CN110358692B - 生产神经酸的重组酵母菌株及其应用 - Google Patents

生产神经酸的重组酵母菌株及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110358692B
CN110358692B CN201810309632.4A CN201810309632A CN110358692B CN 110358692 B CN110358692 B CN 110358692B CN 201810309632 A CN201810309632 A CN 201810309632A CN 110358692 B CN110358692 B CN 110358692B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
seq
fatty acid
nucleotide sequence
endoplasmic reticulum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810309632.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110358692A (zh
Inventor
孟慧敏
王士安
李家欣
李福利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Original Assignee
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS filed Critical Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority to CN201810309632.4A priority Critical patent/CN110358692B/zh
Priority to EP19785189.2A priority patent/EP3778866B1/en
Priority to US17/046,672 priority patent/US11603545B2/en
Priority to PCT/CN2019/081736 priority patent/WO2019196791A1/zh
Priority to JP2020556255A priority patent/JP7261815B2/ja
Publication of CN110358692A publication Critical patent/CN110358692A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110358692B publication Critical patent/CN110358692B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0051—Oxidoreductases (1.) acting on a sulfur group of donors (1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01049—Glucose-6-phosphate dehydrogenase (1.1.1.49)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01003—Aldehyde dehydrogenase (NAD+) (1.2.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y108/00—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8)
    • C12Y108/01—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.8.1)
    • C12Y108/01007—Glutathione-disulfide reductase (1.8.1.7), i.e. glutathione reductase (NADPH)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
    • C12Y111/01009—Glutathione peroxidase (1.11.1.9)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
    • C12Y114/19001—Stearoyl-CoA 9-desaturase (1.14.19.1), i.e. DELTA9-desaturase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/99—Miscellaneous (1.14.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/0102—Diacylglycerol O-acyltransferase (2.3.1.20)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01199—Very-long-chain 3-oxoacyl-CoA synthase (2.3.1.199)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01004—Phospholipase A2 (3.1.1.4)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了生产神经酸的工程化酵母菌株，所述酵母菌株过表达脂肪酸延长酶、去饱和酶、甘油二酯酰基转移酶等长链不饱和脂肪酸合成过程所需酶的相关基因，并且任选地进一步对菌株的甘油三酯合成与分解途径、鞘磷脂合成与分解途径、油脂亚细胞水平合成与分解途径以及氧化还原平衡途径进行调控。该重组酵母菌株能够产生微生物油，制备得到神经酸的含量占总脂肪酸含量的39.6％。

Description

生产神经酸的重组酵母菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及工程化重组酵母菌株， 其能够以高浓度有效地制备神经酸(顺-15-二十四碳单烯酸，别名鲨鱼酸， C24:1,Δ15)。
背景技术
不饱和脂肪酸多为人体必需脂肪酸，具有调节血脂、清理血栓、补脑健脑、 缓解炎症等作用，主要包括单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。其中，超长链 单不饱和脂肪酸(Very long chain monounsaturated fatty acid,VLCMFA)为主碳 链上碳原子数大于18，并且仅有一个双键的不饱和脂肪酸，常见的有鳕油酸 (Eicosenoic acid,C20:1Δ11)、芥酸(Erucic acid,C22:1Δ13)、神经酸(Nervonic acid,C24:1Δ15)和西门木烯酸(Ximenynic acid,C26:1Δ17)。超长链单不饱和 脂肪酸具有独特的药效、保健功效和工业用途等，但是相比多不饱和脂肪酸， 超长链单不饱和脂肪酸的应用推广亟待加强。
神经酸(顺-15-二十四碳单烯酸，别名鲨鱼酸，C24:1Δ15)是与人类健康 关系密切的超长链单不饱和脂肪酸。神经酸主要以鞘糖脂和鞘磷脂的形式存在 于动物大脑白质和髓鞘的神经纤维中，是生物膜的重要组成成分。神经酸在医 学和保健方面具有重要的作用，可用于治疗多发性硬化症等神经紊乱病症。此 外，研究表明神经酸对神经系统的发育具有促进作用，尤其是在婴幼儿脑神经 细胞和视神经细胞生长与发育过程具有重要的作用。人体所需的神经酸主要依 靠外源摄取。近年，随着对神经酸医学和保健功效认识的不断深入，其资源的 开发和利用价值凸显，产品需求正逐步扩大。
神经酸有多种天然来源。目前发现的富含神经酸的动植物及微生物有鲨 鱼、蒜头果、元宝枫、碎米芥、微藻、少数霉菌等。蒜头果是自然界富含神经 酸的中国特有植物，并且蒜头果种仁含油量在64.5％左右，其中神经酸含量高 达43.2％，但是蒜头果的种植困难。元宝枫籽油的神经酸含量约5.8％，为目前 神经酸的主要来源。元宝枫生长缓慢，人工种植元宝枫4-6年挂果，8-10年才进 入盛果期。因此，由元宝枫提取神经酸存在生长周期长、原料供应受季节约束、 产量低等弊端。产油微生物能够合成高细胞含量的脂肪酸，经过遗传工程改造， 可形成与植物油脂组成相似的微生物油脂。
解脂耶鲁维亚酵母(Yarrowia lipolytica)作为一种产油微生物，其油脂积 累可占细胞干重的44～70％，并具有生长速率快、细胞发酵密度高、碳源利用范 围广、遗传操作简单等特点，具有发展为神经酸细胞工厂的极大潜力。解脂耶 鲁维亚酵母中大多数的脂肪酸为C16和C18脂肪酸，由于缺少合成超长链单不饱 和脂肪酸所必需的碳链延长酶和脂肪酸去饱和酶，野生菌株无法合成神经酸。 乔建文等通过基因工程手段将脂肪酸延长酶(AtFAE1，BtFAE1和CgKCS)、 去饱和酶(SCD)以及甘油二酯酰基转移酶(DGAT1)导入解脂耶鲁维亚酵母， 构建的重组酵母细胞可产生神经酸，但其含量仅占细胞中总油脂含量的1.5％， 难以满足工业需求。
发明内容
本发明为解决上述技术问题，通过过表达脂肪酸延长酶、去饱和酶、甘油 二酯酰基转移酶等相关基因，任选地对重组酵母菌株的甘油三酯合成与分解途 径、鞘磷脂合成与分解途径、油脂亚细胞水平合成与分解途径以及氧化还原平 衡途径进行调控，使得构建的重组酵母菌株生产神经酸的能力大大提高，经发 酵优化后，提取获得神经酸的含量占总脂肪酸的含量为39.6％。具体技术方案 如下：
方案一、本发明提供了一种重组酵母菌株，其特征在于，过表达：
(a)一种编码Δ9去饱和酶的基因；
(b)至少四种编码脂肪酸延长酶的基因；
(c)一种编码甘油二酯酰基转移酶的基因；
(d)一种编码靶向内质网的脂肪酸延长酶的基因；
(e)一种编码靶向内质网的甘油二酯酰基转移酶的基因；和/或
(f)一种编码靶向内质网的Δ9去饱和酶基因。
所述重组酵母菌株中过表达脂肪酸合成表达模块，具体包括神经酸生产相 关的脂肪酸延长酶和去饱和酶基因。其中所述脂肪酸延长酶基因可选自，但不 限于高山被孢霉C16延长酶基因MaLCE1，如SEQ ID No：93所示；拟南芥 AtFAE1，如SEQ ID No：94所示；非洲芥菜BtFAE1，如SEQ ID No：95所示； 碎米芥CgKCS，如SEQ ID No：96所示；大鼠脂肪酸延长酶2基因rELO2，如SEQ ID No：97所示；微小隐孢子虫长链脂肪酸延长酶基因CpLCE，如SEQID No： 98所示；羊脂肪酸延长酶6基因gELOVL6，如SEQ ID No：99所示。其中所述去 饱和酶基因可选自，但不限于解脂耶鲁维亚酵母SCD，如SEQ ID No：84所示； 刺孢小克银汉霉Δ9脂肪酸去饱和酶基因D9DMB，如SEQ ID No：100所示；线 虫Δ9脂肪酸去饱和酶基因CeFAT6，如SEQ ID No：101所示；高山被孢霉Δ9脂 肪酸去饱和酶基因MaOLE2，如SEQ ID No：102所示；拟南芥AtADS1，如SEQ ID No：103所示；拟南芥AtADS2，如SEQ ID No：104所示。
同时，所述重组酵母菌株中过表达甘油三酯合成模块，具体指二酰基甘油 酰基转移酶基因，是催化三酰甘油(TAG)合成最后一步反应的酶，也是TAG 合成过程中唯一的关键酶和限速酶，提高酵母细胞中甘油二酯酰基转移酶的表 达量可以提高细胞内油脂的含量。
同时，所述重组酵母菌株中过表达酵母油脂合成与分解亚细胞水平调节模 块，具体是指内质网水平的调控，即在相应基因的3'末端添加内质网滞留信号 肽KDEL。
优选的，方案一所述酵母菌株为解脂耶鲁维亚酵母。
优选的，所述编码Δ9去饱和酶的基因为解脂耶鲁维亚酵母SCD基因，其核 苷酸序列如SEQ ID No：84所示；
优选的，所述的四种编码脂肪酸延长酶基因分别为高山被孢霉C16/18延长 酶基因MaLCE1，其核苷酸序列如SEQ ID No：93所示；拟南芥AtFAE1基因， 其核苷酸序列如SEQID No：94所示；非洲芥菜BtFAE1基因，其核苷酸序列如 SEQ ID No：95所示；碎米芥CgKCS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：96所示；
优选的，所述编码甘油二酯酰基转移酶的基因为解脂耶鲁维亚酵母DGAT1 基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：83所示；
优选的，所述编码靶向内质网的脂肪酸延长酶的基因为带有靶向内质网信 号肽编码序列的碎米芥CgKCSER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：121所示；
优选的，所述编码靶向内质网的甘油二酯酰基转移酶的基因为带有靶向内 质网信号肽编码序列的解脂耶鲁维亚酵母DGAT1ER基因，其核苷酸序列如SEQID No：122所示；
优选的，所述编码靶向内质网的Δ9去饱和酶的基因为带有靶向内质网信号 肽编码序列的解脂耶鲁维亚酵母SCDER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：123 所示。
在另一个实施方案中，本发明提供用于生产神经酸的重组酵母菌株，所述 菌株在方案一所涉及菌株的基础上可进一步过表达：
(a)两种编码靶向内质网的脂肪酸延长酶的基因；和/或
(b)两种编码靶向过氧化物酶体的脂肪酸延长酶的基因。
优选的，所述两种编码靶向内质网的脂肪酸延长酶的基因分别为带有靶向 内质网信号肽编码序列的碎米芥CgKCSER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No： 121所示；带有靶向内质网信号肽编码序列的非洲芥菜BtFAE1ER基因，其核苷 酸序列如SEQ ID No：124所示；
优选的，所述两种编码靶向过氧化物酶体的脂肪酸延长酶的基因分别为带 有靶向过氧化物酶体信号肽编码序列的碎米芥CgKCSPTS基因，其核苷酸序列如 SEQ ID No：125所示；带有靶向过氧化物酶体信号肽编码序列的非洲芥菜 BtFAE1PTS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：126所示。
在另一个实施方案中，本发明提供用于生产神经酸的重组酵母菌株，所述 菌株在方案一所涉及菌株的基础上可进一步过表达：
(a)一种编码醛脱氢酶的基因；
(b)一种编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因；
(c)一种编码谷胱甘肽二硫化物还原酶的基因；和/或
(d)一种编码谷胱甘肽过氧化物酶的基因。
所述重组酵母菌种中进一步包括氧化还原平衡的调控模块，涉及维持神经 酸合成过程中还原力NADPH再生和氧化应激防御相关的基因。
所述醛脱氢酶基因优选为大肠杆菌EcAldH基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：105所示；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因优选为酿酒酵母ScZwf基因，其核苷 酸序列如SEQ ID No：106所示，谷胱甘肽二硫化物还原酶基因优选为解脂耶鲁 维亚酵母ylGSR基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：91所示，谷胱甘肽过氧化物 酶基因优选为解脂耶鲁维亚酵母ylGPO基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：92 所示。
方案二、本发明提供了一种重组酵母菌株，其特征在于，过表达：
(a)一种编码Δ9去饱和酶的基因；
(b)至少三种编码脂肪酸延长酶的基因；
(c)一种编码甘油二酯酰基转移酶的基因；和/或
(d)一种编码磷脂酶A2的基因。
所述重组酵母菌株包括鞘磷脂合成与分解的调控模块，具体涉及磷脂酶A2(phospholipaseA2，PLA2)基因，PLA2是一种能催化磷脂甘油分子上二位酰 基的水解酶，其过表达可以增加神经酸合成过程中底物的供应。所述编码磷脂 酶A2基因可选自，但不限于PLA2-1如SEQ ID No：85所示，PLA2-2如SEQ ID No： 86所示，PLA2-3如SEQ ID No：87所示，PLA2-4如SEQ ID No：88所示，PLA2-5 如SEQ ID No：89所示，PLA2-6如SEQ ID No：90所示。
优选的，所述编码Δ9去饱和酶基因为解脂耶鲁维亚酵母SCD基因，其核苷 酸序列如SEQ ID No：84所示；
优选的，所述三种编码脂肪酸延长酶的基因分别为拟南芥AtFAE1基因，其 核苷酸序列如SEQ ID No：94所示、非洲芥菜BtFAE1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：95所示、碎米芥CgKCS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：96所示；
优选的，所述编码甘油二酯酰基转移酶基因为解脂耶鲁维亚酵母DGAT1 基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：83所示。
方案三、本发明提供了一种重组酵母菌株，其特征在于，过表达：
(a)一种编码靶向过氧化物酶体的脂肪酸延长酶的基因；
(b)一种编码脂肪酸延长酶的基因；
(c)一种编码靶向内质网的脂肪酸延长酶的基因；
(d)一种编码靶向内质网的甘油二酯酰基转移酶的基因；和/或
(e)一种编码靶向内质网的Δ9去饱和酶基因。
优选的，所述酵母菌株优选为解脂耶鲁维亚酵母；
优选的，所述靶向过氧化物酶体的脂肪酸延长酶基因为带有靶向过氧化物 酶体信号肽编码序列的碎米芥CgKCSPTS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：125 所示；
优选的，所述脂肪酸延长酶基因为高山被孢霉C16/18延长酶基因MaLCE1 基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：93所示；
优选的，所述靶向内质网的脂肪酸延长酶的基因为带有靶向内质网信号肽 编码序列的碎米芥CgKCSER，其核苷选序列如SEQ ID No：121所示；
优选的，所述靶向内质网的甘油二酯酰基转移酶基因为带有靶向内质网信 号肽编码序列的解脂耶鲁维亚酵母DGAT1ER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No： 122所示；
优选的，所述靶向内质网的Δ9去饱和酶基因为带有靶向内质网信号肽编码 序列的解脂耶鲁维亚酵母SCDER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：123所示。
方案四、本发明提供了一种重组酵母菌株，其特征在于，过表达：
(a)一种编码Δ9去饱和酶的基因；
(b)一种编码脂肪酸延长酶的基因；
(c)一种编码靶向内质网的脂肪酸延长酶的基因；和/或
(d)一种编码靶向线粒体的脂肪酸延长酶的基因。
优选的，所述酵母菌株优选为解脂耶鲁维亚酵母；
优选的，所述编码Δ9去饱和酶基因为高山被孢霉Δ9脂肪酸去饱和酶 MaOLE2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：102所示；
优选的，所述编码脂肪酸延长酶为羊脂肪酸延长酶6gELOVL6基因，其核 苷酸序列如SEQ ID No：99所示；
优选的，所述编码靶向内质网的脂肪酸延长酶基因为带有靶向内质网信号 肽编码序列的碎米芥CgKCSER，其核苷酸序列如SEQ ID No：121所示；
优选的，所述编码靶向线粒体的脂肪酸延长酶基因为带有靶向线粒体信号 肽编码序列的碎米芥CgKCSMTS，其核苷酸序列如SEQ ID No：127所示。
方案五、本发明提供了一种重组酵母菌株，其特征在于，过表达：
(a)两种编码Δ9去饱和酶的基因；
(b)三种编码脂肪酸延长酶的基因；和/或
(c)一种编码甘油二酯酰基转移酶的基因。
优选的，所述酵母菌株为解脂耶鲁维亚酵母；
优选的，所述两种编码Δ9去饱和酶基因分别为解脂耶鲁维亚酵母SCD基 因，其核苷酸序列如SEQ ID No：84所示；拟南芥AtADS1基因，其核苷酸序列 如SEQ ID No：103所示；或者所述两种编码Δ9去饱和酶基因分别为解脂耶鲁维 亚酵母SCD基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：84所示；拟南芥AtADS2基因， 其核苷酸序列如SEQ ID No：104所示；
优选的，所述三种编码脂肪酸延长酶基因分别为拟南芥AtFAE1基因，其核 苷酸序列如SEQ ID No：94所示；非洲芥菜BtFAE1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：95所示；碎米芥CgKCS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：96所示；
优选的，所述编码甘油二酯酰基转移酶为解脂耶鲁维亚酵母DGAT1如SEQ ID No：83所示。
方案六、本发明提供了一种重组酵母菌株，其特征在于，所述菌株的过氧 化物酶体生物发生因子10的表达被下调，并进一步过表达：
(a)一种编码靶向过氧化物酶体的脂肪酸延长酶的基因；
(b)一种编码脂肪酸延长酶的基因；
(c)一种编码靶向内质网的脂肪酸延长酶的基因；
(d)一种编码靶向内质网的甘油二酯酰基转移酶的基因；和/或
(e)一种编码靶向内质网的Δ9去饱和酶的基因。
所述重组酵母菌株中包括甘油三酯分解模块，具体涉及过氧化物酶体生物 发生因子10基因敲除模块，该基因的敲除可减少长链脂肪酸的分解。
优选的，所述酵母菌株为解脂耶鲁维亚酵母；
优选的，所述表达下调的过氧化物酶体生物发生因子10为pex10基因，其 核苷酸序列如SEQ ID No：120所示；
优选的，所述编码靶向过氧化物酶体的脂肪酸延长酶的基因为带有靶向过 氧化物酶体信号肽编码序列的碎米芥CgKCSPTS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：125所示；
优选的，所述编码脂肪酸延长酶的基因为高山被孢霉C16/18延长酶 MaLCE1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：93所示；
优选的，所述编码靶向内质网的脂肪酸延长酶的基因为带有靶向内质网信 号肽编码序列的碎米芥CgKCSER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：121所示；
优选的，所述编码靶向内质网的甘油二酯酰基转移酶的基因为带有靶向内 质网信号肽编码序列的解脂耶鲁维亚酵母DGAT1ER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：122所示；
优选的，所述编码靶向内质网的Δ9去饱和酶基因为带有靶向内质网信号肽 编码序列的解脂耶鲁维亚酵母SCDER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：123所 示。
优选的，所述酵母为解脂耶鲁维亚酵母。
本发明提供了利用上述方案中构建的任一重组酵母菌株制备微生物油或 神经酸的应用。具体包括，但不限于含有微生物油或神经酸的婴儿代乳品、功 能性食物、医疗食物、医疗营养品、饮食补充剂、药物组合物、动物饲料、和 个人护理产品等。
本发明提供了利用上述技术方案中构建的任一重组酵母菌株制备微生物 油和/或神经酸的方法，具体包括，但不限于微生物的培养、发酵条件的优化及 控制。所述发酵条件的优化包括不同碳源、碳氮比和不同生长时期添加赤藓糖 诱导的优化，所述发酵条件的控制包括，但不限于温度、pH、发酵时间、溶氧、 补料方式等的控制。所述微生物油或/和神经酸的提取工艺包括，但不限于菌株 的分离、破碎以及有机溶剂提取过程。
优选的，所述制备微生物油的方法，包括：
(a)培养本发明方案一、方案二、方案三、方案四、方案五和/或方案六中 所述的任一重组酵母菌株，其中产生包含神经酸的微生物油；以及
(b)回收所述步骤(a)的微生物油。
优选的，所述制备神经酸的方法，包括：
(a)培养本发明方案一、方案二、方案三、方案四、方案五和/或方案六中 所述的任一重组酵母菌株，产生微生物油；以及
(b)回收所述步骤(a)的微生物油，提取神经酸。
菌种保藏
本发明的解脂亚罗酵母(解脂耶鲁维亚酵母)Yarrowia lipolytica(与保藏名 称相同)已于2018年01月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCC No.15309。
相比现有技术，本发明的有益效果：本发明所述方法涉及神经酸合成系统 的代谢通路和发酵调控，获得优质的重组耶鲁维亚酵母菌株，微生物油的产量 提高，制备得到神经酸的含量占总脂肪酸含量的39.6％，神经酸的浓度为16g/L， 具有良好的工业应用前景。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为本发明实施例提供的神经酸合成策略图。
图2为本发明实施例提供的PCR鉴定酵母转化子。
A：构建菌株YL1时不同转化子的CgKCS基因的PCR验证结果。B：构建菌 株YL2时不同转化子的MaLCE1基因的PCR验证结果。C：构建菌株YL2-1时不 同转化子的CgKCS基因的PCR验证结果。D：构建菌株YL2-2时不同转化子的BtFAE1基因的PCR验证结果。E：构建菌株YL2-3时不同转化子的CgKCS基因 的PCR验证结果。F：构建菌株YL2-4时不同转化子的ScZwf基因的PCR验证结 果。G：构建菌株YL3时不同转化子的CgKCS基因的PCR验证结果。H：构建菌株YL4-1时不同转化子的PLA2-1基因的PCR验证结果。I：构建菌株YL4-2时不 同转化子的PLA2-2基因的PCR验证结果。J：构建菌株YL4-3时不同转化子的 PLA2-3基因的PCR验证结果。K：构建菌株YL4-4时不同转化子的PLA2-4基因 的PCR验证结果。L：构建菌株YL4-5时不同转化子的PLA2-5基因的PCR验证 结果。M：构建菌株YL4-6时不同转化子的PLA2-6基因的PCR验证结果。N：构 建菌株YL5时不同转化子的gELOVL6基因的PCR验证结果。O：构建菌株YL6 时不同转化子的CgKCS基因的PCR验证结果。P：构建菌株YL7时不同转化子的 AtADS1基因的PCR验证结果。Q：构建菌株YL8时不同转化子的AtADS2基因的 PCR验证结果。R：构建菌株YL9时不同转化子的pex10基因的PCR验证结果。S： 构建菌株YL10时不同转化子的CgKCS基因的PCR验证结果。T：构建菌株YL11 时不同转化子的DGAT1基因的PCR验证结果。
图3为本发明实施例提供的YL2-3菌株中6种基因表达验证图。
图4为本发明实施例提供的应用TLC法分析神经酸在TAG中的位置特异 性。
图5为本发明实施例提供的脂肪酸组分分析图。
图6为本发明实施例提供的摇瓶发酵条件下YL2-3菌株的生长曲线。
图7为本发明实施例提供的摇瓶发酵条件下不同菌株神经酸的含量图。
图8为本发明实施例提供的Po1g和YL2-4菌株中的细胞内醛水平。
图9为本发明实施例提供的发酵罐放大发酵条件下YL2-3菌株的脂肪酸组 分。
具体实施方式
如下为本发明中所涉及术语的定义。
去饱和酶是指可以在一种或多种脂肪酸中去饱和(即引入双键)而产生所 关注的脂肪酸或前体的多肽，使用Δ-系统从底物的羧基端计数来表示去饱和酶 的活性。优选的，本发明所述去饱和酶为Δ9去饱和酶，它在分子羧基末端编号 为9th和10th的碳原子之间去饱和脂肪酸，例如可催化底物脂肪酸硬脂酸(C18:0) 生成油酸(C18:1)。
脂肪酸延长酶是指能延长脂肪酸碳链从而产生比该延长酶作用于其上的 脂肪酸底物长2个碳原子的酸的多肽。优选的，本发明所述脂肪酸延长酶包括， 但不限于C16/18延长酶、C18/20延伸酶、C20/22延伸酶和C22/24延伸酶。通常， C16/18延长酶将利用C16底物，如高山被孢霉C16/18延长酶基因MaLCE1、羊脂 肪酸延长酶6基因gELOVL6。一些延长酶具有广泛的特异性并因而单个延长酶 可以催化几种延伸酶反应，如碎米芥CgKCS不仅对C18和C20脂肪酸具有底物特 异性，而且可以继续以C22脂肪酸为底物，因此CgKCS具有C18/20、C20/22和 C22/24延伸酶的活性。
甘油二酯酰基转移酶是催化三酰基甘油酯(TAG)合成最后一步反应的酶， 也是TAG合成过程中唯一的关键酶和限速酶，提高酵母细胞中甘油二酯酰基转 移酶的表达量可以提高细胞内油脂的含量。
内质网、过氧化物酶体以及线粒体是指普遍存在于所有真核细胞中的细胞 器。酶靶向内质网、过氧化物酶体、线粒体进行表达，需要在相应基因的3'末 端添加内质网滞留信号肽KDEL、过氧化物酶体靶向信号肽SKL和线粒体靶向 信号肽CoxIV(MLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRYLL)。
过氧化物酶体生物合成因子蛋白即过氧化物酶体蛋白、Pex蛋白，是指涉 及过氧化物酶体生物合成的和/或参与通过ATP水解使细胞蛋白穿过过氧化物 酶体膜的过程的蛋白。
表达盒是指包含如下序列的DNA片段：所选基因的编码序列和所选基因产 物表达所需的位于编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的 调控序列。表达盒通常包含于载体中以有利于克隆和转化。可以将不同表达盒 转化进包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞在内的不同生物体中，只要能针 对每种宿主使用正确的调控序列。表达盒通常由如下序列构成：
1)一种启动子序列，如GPAT、TEF1、EXP1、EYK1和GPD等；
2)一种编码序列；和
3)一种3’不翻译区域(即，终止子)，它在真核细胞中通常包含聚腺苷酸 位点，如XPR2、LIP1t和PQX3t。
微生物油是指由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定的条件下，利用 碳水化合物、碳氢化合物或普通油脂作为碳源，在菌体内产生的大量油脂，其 主要成分为甘油三酯和游离脂肪酸。优选的，本发明所述微生物油是由解脂耶 鲁维亚酵母发酵产生的，经过代谢通路和发酵工艺的调控，获得优质菌株产微 生物油的能力大大提高，并且制备得到神经酸的量占总脂肪酸含量的39.6％， 其他脂肪酸包括，但不限于棕榈油酸、油酸、亚油酸、十六烷酸、十八烷酸以 及二十四烷酸等。
下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克隆：实验室 手册(Molecular Cloning-ALaboratory Manual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中 所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份 数按重量计算。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中 所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例中使用的标准的重组DNA技术和分子克隆技术是本领域所熟知的(Ausubel，F.M等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssoc.和Wiley-Interscience出版)，适用于微生物生长的材料和方法是本领域熟 知的。主要化学试剂购自KAPA Biosystems，New England Biolabs，TransGen Biotech，ThermoFisher Scientific，OMEGA bio-tek等。
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
本发明实施例提供的神经酸合成策略图见图1。
实施例1、质粒构建
1.1基因元件的克隆
1)基因DGAT1、SCD、PLA2-1、PLA2-2、PLA2-3、PLA2-4、PLA2-5、 PLA2-6、ylGSR和ylGPO的获得：
将解脂耶鲁维亚酵母菌株(菌株号polg，购买自Yeastern Biotech Company, 台湾)在YPD培养基(YPD培养基成分为葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母提 取物10g/L))中进行培养，采用CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide, 十六烷基三甲基溴化铵)法提取高纯度的基因组总DNA。将适量菌体加入液氮 冷冻，研磨成粉，加入适量2×CTAB提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0， 20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2％(w/v)CTAB，40mmol/L巯基乙醇)，65℃ 保温10分钟，间歇摇动。随后加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀， 室温下，12000rpm离心10min，将上清液转入另一离心管中，加入等体积的氯 仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，室温，12000rpm离心10分钟。将上层水相转入新 的离心管中，加入等体积异丙醇混匀，室温放置30分钟。4000rpm离心10分钟， 移去上清液，用70％乙醇漂洗，风干后加入20μl的TE缓冲液(100mM Tris-HCl， 10mM EDTA pH8.0)溶解DNA，-20℃保存备用。采用Sau3AI对总DNA进行部 分酶切，酶切后的DNA片段通过电泳进行纯化，采用胶回收纯化试剂盒回收大 约2～6kb的片段，回收的DNA溶解于10mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)中，置于-20℃ 保藏。
以解脂耶鲁维亚酵母的基因组DNA作为模板，以SEQ ID No：1-20作为引 物序列，采用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶(购自KAPA Biosystems)扩增基 因，分别进行PCR扩增(Polymerase Chain Reaction，又称多聚酶链式反应)。 扩增体系皆为25ul，具体为2×KAPA Mix,12.5ul；10uM引物各0.5ul；模板1ul； 加水补至25ul；扩增条件为：95℃预变性3分钟；98℃变性20秒、60-72℃退火 15秒、72℃延伸，延伸时间按照30秒每kb计算，循环数为29-35；72℃延伸10 分钟。得到各基因序列DGAT1如SEQ ID No：83所示、SCD如SEQ ID No：84所示、PLA2-1如SEQ ID No：85所示、PLA2-2如SEQ ID No：86所示、PLA2-3 如SEQ ID No：87所示、PLA2-4如SEQ ID No：88所示、PLA2-5如SEQ ID No： 89所示、PLA2-6如SEQ ID No：90所示、ylGSR如SEQ ID No：91所示和ylGPO 如SEQ ID No：92所示。
2)编码外源脂肪酸延长酶的基因MaLCE如SEQ ID No：93所示、AtFAE1 如SEQ IDNo：94所示、BtFAE1如SEQ ID No：95所示、CgKCS如SEQ ID No： 96所示、rELO2如SEQ ID No：97所示、CpLCE如SEQ ID No：98所示、gELOVL6 如SEQ ID No：99所示，均有由无锡青兰生物科技有限公司通过基因合成获得。
3)编码外源脂肪酸去饱和酶的基因D9DMB如SEQ ID No：100所示、 CeFAT6如SEQID No：101所示、MaOLE2如SEQ ID No：102所示、AtADS1如 SEQ ID No：103所示、AtADS2如SEQ ID No：104所示、EcAldH如SEQ ID No：105所示和ScZwf如SEQ ID No：106所示，均有由无锡青兰生物科技有限公司 通过基因合成获得。
1.2启动子和终止子元件的克隆
1)GPAT、TEF1、EXP1、EYK1和GPD基因启动子的克隆：
采用上述CTAB法提取解脂耶鲁维亚酵母的基因组DNA，以解脂耶鲁维亚 酵母的基因组DNA作为模板，以SEQ ID No：49-58作为引物序列，采用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶扩增启动子，分别进行PCR扩增。扩增体系皆为25ul， 扩增条件以及扩增体系的用量与上述步骤1)中记载的一致。得到启动子基因 GPAT如SEQ ID No：107所示、TEF1如SEQ ID No：108所示、EXP1如SEQ ID No： 109所示、EYK1如SEQ ID No：110所示和GPD如SEQ ID No：111所示。
2)XPR2、LIP1t和PQX3t终止子的克隆：
与启动子的克隆类似，以解脂耶鲁维亚酵母的基因组DNA为模板，以SEQ ID No：59-64作为引物序列，采用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶扩增终止子， 分别进行PCR扩增。扩增体系皆为25ul，扩增条件以及扩增体系的用量与上述 步骤1)中记载的一致。得到终止子序列XPR2如SEQ ID No：112所示、LIP1t 如SEQ ID No：113所示和PQX3t如SEQ ID No：114所示。
1.3筛选标记基因元件的克隆
1)潮霉素抗性基因的克隆
潮霉素(Hgr)抗性筛选标记基因的获得是以质粒pAG32(购自 EUROSCARF)为模板，以SEQ ID No：65-66作为引物序列，采用KAPA HiFi 高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。扩增体系为25ul，扩增条件以及扩增体系的 用量与上述步骤1)中记载的一致。PCR扩增得到潮霉素(Hgr)抗性筛选标记 基因如SEQ ID No：115所示。
2)亮氨酸合成基因(LEU)和尿嘧啶合成酶关键基因(URA3)的获得
采用上述CTAB法提取解脂耶鲁维亚酵母的基因组DNA，以获得基因组 DNA为模板，以SEQ ID No：67-70作为引物序列，采用KAPA HiFi高保真DNA 聚合酶进行PCR扩增。扩增体系为25ul，扩增条件以及扩增体系的用量与上述 步骤1)中记载的一致。PCR扩增分别得到基因LEU如SEQ ID No：116和基因 URA3如SEQ ID No：117。
1.4DNA同源重组片段的克隆
pex10低表达水平的调控，采用同源替换(Verbeke J,Beopoulos A,NicaudJM.Efficient homologous recombination with short length flanking fragments inKu70deficient Yarrowia lipolytica strains.Biotechnology Letters,2013,35(4):571-576.)的方法对基因进行敲除。根据解脂耶鲁维亚酵母基因组序列，查找 pex10基因的DNA序列，选择目的基因的上下游序列(1000bp左右)。采用CTAB 法提取解脂耶鲁维亚酵母的基因组DNA，以获得基因组DNA为模板，以SEQ ID No：71-78作为引物序列，采用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶，25ul反应体系， PCR扩增分别得到同源重组片段pex10-up如SEQ ID No：118所示和pex10-dow如 SEQ ID No：119所示。
扩增条件为：95℃预变性3分钟；98℃变性20秒、60-72℃退火15秒、72℃ 延伸，延伸时间按照15秒每kb计算，循环数为29-35；72℃延伸6分钟。
1.5质粒的组装构建
所有质粒的构建以质粒pYLEX1(购买自Yeastern Biotech Company,台湾) 为基本骨架，采用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶，25ul反应体系，PCR扩增质 粒基本骨架片段、目的基因、启动子、终止子、筛选标记基因，应用Gibson Assembly方法(Gibson DG.Synthesisof DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlappingoligonucleotides.Nucleic Acids Research.2009,37(20): 6984-6990.)和试剂盒(购自New England Biolabs)将pYLEX1质粒骨架与目的 基因、启动子、终止子和筛选标记基因组装成完整质粒(参见表1)。每个质 粒包含一种筛选标记基因、一至三个目的基因，每个目的基因带有一个启动子 和一个终止子。
以构建pDGAT1质粒为例：
1)以质粒pYLEX1为基本骨架，分别以pYLEX1和解脂耶鲁维亚酵母基因 组DNA为模板，以SEQ ID No：51-52，SEQ ID No：59-60，SEQ ID No：79-80 作为引物序列，PCR扩增质粒骨架片段、TEF启动子片段和XPR2终止子片段， 将三个DNA片段应用Gibson Assembly方法组装在一起，获得质粒 pYLEX1-PTEF1-TXPR2。DNA片段浓度控制在100-200ng每个反应，反应体系为10 微升，装配条件为50℃，1小时。反应结束后，取2微升转化DH5α感受态细胞(购 自TransGen Biotech)，阳性克隆由菌落PCR和DNA测序验证筛选获得。
2)分别以pYLEX1-PTEF1-TXPR2和解脂耶鲁维亚酵母基因组DNA为模板，以 SEQ IDNo：1-2，SEQ ID No：81-82作为引物序列，PCR扩增带有启动子和终 止子的质粒骨架片段和DGAT1基因，将两个DNA片段应用Gibson Assembly方 法组装在一起，得到质粒pYLEX1-PT-DGAT1，记为pDGAT1。
表1所记载质粒的构建与pDGAT1质粒的组装类似，即应用Gibson Assembly方法将目的基因、启动子、终止子和筛选标记基因整合到一个质粒上。 靶向内质网、过氧化物酶体和线粒体中表达的基因，需要在相应基因的3'末端 添加内质网滞留信号肽KDEL、过氧化物酶体靶向信号肽SKL和线粒体靶向信 号肽CoxIV(MLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRYLL)。
表1、本发明构建质粒描述
Figure BDA0001622006610000151
Figure BDA0001622006610000161
Figure BDA0001622006610000171
注：表1中marker为标记。
实施例2、解脂耶鲁维亚酵母工程菌的构建
2.1表达盒的获得
应用NotI内切酶(购自Thermo Fisher Scientific)分别酶切表1所记载的质 粒pDS、pAB、pCgKCS、pCgKCSER pCgKCSPTS、pCgKCSMTS、pCERCMTS、pMCSD、 pCB、pPLA2-1、pPLA2-2、pPLA2-3、pPLA2-4、pPLA2-5、pPLA2-6、pylGSR、 pylGPO、prELO2、pCpLCE、pgELOVL6、pMaKCS、pD9DMB、pCeFAT6、 pMaOLE2、pAtADS1、pAtADS2、pEcAldH、pScZwf和p△pex10。
具体酶切体系为：10×FD Green Buffer,2ul；NotI,1ul；质粒,<1ug；ddH2O 补至20ul。酶切产物利用Cycle Pure Kit(购自OMEGA bio-tek)进行纯化回收， 回收步骤如下：酶切产物加入4-5倍体积buffer CP；混匀后转移至DNA吸附柱， 室温下13,000g离心1分钟；弃滤液并加入700μL DNA洗涤缓冲液，13,000g离心 1分钟；弃滤液重复洗涤一次；弃滤液，将空的吸附柱柱13,000g离心2分钟，干 燥柱子；将吸附柱转移到干净的1.5mL离心管中，加30-50μL洗脱缓冲液，13,000g 离心洗脱DNA。
获得表达盒DGAT1-SCD-Hgr或AtFAE1-BtFAE1-LEU或CgKCS-URA或Cg KCSER-URA或CgKCSPTS-URA或CgKCSMTS-URA、CgKCSER-CgKCSMTS-URA或 MaLCE1-CgKCSER-DGAT1ER-SCDER-URA或CgKCSER-BtFAE1ER-CgKCSPTS-BtF AE1PTS-URA或PLA2-1-URA或PLA2-2-URA或PLA2-3-URA或PLA2-4-URA或P LA2-5-URA或PLA2-6-URA或ylGSR-URA或ylGPO-URA或rELO2-URA或CpL CE-URA或gELOVL6-URA或MaKCS-URA或D9DMB-URA或CeFAT6-URA或M aOLE2-URA或AtADS1-URA或AtADS2-URA或EcAldH-URA或ScZwf-URA或△ pex10-URA。
2.2解脂耶鲁维亚酵母转化
(1)培养。从YPD平板培养基上挑取菌株po1g单菌落，接种于含50ml YPD 培养液的250ml摇瓶(YPD培养基成分为葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取 物10g/L)，28℃培养过夜。将上述培养的菌液接种于含50ml YPD的250ml摇瓶 中，至终浓度为OD600＝0.5，而后于28℃培养至OD600为1.0，约需4h。
(2)转化。取4ml上述细胞，5000rpm离心3min，弃上清，加入1μg线性化 的基因表达盒DNA，分别为DGAT1-SCD-Hgr或AtFAE1-BtFAE1-LEU或 CgKCS-URA或CgKCSER-URA或CgKCSPTS-URA或CgKCSMTS-URA、 CgKCSER-CgKCSMTS-URA或MaLCE1-CgKCSER-DGAT1ER-SCDER-URA或 CgKCSER-BtFAE1ER-CgKCSPTS-BtFAE1PTS-URA或PLA2-1-URA或PLA2-2-URA 或PLA2-3-URA或PLA2-4-URA或PLA2-5-URA或PLA2-6-URA或ylGSR-URA 或ylGPO-URA或rELO2-URA或CpLCE-URA或gELOVL6-URA或MaKCS-URA 或D9DMB-URA或CeFAT6-URA或MaOLE2-URA或AtADS1-URA或 AtADS2-URA或EcAldH-URA或ScZwf-URA或△pex10-URA，同时加入90μl 50％PEG3350，5μl 2M LiAC，5μl 2M DTT，2μl DMSO，2.5μl Salman liner DNA (10mg/ml)，在30℃水浴中孵育1h后涡旋震荡，然后39℃水浴10min，直接取 50μl转化体系的混合液涂布筛选平板。YPD筛选平板分别为Hgr(150μg/ml)、 URA选择缺陷型培养基和LEU选择缺陷型培养基。
2.3工程菌株
从筛选平板上挑取单菌落，利用PCR验证转化结果(图2)，RT-PCR验证 基因表达水平(图3和表2)，筛选阳性转化子，获得工程菌株YL1、YL2、YL2-1、 YL2-2、YL2-3、YL2-4、YL3、YL4-1、YL4-2、YL4-3、YL4-4、YL4-5、YL4-6、 YL6、YL7、YL8和YL11。
PCR验证方法如下：以相应解脂耶鲁维亚酵母转化子的DNA为模板，用相 应的引物进行PCR扩增，扩增体系皆为25ul，具体为2×Taq Mix,12.5ul；10uM 引物各0.5ul；模板1ul；加水补至25ul；扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃ 变性30秒、60-72℃退火30秒、72℃延伸，延伸时间按照1分钟每kb计算，循环 数为30；72℃延伸10分钟，扩增结束后1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
RT-PCR验证基因表达水平方法如下：采用TRizol法抽提上述菌株总RNA， 利用核酸测定仪ND-1000检测浓度，同时1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否降 解。根据各个基因序列，设计Real-time PCR特异引物。检测合格的RNA反转录 成cDNA后进行Real time-PCR。Real time-PCR方法具体步骤见Biotium的
Figure BDA0001622006610000181
Master Mixes for qPCR定量检测试剂盒。Real time-PCR扩增由美国Roche公司生产的Light Cycler 480real-time PCRsystem完成。每个样本做三个 复孔，不同样本重复三次，解脂耶鲁维亚酵母Actin基因作为内参。最后根据2-ΔΔCt方法计算相对表达量。
表2.稳定期不同菌株中基因的表达水平。
Figure BDA0001622006610000191
注：()内数字表示该基因上调的倍数；+表明该基因上调。
菌株YL1由上述可知其是经转化由质粒pDS、pBA和pCgKCS来源的表达盒 DGAT1-SCD-Hgr、AtFAE1-BtFAE1-LEU和CgKCS-URA而获得，即过量表达基 因DGAT1和SCD，过表达外源基因AtFAE1、BtFAE1和CgKCS。
菌株YL2在YL1基础上，经转化由质粒pMCSD来源的表达盒 MaLCE1-CgKCSER-DGAT1ER-SCDER-URA而获得，即菌株YL2在YL1的基础上 进一步过表达基因MaLCE1、CgKCSER、DGAT1ER和SCDER。
菌株YL2-1在YL2基础上，经转化由质粒pCgKCSER来源的表达盒 CgKCSER-URA而获得，即菌株YL2-1在YL2的基础上进一步过表达基因 CgKCSER。
菌株YL2-2在YL2基础上，经转化由质粒pCB来源的表达盒 CgKCSER-BtFAE1ER-CgKCSPTS-BtFAE1PTS-URA而获得，即菌株YL2-2在YL2的 基础上进一步在不同的亚细胞(内质网、过氧化物酶体)中进一步过表达基因 CgKCS和BtFAE1。
菌株YL2-3在YL2基础上，经转化由质粒pMCSD来源的表达盒 MaLCE1-CgKCSER-DGAT1ER-SCDER-URA而获得，即菌株YL2-3在YL2的基础上 进一步过表达基因MaLCE1、CgKCSER、DGAT1ER和SCDER。该菌株保藏于中国 普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.15309。
菌株YL2-4在YL2基础上，经转化由质粒pEcAldH、pScZwf、pylGSR和 pylGPO来源的表达盒EcAldH-URA、ScZwf-URA、ylGSR-URA和ylGPO-URA 而获得，即菌株YL2-4在YL2的基础上进一步过表达基因EcAldH、ScZwf、ylGSR 和ylGPO。
菌株YL3由上述可知其是经转化由质粒pCgKCSPTS和pMCSD来源的表达盒 CgKCSPTS-URA和MaLCE1-CgKCSER-DGAT1ER-SCDER-URA而获得，即过表达 基因CgKCSPTS、MaLCE1、CgKCSER、DGAT1ER和SCDER。
菌株YL4-1在YL1基础上，经转化由质粒pPLA2-1来源的表达盒 PLA2-1-URA而获得，即菌株YL4-1在YL1的基础上进一步过表达基因PLA2-1。
菌株YL4-2在YL1基础上，经转化由质粒pPLA2-2来源的表达盒 PLA2-2-URA而获得，即菌株YL4-2在YL1的基础上进一步过表达基因PLA2-2。
菌株YL4-3在YL1基础上，经转化由质粒pPLA2-3来源的表达盒 PLA2-3-URA而获得，即菌株YL4-3在YL1的基础上进一步过表达基因PLA2-3。
菌株YL4-4在YL1基础上，经转化由质粒pPLA2-4来源的表达盒 PLA2-4-URA而获得，即菌株YL4-4在YL1的基础上进一步过表达基因PLA2-4。
菌株YL4-5在YL1基础上，经转化由质粒pPLA2-5来源的表达盒 PLA2-5-URA而获得，即菌株YL4-5在YL1的基础上进一步过表达基因PLA2-5。
菌株YL4-6在YL1基础上，经转化由质粒pPLA2-6来源的表达盒 PLA2-6-URA而获得，即菌株YL4-6在YL1的基础上进一步过表达基因PLA2-6。
菌株YL5其是经转化由质粒pgELOVL6和pMaOLE2来源的表达盒 gELOVL6-URA和MaOLE2-URA而获得，即过表达外源基因gELOVL6和 MaOLE2。
菌株YL6在YL5基础上，经转化由质粒pCERCMTS来源的表达盒 CgKCSER-CgKCSMTS-URA而获得，即菌株YL6在YL5的基础上进一步过表达基 因CgKCSER和CgKCSMTS。
菌株YL7在YL1基础上，经转化由质粒pAtADS1来源的表达盒 AtADS1-URA而获得，即菌株YL7在YL1的基础上进一步过表达基因AtADS1。
菌株YL8在YL1基础上，经转化由质粒pAtADS2来源的表达盒 AtADS2-URA而获得，即菌株YL8在YL1的基础上进一步过表达基因AtADS2。
菌株YL9由上述可知其是经转化由质粒pΔpex10来源的表达盒Δpex10-URA 而获得，即敲除基因pex10。
菌株YL10在YL9基础上，经转化由质粒pCgKCSPTS来源的表达盒 CgKCSPTS-URA而获得，即菌株YL10在YL9的基础上进一步过表达基因 CgKCSPTS。
菌株YL11在YL10基础上，经转化由质粒pMCSD来源的表达盒 MaLCE1-CgKCSER-DGAT1ER-SCDER-URA而获得，即菌株YL11在YL10的基础 上进一步过表达基因MaLCE1、CgKCSER、DGAT1ER和SCDER。
实施例3、菌种培养生产神经酸
3.1菌种摇瓶培养及诱导调控
a.在YPD固体平板上分别活化菌株po1g和YL2-3，28℃培养1天。挑取单菌 落分别接种于装有50ml YPD培养基的250ml摇瓶，28℃培养1天，作为种子培养 液。将种子培养液分别接种于含50ml YNB培养基的250ml摇瓶，使其起始OD600为0.2，28℃培养6天，待用。
其中，YNB培养基的组成为YNB1.7g/L，葡萄糖80g/L，酵母提取物1.5g/L， 尿嘧啶20mg/L，亮氨酸100mg/L。
b.上述方法培养好的种子培养液，分别接种于含50ml诱导培养基的250ml 摇瓶，使其起始OD600为0.2，28℃培养6天，待用。
其中，诱导培养基为含10g/L葡萄糖的YNB，培养1d后待葡萄糖基本消耗 完全，再补加赤藓糖醇作为碳源，再培养2d继续补加葡萄糖。
3.2菌种发酵罐培养(以菌株YL2-3为例)
将上述获得的菌株YL2-3活化后作为种子液，在5L发酵罐中加入3L培养基 YNBF，发酵控制溶氧大于20％(生长期：0-48h)和0-5％(稳定期)。发酵过 程中pH值恒定地控制在5.5，直到发酵结束。控制温度为28℃培养6天。
其中，YNBF培养基的成分为3.4g/L无氨基酸和硫酸铵的酵母氮源，150g/L 葡萄糖，2g/L酵母提取物和8.8g/L硫酸铵。接种量为10％。
3.3微生物油脂的提取
取上述获得的5ml培养液，离心，1g湿菌体加入4mol/L盐酸10mL，振荡均 匀，室温放置30min-1h；沸水浴6-8min，立即放于-20℃速冷30min；然后加入 氯仿-甲醇(1:1，v/v)20mL充分混合，4000r/min离心10min；分离下层氯仿并 称量体积，加入等体积浓度为0.15％的氯化钠，4000r/min离心10min；将下层氯 仿层收集转移到锥形瓶中，70℃干燥2h冷却称重计算微生物油脂的产量，待GC 分析用。
3.4微生物油脂中神经酸的位置特异性分析
利用上述酸热法提取出发菌株和工程菌株发酵培养6d的总脂。采用脂肪酶 消化法检测神经酸在TAG中的位置。具体步骤如下：在3ml甲醇溶液中加入10mg 油脂和10mg固定化的1,3位专一性脂肪酶，30℃反应8h。脂肪酸甲酯和2-MAG 经TLC板进行纯化，气相检测显示只在游离脂肪酸层中存在神经酸，即神经酸 位于TAG的sn-1,3位(图4)。
3.5神经酸占总脂肪酸含量的测定
微生物称重后，在玻璃管中添加2.6ml的甲醇：硫酸＝98：2溶液，并在85℃ 中反应3h。之后在冰箱内冷却，添加lml饱和NaCl和lml正己烷。震荡后进行高 速离心(5000rpm)，进行5min。吸取上清，并用有机溶剂滤膜进行过滤，添 加到气相色谱小瓶中。
神经酸甲酯含量测定应用GC方法测定。使用Agilent7890B-GC仪器，色谱 柱为HP-5(30m×0.32mm×0.25μm)。进样温度：250℃；检测器温度：250℃； 进样体积：1μL；起始柱温为140℃，保持1min，以10℃/min升温至180℃，保持 2min，5℃/min升温至210℃，保持4min，5℃/min升温至250℃，保持4min。
在上述升温条件下，GC检测的神经酸甲酯出峰时间为23.775min(图5)。 在摇瓶培养条件下，菌株YL1、YL2、YL2-1、YL2-2、YL2-3、YL2-4、YL3、 YL4-1、YL4-2、YL4-3、YL4-4、YL4-5、YL4-6、YL6、YL7、YL8和YL11的 神经酸含量占总脂肪酸含量的百分比分别为2.40％、11.09％、10.66％、11.90％、 17.57％、15.12％、9.63％、4.02％、4.36％、4.62％、4.57％、4.82％、4.19％、8.62％、 8.12％、9.12％和11.12％(图7)。17株菌摇瓶批次培养的OD600(以YL2-3为例， 如图6)、生物量和油脂含量相差不大，生物量在20g/L左右，油脂含量约在8.2g/L。在发酵罐培养条件下，菌株YL2-3的最大神经酸含量占总脂肪酸含量的 30.6％，最大生物量为82.6g/L。菌株YL2-3中其他脂肪酸的含量占油脂的比例分 别为：C16:0为5.3％，C16:1为10.9％，C18:0为1.5％，C18:1为28.7％，C18:2为 9.1％，C24:0为2.8％。
3.6细胞内醛水平的测定
为了验证氧化还原平衡的调控，对菌株中的反应性醛物质进行定量分析， 步骤如下：通过冷冻离心机收集po1g和YL2-4细胞沉淀并重悬于PBS缓冲液中。 在振荡器上使酵母沉淀物均质化，在4℃下离心，取上清。根据Sigma的荧光醛 测定试剂盒(MAK141-1KT)所述的说明从上清液中测量细胞内活性醛。结果 发现：相比po1g菌株，YL2-4菌株中的总脂含量提高了2.5倍，活性醛的量明显 减少，其中在50h时，YL2-4菌株中活性醛的量比po1g菌株下降了大约4倍(图8)。
实施例4、神经酸发酵
根据上述的优化结果，将菌株YL2-3在500L发酵罐中进行放大。活化后的 种子液按3％的接种量进行接种，培养温度为28℃，通气量5-8L/min，搅拌转速 为300r/min，发酵pH(5.5)用3M的NaOH溶液调节。一共进行3批发酵，结果 发现菌株YL2-3的生物量平均为126.56g/L，神经酸含量占总脂肪酸含量的 39.6％，油脂含量约在39.3g/L。其他脂肪酸的含量占总脂肪酸含量的比例分别 为：C16:0为4.3％，C16:1为7.9％，C18:0为3.5％，C18:1为25.7％，C18:2为4.9％，C24:0为4.8％(图9)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 生产神经酸的重组酵母菌株及其应用
<130> P2018-0643
<160> 127
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
actttttgca gtactaaccg cagactatcg actcacaata ctac 44
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gcaagaccgg caacgtgggg ttactcaatc attcggaact c 41
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
catagcacgc gtgtagatac ctaagcagcc atgccagaca tac 43
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gaattaaaca cacatcaaca atggtgaaaa acgtggacca ag 42
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
actttttgca gtactaaccg cagatgagaa tctctctact ttgtg 45
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
gcaagaccgg caacgtgggg tcagttgtag cagtaattgc 40
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
actttttgca gtactaaccg cagatgcaat tacggttgat tttg 44
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
gcaagaccgg caacgtgggg ttagttaaaa cagtagcggt tg 42
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
actttttgca gtactaaccg cagatgaaat tctctccact tttgc 45
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
gcaagaccgg caacgtgggg ttacataaga agagcggcaa aac 43
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
actttttgca gtactaaccg cagatgaagt tctcggctac cattc 45
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
gcaagaccgg caacgtgggg ttagttgtaa cagtagtcgg ag 42
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
actttttgca gtactaaccg cagatcgcaa acttcctgct gcttc 45
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
gcaagaccgg caacgtgggg ttaaccagag tactgatagc agtattcc 48
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
actttttgca gtactaaccg cagatgcagt ttacgccctt attc 44
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
gcaagaccgg caacgtgggg tcatttactt gaatcaacac aatatc 46
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
actttttgca gtactaaccg caggcttcta tcccccatta 40
<210> 18
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
gcaagaccgg caacgtgggg ctatctcatg gtcaccagct cct 43
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
actttttgca gtactaaccg cagtccgccg agaaaaccaa 40
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
gcaagaccgg caacgtgggg ttagggcttt ttgaggaggg tc 42
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
gaattaaaca cacatcaaca atggagtctg gacctatgcc 40
<210> 22
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
catagcacgc gtgtagatac ctactgggcc tttttttgag c 41
<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
catagcacgc gtgtagatac ttaagatcgg ccgttctgca c 41
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
gaattaaaca cacatcaaca atgacctctg tgaacgtgaa g 41
<210> 25
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
actttttgca gtactaaccg cagacctctg tgaacgtgaa gctg 44
<210> 26
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
gcaagaccgg caacgtgggg ttaagatcgg ccgttctgca c 41
<210> 27
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
actttttgca gtactaaccg cagacctcta tcaacgtgaa gctg 44
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
gcaagaccgg caacgtgggg ttaagatcgg ccgttttggg 40
<210> 29
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
actttttgca gtactaaccg cagaacatgt ctgtgctgac cctg 44
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
gcaagaccgg caacgtgggg ttactcggcc ttggtggcct 40
<210> 31
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
actttttgca gtactaaccg cagatcatca agaacaacaa caacggc 47
<210> 32
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
gcaagaccgg caacgtgggg ttagtctcgc ttggtgggct tc 42
<210> 33
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
actttttgca gtactaaccg cagtctgtgc tgaccctgca gga 43
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
gcaagaccgg caacgtgggg ttagtcggcc ttggtggcct 40
<210> 35
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 35
actttttgca gtactaaccg cagtcctccg tggtcgagac ctg 43
<210> 36
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 36
gcaagaccgg caacgtgggg ttaacccaga ataccctcag agtcag 46
<210> 37
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
actttttgca gtactaaccg cagaccgtca agacccgatc caac 44
<210> 38
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 38
gcaagaccgg caacgtgggg ttacataata gatttacctc gctggatgtc 50
<210> 39
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 39
actttttgca gtactaaccg caggccaccc ccctgcctcc tac 43
<210> 40
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 40
gcaagaccgg caacgtgggg ttactcctcc ttagagtggt cgccg 45
<210> 41
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 41
actttttgca gtactaaccg cagtctctgt ctgcctctga gaag 44
<210> 42
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 42
gcaagaccgg caacgtgggg ttatcggacc atggccattc 40
<210> 43
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 43
actttttgca gtactaaccg cagtctgtga cctctaccgt ggag 44
<210> 44
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 44
gcaagaccgg caacgtgggg tcatctcacg atggccattc 40
<210> 45
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 45
actttttgca gtactaaccg cagaattttc atcatctggc ttac 44
<210> 46
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 46
gcaagaccgg caacgtgggg tcaggcctcc aggcttatcc ag 42
<210> 47
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 47
actttttgca gtactaaccg cagagtgaag gccccgtcaa 40
<210> 48
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 48
gcaagaccgg caacgtgggg ctaattatcc ttcgtatctt ctg 43
<210> 49
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 49
tctcaagggc atcggtcgac caacttttct tgtcgacctg 40
<210> 50
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 50
cacgctccat ttagcgtgtc gtgtttttgt tg 32
<210> 51
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 51
tctcaagggc atcggtcgac agagaccggg ttggcggcgc 40
<210> 52
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 52
caacgtgggg ctgcggttag tactgcaaaa agtgctggtc g 41
<210> 53
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 53
tctcaagggc atcggtcgac aaggagtttg gcgcccgttt 40
<210> 54
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 54
cacgctccat tgctgtagat atgtcttgtg tgtaagg 37
<210> 55
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 55
tctcaagggc atcggtcgac tttgtgcaag tgtgtgtgt 39
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 56
cacgctccat agtagatgtg taagtgtgta 30
<210> 57
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 57
tctcaagggc atcggtcgac cgcagtagga tgtcctgcac 40
<210> 58
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 58
gtgtagatac tgttgatgtg tgtttaattc aagaatgaat atagag 46
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 59
ctaaccgcag ccccacgttg ccggtcttgc 30
<210> 60
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 60
gctgtcaaac atgagaattc ggacacgggc atctcacttg c 41
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 61
cacatcaaca gtatctacac gcgtgctatg 30
<210> 62
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 62
gctgtcaaac atgagaattc ctaccttgct cgaatgactt attg 44
<210> 63
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 63
atctacagca atggagcgtg tgttctgagt c 31
<210> 64
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 64
gctgtcaaac atgagaattc atttcttgac ctcatcaa 38
<210> 65
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 65
ctcacatcac atccgaacat aaacaaccat gaaaaagcct gaactcacc 49
<210> 66
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 66
acaagaatct ttttattgtc agtactgact attcctttgc cctcggac 48
<210> 67
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 67
tacaaccaca cacatccaca atggaacccg aaactaagaa g 41
<210> 68
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 68
agggcccttt ttatagagtc ttatacacta gcggaccctg 40
<210> 69
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 69
tacaaccaca cacatccaca atgccctcct acgaagctcg 40
<210> 70
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 70
agggcccttt ttatagagtc ctaacagtta atcttctggt aagcctcc 48
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 71
aattccgtcg tcgcctgagt c 21
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 72
gtcgaccgat gcccttgaga g 21
<210> 73
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 73
tctcaagggc atcggtcgac cccggggtgg taatcgaccg actaac 46
<210> 74
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 74
actcaggcga cgacggaatt tgacgaggtc tggatggaag g 41
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 75
gatctcggca gtctctcgga tg 22
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 76
tgttcggaaa tcaacggatg 20
<210> 77
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 77
catccgttga tttccgaaca tttgagccga ggcagatttg 40
<210> 78
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 78
tccgagagac tgccgagatc cccgggtcag agagaaggac tatggag 47
<210> 79
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 79
gaattctcat gtttgacagc ttatcatcga tgataagc 38
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 80
gtcgaccgat gcccttgaga g 21
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 81
ccccacgttg ccggtcttgc 20
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 82
ctgcggttag tactgcaaaa ag 22
<210> 83
<211> 1545
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 83
atgactatcg actcacaata ctacaagtcg cgagacaaaa acgacacggc acccaaaatc 60
gcgggaatcc gatatgcccc gctatcgaca ccattactca accgatgtga gaccttctct 120
ctggtctggc acattttcag cattcccact ttcctcacaa ttttcatgct atgctgcgca 180
attccactgc tctggccatt tgtgattgcg tatgtagtgt acgctgttaa agacgactcc 240
ccgtccaacg gaggagtggt caagcgatac tcgcctattt caagaaactt cttcatctgg 300
aagctctttg gccgctactt ccccataact ctgcacaaga cggtggatct ggagcccacg 360
cacacatact accctctgga cgtccaggag tatcacctga ttgctgagag atactggccg 420
cagaacaagt acctccgagc aatcatctcc accatcgagt actttctgcc cgccttcatg 480
aaacggtctc tttctatcaa cgagcaggag cagcctgccg agcgagatcc tctcctgtct 540
cccgtttctc ccagctctcc gggttctcaa cctgacaagt ggattaacca cgacagcaga 600
tatagccgtg gagaatcatc tggctccaac ggccacgcct cgggctccga acttaacggc 660
aacggcaaca atggcaccac taaccgacga cctttgtcgt ccgcctctgc tggctccact 720
gcatctgatt ccacgcttct taacgggtcc ctcaactcct acgccaacca gatcattggc 780
gaaaacgacc cacagctgtc gcccacaaaa ctcaagccca ctggcagaaa atacatcttc 840
ggctaccacc cccacggcat tatcggcatg ggagcctttg gtggaattgc caccgaggga 900
gctggatggt ccaagctctt tccgggcatc cctgtttctc ttatgactct caccaacaac 960
ttccgagtgc ctctctacag agagtacctc atgagtctgg gagtcgcttc tgtctccaag 1020
aagtcctgca aggccctcct caagcgaaac cagtctatct gcattgtcgt tggtggagca 1080
caggaaagtc ttctggccag acccggtgtc atggacctgg tgctactcaa gcgaaagggt 1140
tttgttcgac ttggtatgga ggtcggaaat gtcgcccttg ttcccatcat ggcctttggt 1200
gagaacgacc tctatgacca ggttagcaac gacaagtcgt ccaagctgta ccgattccag 1260
cagtttgtca agaacttcct tggattcacc cttcctttga tgcatgcccg aggcgtcttc 1320
aactacgatg tcggtcttgt cccctacagg cgacccgtca acattgtggt tggttccccc 1380
attgacttgc cttatctccc acaccccacc gacgaagaag tgtccgaata ccacgaccga 1440
tacatcgccg agctgcagcg aatctacaac gagcacaagg atgaatattt catcgattgg 1500
accgaggagg gcaaaggagc cccagagttc cgaatgattg agtaa 1545
<210> 84
<211> 1449
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 84
atggtgaaaa acgtggacca agtggatctc tcgcaggtcg acaccattgc ctccggccga 60
gatgtcaact acaaggtcaa gtacacctcc ggcgttaaga tgagccaggg cgcctacgac 120
gacaagggcc gccacatttc cgagcagccc ttcacctggg ccaactggca ccagcacatc 180
aactggctca acttcattct ggtgattgcg ctgcctctgt cgtcctttgc tgccgctccc 240
ttcgtctcct tcaactggaa gaccgccgcg tttgctgtcg gctattacat gtgcaccggt 300
ctcggtatca ccgccggcta ccaccgaatg tgggcccatc gagcctacaa ggccgctctg 360
cccgttcgaa tcatccttgc tctgtttgga ggaggagctg tcgagggctc catccgatgg 420
tgggcctcgt ctcaccgagt ccaccaccga tggaccgact ccaacaagga cccttacgac 480
gcccgaaagg gattctggtt ctcccacttt ggctggatgc tgcttgtgcc caaccccaag 540
aacaagggcc gaactgacat ttctgacctc aacaacgact gggttgtccg actccagcac 600
aagtactacg tttacgttct cgtcttcatg gccattgttc tgcccaccct cgtctgtggc 660
tttggctggg gcgactggaa gggaggtctt gtctacgccg gtatcatgcg atacaccttt 720
gtgcagcagg tgactttctg tgtcaactcc cttgcccact ggattggaga gcagcccttc 780
gacgaccgac gaactccccg agaccacgct cttaccgccc tggtcacctt tggagagggc 840
taccacaact tccaccacga gttcccctcg gactaccgaa acgccctcat ctggtaccag 900
tacgacccca ccaagtggct catctggacc ctcaagcagg ttggtctcgc ctgggacctc 960
cagaccttct cccagaacgc catcgagcag ggtctcgtgc agcagcgaca gaagaagctg 1020
gacaagtggc gaaacaacct caactggggt atccccattg agcagctgcc tgtcattgag 1080
tttgaggagt tccaagagca ggccaagacc cgagatctgg ttctcatttc tggcattgtc 1140
cacgacgtgt ctgcctttgt cgagcaccac cctggtggaa aggccctcat tatgagcgcc 1200
gtcggcaagg acggtaccgc tgtcttcaac ggaggtgtct accgacactc caacgctggc 1260
cacaacctgc ttgccaccat gcgagtttcg gtcattcgag gcggcatgga ggttgaggtg 1320
tggaagactg cccagaacga aaagaaggac cagaacattg tctccgatga gagtggaaac 1380
cgaatccacc gagctggtct ccaggccacc cgggtcgaga accccggtat gtctggcatg 1440
gctgcttag 1449
<210> 85
<211> 1647
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 85
atgagaatct ctctactttg tgttgcaact ctttgcagct ctgtcttggc cctctacaca 60
ccccaacgtg gaacatgtcc ttcttcacct ctacttcgac aagccaaggg acttcaaagc 120
gatgaagcag agtacatgtc cagccgtcgg aacaagacca aacctgcctt gagtaccttt 180
ctgaaaaagc aaaacattga caatttcgat gtcgattcct tcctcgaacg ggcgtccccc 240
aagttggctg tggctgccgc tggaggaggc ctgagagcca cttatatggg catgggtaca 300
ttccaggcac tcgacaaccg aacagagaac tccactcttg ccggttacct ccaggccgtc 360
gactacatgt cgggattgtc tgggggttcg tggctagtag gctacctagc tatcaacgat 420
tatccagatt tccagactct tttccacgcg tttgacggca ttttcaatct tccaggatcc 480
atgggaactc tgggaatgct agctaaagtg ttcattgact cccttcagaa actcaaggct 540
ggttatcaga cgtcggtcac tgaccagtgg ggaagactta tctacctgtt gttgggcaac 600
gctgggctgc taaaagcaga ttttaattgg tcggacatcc gaaatctgac ctccttcaca 660
tctcatgaaa tgcccttccc catcattctt ggtaccactg tttttcccgg ctcttctttc 720
gacgtggagt acataaccta taacaactcg atcatggaaa tgactccata tgagttcgga 780
acatgggaca aaaacatccg ggagttcatc gacatgcagt atctgggcac tgaaatggaa 840
aacggcaccc ccgtgggtga atgtaccacc aattacgaca acgccggcct tctgatgggc 900
atttcttcca acgtgttcaa tgcgggtcta gacggacttg gaatcgacgg aatttttgga 960
atcttggtcg aagatcttat gaaactgctg gaaatcatca acgacgcctc ttaccgcctc 1020
ggtgtcattt ctcctaaccc gttctacaag caggatgaca ttccttcgaa ccagaccatc 1080
tccagaggtc tactagtgtg tgacggaggc tttgatctcg aaactatccc catcctgccc 1140
tttttgcaac ccgaacgaga agttgatgtt gtcatctcca tggatccttc tctagacagc 1200
cccgagggat ggcccactgg agaatgtatc agacataccg cagccaaaag tcaatgggag 1260
tttggagagg gagtgttccc ccagattccc gacaatgtca ccttcatcaa cgacaacctc 1320
accaccaagc ctgtcttctt tggttgcaac atcaccaacc tgaagaagta cgataacacc 1380
gacagatact ctccggtcat cgtctacgta cccatgcaca acatttccta cgtgtccaac 1440
ttctccactg gaaagctctt gtataccaag gaggaaagct tcggaaccgt caacaatgcg 1500
tacaacatga tgacaaggac aaacttgacc gaagatgaag aatggggcaa atgcctaggt 1560
tgcgtttcca ttctccgaga gctgcagaga ttgaatgaga ccgtgccgga ttgtgagagg 1620
tgtttcagca attactgcta caactga 1647
<210> 86
<211> 1653
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 86
atgcaattac ggttgatttt gacggcattt gcctctttgg caattgcaga ctacactcct 60
gtgcgagttc catgtccctc caccaatctt acgcgtcctg ccattggact gaatcctgac 120
gaatctgctt acattgagca gcgacatacc aagaccagag aaagcctcaa gacatttctg 180
aagactctag aaagttcctc ttttgatgtt gatgcctttc tgaatgagag gtctcccaag 240
atcgccgttg caattgctgg aggaggagta agagcttctc tgtttggagc cggagttttg 300
gctggtctgg atggtcgagt ttcccaaaac ggtaccgggg gtctgcttca ggcaacagac 360
tacatttctg gtctttctgg gggctcctgg cttgttggac tgctctgttt gtctgactgg 420
atagccgctg accagctagt tggaatgagc gagaaaatga agttcccagg catgcttgac 480
acttttggca tgatgctcaa gattctcaca gacaccatgg ctaagaaaaa ggccggctac 540
cagacatccg tggttgatca gtggggcaga ctgttccatt ttgtgactgc cgaagctggt 600
ttgaactaca cggatccgac atggagtgga attcgcaacc tgagctcgtt cctggacttc 660
tccatgccct ttcctataat cacctcaact tctttatttc caggaacctc gtttgacgtc 720
acccatatcg actatatcaa ccccatggtt gaaatgacac ccttcgagtt cggaagctgg 780
gacagaaact tccgttactt cgctgacact gtgtttctgg gcacggagat ggaagacgcg 840
aagcccctga atcagtgtgt gcgtaattac gacaatcacg gtctattcct gggttcttca 900
ggtggaatct tcaatgctga cgtgatcggc ggatttgaaa tgaaaggctt acatgcgata 960
tttttgtctg gagtcttgga gtatcttgat cttgtcaacg aaggtgagtt ccgagtagga 1020
cttattcaga accccttcta caagatggca catctagtct ccaaccagac aatctccagg 1080
ttcatgtact tgtgcgatgg agggtttgag aagcaacaaa acattccttt gcttcctttt 1140
cttcagcctg aacgagaaat agatcttctc tttgccactg atccatcaac agatactatg 1200
gatggtcatg gatggcccaa tggagcttct ctgagacaca caaaggagaa gagtgacctg 1260
gagtttggca aaggaattta ccctgaaatt cccgaggagg acgagtactt gagcagaaac 1320
ttgtccatgc aacctgcctt ctttggctgc gatatcgctt ctctgaaaca gtacaacaat 1380
acgcaacggt atgcccctgt gattgtcaac attcccatgg gaaacctgac gtatgcttcg 1440
aatttctcga ctggtaagtt cttttacact catgaagaaa cccagggaac ctatttgaat 1500
gcctacaata tggccactag gtccaacttg accgaggacg agaattggaa cgtgtgtcta 1560
gggtgcgtat cactgttgcg cgaatttcag agacggtcca gtgaaatccc cgaccaatgt 1620
cagacctgct tcaaccgcta ctgttttaac taa 1653
<210> 87
<211> 1917
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 87
atgaaattct ctccactttt gctggcgacc gtgggtctgg cccagagctt ctattcgccc 60
accgactcgt acgcgcccgg gtcggtcgac tgtccctcca actccaccca gattgtgcga 120
aagggcgagg gcctttcttc gcaggaacga gagtgggtcc agaaccgaca cgaacagacc 180
cgaccggagc tgctcaacta cctgaaacgg gtgggcttta agtcggtgga cccggaccag 240
ttcctgggcc aggacactaa tatcaccatc ggactgtcct tttctggagg aggatacaga 300
gccatgttgg cgggagcagg ccaatttgcg gctctggacg cgcgaacacc caacgccacc 360
gaaccgggcc atgtgggagg tctggtccag gccgccacct atctggtggg tctttcgggc 420
ggaaactgga tggtgggatc tgtggtcatc aacaacttca ccaccattcc cgacctgcaa 480
cactcgtccg acgtgtggga cctggaacac tccatgatca accccggcgg aatcaacatc 540
ttcaagaccg gctcttattg ggacgacatc aacgacgacg tcaacgacaa gcagcacgcc 600
ggatacaaca cctctttcac cgacatctgg ggccgaggtc tgtcgtacca gttcttcaac 660
gcttccaaca ccgcccgact cacctggtcc gagatccaga actacgacca cttcaagaac 720
cactctatgc cctaccccat tgttgtggcc gacggccgag cccccggaac ccgaatcatc 780
tccggaaact ccaccatttt cgagctggcc ccgttcgagg tcggctcctg ggaccccaat 840
gtctactcct ttgccaagac cgagtggctg ggaaccaaca tgaccaacgg ccgacccaac 900
ggaacctgtg tgcatggctt tgacaacgcc ggtttcattg tgggaacctc ttcttccctg 960
ttcaaccagt tcattctcca gctcaactcc accggagtaa ccggagtggt ctacgacctg 1020
gcccactcta tcctcaagcg tctggataag gactcggacg atatcgccat ctactcgccc 1080
aaccccttca agggcatgtc ctacctcggc aactcgtcca ttgcccaaac cgagtatctg 1140
gatctggtcg acggaggaga agatggacag aatgtgccct actaccctct gctgcagccc 1200
gagagagccg tcgacgtggt catctcctac gacaactccg ccgacaccga ctttaactgg 1260
cccaacggaa cctccgctgt ccagacatac cgacgacagt ttgagaacca ggccaatggc 1320
accattttcc cctacgtgcc cgacgtgaac acattcatca atgagaacct gacttctcga 1380
cccgccttct ttggctgtga cgtgcagaac atgacctcgc tggacaagaa cggttatacc 1440
gacgtcaact cttccgccgc ccttccccct ctcattgtct acattgctaa ctacccctgg 1500
acctttttct ccaacacatc gaccatgtcc aagctgtcgt acaacaagaa ggaggttgcc 1560
ggcatgatcg agaacggcta ctccacctcc acccagttca acggaaccgt ggaccccgac 1620
tggcctgtgt gtcttggctg tgctctgctc aagcgagagg ccacccgacg aaaccagtct 1680
ctgggctctg actgtgacaa gtgcttctcc aagtactgct ggaacggaaa gactgacgat 1740
gatgccgaaa aggctctgaa gtttgctccc gccatctatg ccaacggccc taacgtttct 1800
tccaacgcct caattggcca ggcttcgtcc acctccaagc ccaagaagaa cggcgccgag 1860
ggtctggttc cgggtatggc tgccattgcc attggttttg ccgctcttct tatgtaa 1917
<210> 88
<211> 1710
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 88
atgaagttct cggctaccat tctgaccgcc ctggcagcct cggcggttgc caactacgcc 60
cccatcaagg tggagtgtcc aaaagatgtc aacatctccc gaccagcaga cggcctgagc 120
caccaggagg ccgactacat caatgaacga cacaaaaaga cctccaaggc gctcagagag 180
tacctcggtg ggctcgacat caaggcccga ggcaacaaca ccttcgacac ggactctttt 240
ctgaacgaaa cctcccccaa gctcgccatt gcggctgccg gaggaggttt ccgggccatg 300
ctggttggag caggcgtcat tgctgccctg gacaagcgtg tggacgaaaa caacaagaac 360
ggaggctttc tgcagtccgc agactatctg gccggtttgt ctggaggagc ttggctcgtg 420
ggatctctgg tcctcaacga ctggcctact gtgcctgaga tccaggctga cccccaaatc 480
tggtacctca acaagtcctt ggtgggctca gtcgaacccg gatccatgaa caccgtcggc 540
ctcttcgcca aggtgcttgc agataccacc tccaagcttg ctgccggcta ccagacctcg 600
ctgaccgacc aatggggacg actggtgtca taccagacca tcaactcttc gcacaccaag 660
ggcggtctgg atgccaccga ggtgacctgg tctggcatca gaaacatctc ctctttcgtt 720
gaccatgaaa tgccctttcc catcattctg ggcacatctc ttttccccgg aacttctcac 780
gatgttgacc agattaaatt caacaactcc atcatcgaaa tgacccccta cgagtgggga 840
acctgggaca agaacatccg gcaatttgtc gacaccgagt acctgggtac cgagatgtcc 900
gacggaaagc ccacaggaaa ctgtacccga cgatacgata acgccggctt cctgatggga 960
acctcctcct caattttcaa catggacatg aagactctgg gctttggcgg ctttgagagc 1020
gtgctactgc aggatctctt ctccgctctg gatattgtca acgagggctc tttcaacgtg 1080
gctgtttaca accccaaccc tttctaccaa caggttggca tgcagaccaa tcagaccatc 1140
tccaaggctc tgtacgtgtg tgacggaggt ttcgacaagg agaccattcc cattctgcct 1200
ttccttcagc ccgagagaga ggtcgatgtt gtcattgcca tcgacccttc cactgatact 1260
gaggaaagct ggcccgatgg agagtctctt cgagccaccc agaacaagtc cgactgggag 1320
tttggagacg acgtgtttcc caagatcccc tctaacgaga ccttcatcag caagaatctg 1380
actaccaagc ctgtcttctt cggctgcaac accaccaatc tcaagacgta caaggactcg 1440
gatcgatact ctcccgtcat tgtctacgtg cccatgtctg acatcaccta cccctccaac 1500
ttctccaccg gcaagctgtc ctacaccaac gaggaacagc agcgaaccat caacaacggc 1560
tacaacatga tgactcgaag caacggaacc gaggattcca actgggacaa gtgtctgggc 1620
tgtgtgactc tgctgcgaga gttccagcga cgggactcgg atgttcccaa tgactgtgag 1680
cagtgtttct ccgactactg ttacaactaa 1710
<210> 89
<211> 1623
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 89
atgatcgcaa acttcctgct gcttctggtg ctggtcacct tcgctgcagc ctcctacact 60
ccctccaagg gaagctgcca atacgacacc aacctgcttc gagaagcctc cagtatctct 120
cctgatgagg ccaactacgt tgcctccaag cagtccagtt ccgattccgc tttccagagc 180
tacctcaaga acgtcaacat ccctggtctg gatgtgaacc agtctgccaa cattgccctt 240
tccttctctg gaggaggata tcgagctatg ttgtccggtg ctggccaatt ttctgctctg 300
gatagccgaa acgagatcgc caacactatg ggaggtcttt tacaggcatc caactatctt 360
gtcggatgct ctggaggtgg atggctggtc ggcactattg ccatgaacaa cttccctact 420
atcgctgagg tccgatccaa ctctgacctg tggaagatca atgacaatgt tcccgagctt 480
actaaccctc tttcttggtt ggcgtttggt agatatgctg gcattgttac tgctgccctt 540
ggaaagcgtt tggccggatt taaaatctct ttcaccgacg agtggggtct gctcgtgggg 600
cgaaatcttg ttgataagaa cggcccatac tctacctggt ccgacatcaa ggtcacccaa 660
tcttacctgt ccaacgagat tcccttccct atcattgtcg gtaccactct gaacagcgct 720
gatgagcagg aggctcagat tactatcgac aaccctttga ttgagatgac ccccattgag 780
ttcggctcct tcgacaagtc catcaaatct ttcttcacta cttctgctat tggtacttct 840
gtttctaacg gccagcccac ctcttcccga tgtgtcactg gcttcgacaa tgcccagttc 900
ctgctgggaa ccacatccag tcttttccag ggtgtcagtg gatggcagaa gactatgctg 960
aacattgttg gggctcttaa cggcaacatc gcacccagtg ccatctatca ccccaaccct 1020
ttcaaggatg ccagctcggt ccaggctcct ttcaacggtg actctctcta tgcttcagac 1080
ggaggttatt ctggcatggt tcttcccctg tggcccctta tgcagccatc tcgaaacgtg 1140
gacttggtat tctcattcga taacagcgca ggaggtccca acaatgctcc tagtggagtc 1200
actctggcta acgtgaagca gaaggtcaca aacgagatgg gcgaaggagt gttccccgag 1260
gttcccagca gcgaggagta cattgccaac taccttgtca agccagtgtg gctcggatgt 1320
gaagtttcca agctcaaaaa aatccccaac acagatcgat acgttcctct tgtcatcaca 1380
atggccaacc accagatcaa ctacaactct cttcagcaga ctgacaagat ggactatagc 1440
tctgatgagc aaactggtat gatctctaac ggttttgcag tcgcttctaa caatggtgac 1500
ctgaagtggg cccagtgtgt cggctgtgcg ggtattctcc gagagttcca gagaactggt 1560
aaggaactcc ctgaaacctg ccaggcttgt ctcaaggaat actgctatca gtactctggt 1620
taa 1623
<210> 90
<211> 3009
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 90
atgcagttta cgcccttatt cctgcatttg gtggccactc ttgccgcttc ccctggcggc 60
acatatgagc ccaaacatgt tgattgtccc ccaaccgtac tggttcgaga ggccaacgat 120
accctcaatc ccaaagagaa agactacatg gaccggcgat ggctgcagac tcagcaagaa 180
catgtcaagt ttatggaacg tctcgacatt cccgacttca acgtctcctt cttggacgaa 240
gtcccccctg tcgtgatggg aactgccttc tctggaggtg gttatcgatc catgttgaca 300
ggagcaggtg tcgttgctgc catggacgcc cgtgtaaacg ggtctcttga ccttggcgcg 360
ctgggtggtc tcttccaagc aatgtcctac ttggtgggct tgtccagtgg aagttggttg 420
ttgacctctc tctttctgaa cgacaacttc actgttcctg accttcaggc tgctcctaac 480
ctctggagtc tcgagaactc attctggggt ggagaacgaa tgaaggacgt ccagcttgac 540
aaccccgttc ccaaccctgg tattattgat aacaacggaa ccgagagtga caacagttct 600
cttgtcattg gatctggcct gacagatcgt ctgagctctc gactgaagaa tctcgtcaat 660
ctagctcctc ggaacatcgt ttccgactca atcaagcacc actggaatcg acgaccttcg 720
accggtggag ctgaggttgt caaaaacatt aacctcaacg acatgttggc caaacgacct 780
aactctggta tcgctgagcg tcttcgaaac atgcctccaa tcggtgagag catttccaat 840
ggtcggcgta ctcgtcctag cactggtttt gctgaccgtc tgagaaacag accgaagact 900
ggaatctctg acagactaca ccaccgtccc agtactggac tctctgatcg gctgcgaaac 960
aggcccagta ctggcgtttc cgacacctgg aagaatcgac ccaagactgg ctatgctgat 1020
cggctcaaga attctcaacg gccccacttc gatctcgccc aacgactcag aaatagaccc 1080
aagacaggaa tatatgataa cgtcgacaag gggatctctc gaataaaacc tgggttgtct 1140
gatgcccgaa aggctcttga caaacacatt ccttcgaaac cttcaatggg tgacttcttt 1200
aaccagagaa gacgtcagtc tgatctcgaa aagctcttgg agtacgtttc tcctgacttc 1260
ctctgtgacc tagactattc agagttcctg aagtaccttg accctctgta tacttattac 1320
cacctggaga atgagatcaa gcagaccctg tactacttcc tgatgatcaa ggaagaggtc 1380
gacctgaaat ccagtgctgg ttttgtgacc actatcactg attactgggg tcgagcactc 1440
gcccgtcagc tgcttcctga ttctcgagga ggacagggta ctacctggtc cgatgttcaa 1500
atcacacctc agttcatgaa cgcatctgtg cctttcccta tcatggttgc gattggtcga 1560
gagccctccg agtctaacag tacctacatg atctctcctc tttggtcgac tctcttcgaa 1620
atgactccct tcgagtttgg atcttggaac ccttctttaa acgccttctc tgacactcga 1680
taccttggtt catccctcta taatgggacc cccgtcaaca atgttaccct tgagcctgtt 1740
ccctcaactg agcccgtttg tgtcttggga tatgataatg ctggtttcct tgccggcact 1800
tcttcctctg tcttcaatga tcctttcgag aattcgggta tcgatcagga ctacattcga 1860
gagctcttta ctggtatcat tgatgccctt gagaatttca atacctcttt ctggggtgaa 1920
ttcttttcta cagagaacag cactgtccct gaaactgatc ttacttggcg ggacgccgac 1980
tatgccatct tctcacccaa ccccttcctt gggtttgact ctaacgccac cactgataag 2040
ttttctgagt ccaaacatct tttcctggct gatggtggtg aggatggcca gctggttccc 2100
ttcgagcccc tacttcagga acagcgtaat gttgatgtca tcttcgccat tgatgcgtct 2160
tcgaacactg aggacaactt cccagatgga actgcgctgc gtatgtcaca agagagatac 2220
ctttcggagg attctgagca ggcggctggc atatcgtttc cccagctggc tgcagagttt 2280
ggcaatgaac ctgttttcct tggatgtttc ataaactcgt cttactcggt accacccaag 2340
gggagagcct acagctataa ctatcgacga gaccgtcctg ccgagcccaa tatgactatt 2400
cctgtatatc ctcctcctcc cccgttcgat ttccctaact ctacctttga tcctaactcc 2460
actttttcaa atgttagtat ggcttccagg gctcactgga gagccagaca gattcctgtt 2520
tccaacggca ctactaatga tacgggacct ataattcgcc ctcgacctcg ccctcgaccc 2580
cggccctcac gaccccggcc tatcatcgaa gatggtcgtg actatgacgc tgactatcct 2640
tatgaccaca ctacccctat tggtgccatt ccagtcatgc ctcctacaaa tgtttccacc 2700
gacccctttg tcaacgttac tgttggtgtc gacaagtacc ctcctctcat tgtgtatatc 2760
ccaaacagct accaatctta ctggaccggt gatagtactt tccaggttga gttttccacc 2820
gaggatgttg ccggctacat taccaacggc tacaatctga tgaccagaca gaactccact 2880
gtcgaccccg actggaataa gtgcgttggt tgtgccacta ttctccgggc ttatcaggga 2940
gccaacaaga ccatcccaga cttttgcatg ggatgtttcg atcgatattg tgttgattca 3000
agtaaatga 3009
<210> 91
<211> 1413
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 91
atggcttcta tcccccatta tgactatctg gttatcggcg gaggctctgg aggtgttgct 60
tctgctcgtc gagccgcctc gtacggcgcc aaaacactgc tgatcgaggg caaggcgctg 120
ggaggcacct gcgtcaacgt gggctgtgtg cccaaaaagg tcatgtggaa cgcgtccgat 180
ctggcgggcc gaatccgaca ggccaaggag tacggcttcc ccgacgtgga ccccaagtac 240
gccgacaact ttgactggtc cggattcaag gccaagcgag acgcttacgt caagcgactc 300
aatggaatct acgaacgaaa cctccagaag gagggcgtcg agtacgtgtt tggctgggcc 360
accctctaca agcaggaggg ccaggagttc cccctggtac atgtcaagag cgacgacggc 420
aataccaagc tgtattctgc caagaagatt atgattgcca ccggcggaaa gccccgtctg 480
cccgacgtgc ctggagccga gtacggcatt gactccgacg gcttctttgc tctcgagacc 540
cagcccaagc gagtggcggt ggttggagga ggctacattg gcgtggagct ggctggtgtc 600
ttccacggac tcaactccga gaccaccctc ttctgccgag gccagacggt gctccgagcg 660
ttcgacatca tgatccagga caccatcacc gactactacg tcaaggaggg catcaacgtg 720
ctcaagggct ccggcgtcaa gaagattgtc aagaaggaca atggcgagct gctcgtcacc 780
tacgagcagg atggcgccga gaaggatatc actcttgact cacttatttg gaccattgga 840
cgagagcctc tcaaggacac cctcaacctc ggcgagtttg gcatcaagac caacaagcgg 900
ggctacattg aggtcgacga gtaccagcga tcgtccgttg acaacattta ctcgcttgga 960
gacgtttgcg gcaaggtcga gctaaccccc atggctattg ctgccggacg aaagctgtcc 1020
aaccggctgt ttggtcccac agagttcaag aaccagaagc aggactacac cgatgttcct 1080
tctgccgtct tttcccaccc cgaggttggc tccatcggta tcaccgaggc tgccgccaag 1140
gagcagtatg gcgaggagaa cgtcaaggtc tacacctcca agtttgtcgc catgtactac 1200
gccatgctcg aggagaaggc tcccaccgcc tacaagctgg tgtgtgccgg caaggacgag 1260
aaggttgttg gtctgcacat tgttggcgct gactctgccg agattctgca gggtttcggc 1320
gtggccattc gaatgggagc caccaaggcc gatttcgaca atgttgtggc tatccatccc 1380
acttctgccg aggagctggt gaccatgaga tag 1413
<210> 92
<211> 507
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 92
atgtccgccg agaaaaccaa taccgctttc tacaacctcg ctccactcga caagaacgga 60
gagcctttcc ccttcaagca gcttgagggc aaggtcgtgc tcatcgtgaa cgtcgcctcc 120
aagtgtggct ttactcccca atacaagggc cttgaggagg tctaccagaa gtacaaggat 180
cagggattca ccatcatcgg cttcccctgc aaccagtttg gtggccaaga gcctggttcc 240
gctgacgaga tctcctcctt ctgtcagctg aactacggcg tcactttccc cgttcttcag 300
aagatcaacg tcaacggcaa cgacgccgac cccgtctacg tctacctgaa ggagcagaag 360
gctggtctgc tgggcttccg aggaatcaag tggaactttg agaagttcct ggttgataag 420
cacggtaacg tcgtcgaccg atatgcttcc ctcaagaccc ccgccggcct cgaatccacc 480
atcgagaccc tcctcaaaaa gccctaa 507
<210> 93
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 93
atggagtctg gacctatgcc tgccggaatt ccctttcccg agtactacga cttcttcatg 60
gactggaaga cccctcttgc tatcgctgcc acttacactg tggctgtggg cctgtttaac 120
cctaaggtgg gcaaggtgtc tagagtggtg gccaagtctg ccaatgctaa gcccgccgag 180
agaactcaat ctggagccgc catgaccgct tttgtgttcg tgcacaacct gatcctgtgc 240
gtgtactctg gcatcacctt ctaccacatg ttccccgcca tggtgaagaa cttccgaacc 300
cacactctgc acgaggccta ttgtgacacc gaccagtctc tgtggaacaa cgcccttggc 360
tattggggct acctgttcta cctgtctaag ttctacgagg tgatcgacac catcatcatc 420
atcctgaagg gccgacgatc ttctctgctg cagacctacc atcatgctgg agccatgatc 480
accatgtggt ctggcatcaa ctaccaggct acccccatct ggatcttcgt ggtgttcaac 540
tctttcatcc acaccatcat gtactgctac tacgccttca cctctatcgg ctttcatccc 600
cccggcaaaa agtacctgac ctctatgcag atcacccagt tcctggtggg cattaccatc 660
gccgtgtctt acctgtttgt gcccggctgc atcagaactc ctggcgccca aatggctgtg 720
tggatcaacg tgggctacct gttccctctg acctacctgt ttgtggactt cgccaagcga 780
acctactcta agcgaaccgc catcgccgct caaaaaaagg cccagtag 828
<210> 94
<211> 1521
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 94
atgacctctg tgaacgtgaa gctgctgtac cgatacgtgc tgaccaactt cttcaacctg 60
tgcctgtttc ccctgactgc ctttcttgcc ggaaaagcct ctcgactgac catcaacgac 120
ctgcacaact tcctgtctta cctgcagcac aacctgatca ccgtgaccct gctgtttgcc 180
ttcaccgtgt tcggactggt gctgtacatt gtgacccgac ccaaccctgt gtatctggtg 240
gactactctt gttacctgcc cccccctcac cttaaagtgt ctgtgtctaa ggtgatggac 300
atcttctacc agatccgaaa ggccgacacc tcttctagaa acgtggcctg cgacgaccct 360
tcttctctgg acttcctgcg aaagatccag gagagatctg gcctgggcga cgaaacttac 420
tctcccgaag gcctgattca tgtgcctccc cgaaaaactt tcgccgcctc tagagaagag 480
accgagaagg tgattatcgg cgccctggag aacctgttcg agaacaccaa ggtgaacccc 540
cgagagatcg gcattctggt ggtgaactct tctatgttca accccacccc ctctctttct 600
gccatggtgg tgaacacctt caagctgcga tctaacatca agtctttcaa cctgggcggc 660
atgggatgtt ctgctggagt gatcgccatc gacctggcta aggacctgct gcacgtgcac 720
aagaacacct acgccctggt ggtgtctacc gagaacatca cccagggcat ctacgctggc 780
gagaaccgat ctatgatggt gtctaactgc ctgttcagag ttggaggagc cgccattctg 840
ctgtctaaca agtctggcga ccgacgacga tctaagtaca agctggtgca caccgtgcga 900
actcatactg gcgctgacga caagtctttc cgatgcgtgc agcaggagga tgatgagtct 960
ggcaagatcg gcgtgtgcct gtctaaggac atcaccaacg tggctggcac taccctgact 1020
aagaacatcg ccactctggg ccctctgatt ctgcctctgt ctgagaagtt cctgttcttc 1080
gccaccttcg tggccaagaa gctgctgaag gacaagatca agcactacta cgtgcccgac 1140
ttcaaacttg ccgtggacca cttttgcatc catgctggcg gcagagctgt tattgacgag 1200
ctggagaaga accttggcct gtctcccatt gatgtggagg cctctcgatc tacccttcac 1260
cgattcggca acacctcttc ttcttctatc tggtacgagc tggcctacat cgaagccaag 1320
ggccgaatga agaagggcaa caaggcctgg caaattgctc tgggctctgg cttcaagtgc 1380
aactctgccg tgtgggtggc tctgagaaac gtgaaggcct ctgccaattc tccttggcag 1440
cactgcattg accgataccc cgtgaagatc gactctgacc tgtctaagtc taagacccac 1500
gtgcagaacg gccgatctta a 1521
<210> 95
<211> 1521
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 95
atgacctctg tgaacgtgaa gctgatctac cactacgtga tcaccaacct gttcaacctg 60
tgcttcttcc ccctgactgc tatcgttgcc ggcaaagctt ctcgactgac cattgacgac 120
ctgcaccacc tgtactactc ttacctgcag cacaacctga ttaccatcgc ccccctgttt 180
gcctttaccg tgttcggctc tgtgctgtac attgccaccc gacctaagcc tgtgtacctg 240
gtggagtact cttgttacct gccccccact cactgtcgat cttctatctc taaggtgatg 300
gacatcttct accaggtgcg aaaggccgac ccctctagaa atggcacctg cgacgactct 360
tcttggctgg acttcctgcg aaagatccag gagcgatctg gcctgggaga tgagactcat 420
ggccctgagg gactgcttca cgtgcctccc agaaaaacct ttgccgccgc tagagaagaa 480
accgagaagg tgattatcgg cgccctggag aacctgttcg agaacaccaa ggtgaacccc 540
aaggacatcg gcatcctggt ggtgaactct tctatgttca accccacccc ctctctttct 600
gccatggtgg tgaacacctt caagctgcga tctaacgtgc gatctttcaa cctgggaggc 660
atgggatgtt ctgctggcgt gatcgctatt gacctggcca aagacctgct gcacgtgcac 720
aagaacacct acgccctggt ggtgtctacc gagaacatca cctacaacat ctacgccggc 780
gacaacaagt ctatgatggt gtctaactgc ctgttccgag tgggaggagc cgctattctg 840
ctgtctaaca agccccgaga ccgacgacga tctaagtacg agctggtgca caccgtgcga 900
actcataccg gagctgacga caagtctttc cgatgcgtgc aacagggcga tgacgagtct 960
ggaaagaccg gcgtgtctct gtctaaggac atcaccgacg tggctggaag aaccgtgaag 1020
aagaacatct ctaccctggg ccctctgatt ctgcctctgt ctgagaagct gctgttcttc 1080
gtgaccttca tgggcaagaa gctgttcaag gacaagatca agcactacta cgtgcccgac 1140
ttcaagcttg ccatcgacca cttctgtatc cacgctggcg gacgagctgt gattgatgtg 1200
ctggagaaga accttggact ggcccctatt gatgtggagg cctctcgatc tacccttcac 1260
cgattcggca acacctcttc ttcttctatc tggtacgagc tggcctacat cgaagctaag 1320
ggccgaatga agaagggcaa caaggtgtgg caaatcgctc tgggctctgg cttcaagtgc 1380
aactctgccg tttgggtggc cctgagaaat gtgaaggcct ctcgaaagtc tccttgggag 1440
cactgcattg accgataccc cgtgaagatc gactacgact ctgccaagtc tgaggtgaga 1500
gtgcagaacg gccgatctta a 1521
<210> 96
<211> 1521
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 96
atgacctcta tcaacgtgaa gctgctgtac cactacgtgc tgaccaactt cttcaacctg 60
tgcctgttcc ccctgactgc ttttcctgcc ggcaaggctt ctcaactgac caccaacgac 120
ctgcaccacc tgtactctta cctgcaccac aacctgatca ccgtgaccct gctgtttgcc 180
ttcaccgtgt tcggctctat cctgtacatc gtgaccagac ccaagcctgt gtacctggtg 240
gactactctt gttacctgcc ccccagacat ctgtcttgcg gcatctctcg agtgatggag 300
atcttctacg agatccgaaa gtctgacccc tctcgagagg tgcctttcga cgacccttct 360
tctctggagt tcctgcgaaa gatccaggag cgatctggac tgggagacga gacttatgga 420
ccccagggac tggttcatga tatgcccctg cgaatgaatt ttgccgccgc ccgagaagaa 480
actgagcagg tgatcaacgg agccctggag aagctgttcg agaacaccaa ggtgaacccc 540
cgagagattg gcatcctggt ggtgaactct tctatgttca accccacccc ctctctttct 600
gccatggtgg tgaacacctt caagctgcga tctaacatca agtctttctc tctgggcggc 660
atgggatgtt ctgccggcat catcgctatc gacctggcta aggacctgct gcacgtgcac 720
aagaacacct acgccctggt ggtgtctacc gagaacatca cccactctac ctacaccggc 780
gacaaccgat ctatgatggt gtctaactgc ctgttcagaa tgggcggagc cgccattctg 840
ctgtctaaca aggctggcga ccgacgacga tctaagtaca agctggccca cactgtgaga 900
actcacaccg gcgctgacga tcagtctttc cgatgcgtgc gacaggagga tgatgacaga 960
ggcaagatcg gcgtgtgcct gtctaaagac atcaccgccg tggccggaaa aaccgtgacc 1020
aagaacatcg ctaccctggg acctcttgtg ctgcctctgt ctgagaagtt cctgtacgtg 1080
gtgtctctga tggccaagaa gctgttcaag aacaagatca agcacaccta cgtgcccgat 1140
ttcaagctgg ccatcgacca cttctgcatc catgctggcg gaagagctgt gattgacgtg 1200
ctggagaaga acctggccct gtctcctgtg gatgtggagg cttctcgatc taccctgcac 1260
cgattcggca acacctcttc ttcttctatc tggtacgagc tggcctacat cgaagccaag 1320
ggccgaatga agaagggcaa caaggtgtgg caaatcgcca tcggctctgg cttcaagtgc 1380
aactctgccg tttgggtggc cctgtgtaat gtgaagccct ctgtgaactc tccttgggag 1440
cactgcattg acagataccc cgtggagatc aactacggct cttctaagtc tgagacccga 1500
gcccaaaacg gccgatctta a 1521
<210> 97
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 97
atgaacatgt ctgtgctgac cctgcaggag tacgagttcg agaagcagtt caacgagaac 60
gaggccattc agtggatgca ggagaactgg aagaagtcct tcctgttctc cgccctgtac 120
gccgccttca ttttcggcgg ccgacacctg atgaacaagc gagccaagtt cgagctgcga 180
aagcccctgg tcctgtggtc tctgaccctg gccgtcttct ctatcttcgg tgccctgcga 240
accggtgcct acatgctgta cattctgatg accaagggcc tgaagcagtc cgtctgtgac 300
cagtccttct acaacggtcc cgtctctaag ttctgggcct acgccttcgt cctgtccaag 360
gcccccgagc tgggtgacac cattttcatc attctgcgaa agcagaagct gattttcctg 420
cactggtacc accacattac cgtcctgctg tactcctggt actcctacaa ggacatggtc 480
gccggcggtg gctggttcat gaccatgaac tacggcgtgc acgccgtcat gtactcctac 540
tacgccctgc gagccgccgg cttccgagtc tctcgaaagt tcgccatgtt cattaccctg 600
tctcagatta cccagatgct gatgggttgt gtcatcaact acctggtctt caactggatg 660
cagcacgaca acgaccagtg ttactcccac ttccagaaca ttttctggtc ctccctgatg 720
tacctgtctt acctgctgct gttctgccac ttcttcttcg aggcctacat tggtaaagtg 780
aagaaggcca ccaaggccga gtaa 804
<210> 98
<211> 972
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 98
atgatcatca agaacaacaa caacggctac ttcattgaca acgtcaacaa gatctgggag 60
atccccatca actctgagca catggacatc ctgaaggaga tcccctggtt caagtacctg 120
accctgccca ttgagcgaaa ctggaacggc atgaagctgt tcctgtggac caacgacaac 180
tactacctgg cccacaccat ctgcatcatc tacgccttct tcatctactt cggtcccaag 240
atcatggaga agcgaaagcc cttcaagctg gagaagcccc tgaagtactg gaacctgttc 300
ctggccctgt tctctttcat cggcaccctg cgactgatgc cctacgtgct gaccaacctg 360
attaagtacg gcttcgtctc ttctatctgc tcccccccca ttgcccccct gaccaagggc 420
cctgccggcc tgtggctgtc tctgttcatc tattccaagt acattgagct gatcgacacc 480
ttcttcatca ttgcccgaaa gaagtctctg tccttcctgc actggttcca ccacctgacc 540
gtgctgctgt acacctggga cgcctacgtc tgttgtcaga ccattggtgt cttcttctgt 600
gccattaact acttcgtgca ctccatcatg tacttctact actacctgtc ctcctgtggc 660
aagcgaccca agtggggtat gatcattacc attctgcaga tcgtccagat gattattggc 720
accattctga ccacctccgg tatgtactac tcttacaagc accccttcgc caacgtgttc 780
cccgtcgagt acctgtccca gcccctgaag gtcggttgcc acttcatccg aaccaacggt 840
gtcttcgcct gcctgatgta catctcttac ttcgccctgt tcttcgactt cttcatcaag 900
cgatacatca ccaagggcac ccccctggcc gagtgggtca ccgctaacaa gaagcccacc 960
aagcgagact aa 972
<210> 99
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 99
atgtctgtgc tgaccctgca ggagtacgag ttcgagaagc agttcaacga gaacgaggcc 60
atccagtgga tgcaggagaa ctggaagaag tctttcctgt tctctgccct gtacgccgcc 120
ttcgtcttcg gcggccgaca cctgatgaac aagcgagcca agttcgagct gcgaaagccc 180
ctggtgctgt ggtctctgac cctggccgtg ttctccattt tcggcgccct gcgaaccggc 240
gcctacatgg tctacaccgt gatgaccaag ggcctgaagc actccgtctg tgaccagggc 300
ttctacaacg gccccgtctc caagttctgg gcctacgcct tcgtcctgtc taaggccccc 360
gagctgggtg acaccatctt cattatcctg cgaaagcaga agctgatttt cctgcactgg 420
taccaccaca ttaccgtcct gctgtactcc tggtactcct acaaggacat ggtggccggc 480
ggtggttggt tcatgaccat gaactactct gtgcactctg tgatgtactc ctactacgcc 540
ctgcgagccg ccggcttccg agtctctcga aagttcgcca tgttcatcac cctgtcccag 600
attctgcaga tgctggtggg ctgtgtcatt aactacctgg tgttccagtg gatgcagcac 660
gaccagtgcc actcccactt ccagaacatc ttctggtcct ctctgatgta cctgtcctac 720
ttcgtcctgt tctgccactt cttcttcgag gcctacatcg gctctaagat gcgaaaggcc 780
accaaggccg actaa 795
<210> 100
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 100
atgtcctccg tggtcgagac ctgtaagacc ctgcccgtgc aggcctctcg actggtgccc 60
accgccgtca aggaggaggt ccccaccgac cacaacgtcc ccgacaacta cgtgtcctgg 120
accctgaaga accagaagcc cctgcccccc atcgtgctgg ccaacctgct gcagaacatc 180
gagtggctga ccttcatcat tctgaccatc accccctcca tcgccatcta cggtctgttc 240
accgtcaaca tgcagtggaa gaccttcgtg tggtctgtca tgtactactt catcaccggc 300
ctgggcatca ccgccggcta ccaccgactg tggtctcacc gatcctacaa cgcctctaag 360
cccctgcagt acttcctggc cgtcgccggc accggtgccg ttgagggttc catcaagtgg 420
tggtgccgaa agcaccgagc ccaccaccga tacaccgaca ccgacctgga cccctacaac 480
gccaacaagg gtttcttctt ctcccacgtg ggctggatgc tggtcaagcc ccgagacaag 540
cccggtgtgg ccgacatttc tgacctgcga aagtccgagg tcattcagtg gcagcaccga 600
tggtacgtgt ggctgattgt gggtgccggt ctgctgctgc ccaccgtggt cgctggtctg 660
ggctggggag actgggccgg tggtttcttc tttgccggtg ccgcccgact gaccttcgtg 720
caccactcta ccttctgtgt caactctctg gcccactggc tgggtgagac ccccttcgac 780
gacaagcact ctccccgaga ccacttcatt accgccctgg tcaccgtggg cgagggctac 840
cacaacttcc accaccagtt ccccatggac taccgaaacg ccattcgatg gtaccagtac 900
gaccccacca agtggttcat ttggatgtgc tccaagttcg gcctggcctc tcacctgaag 960
gtcttccccg agaacgaggt gcgaaagggc gagctgacca tgcagctgaa gaagctgcga 1020
gagacccagg acgtgctgac ctgggccccc gacgtggagg gactgcctgt gatttcttgg 1080
gagtccttct ctgagcagtc cgtcacccga cccctgatca tcgtcgccgg cttcatccac 1140
gacgtctctg acttcatcga cgagcacccc ggtggccgac acctgattat taagtacatt 1200
ggtaaagacg ccacccccgc cttcttcggc ggcgtttacg accactccaa cgccgcccac 1260
aacctgctgt ccatgaagcg agtcggtgcc ctgcacggcg gcatccagca cggactgcag 1320
gacatgtcta ttccccccgc ccagcgactg cgaatcgccc gatacaacga gctggccggc 1380
tctccctaca actcctctac cgccacctct gactctgagg gtattctggg ttaa 1434
<210> 101
<211> 1020
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 101
atgaccgtca agacccgatc caacattgcc aagaagatcg agaaggacgg tggccccgag 60
acccagtacc tggccgtgga ccccaacgag atcattcagc tgcaggagga gtctaagaag 120
atcccctaca agatggagat cgtctggcga aacgtggccc tgttcgccgc cctgcacttc 180
gccgctgcca tcggactgta ccagctgatt ttcgaggcca agtggcagac cgtgattttc 240
accttcctgc tgtacgtctt cggtggtttc ggcattaccg ccggtgccca ccgactgtgg 300
tctcacaagt cctacaaggc caccaccccc atgcgaattt tcctgatgat cctgaacaac 360
attgccctgc agaacgacgt cattgagtgg gcccgagacc accgatgtca ccacaagtgg 420
accgacaccg acgccgaccc ccacaacacc acccgaggtt tcttcttcgc ccacatgggc 480
tggctgctgg tgcgaaagca cccccaggtg aaggagcagg gtgccaagct ggacatgtcc 540
gacctgctgt ctgaccccgt cctggtgttc cagcgaaagc actacttccc cctggtcatc 600
ctgtgttgtt tcattctgcc caccattatc cccgtctact tctggaagga gaccgccttc 660
atcgccttct acaccgccgg taccttccga tactgcttca ccctgcacgc cacctggtgt 720
atcaactccg ccgcccacta cttcggttgg aagccctacg actcctccat tacccccgtg 780
gagaacgtgt tcaccaccat cgccgccgtc ggcgagggcg gtcataactt ccaccacacc 840
ttcccccagg actaccgaac ctccgagtac tctctgaagt acaactggac ccgagtgctg 900
atcgacaccg ccgccgccct gggactggtg tacgaccgaa agaccgcctg tgacgagatc 960
atcggccgac aggtgtctaa ccacggctgt gacatccagc gaggtaaatc tattatgtaa 1020
<210> 102
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 102
atggccaccc ccctgcctcc taccttcacc gtgcccgcct cctccaccga gacccgacga 60
gaccccctgc cccacgacgt gctgcctcct ctgttcaacg gtgagaaggt caacatcctg 120
aacatttgga agtacctgga ctggaagcac gtcatcggcc tgctggtgac ccccctggtc 180
gccctttacg gtatgtgtac caccgagctg cacaccaaga ccctggtctg gtccatcgtg 240
tactacttcg ccaccggcct gggtatcacc gccggttacc accgactgtg ggcccaccga 300
gcctacaacg ccggtcccgc tatgtccttc gccctggccc tgttcggcgc cggagctgtt 360
gagggctcta tcaagtggtg gtcccgaggc caccgagccc accaccgatg gaccgacacc 420
gagaaggacc cctactccgc ccaccgaggt gtgttctact ctcacctggg ttggctgctg 480
atcaagcgac ccggttggaa gattggtcac gccgacgtcg acgacctgaa caagaacccc 540
ctggtccagt ggcagcacaa gcactacctg atcctggtca ttctgatggg tctggtgttc 600
cccaccgccg tcgccggtct gggatggggt gactggcgag gtggctactt ctacgccgcc 660
attctgcgac tgatcttcgt gcaccacgcc accttctgcg tgaactctct ggcccactgg 720
ctgggcgacg gccctttcga cgaccgacac accccccgag accacttcat caccgccttc 780
ctgaccctgg gcgagggtta ccacaacttc caccaccagt tcccccagga ctaccgatcc 840
gccatccgat tctaccagta cgaccccacc aagtggctga ttgccacctg cgccttcttc 900
ggtttcgcct ctcacctgaa gaccttcccc gagaacgaga ttaagaaggg caagctgcag 960
atgattgaga aggaggtgct ggagaagaag accaagctgc agtggggtac ccccatcgcc 1020
gacctgccca tcctgtcctt cgaggacttc cagcacgcct gcaagaacga ccgaaagcag 1080
tggatcctgc tggagggcgt cgtctacgac gtcgccgact tcatgaccga gcaccccggt 1140
ggcgagaagt acatcaagat gggcgtgggt aaagacatga cctccgcctt caacggcggt 1200
atgtacgacc actctaacgc cgcccgaaac ctgctgtctc tgatgcgagt cgccgtcgtc 1260
gagttcggtg gcgaggtcga ggcccagaag tcccgaccct ctgtgaccgt gtacggcgac 1320
cactctaagg aggagtaa 1338
<210> 103
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 103
atgtctctgt ctgcctctga gaaggaggag aacaacaaga agatggccgc cgacaaggcc 60
gagatgggtc gaaagaagcg agccatgtgg gagcgaaagt ggaagcgact ggacattgtg 120
aaggccttcg cctccctgtt cgtccacttc ctgtgtctgc tggccccctt caacttcacc 180
tggcccgccc tgcgagtggc cctgattgtg tacaccgtgg gtggcctggg catcaccgtg 240
tcttaccacc gaaacctggc ccaccgatcc ttcaaggtcc ccaagtggct ggagtacttc 300
ttcgcctact gcggcctgct ggccattcag ggcgacccca ttgactgggt gtctacccac 360
cgataccacc accagttcac cgactccgac cgagaccccc actcccccaa cgagggtttc 420
tggttctctc acctgctgtg gctgttcgac accggctacc tggtcgagaa gtgcggccga 480
cgaaccaacg tcgaggacct gaagcgacag tggtactaca agttcctgca gcgaaccgtc 540
ctgtaccaca ttctgacctt cggtttcctg ctgtactact tcggtggtct gtctttcctg 600
acctggggta tgggtattgg tgtcgccatg gagcaccacg tcacctgcct gattaactct 660
ctgtgtcacg tgtggggttc tcgaacctgg aagaccaacg acacctcccg aaacgtgtgg 720
tggctgtccg tgttctcttt cggcgagtcc tggcacaaca accaccacgc cttcgagtcc 780
tccgcccgac agggtctgga gtggtggcag attgacatct cttggtacat tgtccgattc 840
ctggagatca tcggcctggc caccgacgtg aagctgccct ccgagtctca gcgacgacga 900
atggccatgg tccgataa 918
<210> 104
<211> 924
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 104
atgtctgtga cctctaccgt ggaggagaac caccagaaga acccctctac ccctgctgct 60
gtggaggaaa agaagaagcg acgatgggtg ttctgggatc gacgatggcg acgactggac 120
tacgtgaagt tctctgcctc tttcaccgtg cactctctgg ctcttcttgc ccccttctac 180
ttcacttggt ctgccctgtg ggtgaccttc ctgttctaca ccattggcgg cctgggcatt 240
actgtgtctt accaccgaaa cctggcccac cgatctttca aggtgcccaa gtggctggaa 300
tacctgctgg cttattgtgc cctgctggcc attcaaggtg accctatcga ctgggtgtct 360
acccaccgat accaccacca gttcaccgac tctgaacgag atccccactc tcctaaagag 420
ggcttctggt tctctcacct gctgtggatc tacgactctg cctacctggt gtctaaatgc 480
ggccgacgag ccaatgtgga ggatctgaag cgacagtggt tctaccgatt cctgcagaag 540
accgtgctgt tccacattct tggcctgggc ttcttcctgt tttacctggg cggcatgtct 600
tttgtgacct ggggaatggg agtgggagct gccctggaag ttcatgtgac ctgcctgatc 660
aactctctgt gccacatctg gggaacccga acctggaaaa ccaacgacac ctctcgaaac 720
gtgtggtggc tgtctgtgtt ctctttcggc gagtcttggc acaacaacca ccacgccttc 780
gagtcttctg ctcgacaggg actggaatgg tggcagatcg acatctcttg gtacatcgtg 840
cgattcttcg agatcatcgg cctggccacc gatgttaaag tgcccaccga agcccaacga 900
agacgaatgg ccatcgtgag atga 924
<210> 105
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 105
atgaacttcc accacttggc ttactggcaa gacaaggctt tgtctttggc tatcgaaaac 60
agattgttca tcaacggtga atacactgct gctgctgaaa acgaaacttt cgaaactgtt 120
gacccagtta ctcaagctcc attggctaag atcgctagag gtaagtctgt tgacatcgac 180
agagctatgt ctgctgctag aggtgttttc gaaagaggtg actggtcttt gtcttctcca 240
gctaagagaa aggctgtttt gaacaagttg gctgacttga tggaagctca cgctgaagaa 300
ttggctttgt tggaaacttt ggacactggt aagccaatca gacactcttt gagagacgac 360
atcccaggtg ctgctagagc tatcagatgg tacgctgaag ctatcgacaa ggtttacggt 420
gaagttgcta ctacttcttc tcacgaattg gctatgatcg ttagagaacc agttggtgtt 480
atcgctgcta tcgttccatg gaacttccca ttgttgttga cttgttggaa gttgggtcca 540
gctttggctg ctggtaactc tgttatcttg aagccatctg aaaagtctcc attgtctgct 600
atcagattgg ctggtttggc taaggaagct ggtttgccag acggtgtttt gaacgttgtt 660
actggtttcg gtcacgaagc tggtcaagct ttgtctagac acaacgacat cgacgctatc 720
gctttcactg gttctactag aactggtaag caattgttga aggacgctgg tgactctaac 780
atgaagagag tttggttgga agctggtggt aagtctgcta acatcgtttt cgctgactgt 840
ccagacttgc aacaagctgc ttctgctact gctgctggta tcttctacaa ccaaggtcaa 900
gtttgtatcg ctggtactag attgttgttg gaagaatcta tcgctgacga attcttggct 960
ttgttgaagc aacaagctca aaactggcaa ccaggtcacc cattggaccc agctactact 1020
atgggtactt tgatcgactg tgctcacgct gactctgttc actctttcat cagagaaggt 1080
gaatctaagg gtcaattgtt gttggacggt agaaacgctg gtttggctgc tgctatcggt 1140
ccaactatct tcgttgacgt tgacccaaac gcttctttgt ctagagaaga aatcttcggt 1200
ccagttttgg ttgttactag attcacttct gaagaacaag ctttgcaatt ggctaacgac 1260
tctcaatacg gtttgggtgc tgctgtttgg actagagact tgtctagagc tcacagaatg 1320
tctagaagat tgaaggctgg ttctgttttc gttaacaact acaacgacgg tgacatgact 1380
gttccattcg gtggttacaa gcaatctggt aacggtagag acaagtcttt gcacgctttg 1440
gaaaagttca ctgaattgaa gactatctgg atctctttgg aagcttaa 1488
<210> 106
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 106
atgagtgaag gccccgtcaa attcgaaaaa aataccgtca tatctgtctt tggtgcgtca 60
ggtgatctgg caaagaagaa gacttttccc gccttatttg ggcttttcag agaaggttac 120
cttgatccat ctaccaagat cttcggttat gcccggtcca aattgtccat ggaggaggac 180
ctgaagtccc gtgtcctacc ccacttgaaa aaacctcacg gtgaagccga tgactctaag 240
gtcgaacagt tcttcaagat ggtcagctac atttcgggaa attacgacac agatgaaggc 300
ttcgacgaat taagaacgca gatcgagaaa ttcgagaaaa gtgccaacgt cgatgtccca 360
caccgtctct tctatctggc cttgccgcca agcgtttttt tgacggtggc caagcagatc 420
aagagtcgtg tgtacgcaga gaatggcatc acccgtgtaa tcgtagagaa acctttcggc 480
cacgacctgg cctctgccag ggagctgcaa aaaaacctgg ggcccctctt taaagaagaa 540
gagttgtaca gaattgacca ttacttgggt aaagagttgg tcaagaatct tttagtcttg 600
aggttcggta accagttttt gaatgcctcg tggaatagag acaacattca aagcgttcag 660
atttcgttta aagagaggtt cggcaccgaa ggccgtggcg gctatttcga ctctataggc 720
ataatcagag acgtgatgca gaaccatctg ttacaaatca tgactctctt gactatggaa 780
agaccggtgt cttttgaccc ggaatctatt cgtgacgaaa aggttaaggt tctaaaggcc 840
gtggccccca tcgacacgga cgacgtcctc ttgggccagt acggtaaatc tgaggacggg 900
tctaagcccg cctacgtgga tgatgacact gtagacaagg actctaaatg tgtcactttt 960
gcagcaatga ctttcaacat cgaaaacgag cgttgggagg gcgtccccat catgatgcgt 1020
gccggtaagg ctttgaatga gtccaaggtg gagatcagac tgcagtacaa agcggtcgca 1080
tcgggtgtct tcaaagacat tccaaataac gaactggtca tcagagtgca gcccgatgcc 1140
gctgtgtacc taaagtttaa tgctaagacc cctggtctgt caaatgctac ccaagtcaca 1200
gatctgaatc taacttacgc aagcaggtac caagactttt ggattccaga ggcttacgag 1260
gtgttgataa gagacgccct actgggtgac cattccaact ttgtcagaga tgacgaattg 1320
gatatcagtt ggggcatatt caccccatta ctgaagcaca tagagcgtcc ggacggtcca 1380
acaccggaaa tttaccccta cggatcaaga ggtccaaagg gattgaagga atatatgcaa 1440
aaacacaagt atgttatgcc cgaaaagcac ccttacgctt ggcccgtgac taagccagaa 1500
gatacgaagg ataattag 1518
<210> 107
<211> 1130
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 107
caacttttct tgtcgacctg agataccgag gttgcgcagg ggatcaactt ttgtgtctca 60
gagggaccca agtgcgtacg gagagtacag tacatactgt agctaacggt agcaggcgaa 120
ctactggtac atacctcccc cggaatatgt acaggcataa tgcgtatctg tgggacatgt 180
ggtcgttgcg ccattatgta agcagcgtgt actcctctga ctgtccatat ggtttgctcc 240
atctcaccct catcgttttc attgttcaca ggcggccaca aaaaaactgt cttctctcct 300
tctctcttcg ccttagtcta ctcggaccag ttttagttta gcttggcgcc actggataaa 360
tgagacctca ggccttgtga tgaggaggtc acttatgaag catgttagga ggtgcttgta 420
tggatagaga agcacccaaa ataataagaa taataataaa acagggggcg ttgtcatttc 480
atatcgtgtt ttcaccatca atacacctcc aaacaatgcc cttcatgtgg ccagccccaa 540
tattgtcctg tagttcaact ctatgcagct cgtatcttat tgagcaagta aaactctgtc 600
agccgatatt gcccgacccg cgacaagggt caacaaggtg gtgtaaggcc ttcgcagaag 660
tcaaaactgt gccaaacaaa catctagagt ctctttggtg tttctcgcat atatttaatc 720
ggctgtctta cgtatttggc ctcggtaccg gactaatttc ggatcatccc caatacgctt 780
tttcttcgca gctgtcaaca gtgtccatga tctatccacc taaatgggtc atatgaggcg 840
tataatttcg tggtgctgat aataattccc atatatttga cacaaaactt ccccccctag 900
acatacatct cacaatctca cttcttgtgc ttctgtcaca catctcctcc agctgacttc 960
aactcacacc tctgccccag ttggtctaca gcggtataag gtttctctgc atagaggtgc 1020
accactcctc ccgatacttg tttgtgtgac ttgtgggtca cgacatatat atctacacac 1080
attgcgccac cctttggttc ttccagcaca acaaaaacac gacacgctaa 1130
<210> 108
<211> 522
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 108
agagaccggg ttggcggcgc atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 60
cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttctcc ccacatatca 120
aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 180
cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 240
gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 300
aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 360
cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca ttcaaaatgg tgagtttcag 420
aggcagcagc aattgccacg ggctttgagc acacggccgg gtgtggtccc attcccatcg 480
acacaagacg ccacgtcatc cgaccagcac tttttgcagt ac 522
<210> 109
<211> 1002
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 109
aaggagtttg gcgcccgttt tttcgagccc cacacgtttc ggtgagtatg agcggcggca 60
gattcgagcg tttccggttt ccgcggctgg acgagagccc atgatggggg ctcccaccac 120
cagcaatcag ggccctgatt acacacccac ctgtaatgtc atgctgttca tcgtggttaa 180
tgctgctgtg tgctgtgtgt gtgtgttgtt tggcgctcat tgttgcgtta tgcagcgtac 240
accacaatat tggaagctta ttagcctttc tattttttcg tttgcaaggc ttaacaacat 300
tgctgtggag agggatgggg atatggaggc cgctggaggg agtcggagag gcgttttgga 360
gcggcttggc ctggcgccca gctcgcgaaa cgcacctagg accctttggc acgccgaaat 420
gtgccacttt tcagtctagt aacgccttac ctacgtcatt ccatgcatgc atgtttgcgc 480
cttttttccc ttgcccttga tcgccacaca gtacagtgca ctgtacagtg gaggttttgg 540
gggggtctta gatgggagct aaaagcggcc tagcggtaca ctagtgggat tgtatggagt 600
ggcatggagc ctaggtggag cctgacagga cgcacgaccg gctagcccgt gacagacgat 660
gggtggctcc tgttgtccac cgcgtacaaa tgtttgggcc aaagtcttgt cagccttgct 720
tgcgaaccta attcccaatt ttgtcacttc gcacccccat tgatcgagcc ctaacccctg 780
cccatcaggc aatccaatta agctcgcatt gtctgccttg tttagtttgg ctcctgcccg 840
tttcggcgtc cacttgcaca aacacaaaca agcattatat ataaggctcg tctctccctc 900
ccaaccacac tcactttttt gcccgtcttc ccttgctaac acaaaagtca agaacacaaa 960
caaccacccc aaccccctta cacacaagac atatctacag ca 1002
<210> 110
<211> 438
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 110
tttgtgcaag tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tggtgtgttt gtgtgttaga acggatgttc 60
tggtgagtgt gagtgtgtag ttgtgtgatg agaccttggt gccaccccaa ggtatatata 120
tataacacct ccaggagctc taaaaaggca tctacttttc tctatactgt acgtttcaat 180
ctggggaagc ggaatcccaa aagggaaagc cgccgcatta agctccacag ccttgcataa 240
tccgatgacc tgactagtgc ggacaaagac tattatttcg aggcaaggcc accacgtacc 300
gcggtcccaa acttttgcaa agctgaaaac agcgtggggg tcaacgtgga tcagaaagag 360
gggcagatca gcttctataa gaagctcctt tccccacaat tggcccacac gacacttcta 420
cacacttaca catctact 438
<210> 111
<211> 931
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 111
cgcagtagga tgtcctgcac gggtcttttt gtggggtgtg gagaaagggg tgcttggaga 60
tggaagccgg tagaaccggg ctgcttgggg ggatttgggg ccgctgggct ccaaagaggg 120
gtaggcattt cgttggggtt acgtaattgc ggcatttggg tcctgcgcgc atgtcccatt 180
ggtcagaatt agtccggata ggagacttat cagccaatca cagcgccgga tccacctgta 240
ggttgggttg ggtgggagca cccctccaca gagtagagtc aaacagcagc agcaacatga 300
tagttggggg tgtgcgtgtt aaaggaaaaa aaaagaagct tgggttatat tcccgctcta 360
tttagaggtt gcgggataga cgccgacgga gggcaatggc gccatggaac cttgcggata 420
tcgatacgcc gcggcggact gcgtccgaac cagctccagc agcgtttttt ccgggccatt 480
gagccgactg cgaccccgcc aacgtgtctt ggcccacgca ctcatgtcat gttggtgttg 540
ggaggccact ttttaagtag cacaaggcac ctagctcgca gcaaggtgtc cgaaccaaag 600
aagcggctgc agtggtgcaa acggggcgga aacggcggga aaaagccacg ggggcacgaa 660
ttgaggcacg ccctcgaatt tgagacgagt cacggcccca ttcgcccgcg caatggctcg 720
ccaacgcccg gtcttttgca ccacatcagg ttaccccaag ccaaaccttt gtgttaaaaa 780
gcttaacata ttataccgaa cgtaggtttg ggcgggcttg ctccgtctgt ccaaggcaac 840
atttatataa gggtctgcat cgccggctca attgaatctt ttttcttctt ctcttctcta 900
tattcattct tgaattaaac acacatcaac a 931
<210> 112
<211> 407
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 112
ccccacgttg ccggtcttgc ctcctactac ctgtccatca atgacgaggt tctcacccct 60
gcccaggtcg aggctcttat tactgagtcc aacaccggtg ttcttcccac caccaacctc 120
aagggctctc ccaacgctgt tgcctacaac ggtgttggca tttaggcaat taacagatag 180
tttgccggtg ataattctct taacctccca cactcctttg acataacgat ttatgtaacg 240
aaactgaaat ttgaccagat attgttgtaa atagaaaatc tggcttgtag gtggcaaaat 300
gcggcgtctt tgttcatcaa ttccctctgt gactactcgt catcccttta tgttcgactg 360
tcgtatttct tattttccat acatatgcaa gtgagatgcc cgtgtcc 407
<210> 113
<211> 500
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 113
ggttcatgag aagataaata tataaataca ttgagatatt aaatgcgcta gattagagag 60
cctcatactg ctcggagaga agccaagacg agtactcaaa ggggattaca ccatccatat 120
ccacagacac aagctgggga aaggttctat atacactttc cggaataccg tagtttccga 180
tgttatcaat gggggcagcc aggatttcag gcacttcggt gtctcggggt gaaatggcgt 240
tcttggcctc catcaagtcg taccatgtct tcatttgcct gtcaaagtaa aacagaagca 300
gatgaagaat gaacttgaag tgaaggacgt gactacaaca gcctgcctgg tcaaccacat 360
cattcatgtt gctgatgatc ttctgaatca gctgaagagg gtactctgtc tcaatcagat 420
caccaaattt ggggtgcagt agggcacatg atcgaagcat gagtgcagta gtagcacaat 480
aagtcattcg agcaaggtag 500
<210> 114
<211> 500
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 114
atggagcgtg tgttctgagt cgatgttttc tatggagttg tgagtgttag tagacatgat 60
gggtttatat atgatgaatg aatagatgtg attttgattt gcacgatgga attgagaact 120
ttgtaaacgt acatgggaat gtatgaatgt gggggttttg tgactggata actgacggtc 180
agtggacgcc gttgttcaaa tatccaagag atgcgagaaa ctttgggtca agtgaacatg 240
tcctctctgt tcaagtaaac catcaactat gggtagtata tttagtaagg acaggagttg 300
agagaggaaa gttgccattc tttggagtcc cagaaacgta ttttcgcgtt ccaagatcaa 360
attagtagag taatacgggc acgggaatcc attcatagtc tcaattttcc cataggtgtg 420
ctacaaggtg ttgagatgtg gtacagtacc accatgattc gagataaaga gcccagaagt 480
cattgatgag gtcaagaaat 500
<210> 115
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 115
atgaaaaagc ctgaactcac cgccacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60
agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120
gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180
cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240
ggggaattta gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300
caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 360
gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420
atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480
cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540
ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600
tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660
atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720
tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780
cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840
ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900
gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960
tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020
gaatag 1026
<210> 116
<211> 1218
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 116
atggaacccg aaactaagaa gaccaagact gactccaaga agattgttct tctcggcggc 60
gacttctgtg gccccgaggt gattgccgag gccgtcaagg tgctcaagtc tgttgctgag 120
gcctccggca ccgagtttgt gttcgaggac cgactcattg gaggagctgc cattgagaag 180
gagggcgagc ccatcaccga cgctactctc gacatctgcc gaaaggctga ctctattatg 240
ctcggtgctg tcggaggcgc tgccaacacc gtatggacca ctcccgacgg acgaaccgac 300
gtgcgacccg agcagggtct cctcaagctg cgaaaggacc tgaacctgta cgccaacctg 360
cgaccctgcc agctgctgtc gcccaagctc gccgatctct cccccatccg aaacgttgag 420
ggcaccgact tcatcattgt ccgagagctc gtcggaggta tctactttgg agagcgaaag 480
gaggatgacg gatctggcgt cgcttccgac accgagacct actccgttcc tgaggttgag 540
cgaattgccc gaatggccgc cttcctggcc cttcagcaca acccccctct tcccgtgtgg 600
tctcttgaca aggccaacgt gctggcctcc tctcgacttt ggcgaaagac tgtcactcga 660
gtcctcaagg acgaattccc ccagctcgag ctcaaccacc agctgatcga ctcggccgcc 720
atgatcctca tcaagcagcc ctccaagatg aatggtatca tcatcaccac caacatgttt 780
ggcgatatca tctccgacga ggcctccgtc atccccggtt ctctgggtct gctgccctcc 840
gcctctctgg cttctctgcc cgacaccaac gaggcgttcg gtctgtacga gccctgtcac 900
ggatctgccc ccgatctcgg caagcagaag gtcaacccca ttgccaccat tctgtctgcc 960
gccatgatgc tcaagttctc tcttaacatg aagcccgccg gtgacgctgt tgaggctgcc 1020
gtcaaggagt ccgtcgaggc tggtatcact accgccgata tcggaggctc ttcctccacc 1080
tccgaggtcg gagacttgtt gccaacaagg tcaaggagct gctcaagaag gagtaagtcg 1140
tttctacgac gcattgatgg aaggagcaaa ctgacgcgcc tgcgggttgg tctaccggca 1200
gggtccgcta gtgtataa 1218
<210> 117
<211> 855
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 117
atgccctcct acgaagctcg agctaacgtc cacaagtccg cctttgccgc tcgagtgctc 60
aagctcgtgg cagccaagaa aaccaacctg tgtgcttctc tggatgttac caccaccaag 120
gagctcattg agcttgccga taaggtcgga ccttatgtgt gcatgatcaa aacccatatc 180
gacatcattg acgacttcac ctacgccggc actgtgctcc ccctcaagga acttgctctt 240
aagcacggtt tcttcctgtt cgaggacaga aagttcgcag atattggcaa cactgtcaag 300
caccagtacc ggtgtcaccg aatcgccgag tggtccgata tcaccaacgc ccacggtgta 360
cccggaaccg gaatcattgc tggcctgcga gctggtgccg aggaaactgt ctctgaacag 420
aagaaggagg acgtctctga ctacgagaac tcccagtaca aggagttcct agtcccctct 480
cccaacgaga agctggccag aggtctgctc atgctggccg agctgtcttg caagggctct 540
ctggccactg gcgagtactc caagcagacc attgagcttg cccgatccga ccccgagttt 600
gtggttggct tcattgccca gaaccgacct aagggcgact ctgaggactg gcttattctg 660
acccccgggg tgggtcttga cgacaaggga gacgctctcg gacagcagta ccgaactgtt 720
gaggatgtca tgtctaccgg aacggatatc ataattgtcg gccgaggtct gtacggccag 780
aaccgagatc ctattgagga ggccaagcga taccagaagg ctggctggga ggcttaccag 840
aagattaact gttag 855
<210> 118
<211> 619
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 118
gtggtaatcg accgactaac catttttagc tgacaaacac ttgctaactc ctataacgaa 60
tgaatgacta acttggcata ttgttaccaa gtattacttg ggatatagtt gagtgtaacc 120
attgctaaga atccaaactg gagcttctaa aggtctggga gtcgccgtat gtgttcatat 180
cgaaatcaaa gaaatcataa tcgcaacaga attcaaaatc aagcagatta atatccatta 240
ttgtactcgg atcgtgacat atctgatatg atctcggata tgatctctga ctgtttactg 300
ggagatttgt tgaagatttg ttgaggttat ctgaaaagta gacaatagag acaaaatgac 360
gatatcaaga actgaatcgg gccgaaatac tcggtatcat tcccttcagc agtaactgta 420
ttgctctatc aatgcgacga gatacctcca caattaatac tgtatacgct ctaccactca 480
tatctccaat gctaaaatat attcatgccc aggacctctg tgcactgcta tgcagcacag 540
tgttgtcgat tgaattggtc gtgtctggtc cctgatgctc tgtgtctcgc tgactagtcc 600
ttccatccag acctcgtca 619
<210> 119
<211> 962
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 119
tttgagccga ggcagatttg ggttgcttag taagcagacg tggcgttgca agtagatgtg 60
gcaaatgggg acgaagattc cgaggggata tcatagttcc aaggggatgt catcatttgc 120
cagctttcgc cgccactttt gacgagtttt tgtgggtcaa ataagtttag ttgaactttt 180
caaatttcag ttggcatttt gttaatagaa agggtgccgg tgctgggggg ttcattcctc 240
gggttgcaga tatcctatct gtcttagggg tatctctttc aatcgacaag atgtagttgg 300
gtaacaatta tttattaata ttctctccat ccagtacagt actaacatct tgacatctca 360
gcacaagtgc atcttcccaa gtgtttgttg gagaggttgt tgggtattac ttaggaaaca 420
gaacacagta cgtggagatc ttggatacat cgtacatgga ggttatccat aaaaaagacc 480
ctccaggact agttacaatg ccgttagatg aggaaatcca caaccctgat tcactatgaa 540
catattatct tcccccaaac ttgcgatata tggcccttga tgatagcctt gattttaccc 600
ttgatggtac ctccacgacc aaccgatctg ctgtttgaag agatattttc aaatttgaag 660
tgctcagatc tactaaacat gagtccagta attctttccg tctttccgat ttccgatatt 720
ccctttttta gcccgacttt tcactgctcc catgtcaaac gattaggact tgggagacaa 780
tcccactgtc aaaatcaccc cgatattctc tgtaaaacaa gtacttcttc cacgtgatct 840
tcaaatacct cttccacgtg accttcaaat acctcttcaa gtacctcttc cacgcgacct 900
tcaaagtccc ttcaaatacc cttctcaatt ctccccttct cctccatagt ccttctctct 960
ga 962
<210> 120
<211> 1134
<212> DNA
<213> 解脂耶鲁维亚酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 120
atgtggggaa gttcacatgc attcgctggt gaatctgatc tgacactaca actacacacc 60
aggtccaaca tgagcgacaa tacgacaatc aaaaagccga tccgacccaa accgatccgg 120
acggaacgcc tgccttacgc tggggccgca gaaatcatcc gagccaacca gaaagaccac 180
tactttgagt ccgtgcttga acagcatctc gtcacgtttc tgcagaaatg gaagggagta 240
cgatttatcc accagtacaa ggaggagctg gagacggcgt ccaagtttgc atatctcggt 300
ttgtgtacgc ttgtgggctc caagactctc ggagaagagt acaccaatct catgtacact 360
atcagagacc gaacagctct accgggggtg gtgagacggt ttggctacgt gctttccaac 420
actctgtttc catacctgtt tgtgcgctac atgggcaagt tgcgcgccaa actgatgcgc 480
gagtatcccc atctggtgga gtacgacgaa gatgagcctg tgcccagccc ggaaacatgg 540
aaggagcggg tcatcaagac gtttgtgaac aagtttgaca agttcacggc gctggagggg 600
tttaccgcga tccacttggc gattttctac gtctacggct cgtactacca gctcagtaag 660
cggatctggg gcatgcgtta tgtatttgga caccgactgg acaagaatga gcctcgaatc 720
ggttacgaga tgctcggtct gctgattttc gcccggtttg ccacgtcatt tgtgcagacg 780
ggaagagagt acctcggagc gctgctggaa aagagcgtgg agaaagaggc aggggagaag 840
gaagatgaaa aggaagcggt tgtgccgaaa aagaagtcgt caattccgtt cattgaggat 900
acagaagggg agacggaaga caagatcgat ctggaggacc ctcgacagct caagttcatt 960
cctgaggcgt ccagagcgtg cactctgtgt ctgtcataca ttagtgcgcc ggcatgtacg 1020
ccatgtggac actttttctg ttgggactgt atttccgaat gggtgagaga gaagcccgag 1080
tgtcccttgt gtcggcaggg tgtgagagag cagaacttgt tgcctatcag ataa 1134
<210> 121
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 121
atgacctcta tcaacgtgaa gctgctgtac cactacgtgc tgaccaactt cttcaacctg 60
tgcctgttcc ccctgactgc ttttcctgcc ggcaaggctt ctcaactgac caccaacgac 120
ctgcaccacc tgtactctta cctgcaccac aacctgatca ccgtgaccct gctgtttgcc 180
ttcaccgtgt tcggctctat cctgtacatc gtgaccagac ccaagcctgt gtacctggtg 240
gactactctt gttacctgcc ccccagacat ctgtcttgcg gcatctctcg agtgatggag 300
atcttctacg agatccgaaa gtctgacccc tctcgagagg tgcctttcga cgacccttct 360
tctctggagt tcctgcgaaa gatccaggag cgatctggac tgggagacga gacttatgga 420
ccccagggac tggttcatga tatgcccctg cgaatgaatt ttgccgccgc ccgagaagaa 480
actgagcagg tgatcaacgg agccctggag aagctgttcg agaacaccaa ggtgaacccc 540
cgagagattg gcatcctggt ggtgaactct tctatgttca accccacccc ctctctttct 600
gccatggtgg tgaacacctt caagctgcga tctaacatca agtctttctc tctgggcggc 660
atgggatgtt ctgccggcat catcgctatc gacctggcta aggacctgct gcacgtgcac 720
aagaacacct acgccctggt ggtgtctacc gagaacatca cccactctac ctacaccggc 780
gacaaccgat ctatgatggt gtctaactgc ctgttcagaa tgggcggagc cgccattctg 840
ctgtctaaca aggctggcga ccgacgacga tctaagtaca agctggccca cactgtgaga 900
actcacaccg gcgctgacga tcagtctttc cgatgcgtgc gacaggagga tgatgacaga 960
ggcaagatcg gcgtgtgcct gtctaaagac atcaccgccg tggccggaaa aaccgtgacc 1020
aagaacatcg ctaccctggg acctcttgtg ctgcctctgt ctgagaagtt cctgtacgtg 1080
gtgtctctga tggccaagaa gctgttcaag aacaagatca agcacaccta cgtgcccgat 1140
ttcaagctgg ccatcgacca cttctgcatc catgctggcg gaagagctgt gattgacgtg 1200
ctggagaaga acctggccct gtctcctgtg gatgtggagg cttctcgatc taccctgcac 1260
cgattcggca acacctcttc ttcttctatc tggtacgagc tggcctacat cgaagccaag 1320
ggccgaatga agaagggcaa caaggtgtgg caaatcgcca tcggctctgg cttcaagtgc 1380
aactctgccg tttgggtggc cctgtgtaat gtgaagccct ctgtgaactc tccttgggag 1440
cactgcattg acagataccc cgtggagatc aactacggct cttctaagtc tgagacccga 1500
gcccaaaacg gccgatctaa ggacgagctg taa 1533
<210> 122
<211> 1557
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 122
atgactatcg actcacaata ctacaagtcg cgagacaaaa acgacacggc acccaaaatc 60
gcgggaatcc gatatgcccc gctatcgaca ccattactca accgatgtga gaccttctct 120
ctggtctggc acattttcag cattcccact ttcctcacaa ttttcatgct atgctgcgca 180
attccactgc tctggccatt tgtgattgcg tatgtagtgt acgctgttaa agacgactcc 240
ccgtccaacg gaggagtggt caagcgatac tcgcctattt caagaaactt cttcatctgg 300
aagctctttg gccgctactt ccccataact ctgcacaaga cggtggatct ggagcccacg 360
cacacatact accctctgga cgtccaggag tatcacctga ttgctgagag atactggccg 420
cagaacaagt acctccgagc aatcatctcc accatcgagt actttctgcc cgccttcatg 480
aaacggtctc tttctatcaa cgagcaggag cagcctgccg agcgagatcc tctcctgtct 540
cccgtttctc ccagctctcc gggttctcaa cctgacaagt ggattaacca cgacagcaga 600
tatagccgtg gagaatcatc tggctccaac ggccacgcct cgggctccga acttaacggc 660
aacggcaaca atggcaccac taaccgacga cctttgtcgt ccgcctctgc tggctccact 720
gcatctgatt ccacgcttct taacgggtcc ctcaactcct acgccaacca gatcattggc 780
gaaaacgacc cacagctgtc gcccacaaaa ctcaagccca ctggcagaaa atacatcttc 840
ggctaccacc cccacggcat tatcggcatg ggagcctttg gtggaattgc caccgaggga 900
gctggatggt ccaagctctt tccgggcatc cctgtttctc ttatgactct caccaacaac 960
ttccgagtgc ctctctacag agagtacctc atgagtctgg gagtcgcttc tgtctccaag 1020
aagtcctgca aggccctcct caagcgaaac cagtctatct gcattgtcgt tggtggagca 1080
caggaaagtc ttctggccag acccggtgtc atggacctgg tgctactcaa gcgaaagggt 1140
tttgttcgac ttggtatgga ggtcggaaat gtcgcccttg ttcccatcat ggcctttggt 1200
gagaacgacc tctatgacca ggttagcaac gacaagtcgt ccaagctgta ccgattccag 1260
cagtttgtca agaacttcct tggattcacc cttcctttga tgcatgcccg aggcgtcttc 1320
aactacgatg tcggtcttgt cccctacagg cgacccgtca acattgtggt tggttccccc 1380
attgacttgc cttatctccc acaccccacc gacgaagaag tgtccgaata ccacgaccga 1440
tacatcgccg agctgcagcg aatctacaac gagcacaagg atgaatattt catcgattgg 1500
accgaggagg gcaaaggagc cccagagttc cgaatgattg agaaggacga gctgtaa 1557
<210> 123
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 123
atggtgaaaa acgtggacca agtggatctc tcgcaggtcg acaccattgc ctccggccga 60
gatgtcaact acaaggtcaa gtacacctcc ggcgttaaga tgagccaggg cgcctacgac 120
gacaagggcc gccacatttc cgagcagccc ttcacctggg ccaactggca ccagcacatc 180
aactggctca acttcattct ggtgattgcg ctgcctctgt cgtcctttgc tgccgctccc 240
ttcgtctcct tcaactggaa gaccgccgcg tttgctgtcg gctattacat gtgcaccggt 300
ctcggtatca ccgccggcta ccaccgaatg tgggcccatc gagcctacaa ggccgctctg 360
cccgttcgaa tcatccttgc tctgtttgga ggaggagctg tcgagggctc catccgatgg 420
tgggcctcgt ctcaccgagt ccaccaccga tggaccgact ccaacaagga cccttacgac 480
gcccgaaagg gattctggtt ctcccacttt ggctggatgc tgcttgtgcc caaccccaag 540
aacaagggcc gaactgacat ttctgacctc aacaacgact gggttgtccg actccagcac 600
aagtactacg tttacgttct cgtcttcatg gccattgttc tgcccaccct cgtctgtggc 660
tttggctggg gcgactggaa gggaggtctt gtctacgccg gtatcatgcg atacaccttt 720
gtgcagcagg tgactttctg tgtcaactcc cttgcccact ggattggaga gcagcccttc 780
gacgaccgac gaactccccg agaccacgct cttaccgccc tggtcacctt tggagagggc 840
taccacaact tccaccacga gttcccctcg gactaccgaa acgccctcat ctggtaccag 900
tacgacccca ccaagtggct catctggacc ctcaagcagg ttggtctcgc ctgggacctc 960
cagaccttct cccagaacgc catcgagcag ggtctcgtgc agcagcgaca gaagaagctg 1020
gacaagtggc gaaacaacct caactggggt atccccattg agcagctgcc tgtcattgag 1080
tttgaggagt tccaagagca ggccaagacc cgagatctgg ttctcatttc tggcattgtc 1140
cacgacgtgt ctgcctttgt cgagcaccac cctggtggaa aggccctcat tatgagcgcc 1200
gtcggcaagg acggtaccgc tgtcttcaac ggaggtgtct accgacactc caacgctggc 1260
cacaacctgc ttgccaccat gcgagtttcg gtcattcgag gcggcatgga ggttgaggtg 1320
tggaagactg cccagaacga aaagaaggac cagaacattg tctccgatga gagtggaaac 1380
cgaatccacc gagctggtct ccaggccacc cgggtcgaga accccggtat gtctggcatg 1440
gctgctaagg acgagctgta g 1461
<210> 124
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 124
atgacctctg tgaacgtgaa gctgatctac cactacgtga tcaccaacct gttcaacctg 60
tgcttcttcc ccctgactgc tatcgttgcc ggcaaagctt ctcgactgac cattgacgac 120
ctgcaccacc tgtactactc ttacctgcag cacaacctga ttaccatcgc ccccctgttt 180
gcctttaccg tgttcggctc tgtgctgtac attgccaccc gacctaagcc tgtgtacctg 240
gtggagtact cttgttacct gccccccact cactgtcgat cttctatctc taaggtgatg 300
gacatcttct accaggtgcg aaaggccgac ccctctagaa atggcacctg cgacgactct 360
tcttggctgg acttcctgcg aaagatccag gagcgatctg gcctgggaga tgagactcat 420
ggccctgagg gactgcttca cgtgcctccc agaaaaacct ttgccgccgc tagagaagaa 480
accgagaagg tgattatcgg cgccctggag aacctgttcg agaacaccaa ggtgaacccc 540
aaggacatcg gcatcctggt ggtgaactct tctatgttca accccacccc ctctctttct 600
gccatggtgg tgaacacctt caagctgcga tctaacgtgc gatctttcaa cctgggaggc 660
atgggatgtt ctgctggcgt gatcgctatt gacctggcca aagacctgct gcacgtgcac 720
aagaacacct acgccctggt ggtgtctacc gagaacatca cctacaacat ctacgccggc 780
gacaacaagt ctatgatggt gtctaactgc ctgttccgag tgggaggagc cgctattctg 840
ctgtctaaca agccccgaga ccgacgacga tctaagtacg agctggtgca caccgtgcga 900
actcataccg gagctgacga caagtctttc cgatgcgtgc aacagggcga tgacgagtct 960
ggaaagaccg gcgtgtctct gtctaaggac atcaccgacg tggctggaag aaccgtgaag 1020
aagaacatct ctaccctggg ccctctgatt ctgcctctgt ctgagaagct gctgttcttc 1080
gtgaccttca tgggcaagaa gctgttcaag gacaagatca agcactacta cgtgcccgac 1140
ttcaagcttg ccatcgacca cttctgtatc cacgctggcg gacgagctgt gattgatgtg 1200
ctggagaaga accttggact ggcccctatt gatgtggagg cctctcgatc tacccttcac 1260
cgattcggca acacctcttc ttcttctatc tggtacgagc tggcctacat cgaagctaag 1320
ggccgaatga agaagggcaa caaggtgtgg caaatcgctc tgggctctgg cttcaagtgc 1380
aactctgccg tttgggtggc cctgagaaat gtgaaggcct ctcgaaagtc tccttgggag 1440
cactgcattg accgataccc cgtgaagatc gactacgact ctgccaagtc tgaggtgaga 1500
gtgcagaacg gccgatctaa ggacgagctg taa 1533
<210> 125
<211> 1530
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 125
atgacctcta tcaacgtgaa gctgctgtac cactacgtgc tgaccaactt cttcaacctg 60
tgcctgttcc ccctgactgc ttttcctgcc ggcaaggctt ctcaactgac caccaacgac 120
ctgcaccacc tgtactctta cctgcaccac aacctgatca ccgtgaccct gctgtttgcc 180
ttcaccgtgt tcggctctat cctgtacatc gtgaccagac ccaagcctgt gtacctggtg 240
gactactctt gttacctgcc ccccagacat ctgtcttgcg gcatctctcg agtgatggag 300
atcttctacg agatccgaaa gtctgacccc tctcgagagg tgcctttcga cgacccttct 360
tctctggagt tcctgcgaaa gatccaggag cgatctggac tgggagacga gacttatgga 420
ccccagggac tggttcatga tatgcccctg cgaatgaatt ttgccgccgc ccgagaagaa 480
actgagcagg tgatcaacgg agccctggag aagctgttcg agaacaccaa ggtgaacccc 540
cgagagattg gcatcctggt ggtgaactct tctatgttca accccacccc ctctctttct 600
gccatggtgg tgaacacctt caagctgcga tctaacatca agtctttctc tctgggcggc 660
atgggatgtt ctgccggcat catcgctatc gacctggcta aggacctgct gcacgtgcac 720
aagaacacct acgccctggt ggtgtctacc gagaacatca cccactctac ctacaccggc 780
gacaaccgat ctatgatggt gtctaactgc ctgttcagaa tgggcggagc cgccattctg 840
ctgtctaaca aggctggcga ccgacgacga tctaagtaca agctggccca cactgtgaga 900
actcacaccg gcgctgacga tcagtctttc cgatgcgtgc gacaggagga tgatgacaga 960
ggcaagatcg gcgtgtgcct gtctaaagac atcaccgccg tggccggaaa aaccgtgacc 1020
aagaacatcg ctaccctggg acctcttgtg ctgcctctgt ctgagaagtt cctgtacgtg 1080
gtgtctctga tggccaagaa gctgttcaag aacaagatca agcacaccta cgtgcccgat 1140
ttcaagctgg ccatcgacca cttctgcatc catgctggcg gaagagctgt gattgacgtg 1200
ctggagaaga acctggccct gtctcctgtg gatgtggagg cttctcgatc taccctgcac 1260
cgattcggca acacctcttc ttcttctatc tggtacgagc tggcctacat cgaagccaag 1320
ggccgaatga agaagggcaa caaggtgtgg caaatcgcca tcggctctgg cttcaagtgc 1380
aactctgccg tttgggtggc cctgtgtaat gtgaagccct ctgtgaactc tccttgggag 1440
cactgcattg acagataccc cgtggagatc aactacggct cttctaagtc tgagacccga 1500
gcccaaaacg gccgatcttc caagctgtaa 1530
<210> 126
<211> 1530
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 126
atgacctctg tgaacgtgaa gctgatctac cactacgtga tcaccaacct gttcaacctg 60
tgcttcttcc ccctgactgc tatcgttgcc ggcaaagctt ctcgactgac cattgacgac 120
ctgcaccacc tgtactactc ttacctgcag cacaacctga ttaccatcgc ccccctgttt 180
gcctttaccg tgttcggctc tgtgctgtac attgccaccc gacctaagcc tgtgtacctg 240
gtggagtact cttgttacct gccccccact cactgtcgat cttctatctc taaggtgatg 300
gacatcttct accaggtgcg aaaggccgac ccctctagaa atggcacctg cgacgactct 360
tcttggctgg acttcctgcg aaagatccag gagcgatctg gcctgggaga tgagactcat 420
ggccctgagg gactgcttca cgtgcctccc agaaaaacct ttgccgccgc tagagaagaa 480
accgagaagg tgattatcgg cgccctggag aacctgttcg agaacaccaa ggtgaacccc 540
aaggacatcg gcatcctggt ggtgaactct tctatgttca accccacccc ctctctttct 600
gccatggtgg tgaacacctt caagctgcga tctaacgtgc gatctttcaa cctgggaggc 660
atgggatgtt ctgctggcgt gatcgctatt gacctggcca aagacctgct gcacgtgcac 720
aagaacacct acgccctggt ggtgtctacc gagaacatca cctacaacat ctacgccggc 780
gacaacaagt ctatgatggt gtctaactgc ctgttccgag tgggaggagc cgctattctg 840
ctgtctaaca agccccgaga ccgacgacga tctaagtacg agctggtgca caccgtgcga 900
actcataccg gagctgacga caagtctttc cgatgcgtgc aacagggcga tgacgagtct 960
ggaaagaccg gcgtgtctct gtctaaggac atcaccgacg tggctggaag aaccgtgaag 1020
aagaacatct ctaccctggg ccctctgatt ctgcctctgt ctgagaagct gctgttcttc 1080
gtgaccttca tgggcaagaa gctgttcaag gacaagatca agcactacta cgtgcccgac 1140
ttcaagcttg ccatcgacca cttctgtatc cacgctggcg gacgagctgt gattgatgtg 1200
ctggagaaga accttggact ggcccctatt gatgtggagg cctctcgatc tacccttcac 1260
cgattcggca acacctcttc ttcttctatc tggtacgagc tggcctacat cgaagctaag 1320
ggccgaatga agaagggcaa caaggtgtgg caaatcgctc tgggctctgg cttcaagtgc 1380
aactctgccg tttgggtggc cctgagaaat gtgaaggcct ctcgaaagtc tccttgggag 1440
cactgcattg accgataccc cgtgaagatc gactacgact ctgccaagtc tgaggtgaga 1500
gtgcagaacg gccgatcttc caagctgtaa 1530
<210> 127
<211> 1596
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 127
atgctttcac tacgtcaatc tataagattt ttcaagccag ccacaagaac tttgtgtagc 60
tctagatatc tgcttatgac ctctatcaac gtgaagctgc tgtaccacta cgtgctgacc 120
aacttcttca acctgtgcct gttccccctg actgcttttc ctgccggcaa ggcttctcaa 180
ctgaccacca acgacctgca ccacctgtac tcttacctgc accacaacct gatcaccgtg 240
accctgctgt ttgccttcac cgtgttcggc tctatcctgt acatcgtgac cagacccaag 300
cctgtgtacc tggtggacta ctcttgttac ctgcccccca gacatctgtc ttgcggcatc 360
tctcgagtga tggagatctt ctacgagatc cgaaagtctg acccctctcg agaggtgcct 420
ttcgacgacc cttcttctct ggagttcctg cgaaagatcc aggagcgatc tggactggga 480
gacgagactt atggacccca gggactggtt catgatatgc ccctgcgaat gaattttgcc 540
gccgcccgag aagaaactga gcaggtgatc aacggagccc tggagaagct gttcgagaac 600
accaaggtga acccccgaga gattggcatc ctggtggtga actcttctat gttcaacccc 660
accccctctc tttctgccat ggtggtgaac accttcaagc tgcgatctaa catcaagtct 720
ttctctctgg gcggcatggg atgttctgcc ggcatcatcg ctatcgacct ggctaaggac 780
ctgctgcacg tgcacaagaa cacctacgcc ctggtggtgt ctaccgagaa catcacccac 840
tctacctaca ccggcgacaa ccgatctatg atggtgtcta actgcctgtt cagaatgggc 900
ggagccgcca ttctgctgtc taacaaggct ggcgaccgac gacgatctaa gtacaagctg 960
gcccacactg tgagaactca caccggcgct gacgatcagt ctttccgatg cgtgcgacag 1020
gaggatgatg acagaggcaa gatcggcgtg tgcctgtcta aagacatcac cgccgtggcc 1080
ggaaaaaccg tgaccaagaa catcgctacc ctgggacctc ttgtgctgcc tctgtctgag 1140
aagttcctgt acgtggtgtc tctgatggcc aagaagctgt tcaagaacaa gatcaagcac 1200
acctacgtgc ccgatttcaa gctggccatc gaccacttct gcatccatgc tggcggaaga 1260
gctgtgattg acgtgctgga gaagaacctg gccctgtctc ctgtggatgt ggaggcttct 1320
cgatctaccc tgcaccgatt cggcaacacc tcttcttctt ctatctggta cgagctggcc 1380
tacatcgaag ccaagggccg aatgaagaag ggcaacaagg tgtggcaaat cgccatcggc 1440
tctggcttca agtgcaactc tgccgtttgg gtggccctgt gtaatgtgaa gccctctgtg 1500
aactctcctt gggagcactg cattgacaga taccccgtgg agatcaacta cggctcttct 1560
aagtctgaga cccgagccca aaacggccga tcttaa 1596

Claims (20)

1.一种重组酵母菌株，其特征在于，过表达：
(a) 一种编码Δ9去饱和酶的基因；
(b) 至少四种编码脂肪酸延长酶的基因；
(c) 一种编码甘油二酯酰基转移酶的基因；
(d) 编码靶向内质网的脂肪酸延长酶的基因；
(e) 编码靶向内质网的甘油二酯酰基转移酶的基因；和
(f)编码靶向内质网的Δ9去饱和酶基因；
其中，所述编码Δ9去饱和酶的基因为解脂耶鲁维亚酵母SCD基因，其核苷酸序列如SEQID No：84所示；
所述的四种编码脂肪酸延长酶基因分别为高山被孢霉C16/18延长酶基因MaLCE1，其核苷酸序列如SEQ ID No：93所示；拟南芥AtFAE1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：94所示；非洲芥菜BtFAE1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：95所示；碎米芥CgKCS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：96所示；
所述编码甘油二酯酰基转移酶的基因为解脂耶鲁维亚酵母DGAT1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：83所示；
所述编码靶向内质网的脂肪酸延长酶的基因为带有靶向内质网信号肽编码序列的碎米芥CgKCSER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：121所示；
所述编码靶向内质网的甘油二酯酰基转移酶的基因为带有靶向内质网信号肽编码序列的解脂耶鲁维亚酵母DGAT1ER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：122所示；
所述编码靶向内质网的Δ9去饱和酶的基因为带有靶向内质网信号肽编码序列的解脂耶鲁维亚酵母SCDER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：123所示；
并且，所述重组酵母菌株为重组解脂耶鲁维亚酵母菌株。
2.根据权利要求1所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述重组酵母菌株中过表达脂肪酸合成表达模块，具体包括神经酸生产相关的脂肪酸延长酶和去饱和酶基因。
3.根据权利要求2所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述重组酵母菌株进一步表达：
（5）大鼠脂肪酸延长酶2基因rELO2，如SEQ ID No：97所示；
（6）微小隐孢子虫长链脂肪酸延长酶基因CpLCE，如SEQ ID No：98所示；或
（7）羊脂肪酸延长酶6基因gELOVL6，如SEQ ID No：99所示。
4.根据权利要求2所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述重组酵母菌株进一步表达：
（2）刺孢小克银汉霉Δ9脂肪酸去饱和酶基因D9DMB，如SEQ ID No：100所示；
（3）线虫Δ9脂肪酸去饱和酶基因CeFAT6，如SEQ ID No：101所示；
（4）高山被孢霉Δ9脂肪酸去饱和酶基因MaOLE2，如SEQ ID No：102所示；
（5）拟南芥AtADS1，如SEQ ID No：103所示；或
（6）拟南芥AtADS2，如SEQ ID No：104所示。
5.根据权利要求1所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述重组酵母菌株中过表达甘油三酯合成模块，具体指二酰基甘油酰基转移酶基因，是催化三酰甘油（TAG）合成最后一步反应的酶，也是TAG合成过程中唯一的关键酶和限速酶，提高酵母细胞中甘油二酯酰基转移酶的表达量可以提高细胞内油脂的含量。
6.根据权利要求1所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述重组酵母菌株中过表达酵母油脂合成与分解亚细胞水平调节模块，具体是指内质网水平的调控，即在相应基因的3'末端添加内质网滞留信号肽KDEL。
7.根据权利要求1所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述重组酵母菌株进一步过表达：
(a)两种编码靶向内质网的脂肪酸延长酶的基因；和/或
(b)两种编码靶向过氧化物酶体的脂肪酸延长酶的基因；
其中，所述两种编码靶向内质网的脂肪酸延长酶的基因分别为带有靶向内质网信号肽编码序列的碎米芥CgKCSER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：121所示；带有靶向内质网信号肽编码序列的非洲芥菜BtFAE1ER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：124所示；
所述两种编码靶向过氧化物酶体的脂肪酸延长酶的基因分别为带有靶向过氧化物酶体信号肽编码序列的碎米芥CgKCSPTS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：125所示；带有靶向过氧化物酶体信号肽编码序列的非洲芥菜BtFAE1PTS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：126所示。
8.根据权利要求1所述的重组酵母菌株，其特征在于，进一步过表达：
(a)一种编码醛脱氢酶的基因；
(b)一种编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因；
(c)一种编码谷胱甘肽二硫化物还原酶的基因；和/或
(d)一种编码谷胱甘肽过氧化物酶的基因。
9.根据权利要求8所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述重组酵母菌种中进一步包括氧化还原平衡的调控模块，涉及维持神经酸合成过程中还原力NADPH再生和氧化应激防御相关的基因。
10.根据权利要求8所述的重组酵母菌株，其特征在于，
所述编码醛脱氢酶的基因为大肠杆菌EcAldH基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：105所示；
所述编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因为酿酒酵母ScZwf基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo：106所示；
所述谷胱甘肽二硫化物还原酶的基因为解脂耶鲁维亚酵母ylGSR基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：91所示；
所述谷胱甘肽过氧化物酶的基因为解脂耶鲁维亚酵母ylGPO基因，其核苷酸序列如SEQID No：92所示。
11.一种重组酵母菌株，其特征在于，过表达：
(a)一种编码Δ9去饱和酶的基因；
(b)至少三种编码脂肪酸延长酶的基因；
(c)一种编码甘油二酯酰基转移酶的基因；和
(d)一种编码磷脂酶A2的基因；其中，
所述编码Δ9去饱和酶基因为解脂耶鲁维亚酵母SCD基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：84所示；
所述三种编码脂肪酸延长酶的基因分别为拟南芥AtFAE1基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo：94所示、非洲芥菜BtFAE1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：95所示、碎米芥CgKCS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：96所示；
所述编码甘油二酯酰基转移酶基因为解脂耶鲁维亚酵母DGAT1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：83所示；
所述编码磷脂酶A2基因为PLA2-1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：85所示；或PLA2-2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：86所示；或PLA2-3基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：87所示；或PLA2-4基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：88所示；或PLA2-5基因，其核苷酸序列如SEQID No：89所示；或PLA2-6基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：90所示；
并且，所述重组酵母菌株为重组解脂耶鲁维亚酵母菌株。
12.一种重组酵母菌株，其特征在于，过表达：
(a)一种编码靶向过氧化物酶体的脂肪酸延长酶的基因；
(b)一种编码脂肪酸延长酶的基因；
(c)一种编码靶向内质网的脂肪酸延长酶的基因；
(d)一种编码靶向内质网的甘油二酯酰基转移酶的基因；和
(e)一种编码靶向内质网的Δ9去饱和酶基因；
其中，所述靶向过氧化物酶体的脂肪酸延长酶基因为带有靶向过氧化物酶体信号肽编码序列的碎米芥CgKCSPTS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：125所示；
所述脂肪酸延长酶基因为高山被孢霉C16/18延长酶基因MaLCE1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：93所示；
所述靶向内质网的脂肪酸延长酶的基因为带有靶向内质网信号肽编码序列的碎米芥CgKCSER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：121所示；
所述靶向内质网的甘油二酯酰基转移酶基因为带有靶向内质网信号肽编码序列的解脂耶鲁维亚酵母DGAT1ER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：122所示；
所述靶向内质网的Δ9去饱和酶基因为带有靶向内质网信号肽编码序列的解脂耶鲁维亚酵母SCDER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：123所示；
并且，所述重组酵母菌株为重组解脂耶鲁维亚酵母菌株。
13.一种重组酵母菌株，其特征在于，过表达：
(a)一种编码Δ9去饱和酶的基因；
(b)一种编码脂肪酸延长酶的基因；
(c)一种编码靶向内质网的脂肪酸延长酶的基因；和
(d)一种编码靶向线粒体的脂肪酸延长酶的基因；
其中，所述编码Δ9去饱和酶基因为高山被孢霉Δ9脂肪酸去饱和酶MaOLE2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：102所示；
所述编码脂肪酸延长酶为羊脂肪酸延长酶6 gELOVL6基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo：99所示；
所述编码靶向内质网的脂肪酸延长酶基因为带有靶向内质网信号肽编码序列的碎米芥CgKCSER，其核苷酸序列如SEQ ID No：121所示；
所述编码靶向线粒体的脂肪酸延长酶基因为带有靶向线粒体信号肽编码序列的碎米芥CgKCSMTS，其核苷酸序列如SEQ ID No：127所示；
并且，所述重组酵母菌株为重组解脂耶鲁维亚酵母菌株。
14.一种重组酵母菌株，其特征在于，过表达：
(a)两种编码Δ9去饱和酶的基因；
(b)三种编码脂肪酸延长酶的基因；和
(c)一种编码甘油二酯酰基转移酶的基因；
其中，所述两种编码Δ9去饱和酶基因分别为解脂耶鲁维亚酵母SCD基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：84所示；拟南芥AtADS1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：103所示；或者所述两种编码Δ9去饱和酶基因分别为解脂耶鲁维亚酵母SCD基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo：84所示；拟南芥AtADS2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：104所示；
所述三种编码脂肪酸延长酶基因分别为拟南芥AtFAE1基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo：94所示；非洲芥菜BtFAE1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：95所示；碎米芥CgKCS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：96所示；
所述编码甘油二酯酰基转移酶为解脂耶鲁维亚酵母DGAT1基因，如SEQ ID No：83所示；
并且，所述重组酵母菌株为重组解脂耶鲁维亚酵母菌株。
15.一种重组酵母菌株，其特征在于，该菌株中过氧化物酶体生物发生因子10的表达被下调，并且进一步过表达：
(a)一种编码靶向过氧化物酶体的脂肪酸延长酶的基因；
(b)一种编码脂肪酸延长酶的基因；
(c)一种编码靶向内质网的脂肪酸延长酶的基因；
(d)一种编码靶向内质网的甘油二酯酰基转移酶的基因；和
(e)一种编码靶向内质网的Δ9去饱和酶基因；其中，所述表达下调的过氧化物酶体生物发生因子10为pex10基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：120所示；
所述编码靶向过氧化物酶体的脂肪酸延长酶的基因为带有靶向过氧化物酶体信号肽编码序列的碎米芥CgKCSPTS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：125所示；
所述编码脂肪酸延长酶的基因为高山被孢霉C16/18延长酶MaLCE1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：93所示；
所述编码靶向内质网的脂肪酸延长酶的基因为带有靶向内质网信号肽编码序列的碎米芥CgKCSER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：121所示；
所述编码靶向内质网的甘油二酯酰基转移酶的基因为带有靶向内质网信号肽编码序列的解脂耶鲁维亚酵母DGAT1ER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：122所示；
所述编码靶向内质网的Δ9去饱和酶基因为带有靶向内质网信号肽编码序列的解脂耶鲁维亚酵母SCDER基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：123所示；
并且，所述重组酵母菌株为重组解脂耶鲁维亚酵母菌株。
16.根据权利要求15所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述重组酵母菌株中包括甘油三酯分解模块，具体涉及过氧化物酶体生物发生因子10基因敲除模块，该基因的敲除可减少长链脂肪酸的分解。
17.利用权利要求1-16所述的任一重组酵母菌株制备微生物油的应用。
18.利用权利要求1-16所述的任一重组酵母菌株制备微生物油的方法：
(a) 培养权利要求1-16所述的任一重组酵母菌株，其中产生包含神经酸的微生物油；以及
(b) 回收所述步骤(a)的微生物油。
19.利用权利要求1-16所述的任一重组酵母菌株制备神经酸的应用。
20.利用权利要求1-16所述的任一重组酵母菌株制备神经酸的方法，包括：
(a) 培养权利要求1-16所述的任一重组酵母菌株，产生微生物油；以及
(b) 回收所述步骤(a)的微生物油，提取神经酸。
CN201810309632.4A 2018-04-09 2018-04-09 生产神经酸的重组酵母菌株及其应用 Active CN110358692B (zh)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810309632.4A CN110358692B (zh) 2018-04-09 2018-04-09 生产神经酸的重组酵母菌株及其应用
EP19785189.2A EP3778866B1 (en) 2018-04-09 2019-04-08 Recombinant yeast strain for producing nervonic acids and application thereof
US17/046,672 US11603545B2 (en) 2018-04-09 2019-04-08 Recombinant yeast strain for producing nervonic acids and application thereof
PCT/CN2019/081736 WO2019196791A1 (zh) 2018-04-09 2019-04-08 生产神经酸的重组酵母菌株及其应用
JP2020556255A JP7261815B2 (ja) 2018-04-09 2019-04-08 ネルボン酸を生産する組換え酵母菌株およびその使用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810309632.4A CN110358692B (zh) 2018-04-09 2018-04-09 生产神经酸的重组酵母菌株及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110358692A CN110358692A (zh) 2019-10-22
CN110358692B true CN110358692B (zh) 2021-07-27

Family

ID=68162802

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810309632.4A Active CN110358692B (zh) 2018-04-09 2018-04-09 生产神经酸的重组酵母菌株及其应用

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11603545B2 (zh)
EP (1) EP3778866B1 (zh)
JP (1) JP7261815B2 (zh)
CN (1) CN110358692B (zh)
WO (1) WO2019196791A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891653A (zh) * 2022-05-17 2022-08-12 南京工业大学 一株高产神经酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021045234A1 (ja) * 2019-09-06 2021-03-11 国立大学法人東海国立大学機構 トランス脂肪酸含有エステル体を分解する新規エステラーゼ
CN113999870B (zh) * 2020-02-26 2024-02-20 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 一种表达cbdas的重组酿酒酵母及其构建方法和应用
CN114517164A (zh) * 2020-11-19 2022-05-20 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种脂肪酸延长酶基因在酵母合成神经酸中的应用
CN112299986A (zh) * 2020-11-25 2021-02-02 宝鸡文理学院 一种元宝枫籽油中神经酸的分离纯化工艺
CN113462688B (zh) * 2021-06-30 2022-07-29 华中科技大学 一种蓝光调节启动子、蓝光调节启动子的融合基因、蓝光介导调节质粒及构建方法和应用
CN114907999B (zh) * 2021-12-17 2023-08-29 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种内质网调节因子在促进酵母合成油脂中的应用
CN114958636B (zh) * 2022-05-13 2023-07-14 南京工业大学 一株高产石榴酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1816632A (zh) * 2003-07-02 2006-08-09 纳幕尔杜邦公司 用于改变产油酵母多不饱和脂肪酸和油含量的酰基转移酶
CN1703144B (zh) * 2002-05-22 2011-04-13 孟山都技术有限公司 来源于真菌的脂肪酸脱氢酶
CN108271383A (zh) * 2015-04-02 2018-07-10 比奥派多利亚有限公司 真菌细胞和生产非常长链脂肪酸衍生产物的方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2542564A1 (en) * 2003-11-12 2005-05-26 E.I. Du Pont De Nemours And Company Delta-15 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oilseed plants and oleaginous yeast
US7550286B2 (en) * 2004-11-04 2009-06-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Docosahexaenoic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
US7470532B2 (en) * 2005-10-19 2008-12-30 E.I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina C16/18 fatty acid elongase
EP2542671A2 (en) * 2010-03-02 2013-01-09 Massachusetts Institute Of Technology Microbial engineering for the production of fatty acids and fatty acid derivatives
US8980589B2 (en) * 2010-08-26 2015-03-17 E I Du Pont De Nemours And Company Mutant delta-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids
EP2768954B1 (en) * 2011-10-19 2018-12-05 Massachusetts Institute of Technology Engineered microbes and methods for microbial oil production
CA2870364A1 (en) * 2012-04-18 2013-10-24 Solazyme, Inc. Recombinant microbes with modified fatty acid synthetic pathway enzymes and uses thereof
CN104004797B (zh) * 2014-06-20 2016-03-16 天津科技大学 sn-2位为二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸的制备方法
CN104017786B (zh) * 2014-06-20 2016-06-15 天津科技大学 一种磷脂酶a2突变体及其制备方法
CN104651391A (zh) * 2015-02-13 2015-05-27 江南大学 干酪乳杆菌磷脂酶a2基因的重组表达与应用
US11142770B2 (en) * 2015-10-20 2021-10-12 Massachusetts Institute Of Technology Isolated oleaginous yeast
CN106834251B (zh) * 2016-12-23 2020-02-18 天津科技大学 一种磷脂酶a2及其制备2-dha-ps的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1703144B (zh) * 2002-05-22 2011-04-13 孟山都技术有限公司 来源于真菌的脂肪酸脱氢酶
CN1816632A (zh) * 2003-07-02 2006-08-09 纳幕尔杜邦公司 用于改变产油酵母多不饱和脂肪酸和油含量的酰基转移酶
CN108271383A (zh) * 2015-04-02 2018-07-10 比奥派多利亚有限公司 真菌细胞和生产非常长链脂肪酸衍生产物的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biosynthesis of nervonic acid and perspectives for its production by microalgae and other microorganisms;Yong Fan et al.;《Applied Microbiology and Biotechnology》;20180224;全文 *
Engineering Yarrowia lipolytica as a platform for synthesis of drop-in transportation fuels and oleochemicals;Peng Xu et al.;《PNAS》;20160927;第113卷(第39期);全文 *
Overexpression of diacylglycerol acyltransferase in Yarrowia lipolytica affects lipid body size, number and distribution;Peter Gajdos et al.;《FEMS Yeast Research》;20161231;全文 *
解脂耶罗维亚酵母产神经酸代谢工程研究;乔建文;《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊)基础科学辑》;20180215;全文 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891653A (zh) * 2022-05-17 2022-08-12 南京工业大学 一株高产神经酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP3778866A1 (en) 2021-02-17
US20210032665A1 (en) 2021-02-04
CN110358692A (zh) 2019-10-22
WO2019196791A1 (zh) 2019-10-17
EP3778866A4 (en) 2022-03-09
JP2021520821A (ja) 2021-08-26
EP3778866B1 (en) 2024-05-29
JP7261815B2 (ja) 2023-04-20
US11603545B2 (en) 2023-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110358692B (zh) 生产神经酸的重组酵母菌株及其应用
Wang et al. The soybean Dof‐type transcription factor genes, GmDof4 and GmDof11, enhance lipid content in the seeds of transgenic Arabidopsis plants
CA2731760C (en) Pyripyropene a biosynthetic gene
AU2022200938A1 (en) Increasing lipid production and optimizing lipid composition
DK2588616T3 (en) PROCEDURE FOR MAKING A RELATIONSHIP OF INTEREST
CN107208088A (zh) 酵母中的油酸生产
CN112695047B (zh) 一种三角褐指藻中表达外源丙酮酸磷酸双激酶的突变株用于生产岩藻黄质的方法
CN107075450B (zh) 在红冬孢酵母属和红酵母属物种中高效产生多不饱和脂肪酸(pufa)的方法
CN111484964A (zh) 一种高产9-ohad的分枝杆菌及其构建的方法
CN113151319A (zh) 二酰基甘油酰基转移酶(dga1)多核苷酸，和通过异源dga1的超量表达增加酵母细胞脂质生产的方法
KR20120120287A (ko) 피리피로펜의 제조 방법
CN114540261B (zh) 一种产氨基己二酸的基因工程菌
CN110997703B (zh) 新丙酮酸转移酶
CN114806913B (zh) 具有线粒体定位还原tca途径的高产琥珀酸酵母工程菌株及其构建方法和应用
CN113736806B (zh) 提高海洋微拟球藻油脂合成的基因及其用途
Laptev et al. New recombinant strains of the yeast Yarrowia lipolytica with overexpression of the aconitate hydratase gene for the obtainment of isocitric acid from rapeseed oil
CN108330114B (zh) 一种利用epa的甘油二酯酰基转移酶及其应用
CN108753810B (zh) 一种转录调节蛋白基因orf2的用途
CN113512100A (zh) LipR蛋白及其编码基因在调控DHA和油脂合成中的应用
JP4756743B2 (ja) 真菌の菌糸の成長
CN110499300B (zh) 一种β-异丙基苹果酸脱氢酶及其在脂质合成中的应用
US10533232B2 (en) Parasitic phytophthora-derived omega-3 fatty acid desaturase for synthesizing polyunsaturated fatty acids, carrier containing fatty acid desaturase, recombinant microorganisms, and application thereof
Kim et al. Effect of expression of genes in the sphingolipid synthesis pathway on the biosynthesis of ceramide in Saccharomyces cerevisiae
KR101469689B1 (ko) 지방산 함량 개선을 위한 형질전환 효모 및 그의 제조방법
CN111206023A (zh) 一种高效提高微藻甘油三酯含量的代谢工程方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant