacturer: Applied Chemistry, Allentown, US) carried out, on the other hand, a pilot plant (manufacturer: Nova, Switzerland, capacity 4 L, dimension of the extraction cylinder 22 cm height x 7.5 cm id) (see FIG. 4).
  • the pilot plant extraction cylinder whose bottom was laid with glass wool, was pre-pressed with seed. Before closing the cylinder, glass wool was placed on the pre-pressed seed. The cylinder unit was then connected to inlet and outlet valves and placed in a preheated oven (4 L autoclave oven). The compressed CO2 could now be pumped through the pre-pressed seeds fixed with glass wool. After the discharge of the extraction cylinder, the pressure of the CO2 laden with the extract was taken by means of an expansion valve and discharged into a separator. Sample material was collected here. The expansion valve released the pressure in the laboratory system to 1 bar, in the pilot plant to 50-70 bar. CO2 could not be collected in the laboratory system. In the pilot plant, the CO2 was fed back to the high pressure pump via a return from the separator ( Figure 4) and therefore formed a closed system.
  • the stepwise approach showed the following optimized parameters for the most complete and gentle extraction of a Brassicasamenöls.
  • Pre-press particle size of less than 0.2 mm by roller press with gap size 0.15 mm, SFE with preferred pressure of at least 300 bar, better 350 bar.
  • the temperature could be maintained between 40 and 60 ° C.
  • the lowest possible temperature of 40 ° C is preferable here to reduce oxidative processes in the oil.
  • An optimal yield was achieved in an extraction run of 60 kg of CO2 per hour after 120 min.
  • the optimum CO2 mass flow rate was 80 to 100 times the mass of the substrate to achieve 90% yield of the maximum achievable yield. Shorter extraction times resulted in less complete extraction, but could provide extraction cost benefits.
  • the advantages of the advanced SFE technology for the extraction of Brassica seeds can be summarized as follows.
  • the extraction efficiency is significantly optimized in the process developed here on a pilot scale, compared to the prior art.
  • the pilot scale CO2 SFE can thus be scaled to the required industrial scale of, for example, 800 tons of oil per year without significant changes.
  • Such plant seed oil according to the invention thus extracted does not contain any residual solvents and is therefore particularly suitable for food production, preferably for the production of baby food.
  • the bleaching was done with 1% bleaching earth (Tonsil Optimum 214 FF, 90 ° C, 20 minutes, 350 rpm, to 20 mbar). It was then filtered using an acetate filter under pressure and nitrogen. Deodorization is carried out at 220 ° C, 20 minutes, 1 - 2 mbar with deionized and degassed water.
  • Refining is not always necessary for plant seed oil derived from supercritical CO2 extraction.
  • direct use of the oil obtained via SFE Supercritical CO2 Extraction is possible, i. no subsequent refining is necessary for this.
  • These products include milk, juice, porridge, syrup, candy and fermented product for the toddler.
  • Refining of the plant seed oil obtained via supercritical CO2 extraction is recommended, however, from the o.a. Reasons for use in baby food.
  • Example 7 Composition of the plant seed oil according to the invention
  • the plant seed oil according to the invention contains the fatty acids important for infant nutrition in the following percentages by weight (mass of the fatty acids in percent of the total fatty acid content)
  • Linoleic acid (18: 2 n-6) 20-25 alpha-linolenic acid (18: 3 n-3) 3-7
  • GLA Gamma-linolenic acid
  • DGLA Dihomo-gamma-linolenic acid
  • SDA 4-8 stearidonic acid
  • Example 8 Infant Nutrition Containing the Plant Seed Oil of the Invention
  • the ARA content in the exemplary infant formula described herein was adjusted to the total amount of ARA found in breast milk during the first 0-12 months of lactation.
  • An additional advantage is that if that Vegetable seed oil according to the invention is used to supplement the baby milk with ARA, thus also the values for the GLA, DGLA, SDA and EPA are in the range of concentrations as in breast milk. This is because the plant seed oil of the present invention contains the three highly unsaturated fatty acids almost in the proportions also found in breast milk.
  • the plant seed oil of the present invention when used as part of the infant formula to balance the ARA concentration, then the GLA, DGLA SDA and EPA are supplied in the proper concentrations to provide the appropriate nutrients for the particular infant, baby and child foods to deliver.
  • no change in the oil such as the admixture of, for example, other GLA, DGLA, SDA and EPA-containing oils is necessary.
  • the ARA-containing plant seed oil according to the invention was added to the baby food (0.5-7.5 g of ARA-containing oil / 100 g total fat content in the baby food). This added amount of ARA accounts for a part of the total amount of fat (total fat content of about 28g per 100g dry weight).
  • the fatty acid pattern of the baby food with respect to the LCPUFA is decisively approximated to breast milk, as can be seen from the following Table 7.
  • Table 7 compares the average fatty acid pattern of infant formula from three independent manufacturers as documented in the US Food Database (USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 20 (2007)).
  • Table 7 Average fatty acid patterns of the fat blend of three commercial infant formulas marketed as dry powder to prepare a mother substitute milk and not supplemented with ARA (Column 2, infant foods: Mead Johnson, Enfamil, with iron, powder, NDB No: 03805; Similac, Isomil, with iron, powder, NDB No: 03843; Nestle, Good Start Supreme, with iron, powder NDB No: 03802), three commercial infant formulas supplemented with ARA (Column 3, infant formulas: Mead Johnson, Enfamil, Lipil , iron, powder (NDB No: 03808); Ross, Similac, Isomil, Advance with Iron, Powder (NDB No: 03954); PBM Products, Ultra Bright Beginnings, Powder (NDB No: 03883)) and an exemplary infant formula ( Column 4) which has been supplemented with ARA by means of the plant seed oil according to the invention (described in column 5).
  • Column 6 describes the mean levels of the most important LCPUFA of breast milk from
  • NDB stands for Nutrients Data Base.
  • the upper limit of 0.75% ARA as part of daily fat intake for infants is recommended in US GRAS GRN 80 (www.cfsan.fda.gov/ ⁇ rdb/opa-g080.html).
  • an addition of 5% of the plant seed oil according to the invention is necessary, which contains 15% ARA based on its total fatty acid content. This results in a total addition of 1.36% of the plant seed oil according to the invention based on infant formula dry matter.
  • a higher or lower target concentration of ARA in the infant formula can be achieved by correspondingly increasing or decreasing the plant seed oil of the invention in the total fat mixture.
  • the plant seed oil according to the invention can be used not only in baby food, but also in complete food.
  • a complete food to which the plant seed oil of the present invention is added contains arachidonic acid (ARA) in similar concentrations as the mother's milk.
  • the complete diet also contains gamma-linolenic acid (GLA), dihomo-gamma-linolenic acid (DGLA), stearidonic acid (SDA) and eicosapentaenoic acid (EPA) in similar concentrations as breast milk.
  • GLA gamma-linolenic acid
  • DGLA dihomo-gamma-linolenic acid
  • SDA stearidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • the cited complete food may, for example, be infant milk, follow-on milk, toddler drink, fruit juice, corn porridge, milk, yogurt or a fermented product.
  • Complete product may also be solid or mushy baby food, sweets, biscuits or gelatine products. It is intended for example for the nutrition of infants, non-children and children to their normal growth and their to support healthy development.
  • Table 8 Comparison of the ratios of the most important PUFA (with the exception of DHA) in baby food and breast milk.
  • Column 2 shows the average ratios of the most important PUFA in three commercial infant formulas (dry powder for preparing a mother's milk substitute) supplemented with ARA and DHA (infant formulas: Mead Johnson, Enfamil, Lipil, with iron, powder (NDB No: 03808); Similac, Isomil, Advance with Iron, Powder (NDB No: 03954), PBM Products, Ultra Bright Beginnings, Powder (NDB No: 03883)), the most important PUFA ratios of an exemplary infant formula (column 3) using the plant seed oil of the invention with ARA (Column 4) was added.
  • Column 5 describes the average PUFA ratios of breast milk from different countries (Yuhas et al., 2006 Lipids 41: 851-8).
  • the example chosen shows that the favorable ratios of the important PUFA ARA, GLA, DGLA, SDA and EPA of the plant seed oil according to the invention (Table 8, column 4) are directly reflected in the baby food (Table 8, columns 3 and 5).
  • the ratio of arachidonic acid to gamma-linolenic acid is about 1: 1 to about 5: 1
  • the ratio of arachidonic acid to dihomo-gamma-linolenic acid is about 1: 1 to about 5: 1.
  • the ratios achieved with the plant seed oil according to the invention therefore very advantageously cover the present in breast milk ratios between arachidonic acid (ARA) and gamma-linolenic acid (GLA) 2: 1 to 4: 1 and between arachidonic acid and dihomo-gamma-linolenic acids (DGLA) 1: 1 to 2: 1 (Yuhas et al., 2006_Upids 41: 851-8); see Table 8, column 5 and Figure 7.
  • ARA arachidonic acid
  • GLA gamma-linolenic acid
  • DGLA dihomo-gamma-linolenic acids
  • the ratio of arachidonic acid to stearidonic acid is 14: 1 to 38: 1 and again reflects the ratio present in breast milk (ARA: SDA approx. 7: 1 to 45: 1) (Yuhas et al., 2006 Lipids 41 : 851-8).
  • the ratio of arachidonic acid to eicosapentaenoic acid in the plant seed oil according to the invention is 3: 1 to 7: 1 and here too reflects the ratio (ARA: EPA about 2: 1 to 7: 1) present in the breast milk (Yuhas et al., 2006 Lipids 41: 851-8).
  • the plant seed oil according to the invention also contains, like breast milk, the essential fatty acids linoleic acid and alpha-linolenic acid. Also in relation to the ratio of linoleic acid to alpha-linolenic acid, the plant seed oil of the invention comes very close to breast milk (Table 8, columns 3 and 5). In breast milk, the ratio is about 7: 1 to 18: 1 (Yuhas et al., 2006 Lipids 41: 851-8).
  • infant formula is supplemented with the plant seed oil according to the invention with the important PUFA ARA, GLA, DGLA, SDA and EPA in order to bring the concentrations and ratios into line with those in breast milk.
  • the supplemented baby food can be further supplemented with a source of DHA.
  • DHA the upper limit of 0.5% DAH as part of daily fat intake for infants is recommended in US GRAS GRN 80 (www.cfsan.fda.gov/ ⁇ rdb/opa-g080.html).
  • a target concentration of 0.5% DHA in the total fatty acid content of the baby food for example, an addition of 1.2 g DHASCO® per 100 g total fat is required, which contains 40% of DHA based on its total fatty acid content
  • the infant formula can therefore be added to the ARA-containing plant seed oil according to the invention (0.5-7.5 g / 100 g fat) and DHASCO®.
  • the amount of ARA added is 5% and the amount of DHA added is 1.2% of the total fat mass (with a total fat content of the infant formula of approximately 28g per 100g dry weight).
  • the addition of both oils further approximates the fatty acid pattern of infant formula with respect to LCPUFA to breast milk, as shown in Table 9 below.
  • Table 9 compares the average fatty acid pattern of infant formula from three independent manufacturers as documented in the US Nutrition Database (USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 20 (2007)).
  • Table 9 Average fatty acid patterns of the fat blend of three commercial infant formulas (dry powder for preparing a mother substitute milk) which were not supplemented with ARA and DHA (Column 2, infant foods: Mead Johnson, Enfamil, with iron, powder, NDB No: 03805, Ross, Similac , Nestlé, Good Start Supreme, with iron, powder NDB No: 03802), three commercial infant formulas supplemented with ARA (Column 3, infant formulas: Mead Johnson, Enfamil, Lipil, Ross, Similac, Isomil, Advance with Iron, Powder (NDB No: 03954), PBM Products, Ultra Bright Beginnings, Powder (NDB No: 03883)) and an exemplary infant formula (Column 4) which was supplemented with ARA in column 5 by means of the plant seed oil according to the invention and which was supplemented with DHA by means of DHASCO® (Arterburn et al., 2007, Lipids 42: 1011-24) (column 6). Column 7 describes the average
  • Table 10 Comparison of the ratios of the most important PUFA in baby food and breast milk.
  • Column 2 shows the mean ratios of the most important PUFA in three commercial infant formulas supplemented with ARA and DHA (infant formulas: Mead Johnson, Enfamil, Lipil, with iron, powder (NDB No: 03808); Ross, Similac, Isomil, Advance with iron , Powder (NDB No: 03954), PBM Products, Ultra Bright Beginning, powder (NDB No: 03883)), the most important PUFA ratios of an exemplary infant formula (column 3) by means of the invention Plant seed oil with ARA (column 4) and by means of DHASCO® (column 5, Arterburn et al., 2007, Lipids 42: 101 1-24).
  • Column 6 describes the average PUFA ratios of breast milk from different countries (Yuhas et al., 2006_Lipids 41: 851-8).
  • Table 10 shows that the favorable ratios of the important PUFA ARA, GLA, DGLA, SDA, EPA and DHA of the plant seed oil according to the invention (Table 10, column 4) are directly reflected in the baby food (Table 10, column 3) and that moreover Particularly favorable ratios of the fatty acids DHA and EPA can be achieved.
  • the ratio of ARA to DHA is 1.5: 1 and reflects the breast milk ratio (ARA: DHA approx. 0.6: 1 to 7.2: 1) (Yuhas et al., 2006 Lipids 41: 851-8).
  • the ratio of DHA to EPA is 3.3: 1 and again reflects the breast milk present ratio (DHA: EPA ca. 2.1: 1 to 5.0: 1) (Yuhas et al. 2006_Lipids 41: 851-8)
  • the plant seed oil of the invention has been developed to support optimal growth, visual and cognitive development and the development of improved immunity of newborns, babies and toddlers. As an additive in baby food, it is preferably for premature infants as well as infants and infants from: 0-6 months (infant formulas), 0-12 months (infant formula), and 12-24 months (infants).
  • exemplary formulations are listed which are supplemented particularly favorably by the plant seed oil according to the invention.
  • the ingredients of the formulations are mixed particularly favorably in proportions, so that the baby food contains main nutrients in the following concentrations (data in g / 100 kcal of the baby food): fats, 3-7 g; Proteins, 1-5g; Carbohydrates, 6-16g.
  • the infant formula contains vitamins and minerals in amounts recommended for the infant or toddler age, as well as ARA and DHA at 0.025 to 0.5 percent of the energy of the infant formula or at a concentration of 0.05 to 1.0 g / each. 100g fat of baby food.
  • the infant formula also contains GLA, DGLA, SDA and EPA in ratios that are particularly similar to breast milk.
  • the functional fatty acids ARA, GLA, DGLA, SDA and EPA originate here from the plant seed oil according to the invention.
  • the infant formula may be composed, for example, of the following ingredients: mineral-reduced whey, defatted milk, vegetable oil (palm olein, soy, coconut, oleic sunflower and low-acid rapeseed oils), lactose, the plant seed oil according to the invention, Crypthecodinium cohnii- ⁇ I or fish oil, vitamin A palmitate, Vitamin D3, vitamin E acetate, vitamin K1, thiamine hydrochloride, vitamin B6 hydrochloride, vitamin B12, niacinamide, folic acid, calcium pantothenate, biotin, sodium ascorbate, inositol, calcium chloride, calcium phosphate, iron sulfate, zinc sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, sodium chloride, sodium citrate , Potassium citrate, potassium hydroxide, sodium selenite, taurine, nucleotides (adenosine 5-monophosphate, c
  • composition of a baby food with the plant seed oil according to the invention is a baby food with probiotics and with ARA, optionally combined with prebiotics.
  • ARA can optionally be combined with docosahexaenoic acid (DHA), as shown above.
  • Important constituents of this infant formula are modified sweet whey proteins intact or partially hydrolyzed, probiotics in the form of bifidobacteria and / or lactobacilli, optionally prebiotics in the form of specific mono- and disaccharides, oligosaccharides or starches, and the plant seed oil according to the invention.
  • This baby food contains (per 100kcal): energy content (kcal) (100), protein (g) (casein / whey: 30/70) (1, 83), total fat content (g) (5,3) of which linoleic acid (g) ( 0.7-0.8), alpha-linolenic acid (mg) (90-110), ARA (mg) (5-60), GLA (mg) (3-40), DGLA (mg) (2-30) , SDA (mg) (1-6), EPA (mg) (1-12), DHA (mg) (5-60), lactose (g) (1 1, 2), minerals (g) (0.37 ), Na (mg) (23), K (mg) (89), Cl (mg) (64), Ca (mg) (62), P (mg) (31), Mg (mg) (7), Mn ( ⁇ g) (8), Se ( ⁇ g) (2), Vitamin A ( ⁇ g RE) (105), Vitamin D ( ⁇ g) (1, 5), Vitamin E (mg
  • infant formula with the plant seed oil according to the invention and the carotenoids beta-carotene, lycopene, lutein and zeaxanthin.
  • the combination of lutein, lycopene and beta-carotene accounts for 0, 05-0, 8mg / 100g of total fat or nutritional formula.
  • the total amount by weight in the infant formula is 0.01-0.6 mg beta-carotene, 0.01-0.8 mg lycopene and 0.01-0.5 mg lutein plus zeaxanthin.
  • the proportion of polyunsaturated fatty acids is 0.05-20% by weight of the total solids of the baby food.
  • the polyunsaturated fatty acids are arachidonic acid (preferred), GLA, DGLA, SDA, eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, linoleic acid and / or alpha linolenic acid.
  • the amount of ARA contained in the baby food is 0.1 to 1.0 g / 100 g of the total fat or 0.05 to 0.5 percent of the total energy.
  • the amounts of GLA, DGLA, SDA and EPA contained are respectively 0.06-0.7, 0.04-0.5, 0.01-0.1 and 0.02-0.2 g / 100g of total fat. It was also made a liquid baby food.
  • Lactose 44.5% vegetable seed oil according to the invention (15% ARA) 0.1 to 1.5%, DHA-containing oil (40% DHA) 0.1%, non-fat dry milk 18.7%, high-oleic safflower oil 10.7%, mono- and diglycerides 0.27%, soybean oil 8.2%, whey protein 4.6%, calcium carbonate 0.35%, coconut oil 7.58%, citric acid 0.02%, potassium citrate 0.40%, ascorbic acid 0.29%, lecithin 0.27%, magnesium chloride 0.04%, potassium chloride 0.14%, iron sulfate 0.04%, carrageenan 0.22%, choline chloride 0.04%, nucleotide and choline premix 0.22%, riboflavin 0.002%, L-carnitine 0.002%,
  • Example 9 Application of the plant seed oil according to the invention for the nutrition of animals
  • the plant seed oil according to the invention is also suitable as a nutritional supplement for feed applications for improving the breeding result. It can be used as a feed supplement to improve stocking results (eg trout fishing, cattle, pigs, chickens) and for the health of pets (for example cats and dogs).
  • the plant seed oil of the present invention contains arachidonic acid (ARA) in concentrations suitable for improving the reproduction rates when the diet of the young or dam is supplemented with ARA.
  • ARA arachidonic acid
  • GLA gamma-linolenic acid
  • DGLA dihomo-gamma-linolenic acid
  • SDA stearidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • Example 10 Technical Applications of the Plant Seed Oil of the Invention
  • the addition of the plant seed oil of the invention provides a technical oil having a singularly high concentration of unsaturated fatty acids having double bonds
  • the oil may be used alone or in combination with a polymerization agent for the following
  • the advantage of the oil described above lies in its unique polymerization properties.
  • the oil polymerizes faster, smoother, and forms a firmer three-dimensional structure useful where network strength, durability, and elasticity are required (such as in coatings and floor coverings or plastics).

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Pflanzensamenöl, umfassend Arachidonsäure mit einem Gehalt von ungefähr 7 bis ungefähr 26 Gewichtsprozent am Gesamtfettsäuregehalt, wobei das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Gamma-Linolensäure ungefähr 1:1 bis ungefähr 5:1 und das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Dihomo-Gamma-Linolensäure ungefähr 1:1 bis ungefähr 5:1 beträgt. Die Erfindung betrifft des weiteren Verfahren zur Herstellung dieses Pflanzensamenöls sowie Formulierungen und Verwendungen des Pflanzensamenöls. Insbesondere stellt die Erfindung auch Nahrungsmittel und Babynahrung zur Verfügung, die das angeführte Pflanzensamenöl enthalten.

Description

Pflanzensamenöl
Die Erfindung bezieht sich auf ein Pflanzensamenöl, umfassend Arachidonsäure mit einem Gehalt von ungefähr 7 bis ungefähr 26 Gewichtsprozent am Gesamtfettsäuregehalt, wobei das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 und das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Dihomo- Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 beträgt. Die Erfindung betrifft des weiteren Verfahren zur Herstellung dieses Pflanzensamenöls sowie Formulierungen und Verwendungen des Pflanzensamenöls. Insbesondere stellt die Erfindung auch Nahrungsmittel und Babynahrung zur Verfügung, die das angeführte Pflanzensamenöl enthalten.
Arachidonsäure (ARA) ist eine langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure der Omega-6 (n-6)- Klasse (C20:4 5,8,11 ,14-Eicosatetraensäure). Im folgenden werden mehrfach ungesättigte Fettsäuren als PUFA, PUFAs, LCPUFA oder LCPUFAs bezeichnet (poly unsaturated fatty acids, PUFA, mehrfach ungesättigte Fettsäuren;Jong chain poly unsaturated fatty acids, LCPUFA, langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren).
ARA ist die am häufigsten vorkommende C20-PUFA im menschlichen Blut Plasma (Siguel and Schaefer (1988) Aging and nutritional requirements of essential fatty acids. In: Dietary Fat Requirments in Health and Development (Beare-Rogers, ed.) pp 163-189, American OiI Chemist's Society, Champaign, IL.). Sie ist vor allem im Organ-, Muskel- und Blutgewebe vorhanden, wo sie eine wichtige Funktion als Strukturlipid erfüllt, das vorwiegend mit Phospolipiden in Blut, Leber, Muskeln und anderen wichtigen Organsystemen assoziiert ist. Neben ihrer hauptsächlichen Funktion als Strukturlipid dient ARA auch als direkte Vorstufe für eine Reihe von zirkulierenden Eicosanoiden wie Prostaglandin E2(PGE2), Prostacyclin I2(PGI2), Thromboxan A2(TxA2) und die Leukotriene B4(LTB4) und C4(LTC4). Diese Eicosanoide beeinflussen die Wachstumssteuerung, die Entzündungsabwehrreaktion, die Blutrheologie, den Gefäßtonus, die Leukocytenfunktion und die Plättchenaktivierung (Calder 2006, Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 75:197-202; Roland et al. 2004, Mini Rev Med Chem. 4:659-68).
Die menschliche Muttermilch enthält in allen Stadien der Laktation einen beträchtlichen Anteil an ARA. Dieser beträgt etwa 0,2 bis 1 ,0% des Gesamtgehalts an Fettsäuren (Brenna et al. 2007 AJCN 85:1457). Die Konzentration hängt vom Laktationsstadium, vom Ernährungszustand der Mutter und von Umweltbedingungen ab. Daher empfehlen Organisationen wie die „World Association of Perinatal Medicine", die „Early Nutrition
Academy", die „Child Health Foundation", die „World Health Organization", die „British Nutrition Foundation", die „European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition", und die „International Society for the Study of Fatty Acids and Lipids", in Fällen in denen Brustfütterung keine Option ist, die Nutzung von Babynahrung, die unter anderem mit ARA supplementiert ist (Koletzko et al. 2008, J Perinat Med. 2008;36:5-14; Diersen-Schade et al. 2005 Lipid Technology 17:225). ARA wird mittlerweiler auch von immer mehr Herstellern der Säuglingsnahrung zugesetzt, um diese der Muttermilch anzugleichen. Interessanterweise schwankt die Konzentration von ARA in der Muttermilch im Allgemeinen weniger als die von Docosahexaensäure (DHA, 0,1 bis mehr als 1 ,0% des Gesamtgehalts an Fettsäuren) (Diersen- Schade 2005 LipTech 17:225; Innis 2007 ProcNutrSoc 66:397; Brenna et al. 2007 AJCN 85:1457), was auf eine genauere physiologische Regulierung hinweist, damit der für die Säuglingsernährung notwendige ARA-Gehalt zur Verfügung steht. Die potenziellen gesundheitlichen Vorteile, die die ARA für Säuglinge im prä-, peri- und postnatalen Stadium bietet, liegen in der Unterstützung der Gehirnentwicklung und -funktionen sowie in einer verbesserten Entwicklung der Augen (Diersen-Schade et al. 2005 Lipid Technology 17:225). Die übereinstimmenden Empfehlungen und praktischen Richtlinien für die Gesundheitsfürsorge, die von der „World Association of Perinatal Medicine" (Weltvereinigung für Perinatalmedizin), der „Early Nutrition Academy" (Akademie für frühkindliche Ernährung) und der „Child Health Foundation" (Stiftung für die Gesundheit der Kinder) unterstützt werden, unterstreichen die Wichtigkeit einer ausreichenden Aufnahme von ARA mit der Säuglingsnahrung (Koletzko et al. 2008, J Perinat Med. 2008;36:5-14). Insbesondere der Fötus und das Neugeborene sollten LC-PUFA in ausreichender Menge erhalten, um die optimale visuelle und kognitive Entwicklung zu unterstützen. Es wird angenommen, dass sich für das Neugeborene bis zum Alter von ungefähr zwei Jahren Vorteile durch die Nahrungsergänzung mit ARA ergeben.
Ab Mai 2001 war die durch ARA ergänzte Säuglingsnahrung kein Nischenprodukt mehr, denn ARA entwickelte sich in den hoch entwickelten Ländern zu einem fast obligatorischen Bestandteil der Säuglingsmilch. Diese Entwicklung wurde auch dadurch unterstützt, dass die US „Food and Drug Administration" (FDA) eine positive Bewertung zu Martek's GRAS- Einstufung bezüglich der Verwendung von DHASCO®- (DHA, Crypthecodinium cohnii) und ARASCO®- (ARA, Mortierella alpina) Ölmischungen in Säuglingsnahrungen abgegeben hatte. Die Abkürzung „GRAS" bezeichnet hierbei die Einstufung „Generally Recognized as Safe" , i.e. als sicher für den Einsatz in Nahrungsmitteln. Der Zusatz von ARA zur Säuglingsmilch und somit auch der ARA-Markt wurde einerseits durch Martek's Einflussnahme und andererseits dadurch vorangetrieben, dass die potentiellen gesundheitlichen Vorteile von ARA für die Entwicklung von Säuglingen zunehmend anerkannt wurden. Außer der ARA ist auch die DHA (Docosahexaensäure) eine wichtige Fettsäure, die der Säuglingsnahrung zugesetzt werden sollte. DHA kommt in menschlicher Muttermilch vor, und es wird angenommen, dass sie die Entwicklung des Gehirns, des Nervengewebes und der Augen des wachsenden Säuglings unterstützt. Es wurde nachgewiesen, dass der Zusatz von DHA in wirksamen Konzentrationen sowohl bei zum berechneten Termin als auch bei zu früh geborenen Säuglingen die kognitive Entwicklung der Sehschärfe verbessert. Neben der ARA und der DHA beinhaltet die Muttermilch noch weitere hochgradig ungesättigte Fettsäuren, die weniger erforscht sind, jedoch auch eine große Rolle für die Entwicklung des Säuglings spielen. Bei diesen Fettsäuren handelt es sich beispielsweise um Gamma- Linolensäure (GLA, 0,1-0,2% des Gesamtgehalts an Fettsäuren), Dihomo-Gamma- Linolensäure (DGLA, 0,2-0,4% des Gesamtgehalts an Fettsäuren), Stearidonsäure (SDA, bis zu 0,1 % des Gesamtgehalts an Fettsäuren) und Eicosapentaensäure (EPA, 0,05-0,3% des Gesamtgehalts an Fettsäuren) (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8). Um die Ersatznahrung möglichst gut an die Muttermilch anzugleichen, ist es wichtig, diese hochgradig ungesättigten Fettsäuren in den Lipidanteil der Säuglingsnahrung zu integrieren. Die Rolle der hochgradig ungesättigten n-6-Fettsäuren GLA und DGLA wird gerade untersucht. Das Vorhandensein von GLA und DGLA in der Muttermilch spricht dafür, dass sie unabhängig von der ARA für die Entwicklung des gestillten Säuglings wichtig sind. Die Forschung zeigt, dass die n-6-Fettsäuren des Säuglings bei der physiologischen Integration in die menschlichen Gewebelipide miteinander konkurrieren (AI et al. 2008, Am J Clin Nutr 71 :285S-91 S). Daher ist es wichtig, dass ein ausgeglichenes Fettsäurenmuster mit bei werdenden und stillenden Müttern ermöglicht wird (Geppert et al. 2008, Br. J. Nutrition 99: 360-9). Zu den potentiellen Vorteilen der frühzeitigen zusätzliche Gabe von GLA zählt ein reduzierter IgE-Gesamtwert im ersten Lebensjahr bei Säuglingen, die an atopischer Dermatitis oder atopischen Ekzemen, eine häufige vererbte Hauterkrankung, leiden (Demmelmair H., FeIdI F., Horvath I. et al. Influence of formulas with borage oil or borage oil plus fish oil on the arachidonic acid Status in premature infants, Lipids 2001 ; 36:555-66. Kitz R., Rose MA., Schonborn H., Zielen S., Bohles HJ. Impact of early dietary gamma-linolenic acid supplementation on atopic eczema in infancy. Pediatr. Allergy Immunol. 2006, 17:112-7). Es zeigt sich auch die Tendenz, dass durch die zusätzliche Gabe von GLA bei Kindern mit einem hohen familiären Risiko für eine atopische Dermatitis die Erkrankung im späten Kleinkindalter eingedämmt werden kann (van Gool et al. 2003, Am J Clin Nutr 77:943). Obwohl sich durch die mit der Nahrung zugeführte GLA die Häufigkeit der atopischen Ekzeme nicht beeinflussen oder verringern lässt (Kritz et al. 2006), scheint bei Säuglingen, die an atopischen Ekzemen leiden, durch die zusätzliche Gabe von GLA im ersten Lebensjahr der IgE-Gesamtwert zu sinken (Kritz et al. 2006). DGLA ist eine Vorstufe bei der Synthese des Prostaglandins E1 (PGE1) und auch der Serie-3-Prostaglandine (Das 2008, Lipids in Health and Disease 7:9). Auch andere Vorzüge von DGLA Supplementation in der Babymilch wurden gezeigt. Zum Beispiel beeinflusst DGLA die Zytokin Produktion in humanen Peripheren Blut Mononukleären Zellen unabhänig von Zykloogygenase Aktivierung (Dooper et al. 2003 Immunology 110:348-57). Dies deutet auf eine Stärkung der Immunfunktion durch DGLA hin, die auch für Neugeborene von entscheidender Bedeutung ist. Darüber hinaus reduziert eine Erhöhung der Konzentration von DGLA und ARA in der Neugeborenennahrung das Risiko der HIV Virus Übertragung zwischen Mutter und Kind (Villamor et al. 2007 Am J Clin Nutr 86:682-689).
Es besteht somit ein Bedarf an Babynahrung, die dem Baby eine ausreichende Aufnahme von langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren erlaubt, um die optimale Entwicklung des Babys zu unterstützen.
Dieses technische Problem wird gelöst durch ein Pflanzensamenöl, umfassend Arachidonsäure mit einem Gehalt von ungefähr 7 bis ungefähr 26 Gewichtsprozent am Gesamtfettsäuregehalt, wobei das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 und das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Dihomo-Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 beträgt.
Im Unterschied zu bisher durchgeführten Versuchen zur Herstellung von Arachidonsäuren in transgenen Pflanzen, wie z.B. in WO2005/083093 oder Kajikawa et al. (Biosci. Biotechno. Biochem., 72, 70549-1-10, 2008), oder von Ölen aus Microorganismen, wie z.B. Ölen aus Mortierella alpina, weist das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl überraschende, neue Eigenschaften auf. Insbesondere weist das angeführte Pflanzensamenöl der Erfindung Mengenverhältnisse zwischen den Fettsäuren Arachidonsäure (ARA) und Gamma-Linolensäure (GLA) sowie Arachidonsäure und Dihomo-Gamma-Linolensäuren (DGLA)) auf wie sie auch in der Muttermilch vorliegen. In der Muttermilch beträgt das Verhältnis zwischen Arachidonsäure (ARA) und Gamma-Linolensäure (GLA) etwa 2:1 bis 4:1 und zwischen Arachidonsäure und Dihomo-Gamma-Linolensäuren (DGLA) etwa 1 :1 bis 2:1 (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8). Figur 7 gibt hierzu einen Überblick über die Fettsäureverhältnisse in der Muttermilch. In dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl liegt das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Gamma-Linolensäure bei ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 und das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Dihomo-Gamma-Linolensäure bei ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1.
Soweit nicht anderweitig angegeben, beziehen sich die hierin angeführten Verhältnisse auf die Verhältnisse der Gewichtsprozente der jeweiligen Fettsäuren.
Somit bietet das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl neben einem hohen Gehalt an Arachidonsäure mit ihrer physiologisch positiven Wirkung auch ein günstiges Verhältnis von Arachidonsäure zu GLA und Arachidonsäure zu DGLA. GLA und DGLA sind neben Arachidonsäure wichtige Komponenten der Fettfraktion von Muttermilch (Wang et al. Pediatrics International 2000, 42(1):14-20; Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8). Die jüngste Forschung zeigt zudem, dass die n-6-Fettsäuren des Säuglings bei der physiologischen Integration in die menschlichen Gewebelipide miteinander konkurrieren (Geppert et al. 2008, Br. J. Nutrition 99: 360-9). Deshalb ermöglicht erst ein ausgewogenes Verhältnis der Fettsäuren in der Säuglingsnahrung ein optimales Wachstum und eine optimale Entwicklung des Säuglings. Mit dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl konnte somit eine Zusammensetzung erhalten werden, die sehr nahe an der Fettsäurekomposition in der Muttermilch ist. Dieses der Muttermilch sehr nahe kommende Verhältnis von Arachidonsäure zu GLA und Arachidonsäure zu DGLA konnte durch die Herstellung von transgenen Pflanzen, die eine Acyl- CoA abhängige Delta-6 Desaturase exprimieren, erreicht werden. Diese Delta-6 Desaturase stammt aus Ostreococcus tauri. Erst die Verwendung dieses Enzyms in der spezifischen Promoter-Gen Kombination wie sie in den erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten vorliegt ermöglichte die Herstellung eines Pflanzensamenöls, das sich durch im Vergleich zum im Stand der Technik beschriebenen Öle erstmals durch niedrige Gehalte an Gamma-Linolensäure und Dihomo-Gamma-Linolensäure auszeichnet. Bekannte Delta 6-Desaturasen, wie zum Beispiel in WO2005/083093 verwendet und beschrieben, verwenden Linolsäure verestert an der sn-2 Position mit Phospholipiden, wie etwa Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, oder Phosphatidylglycol, als Substrat. Für die Delta 6-Desaturase aus Ostreococcus tauri konnte in Hefemodellstudien eine unterschiedliche Substratverwertung gezeigt werden, wie in WO2006/069710 beschrieben. Es wurden nun die weiter unten und den Beispielen beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte für die Transformation von Raps (Brassica napus) erstellt und transgene Raps-Pflanzen mit dieser Eigenschaft erzeugt. Überraschenderweise zeigen Samenöle dieser Pflanzen niedrige Gehalte an GLA und DGLA (Figur 3B und Tabelle 3), aus denen die folgende Syntheseabfolge abgeleitet werden kann: Die Delta 6-Desaturase verwendet Linolat-CoA als Substrat. Das Produkt Gamma- Linolat-CoA wird direkt von der Δ6-Elongase als Substrat in Dihomo-Gamma-Linolenat-CoA umgesetzt. Das Produkt der Elongationsreaktion wird durch Acyltransferasen in die sn2- Position von Phospholipiden überführt und durch die Delta 5-Desaturase in Arachidonsäure- Phosphatidylcholin, oder andere, oben beschriebene Phospholipide umgesetzt. Durch Acyltransferasen wird Arachidonsäure in Triacylglyceride (i.e. Öl) überführt und ist damit eine Komponente des Samenöls. Es konnte insbesondere gezeigt werden, dass die Zwischenprodukte der Synthese entsprechend der Promoter- und Genaktivität in ihrer Konzentration beeinflusst werden können. Die Erfindung identifiziert in den hier beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten Promoter-Gen-Kombinationen zur Herstellung von Pflanzensamenölen mit einer Fettsäurekomposition, die ähnlich der Muttermilch ist und sich deshalb vorteilhaft zur Produktion von Babynahrung eignet. Dies konnte erst mit den in den erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten der SEQ ID NOs. 15, 16 und 17 vorliegenden spezifischen Promoter-Gen-Kombinationen erreicht werden.
Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl kann in verschiedenen Konzentrationen für Säuglingsmilch oder andere Ernährungsprodukte für Säuglinge verwendet werden. Bei den hierin angegebenen Konzentrationen und Formulierungen verfügt das erfindungsgemäße
Pflanzensamenöl über ein Fettsäureprofil, das dem der Muttermilch näher kommt als sämtliche der früher verwendeten Produkte. Somit erlaubt das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl eine direkte Integration der hochgradig ungesättigten Fettsäuren in den Lipidanteil der Säuglingsnahrung, um die Ersatznahrung möglichst gut an die Muttermilch anzugleichen. Durch seinen günstigen Anteil an ARA, GLA und DGLA eignet sich das erfindungsgemäße
Pflanzensamenöl besonders für die Ernährung von Frühgeborenen und Babys bis zum Alter von etwa 2 Jahren, um eine gesunde Entwicklung, besonders von Nervensystem und Augen sowie des Immunsystems, des Frühgeborenen oder Babys zu gewährleisten. Durch Mischen oder Formulierung des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls mit einer limitierten Anzahl an pflanzlichen und nicht-pflanzlichen Ölen, wie mikrobiellen Ölen oder Fischölen, kann eine noch bessere Angleichung der Ersatznahrung an das Fettsäuremuster der Muttermilch erreicht werden. Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl hat außerdem ein Hintergrund- Fettsäureprofil, das dem von Raps- oder Canolaöl ähnelt, welches unter anderem für Säuglingsnahrung verwendet wird. Dadurch ist das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl als ARA Quelle besser geeignet als die zur Zeit am meisten verwendete ARA Quelle ARASCO®. Beispielsweise enthält ARASCO® der Humanmuttermilch weitgehend fremde Fettsäuren wie zum Beispiel C22:0, C24:0 und C22:5 n-6 in Konzentrationen bis 3% (Australia New Zeland Food Authority 2002, Proposal P93 - Review Of Infant Formula, Supplementary Final Assessment (Inquiry - S.24), Report, 08/02). Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl liegt bei diesen Fettsäuren deutlich unter ARASCO® und weist zudem grosse Mengen an C18:1 n-9 auf, welche die häufigste Fettsäure in der Muttermilch darstellt (Innis & King, Am J Clin Nutr 1999, 70:383-90). Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl zeichnet sich im Gegensatz zu den im Stand der Technik beschriebenen, herkömmlichen Ölen, wie mikrobielle Öle aus Mortierella alpina oder Crypthecodinium cohnii oder Fischöle aus Lachs, Wal oder Eidotter, dadurch aus, dass Arachidonsäure und Gamma-Linolensäure sowie Arachidonsäure und Dihomo-Gamma- Linolensäure erstmals in einem ausgewogeneren Verhältnis vorliegen, das dem der Muttermilch am nächsten kommt. Die Tabelle 4 in den folgenden Beispielen gibt eine exemplarische Übersicht über die angeführten Mengenverhältnisse der Fettsäuren im erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl im Vergleich zu Ölen aus verschiedenen Organismen, die entweder Arachidonsäure natürlicherweise produzieren oder in die Gene für den Stoffwechselweg übertragen wurden. So beträgt in dem in WO2005/083093 beschriebenen Samenöl aus
Brassica juncea das Verhältnis zwischen den Fettsäuren Arachidonsäure (ARA) und Gamma- Linolensäure (GLA) etwa 1 :1 und größer 1 :1 (d.h. mehr GLA als ARA), und zwischen Arachidonsäure und Dihomo-Gamma-Linolensäuren (DGLA) etwa 1 :5 und weniger (d.h. noch weniger DGLA als ARA als im Verhältnis 1 :5). In dem Öl aus Marchantia polymorpha beträgt das Verhältnis zwischen der Fettsäure Arachidonsäure (ARA) und Gamma-Linolensäure (GLA) etwa 1 :4 bis 1 :5 und zwischen Arachidonsäure und Dihomo-Gamma-Linolensäuren (DGLA) etwa 1 :10 und mehr (d.h. noch weniger DGLA als ARA als im Verhältnis 1 :10). In dem Öl aus Glycine max beträgt das Verhältnis zwischen der Fettsäure Arachidonsäure (ARA) und Gamma-Linolensäure (GLA) etwa 0,1 :1 bis 0,15:1 und zwischen Arachidonsäure und Dihomo- Gamma-Linolensäuren (DGLA) etwa 0,18:1 bis 0,2:1. Der Gehalt an Arachidonsäure in dem Öl aus Glycine liegt bei 2-3%, da die bisherigen Verfahren keine kommerziell nutzbaren Arachidonsäure-Gehalte liefern konnten. In dem Öl aus Mortierella alpina (Suntory TGA40) beträgt das Verhältnis zwischen der Fettsäure Arachidonsäure (ARA) und Gamma-Linolensäure (GLA) mehr als 10:1 und zwischen Arachidonsäure und Dihomo-Gamma-Linolensäuren (DGLA) ebenfalls mehr als 10:1.
In der Muttermilch beträgt dagegen das Verhältnis zwischen Arachidonsäure (ARA) und Gamma-Linolensäure (GLA) etwa 2:1 bis etwa 4:1 und zwischen Arachidonsäure und Dihomo- Gamma-Linolensäuren (DGLA) etwa 1 :1 bis etwa 2:1 (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8). In dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl liegt das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Gamma-Linolensäure bei ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 und das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Dihomo-Gamma-Linolensäure bei ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 und somit erstmals in den Bereichen, die auch in der Muttermilch vorhanden sind.
Die Erfindung betrifft also insbesondere ein Pflanzensamenöl umfassend Arachidonsäure mit einem Gehalt von ungefähr 7 bis ungefähr 26 oder 7 bis 26 Gewichtsprozent am Gesamtfettsäuregehalt, wobei das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 oder 1 :1 bis 5:1 und das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Dihomo-Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 oder 1 :1 bis 5:1 beträgt.
Der Arachidonsäuregehalt in dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl beträgt zwischen ungefähr 7 und ungefähr 26 Gewichtsprozent oder zwischen 7 und 26 Gewichtsprozent, vorzugsweise zwischen ungefähr 10 und ungefähr 26 Gewichtsprozent oder zwischen 10 und 26 Gewichtsprozent, noch mehr bevorzugt zwischen ungefähr 12 und ungefähr 26 Gewichtsprozent oder zwischen 12 und 26 Gewichtsprozent, oder zwischen ungefähr 15 und ungefähr 26 Gewichtsprozent oder zwischen 15 und 26 Gewichtsprozent, am Gesamtfettsäuregehalt. Besonders bevorzugt beträgt der Arachidonsäuregehalt in dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl 15 Gewichtsprozent am Gesamtfettsäuregehalt. Die Zusammensetzung eines solchen Öls ist weiter unten und in den Beispielen beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Pflanzensamenöls der Erfindung beträgt das Verhältnis der Gewichtsprozente von Linolsäure zu alpha-Linolensäure ungefähr 3:1 bis ungefähr 12:1 oder 3:1 bis 12:1 , vorzugsweise ungefähr 4:1 bis ungefähr 12:1 oder 4:1 bis 12:1 , noch mehr bevorzugt ungefähr 5:1 bis ungefähr 12:1 oder 5:1 bis 12:1 oder ungefähr 6:1 bis ungefähr 12:1 oder 6:1 bis 12:1.
Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl enthält wie die Muttermilch die essentiellen
Fettsäuren Linolsäure und Alpha-Linolensäure. Im Bezug auf das Verhältnis von Linolsäure zu alpha-Linolensäure ergänzt das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl die in Säuglingsnahrungsprodukten vorwiegend verwendeten Öle, wie Sojaöl oder Sonnenblumenöl. Die durch das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl ergänzten Säuglingsnahrungsprodukte kommen den Linolsäure zu Alpha-Linolensäure Verhältnissen die in der Muttermilch vorliegen sehr nahe. Hier beträgt das Verhältnis ca. 7:1 bis 18:1 (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 : 851-8).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Pflanzensamenöls der Erfindung beträgt das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Eicosapentaensäure ungefähr 3:1 bis ungefähr 7:1 oder 3:1 bis 7:1 , vorzugsweise ungefähr 4:1 bis ungefähr 7:1 oder 4:1 bis 7:1 und noch mehr bevorzugt ungefähr 5:1 bis ungefähr 7:1 oder 5:1 bis 7:1 , und spiegelt auch hier das in der Muttermilch vorliegende Verhältnis ARA:EPA von ca. 2:1 bis ca. 7:1 wieder (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 : 851-8).
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Pflanzensamenöl der Erfindung auch die
Fettsäure Stearidonsäure. Bevorzugt liegt Stearidonsäure mit einem Gehalt von ungefähr 0,1 bis ungefähr 1 oder 0,1 bis 1 Gewichtsprozent am Gesamtfettsäuregehalt (besonders wenn in der Säuglingsnahrung verwendet), vorzugsweise von ungefähr 0,3 bis ungefähr 1 oder 0,3 bis 1 Gewichtsprozent, oder ungefähr 0,4 bis ungefähr 1 oder 0,4 bis 1 Gewichtsprozent, besonders bevorzugt von ungefähr 0,5 bis ungefähr 1 oder 0,5 bis 1 Gewichtsprozent vor.
Für die Messungen der Ölspezifikationen gelten immer Variatonsbereiche, die auf der individuellen Organismenentwicklung, dem Aufschluss- und Extraktionsverfahren und der Gerätemessgenauigkeit basieren. Es wurden die hierin angegebenen Verhältnisse aus diesem Grund mit den Begriffen „ungefähr", „ca.", oder „etwa" angeführt.
Dihomo-Gamma-Linolensäure, ARA und EPA sind Vorstufen der biologisch aktiven Eicosanoide (Das 2008 Lipids Health Dis. 7:9). Dies ist von besonderer Bedeutung für Frühgeborene und Neugeborene, deren Stoffwechsel noch nicht genügend ausgereift ist. ARA und DHA sind wichtige Komponenten von spezifischen Membranphospholipiden und für die Entwicklung des Nervensystems, der Retina und Sehfunktionen von großer Bedeutung. SDA, ARA, EPA und DHA sind in der Muttermilch enthalten und daher wesentliche Bestandteile von Frühgeborenen- und Säuglingsanfangsnahrungen (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8). Somit weist das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl nicht nur erstmals einen hohen Gehalt an ARA und ein ausgewogeneres Verhältnis von ARA zu GLA und DGLA auf als alle bisher im Stand der Technik beschriebenen Öle. Es enthält mit den essentiellen Fettsäuren Linolsäure und Alpha-Linolensäure sowie den hochgradig ungesättigten Fettsäuren SDA und EPA weitere Komponenten, die auch in der Muttermilch vorkommen. DHA kann beispielsweise durch Mischen mit anderen Ölen zugefügt werden, wie im folgenden genauer beschrieben. Das Hintergrund-Fettsäureprofil des erfindungsgemäßen Öls kommt somit sehr nahe an die Fettsäurekomposition der Muttermilch.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Pflanzensamenöl aus einer transgenen Pflanze gewonnen.
Unter dem Begriff „transgen" ist zu verstehen, dass ein heterologes Polynucleotid, also ein in der jeweiligen Pflanze nicht natürlicherweise vorkommendes Polynucleotid, in die Pflanze eingebracht wird. Dies kann entweder durch zufällige Insertion des Polynucleotids oder durch homologe Rekombination erreicht werden. Selbstverständlich kann statt des Polynucleotids auch ein Vektor eingebracht werden. Verfahren zum Einbringen von Polynukleotiden oder Vektoren zwecks zufälliger Insertion oder homologer Rekombination sind im Stand der Technik bekannt und auch nachfolgend genauer beschrieben. Wirtszellen, die das Polynucleotid oder den Vektor enthalten, können ebenfalls in einen Pflanze eingebracht werden und so eine transgene Pflanze erzeugen. Bei einer solchen Pflanze handelt es sich dann aber um eine chimäre Pflanze bei der lediglich die Zellen, die sich von den eingebrachten Zellen ableiten, transgen sind, d.h. das heterologe Polynucleotid umfassen. Bevorzugt wird in die transgene Pflanze ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt wie in den SEQ ID NOs. 15, 16 oder 17 gezeigt eingebracht.
Bevorzugt sind die transgenen Pflanzen Öl-produzierende Pflanzen, das heißt solche, die für die Herstellung von Ölen verwendet werden.
Als transgene Pflanzen können grundsätzlich alle Pflanzen verwendet werden, d.h. sowohl zweikeimblättrige als auch einkeimblättrige Pflanzen. Vorzugsweise handelt es sich um Ölfruchtpflanzen, die große Mengen an Lipidverbindungen enthalten, wie Raps, Canola, Färberdistel (Saflor, Carthamus tinctoria), Lein oder aber Feldfrüchte, wie Mais.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl in trangenem Raps, transgenem Soja, transgenem Lein, transgener Färberdistel oder transgenem Mais hergestellt, die mit einem Nukleinsäurekonstrukt wie in den SEQ ID NOs. 15, 16 oder 17 gezeigt transformiert sind. Ganz besonders bevorzugt ist die transgene Pflanze trangener Raps.
Tabelle 1 in den folgenden Beispielen zeigt die vorzugsweise verwendeten Gene zur Synthese von ARA mit der bevorzugten Fettsäurekomposition.
Die Erfindung betrifft auch die Nukleinsäurekonstrukte wie in den SEQ ID NOs. 15, 16 und 17 gezeigt sowie transgene Pflanzen, die mit diesen Nukleinsäurekonstrukten transformiert sind und deren Nachkommen, die das Nukleinsäurekonstrukt stabil im Genom integriert haben.
Falls ein Pflanzensamenöl mit DHA hergestellt werden soll, enthalten die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte zusätzlich zu den oben angeführten Genen geeignete Promoter-Gen- Terminator-Kassetten, die vorzugsweise die für die Delta 5-Elongase kodierende DNA aus Ostreococcus tauri wie in SEQ ID NO. 18 gezeigt und oder die für die Delta 4-Desaturase kodierende DNA aus Traustochytrium ssp. wie in SEQ ID NO. 20 dargestellt enthalten. Die erwähnten DNAs und geeignete Kassetten sind z.B. in WO2005/083093 beschrieben.
Die Erfindung betrifft zudem ein Pflanzensamenöl umfassend ein Fettsäurespektrum enthaltend Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Gamma-Linolensäure, Alpha-Linolensäure, Stearidonsäure, Dihomo-Gamma-Linolensäure, Arachidonsäure und Eicosapentaensäure. Ein solches Fettsäurespektrum ist in beispielsweise Figur 3B gezeigt.
Noch mehr bevorzugt umfasst das Pflanzensamenöl der Erfindung ungefähr 3,2-5,3% Palmitinsäure, ungefähr 2,2-5,3% Stearinsäure, ungefähr 10-25% Ölsäure, ungefähr 22-36% Linolsäure, ungefähr 4-12% Gamma-Linolensäure, ungefähr 3-8% Alpha-Linolensäure, ungefähr 0,2-1 % Stearidonsäure, ungefähr 3-9% Dihomo-Gamma-Linolensäure, ungefähr 12- 25% Arachidonsäure und ungefähr 1-4% Eicosapentaensäure bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt; oder das Pflanzensamenöl der Erfindung umfasst 3,2-5,3% Palmitinsäure, 2,2-5,3% Stearinsäure, 10-25% Ölsäure, 22-36% Linolsäure, 4-12% Gamma- Linolensäure, 3-8% Alpha-Linolensäure, 0,2-1 % Stearidonsäure, 3-9% Dihomo-Gamma- Linolensäure, 12-25% Arachidonsäure und 1-4% Eicosapentaensäure bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt.
Besonders bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl die für die Säuglingsernährung wichtigen Fettsäuren in folgenden Gewichtsprozenten (Masse der Fettsäuren in Prozent vom Gesamtfettsäuregehalt)
Zielfettsäure %
Arachidonsäure (20:4 n-6) ca. 15
Essentielle Fettsäuren:
Linolsäure (18:2 n-6) ca. 20-25 Alpha-Linolensäure (18:3 n-3) ca. 3-7 Zusätzliche für den Säugling wertvolle Fettsäuren:
Gamma-Linolensäure (GLA) (18:3 n-6) ca. 6-1 1
Dihomo-Gamma-Linolensäure (DGLA)(20:3 n-6) ca. 4-8
Stearidonsäure (SDA) ca. 1-2 Eicosapentaensäure (EPA) ca. 2-4;
oder
Zielfettsäure % Arachidonsäure (20:4 n-6) 15
Essentielle Fettsäuren:
Linolsäure (18:2 n-6) 20-25
Alpha-Linolensäure (18:3 n-3) 3-7
Zusätzliche für den Säugling wertvolle Fettsäuren:
Gamma-Linolensäure (GLA) (18:3 n-6) 6-1 1
Dihomo-Gamma-Linolensäure (DGLA)(20:3 n-6) 4-8
Stearidonsäure (SDA) 1-2 Eicosapentaensäure (EPA) 2-4.
Die Erfindung betrifft des weiteren eine Formulierung oder ein Mischöl, umfassend ein erfindungsgemäßes Pflanzensamenöl und mindestens ein weiteres Öl ausgewählt aus der Gruppe Pflanzenöl, mikrobielles Öl und Fischöl, wobei das Pflanzenöl, mikrobielle Öl oder Fischöl Docosahexaensäure enthält.
Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl kann mit einem oder mehreren Ölen gemischt werden, um beispielsweise den Gehalt einer oder mehrerer Fettsäuren zu verändern, d.h. zur erhöhen oder zu verringern. Das beigemischte Öl kann etwa ein weiteres natürlich vorkommendes oder transgenes Pflanzenöl oder Pflanzensamenöl sein. Als Beispiel kann Leinöl genannt werden, welches einen hohen Anteil an Alpha Linolensäure aufweist. Es kann auch ein mikrobielles Öl, zum Beispiel ein Öl aus Mortierella alpina oder aus Crypthecodinium cohnii, sein. Besonders geeignet sind hierbei DHASCO®- (DHA, Crypthecodinium cohnii) und ARASCO®- (ARA, Mortierella alpina) Ölmischungen, die zum Beispiel in Säuglingsnahrungen verwendet werden. Durch die Beimischung von DHASCO®- (DHA, Crypthecodinium cohnii) zu dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl kann beispielsweise die Fettsäure DHA eingebracht werden. Es eignen sich aber auch Fischöle zur Formulierung des Pflanzensamenöls der Erfindung, zum Beispiel Lachsöl, Heringsöl, Makrelenöl, Thunfischöl oder Dorschöl (United States Department of Agriculture 2005, „Nutrition and Your Health: Dietary Guidelines for Americans" EPA and DHA Content of Fish Species, Data From NDB SR 16-1 ; siehe auch z.B. GRAS Notifications 94, 109 and 193), um etwa die Komposition der Fettsäuren in dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl zu verändern. Fischöle zeichnen sich unter anderem durch einen hohen Gehalt an langkettigen, mehrfach ungesättigten Omega-3 Fettsäuren aus. Das Pflanzensamenöl der Erfindung kann mit nur einem weiteren Öl gemischt werden, aber auch mit zwei, drei oder noch mehr Ölen. Das eine Öl oder die weiteren beigemischten Öle können dabei aus dem gleichen Organismus stammen oder aus verschiedenen Orgsanismen. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl mit einem mikrobiellen Öl, z.B. einem Öl aus Mortierella alpina oder aus Crypthecodinium cohnii oder Schizochytrium sp. (Arterburn et al. 2007_Lipids 42-101 1-24), und/oder einem Fischöl (etwa Lachsöl oder Tunfischöl) formuliert werden. Formulierungen von Pflanzensamenölen sind im Stand der Technik beschrieben. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl auch mit dem BASF Pulver Produkt Nummer 30056967, „Dry n-3® 5:25 C Powder Microencapsulated fish oil rieh in DHA for Infant formula" in einer Säuglingsnahrung verarbeitet werden. Alternativ kann als Quelle für DHA auch DHASCO® (docosahexaenoie aeid-rich single-cell oil) wie in der GRAS Notice No. GRN 000041 beschrieben angewandt werden. Dabei kann das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl ähnlich dem o.a. BASF Produkt zunächst in ein mikroenkapsuliertes Pulver überführt werden oder direkt als prozessiertes und stabilisiertes Pflanzensamenöl angewandt werden. Beide dieser Pulver oder Öle können dann gemischt oder einzeln in den gewünschten Mengen dem Säuglingsnahrungsprodukt zugegeben werden. Die Zugabe geschieht gegen Ende der Produktion des Säuglingsnahrungsproduktes unter Schutzmassnahmen vor Oxidation. Bevorzugte Konzentrationen zu welchen die Produkte der Säuglingsnahrung zugegeben werden hängen von verschiedenen Faktoren ab. Eine bevorzugte Menge der Zugabe des erfindungsgemäße Pflanzensamenöls bezogen auf das Endprodukt ist jene Menge des Öls welche eine Konzentration von bis zu 1 g ARA/100 g des Gesamtfettes im Säuglingsnahrungsprodukt ergibt. Eine bevorzugte Menge der Zugabe des BASF Produkts Nummer 30056967 oder des DHASCO® Öls bezogen auf das Endprodukt ist jene Menge des Pulver oder Öls welche eine Konzentration von bis zu 1 g DHA/100 g des Gesamtfettes im Säuglingsnahrungsprodukt ergibt. Die bevorzugten Mengen des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls und des BASF Produkts Nummer 30056967 oder des DHASCO Öls können abhängen unter anderem von der nationalen Gesetzeslage der einzelnen Länder in denen das Säuglingsnahrungsprodukt vertrieben wird, von den Herstellerproduktwünschen und von den Kundenwünschen.
Die Erfindung stellt zudem Nahrungsmittel, zur Verfügung welches ein erfindungsgemäßes Pflanzensamenöl umfasst.
Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl kann zum Beispiel direkt als kaltgepresstes Öl, z.B. als Salatöl verwendet werden. Es kann beispielsweise auch in Milch oder Milchprodukten wie Käse oder Joghurt verwendet werden. Es kann aber auch Margarine, oder Brot oder Backwaren zugesetzt werden. Schließlich eignet es sich generell als Nahrungsergänzungsmittel (Supplement). Hierunter sind Produkte zur erhöhten Versorgung des menschlichen Stoffwechsels mit bestimmten Nähr- oder Wirkstoffen im Grenzbereich zwischen Arzneimitteln und Lebensmitteln zu verstehen. Rechtlich ist diese Produktgruppe der Nahrungsergänzungsmittel im EU-Recht durch die Richtlinie 2002/46/EG geregelt. Dabei sind insbesondere die zulässigen Mineralstoffe und Vitamine vorgegeben. In der hierauf basierenden Nahrungsergänzungsmittel-Verordnung ist ein Nahrungsergänzungsmittel:„ein Lebensmittel, das dazu bestimmt ist, die allgemeine Ernährung zu ergänzen, ein Konzentrat von Nährstoffen oder sonstigen Stoffen mit ernährungsspezifischer oder physiologischer Wirkung allein oder in Zusammensetzung darstellt und in dosierter Form, insbesondere in Form von Kapseln, Pastillen, Tabletten, Pillen, Brausetabletten und anderen ähnlichen Darreichungsformen, Pulverbeutel, Flüssigampullen, Flaschen mit Tropfeinsätzen und ähnlichen Darreichungsformen von Flüssigkeiten und Pulvern zur Aufnahme in abgemessenen kleinen Mengen in den Verkehr gebracht wird." Da sie rechtlich zu den Lebensmitteln gehören, fallen sie in Deutschland unter die Regelungen des Lebensmittel- und Futtergesetzbuchs (LFGB). Die erlaubten Inhaltsstoffe sind in Anhang 1 der Nahrungsergänzungsmittelverordnung (NemV) aufgeführt.
Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl kann hierbei allein oder in Kombination mit einem Öl oder weiteren Ölen wie zum Beispiel mikrobiellem Öl, etwa aus Mortierella alpina oder Crypthecodinium cohnii oder Fischöl zur Nahrungsergänzung verwendet werden. Es können auch Tocopherole z.B. Vitamin E und Tocotrienole und Ascorbyl Palmitat oder Pflanzenextrakte wie zum Beispiel Rosemarin und Pflanzensterole, oder Carotenoide wie zum Beispiel Lutein, Zeaxanthin, Astaxanthin und Lykopen, oder Koenzyme wie zum Beispiel Koenyzm Q zugesetzt werden. Geeignete Verabreichungsformen sind hierbei Kapseln, Pastillen, Tabletten, Pillen, Brausetabletten und andere ähnliche Darreichungsformen, Pulverbeutel, Flüssigampullen, Flaschen mit Tropfeinsätzen und ähnlichen Darreichungsformen von Flüssigkeiten und Pulvern zur Aufnahme des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls in abgemessenen kleinen Mengen. Die Dosierung der Fettsäuren zur Nahrungsergänzung ist im Stand der Technik hinlänglich beschrieben.
Die Erfindung betrifft hierbei bevorzugt Babynahrung, welche das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl umfasst.
Wenn nicht gestillt wird, dient Babynahrung in den ersten Lebensmonaten nach der Geburt der ausschließlichen Ernährung. Der Begriff „Babynahrung" wie hier verwendet umfasst zum Beispiel Frühgeborenennahrung, Säuglingsanfangsnahrung, Säuglingsnahrung, oder Kleinkindernahrung. Frühgeborennahrung bedeutet dabei Nahrung für Neugeborene, die vor dem errechneten Geburtstermin zur Welt kommen. Säuglingsanfangsnahrungen sind Lebensmittel, die für die besondere Ernährung von Säuglingen während der ersten vier bis sechs Monate nach der Geburt (also von Geburt bis zum Alter von vier bis sechs Monaten) bestimmt sind und für sich allein den Ernährungserfordernissen dieser Personengruppe entsprechen. Unter Säuglingsnahrung ist Nahrung für Säuglinge zu verstehen, wobei mit
Säuglingen Kleinkinder bis zu etwa zwölf Monaten gemeint sind (Geburt bis zum Alter von 12 Monaten). Unter Kleinkindernahrung wird Nahrung verstanden, die Kleinkindern bis zum Alter von etwa vierundzwanzig Monaten (Geburt bis 24 Monate) verabreicht wird. Die LC-PUFA- Gehalte für solche Anwendungen in der Ernährung von Babies oder Kleinkindern im Alter von ca. 4-6 Monaten bis 24 Monaten liegen im gleichen Bereich wie für
Säuglingsanfangsnahrungen bezogen auf den Fettgehalt der Nahrung. Die Zusammensetzung einer exemplarischen Säuglingsnahrung die das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl enthält ist in den folgenden Beispielen gezeigt. Die erfindungsgemäßen Pflanzensamenöle können beispielsweise in der Mutterersatzmilch, in der Folgemilch (zum Beispiel nach dem Absetzen des Säuglings von der Mutterbrust) oder als Beikost eingesetzt werden, etwa als Zusatz von Babybrei, Gläschenkost, rekonstituierte Trockennahrung, Milch und Milchersatzgetränke, Saft und andere Warm- oder Kaltgetränke und Diätnahrungsmittel. Die Pflanzensamenöle der Erfindung finden aber auch Anwendungen in der Ernährung von schwangeren Müttern sowie stillenden Müttern, da die LC-PUFAs in die Muttermilch gelangen können. Zudem können sie auch für Nachrungsergänzungszwecke für Kinder im Alter bis 24 Monate, aber auch für ältere Kinder und Erwachsene benutzt werden. Nahrungsergänzungen können in jeglicher Form verabreicht werden beispielsweise in Form von Milch, Saft, Brei, Sirup, Süssigkeit, fermentiertem Produkt, Pillen, Kapseln, oder Dragees.
Babynahrung oder Säuglingsnahrung wie hierin verwendet ist als Oberbegriff für alle Lebensmittel zu verstehen, die für die Ernährung von Säuglingen oder Kleinkindern bis zu 24 Monaten besonders geeignet sind. Dazu gehört auch Muttermilch. Industrielle Babyfertignahrung wird in der Regel ohne Salz, Gewürze, Zucker und meistens auch ohne Färb- und Konservierungsstoffe hergestellt. Unterschieden wird hierbei lebensmittelrechtlich zwischen Säuglingsanfangsnahrung, Folgenahrung und Beikost (Lebensmittel-Lexikon Dr. Oetker, 4. Aufl. 2004, Artikel Säuglingsnahrung).
Hierbei kann unterschieden werden zwischen:
Säuglingsanfangsnahrung (0 bis 6 Monate)
Als Säuglingsanfangsnahrung werden lebensmittelrechtlich alle Lebensmittel und Produkte bezeichnet, die speziell für die Ernährung in den ersten sechs Lebensmonaten bestimmt sind und alle Nährstoffe enthalten, die der Säugling benötigt. Für die Zubereitung der Fertigprodukte wird in manchen Fällen noch Wasser hinzugefügt.
Folgenahrung (4 bis 24 Monate)
Folgenahrung für Säuglinge sind im Lebensmittelrecht alle Lebensmittel und Produkte, die speziell für Säuglinge etwa ab dem vierten Monat bestimmt sind und wie die Anfangsnahrung eine flüssige Konsistenz haben, aber mehr Kohlehydrate in Form von Stärke enthalten.
Beikost (4 bis 24 Monate)
Als Beikost werden alle Lebensmittel und Zubereitungen bezeichnet, die für Säuglinge als Ergänzung der Milchnahrung dienen, um die Umstellung auf feste Nahrung vorzubereiten.
Spezialnahrung (0 bis 24 Monate)
Für Babys und Kleinkinder von Allergikern die eine erhöhte erbliche Allergieneigung haben. Da bei Babys die Darmschleimhaut noch durchlässig ist und artfremdes Eiweiß, zum Beispiel aus Kuhmilch, eine Lebensmittelallergie auslösen kann, gibt es auf dem Markt so genannte hypoallergene Säuglingsnahrung. Auch sie sollte mit ARA ergänzt werden.
Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl eignet sich neben den oben angeführten Anwendungen auch als Komplettnahrung. Unter Komplettnahrung ist hierbei eine Nahrung zu verstehen, die den kompletten Ernährungsbedarf eines tierischen oder menschlichen Individuums (z.B. eines Babys) abdeckt, so dass ein gesundes Wachstum optimal gewährleistet ist. Eine Komplettnahrung, der das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl zugesetzt ist, enthält Arachidonsäure (ARA) in ähnlichen Konzentrationen wie die Muttermilch. Die Komplettnahrung enthält auch Gamma-Linolensäure (GLA), Dihomo-Gamma-Linolensäure (DGLA), Stearidonsäure (SDA) und Eicosapentaensäure (EPA), sowie optional DHA, in ähnlichen Konzentrationen wie die Muttermilch. Sie eignet sich deshalb ganz besonders gut zur Herstellung von Babynahrung. Die oben angeführte Komplettnahrung kann zum Beispiel Säuglingsmilch, Folgemilch, Getränk fürs Kleinkind, Fruchtsaft, Breiprodukte, Milch, Joghurt oder fermentierte Produkte sein. Sie ist für die Ernährung von Säuglingen und Kindern bestimmt, um ihr normales Wachstum und ihre Entwicklung zu unterstützen. Beim Komplettprodukt kann es sich auch um feste Babynahrung, Süßigkeiten, Kekse oder Gelatineprodukte handeln. Der ARA-Gehalt in der Säuglingsnahrung wie in den Beispielen gezeigt wurde der
Gesamtmenge an ARA angeglichen, die in der Muttermilch während der ersten 0-12 Monate der Laktation gefunden wurde. Ein zusätzlicher Vorteil besteht darin, dass wenn das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl verwendet wird, um die Säuglingsmilch mit ARA zu ergänzen, somit auch die Werte für die GLA, DGLA und SDA im Bereich der Konzentrationen wie in der Muttermilch liegen. Das liegt daran, dass das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl die drei hochgradig ungesättigten Fettsäuren nahezu in den Anteilen enthält, die auch in der Muttermilch gefunden wurden. Wird also das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl als Bestandteil der Babynahrung verwendet, um die ARA-Konzentration anzugleichen, dann werden die GLA und die DGLA in den richtigen Konzentrationen mitgeliefert, um die entsprechenden Nährstoffe für die speziellen Baby- und Kindernahrungen bereit zu stellen. In diesem Fall ist keine Veränderung des Öls wie etwa das Zumischen von beispielsweise weiteren GLA-, DGLA- und SDA- haltigen Ölen notwendig.
Babynahrungen sind in Europa den diätetischen Lebensmitteln zugeordnet (siehe z.B. "Directive 91/321/EC") Die Qualitätsanforderungen an Säuglings- und Babynahrung sind deshalb sehr hoch und weltweit streng geregelt. Europa orientiert sich hierbei an der EG- Richtlinie 91/321/EG und dem Codex Alimentarius Alinorm 03/26a, welche innerhalb der EG inzwischen in nationales Recht umgesetzt wurden. Als wichtige neue europäische Richtlinien und Direktiven sind der Codex Alimentarius: International Code of Hygienic Practice for Foods for Infants and Children (2004), die VO 852/2004/EG Lebensmittelhygienegesetz , Anlage Il (GHP,GMP)(Novellierung des Hygienerechts in Deutschland, 29.04.2004), sowie die VO 178/2002/EG: Festlegung der allgemeinen Grundsätze und Anforderungen des Lebensmittelrechts, zur Festlegung von Verfahren zur Lebensmittelsicherheit. 28.02.2002 (Chain Control, Rückverfolgbarkeit von Rohstoffen) zu nennen. Auch Osteuropa orientiert sich an den EG-Richtlinien und hat nationale sehr strenge gesetzliche Vorschriften. Asien und
Australien: richten sich am WHO/FAO-Code, Codex Alimentarius und den FDA Regularien der USA aus. Die FDA Regularien der USA decken sich weitgehend mit WHO-Code und Codex Alimentarius. Die nationalen Gesetzgebungen in Süd- und Mittelamerika orientieren sich an der US-Regulation, dem WHO-Code und Codex Alimentarius.
Wichtige gesetzliche Regelungen in Deutschland sind in der Diät-Verodnung (VO), in den §§ 14, 14b, 14c, 14d, 22a, 22b (Deutschland) angeführt. Die EG Verodnung (VO) 683/2004/EG betrifft Aflatoxine und Mykotoxine in Säuglings- und Kleinkindernahrungen. Die VO
1830/2003/EG regelt die Rückverfolgbarkeit von genetisch modifizierten Organismen (GMO) und von aus GMO Organismen hergestellten Lebensmitteln (22.09.2003). Die Höchstmengen- VO betrifft hierbei Rückstände von Pflanzenschutzmitteln odeer Schädlingsbekämpfungsmitteln (05.1 1.2003). Die VO 2377/90/EG betrifft die Festsetzung von Höchstmengen für Tierarzneimittelrückständen in Nahrungsmitteln tierischen Ursprungs (30.12.2000). Die Schadstoff-VO betrifft beispielsweise den maximal zulässigen Dioxin- und PCB-Gehalt.
Babynahrungen können beispielweise in Pulverform hergestellt werden. Hierzu werden sie zum Beispiel sprühgetrocknet, instantisiert, und agglomeriert. Die Verpackung erfolgt in Weißblechdosen (mit Stickstoff/Kohlendioxid begast) oder Aluminiumverbundfolienbeuteln (begast, nicht begast). Babynahrungen können aber auch in in flüssiger und emulgierter Form hergestellt werden. Hierzu werden sie zum Beispiel terminalsterilisiert in Glasflaschen oder Dosen abgefüllt. Weiter praktiziert kann auch eine aseptische Abfüllung in Glas (Brikpak) oder eine Abfüllung des terminalsterilisierten Konzentrates in Dosen werden.
Als Rohstoffe zur Herstellung von Babynahrung können beispielsweise die folgenden Komponenten verwendet werden:
Kuhmilch, Ziegenmilch (z.B. China, Australien), Casein/Caseinate, entmineralisiert.es Molkenpulver, Aminosäuren, Taurin, Carnitin; Pflanzenöle (Palmöl, Sojaöl, Sonnenblumenöl, hoch ölsäurehaltiges Sonnenblumenöl, Distelöl, Kokosöl, Rapsöl), Milchfett, Fischöle
(Thunfischöl, Dorschleberöl, Krillöl), Eilipide (Ovothin), ARASCO®, DHASCO®; Kohlenhydrate (Laktose, Maltodextrin, Stärke), andere Zuckerarten, Oligosaccharide (Prebiotika), Bakterienkulturen (Probiotika); Vitamine, Cholin, myo-lnositol; Mineralstoffe (Ca, Na, K, Mg, P, Cl), Spurenelemente (Fe, Zn, Cu, Mn, Cr, Se, F, J), Nucleotide.
Bei den wichtigsten Herstellverfahren erfolgt die Herstellung der Babynahrung durch Sprühtrocknung von fetthaltigen Halbfabrikaten und dem Nachmischen von Kohlenhydraten, Vitaminen und Mikronutrients. Die Herstellung der Babynahrung kann aber auch durch das Einarbeiten von LC-PUFAs in die Fettphase und dem Versprühen mit den Protein- und Kohlenhydratkomponenten zu einem Halbfabrikat erfolgen.
Figur 5 zeigt exemplarisch die Herstellung von Säuglingsnahrung in flüssiger Form, während Figur 6 ein Beispiel für die Herstellung von Säuglingsnahrung durch Komplettsprühung gibt.
Eine Stabilisierung der LC-PUFAs in dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl kann hierbei beispielsweise durch den Zusatz von Tocopherolen und Tocotrenolen erreicht werden. Der Zusatz von Tokopherolen, Ascorbylpamitat und Natriumascorbat führt zum Schutz der LC- PUFAs und zur Verbesserung der Haltbarkeit, indem die Produktstabilität erhöht und das Ranziditätsrisiko verringert wird. Hiebei sei auf die ESPGHAN Empfehlung verwiesen, die den Vitamin E-Gehalt in Säuglingsnahrungen beleuchtet (J. Ped. Gastroenterology and Nutrition 26, S. 351-352, 1996). Weitere Zusätze zur Stabilisierung der LC-PUFAs können Pflanzenextrakte wie zum Beispiel Rosemarin und Pflanzensterole, oder Carotenoide wie zum Beispiel Lutein, Zeaxanthin, Astaxanthin und Lykopen, oder Koenzyme wie zum Beispiel verschiedene Formen von Koenyzm Q sein. Bei der Verwendung stabilisierender Zusätze sind regionale und nationale gesetzliche Bestimmungen zu beachten.
Um die in dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl enthaltenen LC-PUFA in Pulverform oder Ölform für die Produktion von Babynahrung bereitzustellen eignen sich beispielsweise die folgenden Technologien. Für die Pulverform können einfache Trockenmischsysteme (z.B. Lödigemischer) zum Vermischen mit pulverförmigen Rohstoffen und Halbfabrikaten zum Endprodukt verwendet werden. Für die Ölform (z.B. verpackt in begasten Containern) erfolgt die Einarbeitung in Fettmischungen zusammen mit Emulgatoren und Antioxydantien. Es folgt dann die Herstellung einer Emulsion mit der Wasserphase und die Trocknung zu einem Halbfabrikat (Sprühtrocknung). Das Halbfabrikat wird dann mit den restlichen Rezepturkomponenten trocken zum Endprodukt gemischt. Alternativ erfolgt die Herstellung einer Spezialfettmischung zusammen mit LC-PUFAs und die weitere Verarbeitung wie oben für die Ölform beschrieben.
Für den Einsatz von LC-PUFAs in Pulverform bei der Herstellung von Babynahrung spricht die einfache Handhabung und die sichere Dosierung. Als Nachteil ist anzuführen, dass der Gehalt an LC-PUFAs nur ca. 25% und der Anteil an Mikroverkapselungsubstanzen ca. 75% beträgt. An grosseren Ölbeladungen wird derzeit gearbeitet und Beladungen von weit über 50% Öl erscheinen kommerziell möglich. Bei einem Einsatz von 1 % LCPUFA/100 g Produkt sind 4% Pulver (= 3 g Trägersubstanz/100 g) notwendig. Der Anteil der Trägerstoffe ist erheblich und bei der Rezeptur (vor allem bei Frühgeborenennahrungen) zu berücksichtigen. Als Trägerstoffe können zum Beispiel Gelatine, Saccharose, Stärke, Caseinat, Lecithin,Tricalciumphosphat, Vitamin C, Vitamin E, oder Natriumascorbat verwendet werden. Ein weiterer Nachteil ist in der fehlenden Homogenisierung (Fettkügelchengröße > 1 μm) zu sehen. Auch kann freies Öl auf der Partikeloberfläche (durch Diffusion und unvollständige Verkapselung) zu Ranzidität führen. Der Einsatz von LCPUFAs in Ölform bei der Herstellung von Babynahrung bringt als Vorteil eine einfache Verarbeitung zusammen mit der Fettmischung mit sich, die zu einer homogenen Verteilung führt. Auch können in der Ölform Stabilisatoren ihre Wirkung besser entfalten. Die Homogenisierung führt zu einer vollständigen Lösung der LCPUFA in der Fettphase der
Nahrung. Ein weiterer Vorteil ist in dem Fehlen von Begleitstoffen sowie einer guten Haltbarkeit des Endproduktes zu sehen. Schliesslich bringt die Ölform auch keine mikrobiologischen Probleme mit sich, da das Produkt in der Flüssigphase vor dem Trocknen erhitzt wird. Als Nachteil ist zu nennen dass die Viskosität zu erhöhtem Aufwand bei der Verarbeitung führen kann. Die Prozessführung kann bei der Sprühtrocknung und nachfolgenden Bearbeitung des Pulvers auch zu erhöhter Oxydation führen. Das sprühgetrocknete Halbfabrikat (mit LCPUFA) sollte nicht länger als 3-4 Wochen unbegast zwischengelagert werden. Es ist deshalb eine möglichst rasche weitere Verarbeitung zum Endprodukt und Abpackung in Dosen unter Schutzgas (Stickstoff/Kohlendioxyd) wünschenwert.
Da das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl schon in Ölform vorliegt, ist es zur Herstellung von Säuglingsnahrungen besonders geeignet. Die Verwendung von LCPUFA in Ölform ist kostengünstiger und vorteilhafter, vor allem bei Produkten mit hohem Produktionsvolumen. Die Figur 6 zeigt die Verarbeitung des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls an einem Beispiel der Komplettsprühung, welche zu einem trockenen Endprodukt führt, und die Figur 5 an einem Beispiel der Herstellung eines flüssigen Babynahrungsproduktes.
Anspruch: Die Erfindung betrifft zudem ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls, umfassend die Schritte: a) Herstellung einer transgenen Pflanze durch Transformation mit dem Nukleinsäurekonstrukt wie in den SEQ ID NOs. 15, 16 oder 17 gezeigt b) Kultivierung der transgenen Pflanze aus Schritt a) unter Bedingungen, die die Biosynthese des Pflanzensamenöls erlauben c) Ernten der Pflanzensamen, Extraktion und Raffination des Pflanzensamenöls.
Nach der Ernte und Reinigung der Samen werden die gewonnenen Samen zur Gewinnung des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöles prozessiert. Die Prozessierung beginnt mit der Pressung der Samen, gefolgt von einer Extraktion und einer anschließenden Raffination des Öls und einer Stabilisierung. Bevorzugt werden die Samen kalt gepresst und anschließend Vakuum filtriert. Dieser Prozess findet vorzugsweise unter innerter Atmosphäre, bevorzugt unter Stickstoff, statt. Etwa die Hälfte des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöles wird durch diesen Prozess gewonnen.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Extraktion des Pflanzensamenöls in Schritt c) eine Hexan Extraktion.
Die anschließende Extraktion des aus der Pressung zurückbleibenden Pressrückstandes mit Lösungsmittel, vorzugsweise Hexan, erreicht eine Ausbeute des Öls von über 90%.
Verschiedene Verfahren eignen sich für die Extraktion von Speiseölen, wie zum Beispiel kontinuierliche Verfahren mittels Hexan (Belitz & Grosch, 1999 „Edible Fats and OiIs" In: Food Chemistry, 2nd ed. Springer Verlag). Zur anschließenden Entfernung des Hexans unter die vorgeschriebenen Höchstmengen für Lebensmittelprodukte eignet sich eine Miscelladestillation. Anschließend wird das extrahierte Öl mit dem Pressöl unter innerter Atmosphäre gemischt. Das Rohöl ist nun fertig für die Weiterverarbeitung durch Raffination. Die Extraktion mittels Hexan eignet sich für Speiseöle, als Zusatz in Margarine, aber auch für die Herstellung von Biodiesel. Ein Nachteil der Hexan Extraktion ist darin zu sehen, dass das extrahierte Öl Hexan Rückstände enthalten kann, so dass sich ein solchermaßen extrahiertes Öl nicht für alle Anwendungen, beispielsweise in der Babynahrung, gleich gut eignet.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Extraktion des Pflanzensamenöls in Schritt c) deshalb eine superkritische CO2 Extraktion. Ein solchermaßen extrahiertes Öl enthält vorteilhaft keine Lösungsmittelrückstände, wie z.B. ein Hexan-extrahiertes Öl. Insbesondere bevorzugt umfasst die Extraktion des Pflanzensamenöls in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens die folgenden Schritte: (i) Zerkleinern der Pflanzensamen durch Mahlen oder Pressen vorzugsweise unter inerter Athmosphäre auf eine Partikelgröße von weniger als 0,2 mm; und
(ii) Superkritische CO2 Extraktion, wobei der Druck mindestens 300 bar, die Temperatur zwischen 40 und 6OºC beträgt und der Extraktionslauf 60 kg CO2 pro Stunde durchsetzt und nach 30 bis 120 min abgeschlossen ist.
Superkritische Kohlendioxid (CO2) Extraktion basiert auf der Nutzung von Kohlendioxid in subkritischem oder superkritischem Zustand als Extraktionsmittel, wobei das Extraktionsmittel im Kreislauf geführt wird (Barthet und Daun 2002, JAOCS 79:245-51 ).
Dabei wird die gemahlene Saat der hierin beschriebenen Pflanzen direkt oder ein durch Auspressen des erfindungsgemäßen Pflanzenöls zur teilweisen Entfernung der öligen
Bestandteile gewonnener Presskuchen verwendet. Dieses Verfahren zur Ölgewinnung aus Pflanzensamen hat den Vorteil, dass es besonders schonend unter innerter Atmosphäre und bei relativ geringen Temperaturen durchgeführt werden kann, was die oxidative Prozesse im Öl verringert.
Zur möglichst vollständigen Gewinnung des erfindungsgemäßen Pflanzenöls wurde ein in den Beispielen beschriebenes Verfahren entwickelt, in dem die Samen zunächst auf eine definierte Größe zerkleinert und anschließend nahezu vollständig extrahiert werden. Zunächst wurde hierzu die Saat durch Mahlen oder Pressen auf eine Partikelgröße von weniger als 0,2 mm zerkleinert. Besonders vorteilhaft ist hier die Verwendung einer Rollenpresse mit Spaltgröße 0,15 mm. Bei der anschließenden superkritischen Extraktion liegt der bevorzugte Druck bei mindestens 300 bar, besonders bevorzugt bei 350 bar. Die Temperatur kann zwischen 40 und 6OºC gehalten werden, wobei bevorzugt eine möglichst niedrige Temperatur von 40 bis 50ºC oder noch besser 40 bis 45°C gewählt wird, um oxidative Prozesse im Öl zu verringern. Eine optimale Ausbeute ist bei einem Extraktionslauf von 60 kg CO2 pro Stunde nach 120 min erreicht. Dabei liegt der optimale CO2 Massendurchsatz besonders bevorzugt bei 80- bis 100- mal der Masse des Substrats, um eine 90% Ausbeute der maximal erreichbaren Ausbeute zu erzielen. Kürzere Extraktionszeiten ergeben eine weniger vollständige Extraktion.
Die in der luftgetrockneten Saat verbliebene Feuchtigkeit (etwa 7%) geht in das Extraktionsöl über und erhöht vorteilhaft die gesamt Ölausbeute bei der CO2 Extraktion verglichen mit gefriergetrocknetem Substrat. Daher ist eine Lufttrocknung des Substrats bevorzugt. Während des gesamten Extraktionsprozesses wird ein weitgehend gleich bleibendes Öl bezüglich seiner Fettsäurenzusammensetzung und seiner Oxidationsparameter (Säurezahl, lodzahl) gewonnen. Die Extraktionseffizienz war bei der superkritischen CO2 Extraktion bei den hier angegebenen optimierten Bedingungen vergleichbar der Extraktionseffizienz einer konventionellen Soxhlet Extraktion mittels Hexan. Die im Pilotmaßstab durchgeführte superkritische Kohlendioxid (CO2) Extraktion kann ohne wesentliche Veränderungen auf den benötigten Industriellen Maßstab von beispielsweise 800 Tonnen Öl pro Jahr gesteigert werden.
Die superkritische CO2 Extraktion mittels des hierin beschriebenen Verfahrens eignet sich insbesondere zur Extraktion des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls, da es im Gegensatz zur Hexan Extraktion keine Rückstände des Lösungsmittels Hexan enthält. Somit findet ein solchermaßen extrahiertes erfindungsgemäßes Pflanzensamenöl besonders vorteilhaft Anwendung in der Babynahrung. Bevorzugt wird das Öl über superkritische CO2 Extraktion nach dem in den Beispielen angeführten Verfahren gewonnen. Figur 4 zeigt exemplarisch eine Pilotanlagenskizze zur superkritische CO2 Extraktion für die erfindungsgemäßen Pflanzensamenöle.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Raffination des Pflanzensamenöls in Schritt c) eine an das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl angepasste Alkali-Raffinationstechnologie, die in Großanlagen Verwendung findet und im folgenden näher beschrieben wird. Eine Raffination ist bei dem aus der Superkritischen CO2 Extraktion gewonnenen Öl ist nicht in jedem Fall notwendig. Für einige der beschriebenen Anwendungen der erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls ist der direkte Einsatz des über SFE Superkritischen CO2 Extraktion gewonnenen Öls möglich, d.h. hierzu ist keine anschließende Raffination notwendig. Zu diesen Produkten gehören Milch, Saft, Brei, Sirup, Süssigkeit und fermentiertes Produkt für das Kleinkind.
Für über Hexan Extraktion (optional auch für über Superkritische CO2 Extraktion) gewonnenes Öl wird eine anschliessende Raffination durchgeführt. Die Raffination des rohen Pflanzenöles (Mischöl aus Preß- und Extraktionsöl) und die Abfüllung geschehen komplett unter Vakuum oder unter Stickstoff. Zunächst wird das Rohöl mit 10% Wasser hydratisiert (85°C, 45 min, 300 rpm). Die anschliessende Entschleimung mit 1 ,5 % Zitronensäure (20 %-ig) findet ebenfalls bei 85 ºC statt (45 min, 300 rpm, 10% Wasser). Es folgt die Neutralisation durch Waschen mit 7%- iger Natronlauge (90 - 95°C, 20 min, 250 rpm, 10% Wasser) und das Trocknen bei 90 ºC (1 1 min, 350 rpm bis 30 mbar). Die Bleichung geschieht mit 1 % Bleicherde (Tonsil Optimum 214 FF, 90 ºC, 20 min, 350 rpm, bis 20 mbar). Anschließend wird mittels eines Acetatfilters unter Druck und Stickstoff filtriert. Die Desodorierung wird bei 220ºC, 20 min, 1 - 2 mbar mit entionisiertem und entgastem Wasser durchgeführt.
Alternativ kann ein kaltgepresstes erfindungsgemäßes Pflanzenöl auch direkt zur Ernährung eingesetzt werden.
Das extrahierte erfindungsmäßige Pflanzenöl wird nun stabilisiert durch genau dosierten Zusatz einer Auswahl an stabilisierenden Zusätzen, welche beinhalten können: Tocopherole z.B. Vitamin E und Tocotrienole, Ascorbyl Palmitat, Pflanzenextrakte wie zum Beispiel Rosemarin und Pflanzensterole, Carotenoide wie zum Beispiel Lutein, Zeaxanthin, Astaxanthin und Lykopen, Phsopholipide wie zum Beispiel Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin und Phosphatidylglycol oder Coenzyme wie zum Beispiel Coenzym Q. Nach einer anschließenden biochemischen Qualitätskontrolle ist das Öl fertig zur Anwendung wie hierin beschrieben, etwa in Lebensmittelprodukten, dietätischen Produkten, insbesondere Babynahrung und Nahrungsergänzungsmitteln. Typische Werte für die biochemische Qualitätsparameter sind: Säurezahl 0,15; Peroxidzahl unter der Nachweisgrenze; Farbe AOCS 0,6 R und 22 Y.
Das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Pflanzensamenöl umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform Stoffe mit einer Struktur, die in der folgenden allgemeinen Formel I gezeigt wird
wobei die Variablen und Substituenten die folgenden sind R1 = Hydroxyl, Coenzym A (Thioester), Lysophosphatidylcholin,
Lysophosphatidylethanolamin, Lysophosphatidylglycerol, Lysodiphosphatidylglycerol, Lysophosphatidylserin, Lysophosphatidylinositol, Sphingo- Base oder ein Radikal der Formel Il
R2 = Wasserstoff, Llysophosphatidylcholin, Lysophosphatidylethanolamin,
Lysophosphatidylglycerol, Lysodiphosphatidylglycerol, Lysophosphatidylserin, Lysophosphatidylinositol oder gesättigtes oder ungesättigtes C2-C24-Alkylcarbonyl,
R3 = Wasserstoff, gesättigtes oder ungesättigtes C2-C24-Alkylcarbonyl, oder R2 und R3 sind unabhängig voneinander ein Radikal der Formel Ia:
n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 9, m = 2, 3, 4, 5 oder 6 und p = 0 oder 3.
R1 bedeutet in der allgemeinen Formel I Hydroxyl-, CoenzymA-(Thioester), Lyso- Phosphatidylcholin-, Lyso-Phosphatidylethanolamin-, Lyso-Phosphatidylglycerol-, Lyso- Diphosphatidylglycerol-, Lyso-Phosphatidylserin-, Lyso-Phosphatidylinositol-, Sphingobase-, oder einen Rest der allgemeinen Formel Il
Die oben genannten Reste von R1 sind immer in Form ihrer Thioester an die Verbindungen der allgemeinen Formel I gebunden.
R2 bedeutet in der allgemeinen Formel Il Wasserstoff-, Lyso-Phosphatidylcholin-, Lyso- Phosphatidylethanolamin-, Lyso-Phosphatidylglycerol-, Lyso-Diphosphatidylglycerol-, Lyso- Phosphatidylserin-, Lyso-Phosphatidylinositol- oder gesättigtes oder ungesättigtes C2-C24- Alkylcarbonyl.
Als Alkylreste seien substituiert oder unsubstituiert, gesättigt oder ungesättigte C2-C24- Alkylcarbonyl-Ketten wie Ethylcarbonyl-, n-Propylcarbonyl-, n-Butylcarbonyl-, n-Pentylcarbonyl-, n-Hexylcarbonyl-,n-Heptylcarbonyl-, n-Octylcarbonyl-, n-Nonylcarbonyl-, n-Decylcarbonyl-, n- Undecylcarbonyl-, n-Dodecylcarbonyl-, n-Tridecylcarbonyl-, n-Tetradecylcarbonyl-, n- Pentadecylcarbonyl-, n-Hexadecylcarbonyl-, n-Heptadecylcarbonyl-, n-Octadecylcarbonyl-, n- Nonadecylcarbonyl-, n-Eicosylcarbonyl-, n-Docosanylcarbonyl- oder n-Tetracosanylcarbonyl- genannt, die eine oder mehrere Doppelbindung(en) enthalten. Gesättigte oder ungesättigte C10- C22-Alkylcarbonylreste wie n-Decylcarbonyl-, n-Undecylcarbonyl-, n-Dodecylcarbonyl-, n- Tridecylcarbonyl-, n-Tetradecylcarbonyl-, n-Pentadecylcarbonyl-, n-Hexadecylcarbonyl-, n- Heptadecylcarbonyl-, n-Octadecylcarbonyl-, n-Nonadecylcarbonyl-, n-Eicosylcarbonyl-, n- Docosanylcarbonyl- oder n-Tetracosanylcarbonyl-, die eine oder mehrere Doppelbindung(en) enthalten, sind bevorzugt. Besonders bevorzugt sind gesättigte und/oder ungesättigte C10-C22- Alkylcarbonylreste wie Cio-Alkylcarbonyl-, Cn-Alkylcarbonyl-, Ci2-Alkylcarbonyl-, C13-
Alkylcarbonyl-, C-u-Alkylcarbonyl-, Ciβ-Alkylcarbonyl-, Cis-Alkylcarbonyl-, C2o-Alkylcarbonyl- oder C22-Alkylcarbonylreste, die eine oder mehrere Doppelbindung(en) enthalten. Ganz besonders bevorzugt sind gesättigte oder ungesättigte Ci6-C22-Alkylcarbonylreste wie C16- Alkylcarbonyl-, Cis-Alkylcarbonyl-, C2o-Alkylcarbonyl- oder C22-Alkylcarbonylreste, die eine oder mehrere Doppelbindung(en) enthalten. Diese vorteilhaften Reste können zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen enthalten. Die besonders vorteilhaften Reste mit 20 oder 22 Kohlenstoffatomen in der Fettsäurekette enthalten bis zu sechs Doppelbindungen, vorteilhaft drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen, besonders bevorzugt fünf oder sechs Doppelbindungen. Alle genannten Reste leiten sich von den entsprechenden Fettsäuren ab.
R3 bedeutet in der allgemeinen Formel Il Wasserstoff-, gesättigtes oder ungesättigtes C2-C24- Alkylcarbonyl.
Als Alkylreste seien substituiert oder unsubstituiert, gesättigt oder ungesättigte C2-C24- Alkylcarbonyl-Ketten wie Ethylcarbonyl-, n-Propylcarbonyl-, n-Butylcarbonyl-, n-Pentylcarbonyl-, n-Hexylcarbonyl-, n-Heptylcarbonyl-, n-Octylcarbonyl-, n-Nonylcarbonyl-, n-Decylcarbonyl-, n- Undecylcarbonyl-, n-Dodecylcarbonyl-, n-Tridecylcarbonyl-, n-Tetradecylcarbonyl-, n- Pentadecylcarbonyl-, n-Hexadecylcarbonyl-, n-Heptadecylcarbonyl-, n-Octadecylcarbonyl-, n- Nonadecylcarbonyl-, n-Eicosylcarbonyl-, n-Docosanylcarbonyl- oder n-Tetracosanylcarbonyl- genannt, die ein oder mehrere Doppelbindungen enthalten. Gesättigte oder ungesättigte C10- C22-Alkylcarbonylreste wie n-Decylcarbonyl-, n-Undecylcarbonyl-, n-Dodecylcarbonyl-, n- Tridecylcarbonyl-, n-Tetradecylcarbonyl-, n-Pentadecylcarbonyl-, n-Hexadecylcarbonyl-, n- Heptadecylcarbonyl-, n-Octadecylcarbonyl-, n-Nonadecylcarbonyl-, n-Eicosylcarbonyl-, n- Docosanylcarbonyl- oder n-Tetracosanylcarbonyl-, die ein oder mehrere Doppelbindungen enthalten, sind bevorzugt. Besonders bevorzugt sind gesättigte und/oder ungesättigte C10-C22- Alkylcarbonylreste wie Cio-Alkylcarbonyl-, Cn-Alkylcarbonyl-, Ci2-Alkylcarbonyl-, C13- Alkylcarbonyl-, C-u-Alkylcarbonyl-, C16-Alkylcarbonyl-, C18-Alkylcarbonyl-, C2o-Alkylcarbonyl- oder C22-Alkylcarbonylreste, die ein oder mehrere Doppelbindungen enthalten. Ganz besonders bevorzugt sind gesättigte oder ungesättigte Ci6-C22-Alkylcarbonylreste wie C16-Alkylcarbonyl-, C18-Alkylcarbonyl-, C2o-Alkylcarbonyl- oder C22-Alkylcarbonylreste, die ein oder mehrere
Doppelbindungen enthalten. Diese vorteilhaften Reste können zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen enthalten. Die besonders vorteilhaften Reste mit 20 oder 22 Kohlenstoffatomen in der Fettsäurekette enthalten bis zu sechs Doppelbindungen, vorteilhaft drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen, besonders bevorzugt fünf oder sechs Doppelbindungen. Alle genannten Reste leiten sich von den entsprechenden Fettsäuren ab.
Die oben genannten Reste von R1, R2 and R3 können mit Hydroxyl- und/oder Epoxygruppen substituierte sein und/oder können Dreifachbindungen enthalten.
Vorteilhaft enthält das im folgenden beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Pflanzensamenöl mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit mindestens ein, zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen. Besonders vorteilhaft enthalten die Fettsäuren vier, fünf oder sechs Doppelbindungen. Die Fettsäuren haben vorteilhaft 18-, 20- oder 22-C-Atome in der Fettsäurekette, bevorzugt enthalten die Fettsäuren 20 oder 22 Kohlenstoffatome in der Fettsäurekette. Vorteilhaft werden gesättigte Fettsäuren mit den im Verfahren verwendeten
Nukleinsäurekonstrukten wenig oder gar nicht umgesetzt. Unter wenig ist zu verstehen, dass im Vergleich zu mehrfach ungesättigten Fettsäuren die gesättigten Fettsäuren mit weniger als 5 % der Aktivität, vorteilhaft weniger als 3 %, besonders vorteilhaft mit weniger als 2 %, ganz besonders bevorzugt mit weniger als 1 ; 0,9; 0,8; 0,7; 0;6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,25 oder 0,125 % umgesetzt werden. Diese nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäuren liegen im Pflanzensamenöl in einem Fettsäuregemisch vor.
Vorteilhaft bedeuten die Substituenten R2 oder R3 in den allgemeinen Formeln I und Il unabhängig voneinander gesättigtes oder ungesättigtes Ci8-C22-Alkylcarbonyl-, besonders vorteilhaft bedeuten sie unabhängig voneinander ungesättigtes C18-, C20- oder C22- Alkylcarbonyl- mit mindestens zwei Doppelbindungen. Das im Verfahren hergestellte Pflanzensamenöl enthält mehrfach ungesättigte Fettsäuren, die vorteilhaft in Membranlipiden und/oder Triacylglyceriden gebunden sind, sie können aber auch als freie Fettsäuren oder aber gebunden in Form anderer Fettsäureester in den Pflanzen vorkommen. Dabei liegen sie vorteilhaft in Form von Mischungen verschiedener Fettsäuren oder Mischungen unterschiedlicher Glyceride vor. Die in den Triacylglyceriden gebundenen verschiedenen Fettsäuren lassen sich dabei von kurzkettigen Fettsäuren mit 4 bis 6 C-Atomen, mittelkettigen Fettsäuren mit 8 bis 12 C-Atomen oder langkettigen Fettsäuren mit 14 bis 24 C- Atomen ableiten, bevorzugt sind die langkettigen Fettsäuren, besonders bevorzugt sind die langkettigen Fettsäuren LCPUFAs von C18-, C20- und/oder C22-Fettsäuren.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorteilhaft ein Pflanzensamenöl mit Fettsäureestern mit ein- oder mehrfach ungesättigten Ciβ-, C20- und/oder C22-Fettsäuremolekülen mit mindestens einer oder zwei Doppelbindungen im Fettsäureester, vorteilhaft mit mindestens drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen im Fettsäureester, besonders vorteilhaft von mindestens fünf oder sechs Doppelbindungen im Fettsäureester hergestellt und führen vorteilhaft zur Synthese von Linolsäure (=LA, C18:2Δ9,12), Gamma-Linolensäure (= GLA, C18:3Δ6,9,12), Stearidonsäure (= SDA, C18:4 Δ6,9,12,15). Dihomo-Gamma-Linolensäure (= DGLA, 20:3 Δ8,11,14), ω-3- Eicosatetraensäure (= ETA, C20:4 Δ5,8,11,14), Arachidonsäure (ARA, C20:4 Δ5,8,11,14), Eicosapentaensäure (EPA, C20:5Δ5,8,11,14, 1 7), ω-6-Docosapentaensäure (C22:5Δ4,7,10,13,16), ω-6- Docosatetraensäure (C22:4Δ7,10,13,16), ω-3-Docosapentaensäure (= DPA, C22:5Δ7,10,13,16,19), Docosahexaensäure (= DHA, C22:6Δ4'7'10'13'16'19) oder deren Mischungen. Das hergestellte Pflanzensamenöl umfasst bevorzugt ein Fettsäurespektrum enthaltend Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Gamma-Linolensäure, Alpha-Linolensäure, Stearidonsäure, Dihomo-Gamma-Linolensäure, Arachidonsäure und Eicosapentaensäure, wie auch in Figur 3B gezeigt.
Die Fettsäureester mit mehrfach ungesättigten C18-, C20- und/oder C22-Fettsäuremolekülen können aus den Pflanzen, die für die Herstellung der Fettsäureester verwendet wurden, in Form eines Öls oder Lipids beispielsweise in Form von Verbindungen wie Sphingolipide, Phosphoglyceride, Lipide, Glycolipide wie Glycosphingolipide, Phospholipide wie
Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylinositol oder Diphosphatidylglycerol, Monoacylglyceride, Diacylglyceride, Triacylglyceride oder sonstige Fettsäureester wie die AcetylCoenzymA-Ester, die die mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei, drei, vier, fünf oder sechs bevorzugt fünf oder sechs Doppelbindungen enthalten, isoliert werden, vorteilhaft werden sie in der Form ihrer Diacylglyceride, Triacylglyceride und/oder in Form des Phosphatidylcholin isoliert, besonders bevorzugt in der Form der Triacylglyceride. Neben diesen Estern sind die mehrfach ungesättigten Fettsäuren auch als freie Fettsäuren oder gebunden in anderen Verbindungen in den Pflanzen enthalten. In der Regel liegen die verschiedenen vorgenannten Verbindungen (Fettsäureester und freie Fettsäuren) in den Pflanzen in einer ungefähren Verteilung von 80 bis 90 Gewichtsprozent (Gew.-%) Triglyceride, 2 bis 5 Gew.-% Diglyceride, 5 bis 10 Gew.-% Monoglyceride, 1 bis 5 Gew.-% freie Fettsäuren, 2 bis 8 Gew.-% Phospholipide vor, wobei sich die Summe der verschiedenen Verbindungen zu 100 Gew.-% ergänzt. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die hergestellten LCPUFAs mit einem Gehalt von mindestens 3 Gew.-%, vorteilhaft von mindestens 5 Gew.-%, bevorzugt von mindestens 8 Gew.-%, besonders bevorzugt von mindestens 10 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 15 Gew.-% bezogen auf die gesamten Fettsäuren in einer transgenen Pflanze hergestellt. Dabei werden vorteilhaft C18- und/oder C2o-Fettsäuren, die in den Wirtsorganismen vorhanden sind, zu mindestens 10 %, vorteilhaft zu mindestens 20 %, besonders vorteilhaft zu mindestens 30 %, ganz besonders vorteilhaft zu mindestens 40 % in die entsprechenden Produkte wie ARA, EPA, DPA oder DHA, um nur einige beispielhaft zu nennen, umgesetzt. Vorteilhaft werden die Fettsäuren in gebundener Form hergestellt. Mit Hilfe der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren lassen sich diese ungesättigten Fettsäuren an sn1-, sn2- und/oder sn3-Position der vorteilhaft hergestellten Triglyceride bringen. Da im erfindungsgemäßen Verfahren von den Ausgangsverbindungen Linolsäure (C18:2) bzw. Linolensäure (C18:3) mehrere Reaktionsschritte durchlaufen werden, fallen die Produkte des Verfahrens wie beispielsweise Arachidonsäure (ARA), Eicosapentaensäure
(EPA), ω-6-Docosapentaensäure oder DHA nicht als absolute Reinprodukte an, es sind immer auch geringe Spuren der Vorstufen im Endprodukt enthalten. Sind in der Ausgangspflanze beispielsweise sowohl Linolsäure als auch Linolensäure vorhanden, so liegen die Endprodukte wie ARA, EPA oder DHA als Mischungen vor. Die Vorstufen sollten vorteilhaft nicht mehr als 20 Gew.-%, bevorzugt nicht mehr als 15 Gew.-%, besonders bevorzugt nicht als 10 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt nicht mehr als 5 , 4, 3, 2, 1 oder 0,5 Gew.-% bezogen auf die Menge des jeweilige Endproduktes betragen. Vorteilhaft werden in einer transgenen Pflanze wie hierin beschrieben als Endprodukte Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Gamma- Linolensäure, Alpha-Linolensäure, Stearidonsäure, Dihomo-Gamma-Linolensäure, Arachidonsäure und Eicosapentaensäure, wie auch in dem Fettsäurespektrum in Figur 3B gezeigt, gebildet.
Die in dem Pflanzensamenöl enthaltenen Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, enthalten vorteilhaft ungefähr 3,2-5,3% Palmitinsäure, ungefähr 2,2-5,3% Stearinsäure, ungefähr 10-25% Ölsäure, ungefähr 22-36% Linolsäure, ungefähr 4-12% Gamma-Linolensäure, ungefähr 3-8% Alpha-Linolensäure, ungefähr 0,2-1 % Stearidonsäure, ungefähr 3-9% Dihomo-Gamma-Linolensäure, ungefähr 12- 25% Arachidonsäure und ungefähr 1-4% Eicosapentaensäure, bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt. Weiterhin können die in dem Pflanzensamenöl enthaltenen Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, vorteilhaft Fettsäuren ausgewählt aus der Gruppe der Fettsäuren Erucasäure (13-Docosaensäure), Sterculinsäure (9,10-Methylene octadec-9-enonsäure), Malvalinsäure (8,9-Methylen Heptadec-8-enonsäure), Chaulmoogrinsäure (Cyclopenten- dodecansäure), Furan-Fettsäure (9,12-Epoxy-octadeca-9,1 1-dienonsäure), Vernonsäure (9,10- Epoxyoctadec-12-enonsäure), Tarinsäure (6-Octadecynonsäure),6-Nonadecynonsäure, Santalbinsäure (t11-Octadecen-9-ynoic acid), 6,9-Octadecenynonsäure, Pyrulinsäure (t10- Heptadecen-8-ynonsäure), Crepenyninsäure (9-Octadecen-12-ynonsäure), 13,14- Dihydrooropheinsäure, Octadecen-13-ene-9,11-diynonsäure, Petroselensäure (cis-6- Octadecenonsäure), 9c,12t-Octadecadiensäure, Calendulasäure (8t10t12c- Octadecatriensäure), Catalpinsäure (9t11t3c-Octadecatriensäure), Eleosterinsäure (9c1 1t13t- Octadecatriensäure), Jacarinsäure (8c10t12c-Octadecatriensäure), Punicinsäure (9c1 1t13c- Octadecatriensäure), Parinarinsäure (9c11t13t15c-Octadecatetraensäure), Pinolensäure (all- cis-5,9,12-Octadecatriensäure), Laballensäure (5,6-Octadecadienallensäure), Ricinolsäure (12- Hydroxyölsäure) und/oder Coriolinsäure (13-Hydroxy-9c, it-Octadecadienonsäure) enthalten. Die vorgenannten Fettsäuren kommen in den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäureester bzw. Fettsäuregemischen in der Regel vorteilhaft nur in Spuren vor, das heißt sie kommen bezogen auf die Gesamtfettsäuren zu weniger als 30 %, bevorzugt zu weniger als 25 %, 24 %, 23 %, 22 % oder 21 %, besonders bevorzugt zu weniger als 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7%, 6 % oder 5%, ganz besonders bevorzugt zu weniger als 4 %, 3 %, 2 % oder 1 % vor. Vorteilhaft enthalten die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische weniger als 0,1 % bezogen auf die Gesamtfettsäuren an einer der folgenden Fettsäuren, oder besser keine Clupanodonsäure (= Docosapentaensäure, C22:5Δ4'8'12'15'21) und keine Nisinsäure (Tetracosahexaensäure, C23'6Δ3'8'12'15'18'21)
Durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresekonstrukte bzw. die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäurekonstrukte kann eine Steigerung der Ausbeute an mehrfach ungesättigten Fettsäuren von mindestens 50 %, vorteilhaft von mindestens 80 %, besonders vorteilhaft von mindestens 100 %, ganz besonders vorteilhaft von mindestens 150 % gegenüber der nicht-transgenen Ausgangspflanze, beispielsweise Raps, Lein, Färberdiestel oder Soja, beim Vergleich in der GC-Analyse erreicht werden.
Auch chemisch reine mehrfach ungesättigte Fettsäurezusammensetzungen sind nach den vor beschriebenen Verfahren herstellbar. Dazu werden die Fettsäurezusammensetzungen aus den Pflanzen in bekannter Weise beispielsweise über Extraktion, Destillation, Kristallisation, Chromatographie oder Kombinationen dieser Methoden isoliert. Diese chemisch reinen Fettsäurezusammensetzungen sind für Anwendungen im Bereich der Lebensmittelindustrie zur Herstellung von Nahrungsmitteln, insbesondere Babynahrung, aber auch in der Kosmetikindustrie und der Pharmaindustrie vorteilhaft.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte sind in den SEQ ID NOs. 15, 16 und 17 gezeigt sowie oben und in den Tabellen 1 und 2 detailliert beschrieben. Im Prinzip können alle Gene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels vorteilhaft in Kombination mit den erfinderischen Nukleinsäurekonstrukten (im Sinne dieser Anmeldung soll der Plural den Singular und umgekehrt beinhalten) im Verfahren zur Herstellung von Pflanzensamenöl mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren verwendet werden. Beispielsweise kann eine transgene Pflanze, die mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt transformiert ist, mit einem weiteren Expressionsvektor, mittels dessen ein oder mehrere Gene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels exprimiert werden können, zusätzlich über geeignete Transformationsverfahren in die transgene Pflanze eingebracht werden. Vorteilhaft werden Gene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA- Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n), Acyl-CoAiLysophospholipid-Acyltransferasen, Fettsäure- Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A- Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-
Elongase(n) verwendet. Besonders bevorzugt werden Gene ausgewählt aus der Gruppe der Δ- 5-Desaturasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-8-Desaturasen, Δ-12-Desaturasen, omega-3-Desaturasen in Kombination mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten verwendet, wobei einzelne Gene oder mehrere Gene in Kombination verwendet werden können. Besonders bevorzugt können, wie bereits erwähnt, in diesem Zusammenhang die Δ-6-Desaturase mit SEQ ID Nr. 5 und 7, die Δ-5-Desaturase mit SEQ ID Nr. 9, die Δ-12-Desaturase mit SEQ ID Nr. 1 1 und 13, die Δ-6-Elongase mit SEQ ID Nr. 1 und 3, die Δ-5-Elongase mit der SEQ ID Nr. 18, und/oder die Δ-4-Desaturase mit der SEQ ID NO. 20 eingesetzt werden.
Vorteilhaft setzen die im erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt verwendeten Desaturasen ihre jeweiligen Substrate in Form der CoA-Fettsäureester um. Dies führt, wenn vorher ein Elongationsschritt stattgefunden hat, vorteilhaft zu einer erhöhten Produktausbeute. Die jeweiligen Desaturierungsprodukte werden dadurch in höheren Mengen synthetisiert, da der Elongationsschritt in der Regel an den CoA-Fettsäureestern erfolgt, während der Desaturierungsschritt überwiegend an den Phospholipiden oder an den Triglyceriden erfolgt. Eine Ausstauschreaktion, die eine weitere möglicherweise limitierende Enzymreaktion erforderlich machen würde, zwischen den CoA-Fettsäureestern und den Phospholipiden oder Triglyceriden ist somit nicht erforderlich.
Durch die enzymatische Aktivität der durch das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt kodierten Polypeptide können unterschiedlichste mehrfach ungesättigte Fettsäuren im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden. Je nach Auswahl der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Pflanzen lassen sich Mischungen der verschiedenen Fettsäuren wie Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Gamma- Linolensäure, Alpha-Linolensäure, Stearidonsäure, Dihomo-Gamma-Linolensäure,
Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und/oder DHA in freier oder gebundener Form herstellen. Je nachdem welche Fettsäurezusammensetzung in der Ausgangspflanze vorherrscht (C18:2- oder C18:3-Fettsäuren) entstehen so Fettsäuren, die sich von C18:2-Fettsäuren ableiten, wie GLA, DGLA oder ARA oder solche, die sich von C18:3-Fettsäuren ableiten, wie SDA, ETA oder EPA. Liegt in der für das Verfahren verwendeten Pflanze als ungesättigte Fettsäure nur
Linolsäure (= LA, C18:2Δ9,12) vor, so können als Produkte des Verfahrens nur GLA, DGLA und ARA entstehen, die als freie Fettsäuren oder gebunden vorliegen können. Ist in der im Verfahren verwendeten Pflanze als ungesättigte Fettsäure nur alpha-Linolensäure (= ALA, C18:3Δ9'12'15) vorhanden, wie beispielsweise in Lein, so können als Produkte des Verfahrens nur SDA, ETA, EPA und/oder DHA entstehen, die wie oben beschrieben als freie Fettsäuren oder gebunden vorliegen können. Durch Modifikation der Aktivität der an der Synthese beteiligten Enzyme Δ-5-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-4-Desaturase, Δ-12-Desaturase, Δ-5-Elongase und/oder Δ-6-Elongase lassen sich in den vorgenannten Pflanzen gezielt Pflanzensamenöle mit einer gewünschten Fettsäurekomposition herstellen. Durch die Aktivität der Δ-6-Desaturase und Δ-6-Elongase entstehen beispielsweise Öle mit GLA und DGLA bzw. SDA und ETA, je nach Ausgangspflanze und ungesättigter Fettsäure. Werden die Δ-5-Desaturase, die Δ-5- Elongase und die Δ-4-Desaturase zusätzlich in die Pflanze eingebracht, so entstehen zusätzlich ARA, EPA und/oder DHA. Da es sich um Biosyntheseketten handelt, liegen die jeweiligen Endprodukte nicht als Reinsubstanzen in den Pflanzen vor. Es sind immer auch geringe Mengen der Vorläuferverbindungen im Endprodukt enthalten. Diese geringen Mengen betragen weniger als 20 Gew.-%, vorteilhaft weniger als 15 Gew.-%, besonders vorteilhaft weniger als 10 Gew.-%, ganz besonders vorteilhaft weniger als 5, 4, 3, 2 oder 1 Gew.-% bezogen auf die gewünschten Endprodukte zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Gamma-Linolensäure, Alpha-Linolensäure, Stearidonsäure, Dihomo-Gamma- Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und/oder DHA oder deren Mischungen.
Zur Steigerung der Ausbeute im beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Pflanzensamenölen mit einem vorteilhaft erhöhten Gehalt an mehrfach ungesättigten
Fettsäuren ist es vorteilhaft die Menge an Ausgangsprodukt für die Fettsäuresynthese zu steigern, dies kann beispielsweise durch das Einbringen einer Nukleinsäure in die Pflanze, die für ein Polypeptid mit Δ-12-Desaturase codiert, erreicht werden. Dies ist besonders vorteilhaft in Öl-produzierenden Pflanzen beispielsweise der Familie der Brassicaceae wie der Gattung Brassica z.B. Raps, die einen hohen Ölsäuregehalt aufweisen. Da diese Organismen nur einen geringen Gehalt an Linolsäure aufweisen (Mikoklajczak et al., Journal of the American OiI Chemical Society, 38, 1961 , 678 - 681 ) ist die Verwendung der genannten Δ-12-Desaturasen zur Herstellung des Ausgangsprodukts Linolsäure vorteilhaft.
Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren die vorgenannten Nukleinsäurekonstrukte eingesetzt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens einer Pflanzenzelle oder einer ganzen Pflanze, die die im Verfahren verwendeten Nukleinsäurekonstrukte enthält, wobei die Zelle und/oder die Pflanze mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt, wie beschrieben, allein oder in Kombination mit weiteren Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine des Fettsäure- oder Lipidsstoffwechsels codieren, transformiert wird. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst dieses Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens der Öle, Lipide oder freien Fettsäuren aus der Pflanze oder aus der Kultur. Bei der Kultur kann es sich beispielsweise um eine Treibhaus- oder Feldkultur einer Pflanze handeln. Die so hergestellte Zelle oder Pflanze ist vorteilhaft eine Zelle eines Öl-produzierenden Organismus, wie einer Ölfruchtpflanze wie beispielsweise Raps, Canola, Lein, Soja, Färberdistel oder einer Feldfruchtpflanze wie Mais.
Unter Anzucht ist beispielsweise die Kultivierung im Falle von Pflanzenzellen, -gewebe oder - organe auf oder in einem Nährmedium oder der ganzen Pflanze auf bzw. in einem Substrat beispielsweise in Hydrokultur, Blumentopferde oder auf einem Ackerboden zu verstehen. Als Organismen bzw. Wirtszellen für das erfindungsgemäße Verfahren sind solche geeignet, die in der Lage sind Fettsäuren, speziell ungesättigte Fettsäuren zu synthetisieren bzw. für die Expression rekombinanter Gene geeignet sind. Bevorzugt sind die Pflanzen Raps, Canola, Lein, Soja, Färberdistel oder Mais.
Transgene Pflanzen, die die im erfindungsgemäßen Verfahren synthetisierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren enthalten, können vorteilhaft direkt vermarktet werden, ohne dass die synthetisierten Öle, Lipide oder Fettsäuren isoliert werden müssen. Unter Pflanzen im erfindungsgemäßen Verfahren sind ganze Pflanzen sowie alle Pflanzenteile, Pflanzenorgane oder Pflanzenteile wie Blatt, Stiel, Samen, Wurzel, Knollen, Antheren, Fasern, Wurzelhaare, Stängel, Embryos, KaIIi, Kotelydonen, Petiolen, Erntematerial, pflanzliches Gewebe, reproduktives Gewebe, Zellkulturen, die sich von der transgenen Pflanze ableiten und/oder dazu verwendet werden können, die transgene Pflanze hervorzubringen. Der Samen umfasst dabei alle Samenteile wie die Samenhüllen, Epidermis- und Samenzellen, Endosperm oder Embyrogewebe. Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen können aber auch aus den Pflanzen oder Pflanzenteilen wie etwa die Samen in Form ihrer Öle, Fett, Lipide und/oder freien Fettsäuren isoliert werden. Durch dieses Verfahren hergestellte mehrfach ungesättigte Fettsäuren lassen sich durch Ernten der Pflanzen entweder aus der Kultur, in der sie wachsen, oder vom Feld ernten. Dies kann über Pressen oder Extraktion der Pflanzenteile, bevorzugt der Pflanzensamen, erfolgen. Dabei können die Öle, Fette, Lipide und/oder freien Fettsäuren durch sogenanntes kalt schlagen oder kalt pressen ohne Zuführung von Wärme durch Pressen gewonnen werden. Damit sich die Pflanzenteile, speziell die Samen, leichter aufschließen lassen, werden sie vorher zerkleinert, gedämpft oder geröstet. Die so vorbehandelten Samen können anschließend gepresst werden oder mit Lösungsmittel wie warmes Hexan extrahiert werden. Anschließend wird das Lösungsmittel wieder entfernt. Im Falle von Pflanzenzellen werden diese nach Ernte beispielsweise direkt ohne weitere Arbeitsschritte extrahiert oder aber nach Aufschluss über verschiedene dem Fachmann bekannte Methoden extrahiert. Auf diese Weise können mehr als 96 % der im Verfahren hergestellten Verbindungen isoliert werden. Anschließend werden die so erhaltenen Produkte weiter bearbeitet, das heißt raffiniert. Dabei werden zunächst beispielsweise die
Pflanzenschleime und Trübstoffe entfernt. Die sogenannte Entschleimung kann enzymatisch oder beispielsweise chemisch/physikalisch durch Zugabe von Säure wie Phosphorsäure erfolgen. Anschließend werden die freien Fettsäuren durch Behandlung mit einer Base beispielsweise Natronlauge entfernt. Das erhaltene Produkt wird zur Entfernung der im Produkt verbliebenen Lauge mit Wasser gründlich gewaschen und getrocknet. Um die noch im Produkt enthaltenen Farbstoffe zu entfernen werden die Produkte einer Bleichung mit beispielsweise Bleicherde oder Aktivkohle unterzogen. Zum Schluss wird das Produkt noch beispielsweise mit Wasserdampf desodoriert.
Vorzugsweise enthält das durch das erfindungsgemäße Verfahren produzierte
Pflanzensamenöl PUFAs bzw. LCPUFAs, i.e. Ciβ-, C20- oder C22-Fettsäuremoleküle, vorteilhaft C18-, C20- oder C22-Fettsäuremoleküle mit mindestens einer Doppelbindung im Fettsäuremolekül, vorzugsweise zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen. Diese Ciβ-, C20- oder C22-Fettsäuremoleküle lassen sich aus der Pflanze, speziell Pflanzensamen, in Form eines Öls oder Lipids isolieren.
Eine Ausführungsform der Erfindung sind deshalb Pflanzensamenöle, Lipide oder Fettsäuren oder Fraktionen davon, die Arachidonsäure mit einem Gehalt von ungefähr 7 bis ungefähr 26 Gewichtsprozent am Gesamtfettsäuregehalt enthalten, wobei das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 und das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Dihomo-Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 beträgt. Diese Pflanzensamenöle, Lipide oder Fettsäuren oder Fraktionen davon können durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt werden unter Verwendung von transgenen Pflanzen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte wie in den SEQ ID NOs. 15, 16 oder 17 gezeigt in ihrem Genom integriert haben. Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl umfasst hierbei bevorzugt ein Fettsaürespektrum mit den Fettsäuren Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Gamma-Linolensäure, Alpha- Linolensäure, Stearidonsäure, Dihomo-Gamma-Linolensäure, Arachidonsäure und Eicosapentaensäure, wie auch in dem Fettsäurespektrum in Figur 3B gezeigt.
Die in dem Pflanzensamenöl enthaltenen Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische, enthalten vorteilhaft ungefähr 3,2-5,3% Palmitinsäure, ungefähr 2,2-5,3% Stearinsäure, ungefähr 10-25% Ölsäure, ungefähr 22-36% Linolsäure, ungefähr 4-12% Gamma-Linolensäure, ungefähr 3-8% Alpha-Linolensäure, ungefähr 0,2-1 % Stearidonsäure, ungefähr 3-9% Dihomo-Gamma- Linolensäure, ungefähr 12-25% Arachidonsäure und ungefähr 1-4% Eicosapentaensäure, bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt. Weiterhin können die genannten Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische, vorteilhaft Fettsäuren ausgewählt aus der Gruppe der Fettsäuren Erucasäure (13-Docosaensäure), Sterculinsäure (9,10-Methylene octadec-9-enonsäure), Malvalinsäure (8,9-Methylen Heptadec-8-enonsäure), Chaulmoogrinsäure (Cyclopenten- dodecansäure), Furan-Fettsäure (9,12-Epoxy-octadeca-9,1 1-dienonsäure), Vernonsäure (9,10- Epoxyoctadec-12-enonsäure), Tarinsäure (6-Octadecynonsäure),6-Nonadecynonsäure, Santalbinsäure (t11-Octadecen-9-ynoic acid), 6,9-Octadecenynonsäure, Pyrulinsäure (t10- Heptadecen-8-ynonsäure), Crepenyninsäure (9-Octadecen-12-ynonsäure), 13,14- Dihydrooropheinsäure, Octadecen-13-ene-9,11-diynonsäure, Petroselensäure (cis-6- Octadecenonsäure), 9c,12t-Octadecadiensäure, Calendulasäure (8t10t12c- Octadecatriensäure), Catalpinsäure (9t1 1t13c-Octadecatriensäure), Eleosterinsäure (9c1 1t13t- Octadecatriensäure), Jacarinsäure (8c10t12c-Octadecatriensäure), Punicinsäure (9c11t13c- Octadecatriensäure),Parinarinsäure (9c1 1t13t15c-Octadecatetraensäure), Pinolensäure (all-cis- 5,9,12-Octadecatriensäure), Laballensäure (5,6-Octadecadienallensäure), Ricinolsäure (12- Hydroxyölsäure) und/oder Coriolinsäure (13-Hydroxy-9c,1 1t-Octadecadienonsäure), enthalten. Die vorgenannten Fettsäuren kommen in den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäureester- bzw. Fettsäuregemischen in der Regel vorteilhaft nur in Spuren vor, das heißt, sie kommen bezogen auf die Gesamtfettsäuren zu weniger als 30 %, bevorzugt zu weniger als 25 %, 24 %, 23 %, 22 % oder 21 %, besonders bevorzugt zu weniger als 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7%, 6 % oder 5%, ganz besonders bevorzugt zu weniger als 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5% oder 0,1 % vor. Vorteilhaft enthalten die o.a. Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische weniger als 0,1 % bezogen auf die Gesamtfettsäuren an einer der folgenden Fettsäuren, oder besser keine Clupanodonsäure (= Docosapentaensäure, C22:5Δ4'8'12'15'21) und keine Nisinsäure (Tetracosahexaensäure, C23:6Δ3,8,12,15,18,21).
Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen Pflanzensamenöle ungefähr 7 bis ungefähr 26 Gewichtsprozent ARA und mindestens 1 %, 1 ,5%, 2%, 3%, 4% oder 5%, vorteilhaft mindestens 6%, oder 7%, besonders vorteilhaft mindestens 8%, 9% oder 10% EPA bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt des Produktionsorganismus, vorteilhaft einer transgenen Pflanze, besonders vorteilhaft einer Ölfruchtpflanze wie Soja, Raps, Färbersafflor, Lein oder der Feldfrucht Mais. Zusätzlich kann das o.a. Pflanzensamenöl DHA in den für EPA angegebenen Mengen enthalten.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verwendung des Pflanzensamenöls der Erfindung oder von daraus extrahierten LC-PUFAs in Futtermitteln, Nahrungsmitteln, bevorzugt Babynahrung, Kosmetika oder Pharmazeutika. Die erfindungsgemäßen
Pflanzensamenöle oder daraus extrahierten LC-PUFAs können in der dem Fachmann bekannten Weise zur Abmischung mit anderen Ölen, Lipiden, Fettsäuren oder Fettsäuregemischen, beispielsweise pflanzlichen (wie oben beschrieben) oder mikrobiellen (z.B. aus Mortierella alpina oder Crythecodinium cohnii) oder tierischen Ursprungs (wie Fischölen) verwendet werden. Auch diese Gemische von Ölen, Lipiden, Fettsäuren oder
Fettsäuregemische, die aus (i) pflanzlichen und mikrobiellen oder (ii) pflanzlichen und tierischen oder (iii) aus pflanzlichen und mikrobiellen und tierischen Bestandteilen bestehen, können zur Herstellung von Futtermitteln, Nahrungsmitteln bevorzugt Babynahrung, Kosmetika oder Pharmazeutika verwendet werden.
Unter dem Begriff "Öl", "Lipid" oder "Fett" wird ein Fettsäuregemisch verstanden, das ungesättigte, gesättigte, vorzugsweise veresterte Fettsäure(n) enthält. Bevorzugt ist, dass das Öl, Lipid oder Fett einen hohen Anteil an einfach und mehrfach ungesättigten vorteilhaft veresterten Fettsäure(n) hat. Vorzugsweise ist der Anteil an ungesättigten veresterten Fettsäuren ungefähr 30 %, mehr bevorzugt ist ein Anteil von 50 %, noch mehr bevorzugt ist ein Anteil von 60 %, 70 %, 80 %, 90%, 95%, 99% oder 99,5%. Zur Bestimmung kann z.B. der Anteil an Fettsäure nach Überführung der Fettsäuren in die Methylestern durch Umesterung gaschromatographisch bestimmt werden. Das Öl, Lipid oder Fett kann verschiedene andere gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, z.B. Calendulasäure, Palmitin-, Palmitolein-, Stearin-, Ölsäure etc., enthalten. Insbesondere kann je nach Ausgangspflanze der Anteil der verschiedenen Fettsäuren in dem Öl oder Fett schwanken.
Bei den im Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit vorteilhaft mindestens zwei Doppelbindungen, handelt es sich wie oben beschrieben beispielsweise um Sphingolipide, Phosphoglyceride, Lipide, Glycolipide, Phospholipide, Monoacylglycerin, Diacylglycerin, Triacylglycerin oder sonstige Fettsäureester. Aus dem so im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Pflanzensamenöl mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit vorteilhaft mindestens einer, zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen lassen sich die enthaltenden mehrfach ungesättigten Fettsäuren beispielsweise über eine Alkalibehandlung beispielsweise wässrige KOH oder NaOH oder saure Hydrolyse vorteilhaft in Gegenwart eines Alkohols wie Methanol oder Ethanol oder über eine enzymatische Abspaltung freisetzen und isolieren über beispielsweise Phasentrennung und anschließender Ansäuerung über z.B. H2SO4. Die Freisetzung der Fettsäuren kann auch direkt ohne die vorhergehend beschriebene Aufarbeitung erfolgen.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäurekonstrukte können nach Einbringung in eine
Pflanzenzelle bzw. Pflanze entweder auf einem separaten Plasmid liegen oder vorteilhaft in das Genom der Wirtszelle integriert sein. Bei Integration in das Genom kann die Integration zufallsgemäß sein oder durch derartige Rekombination erfolgen, dass das native Gen durch die eingebrachte Kopie ersetzt wird, wodurch die Produktion der gewünschten Verbindung durch die Zelle moduliert wird, oder durch Verwendung eines Gens in „trans", so dass das Gen mit einer funktionellen Expressionseinheit, welche mindestens eine die Expression eines Gens gewährleistende Sequenz und mindestens eine die Polyadenylierung eines funktionell transkribierten Gens gewährleistende Sequenz enthält, funktionell verbunden ist. Vorteilhaft werden die Nukleinsäuren über Multiexpressionskassetten oder Konstrukte zur multiparallelen Expression in die Pflanze vorteilhaft zur multiparallelen samenspezifischen Expression von Genen in die Pflanzen gebracht.
Moose und Algen sind die einzigen bekannten Pflanzensysteme, die erhebliche Mengen an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, wie Arachidonsäure (ARA) und/oder Eicosapentaensäure (EPA) und/oder Docosahexaensäure (DHA) herstellen. Moose enthalten PUFAs in Membranlipiden während Algen, algenverwandte Organismen und einige Pilze auch nennenswerte Mengen an PUFAs in der Triacylglycerolfraktion akkumulieren. Daher eignen sich Nukleinsäuremoleküle, die aus solchen Stämmen isoliert werden, die PUFAs auch in der Triacylglycerolfraktion akkumulieren, besonders vorteilhaft für das erfindungsgemäße Verfahren und damit zur Modifikation des Lipid- und PUFA-Produktionssystems in einem Wirt, insbesondere Pflanzen, wie Ölfruchtpflanzen, beispielsweise Raps, Canola, Lein, Soja, Färberdistel. Sie sind deshalb vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar. Zur Herstellung des Pflanzensamenöls mit den langkettigen PUFAs im erfindungsgemäßen Verfahren unter bervorzugter Verwendung der Nukleinsäurekonstrukte mit den SEQ ID NOs. 15, 16 oder 17 müssen die mehrfach ungesättigten Cis-Fettsäuren zunächst durch die enzymatische Aktivität einer Desaturase desaturiert und anschließend über eine Elongase um mindestens zwei Kohlenstoffatome verlängert werden. Nach einer Elongationsrunde führt diese Enzymaktivität zu C2o-Fettsäuren, und nach zwei Elongationsrunden zu C22-Fettsäuren. Die Aktivität der erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Desaturasen und Elongasen führt vorzugsweise zu Ciβ-, C20- und/oder C22-Fettsäuren vorteilhaft mit mindestens einer Doppelbindung im Fettsäuremolekül, vorzugsweise mit zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen, besonders bevorzugt zu Ciβ-, C20- und/oder C22-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise mit drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen, ganz besonders bevorzugt mit fünf oder sechs Doppelbindungen im Molekül. Nachdem eine erste Desaturierung und die Verlängerung stattfanden, können weitere Desaturierungs- und Elongierungsschritte wie z.B. eine solche Desaturierung in Δ-5- und Δ-4- Position erfolgen. Besonders bevorzugt als Produkte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Gamma-Linolensäure, Alpha-Linolensäure, Stearidonsäure, Dihomo-Gamma-Linolensäure, Arachidonsäure und Eicosapentaensäure.
Der bevorzugte Biosyntheseort von Fettsäuren, Ölen, Lipiden oder Fette in den vorteilhaft verwendeten transgenen Pflanzen ist beispielsweise im allgemeinen der Samen oder Zellschichten des Samens, so dass eine samenspezifische Expression der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren sinnvoll ist. Die Biosynthese von Fettsäuren, Ölen oder Lipiden muss nicht auf das Samengewebe beschränkt sein, sondern kann auch in allen übrigen Teilen der Pflanze - beispielsweise in Epidermiszellen oder in den Knollen - gewebespezifisch erfolgen.
Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte, die u.a. für eine Elongase codieren, können im Verfahren die hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mindestens um 5 %, bevorzugt mindestens um 10 %, besonders bevorzugt mindestens um 20 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 50 % gegenüber dem Wildtyp der Pflanzen, die die Nukleinsäuren nicht rekombinant enthalten, erhöht werden.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können die mehrfach ungesättigten Fettsäuren in den im Verfahren hergestellten Pflanzensamenöl prinzipiell auf zwei Arten erhöht werden. Es kann vorteilhaft der Pool an freien mehrfach ungesättigten Fettsäuren und/oder der Anteil der über das Verfahren hergestellten veresterten mehrfach ungesättigten Fettsäuren erhöht werden. Vorteilhaft wird durch das erfindungsgemäße Verfahren der Pool an veresterten mehrfach ungesättigten Fettsäuren in den transgenen Pflanzen erhöht.
Die Nukleinsäurekonstrukte der vorliegenden Erfindung, die am Stoffwechsel von Lipiden und Fettsäuren, PUFA-Cofaktoren und Enzymen oder am Transport lipophiler Verbindungen über Membranen beteiligt sind, werden im erfindungsgemäßen Verfahren zur Modulation der Produktion von PUFAs in transgenen Pflanzen, wie Mais, Soja, Linum Arten wie Lein, Öl- oder Faserlein, Brassica-Arten, wie Raps, Canola und Rübsen, Färberdistelen entweder direkt (z.B. wenn die Überexpression oder Optimierung eines Fettsäurebiosynthese-Proteins einen direkten Einfluss auf die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der Fettsäure aus modifizierten Pflanzen hat) verwendet und/oder können eine indirekt Auswirkung haben, die dennoch zu einer Steigerung der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der PUFAs oder einer Abnahme unerwünschter Verbindungen führt (z.B. wenn die Modulation des Stoffwechsels von Lipiden und Fettsäuren, Cofaktoren und Enzymen zu Veränderungen der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion oder der Zusammensetzung der gewünschten Verbindungen innerhalb der Zellen führt, was wiederum die Produktion einer oder mehrerer Fettsäuren beeinflussen kann). Die Kombination verschiedener Vorläufermoleküle und Biosyntheseenzyme führt zur Herstellung verschiedener Fettsäuremoleküle, was eine entscheidende Auswirkung auf die Zusammensetzung der Lipide hat. Da mehrfach ungesättigte Fettsäuren (= PUFAs) nicht nur einfach in Triacylglycerin sondern auch in Membranlipide eingebaut werden.
Die Lipidsynthese lässt sich in zwei Abschnitte unterteilen: die Synthese von Fettsäuren und ihre Bindung an sn-Glycerin-3-Phosphat sowie die Addition oder Modifikation einer polaren Kopfgruppe. Übliche Lipide, die in Membranen verwendet werden, umfassen Phospholipide, Glycolipide, Sphingolipide und Phosphoglyceride. Die Fettsäuresynthese beginnt mit der Umwandlung von Acetyl-CoA in Malonyl-CoA durch die Acetyl-CoA-Carboxylase oder in Acetyl- ACP durch die Acetyltransacylase. Nach einer Kondensationsreaktion bilden diese beiden Produktmoleküle zusammen Acetoacetyl-ACP, das über eine Reihe von Kondensations-, Reduktions- und Dehydratisierungsreaktionen umgewandelt wird, so dass ein gesättigtes Fettsäuremolekül mit der gewünschten Kettenlänge erhalten wird. Die Produktion der ungesättigten Fettsäuren aus diesen Molekülen wird durch spezifische Desaturasen katalysiert, und zwar entweder aerob mittels molekularem Sauerstoff oder anaerob (bezüglich der Fettsäuresynthese in Mikroorganismen siehe F. C. Neidhardt et al. (1996) E. coli und Salmonella. ASM Press: Washington, D. C, S. 612-636 und darin enthaltene Literaturstellen; Lengeier et al. (Hrsgb.) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, und die enthaltene Literaturstellen, sowie Magnuson, K., et al. (1993) Microbiological Reviews 57:522-542 und die enthaltenen Literaturstellen). Die so hergestellten an Phospholipide gebundenen Fettsäuren müssen anschließend wieder für die weiteren Elongationen aus den Phospholipiden in den FettsäureCoA-Ester-Pool überführt werden. Dies ermöglichen Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyl- transferasen. Weiterhin können diese Enzyme die elongierten Fettsäuren wieder von den CoA- Estern auf die Phospholipide übertragen. Diese Reaktionsabfolge kann gegebenenfalls mehrfach durchlaufen werden.
Vorläufer für die PUFA-Biosynthese sind beispielsweise Ölsäure, Linol- und Linolensäure. Diese Cis-Kohlenstoff-Fettsäuren müssen auf C20 und C22 verlängert werden, damit Fettsäuren vom Eicosa- und Docosa-Kettentyp erhalten werden. Mithilfe der im Verfahren verwendeten Nukleinsäurekonstrukte die Desaturasen (wie die Δ-12- und Δ-15, omega-3-, Δ-12, Δ-4-, Δ-5- und Δ-6-Desaturasen) und/oder Elongasen (Δ-5- und Δ-6-Elongasen) können beispielsweise Arachidonsäure, Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure oder Docosahexaensäure hergestellt werden und anschließend für verschiedene Zwecke bei Nahrungsmittel-, Futter-, Kosmetik- oder pharmazeutischen Anwendungen verwendet werden. Mit den genannten
Enzymen können C20- und/oder C22-Fettsäuren mit mindestens einer, vorteilhaft mindestens zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise C20- oder C22-Fettsäuren mit vorteilhaft vier, fünf oder sechs Doppelbindungen im Fettsäuremolekül hergestellt werden. Die Desaturierung kann vor oder nach Elongation der entsprechenden Fettsäure erfolgen. Daher führen die Produkte der Desaturaseaktivitäten und der möglichen weiteren Desaturierung und Elongation zu bevorzugten PUFAs mit höherem Desaturierungsgrad, einschließlich einer weiteren Elongation von C20 zu C22- Fettsäuren, zu Fettsäuren wie Gamma-Linolensäure, Dihomo-Gamma-Iinolensäure, Arachidonsäure, Stearidonsäure, Eicosatetraensäure oder Eicosapentaensäure. Substrate der verwendeten Desaturasen und Elongasen im erfindungsgemäßen Verfahren sind C16-, Ciβ- oder C2o-Fettsäuren wie zum Beispiel Linolsäure, Gamma-Linolensäure, Alpha-Linolensäure, Dihomo-Gamma-linolensäure, Eicosatetraensäure oder Stearidonsäure. Bevorzugte Substrate sind Linolsäure, Gamma-Linolensäure und/oder Alpha-Linolensäure, Dihomo-Gamma- linolensäure bzw. Arachidonsäure, Eicosatetraensäure oder Eicosapentaensäure. Die synthetisierten C20- oder C22-Fettsäuren mit mindestens einer, zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen in der Fettsäure fallen im erfindungsgemäßen Verfahren in Form der freien Fettsäure oder in Form ihrer Ester beispielsweise in Form ihrer Glyceride an.
Unter dem Begriff "Glycerid" wird ein mit ein, zwei oder drei Carbonsäureresten verestertes Glycerin verstanden (Mono-, Di- oder Triglycerid). Unter "Glycerid" wird auch ein Gemisch an verschiedenen Glyceriden verstanden. Das Glycerid oder das Glyceridgemisch kann weitere Zusätze, z.B. freie Fettsäuren, Antioxidantien, Proteine, Kohlenhydrate, Vitamine und/oder andere Substanzen enthalten. Unter einem "Glycerid" im Sinne des erfindungsgemäßen
Verfahrens werden ferner vom Glycerin abgeleitete Derivate verstanden. Dazu zählen neben den oben beschriebenen Fettsäureglyceriden auch Glycerophospholipide und Glyceroglycolipide. Bevorzugt seien hier die Glycerophospholipide wie Lecithin (Phosphatidylcholin), Cardiolipin, Phosphatidylglycerin, Phosphatidylserin und Alkylacylglycerophospholipide beispielhaft genannt.
Ferner müssen Fettsäuren anschließend an verschiedene Modifikationsorte transportiert und in das Triacylglycerin-Speicherlipid eingebaut werden. Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Lipidsynthese ist der Transfer von Fettsäuren auf die polaren Kopfgruppen, beispielsweise durch Glycerin-Fettsäure-Acyltransferase (siehe Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5):161-166).
Veröffentlichungen über die Pflanzen-Fettsäurebiosynthese, Desaturierung, den Lipidstoffwechsel und Membrantransport von fetthaltigen Verbindungen, die Betaoxidation, Fettsäuremodifikation und Cofaktoren, Triacylglycerin-Speicherung und -Assemblierung einschließlich der Literaturstellen darin siehe in den folgenden Artikeln: Kinney, 1997, Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 19:149-166; Ohlrogge und Browse, 1995, Plant Cell 7:957- 970; Shanklin und Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611 -641 ; Voelker, 1996, Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 18:1 11-13; Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31 :397-417; Gühnemann-Schäfer & Kindl, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256:181-186; Kunau et al., 1995, Prog. Lipid Res. 34:267-342; Stymne et al., 1993, in: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Hrsgb.: Murata und Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13(1 ):1-16.
Das im Verfahren hergestellte Pflanzensamenöl umfasst PUFAs, eine Gruppe von Molekülen, die höhere Tiere nicht mehr synthetisieren können und somit aufnehmen müssen oder die höhere Tiere nicht mehr ausreichend selbst herstellen können und somit zusätzlich aufnehmen müssen, obwohl sie leicht von anderen Organismen, wie Bakterien, synthetisiert werden. Beispielsweise können Katzen Arachidonsäure nicht mehr synthetisieren.
Unter „Phospholipiden" im Sinne der Erfindung sind zu verstehen Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin und/oder
Phosphatidylinositol vorteilhafterweise Phosphatidylcholin. Die Begriffe „Produktion oder Produktivität" sind im Fachgebiet bekannt und beinhalten die Konzentration des Produktes (Verbindungen der Formel I), das in einer bestimmten Zeitspanne und einem bestimmten Volumen gebildet wird (z.B. kg Produkt pro Stunde pro Liter). Es umfasst auch die Produktivität innerhalb einer Pflanzenzelle oder einer Pflanze, das heißt den Gehalt an den gewünschten im Verfahren hergestellten Fettsäuren bezogen auf den Gehalt an allen Fettsäuren in dieser Zelle oder Pflanze. Der Begriff „Effizienz der Produktion" umfasst die Zeit, die zur Erzielung einer bestimmten Produktionsmenge nötig ist (z.B. wie lange die Zelle zur Aufrichtung einer bestimmten Durchsatzrate einer Feinchemikalie benötigt). Der Begriff „Ausbeute oder Produkt/Kohlenstoff-Ausbeute" ist im Fachgebiet bekannt und umfasst die Effizienz der Umwandlung der Kohlenstoffquelle in das Produkt (d.h. die Feinchemikalie). Dies wird gewöhnlich beispielsweise ausgedrückt als kg Produkt pro kg Kohlenstoffquelle. Durch Erhöhen der Ausbeute oder Produktion der Verbindung wird die Menge der gewonnenen Moleküle oder der geeigneten gewonnenen Moleküle dieser Verbindung in einer bestimmten Kulturmenge über einen festgelegten Zeitraum erhöht. Die Begriffe „Biosynthese oder Biosyntheseweg" sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Synthese einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle aus Zwischenverbindungen, beispielsweise in einem Mehrschritt- und stark regulierten Prozess. Die Begriffe „Abbau oder Abbauweg" sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Spaltung einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle in Abbauprodukte (allgemeiner gesagt, kleinere oder weniger komplexe Moleküle), beispielsweise in einem Mehrschritt- und stark regulierten Prozess. Der Begriff „Stoffwechsel" ist im Fachgebiet bekannt und umfasst die Gesamtheit der biochemischen Reaktionen, die in einem Organismus stattfinden. Der Stoffwechsel einer bestimmten Verbindung (z.B. der Stoffwechsel einer Fettsäure) umfasst dann die Gesamtheit der Biosynthese-, Modifikations- und Abbauwege dieser Verbindung in der Zelle, die diese Verbindung betreffen.
Durch den Einsatz der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte und optional weiterer Polynukleotide, die für Enzyme des Lipid oder Fettsäurestoffwechsels kodieren, in dem erfindungsgemäßen Verfahren können verschiedene vorteilhafte Effekte erzielt werden. So kann die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der mehrfach ungesättigten Fettsäuren in einer Pflanze, bevorzugt in einer Ölfruchtpflanze, beeinflusst werden. Die Anzahl oder Aktivität der Polypeptide bzw. Polynukleotide kann erhöht werden, so dass größere Mengen der Genprodukte und damit letztlich größere Mengen der Verbindungen der allgemeinen Formel I hergestellt werden. Auch eine de novo Synthese in einem Organismus, dem die Aktivität und Fähigkeit zur Biosynthese der Verbindungen vor dem Einbringen des/der entsprechenden Gens/Gene fehlte, ist möglich. Entsprechendes gilt für die Kombination mit weiteren Desaturasen oder Elongasen oder weiteren Enzymen aus dem Fettsäure- und Lipidstoffwechsel. Auch die Verwendung verschiedener divergenter, d.h. auf DNA- Sequenzebene unterschiedlicher Sequenzen kann dabei vorteilhaft sein bzw. die Verwendung von Promotoren zur Genexpression, die eine andere zeitliche Genexpression z.B. abhängig vom Reifegrad eines Samens oder Öl-speichernden Gewebes ermöglicht.
Durch das Einbringen eines erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes in eine Pflanze, allein oder in Kombination mit anderen Genen, kann nicht nur der Biosynthesefluss zum Endprodukt erhöht, sondern auch die entsprechende Triacylglycerin- Zusammensetzung erhöht oder de novo geschaffen werden. Ebenso kann die Anzahl oder Aktivität anderer Gene, die am Import von Nährstoffen, die zur Biosynthese einer oder mehrerer Fettsäuren, Ölen, polaren und/oder neutralen Lipiden nötig sind, erhöht sein, so dass die Konzentration dieser Vorläufer, Cofaktoren oder Zwischenverbindungen innerhalb der Zellen oder innerhalb des Speicherkompartiments erhöht ist, wodurch die Fähigkeit der Zellen zur Produktion von PUFAs weiter gesteigert wird. Durch Optimierung der Aktivität oder Erhöhung der Anzahl einer oder mehrerer Polynukleotide bzw. Polypeptide, die an der Biosynthese dieser Verbindungen beteiligt sind, oder durch Zerstören der Aktivität einer oder mehrerer Gene, die am Abbau dieser Verbindungen beteiligt sind, kann es möglich sein, die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Fettsäure- und Lipidmolekülen aus Pflanzen zu steigern. Das im Verfahren gewonnene Pflanzensamenöl eignet sich als Ausgangsmaterial für die chemische Synthese von weiteren Wertprodukten. Sie können beispielsweise in Kombination miteinander oder allein zur Herstellung von Pharmaka, Nahrungsmittel, insbesondere Säuglings- oder Babynahrung, Tierfutter oder Kosmetika verwendet werden.
Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Verfahren einen weiteren Schritt d) des Formulierens des Pflanzensamenöls als ÖI-. Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung.
Noch mehr bevorzugt wird die ÖI-. Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung in dem erfindungsgemäßen Verfahren weiter formuliert zu einem Nahrungsmittel, bevorzugt zu Babynahrung.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahren wird die Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung weiter formuliert zu einem Arzneimittel, zu Kosmetik, zu einem Nahrungsmittel, zu einem Nahrungsergänzungsmittel, zu einem Futtermittel, vorzugsweise Fischfutter oder Futter für Legehennen, oder zu einem Nahrungsergänzungsmittel.
Schließlich betrifft die Erfindung grundsätzlich die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes, einer transgenen Pflanzenzelle oder einer transgenen Pflanze, die diese Nukleinsäurekonstrukte enthält, für die Herstellung einer Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung. Diese ist dann bevorzugt als Arzneimittel, Kosmetik, Nahrungsmittel, besonders Babynahrung, Futtermittel, vorzugsweise Fischfutter oder Futter für Legehennen, oder Nahrungsergänzungsmittel einzusetzen.
Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl neben den oben beschriebenen Anwendungen für die Ernährung von Tieren, insbesondere als Nahrungsergänzungsprodukt für Futteranwendungen zur Verbesserung des Zuchtergebnisses verwendet werden. Ein Futterzusatz zur Verbesserung von Bestandszuchtergebnissen, zum Beispiel von Forellenfischen, Rindern, Schafen, Schweinen, Hühnern, und für die Gesundheit von Haustieren, zum Beispiel von Katzen und Hunden, enthält Arachidonsäure (ARA) in
Konzentrationen, die geeignet sind, um die Reproduktionsraten zu verbessern, wenn die Nahrung des Jungtieres oder des Muttertieres mit ARA ergänzt wird. Das Futtermittelprodukt enthält hierbei neben ARA auch Gamma-Linolensäure (GLA), Dihomo-Gamma-Linolensäure (DGLA), Stearidonsäure (SDA) und Eicosapentaensäure (EPA), um einen hochwertigen Futtermittelzusatz zu erhalten. Die Ergänzung von Ernährungs- und Futtermittelprodukten führt zu höheren Reproduktionsraten, besseren Überlebenschancen für die Jungtiere, sowie zu einer verbesserten neurologischen und visuellen Entwicklung.
Weiterhin kann das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl auch für technische Zwecke eingesetzt werden, etwa in Form eines technischen Öls. Ein solches Öl enthält eine einzigartig hohe Konzentration an ungesättigten Fettsäuren mit Doppelbindungen als Polymerisationskomponente. Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl kann allein oder in Kombination mit einem Polymerisationsmittel für die folgenden technische Anwendungen eingesetzt werden: 1. Lacke und Überzüge (Verwendung als oxidatives Trockenöl)
2. Polymere für Bodenbeläge oder Kunststoffe (Verwendung als oxidatives Trockenöl)
3. Andere chemische Anwendungen
4. Kosmetische Anwendungen
5. Anwendungen im Bereich Elektronik und Halbleitertechnik
Der Vorteil des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl liegt in seinen einzigartigen Polymerisationseigenschaften. Das Öl polymerisiert schneller und gleichmäßiger und bildet eine festere dreidimensionale Struktur, die dort sinnvoll ist, wo Festigkeit, Strapazierfähigkeit und Elastizität des Netzwerks erforderlich sind (Überzüge und Fußbodenbeläge oder Kunststoffe). Durch seine gleichmässige Verteilung der
Doppelbindungen auf die meisten Fettläuren im Öl erhält das Produkt zudem eine hohe Elastizität.
Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung zitierten Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen ist hiermit durch Bezugnahme auf den jeweiligen speziellen Offenbarungsgehalt aufgenommen. Figuren
Figur 1 : Stoffwechselwege zur Synthese von LC-PUFA.
Figur 2A-C: Plasmidkarten der konstruierten T-Plasmide für die Transformation in Brassica napus. Die zugehörigen Sequenzen sind in den SEQ ID NOs. 15 (Figur 2A), 16 (Figur 2B) und 17 (Figur 2C) gezeigt.
Figur 3A: Chromatogramm der gaschromatographischen Fettsäureanalyse von nicht- transgenem Raps (Brassica napus). Die Peaks sind mit den zugeordneten Fettsäuren annotiert, die Nomenklatur ist in Tabelle 5 erläutert.
Figur 3B: Chromatogramm der gaschromatographischen Fettsäureanalyse von transgenem Raps (Brassica napus), transformiert mit dem Konstrukt VC-LJB913-1qcz (SEQ ID NO. 15). Die Peaks sind mit den zugeordneten Fettsäuren annotiert, die Nomenklatur ist in Tabelle 5 erläutert.
Figur 4: Pilotanlagenskizze zur superkritischen CO2 Extraktion für Öle.
Figur 5: Herstellung von Säuglingsnahrung in flüssiger Form.
Figur 6: Herstellung von Säuglingsnahrung durch Komplettsprühung (Gesamtprodukt).
Figur 7: Fettsäure-Verhältnisse in der Muttermilch: Die Werte wurden für die einzelnen Länder gemittelt und das jeweilige Maximum oder Miminum der Verhhältnise im Ländermittel dargestellt ( Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8).
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefasst werden sollten.
Beispiel 1 : Allgemeine Klonierungsverfahren
Die Klonierungsverfahren wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli Zellen, Anzucht von Bakterien und die Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) (CoId Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben durchgeführt.
Beispiel 2: Lipidextraktion und -analyse von Pflanzensamenölen
Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen oder auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Fettsäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierte Pflanze unter geeigneten Bedingungen (wie den vorstehend beschriebenen) gezüchtet werden und das Medium und/oder die zellulären Komponenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d.h. von Lipiden oder einer Fettsäure) untersucht wird. Diese Analysetechniken sind dem Fachmann bekannt und umfassen Spektroskopie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie (siehe beispielsweise Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification", S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988)
Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J. F., und Cabral, J. M. S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., und Henry, J. D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 1 1 , S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, FJ. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Neben den oben erwähnten Verfahren werden Pflanzenlipide aus Pflanzenmaterial wie von Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96 (22): 12935-12940, und Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145, beschrieben extrahiert. Die qualitative und quantitative Lipid- oder Fettsäureanalyse ist beschrieben bei Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: OiIy Press (OiIy Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: OiIy Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (OiIy Press Lipid Library; 1 ); "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) u.d.T.: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.
Ein Beispiel ist die Analyse von Fettsäuren (Abkürzungen: FAME, Fettsäuremethylester; GC- MS, Gas-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie; TAG, Triacylglycerin; TLC, Dünnschichtchromatographie). Das zu analysierende Material wurde durch Mahlen mit einer Stahlkugel (Retsch Mühle, 1 min) aufgebrochen. Das Material wurde nach dem Aufbrechen zentrifugiert und das Sediment in Aqua dest. resuspendiert, 10 min bei 100ºC erhitzt, auf Eis abgekühlt und erneut zentrifugiert, gefolgt von Extraktion in 0,5 M Schwefelsäure in Methanol mit 2 % Dimethoxypropan für 1 Std. bei 90ºC, was zu hydrolysierten Öl- und Lipidverbindungen führt, die transmethylierte Lipide ergeben. Diese Fettsäuremethylester wurden in Petrolether extrahiert und schließlich einer GC- Analyse unter Verwendung einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 mikrom, 0,32 mm) bei einem Temperaturgradienten zwischen 170°C und 240ºC für 20 min und 5 min bei 240°C unterworfen. Die Identität der erhaltenen Fettsäuremethylester wurde unter Verwendung von Standards, die aus kommerziellen Quellen erhältlich sind (z. B. Sigma), definiert. Beispiel 3: Kombination der am Stoffwechselweg beteiligten Gene und deren Zusammenbau in ein T-Plasmid.
Zur Synthese von LC-PUFA im Samen von Raps wurden die im Stoffwechselweg notwendigen Gene (Tabelle 1 ), kombiniert mit Expressionselementen (Promotoren, Terminatoren, Tabelle 2), in Transformationsvektoren übertragen.
Ausgehend von den Genen und den Expressionselementen wurde das Gateway- Klonierungsverfahren (Invitrogen) entsprechend der Herstellerangaben verwendet, um Mehrfachkassetten in pENTR-Vektoren in das binäre T-Plasmid pSUN zu kombinieren. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung gibt Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5: 446^451. Durch die Rekombinationsreaktion der pENTR Vektoren wurden die binären T-Plasmide VC-LJB913-1 qcz (SEQ ID 15), VC-LJ B1327-1 qcz (SEQ ID 16) und VC-LJB1328- 1 qcz (SEQ ID 17) erhalten. Die Abfolge der funktionellen Expressionskassetten (Promoter, Gen, Terminator) sind in den Figuren 2A, 2B und 2C für die erhaltenen Vektoren dargestellt.
In ähnlicher Weise können auch funktionelle Expressionskassetten zur Synthese eines Pflanzensamenöls, welches die mehrfach ungesättigte, langkettige Fettsäure Docosa- hexaensäure (DHA) enthält, hergestellt werden. DHA stellt eine weitere wichtige Komponente der Muttermilch dar. Für die Synthese von DHA in Pflanzen können Konstrukte in Raps transformiert werden, wie sie in WO2005/083093 beschrieben wurden. Falls ein Pflanzen- samenöl mit DHA hergestellt werden soll, enthalten die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- konstrukte zusätzllich zu den oben angeführten Genen vorzugsweise Gene, die die Delta 5- Elongase aus Ostreococcus tauri wie in SEQ ID NO. 18 gezeigt und die Delta 4-Desaturase aus Traustochytrium ssp. wie in SEQ ID NO. 20 dargestellt kodieren. Als Promoter eignen sich hierbei SEQ ID Nr. 22, 24, 26, 28, 30 und 33 als Terminatoren können SEQ ID Nr. 23, 25, 27, 29, 31 , 32 und 34 eingesetzt werden.
Beispiel 4: Erzeugung transgener Rapspflanzen (verändert nach Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8:238-242)
Zur Erzeugung transgener Rapspflanzen (Brassica napus) wurden binäre Vektoren wie die weiter oben beschrieben pSUN Plasmide mit den entsprechend kombinierten Genen in Agrobacterium tumefaciens C58C1 :pGV2260 transformiert (Deblaere et al, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788). Zur Transformation von Rapspflanzen wurde eine 1 :50 Verdünnung einer Übernachtkultur einer positiv transformierten Agrobakterienkolonie in Murashige-Skoog Medium (Murashige und Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473) mit 3 % Saccharose (3MS-Medium) benutzt. Petiolen oder Hypokotyledonen frisch gekeimter steriler Rapspflanzen (zu je ca. 1 cm2) wurden in einer Petrischale mit einer 1 :50 Agrobakterienverdünnung für 5-10 Minuten inkubiert. Es folgte eine 3-tägige Co-Inkubation in Dunkelheit bei 25°C auf 3MS-Medium mit 0,8 % Bacto- Agar. Die Kultivierung wurde nach 3 Tagen mit 16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit weitergeführt und in wöchentlichem Rhythmus auf MS-Medium mit 500 mg/l Claforan (Cefotaxime-Natrium), 50 mg/l Kanamycin, 20 mikroM Benzylaminopurin (BAP) und 1 ,6 g/l Glukose weitergeführt. Wachsende Sprosse wurden auf MS-Medium mit 2 % Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0,8 % Bacto-Agar überführt. Bildeten sich nach drei Wochen keine Wurzeln, so wurde als Wachstumshormon 2-lndolbuttersäure zum Bewurzeln zum Medium gegeben.
Regenerierte Sprosse wurden auf 2MS-Medium mit Kanamycin und Claforan erhalten, nach Bewurzelung in Erde überführt und nach Kultivierung für zwei Wochen in einer Klimakammer oder im Gewächshaus angezogen, zur Blüte gebracht, reife Samen geerntet und auf Expression der Desaturase- bzw. Elongase-Gene mittels Lipidanalysen untersucht wie beispielhaft in Qiu et al. 2001 , J. Biol. Chem. 276, 31561-31566 beschrieben. b) Herstellung von transgenen Leinpflanzen
Die Herstellung von transgenen Leinpflanzen können zum Beispiel nach der Methode von Bell et al., 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 35(6):456-465 mittels particle bombartment erzeugt werden. Agrobakterien-vermittelte Transformationen können zum Beispiel nach Mlynarova et al. (1994), Plant Cell Report 13: 282-285 hergestellt werden.
Beispiel 5: Lipidanalyse von transgenen Rapspflanzen, transformiert mit den dargestellten T- Plasmiden.
Die Plasmide, die unter Beispiel 3 hergestellt wurden, wurden wie in Beispiel 4 beschrieben in Raps (Brassica napus) transformiert. Nach Auswahl der transgenen Pflanzen mittels PCR wurden diese zur Samenreife angezogen (Tag-Nachzyklus: 16h, 20OmE, 21ºC, 8h dunkel, 19ºC) und die Samen geerntet.
Geerntete Samen wurden wie unter Beispiel 2 beschrieben extrahiert und einer gaschromatographischen Analyse unterworfen. Tabelle 3 zeigt die Resultate von verschiedenen Linien dieser Konstrukte. Tabelle 5 zeigt die verwendete Nomenklatur für die Fettsäuren. Tabelle 6 zeigt die Verhältnisse von ARA zu den Mittelwerten aller gemessenen Fettsäuren. Überraschenderweise konnte dabei gefunden werden, dass im Unterschied zu bisher durchgeführten Versuchen zur Herstellung von Arachidonsäuren in transgenen Pflanzen (z.B. WO2005/083093 oder Kajikawa et al. Biosci. Biotechno. Biochem., 72, 70549-1-10, 2008) oder aus Ölen von Microorganismen (z.B. Mortierella alpina) neue Eigenschaften erzielt werden konnten. Insbesondere wurden neue Verhältnisse zwischen der Fettsäuren Gamma- Linolensäure (GLA) und Arachidonsäure (ARA) und Dihomo-Gama-Linolensäuren (DGLA) und Arachidonsäure erhalten. Tabelle 4 gibt eine Übersicht über die Verhältnisse im Vergleich zu verschiedenen Organismen, die entweder Arachidonsäure natürlicherweise produzieren oder in die Gene für den entsprechenden Stoffwechselweg übertragen wurden. Neben der physiologisch positiven Wirkung von Arachidonsäure sei an dieser Stelle auch das in den Pflanzen erhaltene günstige Verhältnis zu GLA und DGLA nochmals erwähnt. GLA und DGLA sind neben Arachidonsäure wichtige Komponenten der Fettfraktion von Muttermilch. Die in dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl vorliegenden Verhältnisse liegen sehr nahe an denen in der Muttermilch. Zudem ist die Fettsäurekomposition in dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl sehr ähnlich wie die in der Muttermilch vorliegende; vergleiche Figur 7.
Tabelle 4: Verhältnisse von ARA:GLA, ARA:DGLA und LA:ALA in verschiedenen Organismen.
Tabelle 5: Verwendete Nomenklatur
Beispiel 6: Prozessierung des Pflanzensamenöls
Nach der Ernte, Reinigung und Lufttrocknung der Samen (etwa 7% Restfeuchtigkeit) der in Beispiel 4 hergestellten transgenen Rapspflanzen sowie von Wildtyp Rapspflanzen wurden die gewonnenen Samen zur Gewinnung des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöles und des Wildtypöls prozessiert. Die Prozessierung begann mit der Zerkleinerung und Pressung der Samen, gefolgt von einer Extraktion. Extrahiert wurde einmal mittels Hexan und zum anderen mittels der Superkritischen CO2 Extraktion. Anschließendend wurde eine Raffination des Hexan- extrahierten Öls sowie eine Stabilisierung durchgeführt.
Im folgenden werden die Extraktionsprozesse und der Raffinationsprozess detaillierter beschrieben.
Die superkritische Kohlendioxid (CO2) Extraktion basiert auf der Nutzung von Kohlendioxid in subkritischem oder superkritischem Zustand als Extraktionsmittel, wobei das Extraktionsmittel im Kreislauf geführt wird (Barthet und Daun 2002, JAOCS 79:245-51). Für die Extraktion mittels Superkritischer Flüssigkeitsextraktion (SFE) wurde die Saat transgener Rapspflanzen wie in Beispiel 4 beschrieben und die Saat eines Brassica napus Wildtyps verwendet. Die Saaten wurden vor der Extraktion mit SFE zunächst mittels einer Vorpressung (Walzenpresse) unter Stickstoffatmosphäre auf 0,15 mm oder 0,05 mm zerkleinert.
Zum Vergleich wurde eine klassische Soxhlet-Extraktion mittels Hexan durchgeführt. Für diese organische Extraktion wurden weitgehend Standardbedingungen gewählt. 10 g vorgepresste Saat wurde in einen Zellulosefilter platziert. Ein Destillationskolben mit 200 ml_ des organischen Lösungsmittels (Hexan) wurde erhitzt. Verdampftes Lösungsmittel kondensierte im über dem Kolben angebrachten Kondensator. Das Kondensat tropfte in den mit der vorgepressten Saat bestückten Filter und löste die fettlöslichen Bestandteile. Sobald der Flüssigkeitspegel die Grenze des Absaugrohres erreicht hatte, floss das Lösungsmittel mit Unterdruck zurück in den Destillationskolben. Die Soxhlet-Extraktion wurde als vollständig erachtet und gestoppt, sobald die Farbtransparenz des Extraktionslösungsmittels in der Filtereinheit konstant blieb. Das Extrakt wurde daraufhin vom Lösungsmittel durch Verdampfung des Lösungsmittels im Vakuum entfernt und die Masse des Extrakts bestimmt.
Für die SFE wurde CO2 mit einer Reinheit von 99.95 % verwendet (Sigma Aldrich). Die diskontinuierliche SFE wurde zum einen im Labormaßstab mittels "Spe-ed SFE" (25-50 mL, Dimension 15,8 cm x 1.4 cm i.D., Hersteller: Applied Chemistry, Allentown, US) durchgeführt, zum anderen wurde eine Pilotanlage (Hersteller: Nova, Schweiz, Kapazität 4 L, Dimension des Extraktionszylinders 22 cm Höhe x 7,5 cm i.D.) verwendet (siehe Figur 4).
Die Experimente wurden zunächst im Labormaßstab auf der "Spe-ed SFE" Testeinheit durchgeführt, um Parameter wie Druck, Temperatur, Extraktionszeit, CO2 Durchsatz (Flussrate) und Zerkleinerungsgrad der Saat flexibel variieren zu können. Die besten experimentell ermittelten Parameter wurden nun auf den Pilotmaßstab übertragen.
Der Extraktionszylinder der Pilotanlage, dessen Boden mit Glaswolle ausgelegt wurde, wurde mit vorgepresster Saat bestückt. Vor Verschluss des Zylinders wurde auf die vorgepresste Saat Glaswolle platziert. Die Zylindereinheit wurde daraufhin mit Ein- und Ausflussventilen verbunden und in einen vorgewärmten Ofen (4 L Autoklavierofen) platziert. Das komprimierte CO2 konnte nun durch die mit Glaswolle fixierte vorgepresste Saat gepumpt werden. Hinter dem Ausfluss des Extraktionszylinders wurde der Druck vom mit Extrakt beladenen CO2 mittels eines Expansionsventils entnommen und in einen Separator entlassen. Probenmaterial wurde hier gesammelt. Das Expansionsventil entliess den Druck im Laborsystem auf 1 Bar, in der Pilotanlage auf 50-70 Bar. CO2 konnte im Laborsystem nicht aufgefangen werden. In der Pilotanlage wurde das CO2 über eine Rückführung vom Separator wieder der Hochdruckpumpe zugeführt (Figur 4) und bildete daher ein geschlossenes System.
Das schrittweise Herangehen zeigte folgende optimierte Parameter für die möglichst vollständige und schonende Extraktion eines Brassicasamenöls. Vorpress-Partikelgröße von weniger als 0,2 mm mittels Rollenpresse mit Spaltgröße 0,15 mm, SFE mit bevorzugtem Druck von mindestens 300 bar, besser 350 bar. Die Temperatur konnte zwischen 40 und 6OºC gehalten werden. Eine möglichst niedrige Temperatur von 40ºC ist hierbei vorzuziehen, um oxidative Prozesse im Öl zu verringern. Eine optimale Ausbeute war bei einem Extraktionslauf von 60 kg CO2 pro Stunde nach 120 min erreicht. Dabei lag der optimale CO2 Massendurchsatz bei 80- bis 100-mal der Masse des Substrats um 90% Ausbeute der maximal erreichbaren Ausbeute zu erzielen. Kürzere Extraktionszeiten ergaben eine weniger vollständige Extraktion, könnten jedoch Vorteile für die Extraktionskosten bieten.
Die Vorteile der hier weiterentwickelten SFE Technologie für die Extraktion von Brassica Samen können wie folgt zusammengefasst werden. Die Extraktionseffizienz ist bei dem hier im Pilotmaßstab entwickelten Verfahren, gegenüber dem Stand der Technik, deutlich optimiert. Mittels der CO2 SFE wurde überraschenderweise bei den hier gezeigten Bedingungen eine, der konventionellen Soxhlet Extraktion mittels Hexan, vergleichbare Extraktionseffizienz erreicht. Die im Pilotmaßstab durchgeführte CO2 SFE kann somit ohne wesentliche Veränderungen auf den benötigten Industriellen Maßstab von beispielsweise 800 Tonnen Öl pro Jahr skaliert werden. Ein solchermaßen extrahiertes erfindungsgemäßes Pflanzensamenöl enthält keinerlei Lösungsmittelrückstände und ist deshalb insbesondere zur Nahrungsmittelherstellung, bevorzugt zur Herstellung von Babynahrung, geeignet.
Für das über die Hexan Extraktion gewonnene Pflanzensamenöl wurde eine anschliessende Raffination durchgeführt. Die Raffination des rohen Pflanzenöles (Mischöl aus Preß- und Extraktionsöl) und die Abfüllung geschahen komplett unter Vakuum oder unter Stickstoff. Zunächst wurde das Rohöl mit 10% Wasser hydratisiert (85°C, 45 min, 300 rpm). Die anschliessende Entschleimung mit 1 ,5 % Zitronensäure (20 %-ig) fand ebenfalls bei 85 ºC statt (45 min, 300 rpm, 10% Wasser). Es folgte die Neutralisation durch Waschen mit 7%- iger Natronlauge (90 - 95°C, 20 min, 250 rpm, 10% Wasser) und das Trocknen bei 90 ºC (1 1 min, 350 rpm bis 30 mbar). Die Bleichung geschah mit 1 % Bleicherde (Tonsil Optimum 214 FF, 90 ºC, 20 min, 350 rpm, bis 20 mbar). Anschließend wurde mittels eines Acetatfilters unter Druck und Stickstoff filtriert. Die Desodorierung wird bei 220ºC, 20 min, 1 - 2 mbar mit entionisiertem und entgastem Wasser durchgeführt.
Eine Raffination ist bei dem aus der Superkritischen CO2 Extraktion gewonnenen Pflanzensamenöl nicht in jedem Fall notwendig. Für einige der beschriebenen Anwendungen der erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls ist der direkte Einsatz des über SFE Superkritischen CO2 Extraktion gewonnenen Öls möglich, d.h. hierzu ist keine anschließende Raffination notwendig. Zu diesen Produkten gehören Milch, Saft, Brei, Sirup, Süssigkeit und fermentiertes Produkt für das Kleinkind. Eine Raffination des über Superkritischen CO2 Extraktion gewonnenen Pflanzensamenöls empfiehlt sich aber aus den o.a. Gründen für den Einsatz in Babynahrung.
Beispiel 7: Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls
Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl enthält die für die Säuglingsernährung wichtigen Fettsäuren in folgenden Gewichtsprozenten (Masse der Fettsäuren in Prozent vom Gesamtfettsäuregehalt)
Zielfettsäure %
Arachidonsäure (20:4 n-6) 15
Essentielle Fettsäuren:
Linolsäure (18:2 n-6) 20-25 Alpha-Linolensäure (18:3 n-3) 3-7
Zusätzliche für den Säugling wertvolle Fettsäuren:
Gamma-Linolensäure (GLA) (18:3 n-6) 6-1 1
Dihomo-Gamma-Linolensäure (DGLA)(20:3 n-6) 4-8 Stearidonsäure (SDA) 1-2
Eicosapentaensäure (EPA) 2-4
Beispiel 8: Säuglingsnahrung , die das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl enthält Der ARA-Gehalt in der hierin beschriebenen exemplarischen Säuglingsnahrung wurde der Gesamtmenge an ARA angeglichen, die in der Muttermilch während der ersten 0-12 Monate der Laktation gefunden wurde. Ein zusätzlicher Vorteil besteht darin, dass wenn das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl verwendet wird, um die Säuglingsmilch mit ARA zu ergänzen, somit auch die Werte für die GLA, DGLA, SDA und EPA im Bereich der Konzentrationen wie in der Muttermilch liegen. Das liegt daran, dass das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl die drei hochgradig ungesättigten Fettsäuren nahezu in den Anteilen enthält, die auch in der Muttermilch gefunden wurden. Wird also das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl als Bestandteil der Säuglingsnahrung verwendet, um die ARA-Konzen- tration anzugleichen, dann werden die GLA, DGLA SDA und EPA in den richtigen Konzentrationen mitgeliefert, um die entsprechenden Nährstoffe für die speziellen Säuglings-, Baby- und Kindernahrungen bereit zu stellen. In diesem Fall ist keine Veränderung des Öls wie etwa das Zumischen von beispielsweise weiteren GLA-, DGLA-, SDA- und EPA- haltigen Ölen notwendig.
Das ARA-haltige erfindungsgemäße Pflanzensamenöl wurde der Säuglingsnahrung zugesetzt (0,5-7,5 g ARA-haltiges ÖI/100g Gesamtfettgehalt in der Säuglingsnahrung). Diese zugefügte ARA-Menge macht einen Teil der Gesamtfettmenge aus (Gesamtfettgehalt von ungefähr 28g pro 100g Trockenmasse). Durch den Zusatz des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls wird das Fettsäuremuster der Säuglingsnahrung bezüglich der LCPUFA der Muttermilch entscheidend angenähert, wie aus folgender Tabelle 7 ersichtlich. Die Tabelle 7 vergleicht das durchschnittliche Fettsäuremuster von Säuglingsnahrung dreier unabhängiger Hersteller, wie dokumentiert in der Ernährungsdatenbank der USA (USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 20 (2007)).
Tabelle 7: Durchschnittliche Fettsäuremuster der Fettmischung von drei kommerziellen Säuglingsnahrungen die als Trockenpulver zum Zubereiten einer Mutterersatzmilch vermarktet werden und die nicht mit ARA ergänzt wurden (Kolonne 2, Säuglingsnahrungen: Mead Johnson, Enfamil, with iron, powder, NDB No: 03805; Ross, Similac, Isomil, with iron, powder, NDB No: 03843; Nestle, Good Start Supreme, with iron, powder NDB No: 03802), drei kommerziellen Säuglingsnahrungen die mit ARA ergänzt wurden (Kolonne 3, Säuglingsnahrungen: Mead Johnson, Enfamil, Lipil, with iron, powder (NDB No: 03808); Ross, Similac, Isomil, Advance with iron, powder (NDB No: 03954); PBM Products, Ultra Bright Beginnings, powder (NDB No: 03883)) und eine exemplarische Säuglingsnahrung (Kolonne 4) die mittels des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls (beschrieben in Kolonne 5) mit ARA ergänzt wurde. Kolonne 6 beschreibt die durchschnittlichen Gehalte der wichtigsten LCPUFA der Muttermilch aus verschiedenen Ländern (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8).
NDB steht hierbei für Nutrients Data Base.
Die Obergrenze von 0.75% ARA als Teil der täglichen Fettaufnahme für Säuglinge wird in US GRAS GRN 80 empfohlen (www.cfsan.fda.gov/~rdb/opa-g080.html). Um die Zielkonzentration von 0.75% ARA am Gesamtfettsäuregehalt der Säuglingsnahrung zu erreichen ist eine Zugabe von 5% des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls notwendig, welches 15% ARA bezogen auf seinen Gesamtfettsäuregehalt enthält. Dadurch errechnet sich eine Gesamtzugabe von 1.36% des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls bezogen auf Säuglingsnahrungstrockenmasse. Eine höhere oder eine geringere Zielkonzentration an ARA in der Säuglingsnahrung kann durch entsprechende Erhöhung oder Verringerung des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls in der Gesamtfettmischung erreicht werden.
Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl kann nicht nur in Säuglingsnahrung eingesetzt werden, sondern auch in Komplettnahrung. Eine Komplettnahrung, der das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl zugesetzt ist, enthält Arachidonsäure (ARA) in ähnlichen Konzentrationen wie die Muttermilch. Die Komplettnahrung enthält auch Gamma- Linolensäure (GLA), Dihomo-Gamma-Linolensäure (DGLA), Stearidonsäure (SDA) und Eicosapentaensäure (EPA) in ähnlichen Konzentrationen wie die Muttermilch. Die angeführte Komplettnahrung kann zum Beispiel Säuglingsmilch, Folgemilch, Getränk fürs Kleinkind, Fruchtsaft, Getreidebrei, Milch, Joghurt oder ein fermentiertes Produkt sein. Beim
Komplettprodukt kann es sich auch um feste oder breiartige Babynahrung, Süßigkeiten, Kekse oder Gelatineprodukte handeln. Sie ist beispielsweise für die Ernährung von Säuglingen, Keinkindern und Kindern bestimmt, um ihr normales Wachstum und ihre gesunde Entwicklung zu unterstützen.
Durch die Zugabe des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls zur Säuglingsnahrung oder Komplettnahrung wird ein der Muttermilch sehr ähnliches Verhältnis der wichtigsten ungesättigten Fettsäuren erreicht (Tabelle 8).
Tabelle 8: Vergleich der Verhältnisse der wichtigsten PUFA (mit Ausnahme von DHA) in Säuglingsnahrung und Muttermilch. Kolonne 2 zeigt die durchschnittlichen Verhältnisse der wichtigsten PUFA in drei kommerziellen Säuglingsnahrungen (Trockenpulver zum Zubereiten einer Mutterersatzmilch) die mit ARA und DHA ergänzt wurden (Säuglingsnahrungen: Mead Johnson, Enfamil, Lipil, with iron, powder (NDB No: 03808); Ross, Similac, Isomil, Advance with iron, powder (NDB No: 03954); PBM Products, Ultra Bright Beginnings, powder (NDB No: 03883)), die wichtigsten PUFA Verhältnisse einer exemplarischen Säuglingsnahrung (Kolonne 3) die mittels des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls mit ARA (Kolonne 4) ergänzt wurde. Kolonne 5 beschreibt die durchschnittlichen PUFA Verhältnisse der Muttermilch aus verschiedenen Ländern (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8).
Das gewählte Beispiel zeigt, dass sich die günstigen Verhältnisse der wichtigen PUFA ARA, GLA, DGLA, SDA und EPA des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls (Tabelle 8, Kolonne 4) direkt in der Säuglingsnahrung wieder spiegeln (Tabelle 8, Kolonnen 3 und 5). In dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl liegt das Verhältnis von Arachidonsäure zu Gamma- Linolensäure bei etwa 1 :1 bis etwa 5:1 und das Verhältnis von Arachidonsäure zu Dihomo- Gamma-Linolensäure bei etwa 1 :1 bis etwa 5:1. Die mit dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl erreichten Verhältnisse decken daher sehr vorteilhaft die in der Muttermilch vorliegende Verhältnisse zwischen Arachidonsäure (ARA) und Gamma-Linolensäure (GLA) 2:1 bis 4:1 und zwischen Arachidonsäure und Dihomo-Gamma-Linolensäuren (DGLA) 1 :1 bis 2:1 (Yuhas et al. 2006_Upids 41 :851-8); siehe Tabelle 8, Kolonne 5 und Figur 7.
Im Pflanzensamenöl der Erfindung beträgt das Verhältnis von Arachidonsäure zu Stearidonsäure 14:1 bis 38:1 und spiegelt auch hier das in der Muttermilch vorliegende Verhältnis (ARA:SDA ca 7:1 bis 45:1) wieder (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8). Außerdem beträgt das Verhältnis von Arachidonsäure zu Eicosapentaensäure im erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl 3:1 bis 7:1 und spiegelt auch hier das in der Muttermilch vorliegende Verhältnis (ARA:EPA ca. 2:1 bis 7:1 ) wieder (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8).
Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl enthält zudem wie die Muttermilch die essentiellen Fettsäuren Linolsäure und Alpha-Linolensäure. Auch im Bezug auf das Verhältnis von Linolsäure zu alpha-Linolensäure kommt das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl der Muttermilch sehr nahe (Tabelle 8, Kolonnen 3 und 5). In der Muttermilch beträgt das Verhältnis ca. 7:1 bis 18:1 (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8).
Vorteilhaft wird Säuglingsnahrung mit dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl ergänzt um die wichtigen PUFA ARA, GLA, DGLA, SDA und EPA, um die Konzentrationen und Verhältnisse an die in der Muttermilch vorliegenden anzugleichen. Darüber hinaus kann die so ergänzte Säuglingsnahrung weiter mit einer Quelle an DHA ergänzt werden.
Für DHA wird die Obergrenze von 0.5% DAH als Teil der täglichen Fettaufnahme für Säuglinge wird in US GRAS GRN 80 empfohlen (www.cfsan.fda.gov/~rdb/opa-g080.html). Um die Zielkonzentration von 0.5% DHA am Gesamtfettsäuregehalt der Säuglingsnahrung zu erreichen ist beispielsweise eine Zugabe von 1.2 g DHASCO® per 100 g Gesamtfett erforderlich, welches 40% DHA bezogen auf seinen Gesamtfettsäuregehalt enthält
(Arterburn et al. 2007, Lipids 42:101 1-24). Dadurch errechnet sich eine Gesamtzugabe von 0.32% DHASCO® bezogen auf Säuglingsnahrungstrockenmasse. Eine höhere oder eine geringere Zielkonzentration an DHA in der Säuglingsnahrung kann durch entsprechende Erhöhung oder Verringerung des für das Produkt bestimmten DHA-haltigen Inhaltsstoffes erreicht werden.
Der Säuglingsnahrung kann daher das ARA-haltige erfindungsgemäße Pflanzensamenöl (0,5-7,5 g/100g Fett) und DHASCO® zugefügt werden. Im Beispiel macht die zugefügte ARA-Menge 5% und die zugefügte DHA-Menge 1.2% der Gesamtfettmasse aus (bei einem Gesamtfettgehalt der Säuglingsnahrung von ungefähr 28g pro 100g Trockenmasse). Durch den Zusatz beider Öle wird das Fettsäuremuster der Säuglingsnahrung bezüglich der LCPUFA der Muttermilch noch weiter angenähert, wie aus folgender Tabelle 9 ersichtlich. Die Tabelle 9 vergleicht das durchschnittliche Fettsäuremuster von Säuglingsnahrung dreier unabhängiger Hersteller wie dokumentiert in der Ernährungsdatenbank der USA (USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 20 (2007)) Tabelle 9: Durchschnittliche Fettsäuremuster der Fettmischung von drei kommerziellen Säuglingsnahrungen (Trockenpulver zum Zubereiten einer Mutterersatzmilch) die nicht mit ARA und DHA ergänzt wurden (Kolonne 2, Säuglingsnahrungen: Mead Johnson, Enfamil, with iron, powder, NDB No: 03805; Ross, Similac, Isomil, with iron, powder, NDB No: 03843; Nestle, Good Start Supreme, with iron, powder NDB No: 03802), drei kommerziellen Säuglingsnahrungen die mit ARA ergänzt wurden (Kolonne 3, Säuglingsnahrungen: Mead Johnson, Enfamil, Lipil, with iron, powder (NDB No: 03808); Ross, Similac, Isomil, Advance with iron, powder (NDB No: 03954); PBM Products, Ultra Bright Beginnings, powder (NDB No: 03883)) und eine exemplarische Säuglingsnahrung (Kolonne 4) die mittels des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls beschrieben in Kolonne 5 mit ARA ergänzt wurde und die mittels DHASCO® (Arterburn et al. 2007, Lipids 42:1011-24) mit DHA ergänzt wurde (Kolonne 6). Kolonne 7 beschreibt die durchschnittlichen Gehalte der wichtigsten LCPUFA der Muttermilch in verschiedenen Ländern (Yuhas, loc.cit.).
Durch die Zugabe des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls und die gleichzeitige Ergänzung mit DHASCO® wird ein der Muttermilch noch ähnlicheres Verhältnis der wichtigsten ungesättigten Fettsäuren erreicht (Tabelle 9) als durch die alleinige Ergänzung mit dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl. Diese weitere Angleichung der Säuglingsnahrung an die Muttermilch durch die Zugabe von DHA kann auch mit anderen hoch-DHA enthaltenden Ölen, wie beispielsweise dem BASF Pulver Produkt Nummer 30056967 (Dry n-3® 5:25 C Powder Microencapsulated fish oil rieh in DHA for Infant formula) erreicht werden.
Tabelle 10: Vergleich der Verhältnisse der wichtigsten PUFA in Säuglingsnahrung und Muttermilch. Kolonne 2 zeigt die durchschnittlichen Verhältnisse der wichtigsten PUFA in drei kommerziellen Säuglingsnahrungen die mit ARA und DHA ergänzt wurden (Säuglingsnahrungen: Mead Johnson, Enfamil, Lipil, with iron, powder (NDB No: 03808); Ross, Similac, Isomil, Advance with iron, powder (NDB No: 03954); PBM Products, Ultra Bright Beginnings, powder (NDB No: 03883)), die wichtigsten PUFA Verhältnisse einer exemplarischen Säuglingsnahrung (Kolonne 3) die mittels des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls mit ARA (Kolonne 4) und mittels DHASCO® (Kolonne 5, Arterburn et al. 2007, Lipids 42:101 1-24) ergänzt wurde. Kolonne 6 beschreibt die durchschnittlichen PUFA Verhältnisse der Muttermilch aus verschiedenen Ländern (Yuhas et al. 2006_Lipids 41 :851- 8).
Tabelle 10 zeigt, dass sich die günstigen Verhältnisse der wichtigen PUFA ARA, GLA, DGLA, SDA, EPA und DHA des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls (Tabelle 10, Kolonne 4) direkt in der Säuglingsnahrung wieder spiegeln (Tabelle 10, Kolonne 3) und dass darüber hinaus besonders günstige Verhältnisse der Fettsäuren DHA und EPA erreicht werden.
Bei der Säuglingsnahrung, welche mit dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl und mit DHASCO® ergänzt wurde beträgt das Verhältnis von ARA zu DHA 1.5:1 und spiegelt hier das in der Muttermilch vorliegende Verhältnis (ARA:DHA ca 0.6:1 bis 7.2:1) wieder (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8). Außerdem beträgt in einer bevorzugten Ausführungsform des Pflanzensamenöls der Erfindung das Verhältnis von DHA zu EPA bei 3.3:1 und spiegelt auch hier das in der Muttermilch vorliegende Verhältnis (DHA:EPA ca. 2.1 :1 bis 5.0:1) wieder (Yuhas et al. 2006_Lipids 41 :851-8)
Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl wurde entwickelt, um das optimale Wachstum, die visuelle und kognitive Entwicklung und die Entwicklung einer verbesserten Immunität von Neugeborenen, Babys und Kleinkindern zu unterstützen. Als Zusatz in der Babynahrung ist es vorzugsweise für frühgeborene Säuglinge als auch für Babys bzw. Kleinkindern im Alter von: 0-6 Monaten (Säuglingsanfangsnahrung), 0-12 Monaten (Säuglingsnahrung), und 12-24 Monaten (Kleinkinder) geeignet.
Im Nachfolgenden werden beispielhaft Rezepturen aufgeführt, welche durch das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl besonders günstig ergänzt werden. Besonders günstig werden die Inhaltsstoffe der Rezepturen in Mengenverhältnissen gemischt, so dass die Säuglingsnahrung Hauptnährstoffe in folgenden Konzentrationen beinhaltet (Angaben in g/100kcal der Säuglingsnahrung): Fette, 3-7g; Proteine, 1-5g; Kohlenhydrate, 6-16g. Zusätzlich enthält die Säuglingsnahrung Vitamine und Mineralien in einer für das entsprechende Alter des Säuglings oder Kleinkindes empfohlenen Mengen, sowie ARA und DHA zu jeweils 0,025 bis 0,5 Prozent der Energie der Säuglingsnahrung oder in einer Konzentration von jeweils 0,05 bis 1 ,0g/100g Fett der Säuglingsnahrung. Die Säuglingsnahrung enthält darüber hinaus GLA, DGLA, SDA und EPA in Verhältnissen welche der Muttermilch besonders ähnlich sind. Die funktionellen Fettsäuren ARA, GLA, DGLA, SDA und EPA stammen hierbei aus dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl.
Die Säuglingsnahrung kann sich beispielsweise aus folgenden Bestandteilen zusammensetzen: Mineralienreduzierte Molke, entfettete Milch, Pflanzenöl (Palmolein, Soja, Kokosnuss, ölsäurereiche Sonnenblume und erucasäurearme Rapsöle), Laktose, das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl, Crypthecodinium cohnii-ÖI oder Fischöl, Vitamin-A- Palmitat, Vitamin D3, Vitamin-E-Acetat, Vitamin K1 , Thiaminhydrochlorid, Vitamin-B6- Hydrochlorid, Vitamin B12, Niacinamid, Folsäure, Kalziumpantothenat, Biotin, Natriumascorbat, Inositol, Kalziumchlorid, Kalziumphosphat, Eisensulfat, Zinksulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat, Natriumchlorid, Natriumeitrat, Kaliumeitrat, Kaliumhydroxid, Natriumselenit, Taurin, Nucleotide (Adenosin-5-monophosphat, Cytidin-5-monophosphat, Dinatriumguanosin-5-monophosphat, Dinatriumuridin-5-monophosphat), eine Quelle für Carotinoide, eine Quelle für Prebiotika und eine Quelle für Probiotika.
Ein weiteres Beispiel für die Zusammensetzung einer Säuglingsnahrung mit dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl ist eine Säuglingsnahrung mit Probiotika und mit ARA, wahlweise kombiniert mit Prebiotika. ARA kann hierbei wahlweise mit Docosahexaensäure (DHA) kombiniert werden, wie weiter oben gezeigt. Wichtige Bestandteile dieser Säuglingsnahrung sind dabei modifizierte süße Molkeproteine intakt oder teilweise hydrolysiert, Probiotika in Form von Bifidobakterien und/oder Laktobazillen, wahlweise Prebiotika in Form von spezifischen Mono- und Disacchariden, Oligosacchariden oder Stärken und das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl. Diese Säuglingsnahrung enthält (pro 100kcal): Energiegehalt (kcal) (100), Protein (g) (Casein/Molke: 30/70) (1 ,83), Gesamtfettgehalt (g) (5,3) davon Linolsäure (g) (0,7-0,8), Alpha-Linolensäure (mg) (90-110), ARA (mg) (5-60), GLA (mg) (3-40), DGLA (mg) (2-30), SDA (mg) (1-6), EPA (mg) (1-12), DHA (mg) (5-60), Laktose (g) (1 1 ,2), Mineralien (g) (0,37), Na (mg) (23), K (mg) (89), Cl (mg) (64), Ca (mg) (62), P (mg) (31 ), Mg (mg) (7), Mn (μg) (8), Se (μg) (2), Vitamin A (μg RE) (105), Vitamin D (μg) (1 ,5), Vitamin E (mg TE) (0,8), Vitamin K1 (μg)(8), Vitamin C (mg) (10), Vitamin B1 (mg) (0,07), Vitamin B2 (mg) (0,15), Niacin (mg) (16,7), Vitamin B6 (mg) (0,075), Folsäure (μg) (9), Pantothensäure (mg) (0,45), Vitamin B12 (μg) (0,3), Biotin (μg) (2,2), Cholin (mg) (10), Fe (mg) (1 ,2), I (μg) (15), Cu (mg) (0,06), Zn (mg) (0,75) als Nährstoffe.
Darüber hinaus ist ein weiteres Beispiel eine Säuglingsnahrung mit dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl und den Carotinoiden beta-Carotin, Lycopen, Lutein und Zeaxanthin. Die Kombination von Lutein, Lycopen und beta-Carotin macht 0, 05-0, 8mg/100g des Gesamtfettgehalts oder der Nahrungsrezeptur aus. Die Masseanteile an der Gesamtölmenge in der Säuglingsnahrung betragen: 0,01-0,6 mg Beta-Carotin, 0,01-0,8 mg Lycopen und 0,01-0,5 mg Lutein plus Zeaxanthin. Der Anteil der mehrfach ungesättigten Fettsäuren beträgt 0,05- 20 Gewichts-% am Gesamtfeststoff der Säuglingsnahrung. Bei den mehrfach ungesättigten Fettsäuren handelt es sich um Arachidonsäure (bevorzugt), GLA, DGLA, SDA, Eicosapentaensäure, Docosahexaensäure, Linolsäure und/oder alpha Linolensäure. Die in der Säuglingsnahrung enthaltene ARA-Menge beträgt 0,1 bis 1 ,0g/100g des Gesamtfetts oder 0,05 bis 0,5 Prozent der Gesamtenergie. Die enthaltenen Mengen an GLA, DGLA, SDA und EPA betragen jeweils 0.06-0.7, 0.04-0.5, 0.01-0.1 and 0.02-0.2 g/100g des Gesamtfetts. Es wurde auch eine flüssige Säuglingsnahrung hergestellt. Wasser wurde dazu mit folgenden Trockenbestandteilen verarbeitet: Laktose 44.5%, erfindungsgemäßes Pflanzen- samenöl (15% ARA) 0.1 bis 1.5%, DHA-haltiges Öl (40% DHA) 0.1 %, fettlose Trockenmilch 18.7%, ölsäurereiches Safloröl 10.7%, Mono- und Diglyceride 0.27%, Sojaöl 8.2%, Molkeprotein 4.6%, Kalziumcarbonat 0.35%, Kokosnussöl 7.58%, Zitronensäure 0.02%, Kaliumeitrat 0.40%, Ascorbinsäure 0.29%, Lecithin 0.27%, Magnesiumchlorid 0.04%, Kaliumchlorid 0.14%, Eisensulfat 0.04%, Carrageenan 0.22%, Cholinchlorid 0.04%, Nucleotid- und Cholin- Vorgemisch 0.22%, Riboflavin 0.002%, L-Carnitin 0.002%,
Kaliumhydroxid 1.65%, Luteinlösung (5%aktiv) 0.64%, wasserlösliches Vitamin-Vorgemisch 0.27%, Vitamin-ADEK-Vorgemisch 20%, Vitamin A 0.0007%, Beta-Carotinlösung (30%) 0.0001 %, Lutein (1.2 ppm), Lycopene (0.48 ppm),
Tabelle n :
Bereiche der Nährstoffzusammensetzung in Säuglingsnahrung enthaltend das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl (Quelle: USDA Nationale Nährstoffdatenbank für Standardreferenz, Veröffentlichung 20 (2007)
Beispiel 9: Anwendung des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls für die Ernährung von Tieren
Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl ist auch als Nahrungsergänzungsprodukt für Futteranwendungen zur Verbesserung des Zuchtergebnisses geeignet. Es kann als Futterzusatz zur Verbesserung von Bestandszuchtergebnissen (zum Beispiel von Forellenfischen, Rindern, Schweinen, Hühnern) und für die Gesundheit von Haustieren (zum Beispiel von Katzen und Hunden) verwendet werden. Dazu enthält das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl Arachidonsäure (ARA) in Konzentrationen, die geeignet sind, um die Reproduktionsraten zu verbessern, wenn die Nahrung des Jungtieres oder des Muttertieres mit ARA ergänzt wird.
Das Futtermittelprodukt erhält durch den Zusatz des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls neben ARA auch Gamma-Linolensäure (GLA), Dihomo-Gamma-Linolensäure (DGLA), Stearidonsäure (SDA) und Eicosapentaensäure (EPA). Die Ergänzung von Ernährungsprodukten mit dem Pflanzensamenöl der Erfindung führt zu höheren
Reproduktionsraten, besseren Überlebenschancen für die Jungtiere, sowie zu einer verbesserten neurologischen und visuellen Entwicklung.
Beispiel 10: Technische Anwendungen des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls Der Zusatz des Pflanzensamenöls der Erfindung liefert ein technisches Öl mit einer einzigartig hohen Konzentration an ungesättigten Fettsäuren mit Doppelbindungen als
Polymerisationskomponente für technische Anwendungen.
Das Öl kann allein oder in Kombination mit einem Polymerisationsmittel für die folgenden
Anwendungen eingesetzt werden: 1. Lacke und Überzüge (Verwendung als oxidatives Trockenöl)
2. Polymere für Bodenbeläge oder Kunststoffe (Verwendung als oxidatives Trockenöl)
3. Andere chemische Anwendungen
4. Kosmetische Anwendungen
5. Anwendungen im Bereich Elektronik und Halbleitertechnik
Der Vorteil des oben beschriebenen Öls liegt in seinen einzigartigen Polymerisationseigenschaften. Das Öl polymerisiert schneller, gleichmäßiger und bildet eine festere dreidimensionale Struktur, die dort sinnvoll ist, wo Festigkeit, Strapazierfähigkeit und Elastizität des Netzwerks erforderlich sind (wie etwa in Überzügen und Fußbodenbelägen oder Kunststoffen).

Claims

Ansprüche
1. Pflanzensamenöl, umfassend Arachidonsäure mit einem Gehalt von ungefähr 7 bis ungefähr 26 Gewichtsprozent am Gesamtfettsäuregehalt, wobei das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 und das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Dihomo- Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 beträgt.
2. Pflanzensamenöl nach Anspruch 1 , wobei das Verhältnis der Gewichtsprozente von Linolsäure zu alpha-Linolensäure ungefähr 3:1 bis ungefähr 12:1 beträgt.
3. Pflanzensamenöl nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Eicosapentaensäure ungefähr 3:1 bis ungefähr 7:1 beträgt.
4. Pflanzensamenöl nach einem der Ansprüche 1 bis 3, weiterhin umfassend Stearidonsäure.
5. Pflanzensamenöl nach Anspruch 4, wobei Stearidonsäure mit einem Gehalt von ungefähr 0,1 bis ungefähr 1 Gewichtsprozent am Gesamtfettsäuregehalt vorliegt.
6. Pflanzensamenöl nach einem der Ansprüche 1 - 5, erhältlich aus einer transgenen Pflanze, wobei die transgene Pflanze mit einem Nukleinsäurekonstrukt wie in den SEQ ID NOs. 15, 16 oder 17 gezeigt transformiert ist.
7. Pflanzensamenöl, umfassend ein Fettsäurespektrum enthaltend Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Gamma-Linolensäure, Alpha-Linolensäure, Stearidonsäure, Dihomo-Gamma-Linolensäure, Arachidonsäure und Eicosapentaensäure.
8. Pflanzensamenöl nach Anspruch 7, umfassend ungefähr 3,2-5,3% Palmitinsäure, ungefähr 2,2-5,3% Stearinsäure, ungefähr 10-25% Ölsäure, ungefähr 22-36% Linolsäure, ungefähr 4-12% Gamma-Linolensäure, ungefähr 3-8% Alpha-Linolensäure, ungefähr 0,2- 1 % Stearidonsäure, ungefähr 3-9% Dihomo-Gamma-Linolensäure, ungefähr 12-25% Arachidonsäure und ungefähr 1-4% Eicosapentaensäure, bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt.
9. Formulierung oder Mischöl, umfassend ein Pflanzensamenöl nach den Ansprüchen 1 bis 8 und mindestens ein weiteres Öl ausgewählt aus der Gruppe Pflanzenöl, mikrobielles Öl und Fischöl, wobei das Pflanzenöl, mikrobielle Öl oder Fischöl Docosahexaensäure enthält.
10. Nahrungsmittel, umfassend ein Pflanzensamenöl nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eine Formulierung oder ein Mischöl nach Anspruch 9.
1 1. Babynahrung, umfassend ein Pflanzensamenöl nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eine Formulierung oder ein Mischöl nach Anspruch 9.
12. Verfahren zur Herstellung eines Pflanzensamenöls nach den Ansprüchen 1 bis 8, umfassend die Schritte: a) Herstellung einer transgenen Pflanze durch Transformation mit dem Nukleinsäurekonstrukt wie in den SEQ ID NOs. 15, 16 oder 17 gezeigt; b) Kultivierung der transgenen Pflanze aus Schritt a) unter Bedingungen, die die Biosynthese des Pflanzensamenöls erlauben; und c) Ernten der Pflanzensamen, Extraktion und Raffination des Pflanzensamenöls.
13. Verfahren nach Anspruch 12, weiter umfassend den Schritt d) des Formulierens des Pflanzensamenöls als Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die ÖI-. Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung weiter formuliert wird zu einem Nahrungsmittel, bevorzugt zu Babynahrung.
15. Verwendung des Pflanzensamenöls nach den Ansprüchen 1 bis 8 oder wie nach dem Verfahren der Ansprüche 12 bis 14 hergestellt oder der Formulierung oder des Mischöls nach Anspruch 11 zur Herstellung von Nahrungsmitteln, bevorzugt Babynahrung, Kosmetik, Futtermitteln, bevorzugt Fischfutter, oder Arzneimitteln.
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