CN114907999B

CN114907999B - 一种内质网调节因子在促进酵母合成油脂中的应用

Info

Publication number: CN114907999B
Application number: CN202111552485.1A
Authority: CN
Inventors: 王士安; 苏航; 李福利; 孟子越
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2021-12-17
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2023-08-29
Anticipated expiration: 2041-12-17
Also published as: CN114907999A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种内质网面积调节因子在促进酵母合成油脂中的应用。解脂耶氏酵母的内质网面积调节因子在促进酵母合成油脂和/或神经酸中的应用。同时利用该基因经过克隆后，采用同源重组法导入解脂耶氏酵母进行高表达，使其具有或者增强合成油脂及神经酸的能力。本发明中重组菌株与出发菌株相比，总脂产量提升39.3％，且神经酸浓度在摇瓶水平达到3.5g/L，在50L发酵罐上油脂产量达到85.5g/L，神经酸占总脂比例达到17％，神经酸发酵浓度达到14.5g/L。本发明所阐述的基因功能和方法可用于构建高产油脂及神经酸的解脂耶氏酵母工程菌株，不仅在生物燃料的生产，而且在化工、医药和保健等领域具有广泛的应用前景。

Description

一种内质网调节因子在促进酵母合成油脂中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种内质网面积调节因子在促进酵母合成油脂中的应用。

背景技术

随着化石能源的大量消耗以及全球气候问题日趋严峻，人们对绿色能源的需求进一步增加，其中利用可再生资源合成生物燃料是一个重要发展方向。某些微生物可以高效地把生物质转化为油脂，微生物油脂可作为生物柴油、航空煤油等液体燃料的原料。以微生物油脂为基础的燃料具有一些独特的优点，如高能量密度、低吸湿性、与柴油混溶性以及与现有基础设施的兼容性等。因此，微生物油脂已受到国内外研究者的高度重视。

解脂耶氏酵母是一种产油酵母，常从奶酪、酸奶和香肠等食品中分离，属于公认安全(Generally recognized as safe,GRAS)的微生物类别。解脂耶氏酵母的应用可以追溯到二十世纪六十年代，当时利用正烷烃合成单细胞蛋白，后来逐渐发展为研究蛋白分泌、烷烃代谢、脂质体形成和油脂合成的非传统模式生物。除了生物安全性，解脂耶氏酵母还具有多方面的优势[Abdel-Mawgoud,A.M.et al.Metab Eng,2018,50,192-208；Miller,K.K.&Alper,H.S.Appl Microbiol Biot,2019,103,9251-9262；Liu,H.H.,Ji,X.J.&Huang,H.Biotechnol Adv,2015,33,1522-1546]，包括：(1)生长快(超过酿酒酵母)、发酵密度高；(2)耐受有机溶剂、高盐和宽幅pH；(3)乙酰辅酶A和磷酸戊糖途径的代谢流量高，适于合成多种代谢产物；(4)经共转录途径分泌蛋白，分泌效率高、糖基化程度低；(5)高产微生物油脂、脂酶、蛋白酶等。近年，国内外研究者尝试以解脂耶氏酵母为底盘合成各类化合物。美国麻省理工学院以葡萄糖做碳源，解脂耶氏酵母合成油脂可超过90g/L，并且糖油转化率接近理论值[Qiao,K.J.,et al.Nat Biotechnol,2017,35,173-177]。美国德克萨斯大学以解脂耶氏酵母为宿主合成聚酮类平台化合物三乙酸内酯(Triacetic acid lactone)，发酵产量达到36g/L[Markham,K.A.et al.P Natl Acad Sci USA,2018,115,2096-2101]。杜邦公司利用解脂耶氏酵母合成不饱和脂肪酸EPA，含量高达油脂的56％。德国亥姆霍兹研究所利用解脂耶氏酵母合成多不饱和脂肪酸，其中DHA(二十二碳六烯酸)可占油脂的16.8％[Gemperlein,K.et al.Nat Commun,2019,10,4055]。

某些植物种子的油脂中含有超长链单不饱和脂肪酸神经酸(cis-15-Tetracosenoic acid,24:1Δ15)，神经酸主要以鞘糖脂和鞘磷脂的形式存在于动物大脑白质和髓鞘的神经纤维中，是生物膜的重要组成成分。神经酸在医学和保健方面具有重要的作用，具有促进大脑发育、改善记忆、调节血脂、增强免疫等功效，可用于治疗多发性硬化症等神经紊乱病症。此外，研究表明神经酸对神经系统的发育具有促进作用，尤其是在婴幼儿脑神经细胞和视神经细胞生长与发育过程具有重要的作用。

神经酸有多种天然来源，包括鲨鱼、蒜头果、元宝枫、碎米芥、微藻、少数霉菌等[Fan,Y.et al.Algal Research,2018,31225-231；Huai,D.et al.PLoS One,2015,10(6):e131755；Taylor,D.C.et al.Plant Biotechnol J,2009,7:925-938]。其中，蒜头果(M.oleifera)是自然界发现的神经酸含量最高的一种植物，其种仁含油量在64.5％左右，而油脂中的神经酸含量高达43.2％，但蒜头果种植困难，且生长周期长[Marillia,E.F.etal.Biocatal.Agric.Biotechnol,2014,3:65-74]。目前，市售神经酸产品主要来自元宝枫籽油提取物，其神经酸含量在5％左右。然而，仅靠植物来源的神经酸不能满足市场需求，而且价格昂贵。采用微生物合成生物学方法合成神经酸是一条十分有潜力的路径，本专利的发明人在前期工作中已经建立了解脂耶氏酵母合成神经酸技术[ZL201810309632.4；PCT/CN2019/081736；PCT/CN2021/131563]。

微生物油脂的合成与内质网、高尔基体、过氧化物酶体等相关，脂肪酸的去饱和长链脂肪酸的延长在内质网进行，高尔基体与脂蛋白的合成和分泌有关，过氧化物酶是脂肪酸氧化的场所。微生物的油脂合成以乙酰辅酶A为前体，乙酰辅酶A主要在线粒体中形成，然后经柠檬酸穿梭转运到细胞质，柠檬酸在细胞质中被柠檬酸裂解酶裂解为乙酰辅酶A和草酰乙酸，后者被苹果酸脱氢酶还原成苹果酸，再由苹果酸酶氧化脱羧生成丙酮酸，进入三羧酸循环。乙酰辅酶A由乙酰辅酶A羧化酶(ACC)催化为丙二酸单酰辅酶A，参与脂肪酸的合成。在胞质中，脂肪酸的合成由脂肪酸合酶(FAS)催化，反应起始的二碳单元是乙酰辅酶A，每轮循环加入一个丙二酸单酰辅酶A；然后经过还原、脱水、再还原，得到饱和羧酸。脂肪酸的去饱和以及链长大于16脂肪酸的延长在内质网进行，内质网在脂类合成与脂质体形成中起关键作用，但目前已报道的内质网面积调节因子很少，主要局限于少数模式生物。在生物技术领域，有研究报道，酿酒酵母过表达INO2基因，可以调节蛋白质、角鲨烯[CN202110926222.6；CN202110757496.7]、萜类化合物[Kim,J.E.et al.MetabolicEngineering,2019,56:50-59]、乙醇[Fang.T.et al.Genomics,2020,112:1674-1679]和番茄红素[Chen,Y.et al.Microb.Cell Fact,2016,15:1-13.]的合成。在解脂耶氏酵母中，还未见关于内质网面积调节因子的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种内质网调节因子在促进酵母合成油脂中的应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种内质网调节因子在促进酵母合成油脂中的应用，解脂耶氏酵母的内质网面积调节因子在促进酵母合成油脂和/或神经酸中的应用。

所述内质网面积调节因子AOW01275.1基因SEQ ID No.1所示核苷酸序列在促进酵母合成油脂和/或神经酸中的应用。

所述SEQ ID No.1所示核苷酸序列内质网面积调节因子AOW01275.1在促进酵母合成油脂和/或神经酸中的应用。

一种合成油脂的重组酵母，以解脂耶氏酵母为出发菌株，过表达解脂耶氏酵母的内质网面积调节因子AOW01275.1基因。

以已经表达延长酶CgKCS的解脂耶氏酵母菌株Po1g-G3-CgKCS为出发菌株，采用同源重组方式导入AOW01275.1基因，获得菌株记为Po1g-G3-CgKCS-1206。

所述同源重组时，首先构建同源重组质粒pYL-PEX10-1206-URA，通过尿嘧啶营养缺陷型平板筛选转化子，获得导入AOW01275.1基因的重组菌株Po1g-G3-CgKCS-1206；其中，重组质粒中以质粒pYL-PEX10-M461作为骨架，同源臂为解脂耶氏酵母PEX10基因的上下游片段。

一种合成油脂的方法，采用所述的合成油脂的重组酵母发酵制备得到。

将合成油脂的重组酵母接种至种子培养基，培养24小时，而后按10％的接种量接入发酵培养基中，发酵培养5至8天，制备得到油脂。

本发明所具有的优点：

本发明通过调控解脂耶氏酵母中促进合成油脂的基因实现提高油脂合成，该方法涉及应用同源重组方法，导入解脂耶氏酵母的内质网调节因子基因，使解脂耶氏酵母具有或者增强合成油脂及神经酸的能力。本发明重组菌株与出发菌株相比，总脂产量提升39.3％，同时，神经酸占总脂肪酸比例达到17％。本发明所提供的方法可用于构建高产油脂及神经酸的微生物工程菌，在化工、医药和保健等领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例提供的酿酒酵母内质网调节因子ScINO2与解脂耶氏酵母预测蛋白AOW06291.1和AOW01275.1的序列比对分析。

图2为本发明实施例提供的重组菌株的诊断PCR验证；其中，方框所示为阳性克隆，A为表达AOW06291.1基因的菌株YL-INO2，B为表达AOW01275.1基因的菌株YL-1206。

图3为本发明实施例提供的重组菌株摇瓶发酵的OD值(A)和细胞干重(B)。CK：对照菌株Po1g-G3-CgKCS；YL-INO2：过表达AOW06291.1基因的重组菌株；YL-1206：过表达AOW01275.1基因的重组菌株。

图4为本发明实施例提供的重组菌株摇瓶发酵的总脂产量(A)，油脂含量(B)和神经酸产量(C)。CK：对照菌株Po1g-G3-CgKCS；YL-INO2：过表达AOW06291.1基因的重组菌株；YL-1206：过表达AOW01275.1基因的重组菌株。

图5为本发明实施例提供的重组菌株摇瓶发酵的脂肪酸组成比较。CK：对照菌株Po1g-G3-CgKCS；YL-INO2：过表达AOW06291.1基因的重组菌株(A)；YL-1206：过表达AOW01275.1基因的重组菌株(B)。

图6为本发明实施例提供的电镜观察重组菌株的内质网大小变化。左图为低倍率图像，右图为高倍率图像对应左图的方框区域。箭头表示ER区域。CK：对照菌株Po1g-G3-CgKCS；YL-1206：过表达AOW01275.1基因的重组菌株。

图7为本发明实施例提供的重组菌株YL-1206的50L发酵罐发酵结果。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

实施例1解脂耶氏酵母内质网调节因子的挖掘和分析

基于生物信息学分析，以已知的酿酒酵母来源的内质网调节因子ScINO2序列为参照，建立比对序列库，操作如下：(1)在个人电脑上运行cmd命令(或在安装目录下进入PowerShell)。(2)输入以下命令:安装路径\bin\makeblastdb-in建库序列文件名.fasta-dbtype nucl-out database；分别对应:工具-in用于建库的序列文件(fasta格式)-dbtype数据库类型-out数据库名。

根据同源性分析，从解脂耶氏酵母基因组数据中获取了2个潜在的内质网调节因子基因GenBank No.AOW01275.1和AOW06291.1。

利用CLUSTALW分别比对了酿酒酵母来源的ScINO2与AOW06291.1和AOW01275.1的序列相似性。结果显示，NCBI数据库中的AOW06291.1序列在N端比ScINO2多153个氨基酸，应为编码区预测不准确(图1)。两条预测序列与ScINO2的相似性都低于30％，其中AOW06291.1与ScINO2的序列一致性(Identities)为0.146，序列相似性(Similarities)为0.247；AOW01275.1与ScINO2的序列一致性为0.141，序列相似性为0.297。

>SEQ ID No.1

AOW01275.1基因序列

ATGTTGAAACCAACCTACATTGAGCCAGCACCATACAAGCTGGAGGAATTGACCATCGACCACAACGTTCCTCACTTCAGACAGTCATCCAAGTCCTACAACCCGCATCCCCAGCAGCTAGAGTTCAGAGGAAATTCGTTTGTGTCACTACTAAGAGCCCTGGACGGCCGCACCTTGGCGGAGACCCCGAAGTCCTCACCGTGTGTGTCTCCTGAAGTAGAAAGCTACTTTGCCCCATTAGTCGTTAAGAAACAGCGAAGAGATCGCGTGGTGACAGCTTTCGATACCCTTGAATCCTCAGAGAGTAACGGCATGTCGCCCCCAATGGTCAACTCGACTAGCCCCATCACTCCAGAATCATCTGGCCTTCACAGTACCATTCCGGGAAGTACCCCTTTCGTCGCAGGAAAGAAACCTATTTTAGAACGGGTTTCTGTCAGCAGCGGGGGACTCCCTGTTGGGAAGCTATTCATGGCAGACATTTGGCAGGATGAGGACCCGGAAACCCCAGACGTGGTGAACGTTTTGGTGATGGATTCCGGAAGCCCTGCCGTTGCTACGGCTAGTCCAGGCAAAACTGTGTCTCCATCAGATGCACTTGACATGATGATCAAATGTGGAGGCAGGGACGCCAGACTCTATCAGGACAGTGCTGCGACGGCTGGGATGACCACCACAACCCCCAAGCGCCACCGTGACCAGTGGAAGGCCAAATGGAGTGATACCAAGCGACATAGCAAGGACTTCTTCAAGAAAGCCAAAAGAGGTCGAGGAGGAGCTGCATTGAACAGAAGTGACTACTCAGAGTCTGTTTCTTCCCTTATGGAAGAGACCAACAATAGCTCCGGTGGAGCTAGGGCTCGCTTCAGCGGGGCCAGCGGGGGTAGCGGGGCCAGCGGGGTTAGTGGTGCCAGCCAGGCTAGCAGTACCAGTGCAGCTACAAGTAGTGTTGCCTGTTCTGACAAAGAGGAGGCCAATGGTCCCATTGGTATTAACTTCACTGATTTCAGTGGCGCTTATTCCTACCAGGACATGGTCACTGCTAGTGAAGGCACCCCGAGAGCGTGCCACTCGGATCATTTCGGCAGTTTGGAAGAGGACTTGGAGGACGGCGGAGAAGCCGAGTTGACATCTTCCTACGAGCATTTGTTCGAGAAAGAGTCACTTCGTACCAAGTTTTACAAGGTGTTCAAGAAGGGGACTTAG

(a)序列特征：

·长度：1206

·类型：DNA序列

·链型：单链

·拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：解脂耶氏酵母

序列特点：该基因的编码产物内质网调节因子的核苷酸序列。

>SEQ ID No.2

AOW01275.1氨基酸序列

MLKPTYIEPAPYKLEELTIDHNVPHFRQSSKSYNPHPQQLEFRGNSFVSLLRALDGRTLAETPKSSPCVSPEVESYFAPLVVKKQRRDRVVTAFDTLESSESNGMSPPMVNSTSPITPESSGLHSTIPGSTPFVAGKKPILERVSVSSGGLPVGKLFMADIWQDEDPETPDVVNVLVMDSGSPAVATASPGKTVSPSDALDMMIKCGGRDARLYQDSAATAGMTTTTPKRHRDQWKAKWSDTKRHSKDFFKKAKRGRGGAALNRSDYSESVSSLMEETNNSSGGARARFSGASGGSGASGVSGASQASSTSAATSSVACSDKEEANGPIGINFTDFSGAYSYQDMVTASEGTPRACHSDHFGSLEEDLEDGGEAELTSSYEHLFEKESLRTKFYKVFKKGT

(a)序列特征：

·长度：401

·类型：氨基酸序列

·链型：单链

·拓扑结构：线性

(b)分子类型：氨基酸

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：解脂耶氏酵母

序列特点：该基因的编码产物内质网调节因子的氨基酸序列。

>SEQ ID No.3

AOW06291.1基因序列

ATGCACCTTTCCCACCCACAGGAGAAACAAGTCTTCATCACCACTCCGTCCCCGTCGTCCTCTGTTTCAACCCAGTCCACCGCCTCGTCGTCACTGTCGCTATTCCACACGGCAGACTCCGATCTCTCCGCCTCCGAAGAAGACGACTTTCCGTACCACGCAACAACCCACACAAATATAAAGCCTGGTGTGTCTTTCTCCGCCACCTCAGGCACAATGATGAGTGCGTTATCCCCTGTCTCGGTGCAGTCTCCGTCGACCGTTTTCATGATGAAGGAACCCGCACAGGCACAGGCCCAGATGTCCCACGACAACAACAACAACAACAACAGTAGCAGCCATGTCACCACCCCTAAACACAACGCCGCCCCTGTAACCAAATCAGACGACCCCTTCGATGTCGACAACTACCCCACCGACTTTGACTCCGCCTTCCTCAACCTGTCGCCCACCATGGGGATGGGCCCCGGCGACGGCATGGATGGTATTCCGCTGTTCAACGCAGAGGAGGAGTCCGCTTTCTCGTCCTTCCTCGACAACGTGGCTCTGGATCCTAACTTCATCTTCGAGCCCAATCTCTCTGATGCCCTGCCCAAGTGGCCCGAATCGAAACCCTGGGGCCCCAACGACTCGCATAAGCCACGAACCGACAAGTTCACCAAGTTTGGCAACTCTCCCGGTCTCGATTTGCTCGCTGCCAATTCCCCCGACGCAGTTAACATCCACGAACGCCTACTGAAACACGAGTCGAAGGAGTATCTCAGCCCCAACCACAACGACTATGCTCAGAGCGACTCGCGGGCCCAGGCGCTCGCCATGGCTGAAACACAGGGCTACGGACAGCTAAAACACAAAGAAAGCCGCTCATCGTTATCACAGCCCTCGTCGCTACACAACAACAGCGTGACGGGGTCGTCAGTCACAACCACACGTCCCTCGCCACAAACGTCGGGACCCTCCCCCGTGTCGTCGGGCACGTCAGCGGCGTCGTCCGCACCCATGGGCCTTCATTTCGGCTCAGACCCTGCATTTGGAGGCTCCAGCTTCCAGCCCAACAGCGGCACCCCAGCCCTCAAAAAGGTGCGGGGCTTCGACGAGCTGCCCCCTGCCGTCCACGAGGGACACGGGCACATGCACATGCAGCCACAACGCATGGTGACCGGTCTGGAGGGTGTAGTCAACCCCAAGCTGGTGGTTGCAGCTGCACAGATGAGCCAGGGCGTGACGGACCAGAACATCTTCATGCTCAAGCGACGAAAGTCGGACAACATGGCTGCAAGCATGAACTCGAACGTGCCACACGATATCTATGCTCCCGTCCCACATGCTGAGCAGATGTATCATATGCAACAACAACAGCAACAGCAGCATCTCCACCAGCAACAGCAGCAACAACATCACCAACAATCACAAAATCAGCATATCCAACAACAGCAGCAACAGCAGCAGCATCAGATGCACCACCCTCACCATACACAGCAGCACTTCCAGGCACGAATGCACTTTGGCGACGGCATGGATGGCGAGGTGTCCATGAGTACCGTCTCTCAGGCGGGTTTGCACATGAACTCCAACCCTAGCATGTTGTTCCCCGACAAGGATGCTCTAGCAGACTCGTACCAGCAGCAGCAGCAGCAAATGCATAGTCAACACAACCCTCCTTCGCATCATCCTCAGCACAACCAGCAGCAGCAGCAGCAACCGCAGGTCAAGACTGAGCAGAATATGTCTGCATCGCCTACTCCGGGATCTCCCAACCTCACGGAGGACCAGAAACGTATGAACCACATCTCTTCCGAAAAGCGACGGCGGGATCTCATCAAGCAGGAGTTTGAGGAAATGTGCGGCCTGGTGCCTCGTCTGGCTGCAAACAGCGATGAGAAGGGCAAGCGACGCCATGGTCATCGAGGACGTATGCCCAAGGACTCGGACAAGGACAAGGATACTGGAACCAAGTCCAAGTCGATTCTACTATCGATTGTGTACGAATACATGTGCGAGCTGGTGGAGCGAAACAAGGCCATGCGGGGCATGATCACCGAAAAGGGCGGATATCACAGCGATATCGCCAATGCTCTTCATCCTCCCAAGATTGATGAGTAA

(a)序列特征：

·长度：2103

·类型：DNA序列

·链型：单链

·拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：解脂耶氏酵母

>SEQ ID No.4

AOW06291.1氨基酸序列

MHLSHPQEKQVFITTPSPSSSVSTQSTASSSLSLFHTADSDLSASEEDDFPYHATTHTNIKPGVSFSATSGTMMSALSPVSVQSPSTVFMMKEPAQAQAQMSHDNNNNNNSSSHVTTPKHNAAPVTKSDDPFDVDNYPTDFDSAFLNLSPTMGMGPGDGMDGIPLFNAEEESAFSSFLDNVALDPNFIFEPNLSDALPKWPESKPWGPNDSHKPRTDKFTKFGNSPGLDLLAANSPDAVNIHERLLKHESKEYLSPNHNDYAQSDSRAQALAMAETQGYGQLKHKESRSSLSQPSSLHNNSVTGSSVTTTRPSPQTSGPSPVSSGTSAASSAPMGLHFGSDPAFGGSSFQPNSGTPALKKVRGFDELPPAVHEGHGHMHMQPQRMVTGLEGVVNPKLVVAAAQMSQGVTDQNIFMLKRRKSDNMAASMNSNVPHDIYAPVPHAEQMYHMQQQQQQQHLHQQQQQQHHQQSQNQHIQQQQQQQQHQMHHPHHTQQHFQARMHFGDGMDGEVSMSTVSQAGLHMNSNPSMLFPDKDALADSYQQQQQQMHSQHNPPSHHPQHNQQQQQQPQVKTEQNMSASPTPGSPNLTEDQKRMNHISSEKRRRDLIKQEFEEMCGLVPRLAANSDEKGKRRHGHRGRMPKDSDKDKDTGTKSKSILLSIVYEYMCELVERNKAMRGMITEKGGYHSDIANALHPPKIDE

(a)序列特征：

·长度：700

·类型：氨基酸序列

·链型：单链

·拓扑结构：线性

(b)分子类型：氨基酸

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：解脂耶氏酵母

实施例2内质网调节因子的质粒构建及酵母转化

AOW01275.1基因和AOW06291.1基因分别从解脂耶氏酵母基因组上扩增得到，质粒载体的构建采用Gibson assembly方法，所有装配片段采用PCR扩增方法获得。质粒骨架源自pYL-PEX10-CgKCS质粒，该质粒由以下5部分组成：

a)大肠杆菌中的筛选标记Amp抗性基因及复制起始位点pBR322 ori；

b)解脂耶氏酵母中的筛选标记URA及其启动子PLEU2和终止子；

c)定点整合位点PEX10的上游整合片段PEX10up；

d)定点整合位点PEX10的下游整合片段PEX10dn；

e)延长酶CgKCS及其强启动子pTEF和终止子XPR2。(所述引物见表1)

表1构建质粒pYL-PEX10-CgKCS所用引物

所构建的质粒经过菌落PCR和测序验证(北京擎科生物科技有限公司)后作为质粒骨架使用。

上述所有PCR扩增采用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶，扩增体系皆为50μl(2×KAPAMix,25ul；10μM引物各1.5ul；模板1μl；加水补至50μl)，即得到各DNA序列。扩增条件为：95℃预变性3分钟；98℃变性20秒、60-72℃退火15秒、72℃延伸，延伸时间按照30秒每kb计算，循环数为29-35；72℃延伸10分钟。

将质粒骨架和上述获得不同酯化酶基因片段装配后分别转化大肠杆菌感受态Trans-T1(北京全式金生物技术有限公司)，再用引物TEFin-PF和XPR2-PR进行菌落PCR和测序验证(北京擎科生物科技有限公司)后，获得AOW01275.1基因的同源重组质粒pYLEX-PEX10-1206-URA和AOW06291.1基因的同源重组质粒pYLEX-PEX10-INO2-URA(所述引物见表2)。

表2.构建质粒和菌落PCR所用引物

利用引物10up和10dn(表3)对重组质粒pYLEX-PEX10-1206-URA和pYLEX-PEX10-INO2-URA分别进行扩增获得转化片段，而后分别转化解脂耶氏酵母。

对上述获得的各重组菌株的不同转化子进行诊断PCR验证。从筛选平板上挑单菌落于YPD平板上，生长约24小时后，挑取菌体，应用真菌基因组快提试剂盒(生工生物工程股份有限公司)提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，PCR扩增转化片段(引物见表3)。PCR扩增采用EasyTaq DNA聚合酶，扩增体系皆为20μl(2×EasyTaq Mix,10μl；10μM引物各0.6μl；模板1μl；加水补至20μl)，扩增片段通过琼脂糖凝胶电泳进行确定。扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸，延伸时间按照60秒每kb计算，循环数为36；72℃延伸10分钟。诊断PCR结果如图2所示，图2A筛选到定点整合AOW06291.1基因的重组酵母菌株(YL-INO2)，图2B筛选到定点整合AOW01275.1基因的重组酵母菌株(YL-1206)；。

表3.转化片段和诊断PCR所用引物

实施例3重组菌的摇瓶发酵

将诊断PCR验证成功的不同重组菌株接种于20ml YPD培养基(250ml锥形瓶中)，生长约24小时后转接到YPD培养基平板上，继续培养约24小时。然后刮取一接种环菌体，接种到5ml YNB-URA^-培养基(50ml锥形瓶)中，生长36小时，从中吸取100μl转接到新鲜的5mlYNB-URA^-培养基中，再培养36小时，然后转接到30ml摇瓶发酵培养基(葡萄糖50g/L，硫酸铵35g/L，酵母粉38g/L，磷酸二氢钾8g/L，十二水合磷酸氢二钠6g/L，七水硫酸镁5g/L)，使初始OD统一为0.08，每组三个平行，培养168小时。

3.1酸热法提取总油脂

(1)50ml离心管收集解脂耶氏酵母发酵培养液，6000rpm高速离心5min收集酵母菌体；

(2)1g湿菌体大约加入10ml 4M的盐酸，振荡均匀，放于28℃摇床震荡约1-2h；

(3)沸水浴6-8min，立即放于-20℃冷却30min；

(4)加入氯仿：甲醇＝1:1(V/V)20ml充分混合，

(5)分离下层氯仿并称量体积，加入等体积的0.15％的氯化钠，4000rpm离心10min；

(6)取下层转移到新的已称重的玻璃管中，氮吹仪吹干溶剂相，再次称重计算油脂产量，总脂含量为总脂产量占干重的比例。

3.2脂肪酸甲脂化

(1)在玻璃管中添加2.6ml的甲醇：硫酸＝98:2(V/V)溶液，混匀后放于85℃反应3h，之后在冰箱内冷却；

(2)添加1ml饱和NaCl溶液和1ml正己烷，振荡后5000rpm高速离心5min，吸取上清到EP管中，并用有机相滤膜进行过滤后进行气相色谱实验。

3.3气相色谱分析脂肪酸成分

脂肪酸成分的分析采用气相色谱法(Agilent 7890B-GC)。色谱检测条件：色谱柱为HP-INOWAX(30m×0.32mm×0.5μm)；进样温度：250℃；检测器温度：250℃；进样体积：1μl；起始柱温为140℃，保持1min，以10℃/min升温至180℃，保持2min，5℃/min升温至210℃，保持4min，然后5℃/min升温至250℃，保持4min。以面积归一法得到各脂肪酸组分的相对含量。

3.4菌株OD及生物量测定

生物量测定方法：发酵结束后取1ml发酵液，12000rpm离心5min后去上清，沉淀使用100mM的PBS清洗两次，离心去掉上清后，置于65℃烘箱中烘干至恒重，测定其生物量。

3.5结果

发酵结束测定菌体OD后发现，表达AOW01275.1基因的菌株YL-1206与对照相比提高了33％，表达AOW06291.1基因的菌株YL-INO2与对照组相比无明显提高(图3A)。测定生物量后发现，YL-1206与对照相比提高30.9％，YL-INO2与对照组相比无明显提高(图3B)。测定YL-1206的油脂，结果达到了21.2g/L，YL-INO2与对照组相比无明显提高(图4A)。分析油脂含量可知，菌株YL-1206达到了57.8％，与对照相比提高了6.5％，菌株YL-INO2与对照组相比下降了1％(图4B)。菌株YL-1206的神经酸浓度为3.5g/L，提高了33.2％，菌株YL-INO2与对照组相比无明显提高(图4C)。分析脂肪酸组成发现，YL-INO2的油酸(C18:1)含量从24.2％提升至27.5％，C24:0脂肪酸的含量从7.6％降低至5.05％；YL-1206的油酸含量从24.2％提升至26.4％，C24:0脂肪酸的含量从7.6％降低至6.65％；可见两者在脂肪酸组成上无明显变化(图5)。

这些结果表明虽然AOW06291.1和AOW01275.1与ScINO2的序列相似性相当，然而表达AOW06291.1基因并没有促进油脂的合成及生物量的积累，也没有提高油脂产量，而表达AOW01275.1基因促进了油脂合成及生物量积累，起到了提高油脂和神经酸产量的作用。

实施例4透射电镜观察内质网结构变化

透射电镜样品的制样方法如下：

(1)取-80℃保藏的菌株接种于试管中培养16-18h；

(2)离心收集菌体，并迅速加入2.5％戊二醛，移液器吹打均匀，常温固定2h或4℃冰箱中放置过夜；

(3)将固定菌液离心，弃上清后用10mol/L的PBS清洗三次，每次30min，每次清洗应将细胞吹打均匀；

(4)加入1％的锇酸，固定60min，然后PBS清洗三次，每次30min；

(5)按照30％、50％、70％、80％、90％、95％的梯度进行丙酮脱水，再用纯丙酮脱水三次，每次脱水时间为15min。如果菌体损失较多，此步骤的菌体可不打散；

(6)按照7体积丙配、3体积树脂(电镜专用Sput或Epon812)的比例配制混合液，加入细胞中，渗透5h；

(7)吸取上清后按照3体积丙酮和7体积树脂的比例配制混合液，加入细胞中，渗透5h；

(8)纯树脂渗透过夜；

(9)将菌体置入包埋模具中，加入树脂，70度烘箱中放置24h；

(10)树脂经修块后，使用超薄切片机进行切片，经醋酸双氧化铀染液染色后，使用透射电子显微镜(Hitachi-H7650)观察。

电镜观察的结果见图6。与出发菌株相比，过表达了内质网调节因子AOW01275.1后，内质网区域变大，说明产油和神经酸的提高与内质网结构变化有关。

实施例5：重组菌株YL-1206的发酵罐发酵

5.1材料与方法

(1)培养基

种子培养基(YNB培养基)：YNB(酵母氮源碱、无氨基酸、无硫酸铵)3g/L，葡萄糖60g/L，硫酸铵35g/L，YNB与硫酸铵灭菌后过滤除菌加入。

发酵培养基(FM培养基)：葡萄糖50g/L，硫酸铵35g/L，酵母粉38g/L，磷酸二氢钾8g/L，十二水合磷酸氢二钠6g/L，七水硫酸镁5g/L，消泡剂1mL/L。

补料控制：根据发酵罐中的残糖浓度进行控制，使用灭菌后的600g/L的葡萄糖补料。

(2)50L发酵罐的发酵工艺

从-80℃取出重组菌株YL-1206，放于冰上解冻。吸取100μl接种到250mL的YNB培养基中，220rpm、28℃下摇床培养24h后，以接种后OD约0.01为标准转接到5L种子发酵罐中，种子罐的培养基为FM发酵培养基，装液量为2.5L，种子罐的培养条件为温度28℃，使用制冷机循环制冷；pH使用5mol/L的氢氧化钠控制为5.5，设置DO为20％，培养24h后移种至50L发酵罐(镇江汇能达公司，HND-BJ-5L-50L型)中开始发酵。

根据实验方案配制FM发酵培养基，充分混匀后加入50L发酵罐中。发酵罐的装液量为25L。接种量为10％，温度降低至28℃后，从接种口接入150ml种子液。

发酵条件：发酵温度为28℃，使用制冷机循环制冷；pH使用5mol/L的氢氧化钠控制为5.5；初始通气量为1vvm，前24h内逐渐提高至最大通气量2vvm。溶氧控制方式采用和转速级联控制，设置DO为20％，48h之后调节为10％，转速范围为200rpm-600rpm。补料葡萄糖浓度为600g/L，待发酵罐中残糖浓度降低至30g/L以下进行补料。

发酵过程中的指标分析方法参考实施例1。粗神经酸产量(g/L)＝总脂产量(g/L)×神经酸占总脂肪酸的比例(％)。结果与分析如下。

在摇瓶发酵基础上，使用50L发酵罐进行了重组菌株YL-1206的发酵培养，结果见图7。通过对重组菌的油脂、干重和脂肪酸的组成进行检测，得到以下结论：168h和192h的发酵结果类似，168h干重(DCW)达到了155.7g/L，总油脂产量为83.3g/L，总油脂含量达到53.5％，神经酸占总脂肪酸的比例为17.3％，神经酸产量达到了14.4g/L；192h干重(DCW)达到了167.5g/L，总油脂产量为85.5g/L，总油脂含量达到51％，神经酸占总脂肪酸的比例为17％，神经酸产量达到了14.5g/L(图7)。

序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种内质网调节因子在促进酵母合成油脂中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1206

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgttgaaac caacctacat tgagccagca ccatacaagc tggaggaatt gaccatcgac 60

cacaacgttc ctcacttcag acagtcatcc aagtcctaca acccgcatcc ccagcagcta 120

gagttcagag gaaattcgtt tgtgtcacta ctaagagccc tggacggccg caccttggcg 180

gagaccccga agtcctcacc gtgtgtgtct cctgaagtag aaagctactt tgccccatta 240

gtcgttaaga aacagcgaag agatcgcgtg gtgacagctt tcgataccct tgaatcctca 300

gagagtaacg gcatgtcgcc cccaatggtc aactcgacta gccccatcac tccagaatca 360

tctggccttc acagtaccat tccgggaagt acccctttcg tcgcaggaaa gaaacctatt 420

ttagaacggg tttctgtcag cagcggggga ctccctgttg ggaagctatt catggcagac 480

atttggcagg atgaggaccc ggaaacccca gacgtggtga acgttttggt gatggattcc 540

ggaagccctg ccgttgctac ggctagtcca ggcaaaactg tgtctccatc agatgcactt 600

gacatgatga tcaaatgtgg aggcagggac gccagactct atcaggacag tgctgcgacg 660

gctgggatga ccaccacaac ccccaagcgc caccgtgacc agtggaaggc caaatggagt 720

gataccaagc gacatagcaa ggacttcttc aagaaagcca aaagaggtcg aggaggagct 780

gcattgaaca gaagtgacta ctcagagtct gtttcttccc ttatggaaga gaccaacaat 840

agctccggtg gagctagggc tcgcttcagc ggggccagcg ggggtagcgg ggccagcggg 900

gttagtggtg ccagccaggc tagcagtacc agtgcagcta caagtagtgt tgcctgttct 960

gacaaagagg aggccaatgg tcccattggt attaacttca ctgatttcag tggcgcttat 1020

tcctaccagg acatggtcac tgctagtgaa ggcaccccga gagcgtgcca ctcggatcat 1080

ttcggcagtt tggaagagga cttggaggac ggcggagaag ccgagttgac atcttcctac 1140

gagcatttgt tcgagaaaga gtcacttcgt accaagtttt acaaggtgtt caagaagggg 1200

acttag 1206

<210> 2

<211> 401

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Leu Lys Pro Thr Tyr Ile Glu Pro Ala Pro Tyr Lys Leu Glu Glu

1 5 10 15

Leu Thr Ile Asp His Asn Val Pro His Phe Arg Gln Ser Ser Lys Ser

20 25 30

Tyr Asn Pro His Pro Gln Gln Leu Glu Phe Arg Gly Asn Ser Phe Val

35 40 45

Ser Leu Leu Arg Ala Leu Asp Gly Arg Thr Leu Ala Glu Thr Pro Lys

50 55 60

Ser Ser Pro Cys Val Ser Pro Glu Val Glu Ser Tyr Phe Ala Pro Leu

65 70 75 80

Val Val Lys Lys Gln Arg Arg Asp Arg Val Val Thr Ala Phe Asp Thr

85 90 95

Leu Glu Ser Ser Glu Ser Asn Gly Met Ser Pro Pro Met Val Asn Ser

100 105 110

Thr Ser Pro Ile Thr Pro Glu Ser Ser Gly Leu His Ser Thr Ile Pro

115 120 125

Gly Ser Thr Pro Phe Val Ala Gly Lys Lys Pro Ile Leu Glu Arg Val

130 135 140

Ser Val Ser Ser Gly Gly Leu Pro Val Gly Lys Leu Phe Met Ala Asp

145 150 155 160

Ile Trp Gln Asp Glu Asp Pro Glu Thr Pro Asp Val Val Asn Val Leu

165 170 175

Val Met Asp Ser Gly Ser Pro Ala Val Ala Thr Ala Ser Pro Gly Lys

180 185 190

Thr Val Ser Pro Ser Asp Ala Leu Asp Met Met Ile Lys Cys Gly Gly

195 200 205

Arg Asp Ala Arg Leu Tyr Gln Asp Ser Ala Ala Thr Ala Gly Met Thr

210 215 220

Thr Thr Thr Pro Lys Arg His Arg Asp Gln Trp Lys Ala Lys Trp Ser

225 230 235 240

Asp Thr Lys Arg His Ser Lys Asp Phe Phe Lys Lys Ala Lys Arg Gly

245 250 255

Arg Gly Gly Ala Ala Leu Asn Arg Ser Asp Tyr Ser Glu Ser Val Ser

260 265 270

Ser Leu Met Glu Glu Thr Asn Asn Ser Ser Gly Gly Ala Arg Ala Arg

275 280 285

Phe Ser Gly Ala Ser Gly Gly Ser Gly Ala Ser Gly Val Ser Gly Ala

290 295 300

Ser Gln Ala Ser Ser Thr Ser Ala Ala Thr Ser Ser Val Ala Cys Ser

305 310 315 320

Asp Lys Glu Glu Ala Asn Gly Pro Ile Gly Ile Asn Phe Thr Asp Phe

325 330 335

Ser Gly Ala Tyr Ser Tyr Gln Asp Met Val Thr Ala Ser Glu Gly Thr

340 345 350

Pro Arg Ala Cys His Ser Asp His Phe Gly Ser Leu Glu Glu Asp Leu

355 360 365

Glu Asp Gly Gly Glu Ala Glu Leu Thr Ser Ser Tyr Glu His Leu Phe

370 375 380

Glu Lys Glu Ser Leu Arg Thr Lys Phe Tyr Lys Val Phe Lys Lys Gly

385 390 395 400

Thr

<210> 3

<211> 2103

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcaccttt cccacccaca ggagaaacaa gtcttcatca ccactccgtc cccgtcgtcc 60

tctgtttcaa cccagtccac cgcctcgtcg tcactgtcgc tattccacac ggcagactcc 120

gatctctccg cctccgaaga agacgacttt ccgtaccacg caacaaccca cacaaatata 180

aagcctggtg tgtctttctc cgccacctca ggcacaatga tgagtgcgtt atcccctgtc 240

tcggtgcagt ctccgtcgac cgttttcatg atgaaggaac ccgcacaggc acaggcccag 300

atgtcccacg acaacaacaa caacaacaac agtagcagcc atgtcaccac ccctaaacac 360

aacgccgccc ctgtaaccaa atcagacgac cccttcgatg tcgacaacta ccccaccgac 420

tttgactccg ccttcctcaa cctgtcgccc accatgggga tgggccccgg cgacggcatg 480

gatggtattc cgctgttcaa cgcagaggag gagtccgctt tctcgtcctt cctcgacaac 540

gtggctctgg atcctaactt catcttcgag cccaatctct ctgatgccct gcccaagtgg 600

cccgaatcga aaccctgggg ccccaacgac tcgcataagc cacgaaccga caagttcacc 660

aagtttggca actctcccgg tctcgatttg ctcgctgcca attcccccga cgcagttaac 720

atccacgaac gcctactgaa acacgagtcg aaggagtatc tcagccccaa ccacaacgac 780

tatgctcaga gcgactcgcg ggcccaggcg ctcgccatgg ctgaaacaca gggctacgga 840

cagctaaaac acaaagaaag ccgctcatcg ttatcacagc cctcgtcgct acacaacaac 900

agcgtgacgg ggtcgtcagt cacaaccaca cgtccctcgc cacaaacgtc gggaccctcc 960

cccgtgtcgt cgggcacgtc agcggcgtcg tccgcaccca tgggccttca tttcggctca 1020

gaccctgcat ttggaggctc cagcttccag cccaacagcg gcaccccagc cctcaaaaag 1080

gtgcggggct tcgacgagct gccccctgcc gtccacgagg gacacgggca catgcacatg 1140

cagccacaac gcatggtgac cggtctggag ggtgtagtca accccaagct ggtggttgca 1200

gctgcacaga tgagccaggg cgtgacggac cagaacatct tcatgctcaa gcgacgaaag 1260

tcggacaaca tggctgcaag catgaactcg aacgtgccac acgatatcta tgctcccgtc 1320

ccacatgctg agcagatgta tcatatgcaa caacaacagc aacagcagca tctccaccag 1380

caacagcagc aacaacatca ccaacaatca caaaatcagc atatccaaca acagcagcaa 1440

cagcagcagc atcagatgca ccaccctcac catacacagc agcacttcca ggcacgaatg 1500

cactttggcg acggcatgga tggcgaggtg tccatgagta ccgtctctca ggcgggtttg 1560

cacatgaact ccaaccctag catgttgttc cccgacaagg atgctctagc agactcgtac 1620

cagcagcagc agcagcaaat gcatagtcaa cacaaccctc cttcgcatca tcctcagcac 1680

aaccagcagc agcagcagca accgcaggtc aagactgagc agaatatgtc tgcatcgcct 1740

actccgggat ctcccaacct cacggaggac cagaaacgta tgaaccacat ctcttccgaa 1800

aagcgacggc gggatctcat caagcaggag tttgaggaaa tgtgcggcct ggtgcctcgt 1860

ctggctgcaa acagcgatga gaagggcaag cgacgccatg gtcatcgagg acgtatgccc 1920

aaggactcgg acaaggacaa ggatactgga accaagtcca agtcgattct actatcgatt 1980

gtgtacgaat acatgtgcga gctggtggag cgaaacaagg ccatgcgggg catgatcacc 2040

gaaaagggcg gatatcacag cgatatcgcc aatgctcttc atcctcccaa gattgatgag 2100

taa 2103

<210> 4

<211> 700

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met His Leu Ser His Pro Gln Glu Lys Gln Val Phe Ile Thr Thr Pro

1 5 10 15

Ser Pro Ser Ser Ser Val Ser Thr Gln Ser Thr Ala Ser Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Leu Phe His Thr Ala Asp Ser Asp Leu Ser Ala Ser Glu Glu Asp

35 40 45

Asp Phe Pro Tyr His Ala Thr Thr His Thr Asn Ile Lys Pro Gly Val

50 55 60

Ser Phe Ser Ala Thr Ser Gly Thr Met Met Ser Ala Leu Ser Pro Val

65 70 75 80

Ser Val Gln Ser Pro Ser Thr Val Phe Met Met Lys Glu Pro Ala Gln

85 90 95

Ala Gln Ala Gln Met Ser His Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ser Ser

100 105 110

Ser His Val Thr Thr Pro Lys His Asn Ala Ala Pro Val Thr Lys Ser

115 120 125

Asp Asp Pro Phe Asp Val Asp Asn Tyr Pro Thr Asp Phe Asp Ser Ala

130 135 140

Phe Leu Asn Leu Ser Pro Thr Met Gly Met Gly Pro Gly Asp Gly Met

145 150 155 160

Asp Gly Ile Pro Leu Phe Asn Ala Glu Glu Glu Ser Ala Phe Ser Ser

165 170 175

Phe Leu Asp Asn Val Ala Leu Asp Pro Asn Phe Ile Phe Glu Pro Asn

180 185 190

Leu Ser Asp Ala Leu Pro Lys Trp Pro Glu Ser Lys Pro Trp Gly Pro

195 200 205

Asn Asp Ser His Lys Pro Arg Thr Asp Lys Phe Thr Lys Phe Gly Asn

210 215 220

Ser Pro Gly Leu Asp Leu Leu Ala Ala Asn Ser Pro Asp Ala Val Asn

225 230 235 240

Ile His Glu Arg Leu Leu Lys His Glu Ser Lys Glu Tyr Leu Ser Pro

245 250 255

Asn His Asn Asp Tyr Ala Gln Ser Asp Ser Arg Ala Gln Ala Leu Ala

260 265 270

Met Ala Glu Thr Gln Gly Tyr Gly Gln Leu Lys His Lys Glu Ser Arg

275 280 285

Ser Ser Leu Ser Gln Pro Ser Ser Leu His Asn Asn Ser Val Thr Gly

290 295 300

Ser Ser Val Thr Thr Thr Arg Pro Ser Pro Gln Thr Ser Gly Pro Ser

305 310 315 320

Pro Val Ser Ser Gly Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ala Pro Met Gly Leu

325 330 335

His Phe Gly Ser Asp Pro Ala Phe Gly Gly Ser Ser Phe Gln Pro Asn

340 345 350

Ser Gly Thr Pro Ala Leu Lys Lys Val Arg Gly Phe Asp Glu Leu Pro

355 360 365

Pro Ala Val His Glu Gly His Gly His Met His Met Gln Pro Gln Arg

370 375 380

Met Val Thr Gly Leu Glu Gly Val Val Asn Pro Lys Leu Val Val Ala

385 390 395 400

Ala Ala Gln Met Ser Gln Gly Val Thr Asp Gln Asn Ile Phe Met Leu

405 410 415

Lys Arg Arg Lys Ser Asp Asn Met Ala Ala Ser Met Asn Ser Asn Val

420 425 430

Pro His Asp Ile Tyr Ala Pro Val Pro His Ala Glu Gln Met Tyr His

435 440 445

Met Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu His Gln Gln Gln Gln Gln

450 455 460

Gln His His Gln Gln Ser Gln Asn Gln His Ile Gln Gln Gln Gln Gln

465 470 475 480

Gln Gln Gln His Gln Met His His Pro His His Thr Gln Gln His Phe

485 490 495

Gln Ala Arg Met His Phe Gly Asp Gly Met Asp Gly Glu Val Ser Met

500 505 510

Ser Thr Val Ser Gln Ala Gly Leu His Met Asn Ser Asn Pro Ser Met

515 520 525

Leu Phe Pro Asp Lys Asp Ala Leu Ala Asp Ser Tyr Gln Gln Gln Gln

530 535 540

Gln Gln Met His Ser Gln His Asn Pro Pro Ser His His Pro Gln His

545 550 555 560

Asn Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Gln Val Lys Thr Glu Gln Asn Met

565 570 575

Ser Ala Ser Pro Thr Pro Gly Ser Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Lys

580 585 590

Arg Met Asn His Ile Ser Ser Glu Lys Arg Arg Arg Asp Leu Ile Lys

595 600 605

Gln Glu Phe Glu Glu Met Cys Gly Leu Val Pro Arg Leu Ala Ala Asn

610 615 620

Ser Asp Glu Lys Gly Lys Arg Arg His Gly His Arg Gly Arg Met Pro

625 630 635 640

Lys Asp Ser Asp Lys Asp Lys Asp Thr Gly Thr Lys Ser Lys Ser Ile

645 650 655

Leu Leu Ser Ile Val Tyr Glu Tyr Met Cys Glu Leu Val Glu Arg Asn

660 665 670

Lys Ala Met Arg Gly Met Ile Thr Glu Lys Gly Gly Tyr His Ser Asp

675 680 685

Ile Ala Asn Ala Leu His Pro Pro Lys Ile Asp Glu

690 695 700

Claims

1.一种内质网调节因子在促进酵母合成油脂或神经酸中的应用，其特征在于：所述酵母为解脂耶氏酵母，所述内质网调节因子的编码核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种合成油脂的方法，其特征在于：采用合成油脂的重组酵母发酵制备得到，所述重组酵母是以解脂耶氏酵母为出发菌株，过表达编码序列如SEQ ID No.1所示的内质网调节因子。

3.按权利要求2所述的合成油脂的方法，其特征在于，将合成油脂的重组酵母接种至种子培养基，培养24小时，而后按10%的接种量接入发酵培养基中，发酵培养5至8天，制备得到油脂。