CN112725223A - 一种用于提高质粒发酵产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于提高质粒发酵产量的方法，所述方法包括：在以初级发酵培养基发酵一定时间后，通过补料培养基A以限制的比生长速率进行指数补料发酵，以提高大肠杆菌质粒的产量。本发明的用于提高质粒发酵产量的方法通过优化补料培养基及补料方法，更快、更便捷地获得高质量、高产量的质粒DNA，实现大肠杆菌高密度培养，提高质粒产量，同时可保持质粒的完整性。

Description

一种用于提高质粒发酵产量的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种用于提高质粒发酵产量的方法。

背景技术

质粒DNA在基因工程、转基因生物、基因治疗、农业和DNA疫苗等方面起着关键性作用。近年来，随着生物制品的不断发展，质粒DNA正越来越多地应用于新的基因疗法，包括DNA疫苗、基因替代载体和用于病毒载体生产等。持续生产大量高纯度、高质量质粒DNA的能力也变得愈发重要。目前质粒DNA主要是大肠杆菌发酵，通过提取、层析(如阴离子交换、疏水相互作用)等一系列下游工艺来获得。其中菌种发酵在质粒DNA生产中占据主导地位。现有技术中，只能利用摇瓶培养用于毫克级质粒的生产，无法保证临床前和临床研究所用质粒的数量和质量的需求，导致无法实现工业化规模生产。

目前，利用已有高产质粒的大肠杆菌，使用低温培养和维持低生长速率等方法，长时间培养后收获菌体，进行质粒的提取纯化，尽管产量较高，但其发酵周期过长，宿主蛋白等一些宿主菌自身产物的积累过多，这些都会影响终产品质粒DNA的质量。

综上，现有的质粒DNA工艺生产中，仍面临质粒DNA产品质量品质不够好，以及工艺方法无法满足经济化和规模化的要求。因此有必要进行工艺方法的开发及优化。

发明内容

为此，本发明提一种用于提高质粒发酵产量的方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种用于提高质粒发酵产量的方法，所述方法包括：在以初级发酵培养基发酵一定时间后，通过添加复合氮源的补料培养基A以限制的比生长速率进行指数补料发酵，以提高大肠杆菌质粒的产量。

本发明的一个实施例中，所述补料培养基A以限制的比生长速率进行指数补料发酵包括先以某一比生长速率值进行指数补料发酵一定时间，再以低于所述某一比生长速率值进行指数补料发酵到结束。

本发明的一个实施例中，所述方法还包括在所述指数补料发酵一定时间后，再以比生长速率值在0.08～0.15的区间线性变化，进行线性区间变化的指数补料发酵1～25h；

在所述线性变化的指数补料过程中，若发酵液的OD₆₀₀值与1小时前的 OD₆₀₀值比较，其OD₆₀₀增量值小于2时，将所述补料培养基A替换为补料培养基B，再以4～6％发酵体积/h的补料速率进行补料发酵3～5h。

本发明的一个实施例中，所述补料培养基B中，各组分含量为：葡萄糖 150～250g/L、柠檬酸20～30g/L、甘氨酸4～8g/L、天冬氨酸2～6g/L、谷氨酰胺0.5～1.5g/L。

本发明的一个实施例中，所述线性区间变化的指数补料发酵的开始时间为发酵的第8～9小时。

本发明的一个实施例中，所述补料培养基A中，各组分含量为：酵母浸粉80～125g/L、葡萄糖150～250g/L、亮氨酸1.5～2.5g/L、脯氨酸1.5～2.5g/L、硫酸镁1.5～2.5g/L、硅酮消泡剂母液0.1～0.3mL/L。

本发明的一个实施例中，所述初级培养基中各组分为：酵母浸粉24g/L、大豆蛋白胨12g/L、脯氨酸0.1g/L、亮氨酸0.1g/L、硅酮消泡剂母液50μL/L。

本发明的一个实施例中，所述指数补料发酵的开始时间为发酵的第3～5 小时，发酵维持时间为3-5小时，所述指数补料发酵的温度为37℃。

本发明的一个实施例中，所述大肠杆菌质粒为pLP1-MDK质粒或 pLP2-RSK质粒。

本发明的一个实施例中，所述以初级发酵培养基发酵开始，菌种的接种量为10％。

本发明中，比生长速率：每小时单位质量的菌体所增加的菌体量。μ＝ln2/t，μ即菌体增加一倍时的比生长速率，t为菌体增加一倍所用时间。

本发明中，指数补料发酵：

F_t葡萄糖补料速率(g/h)，μ比生长速率(h^-1)，Y_X/S每克葡萄糖转换为细胞干重的效率(g/g)，Δs葡萄糖浓度(g/L)，X₀细胞干重(g/L)，V₀补料前培养体积(L)，e常数，t补料进行时间(h)。本发明的实施例中，是通过对补料时间和补料量的控制，以限定指数补料发酵过程中的比生长速率。

本发明具有如下优点：

本发明的用于提高质粒发酵产量的方法通过优化补料培养基及补料方法，能更快、更便捷地获得高质量、高产量的质粒DNA，实现大肠杆菌高密度培养，提高质粒产量，同时保持质粒的完整性。

本发明的方法是基于对大肠杆菌生理生化特性，设计适用大肠杆菌稳定生长的富含氨基酸和复合氮源的补料培养基A液，又结合DNA复制中所需核苷酸的合成过程，增加了富含核苷酸合成前体所需氨基酸的补料培养基B，通过采用限制生长速率的补料方式，既限制了菌种在快速生长时代谢副产物的积累，又给予质粒充足的复制时间，保持菌种及质粒呈平稳状态增长。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1A为本发明实施例1的分批补料发酵培养对pLP1-MDK质粒发酵结果；

图1B为本发明实施例1采用分批发酵培养对pLP1-MDK质粒发酵结果；

图2为本发明实施例2不同比生长速率对菌种生长及质粒产量的影响；

图3A为本发明的pLP1-MDK质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图谱，其中，M 为Maker，1、2、3、4、5、6分别代表不同浓度的质粒样品，以保证灰度值分析结果的准确性；其中1、2为100ng/μL，3、4为50ng/μL，5、6为25ng/μL。

图3B为本发明的pLP2-RSK质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图谱，其中，M 为Maker，1、2、3、4、5、6分别代表不同浓度的质粒样品，以保证灰度值分析结果的准确性；其中1、2为100ng/μL，3、4为50ng/μL，5、6为25ng/μL。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中，发酵罐为迪必尔生物工程有限公司的5L玻璃发酵罐 T&J-Btype 5Lx2；

本发明中，采用的发酵质粒为pLP1-MDK质粒，该使用的质粒是在pLP1(Invitrogen)基础上进行抗性基因改为卡那霉素抗性基因的pLP1-MDK质粒。

本发明中，采用的发酵为质粒pLP2(Invitrogen)基础上抗性基因改为卡那霉素抗性基因的pLP2-RSK质粒。

本发明中，硅酮消泡剂母液购买自sigma。

实施例1、用于提高质粒发酵产量的方法

本实施例提供一种用于提高质粒发酵产量的方法，其包括以下步骤：

步骤一、发酵准备

采用玻璃发酵罐，首先进行pH电极校准，并将刚校准的pH电极和溶氧电极分别安装到相应位置；然后，将排气及冷凝水管、酸液瓶、碱液瓶、消泡剂瓶、补料培养基A和补料培养基B的补料瓶及管路安装到发酵罐相对应的位置，121℃空消40min。

步骤二、发酵罐参数设置

将配制的初始培养基1.2L倒入发酵罐，121℃，实消30min。发酵罐冷却后，在无菌环境下将其余补料转入相应补料瓶中后，把发酵罐与控制柜正确连接。保持发酵罐罐压<0.1Mpa；设定空气通入量为1VVM；pH值设定值为 7.00±0.02；初始转速设定250rpm。移除溶氧电极线，校准溶氧零点为0％，插上电极线，设置发酵罐的转速为600rpm，通气量为4L/min，校准溶氧100％，校准结束后溶氧设定为40±5％。

本步骤中，初始培养基配方为：酵母浸粉24g/L、大豆蛋白胨12g/L、脯氨酸0.1g/L、亮氨酸0.1g/L、硅酮消泡剂母液50μL/L。

步骤三、火焰接种

将摇瓶中37℃培养的新鲜种子液按10％接种量接入发酵罐中，设定pH值自动控制，溶氧自动控制，待溶氧低于设定值时，控制柜自动调节转速；待转速达到每分钟800rpm后，维持转速不变，开始自动通入氧气，将设定菌种菌液的接种时间为发酵零点。

步骤四、补料分批发酵

指数补料发酵：从发酵罐发酵零点开始，发酵罐的菌液培养至4h时，开始使用补料培养基A，进行限制比生长速率的指数补料发酵，设定初始比生长速率为0.3，指数补料发酵培养持续4h。

线性区间变化的指数补料：从发酵零点开始计算，当发酵液培养至8～8.5h 时，在0.08～0.15的区间的线性增长的比生长速率进行线性区间变化的指数补料发酵，比生长速率线性区间增长变化的指数补料时长为1～25h。

在线性区间变化的指数补料期间，每小时取发酵液进行OD₆₀₀值检测，当检测时，发酵液的菌种OD₆₀₀值相比与发酵液培养前1小时的OD₆₀₀值增量值小于2，即发酵进行至23h时立刻停止线性变化的指数补料，改为4％发酵体积/h的补料速率进行补料培养基B进行补料，继续培养3～5h后结束发酵。

本步骤中，补料培养基A的配方为：酵母浸粉125g/L、葡萄糖250g/L、亮氨酸2g/L、脯氨酸2g/L、硫酸镁2g/L、硅酮消泡剂母液0.1mL/L；

补料培养基B的配方为：葡萄糖250g/L、柠檬酸30g/L、甘氨酸6g/L、天冬氨酸4g/L、谷氨酰胺1g/L；酸补料的配方为：20％磷酸；碱补料配方为： 1M氢氧化钠和氨水1:1混合；硅酮消泡剂：稀释10倍的硅酮消泡剂母液。

本实施例使用的是质粒pLP1(Invitrogen)基础上改造抗性基因的 pLP1-MDK。发酵过程中定点取样，用小提质粒试剂盒提取质粒，换算质粒产量，检测结果如图1A所示，采用此种分批补料培养方法使质粒产量提高了7 倍以上；无菌环境下收集发酵液，并进行质粒的纯化和收集，最终可收获900 mg/L以上的质粒产量。

对比例1

在实施例1的步骤四中，在未添加补料培养基A和补料培养基B的分批补料发酵培养中，除了碱补料使用33％浓氨水和初始培养基中增加10g/L的葡萄糖作为碳源外，其余溶液及培养条件均与实施例1相同，分批发酵培养结果如图1B所示。

实施例2、限制生长速率提高质粒发酵产量的方法

本实施例提供的限制生长速率提高质粒发酵产量的方法，其包以下步骤：

步骤一、发酵准备

采用玻璃发酵罐，首先进行pH电极校准，并将刚校准的pH电极和溶氧电极分别安装到相应位置；然后，将排气及冷凝水管、酸液瓶、碱液瓶、 Sigma的硅酮消泡剂瓶、补料培养基A和补料培养基B的补料瓶及管路安装到发酵罐相对应的位置，121℃空消40min。

步骤二、发酵罐参数设置

将配制的初始培养基1.2L倒入发酵罐，121℃，实消30min。发酵罐冷却后，在无菌环境下将其余补料转入相应补料瓶中后，把发酵罐与控制柜正确连接。保持发酵罐罐压<0.1Mpa；设定空气通入量为1VVM；pH值设定值为 7.00±0.02；初始转速设定250rpm。移除溶氧电极线，校准溶氧零点为0％，插上电极线，设置发酵罐的转速为600rpm，通气量为4L/min，校准溶氧100％，校准结束后溶氧设定为40±5％。

本步骤中，初始培养基配方为：酵母浸粉24g/L、大豆蛋白胨12g/L、脯氨酸0.1g/L、亮氨酸0.1g/L、硅酮消泡剂母液50μL/L。

步骤三、火焰接种

将摇瓶中37℃培养的新鲜种子液按10％接种量接入发酵罐中，设定pH值自动控制，溶氧自动控制，待溶氧低于设定值时，控制柜自动调节转速；待转速达到每分钟800rpm后，维持转速不变，开始自动通入氧气，设定菌液的接种时间为发酵零点。

步骤四、指数补料发酵

指数补料发酵：从发酵罐发酵零点开始，发酵罐的菌液培养至4h时，开始使用补料培养基A，进行限制比生长速率的指数补料发酵，设定初始比生长速率为0.3，补料发酵培养持续4h。

本步骤中，取两个发酵罐进行试验，指数补料发酵的过程1为：发酵罐1 的指数补料发酵过程为：培养4.5h后开始指数补料发酵，保持比生长速率 0.3至发酵结束。

指数补料发酵的过程2为发酵罐2的指数补料的发酵过程为：培养4.5h 后开始补料，设定初始比生长速率0.3，持续3h后将比生长速率降至0.15，之后保持比生长速率0.15至发酵结束。

指数补料发酵采用补料培养基A：酵母浸粉125g/L，葡萄糖250g/L，亮氨酸2g/L，脯氨酸2g/L，硫酸镁2g/L，硅酮消泡剂母液0.1mL/L；酸补料： 20％磷酸；碱补料：1M氢氧化钠和氨水1:1混合；硅酮消泡剂：稀释10倍的硅酮消泡剂母液。

本实施例使用的是质粒pLP2(Invitrogen)基础上改造抗性基因的 pLP2-RSK，发酵过程中定点取样，用小提质粒试剂盒提取质粒，换算质粒产量。发酵结果如图2所示，本实施例通过降低菌种的比生长速率后，质粒产量明显提升，同时降低了乙酸等有害代谢副产物的积累，提高菌体量。

试验实施例、质粒DNA质量评价

使用Cygnus的大肠杆菌宿主细胞蛋白免疫检测试剂盒，按照说明书检测质粒DNA中宿主蛋白残留；使用申科生物的E.coli残留DNA检测试剂盒，按照说明书检测质粒DNA中宿主基因组残留；通过琼脂糖凝胶电泳法，进行灰度值分析，检测实施例1和实施例2发酵方法制备的质粒DNA超螺旋比例。详见图3A和3B为pLP2-RSK质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图谱，为表1质粒 DNA终产品质量。

表1

由表1和图3A、3B可知，本发明的实施例通过对培养基进行优化，选择富含氨基酸及复合氮源的补料培养基A，富含核苷酸所需前体物质的补料培养基B，采用限制生长速率的补料分批培养方式，实现了高超螺旋比例、高质量、高产量质粒DNA的制备。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种用于提高质粒发酵产量的方法，其特征在于，

所述方法包括：在以初级发酵培养基发酵一定时间后，通过添加复合氮源的补料培养基A以限制的比生长速率进行指数补料发酵，以提高大肠杆菌质粒的产量。

2.如权利要求1所述的用于提高质粒发酵产量的方法，其特征在于，

所述补料培养基A以限制的比生长速率进行指数补料发酵包括先以某一比生长速率值进行指数补料发酵一定时间，再以低于所述某一比生长速率值进行指数补料发酵到结束。

3.如权利要求1所述的用于提高质粒发酵产量的方法，其特征在于，

所述方法还包括在所述指数补料发酵一定时间后，再以比生长速率值在0.08～0.15的区间线性变化，进行线性区间变化的指数补料发酵1～25h；

在所述线性变化的指数补料过程中，若发酵液的OD₆₀₀值与1小时前的OD₆₀₀值比较，其OD₆₀₀增量值小于2时，将所述补料培养基A替换为补料培养基B，再以4～6％发酵体积/h的补料速率进行补料发酵3～5h。

4.如权利要求3所述的用于提高质粒发酵产量的方法，其特征在于，

所述补料培养基B中，各组分含量为：葡萄糖150～250g/L、柠檬酸20～30g/L、甘氨酸4～8g/L、天冬氨酸2～6g/L、谷氨酰胺0.5～1.5g/L。

5.如权利要求3所述的用于提高质粒发酵产量的方法，其特征在于，

所述线性区间变化的指数补料开始时间为发酵的第8～9小时。

6.如权利要求1所述的用于提高质粒发酵产量的方法，其特征在于，

所述补料培养基A中，各组分含量为：酵母浸粉80～125g/L、葡萄糖150～250g/L、亮氨酸1.5～2.5g/L、脯氨酸1.5～2.5g/L、硫酸镁1.5～2.5g/L、硅酮消泡剂母液0.1～0.3mL/L。

7.如权利要求1所述的用于提高质粒发酵产量的方法，其特征在于，

所述初级培养基中各组分为：酵母浸粉24g/L、大豆蛋白胨12g/L、脯氨酸0.1g/L、亮氨酸0.1g/L、硅酮消泡剂母液50μL/L。

8.如权利要求1所述的用于提高质粒发酵产量的方法，其特征在于，

所述指数补料发酵的开始时间为发酵的第3～5小时，发酵维持时间为3～5小时，所述指数补料发酵的温度为37℃。

9.如权利要求1所述的用于提高质粒发酵产量的方法，其特征在于，

所述大肠杆菌质粒为pLP1-MDK质粒或pLP2-RSK质粒。

10.如权利要求1所述的用于提高质粒发酵产量的方法，其特征在于，

所述以初级发酵培养基发酵开始，菌种的接种量为10％。

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