CN106010993B - 生产亚麻酸的圆红冬孢酵母及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种生产α‑亚麻酸的圆红冬孢酵母及其制备方法。本发明通过从多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)胞内克隆得到活性较高的Δ15脱饱和酶基因，连接至经过改造的植物双元表达载体pCAMBIA1300，转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)胞内并通过共培养将Δ15脱饱和酶基因结合至圆红冬孢酵母的基因组上，实现多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶在圆红冬孢酵母胞内的过表达，从而增加α‑亚麻酸在圆红冬孢酵母胞内的产量。

Description

生产亚麻酸的圆红冬孢酵母及其制备方法
技术领域
本发明涉及α-亚麻酸的生产领域，尤其涉及一种生产α-亚麻酸的圆红冬孢酵母及其制备方法和生产α-亚麻酸的方法。
背景技术
α-亚麻酸(cisΔ9,12,15，英文缩写ALA)属于ω-3系列多不饱和脂肪酸，为全顺式9,12,15-十八碳三烯酸，它在人体内不能合成，必须从体外食物中获取，多以不饱和甘油酯的形式存在于亚麻籽、沙棘籽、大豆等植物中。α-亚麻酸在人体内通过一系列的碳链延长和脱饱和反应能够被转化为机体必需的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，然而，α-亚麻酸比EPA和DHA的作用更好并且更安全，它是构成人体组织细胞的主要成分，如果人体缺乏，便会引起机体脂质体代谢紊乱，会直接导致疲劳、健忘、视力减退、免疫力下降、动脉粥样硬化等症状的发生。目前国内外已有明确报道：如果婴幼儿童或青少年缺乏α-亚麻酸，会严重影响智力的正常发育。美国国家食品药品监督管理局的研究证明，缺乏α-亚麻酸将导致儿童大脑及视网膜发育迟缓，营养吸收不均衡或者不能被有效吸收，同时会导致注意力不集中和智力发育迟缓、弱视、多动症、肥胖、厌食以及免疫力低下等多种症状和疾病。成年人缺乏α-亚麻酸，体内的维生素、矿物质、氨基酸、蛋白质等物质不能被有效吸收和利用，甚至会出现代谢紊乱症状。
从自然界植物中提取α-亚麻酸的成本高且产率低，不适合工业化生产的需求。近年来利用微生物生产多不饱和脂肪酸成为研究热点。利用微生物生产多不饱和脂肪酸具有简单、过程可控、易放大、不受天气环境影响等优点。圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)是自然界中为数不多的可以合成多不饱和脂肪酸的酵母，这种产油酵母具有营养需求简单、易进行放大和高密度培养、遗传背景比较清楚等优势。圆红冬孢酵母胞内可以合成并积累α-亚麻酸，然而产量并不高，因而强化圆红冬孢酵母生产α-亚麻酸具有重要的研究和应用价值。目前利用培养和发酵优化的方法对于增加圆红冬孢酵母生产α-亚麻酸的效果并不理想，所以必须从基因水平强化圆红冬孢酵母胞内α-亚麻酸的代谢途径，进而达到增加α-亚麻酸产量的目的。然而，圆红冬孢酵母属于粘红酵母菌，对于这类酵母的遗传操作方法比较有限。
另外，α-亚麻酸在圆红冬孢酵母胞内的合成途径是先由硬脂酸经过Δ9脱饱和酶(FAD9)催化生成油酸；再由Δ12脱饱和酶(FAD12)催化油酸生成亚油酸；最后经过Δ15脱饱和酶(FAD15)催化生成α-亚麻酸。在这条合成途径中Δ15脱饱和酶是主要的限速酶，正是由于圆红冬胞酵母胞内Δ15脱饱和酶的低活性限制了α-亚麻酸的产量。但是如何增强Δ15脱饱和酶的活性，强化从亚油酸到α-亚麻酸的合成途径，进而增加圆红冬胞酵母合成α-亚麻酸的产量是长期以来一直面临的重要难题。
发明内容
为了克服现有技术无法大幅度提高圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloidesACCC 20341)生产α-亚麻酸的问题，本申请的发明人发现，从多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)胞内克隆得到的Δ15脱饱和酶基因在圆红冬孢酵母表达时显示出高活性，将其连接至植物双元表达载体pCAMBIA1300，转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens LBA4404)胞内，并通过共培养将Δ15脱饱和酶基因转化至圆红冬孢酵母，实现具有高活性的多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶在圆红冬孢酵母胞内的过表达，从而能够强化圆红冬孢酵母生产α-亚麻酸的能力。具体地，本发明提供以下内容。
本发明的一方面，提供一种圆红冬孢酵母菌株，其包含多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶基因表达元件。在一个优选实施方案中，多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶基因表达元件包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。在另一优选实施方案中，本发明的圆红冬孢酵母菌株能够过表达具有高活性的多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶。在另一优选实施方案中，本发明的圆红冬孢酵母菌株具有强化α-亚麻酸生产的能力。
本发明的另一方面，提供一种圆红冬孢酵母菌株的制备方法，其包括：将表达多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶的基因或其片段引入圆红冬孢酵母菌株，从而强化所述圆红冬孢酵母菌株的α-亚麻酸生产能力。优选地，所述表达多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶的基因具有SEQID NO:2所示的核苷酸序列。
在一个优选的实施方案中，圆红冬孢酵母菌株的制备方法包括：
Δ15脱饱和酶基因表达载体pCAMBIA-FAD15的构建，其中所述pCAMBIA-FAD15包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
利用所述pCAMBIA-FAD15质粒转化根癌农杆菌；
将所述转化的根癌农杆菌与所述圆红冬孢酵母共培养，从而将Δ15脱饱和酶基因转化至所述圆红冬孢酵母的基因组。
优选地，所述pCAMBIA-FAD15进一步包含潮霉素抗性基因(HYGR)表达元件。优选地，所述潮霉素抗性基因表达元件由GPD基因的启动子、潮霉素抗性基因和CaMV终止子组成。优选地，所述潮霉素抗性基因具SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
本发明的再一方面，提供一种生产α-亚麻酸的方法，其包括培养本发明所述的圆红冬孢酵母菌株的步骤。
在优选地实施方案中，生产α-亚麻酸的方法包括以下步骤：
1)利用YEPD培养基培养活化的圆红冬孢酵母菌株；
2)收集步骤1)培养而得到的圆红冬孢酵母菌株，接种至补料发酵培养基进行补料发酵，所述补料发酵培养基含有碳源、氮源和无机盐，补料发酵过程中，总碳氮比始终维持在100:0.7～1.5。
活化的圆红冬孢酵母菌株可以直接采用活化状态的菌株，也可由保藏状态的菌株活化而来。
所述YEPD培养基或称为YPD培养基，即，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YeastExtract Peptone Dextrose Medium)，按照常规配方配置即可。优选地，按照如下配方配置：8～12g/L酵母粉，8～20g/L蛋白胨，15～25g/L葡萄糖，pH为5.8～6.0。若制固体培养基，加入10～20g/L琼脂粉,优选为15g/L琼脂粉。在本发明的一个优选实施方式中，YEPD培养基按照如下配方配置：10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，pH＝5.8～6.0。
步骤1)和步骤2)可以在发酵罐中进行。步骤2)中，补料发酵是指，通过补料流加所述碳源维持所需的碳氮比。
根据本发明所述的生产α-亚麻酸的方法，优选地，步骤2)中，所述碳源为含有葡萄糖和木糖的混合碳源，所述氮源为谷氨酸钠或蛋白胨，所述无机盐含有钾元素、镁元素和磷元素。
根据本发明所述的生产α-亚麻酸的方法，优选地，步骤2)中，碳源为含有15～25g/L葡萄糖和25～35g/L木糖的混合碳源，氮源为5.8～6.5g/L的谷氨酸钠或4.6～5.5g/L的蛋白胨，所述无机盐包括0.3～0.7wt％的KH2PO4、0.1～0.3wt％的K2HPO4和0.3～0.7wt％的MgCl2。以上各成分的含量是指各成分在补料发酵培养基中的含量。补料发酵过程中，通过流加所述碳源的水溶液(即，通过流加含有15～25g/L的葡萄糖和25～35g/L的木糖的混合碳源水溶液),使总碳氮比始终维持在100:0.8～1.2。更优选地，步骤2)中，碳源为含有18～22g/L葡萄糖和28～32g/L木糖的混合碳源，氮源为5.8～6.2g/L的谷氨酸钠或4.6～5.2g/L的蛋白胨，所述无机盐包括0.4～0.6wt％的KH2PO4、0.1～0.2wt％的K2HPO4和0.4～0.6wt％的MgCl2，补料发酵过程中，通过流加所述混合碳源的水溶液(即，通过流加含有18～22g/L的葡萄糖和28～32g/L的木糖的混合碳源水溶液)，使总碳氮比始终维持在100:0.9～1.1。根据本发明的一个优选实施方式，步骤2)中，碳源为含20g/L葡萄糖和30g/L木糖的混合碳源，氮源为6.2g/L的谷氨酸钠或4.6g/L的蛋白胨，所述无机盐包括0.52wt％的KH2PO4、0.16wt％的K2HPO4和0.48wt％的MgCl2，补料发酵过程中，通过流加所述碳源的水溶液(即，通过流加含有18～22g/L的葡萄糖和28～32g/L的木糖的混合碳源水溶液)，使总碳氮比始终维持在100:1。
根据本发明所述的生产α-亚麻酸的方法，优选地，步骤1)中，圆红冬孢酵母菌株在YEPD培养基培养至OD600为10以上。更优选地，培养至OD600为12～15。
根据本发明所述的生产α-亚麻酸的方法，优选地，步骤2)中，补料发酵的时间为80～150h。更优选地，补料发酵的时间为100～140h。
根据本发明所述的生产α-亚麻酸的方法，优选地，步骤1)中，圆红冬孢酵母菌株在YEPD液体培养基中培养，培养条件为28～30℃，180～230rpm，培养40～60h；步骤2)中，补料发酵的时间为100～130h。根据本发明的一个优选的实施方式，步骤1)中，圆红冬孢酵母在YEPD液体培养基中培养，培养条件为30℃，200rpm，培养48h；步骤2)中，补料发酵的时间为120h。
根据本发明所述的生产α-亚麻酸的方法，优选地，步骤2)中，收集步骤1)培养而得的圆红冬孢酵母菌体的方法为：7000～9000rpm离心，收集菌体，用浓度为15～25mM，pH＝6.5～7的磷酸盐缓冲液洗涤菌体，再次离心收集菌体。根据本发明的一个优选的实施方式，步骤2)中，收集步骤1)培养而得的圆红冬孢酵母菌体的方法为：8000rpm离心，收集菌体，用20mM，pH＝6.8的磷酸盐缓冲液洗涤菌体，再次离心收集菌体。
根据本发明所述的生产α-亚麻酸的方法，优选地，步骤2)得到的发酵液用有机溶剂提取总油脂，所述有机溶剂可以为本领域采用的各种提取微生物总油脂的有机溶剂。优选地，所述有机溶剂为体积比为2～5:1的正己烷和乙醇，更优选为体积比为2.5～3.5:1的正己烷和乙醇。
根据本发明所述的生产α-亚麻酸的方法，优选地，提取总油脂的方法为：7000～9000rpm离心所得发酵液，用pH＝6.5～7的磷酸盐缓冲液洗涤离心的菌体，最后用浓度为5～7mol/L的盐酸重悬，70～90℃水浴酸解30～100min；加入所述有机溶剂萃取其中的油脂，重复萃取3～5次，合并上清液，蒸发所述有机溶剂后即得含α-亚麻酸的总油脂。根据本发明的一个优选的实施方式，提取总油脂的方法为：8000rpm离心所得发酵液，用pH＝6.8的磷酸盐缓冲液洗涤离心的菌体，最后用6mol/L的盐酸重悬，80℃水浴酸解40min；加入所述有机溶剂萃取其中的油脂，重复萃取3次，合并上清液，蒸发所述有机溶剂后即得含α-亚麻酸的总油脂。
圆红冬孢酵母胞内油脂积累量能够达到细胞干重的60％以上，但是生产出来的油脂一般用作生物柴油等能源用途。本发明的发酵培养方法强化了圆红冬孢酵母胞内油脂中α-亚麻酸的产量，可用于保健品，提升了圆红冬孢酵母油脂的利用价值。此外，采用本发明优选的方案中，亦即以葡萄糖和木糖作为混合碳源、以谷氨酸钠或蛋白胨为优化氮源来发酵圆红冬孢酵母，并保持发酵过程的碳氮比，这样可以显著增加圆红冬孢酵母胞内合成α-亚麻酸的量。
附图说明
图1、pCAMBIA-FAD15表达载体的构建过程示意图。
图2、利用重叠延伸PCR的方法得到Δ15脱饱和酶基因表达框(GPD启动子+FAD15+GPD终止子)。其中，M是标记物(marker)；1、2分别是Δ15脱饱和酶融合基因表达框(2678bp)。
图3利用重叠延伸PCR的方法得到潮霉素抗性基因表达框(GPD启动子+HYGR)。其中M是标记物(marker)；1是潮霉素抗性基因HYGR表达框(2111bp)。
图4表示α-亚麻酸产量的对比的数据。其中，图4A表示野生型圆红冬孢酵母的α-亚麻酸的产量；图4B表示圆红冬孢酵母胞内强化Δ15脱饱和酶的表达后α-亚麻酸的产量。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
除非特别声明，本发明的“％”表示重量百分比wt％。本发明的“mM”表示mmol/L。本发明实施例中未限定配方的YEPD培养基均按照如下配方配置：10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，pH5.8～6.0。
本发明中，优选采用pCAMBIA1300载体来构建Δ15脱饱和酶基因表达载体，因为能够高效地转化根癌农杆菌。但是由于pCAMBIA1300载体上携带的CaMV 35S启动子是在植物细胞中行使功能而在圆红冬孢酵母胞内无法发挥作用，所以要对表达Δ15脱饱和酶基因的载体pCAMBIA1300进行改造。为此，本发明人创造性地将圆红冬孢酵母的保守基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GPD)基因的启动子和终止子序列与多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶的开放阅读框连接在一起组成表达元件，然后将其连接在pCAMBIA1300载体上的多克隆位点。结果表明这样的表达元件能够在圆红冬孢酵母胞内高效表达具有高活性的Δ15脱饱和酶。
优选地，为了能够使潮霉素抗性基因在圆红冬孢酵母中表达，本发明人创造性地构建了潮霉素抗性基因表达元件，并将该表达元件与pCAMBIA1300载体连接。优选地，将圆红冬孢酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GPD)基因的启动子与潮霉素抗性基因开放阅读框(SEQ ID NO:10)连接在一起组成表达元件，终止子可用pCAMBIA1300载体自身携带的CaMV终止子。
接下来，将Δ15脱饱和酶FAD15表达元件和潮霉素抗性基因表达元件与pCAMBIA1300载体的连接。连接方法包括：
1)用EcoRI和BamHI双酶切连接的方法将Δ15脱饱和酶FAD15表达元件连接在pCAMBIA1300载体上；
2)用XhoI和BstxI双酶切将潮霉素抗性基因表达元件连接到pCAMBIA1300载体上。
需要说明的是，对于连接步骤1)和2)的顺序没有特别限定，可优先进行步骤1)，然后再进行步骤2)，反之亦可。可选地，可同时进行步骤1)和2)。
优选地，本发明的圆红冬孢酵母的制备方法中，包括pCAMBIA-FAD15质粒转化根癌农杆菌。优选地，采用热击转化E.coil T1感受态细胞，富集培养后提取pCAMBIA-FAD15质粒，然后进行根癌农杆菌转化。
优选地，本发明的圆红冬孢酵母的制备方法中，包括根癌农杆菌转化圆红冬孢酵母的步骤。优选地，转化方法包括将两种菌液混合，共培养从而进行转化的方法。
优选地，本发明的圆红冬孢酵母的制备方法还包括根癌农杆菌转化圆红冬孢酵母后得到的重组子的验证步骤。验证方法可采用本领域内通常使用的任何方法，包括但不限于，PCR扩增验证法、酶切验证法、免疫验证法以及酶活性验证法等。从操作方法及成本节约角度，优选PCR扩增验证法。具体地，提取共培养后的圆红冬孢酵母的基因组，并通过PCR扩增来确认圆红冬孢酵母中是否存在多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶基因。
实施例
1.菌种与实验材料
圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides ACCC 20341)和多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)购自中国农业生物菌种保藏管理中心，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)购自普如汀生物技术(北京)有限公司。质粒、基因组提取试剂盒购自TIANGEN公司，载体pCAMBIA1300购自Biovector公司，Easy Pfu DNA聚合酶购自全氏金公司，尼龙膜Hybond-N+膜购自Amersham公司。限制性内切酶购自NEB公司。化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。
2.Δ15脱饱和酶基因表达载体pCAMBIA-FAD15的构建：
1)多形汉逊酵母菌株和圆红冬孢酵母菌株分别接种在含YEPD培养基的50mL三角瓶中过夜培养8h，离心收集菌体，分别提取两种菌的基因组；
2)以多形汉逊酵母和圆红冬孢酵母的基因组为模板，使用引物pGPD-F(SEQ IDNO:4)和pGPD-R(SEQ ID NO:5)、tGPD-F(SEQ ID NO:8)和tGPD-R(SEQ ID NO:9)、FAD15-F(SEQ ID NO:6)和FAD15-R(SEQ ID NO:7)分别克隆得到圆红冬孢酵母GPD的启动子(SEQ IDNO:1)和终止子序列(SEQ ID NO:3)以及多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶的开放阅读框(SEQ IDNO:2)；
3)使用重叠延伸PCR的方法将上述三段核苷酸序列进行拼接，重叠延伸PCR的方法为：先将GPD启动子和Δ15脱饱和酶互为模板和引物进行扩增，条件为94℃预变性5min，94℃变性40s，60℃退火30s，72℃延伸1min，20个循环；然后将产物取出加入引物pGPD-F和FAD15-R再次进行上述条件的扩增，35个循环，即将得到GPD启动子和Δ15脱饱和酶基因两个片段的融合序列；
4)再次使用步骤3)的方法，引物是pGPD-F和和tGPD-R，将第三个片段GPD的终止子序列连接到前述融合片段的下游，获得Δ15脱饱和酶基因表达框(参见图2)。用EcoRI和BamHI双酶切连接的方法将三段序列融合片段连接在pCAMBIA1300载体上。
3.潮霉素抗性基因表达载体的构建：
1)将圆红冬孢酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)基因的启动子与潮霉素抗性基因开放阅读框连接在一起组成表达元件，终止子使用pCAMBIA1300载体自身携带的CaMV终止子。先以圆红冬孢酵母的基因组和载体pCAMBIA1300为模板，用引物proGPD-F(SEQ ID NO:11)和proGPD-R(SEQ ID NO:12)、Hyg-F(SEQ ID NO:13)和Hyg-R(SEQ ID NO:14)分别扩增出GPD启动子和潮霉素抗性序列；
2)潮霉素抗性基因表达元件的构建使用重叠延伸PCR法：先将GPD启动子和潮霉素抗性基因开放阅读框互为模板和引物进行扩增，条件为94℃预变性5min，94℃变性40s，58℃退火20s，72℃延伸40s，20个循环；然后将产物取出加入引物proGPD-F和Hyg-R再次进行上述条件的扩增，35个循环，即将得到GPD启动子和潮霉素抗性基因两个片段的融合序列；
3)与Δ15脱饱和酶基因表达载体的构建过程相似，GPD启动子和潮霉素抗性基因重叠延伸的引物分别为proGPD-F和proGPD-R、Hyg-F和Hyg-R。经过重叠延伸PCR的方法融合成为潮霉素抗性基因HYGR表达框。结果参见图3。潮霉素抗性基因与pCAMBIA1300载体连接的酶切位点为XhoI和BstxI。
4.pCAMBIA-FAD15质粒转化根癌农杆菌
1)将构建好的载体pCAMBIA-FAD15在42℃热击转化E.coil T1感受态细胞，富集培养后提取pCAMBIA-FAD15质粒进行根癌农杆菌转化；
2)首先进行根癌农杆菌感受态细胞的制备：挑取单菌落，接种于5ml LB培养基中，28℃、220rpm，过夜培养。将1:50的菌液接种到100ml LB培养基中，培养至OD600＝0.5左右。4℃、5000rpm、10min，弃上清。用40ml 10％甘油重悬，冰浴30min。4℃、5000rpm、10min，弃上清。加入2ml 10％的甘油重悬，分装成每管100μl。在超净工作台中，将感受态与pCAMBIA-FAD15质粒混合液转入到预冷的0.2cm电击杯中，放入电转仪进行电转化。电转化条件为：电压2400V、电容25μF、电阻200Ω；电击后立即向电击杯中加入900μl LB培养基并置于冰中2min。将菌液转入到1.5ml EP管，28℃、150rpm孵育2h，涂布在含有50μg/ml卡纳霉素的LB固体培养基上，30℃培养2～3d。
5.根癌农杆菌转化圆红冬孢酵母
分别挑取根癌农杆菌和圆红冬孢酵母单菌落于50μg/ml含卡纳霉素的LB培养基和YPD培养基中，28℃，220rpm培养24h。5000rpm，5min收集菌体，以IM培养基(50μg/ml卡纳霉素)重悬菌体，稀释至OD600＝0.2，继续培养6h，至OD600＝0.6。以1:5稀释圆红冬孢酵母于新鲜YPD培养基中，继续培养6h，收集菌体，再次用IM培养基重悬，稀释至OD600＝0.6。两种菌液各取50μl混合，将全部菌液涂于带有尼龙膜Hybond-N+膜(Amersham公司，美国)的IM平板上，25℃暗培养48h。将Hybond-N+膜转移至YPD(100μg/ml头孢霉素+200μg/ml潮霉素)上，30℃培养2-3d。挑取初筛的转化子，在新的YPD(150μg/ml头孢霉素+300μg/ml潮霉素)上划线，培养2-3d，挑取转化子，提取基因组进行PCR验证重组子。
通过PCR验证得到5株本发明的圆红冬孢酵母菌株，分别命名为1号至5号。
(IM培养基成分：基本培养基(MM)：(K2HPO4 2g/L,KH2PO4 1.45g/L,MgSO4·7H2O0.6g/L,NaCl 0.3g/L,CaCl2·2H2O 0.01g/L,Glucose 2g/L,FeSO4 0.001g/L,ZnSO4·7H2O0.005g/L,CuSO4·5H2O 0.005g/L,H3BO3 0.005g/L,MnSO4·H2O 0.005g/L,Na2MoO4·2H2O0.005g/L,NH4NO3 0.5g/L)，2-吗啉乙磺酸(MES)40mM，乙酰丁香酮(AS)200μΜ，甘油0.5％)。
6.圆红冬孢酵母总油脂的检测
取1号圆红冬孢酵母以及野生型圆红冬孢酵母各10ml(5ml测生物量，5ml提油脂)，离心收集菌体。测生物量的菌放入65℃烘2～3d；提油脂的菌加入5ml浓盐酸和0.5ml H2O，80℃水浴1h，然后加入2ml正己烷和0.75ml无水乙醇，混合液来萃取其中的油脂，此步重复3次，合并上清液，使用旋转蒸发仪将机溶剂蒸干即得微生物油脂，气相色谱质谱联用仪条件：安捷伦6890N-5975C，HP-INNOWAX极性毛细管柱，0.25μm×250μm×30m；载气：氦气；载气流量：1.0mL/min，恒定流量；上样分流比为20:1；进样量1μL；进样口和检测器温度为280℃；升温程序：180℃保持1min，10℃/min升温至220℃，2℃/min升温至240℃，保持5min。260℃后运行3min，全扫描。
检测结果附图4所示，野生型圆红冬孢酵母在优化条件下α-亚麻酸的产量为5.05％，而经过Δ15脱饱和酶强化过表达的圆红冬孢酵母α-亚麻酸的产量达到了8.9％。
另外，发明人以上述同相的方法检测了本申请2号-5号菌株的α-亚麻酸的产量。结果如下表1所示。
表1
编号 α-亚麻酸产量(％)
2号 9.1
3号 9.4
4号 9.5
5号 8.7
通过上述实验说明，多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶在圆红冬孢酵母胞内的表达确实有助于α-亚麻酸的产量的提高。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (10)

1.一种圆红冬孢酵母菌株的制备方法，其特征在于，包括将SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列引入圆红冬孢酵母菌株，从而使所述圆红冬孢酵母菌株过表达具有活性的多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶的步骤；具体包括如下步骤：
(1)构建多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶基因表达载体，其中，所述多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶表达载体包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；所述多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶表达载体还包含潮霉素抗性基因表达元件，所述潮霉素抗性基因表达元件由圆红冬孢酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶GPD基因的启动子、潮霉素抗性基因和CaMV终止子组成；
(2)利用多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶表达载体转化根癌农杆菌以形成转化的根癌农杆菌；
(3)将转化的根癌农杆菌与圆红冬孢酵母共培养，从而将多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶基因转化至所述圆红冬孢酵母；
在步骤(1)中，采用pCAMBIA1300载体构建多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶基因表达载体，将圆红冬孢酵母的保守基因3-磷酸甘油醛脱氢酶GPD基因的SEQ ID NO:1所示的启动子和SEQ ID NO:3所示的终止子序列与多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶的SEQ ID NO:2所示的开放阅读框连接在一起组成多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶FAD15表达元件，用EcoRI和BamHI双酶切连接的方法将多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶FAD15表达元件连接在pCAMBIA1300载体上；将圆红冬孢酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶GPD基因的启动子与SEQ ID NO:10所示的潮霉素抗性基因开放阅读框连接在一起组成潮霉素抗性基因表达元件，终止子用pCAMBIA1300载体自身携带的CaMV终止子，用XhoI和BstxI双酶切将潮霉素抗性基因表达元件连接到pCAMBIA1300载体上。
2.根据权利要求1所述的圆红冬孢酵母菌株的制备方法，其特征在于，还包括根癌农杆菌转化圆红冬孢酵母后得到的重组子的验证步骤。
3.根据权利要求2所述的圆红冬孢酵母菌株的制备方法，其特征在于，验证步骤采用PCR扩增验证法。
4.根据权利要求3所述的圆红冬孢酵母菌株的制备方法，其特征在于，验证步骤具体包括：提取重组子的基因组，并通过PCR扩增来确认圆红冬孢酵母中是否存在多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶基因。
5.一种生产α-亚麻酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采用如权利要求1～4任一项的制备方法获得圆红冬孢酵母菌株，利用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基培养活化的圆红冬孢酵母菌株；
2)收集步骤1)培养而得到的圆红冬孢酵母菌株，接种至补料发酵培养基进行补料发酵，所述补料发酵培养基含有碳源、氮源和无机盐，补料发酵过程中，总碳氮比始终维持在100:0.7～1.5；
在步骤1)中，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基按照如下配方配置：8～12g/L酵母粉，8～20g/L蛋白胨和15～25g/L葡萄糖，且pH为5.8～6.0；
在步骤2)中，所述碳源为含有葡萄糖和木糖的混合碳源，所述氮源为谷氨酸钠或蛋白胨，所述无机盐含有钾元素、镁元素和磷元素。
6.根据权利要求5所述的生产α-亚麻酸的方法，其特征在于，在步骤2)中，碳源为含有15～25g/L葡萄糖和25～35g/L木糖的混合碳源，氮源为5.8～6.5g/L的谷氨酸钠或4.6～5.5g/L的蛋白胨，所述无机盐包括0.3～0.7wt％的KH2PO4、0.1～0.3wt％的K2HPO4和0.3～0.7wt％的MgCl2；以上各成分的含量是指各成分在补料发酵培养基中的含量。
7.根据权利要求6所述的生产α-亚麻酸的方法，其特征在于，补料发酵过程中，通过流加含有15～25g/L的葡萄糖和25～35g/L的木糖的混合碳源水溶液使总碳氮比始终维持在100:0.8～1.2。
8.根据权利要求5所述的生产α-亚麻酸的方法，其特征在于，在步骤2)中，碳源为含有18～22g/L葡萄糖和28～32g/L木糖的混合碳源，氮源为5.8～6.2g/L的谷氨酸钠或4.6～5.2g/L的蛋白胨，所述无机盐包括0.4～0.6wt％的KH2PO4、0.1～0.2wt％的K2HPO4和0.4～0.6wt％的MgCl2；以上各成分的含量是指各成分在补料发酵培养基中的含量。
9.根据权利要求8所述的生产α-亚麻酸的方法，其特征在于，补料发酵过程中，通过流加含有18～22g/L的葡萄糖和28～32g/L的木糖的混合碳源水溶液使总碳氮比始终维持在100:0.9～1.1。
10.根据权利要求5～9任一项所述的生产α-亚麻酸的方法，其特征在于，步骤1)中，培养至OD600为12～15；培养条件为28～30℃，180～230rpm，培养40～60h；
步骤2)中，补料发酵的时间为100～130h。
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