CN101128475B - 适用于改变产油植物及酵母中多不饱和脂肪酸水平的△15脂肪酸去饱和酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可催化亚油酸(18:2，LA)转化为α-亚麻酸(18:3，ALA)的真菌Δ15脂肪酸去饱和酶。描述了编码该去饱和酶的核酸序列、可与此序列杂交的核酸序列、含有该去饱和酶基因的DNA构建体、以及在增强水平上表达该去饱和酶的重组宿主植物与微生物。本申请还描述了通过过量表达Δ15脂肪酸去饱和酶的方式来提高特定ω-3及ω-6脂肪酸产量的方法。

Description

适用于改变产油植物及酵母中多不饱和脂肪酸水平的△15脂肪酸去饱和酶
本申请要求于2003年11月12日申请的美国临时申请No.60/519191的权益。
发明领域
本发明属于生物工程范畴。更具体地，本发明属于对编码可用于破坏或增强植物与生物(包括通过含油酵母而为人所知的微生物在内)中多不饱和脂肪酸的产量的Δ15脂肪酸去饱和酶的核酸片段进行鉴定。
发明背景
长期以来一直认为某些多不饱和脂肪酸——或称其为PUFAs，是健康细胞的重要生物组分。例如，认为这些PUFAs是：
●无法在哺乳动物体内从无到有合成出来的“必需”脂肪酸，作为替代，必须从饮食中获得，或者来自亚油酸(LA)或α-亚麻酸(ALA)的进一步脱氢作用以及碳链增长；
●细胞质膜的组分，在这里可发现它们以磷脂或者三酯酰甘油的形式存在；
●正常发育的必需品，在婴儿大脑的发育以及组织的形成与修复中尤为重要；以及
●包括环前列腺素、类二十烷酸、白三烯及前列腺素类在内的、哺乳动物体内几种重要的生物活性类二十烷酸的前体。
在1970年代，观察到格陵兰的爱斯基摩人中心脏病的低发病率与长链ω-3 PUFAs的高摄入量相关(Dyerberg，J.等，Amer.J.Clin Nutr.28：958-966(1975)；Dyerberg，J.等，Lancet 2(8081)：117-119(July 15，1978))。近来更多的研究已证实了ω-3 PUFAs的心血管保护效果(Shimokawa，H.，World Rev Nutr Diet，88：100-108(2001)；von Schacky，C.，and Dyerberg，J.，World Rev Nutr Diet，88：90-99(2001))。
此外，已发现一些病症会对使用ω-3脂肪酸进行治疗作出反应，譬如血管成形术后再狭窄的速率、发炎与风湿性关节炎的症状、哮喘、牛皮癣及湿疹等。已表明γ-亚麻酸(GLA，一种ω-6 PUFA)可降低同压力相关的血压增高，并可提高算术检测的表现。已表明GLA与二高-γ-亚麻酸(DGLA，另一种ω-6 PUFA)可抑制血小板聚集、导致血管舒张、降低胆固醇水平并抑制血管壁平滑肌与纤维组织的增殖(Brenner等，Adv.Exp.Med.Biol.83：85-101(1976))。已表明单独给药GLA或者DGLA，或同二十碳五烯酸(EPA，一种ω-3 PUFA)联合给药，可减少或防止肠胃出血以及其它由非甾体类抗炎药物导致的副作用(U.S.4,666,701)。此外，已表明GLA或者DGLA可防止或治疗子宫内膜异位及经期综合症(U.S.4,758,592)，并可治疗肌痛性脑脊髓炎与病毒感染后的慢性疲劳(U.S.5,116,871)。其它证据表明PUFAs可以参与调节钙的新陈代谢，说明它们可以用于治疗或预防骨质疏松以及肾脏或者尿路结石。最后，PUFAs可以用于治疗癌症及糖尿病(U.S.4,826,877；Horrobin等，Am.J.Clin.Nutr.57(Suppl.)：732S-737S(1993))。
PUFAs一般分为两大类(由ω-6及ω-3脂肪酸组成)，它们分别来自必需脂肪酸LA及ALA的脱氢作用以及碳链增长。尽管多种商品化的PUFAs原料来源于天然原料[举例来说，月见草、琉璃苣及红醋栗的种子；被孢霉菌(Mortierella)、Porphyridium(红藻)、鱼油及海洋浮游生物(Cyclotella、Nitzschia、Crypthecodinium)]，但它们的生产方法上却有一些不利之处。首先，诸如鱼以及植物这样的天然原料容易含有很高的异源油脂(oil)组分。因此从这些原料获取的油脂需要进行大量的纯化以分离或富集一种或者多种所需的PUFAs。天然原料在实用性方面还有无法控制的波动(举例来说，由于气候、疾病或者在鱼群中过度捕鱼)；而且，生产PUFAs的农作物在经济上同杂交作物相比通常不具有竞争性。某些可天然产生PUFAs的生物(譬如，Porphyridium、被孢菌)的大规模发酵还可能比较昂贵，和/或难以以商业化的规模来培养。
由于上述的局限性，已针对下述方面进行了大量的工作：1.)发展可易于进行商业化生产的PUFAs的重组原料；2.)修饰脂肪酸生物合成途径使得可生产所需的PUFAs。例如，在过去几年中，对多种生物的脂肪酸去饱和酶及碳链增长酶的分离、克隆及操作方面均取得进展。对这些基因序列的了解为在天然状态下不产生PUFAs的全新的宿主生物中生产所需的脂肪酸和/或脂肪酸组分提供了希望。文献报道了啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的大量例子，譬如：Domergue，F.，等(Eur.J.Biochem.269：4105-4113(2002))，其中将来源于海洋硅藻Phaeodactylum fricomutum的两个去饱和酶克隆至啤酒糖酵母中，从而生产出EPA；Beaudoin F.，等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(12)：6421-6(2000))，其中在啤酒糖酵母中使用来源于线虫(Caenorhabditiselegans)的基因再造了ω-3和ω-6 PUFAs的生物合成途径；Dyer，J.M.，等(Appl.Eniv.Microbiol.，59：224-230(2002))，其中在啤酒糖酵母中表达了植物脂肪酸去饱和酶(FAD2和FAD3)，从而生产出ALA；以及，U.S.6,136,574(Knutzon等，Abbott Laboratories)，其中将一个来源于Brassica napus的去饱和酶和两个来源于真菌Morfierella alpina的去饱和酶克隆至啤酒糖酵母中，从而生产出LA、GLA、ALA及STA。
不过对于在其中可表达这些类型的基因从而提供商业规模大量生产的一种或多种具有商业化品质的PUFAs适合的植物和/或微生物系统仍然存在需求。此外，对于在特定的PUFAs中富集油脂，特别是EPA和DHA，也存在需求。
一类先前没有作为PUFAs生产平台来进行研究的微生物是含油酵母。这些生物能够积累高达其干细胞重量80％的油脂。在高油含量下培养含油酵母的技术已经获得很好的发展(例如，参见EP 0 005 277B1；Ratledge，C.，Prog.Ind.Microbiol.16：119-206(1982))，同用于生产ω-3或ω-6 PUFAs的商品化微藻类发酵相比，其成本更具优势。完整的酵母细胞也可当作封装所富集的ω-3或ω-6 PUFAs的便利途径，用于功能性食品及动物饲料添加剂。
尽管具有上述的优势，但绝大多数含油酵母在天然状态下均缺少ω-6 PUFAs——因为这些生物中天然产生的PUFAs通常为18:2的脂肪酸。因此，需要解决的问题是开发出一种可以积累富含ω-3和/或ω-6脂肪酸的油脂的含油酵母。为了这个目的，不仅需要导入可在含油酵母中合成并积累ω-3和/或ω-6脂肪酸所需的去饱和酶和碳链增长酶，而且还要增加18:3底物(即，用于ω-3生产的ALA)的可用性。一般地，可通过能够将LA转化为ALA的Δ15去饱和酶的活性来控制该底物的可用性。
在本发明完成时所公开的文献中揭示了多种已知的Δ15去饱和酶，包括来自光合生物(譬如植物)及线虫的酶。这些酶并不是因为可在含油酵母中有效改变脂肪酸组分才为人所知的，而且也没有被优选用于含油酵母中。此外，在非含油酵母Saccharomyces cerevisiae中异源表达这些去饱和酶，获得了产量低于5％的ALA(Reed，D.等PlantPhysiol.122：715-720(2000)；Meesapyodsuk，D.等Biochem.39：11948-11954(2000)；WO 2003/099216)。因此，有必要去鉴定并分离在用来生产PUFAs的含油微生物(譬如，含油酵母)中能够维持18:3(ALA)的高水平产量以及ω-3对ω-6脂肪酸为更高比例的编码Δ15去饱和酶的基因。
本发明具体涉及从真菌串珠镰孢中分离的编码Δ15去饱和酶的基因，它在含油酵母中表达后表现出令人惊讶的18:2(LA)对18:3(ALA)的转化效率。在稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearium)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)及粗糙链孢霉中也确定了该Δ15去饱和酶的直系同源基因。不过，对串珠镰孢与稻瘟病菌的去饱和酶活性进行进一步的实验分析，结果令人惊讶，表明两种去饱和酶均具有Δ12去饱和酶活性(因此在本申请中将这些酶描述为具有双功能的Δ12/Δ15去饱和酶活性)。
除了对可用作PUFAs生产平台的含油酵母外，还涉及对其它亦可选择作为PUFAs生产平台的植物。
WO 02/26946，于2002年4月4日公开了所分离到的可在LCPUFA-产生生物譬如，破囊壶菌、Pythium irregulare、Schizichytrium及Crypthecodinium中进行表达的编码FAD4、FAD5、FAD5-2及FAD6脂肪酸去饱和酶家族成员的核酸片段。这表明为了生产能够产生LCPUFAs的细胞，可将含有去饱和酶基因的构建体用于包括植物、动物及微生物在内的任何表达系统。
WO 02/26946，于2002年4月4日公开了FAD4、FAD5、FAD5-2及FAD6脂肪酸去饱和酶家族成员以及其生产长链多不饱和脂肪酸的用途。
WO 98/55625，于1998年12月19日公开了在植物中通过表达类聚酮化合物合成基因来生产多不饱和脂肪酸。
WO 98/46764，于1998年10月22日公开了在植物、植物部分及植物细胞制备长链脂肪酸的组分及方法，该法利用了核酸序列以及编码脂肪酸去饱和酶包括Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶及Δ12去饱和酶的构建体。
美国专利No.6,075,183，由Knutzon等于2000年6月13日公开了在植物中合成长链不饱和脂肪酸的方法及组分。
美国专利No.6,459,018，由Knutzon等于2002年10月1日公开了在植物种子中利用含有编码Δ6去饱和酶DNA序列的构建体来生产硬脂艾杜糖酸的方法。
Spychalla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.94，1142-1147(Feb.1997)，描述了对来源于线虫中某个cDNA，当在拟南芥中表达时，它编码一个可催化在18-及20-碳脂肪酸中引入ω-3双键的脂肪酸去饱和酶的分离与鉴定。
发明简述
本发明提供了一种新发现的真菌Δ15去饱和酶以及编码该酶的核酸序列。这种酶，以及本申请中所鉴定的真菌直系同源基因，其独特之处在于它们可同时进行Δ15与Δ12脱氢反应。此外，本发明提供了可表达该真菌Δ15去饱和酶的宿主细胞。
因此本发明提供了分离的、编码真菌Δ15去饱和酶的核酸片段，其选自：
(a)分离的、编码在SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的核酸片段；
(b)分离的、在下述杂交条件下可与(a)杂交的核酸片段所述杂交条件指：0.1×SSC，0.1％SDS，65℃，在2×SSC，0.1％SDS之后用0.1×SSC，0.1％SDS清洗；或者
分离的、与(a)或(b)互补的核酸片段。
作为选择，本发明提供了分离的、包含编码Δ15去饱和酶中至少402个氨基酸的第一段核酸序列在内的核酸片段当其同具有SEQ IDNO：2中所示的序列的多肽比较时，基于序列比对的Clustal方法表明两者具有至少86％的同一性；或者是包含第一段核酸序列互补序列的第二段核酸序列。
此外，本发明提供了由本申请所述的核酸所编码的多肽，以及基因嵌合体和包含它们的转化宿主。在本发明应用中优选的宿主细胞包括，但并不局限于：植物、藻类、细菌、酵母和真菌。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于生产α-亚麻酸的方法，包括：
a)提供宿主细胞，其含有
(i)分离的、编码具有Δ15去饱和酶活性的蛋白的核酸片段，当所述蛋白同具有SEQ ID NO：2中所示的序列的多肽比较时，基于序列比对的Clustal方法表明它们具有至少46.2％的同一性；及
(ii)亚油酸的来源；
b)在编码具有Δ15去饱和酶活性的蛋白的核酸片段可以被表达并且亚油酸可被转化为α-亚麻酸的条件下，培养步骤(a)中的宿主细胞；以及
c)选择回收步骤(b)中的α-亚麻酸。
类似地，本发明提供了一种用于生产α-亚麻酸的方法，包括：
a)提供宿主细胞，它含有
(i)分离的、编码具有Δ15去饱和酶活性的蛋白的核酸片段，当所述蛋白同具有SEQ ID NO：2中所示的序列的多肽比较时，基于序列比对的Clustal方法表明它们具有至少46.2％的同一性；及
(ii)油酸的来源；
b)在编码具有Δ15去饱和酶活性的蛋白的核酸片段可以被表达并且油酸可被转化为α-亚麻酸的条件下，培养步骤(a)中的宿主细胞；以及
c)选择回收步骤(b)中的α-亚麻酸。
作为选择，本发明提供了一种用于在宿主细胞中生产ω-3脂肪酸的方法，包括：
a)提供宿主细胞，它含有
(i)分离的、编码具有Δ15去饱和酶活性的蛋白的核酸片段，当所述蛋白同具有SEQ ID NO：2中所示的序列的多肽比较时，基于序列比对的Clustal方法表明它们具有至少46.2％的同一性；及
(ii)编码具有功能的ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因；
b)提供由油酸组成的去饱和酶底物来源；
c)在产生ω-3脂肪酸的条件下使用步骤(b)中的去饱和酶底物培养步骤(a)中的宿主细胞；及
d)选择回收步骤(c)中的ω-3脂肪酸。
在一个可选择的实施例中，本发明提供了一种在产生ω-3脂肪酸及ω-6脂肪酸的宿主细胞中提高ω-3脂肪酸对ω-6脂肪酸比例的方法，包括
a)提供可产生ω-3脂肪酸及ω-6脂肪酸的宿主细胞；
b)向(a)中的宿主细胞导入分离的、编码蛋白的核酸片段，当所述蛋白同具有SEQ ID NO：2中所示的序列的多肽比较时，基于序列比对的Clustal方法表明它们具有至少46.2％的同一性，其中多肽可与作为酶底物的油酸及亚油酸结合，其中ω-3脂肪酸对ω-6脂肪酸比例增加了。
此外，本发明提供了通过本发明中的方法来生产微生物油。
在另一个实施例中，发明涉及用于改变油籽植物的成熟种子中总脂肪酸谱的重组构建体，以生产ω-3∶ω-6比例大于0.4的油脂，所述含有分离的核酸片段的构建体从由下述几项所组成的组中选择：
(a)分离的、编码SEQ ID NO：2中所示的全部或部分氨基酸序列的核酸片段；
(b)分离的、当使用0.1×SSC、0.1％SDS、65℃洗涤时可与(a)杂交的核酸片段；
(c)分离的、编码氨基酸序列的核酸片段，所述氨基酸序列基于序列比对的Clustal V方法，同SEQ ID NOs：2、6、10、14、18所示的氨基酸序列具有至少46.2％的序列同一性；或者
(d)分离的、同(a)(b)或(c)完全互补的核酸片段。
其中所述的分离的核酸片段可通过操作连接到至少一种调控序列上。
在第二个实施例中，本发明涉及在其基因组中含有本发明中的重组构建体的油籽植物、植物细胞、植物组织或植物部分。
在第三个实施例中，本发明还涉及从这些植物中所获得的种子、从这些种子中获得的油脂、以及在油脂加工过程中获得的副产品。
在第四个实施例中，本发明涉及本发明中的油脂在食品、动物饲料或者工业应用中的用途，以及本发明中的副产品在食品或动物饲料中的应用。
在第五个实施例中，本发明涉及在油籽植物中提高ω-3脂肪酸对ω-6脂肪酸比例的方法，包括：
a)使用本发明中的重组构建体转化油籽植物细胞；
b)通过步骤(a)中的转化植物细胞重建油籽植物；
c)选择同未转化植物中ω-3脂肪酸对ω-6脂肪酸的比例相比，ω-3脂肪酸对ω-6脂肪酸比例有所提高的那些转化植物。
在第六个实施例中，本发明涉及通过本方法制备的油籽植物、从这些植物中获得的种子、从这些种子中获取的油脂、该油脂在食品或动物饲料中的用途、在该油脂加工过程中获得的副产品以及这些副产品在食品或动物饲料中的应用。
在第七个实施例中，本发明涉及在油籽植物的种子中产生α-亚麻酸的方法，其中种子中α-亚麻酸的含量至少为种子油中总脂肪酸含量的25％，所述的方法包括：
a)使用本发明中的重组构建体转化油籽植物细胞；
b)通过步骤(a)中的转化植物细胞重建油籽植物；
c)选择那些其中所含α-亚麻酸至少为种子油中总脂肪酸含量25％的转化植物。
在第八个实施例中，本发明涉及通过本方法制备的油籽植物、从这些植物获得的种子、从这些种子中获取的油脂、该油脂在食品或动物饲料中的用途、在该油脂加工过程中获得的副产品以及这些副产品在食品或动物饲料中的应用。
在接下来的另一个实施例中，本发明涉及用于改变油籽植物成熟种子中总脂肪酸谱的重组构建体，以生产ω-3对ω-6比例大于2的油脂，其中所述的油脂中二十碳五烯酸的含量高于2％，所述的构建体含有从由下述各项所组成的组中所选择的分离的核酸片段：
a)分离的、编码SEQ ID NO：2中所示的全部或部分氨基酸序列的核酸片段；
b)分离的、当使用0.1×SSC、0.1％SDS、65℃洗涤时可与(a)杂交的核酸片段；
c)分离的、编码氨基酸序列的核酸片段，所述氨基酸序列基于序列比对的Clustal V方法，同SEQ ID NOs：2、6、10、14、18所示的氨基酸序列具有至少46.2％的序列同一性；或者
d)分离的、同(a)(b)或(c)完全互补的核酸片段。
其中所述的分离的核酸片段可通过操作连接到至少一种调控序列上。
在进一步的实施例中，本发明涉及在其基因组中含有本发明中的重组构建体的油籽植物、植物细胞、植物组织或植物部分。本发明还涉及从这些植物获得的种子、从这些种子中获取的油脂、该油脂在食品或动物饲料中的用途、在该油脂加工过程中获得的副产品以及这些副产品在食品或动物饲料中的应用。
此外，本发明提供了通过本发明中方法生产的微生物油。
在另一个实施例中，本发明涉及在油籽植物种子中产生二十碳五烯酸的方法，以生产ω-3对ω-6比例大于2的油脂，其中所述的油脂中二十碳五烯酸的含量高于种子油总脂肪酸含量的2％，所述方法包括：
a)使用本发明中的重组构建体转化油籽植物细胞；
b)通过步骤(a)中的转化植物细胞重建油籽植物；
c)选择那些其中所含二十碳五烯酸至少为种子油中总脂肪酸含量2％的转化植物。
在进一步的实施例中，本发明涉及在其基因组中含有本发明中的重组构建体的油籽植物、植物细胞、植物组织或植物部分。本发明还涉及从这些植物获得的种子、从这些种子中获取的油脂、该油脂在食品或动物饲料中的用途、在该油脂加工过程中获得的副产品以及这些副产品在食品或动物饲料中的应用。
此外，本发明提供了通过本发明中的方法生产的微生物油。
生物保藏
下述质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，并有下面所述的名称、保藏号及保藏日期。
  质粒   保藏号   保藏日期
  pKR274   ATCC PTA-4988   2003.1.30
  pKKE2   ATCC PTA-4987   2003.1.30
  pKR578   ATCC PTA-XXXX   2004.11.4
  pKR585   ATCC PTA-XXXX   2004.11.3
附图的简要描述及序列描述
图1所示的是在含油酵母中脂类积累的生化机制的示意图。
图2所示的是ω-3及ω-6脂肪酸生物合成途径。
图3所示的是可在Yarrowia lipolytica中进行基因表达的质粒载体pY5的构建。
图4所示的是来自不同丝状真菌(即，构巢曲霉、串珠镰孢、禾谷镰孢、稻瘟病菌和粗糙链孢霉)的、与Yarrowia lipolytica Δ12去饱和酶具有同源性的蛋白的系统发育树，使用Megalign DNASTAR软件生成。
图5所示的是来自不同的丝状真菌且与Yarrowia lipolytica Δ12去饱和酶具有同源性的蛋白之间的成对比较(％同一性)——使用的是ClustalW分析(DNASTAR软件中的Megalign程序)。
图6为质粒pKR578的示意图(参见实施例11)。
图7为质粒pKR585的示意图(参见实施例13)。
图8为质粒pKR274的示意图(参见实施例14)。
图9为质粒pKKE2的示意图(参见实施例15)。
通过下述详细描述及作为本申请的一个组成部分的相关序列描述可以更完整地理解本发明。
下述序列遵照37 C.F.R.§1.821-1.825(“含有核苷酸序列和/或氨基酸序列的专利申请的相关要求公告——序列规则”)，并与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)以及EPO与PCT的序列列表要求(规则5.2与49.5(a-bis)，以及208节与附件C)相一致。用于核苷酸及氨基酸序列数据的符号与格式遵照37 C.F.R.§1.822所示的规则。
SEQ ID NOs：1-20、54和55为如表1中所确定的编码基因的ORFs或蛋白。
表1
去饱和酶基因与蛋白序列号
Figure GSB00000439125500111
SEQ ID NOs：21和22分别为引物TEF 5′与TEF 3′，用于分离TEF启动子。
SEQ ID NOs：23和24分别为引物XPR 5′与XPR 3′，用于分离XPR2转录终止子。
SEQ ID NOs：25-36分别对应于引物YL5、YL6、YL9、YL10、YL7、YL8、YL3、YL4、YL1、YL2、YL61和YL62，用于质粒构建。
SEQ ID NO：37对应于命名为“GPDPro”的971bp的片段，在Yarrowia lipolytica中被鉴定为推断的甘油醛-3-磷酸去饱和酶启动子。
SEQ ID NOs：38和39分别为引物YL211与YL212，用于扩增包括Yarrowia lipolytica甘油醛-3-磷酸去饱和酶(GPD)启动子在内的DNA片段。
SEQ ID NOs：40和41分别为GPDsense和GPDantisense引物，用于再次扩增GPD启动子。
SEQ ID NOs：42和44分别是鉴定为P73与P76的变性引物，用于分离Yarrowia lipolytica的Δ12去饱和酶基因。
SEQ ID NOs：43和45分别是与变性引物P73与P76相对应的氨基酸一致序列。
SEQ ID NOs：46-49分别对应于引物P99、P100、P101和P102，用于定点破坏天然的Y.lipolytica Δ12去饱和酶基因。
SEQ ID NOs：50-53分别对应于引物P119、P120、P121和P122，用于筛选所破坏的Y.lipolytica Δ12去饱和酶基因的定点整合。
SEQ ID NOs：56和57分别为引物P192和P193，用于扩增串珠镰孢Δ15去饱和酶(“Fm1”)的编码区。
SEQ ID NO：58对应于在Yarrowia sp.中用于基因最佳表达的密码子优化的翻译起始位点。
SEQ ID NOs：59-64分别为引物P186、P187、P188、P189、P190和P191，用于扩增稻瘟病菌Δ15去饱和酶(“Mg1”)。
SEQ ID NOs：65-72分别为引物PFg1UP1、PFg1LP1、PFg1UP2、PFg1LP2、PFg1UP3、PFg1LP3、PFg1UP4和PFg1LP4，用于扩增禾谷镰孢Δ15去饱和酶(“Fg1”)。
SEQ ID NO：73为实施例6中所述的在Kti启动子上游引入的多限制性内切酶位点序列。
SEQ ID NO：74列出了实施例6中所述的大豆白蛋白转录终止子及限制性内切酶位点的序列。
SEQ ID NO：75为用于扩增白蛋白转录终止子的引物oSalb-12。
SEQ ID NO：76为用于扩增白蛋白转录终止子的引物oSalb-13。
SEQ ID NO：77为实施例6中所述的在β-伴大豆球蛋白启动子前面引入的多限制性内切酶位点序列。
SEQ ID NO：78为实施例11与图5中所描述的质粒pKR578的全序列。
SEQ ID NO：79列出了用于扩增大豆膜联蛋白启动子的寡核苷酸引物GSP1。
SEQ ID NO：80列出了用于扩增大豆膜联蛋白启动子的寡核苷酸引物GSP2。
SEQ ID NO：81列出了膜联蛋白启动子的序列。
SEQ ID NO：82列出了用于扩增大豆BD30启动子的寡核苷酸引物GSP3。
SEQ ID NO：83列出了用于扩增大豆BD30启动子的寡核苷酸引物GSP4。
SEQ ID NO：84列出了大豆BD30启动子的序列。
SEQ ID NO：85列出了大豆β-伴大豆球蛋白β-亚基启动子的序列。
SEQ ID NO：86列出了用于扩增大豆β-伴大豆球蛋白β-亚基启动子的寡核苷酸引物β-con oligo Bam。
SEQ ID NO：87列出了用于扩增大豆β-伴大豆球蛋白β-亚基启动子的寡核苷酸引物β-con oligo Not。
SEQ ID NO：88列出了大豆中大豆球蛋白Gly-1启动子的序列。
SEQ ID NO：89列出了用于扩增Gly-1启动子的寡核苷酸引物glyoligo Bam。
SEQ ID NO：90列出了用于扩增Gly-1启动子的寡核苷酸引物glyoligo Not。
SEQ ID NO：91为用于扩增Kti/NotI/Kti 3′盒的引物oKTi5。
SEQ ID NO：92为用于扩增Kti/NotI/Kti 3′盒的引物oKTi6。
SEQ ID NO：93为用于扩增大豆BD30 3′转录终止子的引物oSBD30-1。
SEQ ID NO：94为用于扩增大豆BD30 3′转录终止子的引物oSBD30-2。
SEQ ID NO：95为实施例13与图6中所描述的质粒pKR585的全序列。
SEQ ID NO：96为用于扩增高山被孢霉菌Δ6去饱和酶的引物oCGR5-1。
SEQ ID NO：97为用于扩增高山被孢霉菌Δ6去饱和酶的引物oCGR5-2。
SEQ ID NO：98为用于扩增大豆球蛋白Gy1启动子的引物oSGly-1。
SEQ ID NO：99为用于扩增大豆球蛋白Gy1启动子的引物oSGly-2。
SEQ ID NO：100为用于扩增legA2启动子序列的引物LegPro5′。
SEQ ID NO：101为用于扩增legA2启动子序列的引物LegPro3′。
SEQ ID NO：102为用于扩增leg2A转录终止子的引物LegTerm5′。
SEQ ID NO：103为用于扩增leg2A转录终止子的引物LegTerm3′。
SEQ ID NO：104为用于扩增高山被孢霉菌去饱和酶的引物CGR4forward。
SEQ ID NO：105为用于扩增高山被孢霉菌去饱和酶的引物CGR4reverse。
SEQ ID NO：106为用于扩增高山被孢霉菌(Mortierella alpina)碳链增长酶的正向引物——RPB2forward。
SEQ ID NO：107为用于扩增高山被孢霉菌碳链增长酶的反向引物——RPB2reverse。
SEQ ID NO：108为用于形成AscI liker的引物Asc5。
SEQ ID NO：109为用于形成AscI liker的引物Asc3。
发明的详细描述
所有引用的专利、专利申请及出版物均以参考的形式将其内容整合在本申请中。
本发明涉及编码Δ15去饱和酶的串珠镰孢基因及稻瘟病菌基因的分离以及其同一性的确定，并在其它真菌中鉴定它们的直系同源基因。此外，还提供了可修饰植物，特别是油籽植物与产油生物，包括含油酵母(譬如Yarrowia lipolytica)和植物(譬如，大豆、玉米及向日葵)中长链多不饱和脂肪酸(PUFA)含量及组分的方法与组成。本发明中的Δ15去饱和酶还可通过它们可以作用于两种酶底物油酸和亚油酸的能力来识别。
发明涉及新颖的Δ15去饱和酶以及编码该酶的基因，可以用这种酶来控制生成有益于健康的PUFAs的生化途径。因此，本发明具有很多应用。根据本申请中所公开的方法，PUFAs或其衍生物可用作那些利用静脉营养、或者预防或治疗营养不良的病人的饮食代用品或者添加剂，特别是婴儿配方食品。或者，纯化的PUFAs(或其衍生物)可以加入到菜油、脂肪或配制的人造黄油中，在正常使用中可以使接受者获得足够量的饮食补充。PUFAs还可以加入婴儿配方食品、营养添加剂或其它食物产品中，并可以发现它可作为抗炎或降低胆固醇的试剂使用。此外，组分可用于药学用途(人类的或兽医的)。在此案例中，PUFAs通常通过口服给药，但也可以通过可成功吸收PUFAs的其它任意途径，譬如肠道外(例如皮下、肌内或静脉内)、直肠、阴道或者局部(譬如，作为皮肤软膏或洗剂)给药。
对人或动物补充通过重组方式生产的PUFAs可以提高所加入的PUFAs及其代谢衍生物的水平。例如，使用花生四烯酸(ARA)治疗不仅可以提高ARA的水平，还可提高诸如前列腺素类这样的ARA下游产物的水平。复杂的调控机制让人期望联合使用多种PUFAs、或者添加不同的PUFAs的结合物，以预防、控制或克服这样的机制，在某个个体达到特定PUFAs的期望水平。
在本公开资料范围内将使用大量的术语。
“开放阅读框”缩写为ORF。
“聚合酶链反应”缩写为PCR。
“美国典型培养物保藏中心”缩写为ATCC。
“多不饱和脂肪酸”缩写为PUFA(s)。
术语“串珠镰孢(Fusarium moniliforme)”与Fusarium verticilloides含义相同。
“食品类似物”是人造的、类似其食品副本的象食品一样的产品，无论是肉、干酪、牛奶还是其它类似物，它特意具有其副本的外观、味道和质地。因此，本申请中所用的术语“食品”也包含食品类似物。
“水产饲料”指在涉及淡水或海水中水生生物、动物和/或植物的繁殖、培养或饲养的水产养殖场中使用的饲料。本申请中所用的术语“动物饲料”也包含水产饲料。
术语“脂肪酸”指的是不同链长的长链脂肪族酸(烷酸)，其长度从约C12至C22(尽管已知有更长及更短链长的酸)。多数链长在C16和C22之间。脂肪酸的结构可以通过一个简单的符号体系“X:Y”来表示，其中X是特定脂肪酸中C原子的总数，Y是双键的数目。
一般地，脂肪酸可分为饱和的或不饱和的。术语“饱和脂肪酸”指在碳主链上没有“双键”的那些脂肪酸。相反，“不饱和脂肪酸”在碳主链上有“双键”(它们通常多为顺式构型)。“单不饱和脂肪酸”在碳主链上仅有一个“双键”(譬如，对于棕榈油酸(16:1)及油酸(18:1)而言通常位于第9和第10个碳原子之间)，而“多不饱和脂肪酸”(或“PUFAs”)在碳主链上至少有个双键(譬如，对于亚油酸(18:2)而言位于第9与第10、及第12与第13个碳原子之间；对于α-亚麻酸(18:3)而言位于第9与第10、第12与第13、及第15与第16个碳原子之间)。
“PUFAs”可以分为两个主要的家族(根据离脂肪酸碳链甲基末端最近的第一个双键的位置)。因此，“ω-6脂肪酸”(ω-6或者n-6)在距分子的ω(甲基)末端6个碳原子处有其第一个不饱和双键，并且共有两个或更多双键，后续不饱和键在向着分子羧基末端每再隔3个碳原子处形成。作为对比，“ω-3脂肪酸”(ω-3或者n-3)在距分子的ω末端3个碳原子处有其第一个不饱和双键，并且共有三个或更多双键，后续不饱和键在向着分子羧基末端每再隔3个碳原子处形成。
对本发明来说，将使用ω-参照系统来指明碳原子数目、双键的数目以及距离ω碳最近的双键的位置，从ω碳开始计数(在这个用法中它编号为1)。该命名法如下面的表2中标题为“缩略符号”的列中所示。表中其余部分总结了ω-3与ω-6脂肪酸的常用名、在说明书全文中将使用的缩写、及每种化合物的化学名。
表2
多不饱和脂肪酸的命名法
Figure GSB00000439125500171
特别地，据此将ω-3脂肪酸定义为来自下面列表中的脂肪酸——其中括号内的数字表明双键距脂肪酸羧基末端的位置：α亚麻酸[ALA；18:3(9，12，15)]、硬脂艾杜糖酸[STA；18:4(6，9，12，15)]、二十碳四烯酸[ETA；20:4(8，11，14，17)]、二十碳五烯酸[EPA；20:5(5，8，11，14，17)]、二十二碳五烯酸[DPA；22:5(7，10，13，16，19)]及二十二碳六烯酸[DHA；22:6(4，7，10，13，16，19)]。
类似地，据此将ω-6脂肪酸定义为来自下面列表中的脂肪酸——其中括号内的数字表明双键距脂肪酸羧基末端的位置：亚油酸[LA；18:2(9，12)]、γ-亚油酸[GLA；18:3(6，9，12)]、二高-γ-亚油酸[HGLA或DGLA；20:3(8，11，14)]、花生四烯酸[ARA；20:4(5，8，11，14)]及二十二碳四烯酸[DTA；22:4(7，10，13，16)]。
牵涉到任一种脂肪酸浓度的术语“浓度”，在本申请中指的是样品中个别脂肪酸的量除以所有脂肪酸的总量。ω-3脂肪酸的浓度被定义为样品中所有ω-3脂肪酸(定义如上)的量除以所有脂肪酸的总量。ω-6脂肪酸的浓度被定义为样品中所有ω-6脂肪酸(定义如上)的量除以所有脂肪酸的总量。典型地，脂肪酸浓度可以表示为重量百分比(wt.％-个别脂肪酸的质量除以所有脂肪酸的质量再乘以100％)或摩尔百分比(mol％-个别脂肪酸的摩尔数除以所有脂肪酸的总摩尔数再乘以100％)。
术语“ω-3对ω-6脂肪酸的比例”或“ω-3对ω-6的比例”(n-3/n-6)在本申请中定义为ω-3脂肪酸的浓度除以ω-6脂肪酸的浓度(wt.％ω-3/wt.％ω-6或者mol％ω-3/mol％ω-6)。
术语“必需脂肪酸”指一类特别的PUFA——个体必须摄取才能存活，却无法从无到有合成出必需脂肪酸来。亚油酸(18:2，ω-6)和亚麻酸(18:3，ω-3)两种脂肪酸是“必需脂肪酸”，因为人无法合成它们，必须从食物中获取。
术语“脂肪”指在℃为固体的脂类物质，通常是饱和的。
术语“油脂(oil)”指在25℃为液体的脂类物质，通常是多聚不饱和的。在某些藻类、含油酵母和丝状真菌的油脂中发现PUFAs。“微生物油”或“单细胞油脂”是那些由微生物在其生命期间天然产生的油脂。这些油脂可含有长链PUFAs。
术语“PUFA生物合成途径的酶”指下述同PUFA生物合成相关的酶中的任意一个(以及编码所述酶的基因)，包括：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶和/或碳链增长酶。
术语“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”指的是一系列基因，当它们在适当条件下表达时，所编码的酶可催化ω-3及ω-6脂肪酸的产生。典型地，同ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径相关的基因编码下列酶中的一部分或全部：Δ12去饱和酶、Δ6去饱和酶、碳链增长酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶及Δ4去饱和酶。一个具有代表性的途径如图2所示，用来提供油酸通过多种中间体到DHA的转化方式，该图展示了ω-3及ω-6脂肪酸是如何从普通原料中生成的。途径自然分成两部分，一部分生成ω-3脂肪酸，另一部分只有ω-6脂肪酸。仅生成ω-3脂肪酸的部分在本中请中将指代ω-3脂肪酸生物合成途径，而仅生成ω-6脂肪酸的部分在本申请中将指代ω-6脂肪酸生物合成途径。
在人体内，有证据表明ω-3脂肪酸具有降低血液中三酯酰甘油水平的效果。其它证据支持它具有保护作用可防止致命性心脏病发作。亚油酸和α-亚麻酸均是合成来源于其长链代谢产物的类花生酸(eicosonoids)的前体。在合成过程中，这些代谢产物会竞争相同的酶。那些来源于α-亚麻酸(ω-3)的代谢产物同来源于亚油酸(ω-6)的相比，具有更低的炎症及免疫性效应。α-亚麻酸还可以产生二十二碳六烯酸(DHA)——一种人脑和视网膜的主要成分。α-亚麻酸最丰富的来源是某些种子油，譬如亚麻籽油、油菜籽油、大豆油及某些坚果，尤其是核桃。具有很长链的、可在体内从α-亚麻酸制备的ω-3脂肪酸DHA及二十碳五烯酸(EPA)，可在鱼油和富含油脂的鲜鱼肉(不是罐头金枪鱼)中获取。来自亚麻的诸如亚麻籽油这样富含α-亚麻酸的油脂，还具有工业用途，可作为“干性油”用于清漆及油漆中。
本申请中所用的同ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径相关的术语“功能性的”指在途径中部分(或者所有)基因表达具有活性的酶。可以这样理解：“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”或者“功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”并不是表明上面段落中所示的基因都是必需的，因为很多脂肪酸产物仅需要该途径中部分基因表达即可。
术语“去饱和酶”指可以在一种或多种脂肪酸中可降低饱和度即，引入双键从而生成所需的单或多不饱和脂肪酸或前体的多肽。尽管在本说明全文中对于特定的脂肪酸使用了ω-参照系统，但使用Δ-系统通过从底物的羧基末端开始计数的方式来表明去饱和酶的活性更为便利。本申请中特别关注的是Δ15去饱和酶，它在从分子的羧基末端数起第十五个与第十六个碳原子之间处降低脂肪酸的饱和度，并催化LA转化为ALA。同本发明相关的其它去饱和酶包括：催化油酸转化为LA的Δ12去饱和酶；催化DGLA转化为ETA和/或ARA转化为EPA的Δ17去饱和酶；催化LA转化为GLA和/或ALA转化为STA的Δ6去饱和酶；催化DGLA转化为ARA和/或ETA转化为EPA的Δ5去饱和酶；催化DPA转化为DHA的Δ4去饱和酶；催化EDA转化为DGLA和/或ETrA转化为ETA的Δ8去饱和酶；以及催化软脂酸转化为棕榈油酸和/或硬脂酸转化为油酸(18:1)的Δ9去饱和酶。在本领域中，Δ15及Δ17去饱和酶有时也称为“omega-3去饱和酶”、“w-3去饱和酶”、和/或“ω-3去饱和酶”。某些去饱和酶对两种或多种底物均有活性(譬如，异丝水霉(Saprolegnia diclina)Δ17去饱和酶的底物包括ARA和DGLA，线虫ω-3去饱和酶的底物包括LA和GLA，本申请中描述的串珠镰孢Δ15去饱和酶的底物包括LA、GLA和DGLA)。
术语“双功能”在涉及本发明中Δ15去饱和酶时指的是具有同时以油酸及亚油酸作为酶底物的能力的多肽。关于“酶底物”，指的是多肽在活性位点上结合的、并以催化方式与其作用的底物。
术语“与Yarrowia lipolytica Δ12去饱和酶同源的蛋白”指的是本申请中SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18与20所确定的、与本申请中SEQ ID NO：55(在共同待决美国专利申请10/840325中确定，其内容通过参考的方式整合在本申请中)所确定的Y.lipolytica去饱和酶具有同源性的蛋白。系统发育分析表明这些蛋白(即，SEQ IDNOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18和20)归于两个不同的亚族中，在本申请中为“亚族1”及“亚族2”。特别地，亚族1中的蛋白(即，SEQID NOs：2、6、10、14和18)——如本申请所鉴定，编码Δ15去饱和酶。相反，亚族2中的蛋白编码具有Δ12去饱和酶活性的蛋白(即，SEQ ID NOs：4、8、12、16和20；参见共同待决美国专利申请60/570679，其内容通过参考的方式整合在本申请中)。
术语“转化率”及“底物转化百分比”指的是特定的酶(譬如，去饱和酶或者碳链增长酶)将底物转化为产物的效率。转化率根据下面的公式来计算：([产物]/[底物+产物])×100，其中“产物”包括中间产物以及途径中由它衍生的所有产物。在本申请中，期望能够鉴定那些在诸如含油酵母宿主这样的真核生物中表达时具有高底物转化百分比(([18:31/[18:2+18:3])×100)的Δ15去饱和酶；这样，例如，至少约为50％的ALA转化率是可用的，至少约为80％的ALA转化率是优选的，而至少约为90％的ALA转化率是特别优选的，至少约为95％的ALA转化率是最优选的。
术语“碳链增长酶”指的是能够增加脂肪酸的碳链并生成比碳链增长酶所作用的脂肪酸底物长两个碳的酸的多肽。碳链增长过程是一个同脂肪酸合成酶相关的多步机制，在这里CoA是酰基载体(Lassner等，The Plant Cell 8：281-292(1996))。简单说，丙二酰-CoA同长链酰基-CoA缩合，生成CO2及β-酮脂酰-CoA(其中酰基部分增长了两个碳原子)。随后的反应包括还原成β-羟酰-CoA、脱水生成烯酰-CoA、及再次还原生成已增长的酰基-CoA。碳链增长酶所催化的反应的实施例有GLA转化为DGLA、STA转化为ETA及EPA转化为DPA。因此，碳链增长酶可以具有不同的特异性。例如，C16/18碳链增长酶优先使用C16底物，C18/20碳链增长酶优先使用C18底物，C20/22碳链增长酶优先使用C20底物。Δ9碳链增长酶可以类似方式分别催化LA及ALA转化为EDA与ETrA。
术语“含油的”指的是那些通常以脂类形式储存其能源的生物(Weete，In：Fungal Lipid Biochemistry，2nd ed.，Plenum，1980)。它们包括油籽植物(譬如，大豆、谷物、红花、向日葵、芥花籽、油菜籽、亚麻、玉米及报春花)与微生物(譬如，破囊壶菌(Thraustochytriumsp.)、Schizochytrium sp.、被孢霉菌(Mortierella sp.)及某些含油酵母)。
术语“含油酵母”指的是那些被归为酵母一类且可含油的微生物。通常，含油微生物中细胞内油脂或三酯酰甘油的含量遵从S型曲线，其中脂类的浓度开始是增加的，并在指数生长期末期或平稳增长期前期达到最大值，然后在平稳期末期及死亡期期间逐渐下降(Yongmanitchai and Ward，Appl.Environ.Microbiol.57：419-25(1991))。含油微生物累积了超过其细胞干重约25％的油脂的情况并不常见。含油酵母的实施例包括，但不局限于下列属：Yarrowia、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属、丝孢酵母属及油脂酵母属。
术语“可发酵的碳底物”是指微生物可以代谢并产生能量的碳源。本发明中典型的碳源包括，但不局限于：单糖、寡糖、多糖、烃类、脂肪酸、脂肪酸酯、甘油一酯、二氧化碳、甲醇、甲醛、甲酸酯及含碳的胺。
术语“密码子优化”当其涉及用于转化多种宿主的基因或核酸片段的编码区时，所指的是在不改变DNA所编码的多肽的前提下，改变基因或核酸片段的编码区的密码子使其与宿主中典型的密码子使用情况相符。
在本申请用法中，“分离的核酸片段”是一段单链或者双链的RNA或DNA多聚体，可含有合成的、非天然的或者改造的核苷酸碱基。DNA多聚体形式的分离的核酸片段可以是由一个或多个cDNA、基因组DNA或合成的DNA片段所组成的。术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”及“核酸片段”/“分离的核酸片段”在本申请中可替换使用。这些术语包含核苷酸序列及其它类似名称。多核苷酸可以是单链或者双链的RNA或DNA多聚体，可含有合成的、非天然的或者改造的核苷酸碱基。DNA多聚体形式的多核苷酸可以是由一个或多个cDNA、基因组DNA、合成的DNA片段或其混合物所组成的。核苷酸(通常以其5′-一磷酸的形式存在)通常使用单个字母来指代，如下所示：“A”为腺苷酸或者脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”为胞苷酸或者脱氧胞苷酸，“G”为鸟苷酸或者脱氧鸟苷酸，“U”为尿苷酸，“T”为脱氧胸苷酸，“R”为嘌呤(A或G)，“Y”为嘧啶(C或T)，“K”为G或T，“H”为A或C或T，“I”为次黄嘌呤，“N”为任意核苷酸。
术语“功能上等价的亚片段”及“功能等价亚片段”在本申请中可替换使用。这些术语指的是某个分离的核酸片段的一部分或亚序列，其中无论该片段或者亚片段是否编码具有活性的酶，依然保存着改变基因表达或者产生某种表型的能力。例如，片段或亚片段可用于在转化植株中产生所需表型的嵌合基因的设计中。可通过连接相对于植物启动子序列正向或反向的无论是否编码活性酶的核酸片段或其亚片段的方式来设计用于抑制作用中的嵌合基因。
当核酸片段的单链形式可同其它核酸片段在适当的温度及溶液离子强度条件下退火时，核酸片段同另一个核酸片段，譬如，cDNA、基因组DNA或RNA分子是“可以杂交”的。杂交及洗涤条件是众所周知的，并在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.Molecular  Cloning：ALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)中、尤其是11章与其中的表11.1(通过参考的方式完全整合在本申请中)中有例证。温度和离子强度的条件决定了杂交的“严谨性”。可以调整严谨条件，用于筛选中度相似片段(诸如来自远源生物的同源序列)至高度相似片段(诸如来自关系密切的生物中功能相同的酶的基因)。杂交后洗涤决定了严谨条件。一套优选的条件应用一系列的洗涤，室温下6×SSC、0.5％SDS洗15min，然后是45℃、2×SSC、0.5％SDS洗30min、接着50℃、0.2×SSC、0.5％SDS、30min洗2次。一套更优选的严谨条件应用了更高的温度，其中洗涤条件与上面的相同，只是最后两次0.2×SSC、0.5％SDS、30min洗涤的温度增高到60℃。另一套优选的高严谨条件在最后应用两次65℃、0.1×SSC、0.1％SDS的洗涤。还有一套严谨条件，包括在65℃、0.1×SSC、0.1％SDS条件下杂交，并在譬如，0.1×SSC、0.1％SDS之后，使用2×SSC、0.1％SDS洗涤。
杂交要求两个核酸含有互补序列，尽管依赖于杂交条件的严谨性，但碱基间的错配也是可以的。对于杂交的核酸而言，适当的严谨性依赖于核酸的长度及互补程度这些本领域中所周知的变量。两个核苷酸序列之间相似性或同源性的程度越高，具有这些序列的核酸杂交时的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(同较高的Tm相对应)按下列顺序递减：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度大于100个核苷酸的杂交，已经有公式用于计算Tm(参见Sambrook等，同上，9.50-9.51)。对于较短的核酸序列，即寡核苷酸的杂交，错配的位置变得更为重要，寡核苷酸的长度决定了它的特异性(参见Sambrook等，同上，11.7-11.8)。在一个实施例中，可杂交的核酸长度至少为约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的的最小长度为至少约15个核苷酸；更优选地为至少约20个核苷酸；最优选地长度为至少约30个核苷酸。此外，熟练的技术人员都知道在必要时可以根据诸如探针长度这样的因子来调节温度及洗涤溶液盐浓度。
氨基酸或核苷酸序列的“实质部分”指的是包含了多肽中足够的氨基酸序列或者基因中足够的核苷酸序列的组分，根据本领域中熟练的工作人员对序列的手工估算，或通过使用诸如BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool；Altschul，S.F.，等，J.Mol.Biol.215：403-410(1993))这样的算法用计算机自动对序列进行对比和鉴定，利用这些组分即可推测并鉴定多肽或基因。一般而言，为了推测鉴定多肽或核酸序列与已知蛋白或基因的同源性，需要已知10个或以上连续氨基酸或30个或以上核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个连续核苷酸的基因特异的寡核苷酸探针可用于序列依赖的基因鉴定(例如Southern杂交)和分离(例如细菌克隆或噬菌体斑的原位杂交)。另外，12-15个碱基的短寡核苷酸可用作PCR扩增引物，以获得包含引物在内的特定核酸片段。因此，核酸序列的“实质部分”含有足以特异性鉴定和/或分离含该序列的核酸片段的序列。本说明书中介绍了编码特定真菌蛋白的完整的核苷酸序列和氨基酸序列。由于本申请报道了这些序列的益处，熟练的技术人员现在可以使用本发明所公开的序列的全部或实质部分用于本领域的技术人员已知的用途。因此，本发明包含序列列表中报道的全序列，以及这些序列如上定义的实质部分。
术语“互补的”用于描述可相互杂交的核苷酸碱基间的关系。例如，关于DNA，腺嘌呤同胸腺嘧啶互补，胞嘧啶同鸟嘌呤互补。因此，本发明也包括可以序列列表中报道的全序列互补的分离的核酸片段，以及那些足够相似的核酸序列。
术语“同一性百分比”，如本领域中所周知的那样，指的是两个或多个多肽序列或者两个或多个多聚核苷酸序列之间的关系，通过比较这些序列来确定。在本领域中，“同一性”也指多肽或多聚核苷酸序列之间序列相关的程度，例如，可以是由这些序列的字串之间的匹配程度来确定。“同一性”和“相似性”可以通过已知方法容易算出，包括但不局限于下面著作中所述的方法：1.)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.，Ed.)Oxford University：NY(1988)；2.)Biocomputing： Informatics and Genome Proiects(Smith，D.W.，Ed.)Academic：NY(1993)；3.)Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，Eds.)Humania：NJ(1994)；4.)Sequence Analysis in  Molecular Biology(von Heinje，G，Ed.)Academic(1987)；及5.)Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.and Devereux，J.，Eds.)Stockton：NY(1991)。用于确定同一性的优选的方法其本意应该是能够在所检验的序列中给出最佳匹配。用于确定同一性和相似性的方法已编程用于很多公开的计算机程序中。序列比对及同一性百分比的计算可以使用LASERGENE生物信息学计算系列(DNASTAR Inc.，Madison，WI)中的Megalign程序来执行。如未有其它说明，序列的多重比对使用比对的Clustal方法(Higgins and Sharp，CABIOS.5：151-153(1989))利用缺省参数(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTHPENALTY＝10)来执行。使用Clustal方法进行成对比对的缺省参数为：KTUPLE 1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5及DIAGONALSSAVED＝5。
合适的核酸片段(本发明中的分离的多聚核苷酸)编码同本申请中所报道的氨基酸序列有至少约70％的同一性、优选地为至少约75％的同一性、最优选地为至少约80％的同一性的多肽。优选的核酸片段编码同本申请中所报道的氨基酸序列有约85％同一性的氨基酸序列。更优选的核酸片段编码同本申请中所报道的氨基酸序列有至少约90％同一性的氨基酸序列。最更优选的是编码同本申请中所报道的氨基酸序列有至少约95％同一性的氨基酸序列的核酸片段。合适的核酸片段不仅具有上述的同源性，而且一般都编码至少含50个氨基酸的多肽，优选地为至少100个氨基酸，更优选地为至少150个氨基酸，更加优选地为至少200个氨基酸，最优选地为至少250个氨基酸。
术语“同源性”、“同源的”、“基本上类似”及“基本上相当于”在本申请中可替换使用。它们指的是其中一个或多个核苷酸碱基的改变并不影响该核酸片段进行基因表达或者产生特定表型的能力的核酸片段。这些术语也指本发明中核酸片段的修饰，譬如相对于初始的、未修饰的片段，在基本上并未改变该核酸片段功能特性的一个或者多个核苷酸的删除或插入。因此可以明白，正如本领域的技术人员所意识到的，本发明包含了比明确示范的序列还要多的序列。
术语“直系同源”或“直系同源序列”在本申请中指的是物种形成后序列趋异的关系(即，在不同物种中来自于物种形成时共同祖先基因的同源序列)。相反，术语“并系同源”指的是由于基因重复所形成的单个物种中的同源序列。本领域的技术人员熟悉鉴别同源、直系同源及并系同源序列的所需技术。
此外，熟练的技术人员公认：本发明中所包含的基本上类似的核酸序列，也可以通过在适当严谨条件下(例如，0.5×SSC，0.1％ SDS，60℃)与本申请所示范的序列、或在功能上等价于本申请中公开的任一核酸序列的本申请所公开的核酸序列的任一部分进行杂交的能力来定义。可以调整严谨条件，用于筛选中度相似片段，诸如来自远源生物的同源序列，至高度相似片段，诸如来自关系密切的生物中功能相同的酶的基因。杂交后洗涤也决定了严谨条件。一套优选的条件应用一系列的洗涤，室温下6×SSC、0.5％ SDS洗15min，然后是45℃、2×SSC、0.5％ SDS洗30min、接着50℃、0.2×SSC、0.5％SDS、30min洗2次。一套更优选的严谨条件应用了更高的温度，其中洗涤条件与上面的相同，只是最后两次0.2×SSC、0.5％SDS、30min洗涤的温度增高到60℃。另一套优选的高严谨条件在最后应用两次65℃、0.1×SSC、0.1％SDS的洗涤。
“密码子简并性”指的是在不改变所编码多肽的氨基酸序列的情况下、遗传密码允许核酸序列中存在变异的性质。熟练的技术人员很注意由于特定宿主细胞对某个特定的氨基酸在核苷酸密码使用上所表现出的“密码子偏爱”。因此，当合成用于在宿主细胞中增加表达的基因时，期望能够对该基因进行设计，使得其中密码子使用的频率接近宿主细胞中优选的密码子使用频率。
“化学合成”同DNA序列相关时，指的是作为组成的核苷酸是在体外组合的。DNA人工化学合成可以使用已制定好的步骤来完成；或者使用某种已大量商品化的机器来进行自动化学合成。“人造基因”可以使用本领域的技术人员熟知的程序从化学合成的寡核苷酸构件中来组合。连接并退火这些构件以形成此后酶学上可组装的基因片段，从而构建完整基因。因此，基于可反映宿主细胞中密码子偏爱性的最优的核苷酸序列，可对基因进行剪裁以实现最佳的基因表达。熟练的技术人员懂得倘若密码子的使用与宿主偏爱的密码子有偏差，成功进行基因表达的可能性会是怎样。基于对来源于宿主细胞中的、其中序列信息是可用的基因的调查，可以确定优选的密码子。
“基因”指的是可以表达特定蛋白的核酸片段，也可以单独指编码区，或者也可包括编码区前面(5′非编码序列)及后面(3′非编码序列)的调控序列。“天然基因”指的是在天然状态发现的带有自己调控序列的基因。“嵌合基因”指的是非天然基因的基因，所包含的调控与编码序列在天然状态下不在一起。因此，嵌合基因可以含有不同来源的调控序列与编码序列，或者调控序列与编码序列虽然来源相同，但以天然状态下不存在的方式排列。“内源基因”指的是天然基因位于生物基因组中天然的位置上。“外源”基因指的是通过转基因导入宿主生物中的基因。外源基因可以包含转入非天然生物中的天然基因、转入其天然宿主中新的位点上的天然基因、或者嵌合基因。“转基因”是通过转化程序导入基因组中的基因。“密码子优化的基因”是指其密码子使用频率设计成与宿主细胞中优选的密码子使用频率相似的基因。
“等位基因”是占据染色体上给定座位的基因的几种可选形式中的一种。当位于染色体上给定座位的所有等位基因均相同时，植物在这个座位上为纯合子。如果位于染色体上给定座位的等位基因有差别，植物在这个座位上为杂合子。
“编码序列”指的是编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指的是位于编码区上游(5′非编码序列)、中间、或下游(3′非编码序列)，并且影响转录、RNA加工或稳定、或者相关编码序列的翻译的核苷酸序列。调控序列可以包括启动子、翻译引导序列、内含子、多聚腺苷酸识别序列、RNA加工位点、效应物结合位点及茎环结构。
“启动子”指的是能够控制编码序列或功能RNA表达的DNA序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子序列由近端及更远的上游元件组成，后者经常用来指增强子。因此，“增强子”是能够刺激启动子活性的DNA序列，也可以是启动子的固有元件，或者是插入的用来增强启动子水平或组织特异性的异源元件。启动子可以整个都来源于天然基因，或者由来源于天然状态的不同启动子的不同元件所组成，甚至还可含有合成的DNA片段。本领域的技术人员知道，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中、或在发育的不同阶段、或对不同的环境条件作出的应答中指导基因表达。进一步可意识到，由于在绝大多数情况下，调控序列盒的精确边界并未完全确定，因此某些变异体的DNA片段可以有相同的启动子活性。在绝大多数时刻、绝大多数细胞类型中均导致基因表达的启动子通常称为“组成型启动子”。持续发现了可用于植物细胞中的多种类型的新启动子；可在Okamuro，J.K.，and Goldberg，R.B.(1989)Biochemistry of Plants 15：1-82编辑的文中发现大量的实施例。
“翻译引导序列”指的是位于基因的启动子序列与编码序列之间的多聚核苷酸序列。翻译引导序列位于完全加工后的mRNA中翻译起始序列的上游。翻译引导序列可以影响初级转录物加工为mRNA、mRNA的稳定性或者翻译效率。翻译引导序列的实施例已有描述((Turner，R.and Foster，G.D.(1995)Mol.Biotechnol.3：225-236)。
术语“3′非编码序列”及“转录终止子”指的是位于编码序列下游的DNA序列。它包括多聚腺苷酸识别序列以及编码可影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其它序列。多聚腺苷酸信号通常表现出影响多聚腺苷酸添加到mRNA前体3′末端的特征。3′区可影响转录、RNA加工或稳定、或者相关编码序列的翻译。
“RNA转录物”指的是一段DNA序列经RNA聚合酶催化转录生成的产物。当RNA转录物是DNA序列完全互补的拷贝时，称其为初级转录物，若是来源于初级转录物经转录后加工的RNA序列，则称之为成熟的RNA。“信使RNA”或“mRNA”指的是没有内含子、可以被细胞翻译成蛋白的RNA。“cDNA”指的是来源于mRNA并与之互补的双链DNA。“正义”RNA指的是包括mRNA的RNA转录物，可被细胞翻译为蛋白。“反义RNA”指的是同全部或部分目标初始转录物或者mRNA互补的RNA转录物，可以阻断靶基因的表达(U.S.5,107,065；WO99/28508)。同反义RNA互补的可以是特定基因转录物的任一部分，即，5′非编码序列、3′非编码序列或者编码序列。“功能RNA”指的是反义RNA、核酶RNA或者其它并不翻译但仍对细胞活动有影响的其它RNA。
术语“可通过操作连接”指的是单个核酸片段上核酸序列的联系，某个序列的功能会受其它序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(即，编码序列处于启动子的转录控制下)，它与编码序列即为可通过操作连接。编码序列可与调控序列以正义或反义方向进行可通过操作连接。在另一个实施例中，互补的RNA区域可以直接或间接地、在5′端或3′端可通过操作连接到靶mRNA上，或者是位于靶mRNA内部，或者是第一个互补区域位于靶mRNA的5′端，它同靶mRNA的3′端互补。
本申请中所用的术语“表达”，指的是生成了有功能的终产物譬如，mRNA或蛋白(前体或成熟的)。
本申请中所用的术语“表达盒”，指的是可以向其中移入核酸序列或片段的、由各分散部分所组成的核酸片段。
“成熟”蛋白指的是经翻译后加工的多肽；即，初级翻译产物中任一前肽或前体肽均被除去的多肽。“前体”蛋白指的是mRNA翻译后的初级产物；即，依然存在前肽和前体肽。前肽和前体肽可以是、但并不局限于细胞内定位信号。
“转化”指的是将核酸片段转入宿主生物中，并导致遗传学上稳定的遗传。核酸片段可以是质粒，譬如，它可自主复制；或者，它可整合到宿主生物的基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物称为“转基因”或“重组”或“转化”生物。
“稳定转化”指的是将核酸片段转入宿主生物基因组，包括核基因组和细胞器基因组中，并导致遗传学上稳定的遗传。相反，“瞬时转化”指的是在不整合或者无稳定遗传的前提下，将核酸片段转入宿主生物的细胞核或含DNA的细胞器中，并导致基因表达。含有转化核酸片段的宿主生物称为“转基因”生物。
“反义抑制”指的是生成了可抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物。“共抑制”指的是生成了可抑制相同的或基本上相似的外源或者内源基因的正义RNA转录物(美国专利No.5,231,020)。先前已通过以正义方向过量表达与内源mRNA具有同源序列的核酸序列的方法，来设计植物中的共抑制构建体，这样可以减少所有与过量表达的序列具有同源性的RNA(参见Vaucheret等(1998)Plant J.16：651-659；及Gura(2000)Nature 404：804-808)。该现象的总体效率较低，所减少的RNA的范围变化很大。近来的工作描述了以互补方向整合到所有或部分mRNA编码序列中的“发夹”结构的应用，它可使所表达的RNA具有潜在的“茎环”结构(于1999年10月21日发布的PCT Publication WO99/53050，以及更近的、于2002年1月3日发布的国际发布号为WO02/00904的申请者代理人的PCT Application)。这在所获得的转基因植物中可增加共抑制的频率。另一个不同的文献描述了直接使用植物病毒序列来抑制或者“沉默”邻近的mRNA编码序列(于1998年8月20日发布的PCT Publication WO 98/36083)尽管已有用来阐述这种复杂情形的遗传学证据，但这两种共抑制现象仍未彻底从原理上得到阐明(Elmayan等(1998)Plant Cell 10：1747-1757)。
用来进行抑制的多聚核苷酸序列并不需要与被抑制的基因中的多聚核苷酸序列具有100％的互补性。例如，对于大豆种子贮存蛋白β-伴大豆球蛋白的所有亚基，可以通过使用来源于该基因编码α-亚基部分的多聚核苷酸来对它们进行抑制(美国专利No.6,362,399)。β-伴大豆球蛋白是一种鉴定为由α、α′及β三个富含负电的亚基的不同组合所组成的异源糖蛋白。编码α与α′亚基的多聚核苷酸序列之间具有85％的同一性，而编码β亚基的多聚核苷酸序列与编码α与α′亚基的相比有75-85％的同一性。因此，与所要抑制的靶多聚核苷酸某个区域具有至少75％同一性的多聚核苷酸可以对期望的靶分子表现出有效抑制。多聚核苷酸应该有至少80％的同一性，优选地为至少90％的同一性，最优选地为至少95％的同一性，或者多聚核苷酸可以与期望的靶分子具有100％的同一性。
术语“质粒”、“载体”及“盒”指的是通常携带那些不属于细胞重要代谢部分的基因的额外的染色体元件，常见的形式为环状双链DNA片段。这类元件可以是自主复制的序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性的或环状的、单链或者双链的DNA或RNA，其来源不限，其中将很多核酸序列结合或重组成独特的构建体，它可以将譬如，用于选择基因产物的启动子片段和DNA序列与合适的3′非翻译序列一起导入细胞中。
“转化盒”指的是含有外源基因、并具有除外源基因之外用于促进特定宿主细胞进行转化的元件的特定载体。“表达盒”指的是含有外源基因、并具有除外源基因之外用于增强该基因宿主细胞中进行表达的元件的特定载体。
术语“重组”指的是通过譬如，化学合成或者使用基因工程技术对分离的核酸区段进行处理，使得序列中两个不同的分离的区段人为地结合在一起。
术语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”及“重组DNA构建体”在本申请中可替换使用。重组构建体含有人工结合在一起的核酸片段即，在天然状态下并不是在一起的调控盒编码序列。例如，嵌合构建体可以含有来自不同来源的调控序列及编码序列，或者是调控序列盒编码序列来自同一来源，但其排列方式与天然状态下的并不同。这类构建体可以单独使用，或者同载体联合起来使用。如果使用了载体，那么载体的选择依赖于转化宿主细胞时所用的方法——这对本领域的技术人员是已知的。例如，可以使用质粒载体。熟练的技术人员会非常注意载体上必须存在的遗传元件，以成功进行转化、选择并增殖含有本发明中任一分离的核酸片段的宿主细胞。熟练的技术人员也公认，不同的、独立的转化过程所导致的表达水平及模式也不同(Jones等，(1985)EMBO J.4：2411-2418；De Almeida等，(1989)Mol.Gen.Genetics 218：78-86)，因此应对多个过程进行筛选，以获得表现出期望表达水平与模式的路线。这类筛选可以通过DNA的Southern分析、mRNA表达的Northern分析、蛋白表达的免疫印迹分析、或者尤其是表型分析来完成。
术语“同源重组”指的是两个DNA分子之间DNA片段的交换(在交换期)。交换的片段是两个DNA分子具有相同核酸序列的位点(即，“同源区”)侧翼的片段。术语“同源区”指的是在参与同源重组的核酸片段上彼此之间具有同源性的核酸序列范围。在这些同源区的长度为至少约10bp、优选地长度为至少约50bp，可发生有效的同源重组。典型地，易于重组的片段至少含有两个同源区，在那里可期望靶基因断裂或置换。
“PCR”或者“聚合酶链反应”是一种用来合成大量特定DNA区段的技术，由一系列重复的循环所组成(PerkinElmer CetusInstruments，Norwalk，CT)。典型地，双链DNA被热变性，两个与靶区段3′边界相互补的引物在低温下退火，然后在中间温度下进行延伸。一整套这三个连续的步骤被称为一个循环。
术语“序列分析软件”指的是可用于核酸或氨基酸序列分析的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可以是已商业化的或者独立开发的。典型的序列分析软件包括、但并不局限于：1.)GCG程序系列(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4.)Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)；以及5.)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.Editor(s)：Suhai，Sandor.Plenum：NewYork，NY)。在本申请的全文中，可以认为在使用序列分析软件进行分析的地方，如未有特别说明，分析结果均基于所引用程序的“缺省值”。在本申请用法中，“缺省值”指的是当软件第一次启动运行时其最初载入的那一套值或参数。
本申请中所用的标准重组DNA及分子克隆技术，在本领域中是众所周知的，并在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.，Molecular  Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(在下文中为“Maniatis”)、Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.and Enquist，L.W.，Experiments with  Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)、以及Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular  Biology，Greene Publishing Assoc.与Wiley-Interscience出版(1987)中均有描述。
脂肪酸的微生物生物合成
一般而言，含油微生物体内的脂类累积是为了适应生长培养基中总的碳氮比例而触发的(图1)。当细胞耗尽了可用的氮源供应时(譬如，当碳氮比高于约40时)，细胞内一磷酸腺苷(AMP)的耗竭会导致线粒体中AMP依赖的异柠檬酸去饱和酶活性的终止并累积柠檬酸盐，柠檬酸被输送到细胞液中，随后由ATP-柠檬酸裂解酶剪切柠檬酸从而产生乙酰-CoA。乙酰-CoA是从头合成脂肪酸的主要构建材料。虽然任何可在代谢后有效产生乙酰-CoA的化合物均可作为脂肪酸的前体，但葡萄糖是这类反应中的主要原料(图1)。葡萄糖经过糖酵解可转化为丙酮酸，然后丙酮酸可以被输送到线粒体中，在那里通过丙酮酸去饱和酶(“PD”)转化为乙酰-CoA。由于乙酰-CoA不能跨过线粒体膜直接输送到细胞质中，因此乙酰-CoA上的两个碳与草酰乙酸缩合生成柠檬酸(由柠檬酸合成酶催化)。柠檬酸可直接输送到细胞质中，在那里它被ATP-柠檬酸裂解酶剪切，重新生成乙酰-CoA和草酰乙酸。草酰乙酸通过转化为苹果酸再进入三羧酸循环。
丙二酰-CoA的合成是脂肪酸生物合成的第一个所需步骤，在细胞质中进行。丙二酰-CoA通过乙酰-CoA羧化酶(“ACC”)对乙酰-CoA的羧化而产生。脂肪酸合成由多酶脂肪酸合成酶复合物(“FAS”)催化，其过程是通过8个二碳片段(乙酰-CoA中的乙酰基团)的缩合来形成一个16个碳的饱和脂肪酸——软脂酸。更具体地，FAS催化一系列的7个反应，包括下面步骤(Smith，S.FASEB J，8(15)：1248-59(1994))：
1.乙酰-CoA和丙二酰-CoA被传递到FAS的酰基载体蛋白(ACP)上。然后酰基基团被转移到丙二酰基团上，形成β-酮丁酰-ACP并释放CO2。
2.β-酮丁酰-ACP经还原(通过β-酮脂酰还原酶)及脱水(通过β-羟酰脱水酶)形成反-单不饱和脂酰基基团。
3.由NADPH还原双键，产生比初始物长两个碳的饱和脂酰基基团。然后丁酰基团可与新的丙二酰基团缩合并重复碳链增长过程的能力再次恢复。
4.当脂酰基基团有16个碳长时，硫酯酶活性将其水解，释放出游离的软脂酸。
软脂酸(16:0)是由位于内质网膜上的碳链增长酶和去饱和酶的作用所形成的、具有更长碳链的饱和及不饱和脂肪酸(譬如，硬脂酸(18:0)、棕榈油酸(16:1)与油酸(18:1))的前体。软脂酸和硬脂酸(视为CoA和/或ACP酯)可通过Δ9去饱和酶作用，分别转化为其不饱和的衍生物——棕榈油酸(16:1)和油酸(18:1)。
三酯酰甘油(脂肪酸主要的贮存单位)是通过两个分子的脂酰-CoA与甘油-3-磷酸的酯化作用以生成1，2-二酯酰甘油磷酸(通常视为磷脂酸)的方式来形成的(图1)。然后磷酸可由磷脂酸磷酸酯酶除去，生成1，2-二酯酰甘油。通过添加第三个脂肪酸，例如通过二酯酰甘油酰基转移酶的作用来形成三酯酰甘油。
ω-脂肪酸的生物合成
简单来说，将LA转化为GLA、DGLA及ARA(ω-6途径)以及将ALA转化为STA、ETA、EPA、DPA及DHA(ω-3途径)的代谢过程包括通过添加二碳单元的碳链增长与在分子中引入双键的脱氢作用(图2)。这需要位于内质网膜上的一系列具有特定脱氢作用及碳链增长的酶的参与。
ω-6脂肪酸
油酸在Δ12去饱和酶的作用下转化为LA(18:2)最初的ω-6脂肪酸。后续的ω-6脂肪酸按下述步骤生成：1.)LA在Δ6去饱和酶的作用下转化为GLA；2.)GLA在碳链增长酶的作用下转化为DGLA；以及3.)DGLA在Δ5去饱和酶的作用下转化为ARA。
ω-3脂肪酸
亚油酸(LA)在Δ15去饱和酶的作用下转化为ALA，即最初的ω-3脂肪酸。后续的ω-3脂肪酸按一系列ω-6脂肪酸中相似的步骤生成。具体地：1.)ALA在Δ6去饱和酶的作用下转化为STA；2.)STA在碳链增长酶的作用下转化为ETA；以及3.)ETA在Δ5去饱和酶的作用下转化为EPA。或者，ETA和EPA可以在Δ17去饱和酶的作用下分别由DGLA和ARA生产。EPA在碳链增长酶及Δ4去饱和酶的作用下还可以进一步转化为DHA。
在另一实施例中，Δ4碳链增长酶能够分别催化LA及ALA转化为EDA及ETrA。然后Δ8去饱和酶将这些产物分别转化为DGLA及ETA。
与生成ω脂肪酸相关的基因
很多微生物——包括藻类、细菌、霉菌及酵母，均可在细胞代谢的正常过程中合成PUFAs及ω脂肪酸。已经特别进行了充分研究的是包括Schizochytrium aggregatm、破囊壶菌属中的多个种及Morteriellaalpina在内的真菌。此外，很多腰鞭毛目(Dinophyceaae)的生物也天然产生高浓度的PUFAs。同样地，已通过遗传学方法鉴定了多种同油脂生成相关的基因，其中某些这类基因的DNA序列已是公开可用的(非限制性的实施例如下面表3所示)：
表3
某些同PUFA生成相关的公开可用的基因
Figure GSB00000439125500341
Figure GSB00000439125500351
续表3
某些同PUFA生成相关的公开可用的基因
Figure GSB00000439125500361
此外，专利文献提供了很多其它的参与油脂生成的基因的DNA序列(和/或涉及上述某几个基因的详细资料以及它们的分离方法)。参见，例如：U.S.5,968,809(Δ6去饱和酶)；U.S.5,972,664与U.S.6,075,183(Δ5去饱和酶)；WO 91/13972与U.S.5,057,419(Δ9去饱和酶)；U.S.2003/0196217 A1(Δ17去饱和酶)；WO 02/090493(Δ4去饱和酶)；WO 94/11516、U.S.5,443,974与美国专利申请No.10/840325(Δ12去饱和酶)；WO 00/12720与U.S.2002/0139974A1(碳链增长酶)。这些专利及申请的每一个均以参考的方式将其内容整合在本申请中。
本申请中特别关心的是Δ15去饱和酶，更具体地，可以在含油酵母(譬如，Yarrowia lipolytica)中用来进行异源表达的Δ15去饱和酶。在本领域中编码Δ15去饱和酶的基因是已知的。例如，它们先前已经从植物(譬如拟南芥、Brassica napus、Glycine max((WO 93/11245))、蓝细菌及线虫中被克隆。此外，在本申请所描述的申请人的发明之后，在WO 03/099216(于2003年12月4日公开)中还揭示了来自粗糙链孢霉、Botrytis cinerea及构巢曲霉的真菌Δ15去饱和酶。
很多因素影响对特定的具有Δ15去饱和酶活性的多肽进行选择，它会在宿主细胞中表达产生PUFAs(可与其它去饱和酶及碳链增长酶一起作用)。根据宿主细胞、底物的可用性及所期望的终产物，有几个多肽值得关注。不过，在选择特定的具有去饱和酶活性的多肽时需要考虑的情况包括多肽的底物特异性、是否多肽或其组分是限速酶、是否该去饱和酶对合成期望的PUFA而言是必需的、和/或多肽所需的辅助因子。优选地，所表达的多肽与其在宿主细胞中所处的生化环境具有相一致的参数。例如，多肽可以与宿主细胞中的其它酶竞争底物。因此对多肽的KM及特异活性的分析可用来确定在给定的宿主细胞中，所给定的多肽用于调节PUFA产物的适合程度。用于特定宿主细胞中的多肽，它可以在该宿主细胞的生化条件下具有功能，然而在其它方面它可以是具有能够修饰期望脂肪酸(即，LA)的Δ15去饱和酶活性的任何多肽。因此，序列可来自任何来源，譬如，从天然来源(来自细菌、藻类、真菌、植物、动物等)中分离，通过半合成途径或从头合成来产生。
为了在本申请中实现本发明的目标，当在期望的真核宿主细胞中进行表达时，使用转化率(即，([18:3]/[18:2+18:3])×100)为至少约50％的具有Δ15去饱和酶活性的多肽是有益的，其中至少约80％的转化率是更佳的，更优选至少约90％的转化率，最优选至少约95％的转化率。
新颖的真菌Δ15去饱和酶的鉴定
已知几种真菌，包括丝状真菌稻瘟病菌、粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)、构巢曲霉、禾谷镰孢和串珠镰孢(Fusarium moniliforme)可以产生18:3(WO 03/099216；WO 03/099216)。考虑到本申请中所公开的指导和发现，这些真菌中的每一个均可期望具有Δ15去饱和酶活性。这些序列特别用于在含油酵母(譬如，Yarrowia lipolytica)中的基因表达。
通过使用Yarrowia lipolytica Δ12去饱和酶蛋白序列(SEQ ID NO：55)作为查询序列进行序列比较，在串珠镰孢中鉴定了一种新颖的Δ15去饱和酶。具体地，这个Yarrowia查询序列被用于在DuPont所有的串珠镰孢M-8114株的表达序列标签(EST)库(E.I.du Pont de Nemoursand Co.，Inc.，Wilmington，DE)中查找推定的编码蛋白序列。其结果是鉴定了分别由核苷酸序列SEQ ID NOs：1和3编码的两个同源序列：Fm1(SEQ ID NO：2)和Fm2(SEQ ID NO：4)。
Yarrowia Δ12去饱和酶序列也可用作公共数据库中几个丝状真菌的查询序列；特别地，在中构巢曲霉(SEQ ID NOs：6和8)、稻瘟病菌(SEQ ID NOs：10和12)、粗糙链孢霉(SEQ ID NOs：14和16)以及禾谷镰孢(SEQ ID NOs：18和20)中鉴定了同源蛋白序列。随后，基于使用Clustal W(慢、精确、Gonnet选项；Thompson等NucleicAcids Res.22：4673-4680(1994))方法对这些序列(即，SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18和20)的比较而进行的系统发育及同源分析，表明与Yarrowia Δ12去饱和酶具有同源性的蛋白分为两个不同的“亚族”。具体地，“亚族1”中的所有蛋白(SEQ ID NOs：2、6、10、14和18)彼此之间具有至少46.2％的同一性，而与“亚族2”(SEQID NOs：4、8、12、16和20)中的蛋白的同一性低于39.6％(图4和5；序列比对的Clustal方法(同上))。亚族2中的蛋白彼此之间具有至少56.3％的同一性。
由于Yarrowia仅能合成18:2(但没有18:3)而上述的每种丝状真菌均可产生18:2与ALA，并且由于Yarrowia只有单一的Δ12去饱和酶而每种丝状真菌均具有两种与Yarrowia Δ12去饱和酶同源的酶，因此，申请人假定这些生物中某个亚族的去饱和酶代表Δ12去饱和酶，另一个代表Δ15去饱和酶。使用表达分析通过对两个亚族每个中具有代表性的蛋白的活性进行测定来检验该假设。具体地，在Yarrowialipolytica中表达Fm2，发现它编码Δ12去饱和酶(参共同待决的美国临时申请60/570679)，而如本申请所述在Y.lipolytica中表达Fm1与Mg1，表现出Δ15去饱和酶活性(此外具有部分Δ12去饱和酶活性)。
使用序列比对的Blastp 2.2.5程序、以下列参数：期望值为10、BLOSUM 62矩阵以及低复杂性过滤(Altschul等，Nucleic Acid Res.25(17)：3389-3402(1997))，对串珠镰孢Δ15去饱和酶核苷酸及推断的氨基酸序列(即，分别为SEQ ID NOs：1和2)与公共数据库中的序列进行比较。这样，串珠镰孢Δ15去饱和酶核苷酸与以GenBank序列号XM_388066.1提供的Gibberella zeae PH-1序列最为相似(在573bp的长度上由86％的同一性)。GenBank序列号XM_388066.1对应于GenBank序列号为XP_388066.1的Gibberella zeae PH-1蛋白以及本申请中的SEQ ID NO：17(即，串珠镰孢Δ15去饱和酶ORF)。直接比较表明串珠镰孢(F.Moniliforme)与禾谷镰孢Δ15去饱和酶ORFs在1211bp的长度上具有87.4％的同一性。
对串珠镰孢Δ15去饱和酶推断的氨基酸序列与公共数据库的数据进行比较，表明基于同一性百分比关系最近的是GenBank序列号为XM_388066.1的序列(在193个氨基酸长度上有89％一致)。这是同本申请中SEQ ID NO：18——编码全长的串珠镰孢Δ15去饱和酶——相对应的部分氨基酸序列，在403个氨基酸的全长上有88.8％的同一性。
更优选的氨基酸片段是与本申请中的序列具有至少约70％-80％的同一性，其中有85％-90％同一性的序列是特别合适的，那些约95％同一性的序列是最优选的。类似地，优选的对应于本ORF的Δ15去饱和酶编码核苷酸序列是那些编码具有活性蛋白的序列，与本申请中所报道的编码串珠镰孢Δ15去饱和酶的核苷酸序列具有至少约70％-80％同一性，其中有85％-90％同一性的序列是特别合适的，那些约95％同一性的序列是最优选的。在本发明中具有用处的同一性百分比包括，但并不局限于：45.4％、46.2％、47％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。相信在46％与100％之间的任何整数百分比均是可用的。
同系物的鉴定与分离
本发明中Δ15去饱和酶核酸片段可以用于鉴定及分离来自相同或其它细菌、藻类、真菌或植物物种中的编码同源蛋白的基因。
鉴定技术
例如，通过本领域的技术人员对序列的手动评估、或者使用诸如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.，等，J.Mol.Biol.215：403-410(1993))及ClustalW(DNASTA软件中的Megalign程序)这样的算法所进行的计算机自动序列比较与鉴定，可将本发明所述的串珠镰孢Δ15去饱和酶氨基酸或核苷酸序列的实质部分用于相关多肽或基因的推断鉴定中。如上所述，使用Yarrowia lipolytica Δ12去饱和酶(SEQ ID NO：55)可以鉴定一系列真菌去饱和酶——在上面分析中，它们聚成了两个不同的蛋白亚族(即，亚族1和亚族2)。亚族1包括上面所述的串珠镰孢Δ15去饱和酶，以及其编码DNA序列在下述各项中发现的蛋白：
●构巢曲霉基因组计划(由基因组研究中心(CGR)，Cambridge，MA赞助)中的重叠群1.122(scaffold 9)(SEQ ID NO：6)；
●稻瘟病菌基因组计划(由CGR与国际稻瘟病基因组协会赞助)中重叠群2.1597的基因座MG08474.1(SEQ ID NO：10)；
●GenBank序列号AABX01000577(粗糙链孢霉)(SEQ ID NO：14)；及
●禾谷镰孢基因组计划(由CGR与国际Gibberella zeae基因组协会(IGGR)赞助)中的重叠群1.320；BAA33772.1(SEQ ID NO：18)
假定上述每个蛋白均可编码Δ15去饱和酶。在WO 03/099216中对构巢曲霉及粗糙链孢霉确认了该假设，本申请中对稻瘟病菌也确认了该假设。
根据序列比对的Clustal方法(同上)对上述蛋白进行的分析表明，这些蛋白与串珠镰孢Δ15去饱和酶(SEQ ID NO：2)具有最少为46.2％一致的序列(图5)。此外，本发明亚族1中的Δ15去饱和酶也同其它已知的Δ15去饱和酶蛋白进行了比较；不过，同其它已知的Δ15去饱和酶相比较，本申请亚族1中的Δ15去饱和酶与亚族2中的蛋白具有更高的同源性(39.6％的同一性)。本领域的技术人员能够利用相似方法去鉴定其它也与亚族1归于一起的直系同源蛋白(本申请中鉴定为Δ15去饱和酶)。
或者，本申请中任一去饱和酶序列(即，SEQ ID NOs：1、2、5、6、9、10、13、14、17、18)均可用作鉴定同源性的杂交反应物。核酸杂交检验的基本组分包括探针、猜测含有感兴趣的基因或基因片段的样品以及明确的杂交方法。本发明中的探针是可与要检测的核酸序列互补的典型的单链核酸序列。探针与要检测的序列是“可杂交的”。探针的长度可在5个碱基至上万个碱基之间变化，这依赖于所要完成的具体的检验。典型地，长度为约15个碱基至30个碱基的探针是合适的。只要求探针分子的部分片段与所检测的核酸序列是互补的。此外，探针与靶序列之间不必完全互补。在没有完全互补的分子间所进行的杂交，其结果是在杂交区域中有某些碱基片段并没有可与之配对的合适的互补碱基。
已详细说明了杂交方法。典型地，探针和样品必须在允许核酸杂交的条件下混和。这涉及在存在合适浓度的无机或有机盐以及适当温度的条件下，使探针和样品接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，这样探针与样品核酸之间任何可能的杂交均可发生。混合物中探针或靶的浓度将决定使杂交发生所需的时间。探针或靶的浓度越高，所需的杂交温育时间就越短。有时候可加入离液剂。离液剂可通过抑制核酸酶活性来稳定核酸。此外，离液剂还使得短寡核苷酸探针的敏感且严谨的杂交可在室温下进行(Van Ness and Chen，Nucl.Acids Res.19：5143-5151(1991))。合适的离液剂包括氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾以及尤其是三氟乙酸铯。典型地，离液剂的终浓度为约3M。如果需要，还可以向杂交混合物中加入甲酰胺，通常为30-50％(v/v)。
可以使用多种杂交液。典型地，它们含有占体积约20至60％、优选地为30％的极性有机试剂。常见的杂交液采用约30-50％v/v甲酰胺、约0.15至1M的氯化钠、约0.05至0.1M缓冲液(譬如，柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9))、约0.05至0.2％的去污剂(譬如，十二烷基磺酸钠)、或者0.5-20mM之间的EDTA、FICOLL(Pharmacia Inc.)(约300-500kdal)、聚乙烯吡咯烷酮(约250-500kdal)、以及血清白蛋白。在典型的杂交液中还包括未标记的载体核酸——它们取自约0.1至5mg/mL、断裂核酸DNA(譬如，小牛胸腺或鲑鱼精DNA、或者酵母RNA)，也可来自含约0.5至2％wt/vol甘氨酸的溶液。还可以包含其它添加物，诸如包括多种极性水溶性或可膨胀试剂(譬如，聚乙二醇)、阴离子聚合物(譬如，聚丙烯酸酯或聚甲基丙稀酸甲酯)及阴离子糖聚合物(譬如，硫酸葡聚糖)在内的体积排阻试剂。
核酸杂交可修改为多种试验形式。其中最适合的是夹心法形式。夹心法特别适用于非变性条件下的杂交。夹心法这类试验的主要组分是固相支持物。固相支持物可吸附或共价耦联固定的、未标记的核酸探针，并与其部分序列互补。
分离方法
本发明中的串珠镰孢Δ15去饱和酶核酸片段(或本申请中所确定的任何Δ15去饱和酶[SEQ ID NOs：5、6、9、10、13、14、17和18])可用于分离来自相同物种或者来自其它细菌、藻类、真菌或植物物种的编码同源蛋白的基因。在本领域中，使用序列依赖的方案来分离同源基因是众所周知的。序列依赖的方案的实施例包括，但并不局限于：1.)核酸杂交法；2.)DNA及RNA扩增法，已通过多种核酸扩增技术的应用来示例[譬如，聚合酶链反应(PCR)，Mullis等，美国专利4,683,202；连接酶链反应(LCR)，Tabor，S.等，Proc.Acad.Sci.USA 82：1074(1985)；或者链置换扩增(SDA)，Walker，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992)]；以及构建文库并通过互补作用来筛选的方法。
例如，对于编码类似本申请中所述去饱和酶的蛋白或者多肽的基因，本领域的技术人员可利用众所周知的方法，通过使用全部或部分该核酸片段作为DNA杂交探针、对来自任何感兴趣的酵母或真菌的文库进行筛选的方式来直接分离(其中，可产生ALA[或者ALA-衍生物]的那些酵母或者真菌是优选的)。基于该核酸序列，可以根据本领域中已知的方法来设计并合成特异性的寡核苷酸探针(Maniatis，同上)。而且，根据熟练技术人员已知的方法(譬如，随机引物DNA标记、切口平移或末端标记技术)，整个序列可直接用于合成DNA探针，或者使用有效的体外转录系统合成RNA探针。此外，可设计特异引物用来扩增部分(或全长)该序列。所获得的扩增产物可以在扩增反应期间直接标记，或者在扩增反应后标记，在适当的严谨条件下用作分离全长DNA片段的探针。
典型地，在PCR-类扩增技术中，引物序列不同且彼此间不互补。根据所需的试验条件，引物应设计为可有效并可靠地复制靶核酸。PCR引物的设计方法在本领域中是常见的，众所周知(Thein and Wallace，″The use of oligonucleotide as specific hybridization probes in theDiagnosis of Genetic Disorders″，in Human Genetic Diseases：APractical Approach，K.E.Davis Ed.，(1986)pp 33-50，IRL：Herndon，VA；及Rychlik，W.，In Methods in Molecular Biology，White，B.A.Ed.，(1993)Vol.15，pp 31-39，PCR Protocols：Current Methods andApplications.Humania：Totowa，NJ)。
通常，在聚合酶链反应方案中，对于来自DNA或RNA的同源基因，可使用该序列的两个短片段来扩增更长的编码该基因核酸片段。对于克隆核酸片段的文库也可以进行聚合酶链反应，其中一个引物序列来源于该核酸片段，另一个引物的序列则利用编码微生物基因的mRNA其前体中3′末端存在多聚腺苷酸。或者，第二个引物序列可以基于来源于克隆载体的序列。例如，熟练的技术人员可以通过使用PCR来扩增转录物中某点与3′或5′末端之间的区域的拷贝数的方式，遵照RACE方案(Frohman等，PNAS USA 85：8998(1988))来生成cDNAs。根据该序列可以设计3′及5′方向的引物。使用商业化的3′RACE或者5′RACE体系(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)，可分离特异的3′或5′DNA片段(Ohara等，PNAS USA 86：5673(1989)；Loh等，Science243：217(1989))。
该核苷酸及所推断的氨基酸序列的可用性促进了DNA表达文库的免疫筛选。可以合成表示部分该氨基酸序列的人造肽段。这些肽可用来免疫动物，产生特异性针对该肽或者含有该氨基酸序列的蛋白的多克隆或者单克隆抗体。然后可以使用这些抗体去筛选DNA表达文库，从而分离感兴趣的全长DNA克隆(Lerner，R.A.Adv.Immunol.36：1(1984)；Maniatis，同上)。
为了提高异源表达进行的基因优化
可使用多种技术在其它宿主中提高某种感兴趣的特定Δ15去饱和酶的表达。有两种此类技术，包括密码子优化和基因诱变。
密码子优化
例如，对于某些实施例，期望修饰编码具有Δ15去饱和酶活性的密码子的某部分，以便在其它宿主(即，含油酵母)中增强编码这些多肽的基因的表达。
一般而言，在特定宿主物种中，通过检查蛋白(优选地，这些蛋白大量表达)中密码子使用情况以及判断哪个密码子使用频率最高的方式，可确定宿主偏爱的密码子。然后，可使用在宿主物种中所偏爱的密码子，全部或者部分合成感兴趣的、具有去饱和酶活性的多肽的编码序列。也可合成全部(或者部分)DNA，以除去降低稳定性的序列或者在转录后的mRNA中形成二级结构的区域。也可合成全部(或者部分)DNA，将碱基组分改变为期望的宿主细胞中最优选的。
在本发明的优选实施例中，来自——譬如串珠镰孢、构巢曲霉、稻瘟病菌、粗糙链孢霉和禾谷镰孢的Δ15去饱和酶，于它们在诸如Yarrowia lipolytica这样的异源含油酵母宿主进行表达之前已进行了密码子优化。
诱变
在文献中已充分建立了合成序列及将序列组合的方法。例如，可使用体外诱变及选择、定点突变、易错PCR(Melnikov等，Nucleic AcidsResearch，27(4)：1056-1062(1999年2月15日))、“基因混排”(U.S.5,605,793；U.S.5,811,238；U.S.5,830,721及U.S.5,837,458)或其它方法，来获得天然去饱和酶基因，例如本申请所述的Δ15去饱和酶的突变。这样会生成在体内具有去饱和酶活性的多肽——它在宿主细胞中发挥功能时具有更合意的物理及动力学参数(譬如，更长的半衰期或者更高的生成期望PUFA的速率)。
如果有必要，可以通过常规诱变、表达所获得的突变多肽及判断其活性的方式，来确定去饱和酶多肽中对酶活至关重要的区域。突变可以包括缺失、插入和点突变，或其组合。典型的功能分析由缺失诱变开始，以判断蛋白功能所必需的N-及C-末端界限，然后进行内部缺失、插入或点突变，以进一步确定功能所必需的区域。也可使用诸如盒式诱变或者全合成这样的其它技术。例如，通过使用核酸外切酶连续除去5′或3′编码区的方式可完成缺失诱变。对这类技术已有可用的试剂盒。缺失之后，通过将含有起始或终止密码子的寡核苷酸分别连接到经5′或3′缺失后的有缺失的编码区，使编码区恢复完整。或者，通过包括定点诱变、诱变PCR在内的多种技术、或通过在已存在的限制性内切酶位点上连接上消化的DNA的方式，将编码起始或终止密码子的寡核苷酸插入到编码区。内部缺失可通过多种方法，包括使用DNA上存在的限制性内切酶位点、使用经定点诱变后的诱变引物或者诱变PCR，按相似的方式进行，插入可通过诸如接头置换诱变、定点诱变或者诱变PCR这样的方法来进行。点突变可通过诸如定点诱变或者诱变PCR这样的技术来进行。
化学诱变也可用来确定对去饱和酶多肽的活性至关重要的区域。表达突变构建体，检测所获得的已经改变的蛋白作为去饱和酶的能力。这样的结构-功能分析可以确定哪个区域可以删除、哪个区域可以有插入、以及哪个点突变仍可使突变蛋白基本上按原有方式发挥天然去饱和酶的功能。所有这些来源于本申请所述的去饱和酶基因的突变蛋白及核苷酸序列，均在本发明的范畴之内。
因此，本发明包括序列列表中所报道的Δ15去饱和酶的全序列、这些全序列的互补序列、这些序列的实质部分、由此衍生的密码子优化的去饱和酶、以及那些基本上与其同源的序列。
利用微生物生产ω-3和/或ω-6脂肪酸
ω-3和/或ω-6脂肪酸的微生物合成相对于从诸如鱼或植物这样的天然来源中进行纯化有几个优势。例如：
1.)已知同高等生物相比，许多微生物具有更单一的油脂组分，使得纯化所需组分更为容易；
2.)微生物的产量不易发生由诸如气候及食品供应这样的外界因素所导致的波动；
3.)微生物产生的油脂基本上不含环境污染的污染物；
4.)微生物可以提高特殊形式的PUFAs——它们可具有特殊用途；及
5.)可通过控制培养条件，特别是提供微生物表达的酶所需的特殊底物、或加入基因工程方法的混和物来抑制非期望的生化途径的方式来控制微生物油生成。
除了这些优势外，通过在宿主中提供新的生物合成途径或者通过抑制非期望的生化途径、从而增加期望的PUFAs(或其共轭形式)的水平并降低非期望PUFAs的水平(参见共同待决的美国专利申请10/840579，通过参考的方式将其内容整合在本申请中)的方法，在重组微生物中进行的ω-3和/或ω-6脂肪酸生产可提供改变天然形成的微生物脂肪酸构型的能力。
生产多种ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法
可以预料，转入在合适启动子控制下的本申请所述的编码Δ15去饱和酶的嵌合基因，会在转化的宿主生物中增加ALA的产量。因而，本发明包含直接生成PUFAs的方法，它包括使脂肪酸底物(即，LA)受到本申请所述的PUFA酶(譬如，串珠镰孢Δ15去饱和酶)的作用，从而将底物转化为期望的脂肪酸产物(即，ALA)。更具体地，本发明的一个目标是提供在微生物(譬如，含油酵母)中生产ALA的方法，其中提供给微生物：
(a)分离的、编码具有Δ15去饱和酶活性的真菌蛋白的核酸片段，当同具有SEQ ID NO：2中所示的序列的多肽比较时，基于序列比对的Clustal方法表明至少有46.2％的同一性；及
(b)由LA组成的去饱和酶底物来源；
其中酵母在可表达嵌合的去饱和酶基因以及LA可转化为ALA的条件下生长，并且其中ALA可以选择回收。因此，本发明最低程度上包括下述Δ15去饱和酶：如本申请所述，SEQ ID NOs：2、6、10、14和18的应用。
或者，本申请所述的每种PUFA基因及其对应的酶产物均可直接用于ω-3 PUFAs的生产。ω-3 PUFAs的间接生产在脂肪酸底物通过中间步骤或者中间途径的方式间接转化为所需脂肪酸产物时发生。因此，可预期本申请所述的Δ15去饱和酶可以与一个或多个编码其它酶的基因联合表达，从而在经历一系列反应后生成所需产物。在一个优选实施例中，例如，可使用含有编码PUFA生物合成途径中其它酶基因的载体来共转化宿主生物以获得更高水平的ω-3脂肪酸产物(譬如，ALA、STA、ETA、EPA、DPA和DHA)。具体地，例如，可以在宿主细胞中过表达任意一种本申请所述的Δ15去饱和酶，该宿主细胞还表达：1.)编码用于产生过量ALA的Δ12去饱和酶的基因(其中产物相对于单独表达Δ15去饱和酶而言是增加的)；2.)编码用于产生过量STA的Δ6去饱和酶(也可以是Δ12去饱和酶)的基因；3.)编码用于产生过量ETA的Δ6去饱和酶及高亲和性碳链增长酶(也可以是Δ12去饱和酶)的基因；以及4.)编码用于产生过量EPA的Δ6去饱和酶、高亲和性碳链增长酶及Δ5去饱和酶(也可以是Δ12去饱和酶)的基因。如同本领域的技术人员所熟知的那样，下述酶活的多种其它组合有助于在同本申请中去饱和酶有关联的宿主细胞中的表达：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶和/或碳链增长酶(参见图2)。位于特定表达盒中的特定基因，依赖于宿主细胞(以及其PUFA谱和/或去饱和酶谱)、底物的有效性以及所期望的终产物。
在另一个实施例中，基于本申请所述的全序列、这些全序列的互补序列、这些序列的实质部分、由此衍生的密码子优化的去饱和酶以及与其基本上同源的那些序列，有助于对宿主生物中天然的Δ15去饱和酶进行敲除。例如，以宿主生物中的Δ15去饱和酶为目标进行敲除，可生成不能合成ALA的突变株。这种突变株可用于产生“纯”ω-6脂肪酸(没有一起合成的ω-3脂肪酸)。
表达系统、盒及载体
具有本申请中所述序列的基因与基因产物可以在异源微生物宿主细胞中，特别是在含油酵母(譬如，Yarrowia lipolytica)中进行表达，在重组微生物宿主进行表达，有助于多种PUFA途径中间产物、或宿主中已存在的PUFA途径调节物合成此前使用宿主无法合成的新产物。
对于本领域的技术人员而言，微生物表达系统与含有可指导外源蛋白高水平表达的调控序列的表达载体均是众所周知的。所有这些均可用来构建嵌合基因，用来生产本申请中任一序列的基因产物。然后这些嵌合基因可通过转化导入合适的微生物中，以高水平表达所编码的酶。
在本领域中，用于转化合适宿主细胞的载体或DNA盒是众所周知的。对构建体中序列的特殊选取依赖于期望的表达产物(同上)、宿主细胞的性质以及计划用来分离转化细胞与非转化细胞的方法。不过典型地，载体或盒均含有指导有关基因转录盒翻译的序列、选择标记以及容许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包括控制转录起始的基因5′区以及控制转录终止的DNA片段的3′区。当控制区是来自被转化的宿主细胞的基因时是最优选的，虽然明白这类控制区不必一定来源于作为生产宿主的特定物种自身的基因。
对本领域的技术人员而言，有众多熟悉的用于促使本申请ORFs在期望宿主细胞中进行表达的起始控制区或启动子。事实上任何能够指导这些基因在所选宿主细胞中进行表达的启动子均适用于本发明。宿主细胞中的表达可以瞬时或稳定方式来完成。可通过在感兴趣的基因上连接具有调控能力的启动子、并诱导该启动子活性的方式来实现瞬时表达。通过使用连接至感兴趣的基因上的、组成型的启动子可获得稳定表达。作为一个实施例，当宿主细胞为酵母时，提供了在酵母细胞中具有功能的，尤其是来自宿主物种的转录及翻译区。例如，转录起始调控区可以从：1.)诸如乙醇去饱和酶、甘油醛-3-磷酸去饱和酶(参见美国专利申请No.10/869630)、磷酸甘油酸变位酶(参见美国专利申请No.10/869630)、果糖二磷酸醛缩酶(参见美国专利申请No.60/519971)、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸甘油酸激酶、甘油-3-磷酸-O-酰基转移酶(参见美国专利申请No.60/610060)等这样的糖酵解途径的基因；或者2.)诸如酸性磷酸酶、乳糖酶、金属硫蛋白、葡萄糖淀粉酶、翻译延伸因子EF1-α(TEF)蛋白(U.S.6,265,185)、核糖体蛋白S7(U.S.6,265,185)等这样的具有调控能力的基因中获得。若干调控序列中的任何一个均可使用，这依赖于所要进行的是组成型还是诱导型转录、启动子表达感兴趣的ORF的效率、构建体的难易程度以及其它类似因素。
已发现翻译起始密码子ATG周围的核苷酸序列可影响酵母细胞中的表达。若本申请中某种Δ15去饱和酶在酵母中低表达，可修饰外源基因的核苷酸序列使其包括有效的酵母翻译起始序列，以获得理想的基因表达效果。对于酵母中的表达，可通过将定点诱变的低效表达基因与内源酵母基因，优选地应为高效表达基因按阅读框融合的方式来实现这点。或者，任何人均可确定宿主中一致的翻译起始序列，然后将在外源基因上设计出该序列从而使其可在感兴趣的宿主中实现最佳表达(参见，譬如，美国专利申请No.10/840478用于Yarrowia lipolytica的应用)。
终止区可以来源于从其中获得起始区的基因的3′区，或者来自不同的基因。大量的终止区现已是已知的，在多种宿主中的功能也令人满意(当用于与其来源相同的及不同的属或种时都如此)。选择终止区通常是出于方便起见，而不是由于特殊性质。优选地，终止区来源于酵母基因，特别是Saccharomyces、Schizosaccharomyces、假丝酵母属、Yarrowia或Kluyveromyces。还知道编码γ-干扰素及α-干扰素的哺乳动物基因的3′-区在酵母中也具有功能。终止控制区也可来源于优选的宿主其自身的多种基因。有时候可以不用终止位点；不过，如果将其包括在内是最优选的。
正如本领域的技术人员所意识到的那样，仅仅将基因插入到克隆载体中并不能保证它会以所需要的水平进行成功表达。为了适应高表达速度的需要，已经通过使用大量不同的控制转录、翻译、蛋白的稳定性、氧气限制以及从宿主细胞分泌遗传元件构建了许多专门的表达载体。更具体地，某些被用来控制基因表达的分子特征包括：1.)相关的转录启动子及终止子序列的性质；2.)所克隆基因的拷贝数以及该基因是位于质粒上的还是整合到宿主细胞基因组中；3.)所合成外源蛋白的最终细胞定位；4.)在宿主生物中翻译的效率；5.)所克隆基因的蛋白在宿主细胞中内在的稳定性；及6.)克隆基因中的密码子使用率，其频率接近宿主细胞偏爱的密码子使用率。这些修饰类型中的每一种均包含在本发明中，作为进一步优化本申请所述的Δ15去饱和酶表达的手段。
转化微生物宿主
一旦获得编码适合于在合适的微生物宿主中表达的多肽的DNA，可将其置于能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体上，或者将其直接整合到宿主细胞的基因组中。表达盒的整合可在宿主基因组中随机发生，或者通过使用含有与宿主基因组具有同源区的构建体，它可与宿主的基因座重组来有针对性地发生。若构建体作用于内源基因座，全部或者部分转录及翻译调控区可由该内源基因座提供。
当从不同的复制载体上表达两个或更多基因时，期望每个载体均有不同的选择方式，而且与其它构建体之间没有同源性以保持稳定表达、防止构建体中的元件发生重排。可通过实验来对所导入的构建体的调控区、选择方式及增殖方法作出明智的选择，使所有导入的基因可在所需水平上表达，从而提供所期望产物的合成。
可通过任何标准技术将含有感兴趣基因的构建体导入宿主细胞中。这些技术包括转化(譬如，醋酸锂转化[Methods in Enzymology，194：186-187(1991)])、原生质体融合、基因枪冲击、电穿孔、微注射或者其它将感兴趣的基因转入宿主细胞的方法。可应用于含油酵母(即，Yarrowia lipolytica)的更具体的技术包括美国专利Nos.4,880,741与5,071,764，以及Chen，D.C.等(Appl Microbiol Biotechnol.48(2)：232-235(1997))。
为了方便起见，通过任何方法的操作吸纳了一段DNA序列(譬如，表达盒)的宿主细胞在本申请中称作“转化子”或者“重组子”。转化的宿主含有至少一个拷贝的表达构建体，也可以含有两个或更多，这依赖于基因是否整合至基因组中、是否扩增或者是否位于染色体之外的具有多个拷贝数的元件上。转化的宿主细胞可以通过所导入构建体上的选择标记来鉴定。或者，某个独立的标记构建体可以与期望的构建体共转化，因为很多转化技术可将许多DNA分子导入宿主细胞中。典型地，转化的宿主可根据它们在选择培养基上的生长能力来进行选择。选择培养基可以加入抗生素或者缺乏未转化的宿主所生长必需的因子，诸如营养物或者生长因子。所导入的标记基因可以提供抗生素抗性、或者编码某种必需的生长因子或酶，因此可使得表达它们的转化宿主能够在选择培养基上生长。当所表达的标记蛋白可以被直接或间接检测时，也可进行转化宿主的选择。标记蛋白可单独表达，或者同其它蛋白融合表达。标记蛋白可通过下述方法检测：1.)其针对有色产物的酶活(譬如，β-半乳糖苷酶可以将底物X-gal[5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷]转化为有色产物；荧光素酶可以将荧光素转化为发光产物)；或2.)其发光或修饰特性(譬如，Aequorea victoria的绿色荧光蛋白在受到蓝光照射时会发出荧光)。或者，抗体可用来检测标记蛋白或位于，譬如感兴趣的蛋白上的分子标签。表达标记蛋白或者标签的细胞可通过例如，直接观察、或者通过诸如FACS或使用抗体淘筛这样的技术来进行选择。任何在酵母中起作用的标记均可用于酵母转化子的选择。理想地，针对卡那霉素、潮霉素及氨基糖苷G418的抗性，以及具有在缺少尿嘧啶或亮氨酸的培养基上的生长能力均是可以考虑的。
转化后，适于本申请Δ15去饱和酶(以及，在宿主细胞中共表达的其它任意PUFA酶)的底物可由宿主天然产生或通过转基因来生成，或者可通过外源来提供。
微生物中ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成的代谢工程
与本申请Δ15去饱和酶序列相关的知识有助于操纵含油酵母中，特别地，在Yarrowia lipolytica中ω-3和/或ω-6脂肪酸的生物合成。这需要直接针对PUFA生物合成途径的代谢工程，或者对PUFA生物合成途径中提供碳的途径进行额外操作。对于本领域的技术人员而言，用于操纵生化途径的方法是众所周知的。
上调所期望的生物合成途径的技术
额外拷贝的去饱和酶(以及任意碳链增长酶)基因，典型地，可通过多拷贝质粒导入宿主中，从而增加ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成的产量。通过使用导致表达增加的强启动子(可以是调控型或组成型)、通过除去/删除mRNA或所编码蛋白中的不稳定序列、或通过向mRNA上添加稳定序列，也可在转录水平上增加去饱和酶及碳链增长酶基因的表达(U.S.4,910,141)。还有一个增加异源去饱和酶或碳链增长酶基因表达的方法，就是在所选的宿主微生物中通过使用用于优化基因表达的密码子来替代天然基因的密码子，从而提高所编码的mRNAs的翻译效率。
下调非期望的生物合成途径的技术
相反，同ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径竞争能量或碳的生化途径，或者干扰特定PUFA终产物生成的宿主自身PUFA生物合成途径中的酶，应通过基因敲除或其它手段(譬如，反义mRNA)进行下调的方式来排除。对于基因敲除，将一段外源DNA片段(典型地，是可作为选择标记的基因)插入到要敲除的结构基因中，破坏后者的编码序列，从而从功能上使改基因失活。将敲除盒转化入宿主细胞中，会导致有功能的宿主自身基因通过与没有功能的敲除基因之间的同源重组发生替代(参见，譬如：Hamilton等J.Bacteriol.171：4617-4622(1989)；Balbas等Gene 136：211-213(1993)；Gueldener等NucleicAcids Res.24：2519-2524(1996)；以及Smith等Methods Mol.Cell.Biol.5：270-277(1996))。
当已知靶基因序列时，反义技术是另一种下调基因表达的方法。为了实现该目的，克隆一个来自期望基因中的核酸片段并连接上一个启动子，这样可以转录出反义的RNA链。然后将该构建体转入宿主细胞中，产生反义的RNA链。反义RNA通过阻止编码感兴趣蛋白的RNA累积的方式来抑制基因表达。本领域的技术人员了解与降低特定基因表达的反义技术应用相关的特别注意事项。例如，反义基因在适当的水平上进行表达，需要使用不同的嵌合基因，这些基因使用了熟练人员已知的不同调控元件。
尽管靶基因敲除与反义技术可提供有效的下调那些序列已知的基因手段，还发展了其它特异性较低的、可以不必基于序列的方法。例如，细胞可暴露在UV射线下，然后筛选期望的表型。对于产生突变而言，化学试剂诱变也很有效，通常使用影响非复制的DNA的化学物质(譬如，HNO2及NH2OH)以及影响正在复制的DNA的试剂(譬如，因为可导致移码突变而闻名的吖啶染料)来诱发突变。使用放射性或者化学试剂来产生突变的专门方法在本领域中有详细的文献记载。参见，例如：Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook of Industrial  Microbiology，2nd ed.(1989)Sinauer Associates：Sunderland，MA；或者Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227(1992)。
另一种非特异性的基因敲除方法是使用转座因子或者转座子。转座子是可以随机插入至DNA中的遗传元件，随后可以根据新序列来判断插入在哪里发生。体内和体外转座的方法均是已知的。两种方法均涉及使用同转座酶相关的转座因子。当转座因子或者转座子在存在转座酶的情况下同核酸片段进行接触时，转座因子将随机插入到核酸片段中。该技术对随机诱变以及基因分离是有用的，因为可以根据转座因子的序列来鉴定被敲除的基因。用于体外转座的试剂盒已商品化[参见，例如：1.)The Primer Island Transposition Kit，产自Perkin ElmerApplied Biosystems，Branchburg，NJ，基于酵母Tyl元件；2.)TheGenome Priming System，产自New England Biolabs，Beverly，MA，基于细菌转座子Tn7；以及3.)EZ::TN Transposon Insertion Systems，产自Epicentre Technologies，Madison，Wl，基于Tn5细菌转座因子]。
在本发明全文中，通过上述任何一种方法来调节脂肪酸生物合成途径的表达都是可用的。例如，本发明提供了编码ω-3和/或ω-6脂肪酸合成途径中关键酶的基因(即，Δ15去饱和酶)。在18:3脂肪酸产量不足的含油酵母中表达这些基因、并利用用于宿主生物代谢工程的多种方法来调节该脂肪酸及其它PUFA生物合成基因的表达，在使优选的PUFA产物的产量达到最大上是特别有用的。同样，为了利用这些基因使得PUFA产量达到最大，必需破坏同PUFA生物合成直接竞争总碳量的那些途径。在另一个实施例中，期望通过敲除本申请中的Δ15去饱和酶，在抑制ω-3脂肪酸共合成的同时提高ω-6脂肪酸的合成。在另外一个实施例中，可以通过将任一本发明中的Δ15去饱和酶基因置于诱导型或调控型启动子的控制之下的方式，来调节ω-3和/或ω-6脂肪酸的产量。
用于Δ15去饱和酶重组表达的优选宿主
用于表达本申请中基因及核酸片段的宿主细胞可以包括生长在广泛的温度及pH值范围内含有简单或复杂的碳水化合物、无机酸与醇类、和/或烃类的多种原料上的微生物宿主。尽管已分离到本发明中所述的基因并用于在含油酵母中，尤其是在Yarrowia lipolytica中进行表达，但可以预料到，由于转录、翻译以及蛋白合成器官的高度保守性，任何细菌、酵母、藻类和/或丝状真菌均是用于表达本发明中核酸片段的合适的宿主。
优选的宿主是诸如含油酵母这样的产油生物。这些产油生物天然具有油脂合成及累积的能力，其中油脂含量可超过约25％的细胞干重，更优选地超过30％的细胞干重，最优选地超过40％的细胞干重。典型地被鉴定为含油酵母的属包括，但并不局限于：Yarrowia、假丝酵母属、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属与油脂酵母属。更具体地，作为例证的油脂合成酵母包括：Rhodosporidium toruloides、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyii)、产油油脂酵母(L.Lipoferus)、拉可夫氏假丝酵母(Candida revkaufi)、铁红假丝酵母(C. Pulcherrima)、热带假丝酵母(C.Tropicalis)、产朊假丝酵母(C.Utilis)、Trichosporonpullans、T.cutaneum、胶粘红酵母(Rhodotorula glutinus)、禾木科红酵母(R.Graminis)及Yarrowia lipolytica(先前被分类为解脂假丝酵母(Candida lipolytica))。
最优选的是含油酵母Yarrowia lipolytica；并且，在进一步的实施例中，最优选的是命名为ATCC #76982、ATCC #20362、ATCC #8862、ATCC #18944和/或LGAM S(7)1的Yarrowia lipolytica菌株(Papanikolaou S.，and Aggelis G.，Bioresour.Technol.82(1)：43-9(2002))。
其它优选的微生物宿主包括产油细菌、藻类和其它真菌；并且，在这组微生物宿主中，特别令人感兴趣的是合成诸如GLA和ARA这样的ω-6脂肪酸的微生物。因此，例如，使用本申请中任一Δ15去饱和酶基因在诱导型或调控型启动子的控制下转化高山被孢菌(该菌已用于ARA的商业化生产)，均可产生能够合成EPA的转化生物。此外，转化这些其自身Δ12去饱和酶中具有敲除或突变的菌株(譬如，使用本领域中众所周知的方法，通过将本发明中任一Δ15去饱和酶转入其自身的Δ12基因座位中)，这种基因工程生物可以提高ω-3对ω-6脂肪酸的比率。
用于PUFA生产的发酵过程
转化的微生物宿主细胞在脂肪酸合成基因达到最优活性、并可产出最大量且最具经济效益的脂肪酸(譬如，ALA，它又增加了多种ω-3脂肪酸的产量)的生产条件下进行生长。通常，可优化的培养基条件包括碳源的类型及数量、氮源的类型及数量、碳-氮比、氧气含量、生长稳定、pH、生物量产生期的长度、油脂累积期的长度以及细胞采集的时间。诸如含油酵母这样令人感兴趣的微生物在复合培养基(譬如，酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉汤(YPD))或者缺少某种生长必需组分从而迫使对期望表达盒进行选择的限定的基本培养基(譬如，YeastNitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI))上进行生长。
本发明中的发酵培养基必须含有合适的碳源。合适的碳源可以包括，但并不局限于：单糖(譬如，葡萄糖，果糖)、二糖(譬如，乳糖或蔗糖)、寡糖、多糖(譬如，淀粉、纤维素或其混合物)、糖醇(譬如，甘油)或者来自可更新原料的混合物(譬如，乳清、玉米浆、甜菜糖蜜、大麦芽)。此外，碳源可以包括烃类、脂肪酸、脂肪酸酯、甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂以及包括植物油(譬如，豆油)及动物油在内的多种商业来源的脂肪酸。而且，碳源可以包括一碳底物(譬如，二氧化碳或者甲醇)，已经证明它们可代谢转化为关键的生化中间产物。因此，可以预料，可应用于本发明中的碳源包括非常广泛的含碳底物，并且仅受宿主生物的选择限制。虽然认为上述所有的碳底物及其混合物均适用于本发明之中，优选的碳底物是糖和/或脂肪酸。最优选的是葡萄糖和/或含有10-22个碳的脂肪酸。
氮可以从无机(譬如，(NH4)2SO4)或者有机来源(譬如，尿素或谷氨酸)获得供给。除了要有合适的碳源及氮源外，发酵培养基中还必须包含适当的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素以及其它本领域的技术人员所已知的、适于微生物生长以及促进PUFA生产所必须的酶途径的组分。值得特别关注的是几种促进脂肪及PUFAs合成的金属离子(譬如，Mn+2、Co+2、Zn+2、Mg+2)(Nakahara，T.等Ind.Appl.Single Cell Oils，D.J.Kyle and R.Colin，eds.pp 61-97(1992))。
本发明中优选的生长培养基是那些普通的、已进行商业化制备的培养基，譬如Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)。也可使用其它限定的或者合成的生长培养基，微生物学或发酵科学领域的熟练人员也了解适于特定微生物生长的培养基。发酵时典型的pH范围在约pH 4.0至pH 8.0之间，其中pH 5.5至pH 7.0是优选的适于起始生长条件的范围。发酵可在有氧或无氧条件下进行，其中微氧条件是优选的。
典型地，在含油酵母细胞中累积高水平的PUFAs需要两阶段的过程，因为生长和合成/储存脂肪之间的代谢状态必须“平衡”。因此，最优选地，两阶段的发酵过程在含油酵母中PUFAs的生产中是必需的。按这种方式，发酵的第一阶段是专门用来产生并积累细胞量，其特征是快速的细胞生长以及细胞分裂。发酵的第二个阶段，优选的在培养基中建立一个缺乏氮的条件，以促进高水平的脂类累积。这种缺乏氮的效果是减小细胞中AMP的有效浓度，从而降低线粒体中NAD依赖的异柠檬酸去饱和酶的活性。当发生这种情况时，会累积柠檬酸，这样在细胞质中形成丰富的乙酰-CoA池，并引发脂肪酸合成。这样，这个时期的特征是细胞分裂的停止、随后脂肪酸的合成及油脂的累积。
虽然典型地，细胞在约30℃时生长，但某些研究已表明在更低的温度时会增加不饱和脂肪酸的合成(Yongmanitchai and Ward，Appl.Environ.Microbiol.57：419-25(1991))。基于经济角度的处理方法，最适于在两阶段发酵中的第一阶段之后、大部分生物体已生成时进行这种温度转变。
可以预期有多种发酵过程方案可以使用，其中所期望的是使用本申请中Δ15去饱和酶基因的商业化ω脂肪酸生产。例如，可通过分批、补料或持续发酵过程来从重组微生物宿主中生产商品化的PUFAs产品。
分批发酵过程是一个封闭体系，其中培养基组分在起始过程设定，在发酵过程中除了维持pH及氧水平所必需的组分外，不进一步添加其它组分。因此，在培养过程起始时，用期望的生物接种培养基，在无需向培养基中添加额外底物(即，碳源及氮源)的情况下即可进行生长或具有代谢活性。在分批过程中，体系的代谢物与生物量组成持续改变，直至培养过程结束。在典型的分批过程中，细胞经历了静态延迟期至高速生长对数期并最后到达生长速率逐渐减少或停止的稳定期。不予处理的话，稳定期的细胞最终将会死亡。标准分批过程的一个变型是补料过程，其中在整个发酵过程中底物是持续添加到发酵罐中的。补料过程也适用于本发明。当新陈代谢的副产品可能会抑制细胞的代谢时，或者期望在任何时间培养基中都有有限量的底物时，会使用补料过程。在补料体系中测量底物的浓度是困难的，因此基于可测定的因子，譬如pH、溶解氧及部分废气的压力(譬如，CO2)的变化来进行估算。在本领域中，分批与补料培养方法是常见的、众所周知的，并且其实施例可以在Thomas D.Brock in Biotechnology：A  Textbook of Industrial Microbiologv，2nd ed.，(1989)Sinauer Associates：Sunderland，MA；或者Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227(1992)中找到，这里通过参考的方式整合在本申请中。
也可以通过连续发酵过程来获得使用了本申请中Δ15去饱和酶的ω脂肪酸的商业化产品，其中向生物反应器中持续加入给定量的培养基，同时取出等体积的培养物用于产物回收。连续培养一般可在恒定的细胞密度下使细胞处于对数生长期。连续或半连续培养方法允许对某个或者任意多个影响细胞生长或终产物浓度的因子进行调整。例如，一个方法是限定碳源，利用所有其它参数来调节新陈代谢。在其它体系中，当由通过培养基浊度所测定的细胞浓度保持恒定时，影响生长的许多因子可是是不断变化的。连续体系试图维持稳定的生长状态，这样细胞生长速率必须同由于从培养基中抽走培养物所造成的细胞损失相平衡。在工业微生物领域中，为了进行连续培养过程而调整养分和生长因子的方法、以及用于使产物形成达到最大速率的技术，均是众所周知的，在前文Brock的著作中对多种方法均有详述。
PUFAs的纯化
PUFAs可以在宿主微生物中以游离脂肪酸或者诸如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂这样的酯化形式存在，并可以通过本领域中多种众所周知的方法来从宿主细胞中进行提取。关于酵母油脂的提取技术、质量分析及可接受标准的一篇综述是Z.Jacobs(Critical Reviews inBiotechnology 12(5/6)：463-491(1992))。A.Singh and O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.45：271-312(1997))还提供了一篇关于下游加工的简要综述。
通常，纯化PUFAs的方法包括使用有机溶剂抽提、超声处理、超临界流体萃取(譬如，使用二氧化碳)、皂化以及诸如挤压这样的物理方法，或者它们的组合。其中特别感兴趣的是在存在水的情况下使用甲醇和氯仿进行抽提(E.G.Bligh & W.J.Dyer，Can.J.Biochem.Physio.37：911-917(1959))。可以期望，其中水层被酸化，从而对带有负电荷的部分给予质子，因此增加了所期望的产物向有机层中的分配。抽提后，通过在氮气流中进行蒸发来除去有机溶剂。当以共轭形式来分离时，可使用酶学或化学方法来剪切产物，从而释放出游离的脂肪酸，或者释放出所感兴趣的、复杂程度更低的结合物，然后通过进一步的操作来生成所期望的终产物。理想地，可使用氢氧化钾来剪切共轭形式的脂肪酸。
若需要进一步纯化，可以使用标准方法。这类方法包括抽提、使用尿素处理、分步结晶、HPLC、分馏、硅胶层析、高速离心或蒸馏、或者这些技术联合使用。可以通过已知技术(譬如，烷基化或碘化作用)在任一步骤完成对诸如酸或烯基基团这样的反应基团的保护。所使用的方法包括对脂肪酸进行甲基化以生成甲基酯。类似地，保护基团可以在任一步骤除去。理想地，通过使用尿素和/或分馏处理可实现对含有GLA、STA、ARA、DHA及EPA的组分的纯化。
在植物中生产ω-3和/或ω-6脂肪酸
本发明的编码区可以在植物、尤其是产油植物中表达。这通过以下步骤完成：1.)构建嵌合基因(包含在诸如启动子及3′转录终止子这样的合适的调控序列控制下的本发明中的Δ15去饱和酶)；2.)将嵌合基因转化入合适的植物宿主中；以及3.)表达上述嵌合基因以生成PUFAs。
因此，本发明涉及用于改变产油植物成熟种子中总脂肪酸谱以生产ω-3∶ω-6比例大于0.4的油脂的重组构建体，该构建体含有从下组中选择的分离的核酸片段：
(a)分离的、编码SEQ ID NO：2中所示的全部或部分氨基酸序列的核酸片段；
(b)分离的、当使用0.1×SSC、0.1％SDS、65℃洗涤时可与(a)杂交的核酸片段；
(c)分离的、编码氨基酸序列的核酸片段，其中所述氨基酸序列基于序列比对的Clustal V方法，同SEQ ID NOs：2、6、10、14、18所示的氨基酸序列具有至少46.2％的序列同一性；或者
(d)分离的、同(a)(b)或(c)完全互补的核酸片段。
其中所述的分离的核酸片段可通过操作连接到至少一种调控序列上。
ω-3对ω-6的比例可以在约2∶5到至少约45∶1的范围内。可用的比例包括，但并不局限于：ω-3为约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19、20、23、24、27、29、31、36、42及45，对大约为1的ω-6。其它可用的ω-3对ω-6比例包括，但并不局限于：2∶5、3∶5、4∶5、1∶1及2∶1。可以确信，从至少约2∶5到至少约45∶1中的任何ω-3对ω-6的整数比均是可用的。
本申请所述的从串珠镰孢中分离到的分离的核酸片段可用于本发明实践中。
本发明还涉及产油植物、植物细胞、植物组织和/或在其基因组中包含本发明中的重组构建体的植物部分。
在更一步的方面中，本发明还涉及从这些转化的油籽植物中获得的种子、从这些种子中获取的油脂、从油脂加工过程中获得的产品、该油脂在食品、动物饲料或工业应用中的用途、副产品在食品或动物饲料中的应用。
本发明提供多种用于转化本申请所述的Δ15去饱和酶的植物宿主。所转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，优选地，它们与被鉴定为含油的植物(譬如，油籽植物)是同一类中。优选的油籽植物宿主的实施例包括，但并不局限于：大豆(Glycine与Soja sp.)、谷物(Zeamays)、亚麻(Linum sp.)、油菜籽(Brassica sp.)、樱草花、芥花籽、玉米、红花(Carthamus sp.)及向日葵(Helianthus sp.)。
通常，可通过过量表达本申请中Δ15去饱和酶来生产本发明中的改良植物。这可以通过首先构建嵌合基因的方式来完成，其中Δ15去饱和酶编码区通过操作连接在能够指导该基因在期望的组织中、在期望的发育时期进行表达的调控序列上。这些控制序列包括启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3′UTR和/或5′UTR区、以及蛋白和/或RNA稳定元件。这些元件在其强度和特异性方面可差别很大。出于便利的原因，嵌合基因包括来自相同基因的启动子序列和翻译引导序列。还必须提供编码转录终止信号的3′非编码序列。优选地，嵌合基因通过载体来导入，并且载有Δ15去饱和酶序列的载体还包含一个或多个选择标记基因，用来区分使用嵌合基因转化了的细胞与未转化的细胞。
本发明使用了多种植物启动子来驱使本申请所述的Δ15去饱和酶基因或其功能片段进行表达。任何在植物中具有功能的启动子均是适合的，包括(但并不局限于)：组成型植物启动子、植物组织特异性启动子、植物发育阶段特异性启动子、诱导型植物启动子、病毒启动子、雄性生殖系特异性启动子、雌性生殖系特异性启动子、花特异性启动子及营养体苗端分生组织特异性启动子。
如上文所提到的，启动子是指导植物细胞器件从启动子下游(3′)所毗邻编码序列开始生成RNA的一段DNA序列。启动子区影响在该区域进行基因RNA转录的速率、发育阶段以及细胞类型。进行RNA转录可生成信使RNA(mRNA)，它作为将RNA序列翻译成所编码多肽的氨基酸序列的模板。5′非翻译引导序列是mRNA中蛋白编码区上游的一个区域，在起始及翻译mRNA中发挥作用。3′转录终止子/多聚腺苷酸信号是蛋白编码区下游的一个非翻译区域，在植物细胞中的功能是造成RNA转录的终止并在RNA的3′末端添加多聚腺苷酸核苷酸。
所选择的用来驱使编码序列表达的启动子的来源并不重要，只要它具有足够的转录活性，可通过在期望的宿主组织中、在正确的时间能将期望的核酸片段表达为可翻译的mRNA从而完成本发明即可。异源的或非异源的(即，内源的)启动子均可用于实现本发明。
可用于实现本发明的合适的启动子包括，但并不局限于：β-伴大豆球蛋白的α主亚基启动子、Kunitz型胰蛋白酶抑制剂3启动子、膜联蛋白启动子、Gly1启动子、β-伴大豆球蛋白的β亚基启动子、P34/GlyBd m 30K启动子、白蛋白启动子、Leg A1启动子及Leg A2启动子。膜联蛋白或P34启动子在活性水平上比得上许多已知的强启动子，譬如CaMV 35S启动子(Atanassova等，(1998)Plant Mol.Biol.37：275-285；Battraw and Hall，(1990)Plant Mol.Biol.15：527-538；Holtorf等，(1995)Plant Mol.Biol.29：637-646；Jefferson等，(1987)EMBO J.6：3901-3907；Wilmink等，(1995)Plant Mol.Biol.28：949-955)、Arabidopsis oleosin启动子(Plant等，(1994)Plant Mol.Biol.25：193-205；Li，(1997)Texas A & M University Ph.D.dissertation，pp.107-128)、拟南芥泛素延伸蛋白启动子(Callis等，1990)、番茄泛素基因启动子(Rollfinke等，1998)、大豆热休克蛋白启动子(Schoffl等，1989)及玉米组蛋白基因启动子(Atanassova等，1998)。
当所需的是对目标异源核酸片段进行种子特异性表达时，在绝大多数植物细胞中使用作为2004年8月26日公开的WO 2004/071178的主题膜联蛋白或P34启动子进行嵌合基因的表达尤为有用。膜联蛋白启动子的另一个有用特征是其在发育种子中的表达谱。本发明中的膜联蛋白启动子在种子发育的早期(传粉后10天之前)最具活性，而在后期很大程度上是静止的。膜联蛋白启动子的表达谱不同于很多种子特异性启动子的表达谱，譬如种子储存蛋白启动子，它通常在发育后期提供最高活性(Chen等，(1989)Dev.Genet.10：112-122；Ellerstrom等，(1996)Plant Mol.Biol.32：1019-1027；Keddie等，(1994)Plant Mol.Biol.24：327-340；Plant等，(1994)Plant Mol.Biol.25：193-205；Li，(1997)Texas A & M University Ph.D.dissertation，pp.107-128)。P34启动子具有更便利的表达谱，但与其它已知种子特异性启动子仍有区别。因此，当期望在胚早期发育阶段进行基因过表达或抑制时，膜联蛋白或P34启动子是非常有吸引力的候选者。例如，可以期望过表达一个调节早期胚发育的基因或者涉及种子成熟之前代谢的基因。
然后，使用本领域的技术人员所众所周知的便利方法将启动子通过操作以正向进行连接。
一旦获得重组构建体，随后可通过本领域中普通熟练人员周知的方法包括，例如，上述的转染、转化及电穿孔，将其转化入所选的油籽植物细胞中。然后在允许PUFA表达的适合条件下培养并重建转化的植物细胞，之后可对其进行回收纯化。
本发明的所有重组构建体可以导入一个植物细胞中，或者，每个构建体导入不同的植物细胞中。
在植物细胞中的表达可以按上述的瞬时或稳定方式来完成。
所期望的PUFAs可以在种子中表达。在本发明范畴内，也可以是从这些转化植物获取的种子或植物部分。
植物部分包括分化的及未分化的组织，包括但并不局限于：根、茎、苗、叶、花粉、种子、瘤组织、以及诸如单种细胞、原生质体、胚与愈伤组织这样的多种细胞及培养物形式。植物组织可是位于植物体内，或者位于器官、组织或细胞培养物内。
主要通过使用Agrobacterium tumefaciens转化双子叶植物并获得转基因植物的方法已公开，其中，可用于棉花(美国专利No.5,004,863，美国专利No.5,159,135)、大豆(美国专利No.5,569,834，美国专利No.5,416,011)、芸苔(美国专利No.5,463,174)、花生(Cheng等(1996)Plant Cell Rep.15：653-657，McKently等(1995)Plant Cell Rep.14：699-703)、番木瓜(Ling，K.等(1991)Bioltechnology 9：752-758)以及豌豆(Grant等(1995)Plant Cell Rep.15：254-258)。其它植物转化常用方法的综述可参见Newell，C.A.(2000)Mol.Biotechnol.16：53-65。这些转化方法中的一种是使用了Agrobacterium rhizogenes(Tepfler，M.and Casse-Delbart，F.(1987)Microbiol.Sci.4：24-28)。已经报道了通过使用PEG融合(PCT publication WO 92/17598)、电穿孔(Chowrira，G.M.等(1995)Mol.Biotechnol.3：17-23；Christou，P.等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：3962-3966)、显微注射、或粒子轰击(McCabe，D.E.et.al.(1988)BiolTechnology 6：923；Christou等(1988)PlantPhysiol.87：671-674)的方式将DNA直接输入大豆中进行转化。
有多种方法用于对从植物组织中获得的植株进行重建。重建的特定方法依赖于起始的植物组织以及要重建的具体植物物种。在本领域中从单个植物原生质体转化子或从多种转化的外植体进行植物重建、发育及培养是众所周知的(Weissbach and Weissbach，(1988)In.：Methods for Plant Molecular Biology，(Eds.)，Academic Press，Inc.，SanDiego，CA)。典型地，这种重建及生长过程包括选择转化细胞、通过胚发育，经历有根的胚芽阶段的正常阶段来培养这些具有特性的细胞的步骤。转基因的胚和种子的重建相似。所获得的转基因的有根幼芽随后种植在诸如土壤这样的合适的植物生长培养基中。优选地，重建植物是自花授粉的，以提供纯合的转基因植物。否则，从重建植物中获得的花粉会与那些由种子生长出来的农艺学上重要谱系的植物发生杂交。相反，来自这些重要谱系的花粉可以用于对重建植物进行授粉。可使用本领域熟练人员所周知的方法对本发明中含有期望多肽的转基因植物进行培养。
除了上面讨论过的步骤外，专业人员还熟悉那些描述大分子(譬如，DNA分子、质粒等)构建、操作及分离、重组DNA片段及重组表达构建体的生成、以及筛选并分离克隆的具体条件和过程的标准资料(参见，例如，Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press；Maliga等(1995)Methods in PlantMolecular Biology，Cold Spring Harbor Press；Birren等(1998)Genome Analysis：Detecting Genes，1，Cold Spring Harbor，New York；Birren等(1998)Genome Analysis：Analyzing DNA，2，Cold SpringHarbor，New York；Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual，eds.Clark，Springer，New York(1997))。
在另一方面，本发明涉及在油籽植物中提高ω-3脂肪酸对ω-6脂肪酸比例的方法，它包括：
a)使用本发明中的重组构建体转化油籽植物细胞；
b)通过步骤(a)中的转化植物细胞重建油籽植物；
c)选择同未转化植物中ω-3脂肪酸对ω-6脂肪酸的比例相比，ω-3脂肪酸对ω-6脂肪酸比例有所提高的那些转化植物。
在更进一步的方面，本发明涉及在油籽植物的种子中产生α-亚麻酸的方法，其中种子中α-亚麻酸的含量至少为种子油中总脂肪酸含量的25％，所述的方法包括：
a)使用本发明中的重组构建体转化油籽植物细胞；
b)通过步骤(a)中的转化植物细胞重建油籽植物；
c)选择那些其中所含α-亚麻酸至少为种子油中总脂肪酸含量25％的转化植物。
在这类种子中油脂中α-亚麻酸的含量范围为至少25％到约89％，或者是25％与89％之间的任意整数百分比，譬如，26％、27％等。
本发明涉及在其基因组中含有通过本发明方法所制备的本发明中的重组构建体的油籽植物、植物细胞、植物组织和/或植物部分。
在更进一步的方面，本发明还涉及从这些转化的油籽植物中获得的种子、从这些种子中获取的油脂、在油脂加工过程中获得的产品、该油脂在食品、动物饲料或工业应用中的用途、副产品在食品或动物饲料中的应用。
在本领域中分离种子油的方法是众所周知的：(Young et al，Processing of Fats and Oils，in″The Lipid Handbook″(Gunstone et aleds.)Chapter 5pp 253-257；London，Chapman & Hall，1994)。
随后可向改造的种子油中添加诸如营养添加剂、食品、婴儿配方食品、动物饲料、宠物食品及其它类似的营养组分。
同其它植物油相比，从物理学角度看，可以确信本发明中的油脂在功能上与食品应用中的其它油脂类似。诸如豆油这样部分氢化的油脂，可广泛用作涂抹奶油、人造黄油以及烧烤及油炸起酥油的成分。
其中加入了本发明中的改造种子油或改造种子的食品或食品类似物的实施例包括诸如肉类加工产品这样肉制品、谷类食品、快餐食品、烧烤食品、油炸食品、健康食品、婴儿配方食品、饮料、营养添加剂、乳制品、宠物食品、动物饲料或水产品。可使用本领域的技术人员所周知的加工过程来制备食品类似物。美国专利Nos.6,355,296 B1及6,187,367 B1描述了乳化的肉类似物以及乳化的肉增量剂。美国专利No.5,206,050 B1描述了可用于烹饪食品类似物的大豆蛋白凝乳(也可作为生成凝乳，可用于制备食品类似物的工艺)。Hwa的美国专利No.4,284,656描述了一种用于食品类似物的大豆蛋白凝乳。Hibbert等的美国专利No.3,988,485描述了一种由交织的植物蛋白纤维形成的类似肉类的蛋白食品。Puski等的美国专利No.3,950,564描述了一种制备基于大豆的肉类替代品的过程，Reinhart等的美国专利No.3,925,566描述了一种仿肉制品。例如，经过加工处理成具有一定结构的、块状或纤维状的、用作食品配料的大豆蛋白称为“大豆组织蛋白(TSP)”。常常将TSP制备成在含水时具有类似肉类、海产品或禽肉的结构及外观。
值得一提的还有肉类似物、干酪类似物、牛奶类似物及其它相似物品。
从大豆中制备的肉类似物含有大豆蛋白或者豆腐以及其它混和在一起的成分，可以模拟成多种肉类。这些肉类替代品以冷冻、罐装或干燥食品的方式出售。通常，它们按与其所替代的食品相同的方式来使用。来自大豆的肉类替代品是蛋白质、铁及维生素B的优质来源。肉类似物的实施例包括，但并不局限于：火腿类似物、香肠类似物、熏肉类似物以及其它类似物。
食品类似物根据其功能和组分特性可归为仿制品或替代品。例如，仿制干酪仅仅需要与它所要替代的干酪相类似。不过，若是产品的营养与其所替代的干酪等价、达到了该干酪的最低组分要求，则通常称之为替代干酪。因此，替代干酪通常比仿制干酪具有更高的蛋白水平，并且维生素和矿物质也进行了加强。
牛奶类似物或不含奶的食品包括，但并不局限于：仿制牛奶、诸如从大豆和/或大豆蛋白产品制备的非乳制冰冻甜点。
肉制品包括种类众多的产品。在美国，“肉类”包括产自牛、猪及羊的“红肉”。除了红肉之外，还有包括鸡、火鸡、鹅、珍珠鸡、鸭的家禽选项，以及鱼类和贝类。对于有时效的及加工的肉制品有一个涵盖很广的分类：新鲜的、腌制并油炸的、以及腌制并煮熟的。香肠和热狗是加工过的肉制品的实施例。因此，本申请中的术语“肉制品”包括，但并不局限于加工过的肉制品。
谷类食品是加工谷物所获得的食品。谷物包括来自草本家族能产生可食用谷粒(种子)的所有植物。最普通的谷物是大麦、玉米、小米、燕麦、昆诺阿藜、稻米、黑麦、高粱、黑小麦、小麦及野生稻。谷类食品的实施例包括，但并不局限于：整粒谷物、碾碎的谷物、粗面粉、面粉、麦麸、胚芽、早餐类谷物、膨化食品、意大利面、以及其它类似物。
烧烤食品包括上述任一种谷物食品，它是经历过烧烤或者用与烧烤相当的方式即，通过加热来干燥或硬化进行过加工。烧烤食品的实施例包括，但并不局限于：面包、蛋糕、油炸圈饼、面包心、烧烤小吃、小点心、小脆饼、小甜饼、以及小成饼干。如上所述，本发明中的油脂可以用作配料。
一般地，通过一系列与从含油种子中提取并纯化食用油相关的步骤来生产豆油。可使用下图所示的一般性步骤来生产豆油和大豆副产品。
Figure GSB00000439125500651
将大豆种子进行清洗、软化、去皮、并剥成片，这会提供油脂提取的效率。通常使用溶剂(己烷)抽提的方法来进行油脂提取，不过也可通过物理压迫和/或溶剂抽提相结合的方法还做到这点。获得的油脂称为粗油。粗油可以通过与可促进其与未水合的甘油三酯部分(豆油)分离的磷脂以及其它极性与中心脂类复合物水合的方式进行脱胶。获得的卵磷脂胶可以进一步加工，制成在多种食品及工业产品中均具有重要商业价值的、可用作乳化剂及脱模(抗粘)剂的卵磷脂产品。同商业应用相比，在用于化学及生化时，术语卵磷脂本身具有不同含义。在化学上，卵磷脂是磷脂酰胆碱。商业上，它指的是中性及极性脂类的天然混合物。极性脂磷脂酰胆碱在已商品化的卵磷脂中其浓度为20-90％。含有磷脂酰胆碱的卵磷脂可从植物、动物及微生物原料中生产，但主要来自植物原料。大豆、向日葵和油菜籽是商品化卵磷脂的主要植物来源。大豆是最常见的来源。植物卵磷脂被认为是符合GRAS(公认安全)的。脱胶油脂可进一步提炼除去杂质；主要是游离的脂肪酸、色素和残留的胶。可通过向粗油中加入可与游离脂肪酸反应形成皂的腐蚀性试剂、以及水合磷脂及蛋白来完成精炼。使用水洗去精炼过程中形成的痕量皂。皂料副产物可直接用于动物饲料。或者酸化后回复成游离脂肪酸。通过漂白土的吸收来除去染料可除去绝大多数叶绿素II及类胡萝卜素混合物。精炼油脂可以氢化，形成具有多种融解特性及结构的脂肪。可使用凝析(分级分离)通过在精心控制的冷却条件下进行结晶的方式，从氢化油脂中除去硬脂酸。除臭，主要是在真空中的蒸气蒸馏是最后一步，用来除去给油脂造成臭味或气味的化合物。其它有价值的副产品，诸如生育酚和固醇可以在除臭过程中分离出去。含有这些副产品的除臭蒸馏物可以作为天然的维生素E产品以及其它高价值的药学产品来出售。精炼的、漂白的、(氢化的、分馏的)并除臭的油脂和脂肪，可包装后直接出售，或者进一步加工成更专门的产品。关于大豆种子加工、豆油生产及副产品应用的更为详尽的文献，可以在Erickson，1995，Practical Handbook of SoybeanProcessing and Utilization，The American Oil Chemists′Society andUnited Soybean Board一书中找到。
同其它油脂，诸如椰子、棕榈、棕榈仁及可可油相比，豆油中饱和脂肪酸的含量相对较低，因此它在室温下是液体。很多加工过的脂肪，包括涂抹奶油、糖果用油脂、硬质脂肪、人造奶油、烧烤起酥油等，在室温下需要具有多种程度不同的固体状态，只能从豆油中通过改变其物理特性的方式来进行生产。实现该目标最常见的方式是催化加氢。
氢化是一个化学反应，其中在诸如镍这样的催化剂的协助下，将氢加到不饱和脂肪酸双键上。高油酸豆油含有不饱和的油酸、亚油酸及亚麻酸，其中每种均可氢化。
氢化作用有两个主要效果。首选，由于减少了不饱和脂肪酸的含量，增加了油脂的氧化稳定性。其次，由于对脂肪酸的修饰提高了熔
乳制品是来源于乳液的产品。牛奶类似物或者非乳制品来自乳液之外的原料，例如，上文讨论过的豆奶。这些产品包括，但并不局限于：全脂奶、脱脂奶、诸如乳酪或者酸奶这样的发酵乳制品、奶油、黄油、炼乳、干奶片、咖啡伴侣、咖啡奶精、冰淇淋、干酪等。
宠物食品是专门用来喂养诸如狗、猫、鸟、爬行动物、鱼、啮齿动物以及其它类似动物的产品。这些产品可以包括上述的谷物与健康产品，以及肉与食用脏器、大豆蛋白产品、草和干草产品包括但并不局限于苜蓿、猫尾草、燕麦草或雀麦草、蔬菜以及其它类似物。
动物饲料是专门用来喂养诸如火鸡、鸡、牛与猪以及其它类似动物的产品。同上述宠物食品一样，这些产品可包括谷物与健康产品、大豆蛋白产品、肉与食用脏器、以及上面所列的草和干草产品。
水产培养饲料是专门用于水产养殖场的产品，它涉及在淡水或咸水中对水生生物、动物和/或植物进行繁殖、培养或饲养。
在另一个实施例中，本发明包括从这类植物种子中获得的油脂。
在另外一方面，本发明涉及用于改变油籽植物成熟种子中总脂肪酸谱从而生成ω-3对ω-6比例大于2的油脂的重组构建体，其中所述的油脂中二十碳五烯酸含量高于2％，所述的含有分离核酸片段的构建体选自含有以下条件的组中：
(a)分离的、编码SEQ ID NO：2中所示的全部或部分氨基酸序列的核酸片段；
(b)分离的、当使用0.1×SSC、0.1％SDS、65℃洗涤时可与(a)杂交的核酸片段；
(c)分离的、编码氨基酸序列的核酸片段，所述氨基酸序列基于序列比对的Clustal V方法，同SEQ ID NOs：2、6、10、14、18所示的氨基酸序列具有至少46.2％的序列同一性；或者
(d)分离的、同(a)(b)或(c)完全互补的核酸片段。
其中所述的分离的核酸片段可通过操作连接到至少一种调控序列上。
另外，本发明涉及在其基因组中含有本发明中的重组构建体的油籽植物、植物细胞、植物组织或植物部分。本发明还涉及从这些植物获得的种子、从这些种子中获取的油脂、该油脂在食品或动物饲料中的用途、在该油脂加工过程中获得的副产品以及这些副产品在食品或点，使得油脂的物理性质发生变化，可在室温下保持半固体或半液体状态。
有很多影响氢化反应的变量，它又改变了终产物的组成。包括压力、稳定、催化剂种类和浓度、搅拌及反应器设计在内的操作条件是可以控制的比较重要的参数。选择氢化条件，可以在较低不饱和脂肪酸之前优先氢化更不饱和的脂肪酸。经常使用非常轻微或小规模的氢化来增加液体油脂的稳定性。进一步的氢化会将液体油脂转化为物理上为固体的脂肪。氢化的程度依赖于针对特定终产物所设计的期望操作以及融解特性。用于制造烧烤产品的液体起酥油、用于商业油炸与焙烧操作的固体脂肪和起酥油、以及用于人造奶油生产的基本原料就是通过氢化作用获得的无数种可能的油脂与脂肪产品种的几个。关于氢化作用和氢化产品的更为详尽的描述，可以在Patterson，H.B.W.，1994，Hydrogenation of Fats and Oils：Theory and Practice.TheAmerican Oil Chemists′Society中找到。
由于存在氢化过程中形成的反式脂肪酸异构体，因此对氢化油脂也存在争论。摄入大量的反式异构体同有害的健康效应包括增高血浆中低密度对高密度脂蛋白的比例从而增加了冠心病的危险相关联。
快餐食品可包括上述或下述食品中的任何一种。
油炸食品可包括上述或下述经油炸制备的食品中的任何一种。
健康食品是对健康有好处的任何食品。许多来源于油籽的食品可被视为健康食品。
饮料可以是液体或者干粉形式。
例如，可以是非碳酸类饮料；新鲜的、冷冻的、罐装的或浓缩的果汁；添加香料或正常的牛奶饮品等。在本领域中，成年人和儿童营养配方均是众所周知的，而且已商品化(譬如，来自Ross ProductsDivision，Abbott Laboratories的
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Figure GSB00000439125500682
Figure GSB00000439125500683
以及
Figure GSB00000439125500684
)。
婴儿配方食品是用来哺育婴儿及年幼儿童的液体或可重新构成液体的粉末。它们用作人乳的替代品。婴儿配方食品在婴儿饮食方面具有特别作用，因为它们通常是婴儿营养的唯一来源。尽管对婴儿而言乳房喂养仍然是最具营养的，但婴儿配方食品仍是宝宝不仅要生存下来还更要茁壮成长的最佳第二选择。
动物饲料中的应用。
此外，本发明提供了通过本发明中的方法生产的微生物油。
在另一个方面，本发明涉及在油籽植物种子中产生二十碳五烯酸的方法，以生产ω-3对ω-6比例大于2的油脂，其中所述的油脂中二十碳五烯酸的含量高于种子油总脂肪酸含量的2％，所述方法包括：
a)使用本发明中的重组构建体转化油籽植物细胞；
b)通过步骤(a)中的转化植物细胞重建油籽植物；
c)选择那些其中所含二十碳五烯酸至少为种子油中总脂肪酸含量2％的转化植物。
另外，本发明涉及在其基因组中含有本发明中的重组构建体的油籽植物、植物细胞、植物组织或植物部分。本发明还涉及从这些植物获得的种子、从这些种子中获取的油脂、该油脂在食品或动物饲料中的用途、在该油脂加工过程中获得的副产品以及这些副产品在食品或动物饲料中的应用。
此外，本发明提供了通过本发明中的方法生产的微生物油。
然后使用本领域的技术人员所周知的方法，参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY，1989(在下文为“Maniatus”)；以及由Greene Publishing Assoc.及Wiley-Interscience(1987)出版的Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology中所述的技术，可构建包含嵌合Δ15去饱和酶基因的多种质粒和载体。
质粒载体的选择依赖于转化宿主植物时所用的方法。熟练的技术人员非常清楚质粒上必须存在的遗传元件，以成功转化、选择并增殖含有嵌合基因的宿主细胞。例如，所使用的终止信号通常来自胭脂碱合成酶启动子或CAMV 35S启动子。经常使用的植物翻译增强子是烟草花叶病毒(TMV)ω序列；此外，已表明含有内含子(例如，来自玉米Shrunken基因的Intron-1)可提高表达水平达100倍之多(Mait，Transgenic Res.6：143-156(1997)；Ni，Plant Journal 7：661-676(1995))。其它的调控元件可包括转录(以及翻译)增强子。
除了上述用于优选的表达载体的调控元件外，对于载体而言，含有可作为选择和/或记分的标记也是有用的。优选地，标记基因是某种抗生素抗性基因，因此可使用合适的抗生素从未转化的细胞中将转化细胞筛选出来。对本领域的技术人员而言，可用于筛选转化的植物细胞、植物组织和植物的选择标记基因是众所周知的。实施例包括，但并不局限性：提供针对theaminoglycosides、新霉素、卡那霉素和巴龙霉素(paromycin)抗性的npt；提供针对潮霉素抗性的hygro；允许细胞使用吲哚来替代色氨酸的trpB；允许细胞使用histinol来替代组氨酸的hisD(Hartman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8047(1988))；允许细胞使用甘露糖的甘露糖-6-磷酸异构酶(WO 94/20627)；提供针对鸟氨酸脱羧酶抑制剂、2-二氟甲基-DL-鸟氨酸(或为“DFMO”)抗性的ODC(鸟氨酸脱羧酶)(McConlogue，In：Current Communications inMolecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold SpringHarbor，NY(1987))；以及提供针对杀稻瘟菌素S抗性的来自Aspergillus terreus的脱氨酶(Tamura，Biosci.Biotechnol.Biochem.592336-2338(1995))。
对于本领域的技术人员而言，可用的记分标记也是众所周知的，并且已商品化，譬如编码荧光素酶(Giacomin，Pl.Sci.116：59-72(1996)；Scikantha，J.Bact.178：121(1996))、绿色荧光蛋白(Gerdes，FEBS Lett.389：44-47(1996))或者R-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson，EMBO J.6：3901-3907(1987))的基因。这类实施例对于简单并快速筛选含有包含Δ15去饱和酶的载体的细胞、组织和生物体非常有用。
对某些应用而言，指导Δ15去饱和酶进入不同的细胞区室是有益的。因此可以想象，上述嵌合基因可通过向其编码区添加适合的细胞内导向序列(和/或将已经存在的导向序列删除)的方式来使其进一步被修饰。这些附加的导向序列包括叶绿体转运肽(Keegstra等，Cell 56：247-253(1989))、指导蛋白进入内质网的信号序列(Chrispeels等，Ann.Rev.Plant Phys.Plant Mol.42：21-53(1991))、以及核定位信号(Raikhel等，Plant Phys.100：1627-1632(1992))。虽然所引用的参考文献给出了上述每一个的实施例，但这个列表并没有完结，在将来会发现更多可应用的导向信号，它们也可用于本发明中。
对于本领域的技术人员而言，有多种已知的、可用的能够将构建体导入植物细胞宿主的技术。这些技术包括使用Agrobacteriumtumefaciens或A.rhizogenes作为转化剂用DNA进行转化。特别优选的是使用了Agrobacterium spp.中Ti及Ri质粒的双元载体。来源于Ti的载体可转化很多种高等植物，包括诸如大豆、棉花、油菜、烟草和稻这样的单子叶植物及双子叶植物(Pacciotti等，Bio/Technology 3：241(1985)；Byrne等，Plant Cell，Tissue and Organ Culture 8：3(1987)；Sukhapinda等，Plant Mol.Biol.8：209-216(1987)；Lorz等，Mol.Gen.Genet.199：178(1985)；Potrykus，Mol.Gen.Genet.199：183(1985)；Park等，J.Plant Biol.38(4)：365-71(1995)；Hiei等，Plant J.6：271-282(1994))。对使用T-DNA转化植物细胞的用法已经进行了广泛的研究，并做了详尽的描述(EP 120516；Hoekema，In：The Binary Plant Vector  System.Offset-drukkerij Kanters B.V.；Alblasserdam(1985)，ChapterV；Knauf等，Genetic Analysis of Host Range Expression byAgrobacterium，In：Molecular Genetics of the Bacteria-Plant  Interaction，Puhler，A.Ed.；Springer-Verlag：New York，1983，p 245；以及An等，EMBO J.4：277-284(1985))。本发明中的嵌合基因可以插入实施例所述的双元载体中以便转入植物中。
对于本领域的技术人员而言，其它转化方法也是可用的，诸如：1.)直接吸取外源DNA构建体(参见EP 295959)；2.)电穿孔技术(参见Fromm等，Nature(London)319：791(1986))；3.)使用包被核酸构建体的金属粒子进行高速弹道轰击(参见Kline等，Nature(London)327：70(1987)及美国专利No.4,945,050)；或者4.)显微注射(参见Gene Transfer To Plants，Potrykus and Spangenberg，Eds.，SpringerVerlag：Berlin，NY(1995))。关于植物转化通常所用方法的综述可以参见Newell，C.A.(Mol.Biotechnol.16：53-65(2000))。使用上述的方法可以转化绝大多数双子叶植物；不过，还发展了其它转化技术用于成功转化单子叶植物。这些方法包括原生质体转化以及通过使用Agrobacterium tumefaciens的植物活体方法进行转化。这种植物活体方法(Bechtold and Pelletier，C.R.Acad.Sci.Paris，316：1194(1993)；orClough S.J.，Bent A.F.；Plant Journal 16(6)：735-43(1998))涉及在发育中花蕾外面使用A.tumefaciens然后将双元载体DNA导入正在发育的小孢子和/或大孢子和/或形成中的种子之中，以在不使用外源细胞分裂素和/或赤霉素的情况下产生转化种子。本领域的技术人员知道所选取的用于这样一个过程的组织可以有很多种；不过，通常优选地，使用在合子形成阶段的植物原料用于植物活体转化过程。
一旦被转化，有多种方法用于从植物组织中重建植株。重建的特定方法依赖于起始的植物组织以及要重建的具体植物物种。在本领域中从单个植物原生质体转化子或从多种转化的外植体进行植物重建、发育及培养是众所周知的(Methods for Plant Molecular Biology；Weissbach and Weissbach，Eds.，Academic：San Diego，CA(1988))。其中特别相关的是将外源基因转入商业上重要的油籽作物——诸如油菜籽(参见De Block等，Plant Physiol.91：694-701(1989)；美国专利No.5,463,174)、向日葵(Everett等，Bio/Technology 5：1201(1987))、大豆(McCabe等，Bio/Technology 6：923(1988)；Hinchee等，Bio/Technology 6：915(1988)；Chee等，Plant Physiol.91：1212-1218(1989)；Christou等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 86：7500-7504(1989)；EP 301749；美国专利No.5,569,834；美国专利No.5,416,011)及谷物(Gordon-Kamm等，Plant Cell 2：603-618(1990)；Fromm等，Biotechnology 8：833-839(1990))中的方法。
典型地，将转基因植物细胞置于合适的选择培养基上用于筛选随后会长成愈伤组织的转基因细胞。幼苗从愈伤组织中长出，通过在生根培养基上生长会从苗中生成小植株。通常会在多种构建体中加入标记用来对植物细胞进行筛选。为了便利，标记会对某种生物杀灭剂(尤其是诸如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素、氯霉素、除草剂或其它类似物这样的抗生素)具有抗性。使用的特定标记可以通过与缺少导入DNA的细胞进行比较来选择转化细胞。
本领域的技术人员知道，在植物中转基因的表达水平和调节会因谱系不同而差别显著。因此，可以检测数个谱系，得到具有期望表达水平及调节的谱系。熟练的技术人员还知道不同的、独立进行的转化会导致不同的表达水平和模式(Jones等，EMBO J.4：2411-2418(1985)；De Almeida等，Mol.Gen.Genetics 218：78-86(1989))，因此一定要对多次转化进行筛选以获得表现出期望表达水平和模式的谱系。这种筛选可通过DNA印迹的Southern分析(Southern，J.Mol.Biol.98：503(1975))、mRNA表达的Northern分析(Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618(1-2)：133-145(1993))、蛋白表达的Western分析或表型分析来完成。一个用来测定蛋白表达量以及检测不同植物组织中重复性的特别有用的方法是使用报告基因(譬如，GUS)。一旦获得转基因植物，它们可生长产生具有期望表型的植物组织或局部。可采集植物组织或植物部分，并/或收集种子。种子可用作长成额外的、其组织或局部具有期望特征的植物的来源。
如上文所讨论的那样，分离种子油的方法在本领域中是众所周知的(Young等，In The Lipid Handbook；Gunstone等，Eds.；Chapman &Hall：London，1994；pp 253-257)。然后改造的种子油可用于多种营养组分中(譬如，营养添加剂、食品、婴儿配方食品、动物饲料、宠物食品等)。
本申请所述工作的最终目标是累积了富含ω-3 PUFAs油脂的生物体的发育，其中优选的宿主是产油植物或者含油酵母。为了这个目标，必须鉴定出在这些宿主中具有合成并高度累积优选的ω-3 PUFAs的功能的去饱和酶。对有效的A15和ω-3去饱和酶进行鉴定对于控制宿主细胞中ω-3对ω-6 PUFAs的比例也是必要的。
在先前的工作中，分离到天然Yarrowia lipolytica Δ12去饱和酶，并过表达该蛋白，结果相对于野生型细胞，油酸转化为LA增加了(美国专利申请10/840325，通过参考的方式完全整合在本申请中；也可参见本申请实施例2以及SEQ ID NOs：54和55)。尽管在这些宿主细胞中LA的可用性增加了，但期望获得适于在Y.lipolytica转化细胞中可高水平生产多种ω-3 PUFAs(譬如，EPA)的更大的底物池。这样，以改造生物体的途径来表达具有高水平Δ15去饱和酶活性的异源蛋白从而具有优势。由于不指望先前在植物原料中分离的Δ15去饱和酶能在含油酵母中有效发挥作用，因此本发明的目标是分离真菌Δ15去饱和酶。可以预料，该真菌去饱和酶的过表达会增加含油酵母宿主中ALA的底物池，从而使得在这些宿主中合成并高度累积优选的ω-3 PUFAs(譬如，STA、ETA、EPA、DPA及DHA)。增高的Δ15去饱和酶活性也能够改变ω-3对ω-6 PUFAs的比例。
为了实现这些目标，在本发明中，申请人分离并克隆了来自串珠镰孢的DNA片段，它编码Δ15去饱和酶(“Fm1”；SEQ ID NOs：1和2)。使用含有串珠镰孢Fm1去饱和酶的嵌合基因转化后在野生型的Yarrowia lipolytica细胞中生成了ALA，基于这点，确认了该基因作为Δ15去饱和酶的活性(实施例5，其中底物转化百分比按([18:3]/[18:2+18:3]＊100)计算为82.5％)。
不过令人惊讶的是，同先前已知的Δ15去饱和酶相比，串珠镰孢Δ15去饱和酶还具有几个独特的性质。具体地，除了串珠镰孢Δ15去饱和酶具有全新的序列之外，它还以具有显著的Δ12去饱和酶活性(即，具有使用油酸作为酶底物的能力)、％ALA产物累积以及广泛的底物特异性而闻名。
●显著的Δ12去饱和酶活性
如实施例中所示，本申请所公开的串珠镰孢Δ15去饱和酶具有显著的Δ12去饱和酶活性(参见表9、实施例5)，其中使用编码SEQ IDNO：2的嵌合基因转化Δ12去饱和酶已被敲除的Yarrowia lipolytica菌株，它能将24％的油酸转化为LA(底物转化百分比按([18:2+18:3]/[18:1+18:2+18:3])＊100)计算，此外还将96％的LA转化为ALA(底物转化百分比按([18:3]/[18:2+18:3])＊100)计算))。这种双功能同其它所有已知的Δ15去饱和酶形成鲜明对照。并且，尽管知道存在可对超过一种底物具有特异性的去饱和酶，但仍可将双功能的串珠镰孢去饱和酶(其中蛋白同时具有Δ12和Δ15去饱和酶活性)和迄今为止所鉴定的任何已知的Δ12或Δ15去饱和酶区分开来。
●ALA产物累积百分比
在Yarrowia lipolytica表达本申请所公开的串珠镰孢Δ15去饱和酶时，相对于已描述的其它异源表达的Δ15去饱和酶(譬如，蠕虫和植物)，它可进行极高的ALA合成。具体地，Fusarium酶非常有活性(即，使用编码SEQ ID NO：2的嵌合基因所转化的Yarrowia lipolytica能够表现出相对于转化宿主细胞中总脂肪酸为31％的％ALA产物累积(参见表9、实施例5))。这代表ALA的转化效率超过83％(按[18:3]/[18:2+18:3]＊100计算)。在使用编码SEQ ID NO：2的嵌合基因转化的Δ12去饱和酶已被敲除的Yarrowia lipolytica菌株中，表明ALA的转化率为96％。相反，在非含油酵母酿酒糖酵母中表达线虫Δ15去饱和酶时，％ALA产物累积仅为4.1％(Meesapyodsuk等Biochem.39：11948-11954(2000))；并且，当在啤酒糖酵母中表达B.napusΔ15去饱和酶时，％ALA产物累积仅为1.3％(Reed.，D.W.等，Plant Physiol.122：715-720(2000))。
串珠镰孢Δ15去饱和酶的高效性，尤其是在Δ12去饱和酶被敲除的Y.lipolytica菌株中，是该蛋白具有双功能的Δ12及Δ15去饱和酶活性的结果，由此Δ12去饱和的产物可用作Δ15去饱和酶的底物。本领域的技术人员知道，通过在几乎没有或完全没有合成18:2能力的宿主生物(譬如，含油酵母的无Δ12去饱和酶谱系或者拟南芥fad2突变体)中表达本申请所公开的酶，18:3/18:2比例可最大化。
●广泛的底物特异性
最后，串珠镰孢Δ15去饱和酶对于18:2的下游ω-6衍生物具有相对广泛的底物特异性；具体地，本申请所述的Δ15去饱和酶能够催化GLA到STA、DGLA到ETA、及ARA到EPA的转化。不过，相对于在酿酒糖酵母中线虫(C.elegans)和B.napusΔ15去饱和酶的异源表达(Meesapyodsuk等，见上；Reed等，见上)，本申请申请人的数据表明在Yarrowia中进行表达时，串珠镰孢Δ15去饱和酶可更有效地将ω-6底物转化为其ω-3对应物，即，具有更高的％底物转化(表4)。
表4
来自蠕虫、植物与真菌的Δ15去饱和酶底物选择的定性比较
Figure GSB00000439125500761
注：除了Y.lipolytica中的18:2外，所有例子均加入了ω-6底物；Nd＝未检测
因此，本发明中真菌Δ15去饱和酶的异源表达通过增强ALA生物合成的方式增加了细胞内的碳流入ω-3脂肪酸生物合成途径。结果，当其它PUFA生物合成酶与本申请的Δ15去饱和酶共同表达时，可提高ω-3/ω-6脂肪酸的比例，并生成更多下游ω-3脂肪酸(譬如，STA、ETA和EPA)。可以预料这样的结果会出现在任何表达本发明中Δ15去饱和酶的微生物中。在另外的实施例中，本发明人通过在植物油籽宿主中过表达串珠镰孢Δ15去饱和酶的方式揭示了类似的结果。因此，可以预料该串珠镰孢Δ15去饱和酶在任何宿主细胞中的表达均会使宿主细胞产生水平高于约10％总脂肪酸的ALA，其中高于约30％是优选的，高于50％是最优选的。类似地，这类转化子显示了改变的ALA对LA比例，其中ALA∶LA比例至少约4是典型的，比例至少为8是优选的，比例至少为12是最优选的。从这些转化子中提取的微生物油含有高于约10％的ALA，其中高于约30％是同样期待的，高于50％会是典型的。
此外，本发明人还从构巢曲霉、粗糙链孢霉、稻瘟病菌和禾谷镰孢中鉴定了一系列同所述串珠镰孢蛋白直系同源的Δ15去饱和酶(即，分别是SEQ ID NOs：6、14、10和18)。也预期这些真菌蛋白可用于在包括含油酵母(譬如，Yarrowia lipolytica)在内的不同宿主细胞中表达Δ15去饱和酶活性。这些蛋白(包括串珠镰孢Δ12去饱和酶(SEQ IDNO：2))归于一个独特的蛋白亚族(本申请中指的是“亚族1”)中，它与归于“亚族2”(即，SEQ ID NOs：4、8、12、16和20，在共同待决美国临时申请案60/570679中鉴定为Δ12去饱和酶)中的蛋白截然不同，虽然所有的蛋白均鉴定与Y.lipolytica去饱和酶本申请中鉴定为SEQ ID NO：55(其特征见共同待决美国专利申请10/840325)同源。综上，亚族1中的蛋白(本申请中鉴定为Δ15去饱和酶)代表其中彼此间具有至少46.2％同一性的一组蛋白(实施例3)，它们可根据序列同源性与先前所述的Δ15去饱和酶完全区分开来。
在WO 03/099216中描述了构巢曲霉和粗糙链孢霉蛋白的功能特性，这确认了其作为Δ15去饱和酶的活性。本申请确认了推测的稻瘟病菌Δ15去饱和酶(“Mg1”；SEQ ID NOs：9 and 10)基因确实具有Δ15去饱和酶的活性，这是基于使用含有Mg1的嵌合基因转化的野生型Yarrowia lipolytica细胞产生了ALA(实施例6)。不过，这些Δ15去饱和酶的活性与上述串珠镰孢Δ15去饱和酶活性的对比显示，并非所有亚族1中的Δ15去饱和酶蛋白均具有双功能的Δ12/Δ15去饱和酶活性。具体地，基于WO 2003/099216中的结果，粗糙链孢霉与构巢曲霉蛋白并未表现出双功能的Δ12/Δ15去饱和酶活性。相反，稻瘟病菌蛋白的表现与串珠镰孢蛋白类似，因此这两个均归为具有双功能的Δ12/Δ15去饱和酶活性一类。推测禾谷镰孢(“Fg1”；SEQ ID NOs：17和18)也具有双功能的Δ12/Δ15去饱和酶活性，因为Fg1与Fm1关系最近(具有88.8％的同一性)，而双功能的Fm1与Mg1仅有60.9％的同一性。
预计这个独特的真菌Δ15去饱和酶类群作为改变脂肪酸组成的手段可用于含油酵母(譬如，Yarrowia lipolytica)中的表达，这是基于对它们会高效发挥功能的期望(即，底物转化百分比，其中LA到ALA的％底物转化至少约50％是有用的，到ALA的转化率至少约80％是优选的，到ALA的转化率至少约90％是特别合适的，到ALA的转化率至少约95％是最优选的)。因此，本发明的一个实施例是在含油酵母中改变脂肪酸谱的方法，其中亚族1中的Δ15去饱和酶蛋白单独表达，或者同其它脂肪酸合成基因(譬如，Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶和/或碳链增长酶)一起表达。另一个实施例是在植物中改变脂肪酸谱的方法，其中亚族1中的Δ15去饱和酶蛋白单独表达，或者同其它脂肪酸合成基因一起表达，从而改变油脂中ω-3∶ω-6的比例和/或改变植物PUFAs的累积或组成。
实施例
本发明通过以下实施例进行进一步描述。
应当理解这些用于阐述本发明中优选实施例的实施例仅用于描述用途。通过以上讨论和这些实施例，本领域的熟练人员可了解本发明的本质特征，在不偏离其主旨和范围下，可对本发明进行各种改变和修改，以使其适于各种用途和条件。
常规方法
在实施例中所用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中是众所周知的，并在以下著作中进行了描述：1.)Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；ColdSpring Harbor，NY(1989)(Maniatis)；2.)T.J.Silhavy，M.L.Bennan，and L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions；Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；及3.)Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，由Greene PublishingAssoc.and Wiley-Interscience出版(1987)。
适于细菌培养物维持和生长的材料和方法在本领域中是众所周知的。适于以下实施例中的实验技术可参见Manual of Methods for  General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg and G.Briggs Philips，Eds)，American Society for Microbiology：Washington，D.C.(1994))；或Thomas D.Brock的Biotechnology：A Textbook of  Industrial Microbiology，2nd ed.，Sinauer Associates：Sunderland，MA(1989)。若无特别说明，所有用于细菌细胞生长和维持的试剂、限制性内切酶和材料均从Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCOLaboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或SigmaChemical Company(St.Louis，MO)获得。
E.coli TOP10细胞和E.coli Electromax DH10B细胞从Invitrogen(Carlsbad，CA)获得。E.coli DH5α高效感受态细胞从GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)获得。E.coli(XL1-Blue)感受态细胞购自Stratagene Company(San Diego，CA)。典型地，所有E.coli菌株于37℃在Luria Bertani(LB)培养皿上进行培养。
根据标准方法进行常规的分子克隆(Sambrook等，同上)。寡具核苷酸由Sigma-Genosys(Spring，TX)合成。PCR产物克隆到Promega的pGEM-T-easy载体(Madison，WI)中。
在ABI自动测序仪上通过dye terminator技术(U.S.5,366,860；EP 272,007)利用重组载体和插入子特异的引物来获得DNA的序列。使用Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)进行序列编辑。所有序列均在两个方向上覆盖至少两次。用DNASTAR软件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)进行基因序列的比较。
缩略语的含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分，“h”表示小时，“d”表示天，“μl”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“uM”表示微摩尔浓度，“mM”表示毫摩尔浓度，“M”表示摩尔浓度，“mmol”表示毫摩尔，“pmole”表示皮摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对，“kB”表示千碱基。
Yarrowia lipolytica的培养
Yarrowia lipolytica菌株ATCC #76982和ATCC #90812购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。Y.lipolytica菌株通常于28℃在YPD琼脂(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)上进行培养。对于转化子的筛选，要使用基本培养基(0.17％无硫酸铵和氨基酸的酵母氮源(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)，2％葡萄糖，0.1％脯氨酸，pH 6.1)。并加入适量腺嘌呤、亮氨酸、赖氨酸和/或尿嘧啶至终浓度0.01％。
Yarrowia lipolica的脂肪酸分析
为了进行脂肪酸分析，通过离心收集细胞，并根据Bligh，E.G.&Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physio.37：911-917(1959))所描述的方法提取脂肪。通过用甲醇钠对抽提的脂类进行酰基转移反应来制备脂肪酸甲基酯(Roughan，G.，and Nishida I.Arch Biochem Biophys.276(1)：38-46(1990))，然后用已填充30-m×0.25mm(i.d.)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。烤箱温度从170℃(维持25分钟)，以3.5℃/min的速率升到185℃。
对于直接的碱基酰基转移反应，收获Yarrowia培养物(3mL)，在蒸馏水中洗涤一次，然后在Speed-Vac中真空干燥5-10分钟。向样品中加入甲醇钠(1％，100μl)，然后摇动并振荡20min。在加入3滴1M的NaCl和400μl的己烷后，对样品进行振荡并离心。除去上层后，用上述GC进行分析。
实施例1
Yarrowia表达载体的构建
本实施例描述了pY5-13(包含嵌合的TEF启动子::XPR终止子基因)、pY5-13GPDN(包含嵌合的GPD启动子::XPR终止子基因)和pY5-20(包含嵌合的潮霉素耐药基因)的构建。
质粒pY5-13的构建
构建的质粒pY5是质粒pINA532(由Dr.Claude Gaillardin，InsitutNational Agronomics，Centre de biotechnologie Agro-Industrielle，laboratoire de Genetique Moleculaire et Cellularie INRA-CNRS，F-78850 Thiverval-Grignon，France惠赠，)的衍生物，用于Yarrowialipolytica中异源基因的表达(图3)。首先，将含有pINA532中ARS18序列和LEU2基因的部分消化的3598bp长的EcoRl片段亚克隆到pBluescript(Strategene，San Diego，CA)的EcoRl位点上，生成pY2。以TEF5′(SEQ ID NO：21)和TEF3′(SEQ ID NO：22)为引物，通过PCR从Yarrowia lipolytica基因组DNA中扩增获得TEF启动子(Muller S.，等，Yeasr，14：12671283(1998))。PCR扩增在50μl总体积中进行，含有：100ng Yarrowia基因组DNA，含10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH8.75)、2mM MgSO4、0.1％TritonX-100的PCR缓冲液，100μg/mL BSA(终浓度)，200μM每种脱氧核糖三磷酸核苷酸、10pmole每种引物和1μl Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene，San Diego，CA)。扩增反应如下进行：在95℃起始变性3min，然后如下进行35个循环：95℃1min，56℃30sec，72℃1min。最后进行一个10分钟的72℃延伸循环，然后于4℃终止反应。将418bp的PCR产物连接到pCR-Blunt上，生成pIP-tef。将pIP-tef的BamHI/EcoRV片段亚克隆到pY2的BamHI/Smal位点，生成pY4。
以pINA532为模板，以XPR5′(SEQ ID NO：23)和XPR3′(SEQID NO：24)为引物，通过PCR扩增获得XPR2转录终止子。PCR扩增在50μl总体积中进行，反应试剂和反应条件如上所述。将得到的179bp的PCR产物用SacII消化，然后连接到pY4的SacII位点，生成pY5。这样pY5(如图3所示)可作为Yarrowia-E.coli穿梭质粒，它包括：
1.)Yarrowia自主复制序列(ARS18)；
2.)ColE1质粒复制起始位点；
3.)氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，用于在E.coli中进行筛选；
4.)Yarrowia LEU2基因，用于在Yarrowia中进行筛选；
5.)翻译延伸启动子(TEF P)，用于在Yarrowia中异源编码区的表达；及
6.)胞外蛋白酶基因终止子(XPR2)，用于Yarrowia中异源基因表达的转录终止。
质粒pY5-13作为pY5的衍生物而构建，以利于在Yarrowialipolytica中的亚克隆和异源基因表达。
特别地，pY5-13是以pY5为模板通过6轮定点突变而获得的。用寡核苷酸YL5和YL6(SEQ ID NOs：25和26)通过定点突变将SalI和ClaI位点从pY5中删除，从而生成pY5-5。用寡核苷酸YL9和YL10(SEQID NOs：27和28)通过定点突变在pY5-5的Leu2基因和TEF启动子之间引入一个SalI位点，从而生成pY5-6。用寡核苷酸YL7和YL8(SEQ ID NOs：29和30)在pY5-6的LEU2基因和ARS18之间引入一个PacI位点，从而生成pY5-8。用寡核苷酸YL3和YL4(SEQ ID NOs：31和32)在pY5-8的TEF启动子翻译起始密码子附近引入一个NcoI位点而生成pY5-9。用寡核苷酸YL1和YL2(SEQ ID NOs：33和34)删除pY5-9的Leu2基因内部的NcoI位点，生成Y5-12。最后，用寡核苷酸YL61和YL62(SEQ ID NOs：35和36)在pY5-12的ColEl和XPR区之间引入BsiWI位点，生成pY5-13。
质粒Y5-13GPDN的构建
以寡核苷酸YL211(SEQ ID NO：38)和YL212(SEQ ID NO：39)为引物，以Yarrowia基因组DNA为模板，扩增含甘油醛-3-磷酸-去饱和酶(GPD)启动子区(″GPDPro″；参见共同待决的美国专利申请No.10/869630，此处通过参考将其内容整合在文中)的DNA片段。简言之，该启动子片段(SEQ ID NO：37)包括GPD基因-968到+3之间的核苷酸区域，其中“ATG”翻译起始密码子中“A”的位置定义为+1。
将扩增的GPDPro DNA片段用SalI完全消化，然后用NcoI进行部分消化。含GPDPro的SalI/NcoI片段通过1％(w/v)琼脂糖电泳进行纯化，并连接到SalI/NcoI消化的pY5-13载体(其中NcoI/SalI消化已将TEF启动子从pY5-13载体骨架上除去)上，从而生成pY5-13GPD。因此，pY5-13GPD含有GPDPro::XPR终止子表达盒。
将pY5-13GPD启动子片段3’端的NcoI位点转变为NotI位点，从而生成pY5-13GPDN。为了实现该目的，将GPDPro通过PCR，用GPDsense(SEQ ID NO：40)和具有NotI位点的GPDantisense(SEQ IDNO：41)引物重新进行扩增。得到的启动子片段用SalI和NotI进行消化，并克隆到pY5-13的SalI/NotI位点(从而除去TEF启动子)，生成pY5-13GPDN。
质粒pY5-20的构建
质粒pY5-20是pY5的衍生物。通过向pY5的NotI位点插入含有嵌合的潮霉素抗性基因的NotI片段来构建。嵌合基因具有在Yarrowialipolytica的TEF启动子调控下的潮霉素抗性ORF。
实施例2
Yarrowia LipolyticaΔ12去饱和酶的克隆及内源Δ12去饱和酶基因 的破坏
根据Yarrowia lipolytica(ATCC #76982)的脂肪酸组成表明该微生物可生成LA(18:2)，但不能生成ALA(18:3)，因此推测Y.lipolytica可能含有具Δ12去饱和酶活性、而不具有Δ15去饱和酶活性的基因。因此，本实施例描述了使用简并PCR引物分离Yarrowia lipolyticaΔ12去饱和酶的部分编码序列，使用部分序列破坏Yarrowia lipolytica中的天然基因，及随后全长基因的亚克隆。
用简并PCR引物通过PCR对来源于Yarrowia lipolytica的部分推 测的Δ12去饱和酶序列进行克隆
用DNeasy组织提取试剂盒(Qiagen，Catalog#69504)分离Yarrowialipolytica(ATCC #76982)中的基因组DNA，并以0.5μg/μl的DNA浓度重悬在试剂盒的缓冲液AE中。以基因组DNA为模板，用根据不同Δ12去饱和酶中保守的氨基酸序列设计的几组简并引物进行PCR扩增。最好的结果是由一组上游和下游简并引物P73和P76获得的，如下表所示。
表5
用于扩增Δ12去饱和酶部分推测序列的简并引物
Figure GSB00000439125500831
[注：缩写是标准的核苷酸和蛋白。所用的核酸的简并代码如下：R＝A/G；Y＝C/T；及N＝A/C/G/T]
根据产品说明书在Eppendorf Mastercycler梯度热循环仪上进行PCR。扩增反应如下进行：在95℃起始变性1min，然后进行30个循环：95℃变性30sec，58℃退火1min，72℃延伸1min。最后一个72℃的延伸循环进行10min，然后在4℃终止反应。
预期大小的(约740bp)PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测、分离、纯化，克隆到pTA载体(Invitrogen)中，并进行测序。根据BLAST程序分析(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.，等，J.Mol.Biol.215：403-410(1993))，得到的序列与已知的Δ12去饱和酶具有同源性。
Yarrowia lipolvticaΔ12去饱和酶基因的定点破坏
Yarrowia lipolvtica ATCC #76982Δ12去饱和酶基因的定点破坏是通过用与命名为pY23D12的定点表达盒对Δ12去饱和酶基因进行同源重组替代来进行的。pY23D12由质粒pY5-20(实施例1)衍生而来。
特别地，通过在类似线性化的pY5-20中插入Hind III/Eco RI片段可生成pY23D12。该642bp的片段包括(5′到3′方向)：从(SEQ IDNO：54的编码序列(ORF))+718到+1031位的3′同源序列，Bgl II限制性内切酶切位点及从(SEQ ID NO：54的编码序列(ORF))+403到+717位的5′同源序列。该片段分别用两组PCR引物P99和P100(SEQID NOs：46和47)，及P101和P102(SEQ ID NOs：48和49)，对642bp PCR产物的3′和5′序列进行PCR扩增而获得。
通过Bgl II限制性内切酶消化将pY23D12线性化，并根据Chen，D.C.等的方法(Appl Microbiol Biotechnol.48(2)：232-235(1997))通过醋酸锂法来转化对数中期的Y.lipolytica ATCC #76982细胞。简言之，将Y.lipolytica划线接种到YPD培养皿上，于30℃培养约18小时。将几环细胞从培养皿上刮下，并重悬到1mL转化缓冲液中，缓冲液含：
●2.25mL 50％平均分子量为3350的PEG；
●0.125mL 2M醋酸锂，pH 6.0；
●0.125mL 2M DTT；及
●50μg剪切的鲑鱼精DNA。
将约500ng质粒DNA放在100μl重悬细胞中，于39℃温育1hr，并间隔15min振荡混合一次。然后将细胞涂布在YPD潮霉素选择培养皿上，于30℃培养2到3天。
分离到4个潮霉素抗性的克隆，并通过PCR筛选定点破坏。将引物(P119[SEQ ID NO：50]和P120[SEQ ID NO：51])设计为可扩增同源重组后的特定拼接片段。另一组PCR引物(P121[SEQ ID NO：52]和P122[SEQ ID NO：53])被设计为可检测天然基因。在4个潮霉素抗性克隆中，有3个是拼接片段阳性，而天然片段阴性的，因此确定发生了定点整合。
在Δ12去饱和酶被破坏的菌株中测定脂肪酸谱
通过对其中一株命名为Q-d12D的破坏菌株中总脂类的GC分析，进一步了验证天然Δ12去饱和酶基因已被破坏。野生型(ATCC#76982)和Q-d12D的单克隆在3mL基本培养基(成分/L：20g葡萄糖，1.7g酵母氮源，1g L-脯氨酸，0.1g L-腺嘌呤，0.1g L-赖氨酸，pH 6.1)中，于30℃培养至OD600约为1.0。收获细胞，用蒸馏水进行洗涤，真空干燥，然后进行直接的酰基转移反应和GC分析(如常规方法中所述)。
野生型Yarrowia和含破坏的Δ12去饱和酶转化Q-d12D的脂肪酸谱如表6所示。脂肪酸定义为16:0(软脂酸)、16:1(棕榈油酸)、18:0、18:1(油酸)和18:2(LA)，每种酸的组成以总脂肪酸的a％表示。
表6
野生型和转化Yarrowia lipolvtica中脂肪酸的组成(％总脂肪酸)
  菌株   16:0   16:1   18:0   18:1   18:2
  野生型   11   14   2   33   34
  Q-d12D破坏型   6   15   1   74   nd
＊nd＝未检测到
结果表明在Q-d12D菌株中天然Δ12去饱和酶基因是失活的。因此，在Yarrowia lipolytica ATCC #76982中只有一个编码有功能的Δ12去饱和酶的基因。
Yarrowia lipolytica Δ12去饱和酶基因的质粒拯救
由于是通过插入含有E.coli氨苄青霉素抗性基因和E.coli ori的完整pY23D12载体而破坏了Δ12去饱和酶基因，因此可在大肠杆菌中拯救其侧翼序列。为此，用DNeasy Tissue试剂盒提取Yarrowia lipolytica菌株Q-d12D的基因组DNA。特别地，在200μl反应体积中用50μl限制性内切酶Age I、Avr II、Nhe I和Sph I消化10μg基因组DNA。消化的DNA用酚:氯仿抽提，并重悬在40μl去离子水中。消化的DNA(10μl)在含3U T4 DNA连接酶的200μl连接混合液中进行自连。连接反应于16℃进行12小时。连接的DNA用酚:氯仿抽提，并重悬在40μl去离子水中。最后，用1μl重悬的连接DNA通过电穿孔转化E.coli，并涂布在含氨苄青霉素(Ap)的LB培养皿上。分离具有Ap抗性的克隆，并通过小量制备分析质粒是否存在。在回收的或挽救的质粒中发现以下长度的插入片段(表7)：
表7
根据限制性内切酶，所回收质粒中插入片段长度
  酶   质粒插入片段长度(kB)
  AgeI   1.6
  AvrII   2.5
  NheI   9.4
  SphI   6.6
用测序引物P99(SEQ ID NO：46)和P102(SEQ ID NO：49)来开始进行质粒的测序。
根据测序结果，组装了编码Yarrowia lipolytica的Δ12去饱和酶基因的全长基因(1936bp；SEQ ID NO：54)。特别地，该序列编码一个1257个碱基的开放阅读框(SEQ ID NO：54中+283到+1539的核苷酸)，而推测的氨基酸序列长419残基(SEQ ID NO：55)。在“Yeastproject Genolevures”的公开的Y.lipolytica蛋白数据库中也发现了该基因，以YALI-CDS3053.1公开(Center for Bioinformatics，LaBRI，Talence Cedex，France)(参见Dujon，B.等，Nature 430(6995)：35-44(2004))。
实施例3
鉴定丝状真菌中的Δ15去饱和酶
本实施例描述了在多种丝状真菌中Δ15去饱和酶的鉴定。这些序列是根据其与Yarrowia lipolytica Δ12去饱和酶(实施例2)的同源性来鉴定的；而且根据系统发育分析，每个种的序列均位于两个“亚族”中的某一个内。
使用Synechochytis Δ15去饱和酶进行同源性检索
首先用Synechochytis Δ15去饱和酶蛋白序列(desB基因，GenBank登录号为D90913)作为查询序列对丝状真菌粗糙链孢霉和稻瘟病菌序列的公共数据库进行BLAST检索(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.，等，J.Mol.Biol.215：403-410(1993))。出人意料地，这些检索没有鉴定到任何同源序列。
使用Yarrowia lipolytica Δ12去饱和酶进行同源检索
然后申请人用Yarrowia lipolytica Δ12去饱和酶蛋白序列(SEQ IDNO：55)作为查询序列对相同的数据库进行BLAST检索。这些检索在每种生物中鉴定了两个同源序列。然后，以SEQ ID NO：55为查询条件，在1.)构巢曲霉和禾谷镰孢的公共数据库，及2.)串珠镰孢菌株M-8114的DuPont EST文库(E.1.duPont de Nemours and Co.，Inc.，Wilmington，DE)(串珠镰孢菌株M-8114可从Fusarium ResearchCenter，University Park，PA获得；亦可参见Plant Disease 81(2)：211-216(1997))中进行检索。这些检索也在每种生物中鉴定到两个与Yarrowia lipolytica Δ12去饱和酶蛋白同源的序列。下表总结了这些同源序列的详细信息。
表8
与Yarrowia lipolytica Δ12去饱和酶具有同源性的ORFs的描述
＊注：奇数SEQ ID NOs表示ORF核苷酸序列，而偶数SEQ ID NOs表示推断的氨基酸序列。
所有这些同源序列或者未注释，或者注释为Δ12去饱和酶或脂肪酸去饱和酶。此外，来源于禾谷镰孢的核苷酸序列是推测具有内含子序列的基因组序列；申请人通过与其它同源序列的氨基酸序列比对而对其推断的氨基酸序列进行了尝试性的组装。
用LASERGENE生物信息计算中心的Megalign程序(Windows 32Megalign 5.06 1993-2003；DNASTAR Inc.，Madison，WI)对每个种的Δ12去饱和酶同源序列的系统树分析意外地发现两个亚族。如图4所示，Nc1、Mg1、Fg1、Fm1和An1归于“亚族1”中，其蛋白与Yarrowialipolytica Δ12去饱和酶有同源性，而Fg2、Fm2、Mg2、Nc2和An2归于Yarrowia lipolytica Δ12去饱和酶蛋白同系物所在的“亚族2”中。
然后用DNASTAR软件的Megalign程序中的Clustal W方法(慢，精确；Gonnet选项；Thompson等，Nucleic Acids Res.22：4673-4680(1994))对每个与Yarrowia lipolytica Δ12去饱和酶具有同源性的蛋白进行比对。这个方法得到的同一性百分比用于检测蛋白是否是直系同源基因(图5)。具体地，该图表示：1.)归于亚族1中蛋白的同一性百分比(左上角的三角形，以黑线表示)；2.)亚族1和亚族2之间蛋白的同一性百分比(右上角的盒子，以点线表示)；及3.)归于亚族2中蛋白的同一性百分比(右下角的三角形)。因此，所有亚族1的蛋白(SEQ ID NOs：2、6、10、14和18)至少互相具有46.2％的同一性，而与亚族2中蛋白(SEQ ID NOs：4、8、12、16和20)的同一性同源性低于39.6％。此外，亚族2中蛋白间的同一性至少为56.3％。
以上分析清楚地区分了两个与Yarrowia lipolytica Δ12去饱和酶(SEQ ID NO：55)具有同源性的蛋白亚族。此外，已知诸如Y.lipolytica这样的酵母只能合成18:2(不能合成18:3)，而这5种丝状真菌中每种都能合成18:2和18:3。另外，从Yarrowia中只分离到一个单独的Δ12去饱和酶，而其它所有真菌均具有两个Yarrowia Δ12去饱和酶的同系物。因此，本发明人推测在这些生物中其中一个亚族的去饱和酶代表Δ12去饱和酶(可将油酸转化为LA(18:2))，而另一个代表Δ15去饱和酶(可将LA转化为ALA(18:3))。
最后，使用Clustal W比对算法(Megalign program of DNASTARsoftware，同上)单独对串珠镰孢Δ15去饱和酶蛋白序列与已知的大范围物种的Δ15去饱和酶蛋白进行相似性分析。本申请报道的Fm1氨基酸序列与C.Elegans，GenBank登录号为L41807的同一性为25.4％，与Synechosystis desB(Gl 1653388)相似性为33.1％，与拟南芥fad2基因的相似性为33.7％，与U.S.2003/0196217中异丝水霉去饱和酶的相似性为29.1％。
实施例4
含有亚族1(编码推测的Δ15去饱和酶)中串珠镰孢去饱和酶的表达质粒pY34(GPDPro::Fm1::XPR)的构建
本实施例描述了含实施例3所鉴定的亚族1中串珠镰孢Δ15去饱和酶(″Fm1″)的表达质粒的构建。具体地，构建一个嵌合基因，从而使推测的Δ15去饱和酶可在Yarrowia GPD启动子(″GPDPro″)调控下进行表达。通过检测所表达的ORF在野生型菌株和互补的Δ12去饱和酶被破坏的突变株(实施例2)中产生ALA的能力，从而可在Yarrowia lipolytica中测定蛋白活性。
以含有全长cDNA的cDNA克隆ffm1c.pK001.g23和ffm1c.pK013.n7为模板，以P192(SEQ ID NO：56)和P193(SEQ IDNO：57)为上下游引物，通过PCR扩增编码串珠镰孢Δ15去饱和酶的ORF。根据厂商说明书，用pfu聚合酶在Eppendorf Mastercycler梯度循环仪上进行PCR。扩增反应如下进行：95℃起始变性1min，然后进行30个循环：95℃变性30sec，58℃退火1min，72℃延伸1min。最后一个72℃延伸循环进行10min，然后于4℃终止反应。
从两个模板中均获得正确大小(约1240bp)的片段。使用QiagenDNA纯化试剂盒(Valencia，CA)从琼脂糖凝胶中纯化来源于克隆ffm1c.pK001.g23的片段，使用用Not I消化，并克隆到质粒pY5-13GPDN(实施例1)上GPDPro和XPR终止子之间的Not I位点。从而生成质粒pY34，它包含GPDPro::Fm1::XPR嵌合基因。确定了所获得的8878bp的质粒中具有Fm1 ORF序列。质粒pY34还包括E.coli复制起点、细菌氨苄青霉素抗性基因，Yarrowia Leu 2基因和Yarrowia自主复制序列(ARS)。
实施例5
含有亚族1(编码推测的Δ15去饱和酶)中串珠镰孢去饱和酶的质粒pY34(GPDPro::Fm1::XPR)在Yarrowia lipolytica的表达
本实施例描述质粒pY34(含有嵌合的GPDPro::Fm1::XPR基因，来源于实施例4)在Yarrowia lipolytica中的表达。具体地，检测了所表达的串珠镰孢ORF在野生型Y.lipolytica(确认了ORF的Δ15去饱和酶活性)和互补的Δ12去饱和酶被破坏的突变株(来源于实施例2；确认了ORF的Δ15/Δ12去饱和酶双功能活性)中转化生产ALA的能力。
使用实施例2中的转化流程将质粒pY5(单独的载体对照，来自实施例1)和pY34(GPDPro::Fm1::XPR)分别转入野生型(WT)和Δ12去饱和酶被破坏(Q-d12D)的Yarrowia lipolytica ATCC #76892菌株中。在Bio101 DOB/CSM-Leu培养皿上筛选转化细胞。
将野生型和转化细胞的单克隆于3mL基本培养基中培养，如实施例2及常规方法中所述进行收集、洗涤、干燥和分析。
野生型Yarrowia 和每个转化子的脂肪酸谱如下面表9所示。脂肪酸定义为16:0(软脂酸)、16:1(棕榈油酸)、18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)和18:3(ALA)，每种酸的组成以总脂肪酸的a％表示。根据以下公式计算“d12d ％ SC”：([18:2+18:3]/[18:1+18:2+18:3])＊100，表示底物转化为18:2的百分比。根据以下公式计算“d15d ％SC”：([18:3]/[18:2+18:3])＊100，表示底物转化为ALA的百分比。
表9
串珠镰孢Fm1作为双功能Δ12/Δ15去饱和酶的鉴定
Figure GSB00000439125500901
上述结果表明，本申请中以Fm1表示的、并鉴定为与Yarrowialipolytica Δ12去饱和酶同源的亚族1中蛋白的串珠镰孢ORF是Δ15去饱和酶。根据这个结果，本发明人预测所有亚族1中的其它成员(SEQIDNOs：6、10、14和18)也具有Δ15去饱和酶功能。
对于Fm1的Δ15去饱和酶活性，值得注意的是该蛋白在Yarrowia(31％ALA累积)中的效率比以前在其它酵母中表达的Δ15去饱和酶更高。特别地，当在非含油酵母，酿酒糖酵母(Sacchromyces cerevisiae)中表达线虫Δ15去饱和酶时，ALA的产物累积百分比仅为4.1％(Meesapyodsuk等，Biochem.39：11948-11954(2000))，而在啤酒糖酵母中表达B.napusΔ15去饱和酶时，ALA的产物累积百分比仅为1.3％(Reed.，D.W.等，Plant Physiol.122：715-720(2000))。根据本申请提供的结果，可以预测串珠镰孢Δ15去饱和酶与PUFA生物合成的其它基因(譬如，Δ6去饱和酶、碳链增长酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ12去饱和酶)将比任何先前鉴定的Δ15去饱和酶获得更高产量的ω-3 PUFAs。
此外，结果意外地表明串珠镰孢Δ15去饱和酶(Fm1)具有部分Δ12去饱和酶活性。具体地，Fm1在Δ12去饱和酶被破坏的Yarrowialipolytica菌株(即，Q-d12D+GPDPro::Fm1::XPR)由于Fm1的Δ12去饱和酶功能，可得到将油酸转化为LA的24％的底物转化率(参见“d12d ％ SC”)。由于Fm1的Δ15去饱和酶进一步提高了LA到ALA的底物转化率(96％，参见“d15d ％ SC”)。这种双功能性与其它任何已知的Δ12或Δ15去饱和酶有显著区别。对本领域的技术人员而言，很显然，在具有低Δ12去饱和酶活性(或完全缺少这种活性)的宿主生物中表达串珠镰孢Δ15去饱和酶可以获得18:3/18:2的最大比率。因此预期当PUFA生物合成的其它基因(例如Δ6去饱和酶、碳链增长酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶)在具有上述串珠镰孢Δ15去饱和酶的这类宿主生物中进行表达时，可获得增高的ω-3对ω-6脂肪酸的比例。
实施例6
亚族1(编码推测的Δ15去饱和酶)中Maananorthe grisea去饱和 酶在Yarrowia lipolytica中的表达
本实施例描述了包含推测的稻瘟病菌Δ15去饱和酶(“Mg1”)的表达质粒的构建及该质粒在Yarrowia lipolytica中的表达。通过检测所表达的ORF在野生型Yarrowia lipolytica菌株中产生ALA的产量验证Mg1是Δ15去饱和酶，通过检测所表达的ORF在Δ12去饱和酶被破坏的Yarrowia lipolytica突变株(来自实施例2)中生成ALA的产量验证其为双功能的Δ12/Δ15去饱和酶。
具体地，构建嵌合的TEF::Mg1基因，其中推测的Δ15去饱和酶在Yarrowia TEF启动子调控下进行表达(Muller S.，等，Yeast，14：12671283(1998))。首先，用与实施例2中所述Yarrowia lipolytica相似的方法分离稻瘟病菌的基因组DNA。然后，由于编码推测的Δ15去饱和酶(SEQ ID NO：9)的稻瘟病菌Mg1基因有两个内含子，因此通过首先分别PCR扩增三个外显子、然后用重叠的PCR引物进行PCR扩增，将这三个外显子连接在一起而得到全长的ORF的方式，来除去这些内含子序列。因此，使用下面表10中的上游和下游引物，将基因组DNA用作3个单独的PCR反应的模板。
表10
扩增编码Mg1的稻瘟病菌外显子的引物
  扩增的外显子   上游引物  下游引物
  Exon 1   P186(SEQ ID NO：59)  P187(SEQ ID NO：60)
  Exon 2   P188(SEQ ID NO：61)  P189(SEQ ID NO：62)
  Exon 3   P190(SEQ ID NO：63)  P191(SEQ ID NO：64)
然后，用3个胶纯化的PCR产物为模板，与上游引物P186和下游引物P191进行PCR扩增获得全长ORF。引物P186和P191含Not I位点，以利于克隆到表达载体上。特别地，将正确大小的片段进行胶纯化，用NcoI和NotI进行消化，并克隆到用NotI酶切的、在YarrowiaTEF启动子调控下的Yarrowia表达载体pY5-13(实施例1)中。获得的克隆命名为pY31。
将几个pY31克隆进行测序。预期地，所有克隆由于上游引物中的NcoI位点而在ORF的位置3处均有T到C替换，以利于克隆。这造成第二个氨基酸由Ser变为Ala。有3个质粒克隆(即，pY31质粒克隆#21、#24和#28)由SEQ ID NO：10(除了上述第二个氨基酸的变化)编码；但没有一个的核苷酸序列与SEQ ID NO：9(即，它们均具有可能由PCR错误产生的、不改变推断的氨基酸序列的额外的沉默核苷酸替换)相同。更特别地，质粒克隆#21、#24和#28有以下碱基替换：在309位的C到T替换，在390位的C的T替换，在549位的T到C替换及在567位的G到C替换。此外，克隆#24在位置645有T到A替换，克隆#21和#28在669位均有C到T替换。
根据实施例2中所述的方法将每个含TEF::Mg1嵌合基因的质粒(即，克隆#21、#24和#28)转入Yarrowia lipolytica(ATCC #76982)野生型(Q)和Δ12去饱和酶被破坏的菌株(Q-d12D)中。按常规方法所述，从每个转化中挑取3个克隆(在下表11中鉴定为“a”、“b”和“c”)，并接种到3mL DOB/CSM培养基中，于30℃培养72小时。收集培养物(1.5mL)，并进行直接酰基转换反应和GC分析(如实施例2和常规方法所述)。
野生型Yarrowia和每个转化子的脂肪酸谱如下表11所示。脂肪酸定义为16:0(软脂酸)、16:1(棕榈油酸)、18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)和18:3(ALA)，每种酸的组成以总脂肪酸(TFAs)的a％表示。根据以下公式计算“d12d ％ SC”：([18:2+18:3]/[18:1+18:2+18:3])＊100，表示底物转化为18:2的百分比。根据以下公式计算“d15d ％ SC”：([18:3]/[18:2+18:3])＊100，表示底物转化为ALA的百分比。
表11
稻瘟病菌Mg1作为双功能Δ12/Δ15去饱和酶的鉴定
Figure GSB00000439125500931
如上所示，在用TEF::Mg1嵌合基因转化的Yarrowia lipolytica野生型(Q)和Δ12去饱和酶被破坏的菌株(Q-d12D)中均可产生ALA。因此，根据这些结果，可确定Mg1是具有双功能Δ12/Δ15去饱和酶活性的去饱和酶。
实施例7
亚族1(编码推测的Δ15去饱和酶)中禾谷镰孢去饱和酶在 Yarrowia lipolytica中的表达
本实施例描述含推测的Fusarium gramine Δ15去饱和酶(“Fg1”)的表达质粒的构建及该质粒在Yarrowia lipolytica中的表达。通过检测所表达的ORF在野生型Yarrowia lipolytica菌株中产生ALA的能力验证Fg1为Δ15去饱和酶，通过检测所表达的ORF在Yarrowia lipolyticaΔ12去饱和酶被破坏的突变株(来自实施例2)中产生ALA的能力验证其为双功能的Δ12/Δ15去饱和酶。
特别地，合成嵌合的TEF::Fg1基因，其中推测的Δ15去饱和酶在Yarrowia TEF启动子调控下进行表达。与实施例6中的方法类似，编码推测的Δ15去饱和酶的禾谷镰孢Fg1基因(SEQ ID NO：17)中存在3的个内含子，在Fg1 ORF表达前通过PCR扩增除去。因此，用下面表12中所示的上游和下游引物，将禾谷镰孢基因组DNA首先用作4个单独PCR反应的模板。
表12
扩增编码Fg1的F.qraminearium外显子的引物
  扩增的外显子   上游引物   下游引物
  Exon 1   PFg1UP1(SEQ ID NO：65)   PFg1LP1(SEQ ID NO：66)
  Exon 2   PFg1UP2(SEQ ID NO：67)   PFg1LP2(SEQ ID NO：68)
  Exon 3   PFg1UP3(SEQ ID NO：69)   PFg1LP3(SEQ ID NO：70)
  Exon 4   PFg1UP4(SEQ ID NO：71)   PFg1LP4(SEQ ID NO：72)
然后，用4个胶纯化的PCR产物为模板，用上游引物PFg1UP1和下游引物PFg1LP4进行PCR，扩增全长ORF。引物PFg1UP1和PFg1LP4含有Not I位点，以利于克隆到表达载体中。将正确大小的片段进行胶纯化、用NotI消化、并克隆到NotI酶切的Yarrowia表达载体中，如实施例6中Mg1编码区所述。
用含有TEF::Fg1嵌合基因的质粒转化Yarrowia lipolytica(ATCC#76982)的野生型(Q)和Δ12去饱和酶被破坏的突变株(Q-d12D)。在基本培养基中培养野生型和转化细胞的单克隆，然后收集细胞，并进行直接的酰基转换反应和GC分析(如实施例2和常规方法所述)。
在转化TEF::Fg1嵌合基因的Yarrowia lipolytica野生型和Δ12去饱和酶被破坏的突变株中均预期地产生了ALA，从而证明Fg1是一种双功能的Δ12/Δ15去饱和酶。该预测基于Fg1蛋白序列与Fm1蛋白序列在a％同一性比较中非常相近。
实施例8
用含亚族1中串珠镰孢Δ15去饱和酶(Fm1)的嵌合基因转化 Arabidopsis植株
本实施例描述用含Fusarium Δ15去饱和酶编码区的嵌合基因转化拟南芥野生型和fad2-1突变菌株的方法。
含Fm1的拟南芥表达载体的构建
将含Fm1Δ15去饱和酶编码区(实施例4)的pY34的NotI片段克隆到大豆表达载体pKR353的NotI位点。如下面实施例18所述，pKR353在来自Kti3(kunitz胰蛋白酶抑制剂3)基因的种子特异的启动子和Kti3转录终止子的旁测含有NotI位点。
分离嵌合的Kti3启动子::Fm1::Kti3终止子基因，将其作为来自pKR353(Δ15)的Asc 1片段，克隆到双元载体pZBL11(Asc1)中唯一的Asc 1位点上。pZBL11(AscI)衍生于双元载体pZBL11，通过在T-DNA边界右边和左边间的Pac I和Asp718位点之间加入Asc I连接元件而获得。pZBL11(美国专利5,968,793；EP 1003891和WO 9859062)也在T-DNA边界内包括提供了对磺酰脲除草剂具有抗性的35S：磺酰脲抗性的乳酸盐合成酶(ALS)的转基因，可用作植株的筛选标记。pZBL11还具有E.coli和Agrobacterium tumefaciens的复制起点及氨苄青霉素抗性基因。
将获得的双元质粒pZBLI(Δ15)转入Agrobacterium菌株LBA4404。随后通过Agrobacterium浸染法，用转染的Agrobacterium转化拟南芥野生型和fad2-1突变株(Okuley，J.等，Plant Cell 6：147-158(1994))。在磺酰脲上筛选转化子，并在种子中检测ALA的产量。
用表达Δ15去饱和酶的嵌合基因所转化的野生型拟南芥比未转化的植株具有更高的ALA含量。用同样的嵌合基因转化的Fad2-1植株比未转化的突变株具有更高的ALA含量；而且转化的fad2-1植株中18:3/18:2的比例比未转化的突变株和野生型转化子的比例更高。
实施例9
用含亚族1中串珠镰孢Δ15去饱和酶(Fm1)的嵌合基因转化大 豆体细胞胚芽培养物
本实施例描述用于培养大豆、然后用含Fm1Δ15去饱和酶编码区的嵌合基因对其进行转化的方法。
含Fm1的大豆表达载体的构建
质粒pKR353(Δ15)(在实施例8中构建)还含有两个含潮霉素B磷酸转移酶基因(“hpt”；Gritz，L.and J.Davies，Gene 25：179-188(1983))的表达盒：
(1)T7启动子::hpt::T7终止子盒——该表达盒除了具有细菌复制起点(ori)外，还可在E.coli中进行筛选和复制。
(2)35S启动子::hpt::NOS 3′转录终止子盒——该表达盒可在大豆中进行筛选(35S，参见Odell等，Nature 313：810-812(1985))；NOS 3′，参见Depicker等，J.Mol.Appl.Genet.1：561：570(1982))。
大豆体细胞胚芽培养物的转化
大豆胚芽悬浮培养物(cv.Jack)于35mL液体培养基SB196(见下文)中，在摇床上以150rpm、26℃培养，其中冷白荧光的光密度为60-85E/m2/s，日/夜光周期为16:8hr。
SB 196-FN低盐液体增殖培养基(每升)：
MS FeEDTA 100×储液             10mL
MS硫酸盐100×储液               10mL
FN低盐卤化物100×储液           10mL
FN低盐P，B，Mo100×储液         10mL
B5维生素(1mL/L)                 1.0mL
2，4-D(终浓度10mg/L)            1.0mL
KNO3                            2.83g
(NH4)2SO4                       0.463g
天冬氨酸                        1.0g
蔗糖(1％)                       10g
pH 5.8
FN低盐储液        1000mL        500mL
1 MS FeEDTA 100×储液
Na2EDTA＊         3.724g        1.862g
FeSO4-7H2O        2.784g        1.392g
            ＊首先加入，于深色瓶中搅拌溶解
2 MS硫酸盐100×储液
MgSO4-7H2O        37.0g         18.5g
MnSO4-H2O         1.69g         0.845g
ZnSO4-7H2O        0.86g         0.43g
CuSO4-5H2O        0.0025g       0.00125g
3 FN低盐卤化物100×储液
CaCl2-2H2O        30.0g         15.0g
KI                0.083g        0.0715g
CoCl2-6H2O        0.0025g       0.00125g
4 低盐P，B，Mo100×储液
KH2PO4            18.5g         9.25g
H3BO3             0.62g         0.31g
Na2MoO4-2H2O      0.025g        0.0125g
每隔7-14天将约35mg组织接种到35mL新鲜液体培养基SB196中，进行亚培养(优选的亚培养间隔是每隔7天进行一次)。
用pKR353(Δ15)(同上)通过粒子枪轰击法(Klein等，Nature，327：70(1987))转化大豆胚芽悬浮培养物。用DuPont BiolisticPDS1000/HE设备(helium retrofit)进行所有转化(E.I.duPont deNemours and Co.，Inc.，Wilmington，DE)。
大豆胚芽悬浮培养的起始
在每个月起始两次大豆培养，每次起始之间隔5-7天。
在种植后45-55天间，摘取可获得的大豆植株上具有未成熟种子的豆荚，并从壳中除去种子，放入灭菌的品红盒中。在以下溶液中将大豆种子振荡15分钟，进行灭菌：95mL高压灭菌蒸馏水加5mL次氯酸钠及1滴肥皂。用2个有灭菌蒸馏水的1L瓶洗涤种子，将那些小于4mm的种子放在单独的显微镜玻片上。切除种子的小末端，并将子叶压到众种皮外。将子叶(每板25-30)转移到含SB1培养基的培养皿中。
SB1固体培养基(每升)：
1包MS盐(Gibco/BRL，Catalog #11117-066)
1mL B5维生素储液(见下文)
31.5g蔗糖
2mL 2，4-D(终浓度20mg/L；2，4-D储液从Phytotech，Catalog #D295以1mg/mL预制)
pH至5.7
8g TC琼脂
B5维生素储液(每100mL)：
10g肌糖
100mg烟酸
100mg维生素B6HCl
1g硫胺
＊注：等分后储存在-20℃；如果溶液不能快速溶解，则用热传播板进行低水平加热。
含子叶的培养皿用纤维带包装，并储存8周。之后，切除次级胚，并在SB196液体培养基中放置7天。
轰击用的DNA的制备
用完整的质粒或含感兴趣的基因和选择性标记基因的质粒片段进行轰击。通过胶分离双消化的质粒而获得片段。在每种情况下，在0.5mL合适的酶混合物中消化100pg质粒DNA。得到的DNA片段通过1％SeaPlaque GTG琼脂糖(BioWhittaker Molecular Applications，Rockland，ME)凝胶电泳进行分离，从琼脂糖胶中切割含嵌合基因的DNA片段。根据厂商的说明书，用GELase消化酶(EpiCentre，Madison，WI)从琼脂糖中纯化DNA。
将50μl含3mg金颗粒(3mg金)的等份的灭菌蒸馏水加到5μl1pg/pl DNA溶液(如上述制备的完整质粒或DNA片段)、50μl 2.5MCaCl2和20μl 0.1M亚精胺中。将混合物在旋涡振荡器的3档振荡3min，然后在工作台微型离心机中离心10sec。沉淀用400μl 100％乙醇洗涤后，通过超声重悬到40μl 100％乙醇中。将5μl DNA悬浮液分散到Biolistic PDS1000/HE仪器碟的每个飞碟中。在每个轰击(即每个碟)中，每5pl等份含约0.375mg金。
组织制备及DNA轰击
将约150-200mg 7天的胚芽悬浮培养物置于空的、灭菌的60×15mm培养皿中，并用塑料网覆盖盘子。用设置在1100PSI的膜破裂压力及抽真空至27-28英寸汞柱的枪膛对每个培养皿的组织进行1或2次轰击。将组织放在距保留/停止屏约3.5英寸的地方。
转化胚芽的筛选
用潮霉素(当潮霉素磷酸转移酶HPT的基因被用作选择标记时)或氯磺隆(当乙酰乳酸合成酶ALS的基因被用作选择标记时)筛选转化的胚芽。在每种情况下，将组织置于新鲜的SB196培养基中，并在轰击后如上所述进行培养。轰击6天后，用新鲜的含选择试剂30mg/L潮霉素或100ng/mL氯磺隆(氯磺隆储液：1mg/mL溶于0.01N氢氧化铵中)的SB196代替原来的SB196。选择培养基每周进行更新。在选择4到6周后，可观察到绿色的转化的组织从未转化的坏死的胚芽簇中生长出来。将分离的、绿色的组织移出并接种到含SB196的多孔培养皿中，使其产生新的、克隆繁殖的、转化的胚芽悬浮培养物。
大豆体细胞胚芽到植株的重建
为了从胚芽悬浮培养物获得整个植株，必须进行组织重建。
胚芽的成熟：将胚芽在SB196中，于26℃、在冷白荧光(PhillipsCool White Econowatt F40/CW/RS/EW)和Agro(Phillips F40 Agro；40watt)灯泡的光密度为90120μE/m2/s、日/夜光周期为16:8hr的条件下培养4-6周。之后，将胚芽簇转移到SB166固体琼脂培养基中培养1-2周。
SB 166固体培养基(每升)：
1包MS盐(Gibco/BRL，Cat#11117-066)
1mL B5维生素1000×储液
60g麦芽糖
750mg六水合MgCl2
5g活性炭
pH 5.7
2g脱乙酰吉兰糖胶
然后将胚芽簇在SB103培养基(除了不包括活性炭外，培养基的制备与SB 166相同)中亚培养3周。在该时期，可从胚芽簇中除去单个的胚芽，并筛选其脂肪酸组成的变化。应注意的是，任何由于感兴趣的基因的表达而造成的可检测的表型均可在该阶段被检出。这包括，但不限定于：脂肪酸谱、蛋白谱及含量、碳水化合物含量、生长速率、发育为正常大豆植株的存活率或能力等变化。
胚芽的干燥和萌发：将成熟的单个胚芽放置在空的小培养皿(35×10mm)中约4-7天以进行干燥。培养皿用纤维带封口(以创造一个小的湿润的小室)。将干燥的胚芽种植在SB71-4培养基中，使其在如上所述相同的培养条件下萌发。
SB 71-4固体培养基(每升)：
1瓶Gamborg B5盐w/蔗糖(Gibco/BRL，Catalog#21153-036)
pH 5.7
5g TC琼脂
将萌发的小植株从萌发培养基中移出，并用水充分漂洗，然后种植在24个单元的Redi-Earth包装碟中，并用干净的塑料顶覆盖。两周后，除去塑料顶，再用一周使植株变硬。如果小植株看起来足够硬，则将它们移植到10″Redi-Earth罐中，每罐最多放3棵苗。10-16周后，收获成熟的种子，压碎，分析其脂肪酸。
实施例10
含亚族1中串珠镰孢Δ15去饱和酶(Fm1)的大豆体细胞胚芽的 分析
本实施例描述在具有包含Fm1Δ15去饱和酶编码区的嵌合基因的转化大豆中用于分析脂肪酸含量的方法。
理论
成熟的体细胞大豆胚芽是合子胚很好的模型。在液体培养基的球状胚芽状态时，体细胞大豆胚芽含很低量的、在大豆合子胚中却典型的三酰基甘油或成熟的贮存蛋白质。在该发育阶段，总三酰基甘油对总极性脂类(磷酸脂和甘油脂)的比例约为1∶4，与典型的大豆合子胚在体细胞胚芽培养起始的发育阶段一样。在胚的球形期阶段，主要的种子蛋白、β-伴大豆球蛋白α-亚基、kunitz胰岛素抑制物3及种子凝集素的mRNAs基本不存在。在转移到无激素的培养基中使其分化为成熟的体细胞胚芽状态时，三酰基甘油成为最多的脂类成分，而β-伴大豆球蛋白α-亚基、kunitz胰岛素抑制物3及种子凝集素的mRNAs在总mRNA中的含量非常丰富。基于此，体细胞大豆胚芽系统与成熟的大豆合子胚在体内的行为非常相似，因此是分析脂肪酸生物合成途径中基因表达改变对表型有何影响的很好的、而且快速的模型。最重要地，该模式系统也可预测来源于转基因胚芽的植株种子中脂肪酸的组成。
脂肪酸分析
将对转基因体细胞大豆胚芽进行分析。为此，通过酰基转换反应从单个成熟的体细胞大豆胚芽中制备脂肪酸的甲基酯。将胚芽放在含50pL氢氧化三甲基巯(TMSH)和0.5mL己烷的小瓶中，室温温育30min，并进行振荡。然后分离脂肪酸甲基酯(从己烷层抽取5μL)，并用填充了Omegawax 320融合硅毛细管柱(Supelco Inc.，Bellefonte，PA；Catalog #24152)的Hewlett-Packard 6890气相色谱仪进行定量。一部分体细胞胚芽比对照体细胞胚芽具有更高水平的ALA。
从转化的胚芽进行成熟植株的重建，并对重建植株产生的种子进行脂肪酸分析。然后将这些植株与其他表达ω-3脂肪酸生物合成途径基因的转基因植株(其中EPA和DPA的组合水平经常高于总量的15％，甚至高达23.5％)进行杂交。优选的生产长链PUFAs(譬如，EPA)的代表性基因包括以下一个或多个：
表13
EPA生物合成途径的基因
  基因   生物   质粒名称   参考文献
  Δ6desaturase   S.diclina   pRSP1   WO 02/081668
  Δ6desaturase   M.alpina   pCGR5   U.S.5,968,809
  Elongase   M.alpina   pRPB2   WO 00/12720
  Elongase   T.aureum   pRAT-4-A7   WO 02/08401
  Δ5desaturase   M.alpina   pCGR4   U.S.6,075,183
  Δ5desaturase   S.diclina   pRSP3   WO 02/081668
  Δ4desaturase   S.aggregatum   pRSA1   WO 02/090493
实施例11
将Fusarium Δ15去饱和酶克隆到大豆表达载体(pKR578)中
本实施例描述在大豆中构建可种子特异性高表达Δ15去饱和酶的载体pKR578。
质粒pKS121(WO 02/00904)在Kunitz大豆胰岛素抑制剂(KTi)启动子[Jofuku等，(1989)Plant Cell 1：1079-1093]和KTi 3′终止子区侧翼含有NotI位点，其分离在美国专利6,372,965(KTi/NotI/KTi3′盒)中有所描述。载体pKR457是pKS121的衍生物，其中Kti/NotI/Kti3′盒上游和下游的限制性位点已通过多个亚克隆步骤进行了修改。载体pKR457也在Kti终止子下游包含大豆白蛋白转录终止子，以延长并加强转录的终止。在pKR457中，除去了KS121中Kti启动子上游的BamHI位点，并引入一个含BsiWI、SalI、SbfI和HindIII位点的新序列(SEQ ID NO：73)，使BsiWI位点邻近Kti启动子的5’端。此外，除去了pKS121中Kti终止子下游的salI位点，并引入一个含XbaI(邻近Kti终止子3’端)、BamHI位点、大豆白蛋白转录终止子序列、BsiWI位点及另外一个BamHI位点(Kti/NotI/KtiSalb盒)的新序列(SEQ IDNO：74)。白蛋白转录终止子是以前用在终止子3’端引入BamHI、XbaI和BsiWI位点的引物oSalb-12(SEQID NO：75)、和在终止子5’端引入BamHI位点的的引物oSalb-13(SEQ ID NO：76)从大豆基因组DNA中扩增得到的。
起始的质粒pKS123(WO 02/08269，其内容通过参考整合在本申请中)含潮霉素B磷酸转移酶基因(HPT)[Gritz，L.and Davies，J.(1983)Gene 25：179-188]，其侧翼为T7启动子和转录终止子(T7prom/hpt/T7term盒)，以及用来在诸如E.coli这样的细菌中筛选和复制的细菌复制起点(ori)。此外，pKS123也包括潮霉素B磷酸转移酶基因，其侧翼为35S启动子[Odell等，(1985)Nature 313：810-812]和NOS 3′转录终止子[Depicker等，(1982)J.Mol.Appl.Genet.1：561：570](35S/hpt/NOS3′盒)，用来在诸如大豆这样的植物中进行筛选。pKS123还包含NotI限制性位点，其侧翼为β-伴大豆球蛋白α-亚基的启动子[Beachy等，(1985)EMBO J.4：3047-3053]和菜豆蛋白基因的3′转录终止区[Doyle，J.J.等(1986)J.Biol.Chem.261：9228-9238]，从而允许克隆到NotI位点的基因在大豆种子中进行很强的组织特异性表达。载体pKR72是pKS123的衍生物，其中含β-伴大豆球蛋白/NotI/菜豆蛋白盒的HindIII片段是反向的，而含SbfI、FseI和BsiWI限制酶切位点的序列(SEQ ID NO：77)被引入到β-伴大豆球蛋白启动子前面的HindIII和BamHI位点之间。用HindIII消化载体pKR72，除去βcon/NotI/Phas 3′盒，从而得到pKR325。
通过克隆pKR457的BsiWI片段而形成一个中间克隆载体，它含有插入pKR325中BsiWI位点的Kti/NotI/KtiSalb盒。然后将pY34(参见实施例4)中含Fusarium Δ15去饱和酶的NotI片段克隆到该中间载体的NotI位点，得到pKR578。质粒pKR578(SEQ ID NO：78)如图6所示。质粒pKR578已提交美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，其ATCC保藏号为PTA-XXXX，保藏日为2004年11月4日。
实施例12
大豆种子特异的启动子的分离
大豆种子特异的启动子的克隆已在WO 04/071467中进行描述，并在此重新进行描述。
使用Universal GenomeWalker系统(Clontech)根据其使用手册(PT3042-1)对大豆膜联蛋白和BD30启动子(在WO 04/071178中描述，于2004年8月26日公开)进行分离。为了构建大豆基因组步行文库，将大豆基因组DNA样品用DraI、EcoRV、PvuII和StuI分别消化2小时。DNA纯化后，将消化的基因组DNA与基因组步行接头AP1和AP2连接。
基于DuPont EST数据库中膜联蛋白cDNA 5′编码序列设计大豆膜联蛋白基因的两个基因特异引物(GSP1和GSP2)。GSP1和GSP2的序列在SEQ ID NOS：79和80中列出。
在第一轮PCR中使用AP1和GSP1引物及基因组步行系统手册中定义的条件。循环条件为94℃4分钟；94℃2秒及72℃3分钟，7个循环；94℃2秒及67℃3分钟，32个循环；67℃4分钟。将第一轮PCR的产物稀释50倍。以1微升稀释产物为模板，用AP2和GSP2为引物进行第二轮PCR。循环条件是94℃4分钟；94℃2秒及72℃3分钟，5个循环；94℃2秒及67℃3分钟，20个循环；67℃3分钟。从EcoRV消化的基因组步行文库中扩增并分离出一个2.1kb的基因组片段。用BamHI和SalI消化基因组片段，并克隆到Bluescript KS+载体上进行测序。该2012bp长的大豆膜联蛋白启动子片段的DNA序列在SEQ ID NO：81中列出。
基于NCBI GenBank中BD30 cDNA的5’编码序列(J05560)设计了大豆BD30的两个基因特异引物(GSP3和GSP4)。GSP3和GSP4引物的寡核苷酸序列在SEQ ID NOS：82和83中列出。
以基因组步行系统手册中阐述的相同条件，用AP1个GSP3引物进行第一轮PCR。在基因组步行实验中，大豆膜联蛋白启动子的循环条件对大豆BD30启动子来说并不好用。因此使用了修改后的降落PCR程序。循环条件是：94℃4分钟；94℃2秒，74℃3分钟，6个循环，其中退火温度在每个循环中降低1℃；94℃2秒，69℃3分钟，32个循环；69℃4分钟。将第一轮PCR产物稀释50倍。以1微升稀释的产物为模板，以AP2和GSP4为引物进行第二轮PCR。循环条件是：94℃4分钟；94℃2秒，74℃3分钟，6个循环，其中退火温度在每个循环中降低1℃；94℃2秒，69℃3分钟，20个循环；69℃3分钟。从PvuII消化基因组步行文库中扩增并分离到一个1.5kb的基因组片段。用BamHI和SalI消化基因组片段，并克隆到Bluescript KS+载体中进行测序。DNA测序表明该基因组片段包含1408bp大豆BD30启动子序列(SEQ ID NO：84)。
基于NCBI数据库中大豆β-伴大豆球蛋白β-亚基启动子序列(S44893)设计了两个在5’端具有BamHI或NotI位点的寡核苷酸，用来扩增大豆β-伴大豆球蛋白α-亚基启动子(SEQ ID NO：85)。这两个寡核苷酸的序列在SEQ ID NOS：86和87中列出。
基于NCBI GenBank数据库中大豆球蛋白Gy1启动子序列(X15121)设计了两个在5’端具有BamHI或NotI位点的寡核苷酸，用来扩增大豆球蛋白Gy1启动子(SEQ ID NO：88)。这两个寡核苷酸序列在SEQ ID NOS：89和90中列出。
实施例13
将Fusarium Δ15去饱和酶克隆到大豆表达载体中，与Δ17去饱和 酶共表达(pKR585)
本实施例描述在大豆中，构建可种子特异性高表达Fusarium Δ15去饱和酶和异丝水霉Δ17去饱和酶的载体pKR585。含有大豆膜联蛋白启动子调控下的异丝水霉Δ17去饱和酶[Pereira等(2004)Biochem.J.378，665-671]的中间克隆载体(pKR271)的构建在WO 04/071467已有描述，并在此重新进行描述。
KTi/NotI/KTi3′盒是使用被设计为在该盒的两端引入XbaI和BsiWI位点的引物oKTi5(SEQ ID NO：91)和oKTi6(SEQ ID NO：92)、从pKS121中通过PCR扩增获得的。将得到的PCR片段亚克隆到克隆载体pUC19的XbaI位点上，得到质粒pKR124，这样，在Kti转录终止子的3’端引入了PstI和SbfI位点。
将含大豆BD30启动子(WO 01/68887)的pJS93的SalI片段与pUC19的SalI片段连接在一起，得到pKR227，从而在BD30启动子的5’端引入了PstI和SbfI位点。
使用被设计为在终止子5’端引入NotI位点的引物oSBD30-1(SEQID NO：93)和被设计为在终止子3’端引入BsiWI位点的引物oSBD30-2(SEQ ID NO：94)从大豆基因组DNA中进行PCR，扩增BD30 3′转录终止子。
根据厂商说明书，将得到的PCR片段亚克隆到中间克隆载体pCR-Script AMP SK(+)(Stratagene)中，获得质粒pKR251r。将含BD30 3′转录终止子的pKR251r的EcoRI/NotI片段克隆到中间克隆载体pKR227的EcoRI/NotI位点上，得到pKR256。
通过BamHI检消化获得来自pJS92的膜联蛋白启动子(SEQ IDNO：81)，并将其末端补齐。将得到的片段连接到补齐的来自pKR124载体骨架的BsiWI片段上，其方向是在膜联蛋白启动子5’端引入PstI和SbfI位点，从而得到pKR265。通过SbfI和NotI消化pKR265得到膜联蛋白启动子，并克隆到含有BD30 3′转录终止子、氨苄青霉素抗性基因及细菌ori区的pKR256的SbfI/NotI片段中，从而得到pKR268。
通过用NotI部分消化pKS203[Pereira等(2004)Biochem.J.378，665-671]，获得异丝水霉Δ17去饱和酶基因，将其克隆到pKR268的NotI位点，得到pKR271。
然后用PstI消化pKR271，将含异丝水霉Δ17去饱和酶的片段克隆到pKR578的SbfI位点，得到pKR585。在这种情况下，Fusarium Δ15去饱和酶可与异丝水霉Δ17去饱和酶在强的，种子特异的启动子下共表达。pKR585(SEQ ID NO：95)的图谱如图7所示。质粒pKR585已提交美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，ATCC登录号为PTA-XXXX，提交日期是2004年11月4日。
实施例14
组装EPA生物合成途径的基因，使其在大豆中表达(pKR274)
本实施例描述pKR274的构建，该载体被设计为在大豆体细胞胚芽和大豆种子中可种子特异性高表达高山被孢霉菌Δ6去饱和酶(美国专利5,968,809)、高山被孢霉菌碳链增长酶(WO 00/12720)和高山被孢霉菌Δ5去饱和酶(美国专利6,075,183)。该载体的构建以前在WO 04/071467中有所描述，此处重新进行描述。
将Δ6去饱和酶克隆在β-伴大豆球蛋白α-亚基启动子[Beachy等，(1985)EMBO J.4：3047-3053]的后面，之后为菜豆球蛋白基因[Doyle，J.J.等(1986)J.BioL Chem.261：9228-9238]3′转录终止区(βcon/Mad6/Phas3′盒)。
将Δ5去饱和酶克隆在Kunitz大豆胰岛素抑制剂(KTi)启动子[Jofuku等，(1989)Plant Cell 1：1079-1093]的后面，之后为KTi 3′终止区，其分离在美国专利6,372,965(KTi/Mad5/KTi3′盒)中有所描述。
将碳链增长酶克隆在大豆球蛋白Gy1启动子(SEQ ID NO：88)后面，之后为豌豆球蛋白A2 3′终止区(Gy1/Maelo/legA2盒)。
所有这些启动子在大豆种子中均表现出很强的组织特异性表达活性。质粒pKR274还包括克隆在T7 RNA聚合酶启动子和T7终止子之间的潮霉素B磷酸转移酶基因[Gritz，L.and Davies，J.(1983)Gene 25：179-188](T7prom/HPT/T7term盒)，可在特定的E.coli菌株——例如NovaBlue(DE3)(Novagen，Madison，WI)，该菌对于λDE3是溶原的(并携带在lacUV5调控下的T7 RNA聚合酶基因)——中根据潮霉素B对质粒进行选择。此外，质粒pKR274含有来自载体pSP72(Stratagene)的、在E.coli中具有功能的细菌复制起点(ori)。
使用引物oCGR5-1(SEQ ID NO：96)和oCGR5-2(SEQ ID NO：97)对pCGR5(美国专利5,968,809)进行PCR，扩增高山被孢霉菌Δ6去饱和酶基因，引物被设计为在Δ6去饱和酶两端引入NotI限制性内切酶位点，并在酶的阅读框的起始密码子处引入NcoI位点。
根据厂商说明书，将得到的PCR片段亚克隆到中间克隆载体pCR-Script AMP SK(+)(Stratagene)中，获得pKR159。
将包含高山被孢霉菌Δ6去饱和酶基因的pKR159的NotI片段以正向克隆到pZBL117的NotI位点，制备植物表达盒pZBL119。
将包含T7prom/hpt/T7term盒和细菌ori的质粒pKS102(WO02/00904)的AscI片段与包含βcon/NotI/Phas盒的质粒pKR72的AscI片段连接在一起，构建载体pKR197。
用NotI消化质粒pKR159，得到高山被孢霉菌Δ6去饱和酶，然后将其克隆到大豆表达载体pKR197的NotI位点，得到pKR269。
使用被设计为在启动子5′端引入SbfI/PstI位点的引物oSGly-1(SEQ ID NO：98)和被设计为在启动子3′端引入NotI位点的引物oSGly-2(SEQ ID NO：99)从pZBL119中扩增大豆球蛋白Gy1启动子。
根据厂商说明书，将得到的PCR片段亚克隆到中间克隆载体pCR-Script AMP SK(+)(Stratagene)中，获得质粒pSGly12。
使用被设计为在启动子5′端引入XbaI和BsiWI位点的引物LegPro5′(SEQ ID NO：100)和被设计为在启动子3′端引入NotI位点的引物LegPro3′(SEQ ID NO：101)从豌豆基因组DNA中扩增legA2启动子。
使用被设计为在终止子5′端引入NotI位点的引物LegTerm5′(SEQID NO：102)和被设计为在终止子3′端引入BsiWI和XbaI位点的引物LegTerm3′(SEQ ID NO：103)从豌豆基因组DNA中扩增legA2转录终止子。
然后将得到的PCR片段用引物LegPro5′和LegTerm3′进行连接并重新扩增，从而形成legA2/NotI/legA23′盒。根据厂商说明书，将legA2/NotI/legA23′盒PCR片段亚克隆到中间克隆载体pCR-ScriptAMP SK(+)(Stratagene)上，得到质粒pKR140。质粒pKR142是通过将包含legA2/NotI/legA23′盒的pKR140的BsiWI片段克隆到含细菌ori和氨苄青霉素抗性基因的pKR124的BsiWI位点上而构建的。然后将来自质粒pKR142的PstI/NotI片段与含大豆球蛋白Gy1启动子的质粒pSGly12的PstI/NotI片段连接在一起，得到pKR263。
使用被设计为在去饱和酶两端引入NotI限制性内切酶位点的引物CGR4foward(SEQ ID NO：104)和CGR4reverse(SEQ ID NO：105)从pCGR4(美国专利6,075,183)中扩增高山被孢霉菌Δ5去饱和酶基因。
将得到的PCR片段用NotI消化，并克隆到载体pKR124的NotI位点上，得到pKR136。
使用被设计为在碳链增长酶两端引入NotI限制性内切酶位点的引物RPB2foward(SEQ ID NO：106)和RPB2reverse(SEQ ID NO：107)从pRPB2(WO 00/12720)中扩增高山被孢菌碳链增长酶基因。将得到PCR片段用NotI消化，并克隆到载体pKR263的NotI位点，获得pKR270。
用BsiWI和SbfI消化质粒pKR270，得到Gy1/Maelo/legA2盒，并将其克隆到含Δ6去饱和酶、T7prom/hpt/T7term盒和细菌ori区的质粒pKR269的BsiWI/SbfI位点上。该质粒命名为质粒pKR272。
然后将通过用BsiWI消化pKR136而得到的KTi/Mad5/KTi3′盒克隆到pKR272的BsiWI位点上，得到pKR274(图8)。
实施例15
组装EPA生物合成途径基因，使其在大豆中表达(pKKE2)
本实施例描述pKKE2的构建，该质粒是一个被设计为在大豆体细胞胚芽和大豆种子中可种子特异性高表达异丝水霉Δ6去饱和酶(WO02/081668)、高山被孢霉菌碳链增长酶(WO 00/12720)和高山被孢霉菌Δ5去饱和酶(美国专利6,075,183)的载体。除了用高山被孢霉菌Δ6去饱和酶代替异丝水霉Δ6去饱和酶外，该载体与pKR274相同。该载体的构建以前在WO 04/071467中已有所描述，此处重新进行描述。
通过用EcoRI和HindIII消化pRSP1(WO 02/081668)而得到S.diclina Δ6去饱和酶基因。将得到的DNA片段末端补齐，并将该片段克隆到补齐的pKS123的NotI位点上，得到pKS208。
通过HindIII消化质粒pKS208而得到βcon/Sdd6/Phas3′盒，并克隆到质粒pKR272的HindIII位点上，获得pKR301。
然后将通过BsiWI消化pKR136而得到的KTi/Mad5/KTi3′盒克隆到pKR301的BsiWI位点，获得pKKE2(图9)。
实施例16
大豆体细胞胚芽培养物的转化
培养条件
大豆胚芽悬浮培养物(cv.Jack)于35ml液体培养基SB196(参见下文配方)中，在摇床上以150rpm、26℃培养，其中冷白荧光的光密度为60-85E/m2/s，日/夜光周期为16:8hr。每隔7天或两周，将约35mg组织接种到35ml新鲜液体SB196中对培养物进行亚培养(优选的亚培养间隔是每隔7天)。
根据粒子枪轰击法(Klein等1987；Nature，327：70)，将大豆胚芽悬浮培养物用实施例18中所述的pKR353(Δ15)质粒进行转化。在所有转化实验中均使用DuPont Biolistic PDS1000/HE仪器(heliumretrofit)。
大豆胚芽悬浮培养的起始
大豆培养每月起始两次，每次起始间隔5-7天。
在种植45-55天后，从可获得的大豆植株上摘取具有未成熟种子的豆荚，从壳中除去种子，并置于灭菌的品红盒中。将大豆种子在加入了1滴象牙皂的5％次氯酸钠溶液(95ml高压灭菌蒸馏水加入5ml次氯酸钠和1滴肥皂)中，振荡灭菌15分钟。混匀。用2个装灭菌蒸馏水的1升瓶子洗涤种子，将那些小于4mm的种子分别置于单独的显微镜玻片上。切开种子的小末端，将子叶从种壳中挤压出来。将子叶转移到含SB1培养基的培养皿上(每培养皿25-30个子叶)。将培养皿用纤维带包起来，储存8周。之后，切除次级胚芽，并将其置于SB196液体培养基中放置7天。
轰击用DNA的制备
用含感兴趣的基因和选择性标记基因的完整质粒或DNA质粒片段进行轰击。通过双消化质粒的胶分离获得这些片段。在每种情况下，均在0.5ml合适的酶混合液中消化100μg质粒DNA。将得到的DNA片段通过1％ SeaPlaque GTG琼脂糖(BioWhitaker MolecularApplications)凝胶电泳进行分离，从琼脂糖胶中切下含嵌合基因的DNA片段。根据厂商说明书，用GELase消化酶从琼脂糖中纯化DNA。
将50μl含3mg金颗粒(3mg金)的等份的灭菌蒸馏水加到5μl1pg/pl DNA溶液(如上述制备的完整质粒或DNA片段)、50μl 2.5MCaCl2和20μl 0.1M亚精胺中。将混合物在旋涡振荡器的3档振荡3min，然后在工作台微型离心机中离心10sec。沉淀用400μl 100％乙醇洗涤后，通过超声重悬到40μl 100％乙醇中。将5μl DNA悬浮液分散到Biolistic PDS1000/HE仪器碟的每个飞碟中。在每个轰击(即每个碟)中，每5pl等份含约0.375mg金。
组织制备及DNA轰击
将约150-200mg 7天的胚芽悬浮培养物置于空的、灭菌的60×15mm培养皿中，并用塑料网覆盖盘子。用设置在1100PSI的膜破裂压力及抽真空至27-28英寸汞柱的枪膛对每个培养皿的组织进行1或2次轰击。将组织放在距保留/停止屏约3.5英寸的地方。
转化胚芽的筛选
用潮霉素(当潮霉素磷酸转移酶——HPT的基因被用作选择标记时)或氯磺隆(当乙酰乳酸合成酶——ALS的基因被用作选择标记时)筛选转化的胚芽。
潮霉素(HPT)筛选
轰击后，将组织置于新鲜的SB196培养基中，并如上述进行培养。轰击6天后，用新鲜的含选择试剂30mg/L潮霉素的SB196代替原来的SB196。选择培养基每周进行更新。在选择4到6周后，可观察到绿色的转化的组织从未转化的坏死的胚芽簇中生长出来。将分离的、绿色的组织移出并接种到含SB196的多孔培养皿中，使其产生新的、克隆繁殖的、转化的胚芽悬浮培养物。
氯磺隆(ALS)筛选
轰击后，将组织分到2个烧瓶中，并如上述进行培养。轰击6到7天后，用新鲜的含选择试剂0.1mg/L氯磺隆的SB196代替原来的SB196。选择培养基每周进行更新。在选择4到6周后，可观察到绿色的转化的组织从未转化的坏死的胚芽簇中生长出来。将分离的、绿色的组织移出并接种到含SB196的多孔培养皿中，使其产生新的、克隆繁殖的、转化的胚芽悬浮培养物。
大豆体细胞胚芽到植株的重建
为了从胚芽悬浮培养物获得整个植株，必须进行组织重建。
胚芽的成熟
将胚芽在SB196中，于26℃、在冷白荧光(Phillips Cool WhiteEconowatt F40/CW/RS/EW)和Agro(Phillips F40 Agro；40 watt)灯泡的光密度为90120μE/m2/s、日/夜光周期为16:8hr的条件下培养4-6周。之后，将胚芽簇转移到SB166固体琼脂培养基中培养1-2周。然后将胚芽簇在SB103培养基中亚培养3周。在该时期，可从胚芽簇中除去单个的胚芽，并筛选其脂肪酸组成的变化。应注意的是，任何由于感兴趣的基因表达而造成的可检测的表型均可在该阶段被检出。这包括但不限定于：脂肪酸谱、蛋白谱及含量、碳水化合物含量、生长速率、发育为正常大豆植株的存活率或能力等变化。
胚芽的干燥和萌发
将成熟的单个胚芽放置在空的小培养皿(35×10mm)中约4-7天以进行干燥。培养皿用纤维带封口(以创造一个小的湿润的小室)。将干燥的胚芽种植在SB71-4培养基中，使其在如上所述相同的培养条件下萌发。将萌发的小植株从萌发培养基中移出，并用水充分漂洗，然后种植在24个单元的Redi-Earth包装碟中，并用干净的塑料顶覆盖。两周后，除去塑料顶，再用一周使植株变硬。如果小植株看起来足够硬，则将它们移植到10″Redi-Earth罐中，每罐最多放3棵苗。10-16周后，收获成熟的种子，压碎，分析其脂肪酸。
培养基配方
SB 196-FN低盐液体增殖培养基(每升)-
MS FeEDTA-100×储液1         10ml
MS Sulfate-100×储液2        10ml
FN低盐Halides-100×储液3     10ml
FN低盐P，B，Mo-100×储液4            10ml
B5维生素(1ml/L)                      1.0ml
2，4-D(终浓度10mg/L)                 1.0ml
KNO3                                 2.83gm
(NH4)2SO4                            0.463gm
天冬氨酸                             1.0gm
蔗糖(1％)                            10gm
pH 5.8
FN低盐储液
储液#            1000mL     500mL
1 MS FeEDTA 100×储液
Na2EDTA＊        3.724g     1.862g
FeSO4-7H2O       2.784g     1.392g
                ＊首先加入，于深色瓶中搅拌溶解
2 MS硫酸盐100×储液
MgSO4-7H2O       37.0g      18.5g
MnSO4-H2O        1.69g      0.845g
ZnSO4-7H2O       0.86g      0.43g
CuSO4-5H2O       0.0025g    0.00125g
3 FN低盐卤化物100×储液
CaCl2-2H2O       30.0g      15.0g
KI               0.083g     0.0715g
CoCl2-6H2O       0.0025g    0.00125g
4 低盐P，B，Mo100×储液
KH2PO4           18.5g      9.25g
H3BO3            0.62g      0.31g
Na2MoO4-2H2O     0.025g     0.0125g
SB1固体培养基(每升)-
1pkg.MS盐(Gibco/BRL，Catalog #11117-066)
1ml B5维生素1000×储液
31.5g蔗糖
2mL 2，4-D(终浓度20mg/L)
pH 5.7
8g TC琼脂
SB 166固体培养基(每升)-
1pkg.MS盐(Gibco/BRL，Cat#11117-066)
1ml B5维生素1000×储液
60g麦芽糖
750mg六水合MgCl2
5g活性炭
pH 5.7
2g脱乙酰吉兰糖胶
SB 103固体培养基(每升)-
1pkg.MS盐(Gibco/BRL，Cat#11117-066)
1ml B5维生素1000×储液
60g麦芽糖
750mg六水合MgCl2
pH 5.7
2g脱乙酰吉兰糖胶
SB 71-4固体培养基(每升)-
1瓶Gamborg B5盐w/蔗糖(Gibco/BRL，Catalog#21153-036)
pH 5.7
5g TC琼脂
2.4-D储液
-由Phytotech cat#D 295预制获得，浓度为1mg/ml
B5维生素储液(每100mL)-等分后储存在-20℃
10g肌糖
100mg烟酸
100mg维生素B6HCl
1g硫胺
如果溶液不能快速溶解，则用热传播板进行低水平加热。
氯磺隆储液
-以1mg/ml溶于0.01N氢氧化铵中
实施例17
含Fusarium Δ15去饱和酶的大豆体细胞胚芽的分析
成熟的体细胞大豆胚芽是合子胚很好的模型。在液体培养基的球状胚芽状态时，体细胞大豆胚芽含很低量的、在大豆合子胚中却典型的三酰基甘油或成熟的贮存蛋白质。在该发育阶段，总三酰基甘油对总极性脂类(磷酸脂和甘油脂)的比例约为1∶4，与典型的大豆合子胚在体细胞胚芽培养起始的发育阶段一样。在胚的球形期阶段，主要的种子蛋白、β-伴大豆球蛋白α-亚基、kunitz胰岛素抑制物3及种子凝集素的mRNAs基本不存在。在转移到无激素的培养基中使其分化为成熟的体细胞胚芽状态时，三酰基甘油成为最多的脂类成分。而β-伴大豆球蛋白α-亚基、kunitz胰岛素抑制物3及种子凝集素的mRNAs在总mRNA中的含量非常丰富。基于此，体细胞大豆胚芽系统与成熟的大豆合子胚在体内的行为非常相似，因此是分析脂肪酸生物合成途径(WO 02/00904中实施例3)中基因表达改变对表型有何影响的很好的、而且快速的模型。最重要地，该模式系统也可预测来源于转基因胚芽的植株种子中脂肪酸的组成。
含上述构建体的转基因大豆体细胞胚芽用类似方法进行分析。为此，通过酰基转换反应从单个成熟的体细胞大豆胚芽中制备脂肪酸的甲基酯。将胚芽放在含50pL氢氧化三甲基巯(TMSH)和0.5mL己烷的小瓶中，室温温育30min，并进行振荡。然后分离脂肪酸甲基酯(从己烷层抽取5μL)，并用填充了Omegawax 320融合硅毛细管柱(Supelco Inc.，Bellefonte，PA；Catalog #24152)的Hewlett-Packard6890气相色谱仪进行定量。烤箱温度设置为在220℃持续2.7min，，然后以20℃/min增加到240℃，再持续2.3min。通过Whatman氢气产生仪提供载气。将保留时间与已商品化的标准甲基酯(Nu-Chek Prep，Inc.catalog#U-99-A)进行比较。
含pKR578的最好的10个胚芽系和仅用筛选标记进行转化的对照胚芽的结果如表14所示。虽然仅显示最好的胚芽系，但其它胚芽系ALA水平的范围为对照水平(22％)至最好水平(89％)间。类似地，也获得了其它ω-3对ω-6比例在0.4到45范围内的胚芽系。最好的胚芽系中的胚芽的平均18:3含量为79％，其分析的最好的胚芽具有89％的18:3，相对而言，对照的平均18:3含量为19％，其最好的胚芽仅具有22％的18:3。这相当于与对照胚芽比，18:3平均提高了4倍。在pKR578转化的胚芽系中，18:3含量为51-89％。该胚芽系ω-3∶ω-6脂肪酸(18:3/18:2)的平均比例为24∶1，其中最好的胚芽的比例为42∶1，相对而言，对照的18:3/18:2比例的平均值和最好值为0.4。这相当于ω-3∶ω-6比例平均提高了66倍。在pKR578转化的胚芽系中，ω-3∶ω-6脂肪酸(18:3/18:2)比例的范围为3∶1-42∶1。
Figure GSB00000439125501161
Figure GSB00000439125501171
Figure GSB00000439125501181
含pKKE2和pKR585的最好胚芽系的结果如表15所示。最好的胚芽系中胚芽的平均ω-3含量为63％，平均EPA含量为7％。所分析的最好的ω-3胚芽其ω-3含量为72％。分析的最好的EPA胚芽其EPA为16％，ω-3含量为57％。这个胚芽系的平均ω-3∶ω-6脂肪酸(18:3/18:2)比例为8∶1，最好的胚芽的比例为16∶1。最好的EPA胚芽中ω-3∶ω-6脂肪酸(18:3/18:2)比例为4∶1。
Figure GSB00000439125501191
表15(续)
Figure GSB00000439125501201
实施例18
拟南芥植株的转化
用HindIII消化载体pKR197以除去β-伴大豆球蛋白表达盒，将载体骨架重新连接，得到pKR277。
用BsiWI消化pKR124除去Kti/NotI/Kti3′盒，将末端补齐，然后将该片段克隆到补齐的pKR277上的HindIII位点，得到pKR353。
将含Fusarium Δ15去饱和酶的pY34的NotI片段克隆到pKR353上的NotI位点，得到pKR353(Δ15)。
载体pHD1衍生于双元载体pZBL11[美国专利No.5,968,793；EP1003891和WO 9859062]，通过在T-DNA边界右边和左边间的PacI和Asp718位点之间加入AscI连接元件的方式。AscI连接元件通过将寡核苷酸Asc5(SEQ ID NO：108)与Asc3(SEQ ID NO：109)退火形成。
载体pZBL11[美国专利No.5,968,793；EP 1003891和WO 9859062]在T-DNA边界内包括提供了对磺酰脲除草剂具有抗性的35S：磺酰脲抗性的乳酸盐合成酶(ALS)的转基因，可用作植株的筛选标记。pZBL11还具有E.coli和Agrobacterium tumefaciens的复制起点及细菌卡那霉素抗性基因。
从pKR353(Δ15)中分离含嵌合基因Kti3启动子：FmΔ15去饱和酶ORF:Kti3终止子的AscI片段，并克隆到两用载体pHD1中单一的AscI位点上，得到pZBL1(D15)。
将质粒pZBLI(D15)转入Agrobacterium菌株NTL4[Luo et.al.(2001)MPMI 14：98]中，该培养物通过土壤杆菌(Agrobacterium)浸染法转化拟南芥的fad2-1突变株[Okuley et.al.(1994)Plant Cell 6：147]。在磺酰脲上筛选出命名为NY的转化子，培养植株，获得T2种子。也用pHD1按同样方法转化作为对照。如下所述分析来自大批T2种子中的脂类(仍分为T-DNA和磺酰脲抗性)。用玻璃棒在50μL TMSH中破碎约25-50个T2种子。在室温下温育约15分钟，并持续搅拌，然后向样品中加入500μL己烷，在搅拌下，室温再温育15分钟。然后将己烷层转移到单独的GC瓶中，通过所述的GC分析(WO 04/071467)进行脂肪酸甲基酯(FAME)分析。各胚芽系的结果如表16所示。在Δ15表达的胚芽系(FmD15-NY)中的平均18:3水平比空载体对照(HD1对照)胚芽系约高1.5倍，而18:3/18:2比例比同样的胚芽系高2倍。野生型拟南芥中n3/n6比例为0.61[Shah et.al.(1997)Plant Physiology114：1533]。本领域的技术人员应理解，因为所分析的大批种子中含有隔离种子(包括野生型、杂合子和纯合子)，因此ALA的水平是低估的。本领域的技术人员也应理解，纯合子系与杂合子系相比，含有二倍Δ15去饱和酶拷贝，因此预计ALA水平会更高(基因剂量效应)。
表16
用FusariumΔ15去饱合酶转化的Arabidopsis Fad2-1突变株中18:3的累积
Figure GSB00000439125501221
野生型拟南芥也可用表达Δ15去饱和酶的嵌合构建体以类似方法进行转化，来自那些植株的种子将比未转化的植株含有更高的ALA含量。
因此，在植物油中ω-3/ω-6脂肪酸的比例可通过向野生型植株或具有降低的18:2的植株中转化嵌合的Δ15去饱和酶基因而得到提高。后者是由于Fusarium Δ15去饱和酶具有双功能Δ12/Δ15去饱和酶的结果。因此，本领域的技术人员可向产量较少或无LA的突变植株中转入双功能Δ12/Δ15去饱和酶，或用双功能Δ12/Δ15去饱和酶和设计成抑制宿主天然Δ12去饱和酶的DNA抑制构建体共转化野生型菌株。天然的Δ12去饱和酶基因包括编码质粒外或质粒Δ12去饱和酶的基因。

Claims (11)

1.分离的、编码真菌Δ15去饱和酶的核酸，其选自：
(a)分离的、编码在SEQ ID NO：2、6、10、14或18中所示的氨基酸序列的核酸；或者
(b)分离的、与(a)完全互补的核酸。
2.权利要求1所述的分离的核酸，其如SEQ ID NO：1所示。
3.权利要求1所述的分离的核酸，其由串珠镰孢(Fusariummoniliforme)中分离。
4.可操作地连接到合适的调控序列上的、包含权利要求1-3任一项中的分离的核酸的嵌合基因。
5.一种用于生产α-亚麻酸的方法，包括：
a)提供宿主细胞，它含有：
(i)分离的、编码具有Δ15去饱和酶活性的蛋白的核酸，其中所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、6、10、14或18中所示；及
(ii)亚油酸的来源；
b)在编码具有Δ15去饱和酶活性的蛋白的核酸被表达、并且亚油酸被转化为α-亚麻酸的条件下，培养步骤(a)中的宿主细胞；以及
c)任选地回收步骤(b)中的α-亚麻酸。
6.权利要求5中的方法，其中分离的、编码具有Δ15去饱和酶活性的蛋白的核酸是从选自串珠镰孢、稻瘟病菌、粗糙链孢霉、禾谷镰孢和构巢曲霉的真菌中分离的。
7.权利要求5中的方法，其中具有Δ15去饱和酶活性的蛋白将亚油酸转化为α-亚麻酸的底物转化百分比至少为50％。
8.权利要求5中的方法，其中具有Δ15去饱和酶活性的蛋白将亚油酸转化为α-亚麻酸的底物转化百分率至少为80％。
9.权利要求5中的方法，其中具有Δ15去饱和酶活性的蛋白将亚油酸转化为α-亚麻酸的底物转化百分率至少为90％。
10.权利要求5中的方法，其中具有Δ15去饱和酶活性的蛋白将亚油酸转化为α-亚麻酸的底物转化百分率高于至少95％。
11.权利要求5中的方法，其中具有Δ15去饱和酶活性的蛋白与作为底物的油酸和亚油酸结合。
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