CN112063562A - 一种高效表达超螺旋质粒dna的大肠杆菌发酵方法 - Google Patents

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田超
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Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种菌体质粒浓度在0.5‑0.75g/L，超螺旋DNA的比例大于78％的大肠杆菌的发酵方法，该方法对接种量、补料策略、pH值、搅拌速度、溶解氧及温度诱导时点及诱导时间进行控制，该方法在不加入抗生素的条件下进行发酵，得到高产率、高质量的超螺旋质粒DNA。

Description

一种高效表达超螺旋质粒DNA的大肠杆菌发酵方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种大肠杆菌的发酵方法，具体涉及一种可以高效表达超螺旋质粒DNA的大肠杆菌的发酵方法。
背景技术
发酵一直都是生产生物制品原料的最关键技术，大肠杆菌表达系统作为最早和最成熟的表达系统之一，人们已经开发了很多大肠杆菌的发酵培养策略，主要的目的是产物的最大限度积累与最小的能源消耗。在工业化生产中常用到分批发酵的方法，在发酵过程中主要的控制参数包呼吸商，pH值，溶解氧，比生长速率等。
随着重组DNA技术的出现和发酵技术的进一步发展，目前大肠杆菌或其他的细胞培养已广泛运用于重组蛋白的表达。这些重组蛋白已经作为生物药被广泛的开发及利用。近些年基因药物发展迅速，与传统的重组DNA载体表达重组蛋白不同，不需要质粒的转录与翻译，发酵过程产生质粒，该质粒经过纯化与制剂过程后即可以作为非病毒给药系统在临床中得以应用。经过人工改造的工程质粒，可以作为一种药物在患者体内表达插入的目的基因，最终达到预防或治疗相关疾病的目的。目前质粒DNA已成为下一代生物制药的代表，拟用于基因疫苗，基因免疫或基因治疗。
随着临床研究的激增，质粒DNA的高需求量对质粒DNA的原核发酵体系提出了更高的要求。已经构建好的质粒，其复制子决定了质粒在单位细胞中表达量的上限，所以在批发酵中，质粒高产出需要较高的菌体密度作为基础。在表达质粒的大肠杆菌发酵体系中，一般需要加入相应的抗生素，一方面是提供选择压，减低污染概率；另一方面是使大肠杆菌在培养过程中使得质粒维持一个较高的拷贝来应对抗生素的选择。但根据相关的要求，在纯化及药品的制剂的放行中必须对加入的抗生素进行残留检测，以确保残留量不会对健康产生影响。
质粒一般有超螺旋、线性和开环等多种拓扑结构。在质粒转染过程中，超螺旋比例高时其转染效率及表达量较高，是基因治疗和DNA疫苗中起主要作用的质粒载体形式。2007年，美国FDA发布相关指导原则，将超螺旋结构的DNA占总质粒DNA的比例作为评价质粒DNA的标准。为得到更高质量的质粒的药品，在第一步的发酵过程中有效地提高质粒质量对减轻下游的纯化工艺压力及提高最终产品的产率都至关重要。
发明内容
本发明提供一种菌体质粒浓度在0.5-0.75g/L，超螺旋DNA的比例大于78％的大肠杆菌的发酵方法，该方法对接种量、补料策略、pH值、搅拌速度、溶解氧及温度诱导时点及诱导时间进行控制，该方法在不加入抗生素的条件下进行发酵，得到高产率、高质量的超螺旋质粒DNA。
本发明为一种大肠杆菌高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法，该方法通过以下技术方案实现：
(1)摇瓶种子的复苏及制备
将低温冻存的菌种在摇瓶中用LB培养基稀释数倍进行复苏培养。当培养至0.5≤OD600≤3.0时，取菌种稀释后进行继代培养并准备进行发酵接种。
(2)接种
接种并测定OD600值,然后将稀释的种子溶液转移到预先灭菌的无菌接种瓶中；
(3)发酵
将步骤(2)获得的培养液加入到含有基础培养基的一次性培养袋中，基础培养基已预先经过湿热灭菌。接种发酵罐后开始发酵，调节初始pH值为7.0±0.3，当pH值≥6.75时，启动补料，补料持续至发酵结束。
(4)质粒的检测
在过程中进行取样，提取质粒DNA后对其浓度及质量进行检测。
进一步地，步骤(1)中所述菌种稀释倍数为100-1000倍。
进一步地，步骤(3)所述补料方法为：采用连续的补料方式，测定补料起始点的OD600值，以起始补料时间点为起点，每1-2小时取样测定发酵液的OD600值，根据公式：
μ＝ln(C前/C后)/T
—μ：比生长速率；
—C前：前一个时间点的菌体OD600值；
—C后：后一个时间点的菌体OD600值；
—T:两个时间点的时间间隔。
计算比生长速率，根据计算的比生长速率在每个测定OD600值的时间点在原补料量的基础上增加5％-50％补料量以控制下个时间段的比生产速率在0.00-0.20范围内。
当发酵液的OD600达到60-80时，将培养温度从30℃调整为42℃进行温度诱导，同时根据比生长速率控制的变化流加补料培养基。
在温度诱导10-14小时后，根据质粒测定的产量与质量结果确定菌体的收获时间。
进一步地，所述补料培养基的成分包括：C源、N源、氨基酸、维生素、微量元素和消泡剂。
进一步地，所述补料培养基C源含量不超过60％；N源含量不超过15％；氨基酸含量不超过8％；维生素含量不超过5％；其他微量元素含量不超过2％；消泡剂含量不超过0.05％；pH控制在7.0-7.4。
进一步地，步骤(3)所述基础培养基的成分包括：C源、N源、氨基酸、维生素、消泡剂和其他微量元素。
进一步地，所述基础培养基C源含量不超过5％；N源含量不超过2％；氨基酸含量不超过1％；维生素含量不超过0.5％；其他微量元素含量不超过1％；消泡剂含量不超过0.05％，pH控制在6.7-7.3。
进一步地，所述补料方法中，补料起始量为0.5-0.8ml/min。
进一步地，所述补料方法中，pH初始设定值范围为7.0±0.3。
进一步地，步骤(2)所述接种过程中的溶解氧维持在10％-30％；具体的，在发酵起始时，设定底通空气饱和时的溶解氧为100％及底通氮气饱和时的溶解氧为0％，以此两点校准溶氧电极，然后设定发酵液的溶解氧含量为10％-30％；通过发酵罐空气、氧气的集联设置保证发酵过程中的溶解氧维持在10％-30％；。
发酵过程起始时，设定搅拌转速为200rpm/min，底通空气0.75L/min，随着菌体浓度增加，溶解氧开始下降，当下降至设定值时，发酵罐自动开启空气、氧气的集联控制，适时调节空气与氧气的进气量以维持溶解氧在30％，由于菌体浓度的不断升高，为了提高通气转变为溶解氧的效率，将起始转速200rpm/min在45min-60min线性提高至250rpm/min，一直保持该转速至发酵结束。
进一步地，步骤(4)所述发酵过程中，通过浓度不超过30％的磷酸或不超过30％的氨水调节pH，使其控制在6.70-7.30范围内。
检该发酵方法是一种高效表达超螺旋质粒DNA的大肠杆菌发酵方法，相对于其他的发酵方法，该方法通过低密度进行接种，批间一致性较好，在发酵过程中不加入抗生素，通过温度诱导获得产量高的质粒，免除了后期对抗生素残留的检测，节约了检测过程中的成本，同时降低了后期药品制备时外源因子的可能污染，使药品的安全性进一步得到保障。该方法以pH的变化作为补料点，相比对测定C源含量确定补料点的方法其补料控制更方便、更精确，以较低的比生长速率进行补料培养，使整个发酵过程更易控制，有利于营养的消耗，同时可以有效的控制泡沫的产生，保证菌体的活性。以30℃到42℃进行质粒的诱导，在降低菌体新陈代谢活性的同时不降低质粒的复制活性，保证了高密度菌体及高浓度质粒的产出，同时在变温后控制诱导时间，保证了质粒在高产出的前提下拥有高比例的超螺旋结构。
附图说明
图1实施例1大肠杆菌发酵曲线
图2实施例2大肠杆菌发酵曲线
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体的实施例，对本发明作详细描述。
实施例1
(1)摇瓶种子初培养。将一支工作用菌种从-80℃冰箱中取出并在室温(20±5℃)下解冻。取600μL已混匀的菌液加入到至少预先30℃平衡一小时的装有200mL种子培养基的1L摇瓶中。将摇瓶在30℃条件下以200rpm/min振荡培养，直至培养液达到0.5≤OD600≤1.5。
(2)摇瓶种子继代培养。准备三瓶装有200mL基础培养基的1L摇瓶，将其在30℃条件下平衡至少1小时。当初培养的培养液达到0.5≤OD600≤1.5时，分别取60μL、200μL、600μL的培养液接种于预先准备好的三个摇瓶中，将摇瓶在30℃条件下以200rpm/min振荡培养，直至培养液达到0.5≤OD600≤1.5。
(3)接种。选取培养状态较好的一瓶种子进行接种，根据发酵罐中基础培养基的体积计算接种液的加入量，菌种的最终发酵起始OD600＝0.004。经计算后将待添加到发酵罐中的培养液转移到预先灭菌的无菌接种瓶中。
(4)发酵。将培养液加入到含有基础培养基的一次性培养袋中，基础培养基已预先经过湿热灭菌，一次性培养袋预先装在50L发酵罐中。接种发酵罐后开始发酵，当pH值≥6.75时，启动补料以维持菌体的正常生长，补料过程中保持较低的比生长速率，阶段性测定菌体的浓度，计算比生长速率，当测定的比生长速率低于0.1时，补料量在原补料基础上提高20％，且通过集联控制，实时添加25％NH3·H2O维持在pH在7.00(±0.30)范围内，在此过程中，在1小时将转速从200rpm/min线性提高至250rpm/min。
第一次补料大约在pH值≥6.75之后开始。补料持续至发酵结束。当OD600值达到60-80时将温度从30℃升高至42℃以诱导质粒拷贝数增加，诱导时间一般为10-12小时。诱导培养结果后，收获前停止补料将发酵罐冷却至15℃后进行收获，计算菌体的温重。
(5)质粒的检测。在过程中进行取样，提取质粒DNA后对其浓度及质量进行检测。检测结果如表1所示
表1发酵中样品的质粒浓度及其质量的检测结果
取样时间(变温后) 6小时 8小时 10小时 12小时
质粒DNA浓度(mg/mL) 0.42 0.52 0.70 0.70
质粒超螺旋DNA含量(％) 92.3 91.7 90.4 89.0
发酵过程如图1所示，在pH≥6.75补料,同时提高搅拌转速，发酵工艺控制稳定，补料策略合理；如表1所示，变温后的6-12小时，质粒的发酵总量在不断增加，质粒超螺旋DNA含量(％)维持在较多水平。
实施例2
(1)摇瓶种子初培养。将一支工作用菌种从-80℃冰箱中取出并在室温(20±5℃)下解冻。取600μL已混匀的菌液加入到至少预先30℃平衡一小时的装有200mL种子培养基的1L摇瓶中。将摇瓶在30℃条件下以200rpm/min振荡培养，直至培养液达到0.5≤OD600≤1.5。
(2)摇瓶种子继代培养。准备三瓶装有200mL基础培养基的1L摇瓶，将其在30℃条件下平衡至少1小时。当初培养的培养液达到0.5≤OD600≤1.5时，分别取60μL、200μL、600μL的培养液接种于预先准备好的三个摇瓶中，将摇瓶在30℃条件下以200rpm/min振荡培养，直至培养液达到0.5≤OD600≤1.5。
(3)接种。选取培养状态较好的一瓶种子进行接种，根据发酵罐中基础培养基的体积计算接种液的加入量，菌种的最终发酵起始OD600＝0.004。经计算后将待添加到发酵罐中的培养液转移到预先灭菌的无菌接种瓶中。
(4)发酵。将培养液加入到含有基础培养基的一次性培养袋中，基础培养基已预先经过湿热灭菌，一次性培养袋预先装在50L发酵罐中。接种发酵罐后开始发酵，当菌体的浓度OD600≥15.0时，启动补料以维持菌体的正常生长，补料过程中保持较低的生长速率，且通过集联控制，实时添加25％NH3·H2O维持在pH在7.00(±0.50)范围内。
(5)第一次补料大约在OD600≥15.0时开始。补料持续至降温收获。过程中根据溶氧量的变化适时的调整搅拌转速，当溶氧量在10％-30％范围，搅拌速度维持在200rpm/min，当溶氧量降低时增加搅拌速度。补料策略根据发酵过程产生的泡沫及进行调整，当量泡沫增加时，增加消泡剂的量同时降低补料量。当OD600值达到60-80时将温度从30℃升高至42℃以诱导质粒拷贝数增加，诱导时间一般为10-12小时。诱导培养结果后，收获前停止补料将发酵罐冷却至15℃后进行收获，计算菌体的温重。
发酵过程如图2所示，在该条件下，发酵过程通气波动较大，控制不稳定，补料策略不明确，过程中产生大量泡沫，整体的发酵过程控制较差，工艺不稳定。

Claims (12)

1.一种大肠杆菌高效表达螺旋质粒DNA的发酵方法，其特征在于：
(1)摇瓶种子的复苏及制备
将低温冻存的菌种复苏培养,再经继代培养得到菌种；
(2)接种
接种并测定OD600值,然后将稀释的种子溶液转移到预先灭菌的无菌接种瓶中；
(3)发酵
将步骤(2)获得的培养液加入到含有基础培养基的一次性培养袋中，基础培养基已预先经过湿热灭菌，接种发酵罐后开始发酵，当pH值≥6.75时，启动补料，补料持续至发酵结束。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤(3)所述补料方法为：采用连续的补料方式，测定补料起始点的OD600值，以起始补料时间点为起点，每1-2小时取样测定发酵液的OD600值，根据公式：
μ＝ln(C前/C后)/T
—μ：比生长速率；
—C前：前一个时间点的菌体OD600值；
—C后：后一个时间点的菌体OD600值；
—T:两个时间点的时间间隔；
计算比生长速率，根据计算的比生长速率在每个测定OD600值的时间点在原补料量的基础上增加5％-50％补料量以控制下个时间段的比生产速率在0.00-0.20范围内；当发酵液的OD600达到60-80时，将培养温度从30℃调整为42℃进行温度诱导，同时根据比生长速率控制的变化流加补料培养基；在温度诱导10-14小时后，根据质粒测定的产量与质量结果确定菌体的收获时间。
3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤(1)所述的复苏培养需将低温冻存的菌种在摇瓶中用LB培养基稀释数倍后进行复苏培养。
4.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤(1)所述的继代培养需满足0.5≤OD600≤3.0。
5.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤(2)所述的稀释种子溶液浓度为0.001≤OD600≤0.005。
6.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：对步骤(3)获取的质粒DNA应对浓度及质量进行检测。
7.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：所述补料培养基的成分包括：C源、N源、氨基酸、维生素、微量元素和消泡剂。
8.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于：所述补料培养基C源含量不超过60％；N源含量不超过15％；氨基酸含量不超过8％；维生素含量不超过5％；其他微量元素含量不超过2％；消泡剂含量不超过0.05％；pH控制在7.0-7.4。
9.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：所述基础培养基的成分包括：C源、N源、氨基酸、维生素、消泡剂和其他微量元素。
10.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于：所述基础培养基C源含量不超过5％；N源含量不超过2％；氨基酸含量不超过1％；维生素含量不超过0.5％；其他微量元素含量不超过1％；消泡剂含量不超过0.05％，pH控制在6.7-7.3。
11.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：所述补料方法中，补料起始量为0.5-0.8ml/min。
12.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：所述补料方法中，pH初始设定值范围为7.0±0.3。
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