CN116286469A - 一种提高大肠杆菌发酵生产质粒产量的方法 - Google Patents

一种提高大肠杆菌发酵生产质粒产量的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116286469A
CN116286469A CN202310007078.5A CN202310007078A CN116286469A CN 116286469 A CN116286469 A CN 116286469A CN 202310007078 A CN202310007078 A CN 202310007078A CN 116286469 A CN116286469 A CN 116286469A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
escherichia coli
flow rate
ventilation
hydroxide solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310007078.5A
Other languages
English (en)
Inventor
曹峥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Yaomingshengji Pharmaceutical Technology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Yaomingshengji Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Yaomingshengji Pharmaceutical Technology Co ltd filed Critical Shanghai Yaomingshengji Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority to CN202310007078.5A priority Critical patent/CN116286469A/zh
Publication of CN116286469A publication Critical patent/CN116286469A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，包括如下步骤：将大肠杆菌种子接入到LB种子培养基中进行活化，然后转入发酵罐中进行高密度培养，通过补料和酸碱调控pH值，并为大肠杆菌的生长提供营养物质，发酵培养过程中将溶解氧与通气量、转速和通氧量进行联动，通过升温‑降温‑再升温的方式对温度进行调控。本发明优化了发酵和补料培养基配方，保证了菌体的高密度生长，通过添加各种微量元素，对代谢进行刺激和扰动，促进菌体的代谢，有利于质粒的复制与拷贝，菌体培养过程中通过多阶段控温，分别实现了菌体的积累和质粒的合成。解决了通常在大肠杆菌生产过程中质粒水平不稳定，产量偏低的问题，并且降低了生产的成本。

Description

一种提高大肠杆菌发酵生产质粒产量的方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵方法，具体涉及一种大肠杆菌的发酵方法。
背景技术：
基因治疗作为一个高速发展的行业，是将DNA自身作为高效生物物质利用的一项医学技术。然而无论是体内还是体外基因转移都需要一种安全、无毒的工具来携带外源基因进入细胞内，这种工具被称为载体，质粒DNA作为一种新的非病毒转基因载体。宿主菌的选择是一个合适的重要环节，大肠杆菌因其培养要求低、生长迅速，遗传背景清楚和表达量高等优点，是生命科学研究的模式生物之一。并且大肠杆菌的高密度细胞培养技术(highcell density cultivation,HCDC)能够显著提高菌体发酵密度，最终提高产物的比生产率，达到提高质粒产量的目的。目前，大肠杆菌生产质粒时，由于质粒对菌体产生的负荷，因此存在着大肠杆菌的OD值较低从而导致质粒产量无法得到提高的问题。如何有效提高发酵大肠杆菌的OD值并提高质粒的产量已成为急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于，针对大肠杆菌生产质粒产量较低的情况，优化了发酵的配方及培养方式，提高了菌体的OD值和质粒产量。本发明通过优化发酵培养基配方保证前期菌体拥有足够的营养物质，通过添加各种微量元素，对菌体代谢进行扰动，促进菌体的代谢，有利于质粒的拷贝，菌体培养过程中通过多阶段控温，分别实现了菌体的积累和产物的合成。通过持续的补料实现了菌体的高密度生长。通过本发明所述的方法提高了质粒的产量，降低了生产的成本。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，包括如下步骤：
(1)取一支大肠杆菌甘油冷冻管，按照1％-5％的接种比接入到LB种子培养基中，进行活化；
(2)将种子培养基放入摇床中，培养6-10h；
(3)根据发酵培养基的配方配置发酵培养基，将培养基进行灭菌，灭菌完成后进行冷却，之后设定发酵培养的参数；
(4)将培养完成的种子转入发酵罐中，进行发酵培养30-36h，培养过程采用酸和碱调控pH值；
(5)发酵培养过程中，通过流加补料培养基维持大肠杆菌的生长；
(6)发酵培养过程中，将溶解氧与通气量、转速和通氧量进行联动；
(7)发酵培养过程中，通过升温-降温-再升温的方式对温度进行调控。
较佳的，步骤(2)中所述的摇床，其培养温度为30-37℃，转速为150-250rpm。
较佳的，步骤(3)中所述发酵培养基为：葡萄糖5-12g/L，甘油3-10g/L，Ye酵母5-10g/L，AOF蛋白胨8-15g/L，磷酸氢二钾0.5-3g/L，磷酸二氢钾0.5-3g/L，硫酸铵0.5-1.0g/L，硫酸镁0.1-0.5g/L，氯化钙0.5-2g/L，硫酸锰0.15-0.5g/L，生物素0.1-1mg/L，维生素B11-5mg/L，维生素B5 1-5mg/L，维生素B6 1-5mg/L，消泡剂0.1-0.5g/L。
较佳的，步骤(3)中所述初始发酵培养的参数为，温度28-32℃，pH值6.8-7.2，转速150-350rpm，溶解氧设定值为20-40％，通气量0.3-0.5VVM，罐压为0.01-0.05MPa。
较佳的，步骤(4)中所述的酸为盐酸或/和磷酸，其浓度为400-500g/L。
较佳的，步骤(4)中，碱为氨水、氢氧化钠溶液或/和氢氧化钾溶液，氢氧化钠溶液或/和氢氧化钾溶液的浓度为10-50g/L，碱溶液的组成为氨水+氢氧化钠溶液或/和氢氧化钾溶液，氨水：氢氧化钠溶液(氢氧化钾溶液)＝1:1-5(V:V)。
较佳的，步骤(5)中，补料培养基为：甘油500-600g/L，Ye酵母80-100g/L，AOF蛋白胨50-60g/L，硫酸镁2-6g/L，消泡剂0.1-0.5g/L。
较佳的，步骤(5)中，补料的开始时间为8-9h，补料流速为1.2mL/(h·L)，9-10h，补料流速为1.6mL/(h·L)，10-11h，补料流速为2.0mL/(h·L)，14-15h，补料流速为4.2mL/(h·L)，17-18h，补料流速为7.6mL/(h·L)，19-20h，补料流速为11.2mL/(h·L)，21-22h，补料流速为16.8mL/(h·L)。
较佳的，步骤(6)中，溶解氧与通气量、转速和通氧量的联动，联动顺序为通气量、转速和通氧量，通气量范围为0.5-1.5vvm，转速为150-1300rpm，通氧量为＞0％。
较佳的，步骤(7)中，12～18h，温度升高为35-42℃；18-20h，温度降为28-32℃；20-32h温度升高至34-38℃。
本发明的优点是：1.将维生素引入发酵配方中，有效的刺激了菌体的代谢并提高了菌体的生物和质粒产量；2.通过多阶段控温的方式，对菌体不断进行刺激，最终获得了更高的质粒产量；3.采用混合碱液的方式来控制发酵体系的pH值，并且对NH4 +的量进行了有效的控制；4.采用全自动控制参数的方式来简化生产的控制过程；5.通过不断地改变温度，持续性的对菌体进行刺激，最终提高了发酵的终产量。6.结束培养时，进行质粒产量的测定，较原始工艺，OD600＞100，质粒产量提高了50％以上。
附图说明
图1是接种装置。
具体实施方式
实施例1：
(1)取一支大肠杆菌甘油冷冻管，按照1％的接种比接入到LB种子培养基中，进行活化；
(2)将种子培养基放入摇床中，摇床温度为37℃，转速为250rpm，培养10h；
(3)发酵培养基配方：甘油10g/L，Ye酵母10g/L，AOF蛋白胨15g/L，磷酸氢二钾3g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸铵1.0g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙2g/L，硫酸锰0.5g/L，生物素1mg/L，维生素B1 5mg/L，维生素B5 5mg/L，维生素B6 5mg/L，消泡剂0.5g/L；将培养基进行灭菌，灭菌完成后进行冷却，之后设定发酵培养的参数：温度32℃，pH值7.2，转速350rpm，溶解氧设定值为40％，通气量0.3VVM，罐压为0.05MPa；开启溶解氧与通气量、转速和通氧量的联动，联动顺序为通气量、转速和通氧量，通气量范围为0.3-1.5VVM，转速为350-1300rpm，通氧量为＞0％；
(4)将培养完成的种子转入发酵罐中(见图1)，进行发酵培养36h，培养过程采用浓度为400g/L的磷酸和氨水：50g/L氢氧化钠溶液(氢氧化钾溶液)＝1:5(V:V)调控pH值；
(5)补料培养基：甘油600g/L，Ye酵母100g/L，消泡剂0.5g/L；9h开始补料，补料流速为1.2mL/(h·L)，10h，补料流速为1.6mL/(h·L)，11h，补料流速为2.0mL/(h·L)，15h，补料流速为4.2mL/(h·L)，18h，补料流速为7.6mL/(h·L)，20h，补料流速为11.2mL/(h·L)，22h，补料流速为16.8mL/(h·L)；
(6)发酵培养过程中，于18h，温度升高为40℃，20h温度降为32℃，32h，温度升为38℃，至36h培养结束；
(7)36h结束培养时，取样进行质粒产量的测定，结果为1272mg/L，较原始工艺，产量提高了62％。并且OD600为120。
实施例2：
(1)取一支大肠杆菌甘油冷冻管，按照5％的接种比接入到LB种子培养基中，进行活化；
(2)将种子培养基放入摇床中，摇床温度为35℃，转速为200rpm，培养6h；
(3)发酵培养基配方：甘油3g/L，Ye酵母5g/L，AOF蛋白胨8g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸铵0.5g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.5g/L，硫酸锰0.15g/L，生物素0.1mg/L，维生素B1 1mg/L，维生素B5 1mg/L，维生素B6 1mg/L，消泡剂0.1g/L；将培养基进行灭菌，灭菌完成后进行冷却，之后设定发酵培养的参数：温度28℃，pH值6.8，转速150rpm，溶解氧设定值为20％，通气量0.5VVM，罐压为0.01MPa；开启溶解氧与通气量、转速和通氧量的联动，联动顺序为通气量、转速和通氧量，通气量范围为0.5-1.5VVM，转速为150-1300rpm，通氧量为＞0％；
(4)将培养完成的种子转入发酵罐中(见图1)，进行发酵培养30h，培养过程采用浓度为500g/L的磷酸和氨水：10g/L氢氧化钠溶液(氢氧化钾溶液)＝1:1(V:V)调控pH值；
(5)补料培养基：甘油500g/L，Ye酵母80g/L，消泡剂0.1g/L；8h开始补料，补料流速为1.2mL/(h·L)，9h，补料流速为1.6mL/(h·L)，10h，补料流速为2.0mL/(h·L)，14h，补料流速为4.2mL/(h·L)，17h，补料流速为7.6mL/(h·L)，19h，补料流速为11.2mL/(h·L)，21h，补料流速为16.8mL/(h·L)；
(6)发酵培养过程中，于12h，温度升高为35℃，18h，温度降为28℃，20h，温度升为36℃，至30h培养结束。
(7)30h结束培养时，取样进行质粒产量的测定，结果为1178mg/L，较原始工艺，产量提高了50％。且OD600为110。
实施例3：
(1)取一支大肠杆菌甘油冷冻管，按照3％的接种比接入到LB种子培养基中，进行活化；
(2)将种子培养基放入摇床中，摇床温度为35℃，转速为200rpm，培养8h；
(3)发酵培养基配方：甘油5g/L，Ye酵母8g/L，AOF蛋白胨10g/L，磷酸氢二钾1.2g/L，磷酸二氢钾1.2g/L，硫酸铵0.8g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钙1.0g/L，硫酸锰0.3g/L，生物素0.5mg/L，维生素B1 3mg/L，维生素B5 3mg/L，维生素B6 3mg/L，消泡剂0.3g/L；将培养基进行灭菌，灭菌完成后进行冷却，之后设定发酵培养的参数：温度30℃，pH值7.0，转速200rpm，溶解氧设定值为30％，通气量0.4VVM，罐压为0.03MPa；开启溶解氧与通气量、转速和通氧量的联动，联动顺序为通气量、转速和通氧量，通气量范围为0.3-1.5VVM，转速为200-1300rpm，通氧量为＞0％；
(4)将培养完成的种子转入发酵罐中(见图1)，进行发酵培养33h，培养过程采用浓度为450g/L的磷酸和氨水：30g/L氢氧化钠溶液(氢氧化钾溶液)＝1:3(V:V)调控pH值；
(5)补料培养基：甘油550g/L，Ye酵母90g/L，消泡剂0.3g/L；8.5h开始补料，补料流速为1.2mL/(h·L)，9.5h，补料流速为1.6mL/(h·L)，10.5h，补料流速为2.0mL/(h·L)，14.5h，补料流速为4.2mL/(h·L)，17.5h，补料流速为7.6mL/(h·L)，19.5h，补料流速为11.2mL/(h·L)，21.5h，补料流速为16.8mL/(h·L)；
(6)发酵培养过程中，于14h，温度升高为37℃，19h，温度降为30℃，22h，温度升至36℃，至34h培养结束。
(7)30h结束培养时，取样进行质粒产量的测定，结果为1225mg/L，较原始工艺，产量提高了56％。且OD600为116。

Claims (10)

1.一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取一支大肠杆菌甘油冷冻管，按照1％-5％的接种比接入到LB种子培养基中，进行活化；
(2)将种子培养基放入摇床中，培养6-10h；
(3)将培养基进行分装和灭菌，灭菌完成后进行冷却，之后设定发酵培养的参数；
(4)将培养完成的种子转入发酵罐中，进行发酵培养30-36h，培养过程采用酸和碱调控pH值；
(5)发酵培养过程中，通过补加补料培养基维持大肠杆菌的生长；
(6)发酵培养过程中，将溶解氧与通气量、转速和通氧量进行联动；
(7)发酵培养过程中，通过升温-降温-升温的方式对温度进行调控。
2.根据权利要求1所述的一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的摇床，其培养温度为30～37℃，转速为150～250rpm。
3.根据权利要求1或2所述的一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，步骤(3)中所述发酵培养基包含以下成分：甘油3～10g/L、Ye酵母5～10g/L、AOF蛋白胨8～15g/L、磷酸氢二钾0.5～3g/L、磷酸二氢钾0.5～3g/L、硫酸铵0.5～1.0g/L、硫酸镁0.1～0.5g/L、氯化钙0.5～2g/L、硫酸锰0.15～0.5g/L、生物素0.1～1mg/L、维生素B1 1～5mg/L、维生素B5 1～5mg/L、维生素B6 1～5mg/L和消泡剂0.1-0.5g/L。
4.根据权利要求1或2所述的一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，步骤(3)中所述初始发酵培养的参数为：温度28～32℃，pH值6.8～7.2，转速150～350rpm，溶解氧设定值为20～40％，通气量0.3～0.5VVM，罐压为0.01～0.05MPa。
5.根据权利要求1或2所述的一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，步骤(4)中所述酸为盐酸或/和磷酸，其浓度为400～500g/L。
6.根据权利要求1或2所述的一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述碱为氨水、氢氧化钠溶液或/和氢氧化钾溶液；氢氧化钠溶液或/和氢氧化钾溶液的浓度为10～50g/L；碱溶液的组成为氨水+氢氧化钠溶液或/和氢氧化钾溶液；氨水：氢氧化钠溶液或/和氢氧化钾溶液＝1:1～5。
7.根据权利要求1或2所述的一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述补料培养基包含以下成分：甘油500～600g/L、Ye酵母80～100g/L和消泡剂0.1～0.5g/L。
8.根据权利要求1或2所述的一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，步骤(5)中，补料的开始时间为：8-9h，补料流速为1.2mL/(h·L)；9-10h，补料流速为1.6mL/(h·L)；10-11h，补料流速为2.0mL/(h·L)；14-15h，补料流速为4.2mL/(h·L)；17-18h，补料流速为7.6mL/(h·L)；19-20h，补料流速为11.2mL/(h·L)；21-22h，补料流速为16.8mL/(h·L)。
9.根据权利要求1或2所述的一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述溶解氧与通气量、转速和通氧量进行联动的顺序为通气量、转速和通氧量；所述通气量范围为0.5～1.5vvm，所述转速为150～1300rpm，所述通氧量为＞0％。
10.根据权利要求1或2所述的一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，步骤(7)中，12～18h，温度升高为35-40℃；18-20h，温度降为28-32℃；20-32h温度升高至34-38℃。
CN202310007078.5A 2023-01-04 2023-01-04 一种提高大肠杆菌发酵生产质粒产量的方法 Pending CN116286469A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310007078.5A CN116286469A (zh) 2023-01-04 2023-01-04 一种提高大肠杆菌发酵生产质粒产量的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310007078.5A CN116286469A (zh) 2023-01-04 2023-01-04 一种提高大肠杆菌发酵生产质粒产量的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116286469A true CN116286469A (zh) 2023-06-23

Family

ID=86798571

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310007078.5A Pending CN116286469A (zh) 2023-01-04 2023-01-04 一种提高大肠杆菌发酵生产质粒产量的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116286469A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117025496A (zh) * 2023-08-16 2023-11-10 浙江健新原力制药有限公司 一种重组质粒的大肠杆菌发酵方法、培养基体系及其应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117025496A (zh) * 2023-08-16 2023-11-10 浙江健新原力制药有限公司 一种重组质粒的大肠杆菌发酵方法、培养基体系及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7390660B2 (en) Methods for growing mammalian cells in vitro
CN101979498B (zh) 一种微藻高产率异养培养的方法
CN102168115A (zh) 一种辅酶q10工业化生产方法
CN116286469A (zh) 一种提高大肠杆菌发酵生产质粒产量的方法
CN112625988A (zh) 一种大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法和应用
CN101497901A (zh) 米根霉半连续高密度发酵产高光学纯度l-乳酸新工艺方法
CN104160016A (zh) 高密度培养大肠杆菌细胞的方法
CN114032260A (zh) 一种提高海南霉素发酵水平的方法
CN103614428A (zh) 一种高效发酵生产l-色氨酸的方法
CN110760446A (zh) 一种卵囊藻培养工艺
CN104694591A (zh) 一种用于生物素亚适量发酵生产谷氨酸的发酵培养基和利用其生产谷氨酸的发酵方法及应用
CN112940945B (zh) 一种中国被毛孢发酵的方法
CN116333948B (zh) 一种食气梭菌增菌培养基及其制备方法
CN101153294B (zh) 琥珀酸的固定化细胞单罐高强度连续发酵工艺
CN109628509B (zh) 半连续发酵工艺生产吡咯喹啉醌的方法
CN101768560A (zh) 一种提高质粒dna在大肠杆菌工程菌中比含量的培养基
JPS6258707B2 (zh)
CN114045251B (zh) 基因工程大肠杆菌高密度发酵培养基及其发酵工艺
CN113957064B (zh) 一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产dpe的方法
Nie et al. A novel strategy on the high-cell-density cultivation of Candida utilis for the enhanced production of glutathione
CN109628526B (zh) 一种提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法
CN112063562A (zh) 一种高效表达超螺旋质粒dna的大肠杆菌发酵方法
CN112852896A (zh) 一种l-精氨酸的发酵生产方法
CN107988293B (zh) 调节压力提高重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺
JP2003521232A (ja) Ｌ−ソルボースの製法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination