CN117025496A - 一种重组质粒的大肠杆菌发酵方法、培养基体系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组质粒的大肠杆菌发酵方法、培养基体系及其应用，对基础培养基、补料培养基的碳源和氮源进行调整，在第一阶段降低细菌生长速度，并通过第二阶段的高碳源补料培养，使得整个发酵过程营养物质供给不会减少，并协同增效促进酶的活性，用于后期质粒合成阶段的前体物质不受影响。所述培养基以及发酵方法可用于大肠杆菌规模化生产慢病毒包装辅助质粒，以获得不低于1000mg/mL的产量和95％以上的超螺旋比例。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵和基因工程领域，具体地说涉及一种重组质粒的大肠杆菌发酵方法、培养基体系及其应用。
背景技术
基因治疗、细胞治疗和DNA疫苗等生物领域近几年发展迅速，其中以表达目的基因重组质粒的市场需求也随之扩大，如何进行高效的规模化生产质粒越来越被行业重视，质粒的生产受到质粒构建、发酵培养、质粒提取、质粒纯化等各个方面的影响。虽然质粒的高效生产大都集中在质粒下游的如质粒提取、质粒纯化等工艺上，但是质粒的质量和产量最终取决于发酵策略。通过在质粒上游发酵培养阶段，除了调整载体设计、宿主菌以外，还可以对发酵基础培养基配方、补料培养基配方、补料方式、诱导温度这几个方面进行优化，来提高质粒产量和质粒质量。
同时由于发酵过程补料量过多，使得发酵液中含有较多的营养物质，对后续菌体收集大规模生产带来一定的困难。因此，如何在提高菌体产量的情况下，降低对下游菌体收集的影响，是该生产工艺亟待解决的问题。
其中以pMDLg/pRRE第三代慢病毒包装辅助质粒的宿主菌发酵工艺的改进具有典型代表性。pMDLg/pRRE质粒载有病毒gag和pol基因，与pRSV-Rev(JY03037)、pMD2.G(JY03027)构成第三代慢病毒包装系统，用于包装第三代慢病毒载体质粒。将这四个质粒共同转染293T等细胞以包装重组慢病毒，用此慢病毒感染目的细胞，即可实现基因敲除、敲降和过表达。大肠杆菌发酵培养产质粒，其生长速率主要受培养温度、pH、补料速度、培养基组成等影响。慢病毒包装辅助质粒含有较多的相同重复序列，现有发酵工艺未针对慢病毒包装辅助质粒pMDLg/pRRE进行多参数的工艺开发，导致质粒表达量不高，细菌生长不稳定，产量低。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种对发酵培养基和补料工艺进行协同优化的适用于规模化生产慢病毒包装辅助质粒的大肠杆菌发酵方法；本发明还有一个目的是提供适用于前述发酵方法的培养基体系；本发明还有一个目的是提供利用所述培养基体系在大肠杆菌规模化生产慢病毒包装辅助质粒上的应用。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的提供的一种慢病毒包装辅助质粒的大肠杆菌发酵方法，使用基础培养基进行第一阶段培养，所述基础培养基的碳源具有能减缓大肠杆菌生长的浓度；在第一时刻加入补料培养基进行第二阶段培养，所述补料培养基中的碳源具有不低于500g/L的浓度；然后在第二时刻升温诱导培养。
其中，所述第一时刻的OD600为6-8且培养时间为11-13小时，此时溶解氧曲线开始趋于平缓时。所述第二时刻的OD600为40-50。由于基础培养基的碳源具有能减缓大肠杆菌生长的浓度，此时发酵液中的质粒含量大约为30-45ng/μL，较传统发酵工艺而言质粒生产量更少。更具体地说，所述具有能减缓大肠杆菌生长的浓度是指低于大肠杆菌代谢正常所需碳源的浓度。本发明通过调节培养基的方式在第一阶段降低细菌生长速度，并通过第二阶段的高碳源补料培养，使得整个发酵过程营养物质供给不会减少，并协同增效促进酶的活性，用于后期质粒合成阶段的前体物质不受影响，不会阻碍菌体的新陈代谢。虽然也可以通过温度变化调节菌体代谢，但会导致菌体代谢过程中各种生化反应速度减慢，使得用于后期质粒合成阶段的前体物质也会减少，不利于发酵后期的质粒诱导。如通过pH进行调节，会影响到酶活，阻碍菌体新陈代谢，使代谢产物的质量和比例发生改变，不利于质粒发酵培养。
本发明所述的大肠杆菌包括但不限于载有病毒gag和pol基因质粒的宿主菌DH5α，抗性为卡那霉素。
本发明所述的质粒是第三代慢病毒包装辅助质粒，包括但不限于pMDLg/pRRE、pRSV-Rev和pMD2.G。
本发明所述的碳源指大肠杆菌生产质粒所使用培养基的碳源，包括快速碳源或缓释碳源的任意一种或两者的结合。所述缓释碳源是指碳源作用缓慢，但持续时间长，包括但不限于淀粉、乳糖、谷物粉、甘油等任意一种或多种的组合，用于菌体进入产物合成阶段。所述快速碳源包括但不限于葡萄糖、甲醇、小分子有机酸(如：乳酸)的任意一种或多种的组合，用于在菌体生长时期，利用速效碳源促进菌体的迅速生长繁殖。
作为本发明的优选方案，所述基础培养基具有低浓度的快速碳源，可显著降低碳源的阻遏作用，缓释碳源发挥其被缓慢分解利用的优势，有利于代谢产物的合成，也具有较低的浓度。所述基础培养基的碳源浓度优选不超过20g/L。
作为本发明的进一步优化，所述基础培养基的碳源至少包括5-15g/L的甘油，甘油不会引起较高的醋酸盐产物，而且可以较高浓度使用而无抑制性。甘油还支持降低最大特异性生长速率，维持菌体代谢的稳定性及外源基因的表达。
作为本发明的进一步优化，所述基础培养基的碳源至少包括1-5g/L的柠檬酸。其中，所述柠檬酸进一步取代基础培养基中的酸性调节剂，因此基础培养基不需要额外添加NH4 +等酸性调节剂。
总体来看，整个发酵体系的碳源以甘油为主，避免乙酸的产生，且替代传统培养基中的硫酸铵，可更好地控制pH。
在以上方案的基础上，本领域技术人员基于现有技术可获得大肠杆菌质粒生产所使用的培养基组分，除了碳源以外还包括氮源、磷酸盐、消泡剂、维生素、微量元素等组分，在不脱离本发明原理的前提下可进行适应性变动，都在本发明的保护范围内。
其中，所述的氮源指大肠杆菌生产质粒所使用培养基的氮源，包括有机氮源或无机氮源的任意一种或两者的组合。有机氮源是天然蛋白质及其水解产物，以及一些含碳含氮化合物，包括但不限于酵母粉、黄豆饼粉、玉米蛋白粉、玉米浆干粉的任意一种或多种的组合，有机氮源是主要的氮源供体，它能被微生物缓慢地利用。无机氮源是不含碳的含氮物质，包括但不限于硫酸铵、硝酸铵、氨水等的任意一种或多种的组合，无机氮源分子结构简单，可以被微生物快速利用。
所述磷酸盐包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和/或其钠盐的任意一种或多种的组合。磷酸盐广泛存在于生物分子中，如DNA、RNA、ATP等，参与生物体内糖、脂肪和蛋白质的代谢过程，并且在核酸的合成中发挥着重要作用。磷酸盐可以在细胞内外维持酸碱平衡，保证细胞功能的正常发挥。磷酸盐作为启动子，可以促进一些蛋白质的表达。在培养基中加入磷酸盐可以诱导细胞合成一些需要的蛋白质。
所述消泡剂包括但不限于硅类消泡剂(有机硅)、聚醚类消泡剂、天然油脂类消泡剂、高级醇类消泡剂的任意一种或多种的组合。按培养基体积的0.01-0.1％比例添加即可达到期望的消泡效果。
所述维生素包括但不限于维生素B1、维生素B12等任意一种或多种的组合，按培养基体积的1％-3％比例添加。
所述微量元素包括但不限于一水柠檬酸三钾、二水柠檬酸三钠、MgSO4·7H2O、85％H3PO4、FeCl3·6H2O、ZnCl2、CoCl2·6H2O、NaMuO4·H2O、MnCl·4H2O、CaCl2·2H2O、CuSO4·5H2O的任意一种或多种的组合，按培养基体积的1％-3％比例添加。
本发明利用高浓度碳源进行补料，对补料速度的控制提出了新的挑战。过慢补料使菌体维持自身所需能量相对增加，菌体生长减慢；补料过快则使得补入的碳源极易产生代谢物在发酵液中积累产生毒性，并且高浓度的甘油还会抑制菌体生长。为此，本发明优选使用缓释碳源作为补料培养基的碳源，所述缓释碳源的选择已在前文列举。更优选地，选用不低于500g/L的浓度的甘油作为补料碳源。作为本发明的进一步优化，选用550-700g/L的甘油作为补料培养基的碳源。
本发明利用甘油酶法在生产过程中进行检测，利用甘油激酶催化甘油转化为L-甘油-3-磷酸，同时消耗一分子ATP并转化为ADP形式，随后在ADP依赖型已糖激酶(ADP-HK)的催化作用下，等摩尔数的葡萄糖被转化为D-葡萄糖-6-磷酸，生成的D-葡萄糖-6-磷酸在D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6P-DH)的催化作用下转化为D-吡喃葡萄糖酸-σ-内酯-6-磷酸，同时伴随着等摩尔数的NAD+转变成NADH。利用甘油分析仪通过分光光度法测定NADH在340nm波长下的吸光度增加值，即可定量计算出样品中的甘油的浓度。该反应中甘油激酶只对甘油起作用，专一性好，在同一反应体系中迅速实现多种物质之间的酶催化的生物转化，效率高，物质的量关系准确，所以最终检测获得的吸光度值可以等量地换算为甘油的含量。
进一步地，所述第二阶段根据上述方法使用甘油分析仪的检测值来调整发酵过程中基于高浓度甘油的补料速度，以维持发酵液中甘油含量在3-7g/L，补料公式如下：
F(t)＝0.08×e0.12(EFT-T)，
其中，F(t)为补料速度，mL/min；
0.08×e0.12为补料系数；
EFT为发酵培养的实时时间；
T为第一时刻。
作为本发明的优选方案，使用600-650g/L的高浓度甘油作为补料培养基碳源，基于上述公式进行补料，更有效地减少补料对高密度发酵培养的稀释作用，且有利于在第二阶段通过甘油酶法进行检测。
进一步地，本发明发酵过程的温度、pH、DO、通气量均为大肠杆菌能正常生产质粒的可实施范围，本领域技术人员在不脱离本发明原理的基础上可以进行任意变化，均在本发明的保护范围内。作为一种优选实施方式，所述第一阶段和第二阶段的培养温度为25-35℃，pH 6.0-8.0，DO 15-45％，通气量1.0-4.0L/min；所述诱导培养温度为42±3℃。
进一步地，当OD600≥60，发酵液中甘油含量≤1g/L时，终止发酵。
对于上述发酵方法，本发明进一步提供了优选的规模化质粒培养基体系，包括基础培养基和补料培养基，所述基础培养基包括如下组分：
所述补料培养基包括如下组分：
作为本发明的进一步优化，所述基础培养基包括如下组分：
所述补料培养基包括如下组分且不含任何快碳源：
其中，作为本发明的最优方案，所述基础培养基为：
所述补料培养基为：
利用上述发酵方法和培养基体系生产质粒，可达1000mg/mL以上的产量，而现有技术大多实现500-700mg/mL的产量。该发酵工艺同时降低了发酵液残留营养物质，在发酵结束培养后，取样检测发酵液中甘油含量不超过1g/L，有利于下游菌体收集的生产。在提高了生产的产能的同时，大幅度降低了生产的成本。
本发明以甘油替代传统葡萄糖作为碳源，降低发酵过程中的细胞产量，同时甘油不会引起较高的醋酸盐产物，且以较高浓度使用而无抑制性。甘油还支持降低最大特异性生长速率，因此，质粒超螺旋比例提高至95％以上，而现有技术的超螺旋比往往不超过85％。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
本实施例提供了一种规模化质粒生产培养基体系，包括如下组分：
表1一种规模化质粒生产培养基体系
其中，维生素和微量元素包括：维生素B1、FeCl3、ZnCl2、CoCl2、NaMuO4、MnCl2、CaCl2、CuSO4混合物。
实施例2
本实施例提供了一种优选的规模化质粒生产培养基体系，具体组分如表2所示。
表2培养基体系1
其中，维生素和微量元素包括：维生素B1、FeCl3、ZnCl2、CoCl2、NaMuO4、MnCl2、CaCl2、CuSO4混合物。
实施例3
本实施例提供了一种优选的规模化质粒生产培养基体系，具体组分如表3所示。
表3培养基体系2
其中，维生素和微量元素包括：维生素B1、FeCl3、ZnCl2、CoCl2、NaMuO4、MnCl2、CaCl2、CuSO4混合物。
实施例4
本实施例提供了一种优选的规模化质粒生产培养基体系，具体组分如表4所示。
表4培养基体系3
其中，维生素和微量元素包括：维生素B1、FeCl3、ZnCl2、CoCl2、NaMuO4、MnCl2、CaCl2、CuSO4混合物。
实施例5
本实施例提供了三组培养基体系用于后面的试验对比。这三组配方与本发明提供的培养基体系相比，基础培养基含有较高比例的碳源和氮源，利用硫酸铵调节pH，而补料培养基中的碳源均不超过500g/L，同时通过调节葡萄糖、甘油的组分进一步了解缓释碳源、快速碳源对发酵工艺带来的影响。
表5其他培养基体系
其中，维生素和微量元素包括：维生素B1、FeCl3、ZnCl2、CoCl2、NaMuO4、MnCl2、CaCl2、CuSO4混合物。
实施例6
本实施例提供了一种重组质粒的大肠杆菌发酵方法，基于实施例2提供的培养基体系进行发酵生产。具体包括如下步骤：
1.准备阶段
1.1培养基制备，基础培养基配方：酵母粉5g/L、甘油17g/L、柠檬酸3g/L、磷酸二氢5g/L、磷酸氢二钠5g/L、氯化钠2g/L、七水硫酸镁1.0g/L、消泡剂204 0.3ml/L；补料培养基配方：酵母粉100g/L、甘油630g/L、七水硫酸镁25g/L、消泡剂204 0.1-0.5ml/L。配制后的培养基进行湿热蒸汽灭菌：温度121±3，℃灭菌时间35±2min，待用。
1.2发酵罐准备：使用艾本德公司的Bioflo320一次性生物反应器，在生物安全柜中，将已灭菌的2000mL±100mL基础培养基转移至无菌发酵罐中，然后用无菌移液枪头将除菌过滤后的维生素B1、FeCl3、ZnCl2、CoCl2、NaMuO4、MnCl2、CaCl2、CuSO4混合物25g/L加入发酵罐内。开始DO 100％校准，确认参数设置符合要求后，接入80mL±5mL种子液，开始发酵培养。发酵培养条件：培养温度30±3℃；转速220～1200rpm；DO 30％±15％；通气量1.0-4.0L/min；pH 7.0±1.0。
2.第一阶段培养
2.1发酵培养过程中取样检测OD600，当培养时间到第11-13小时，OD600为6-8，溶解氧曲线开始趋于平缓时，开始补料。
3.第二阶段培养
3.1甘油检测方法：根据甘油激酶法使用甘油分析仪的检测值进行甘油含量检测。
3.2在补料过程进行每小时取样检测甘油含量，来调整发酵过程的补料速度，控制发酵液中甘油含量在3-7g/L，结合甘油浓度检测值及补料速度值，建立补料速度的计算公式：F(t)＝0.08×e0.12(EFT-T)
其中，F(t)为补料速度，mL/min；
0.08×e0.12为补料系数；
EFT为发酵培养的实时时间；
T为OD600达到6-8时的发酵培养时间。
4.诱导培养
4.1每小时取样对发酵液的OD600进行监控，待OD600为40-50，进行升温诱导操作，调整发酵培养温度为42，℃当工艺温度在42±3，℃开始计算诱导表达时间，诱导时间为8h。
4.2发酵结束的时间点判定：OD600≥60，发酵液中甘油含量≤1g/L，即可发酵结束。
5.检测
5.1对发酵液的质粒纯度及超螺旋纯度进行检测，纯度采用紫外分光光度计法，超螺旋纯度采用限制性酶切后的琼脂糖凝胶电泳法。
实施例7发酵液中的质粒质量
基于实施例6对发酵液质粒纯度的检测方法，获得了整个发酵周期的OD600和纯度数据，如表6所示：
表6发酵周期内的检测结果及质粒纯度
发酵终止后检测发酵液中的质粒超螺旋比例为96％。
按照实施例6相同的试验方法和检测方法，利用对比组1-3提供的培养基体系进行培养，进一步得到表7-9所示的数据。
表7对比组1发酵周期内的检测结果及质粒纯度
发酵终止后检测发酵液中的质粒超螺旋比例为83％。
表8对比组2发酵周期内的的检测结果及质粒纯度
发酵终止后检测发酵液中的质粒超螺旋比例为89％。
表9对比组3发酵周期内的检测结果及质粒纯度
发酵终止后检测发酵液中的质粒超螺旋比例为87％。
结合这些数据可以看出，本发明提供的发酵工艺可显著提高质粒产量达1000mg/mL以上，如采用传统发酵策略(如对比组1)，质粒产量一般不超过700mg/mL。另一方面，从对比组2的数据可以看出，在第一阶段降低碳源、氮源比例，就需要在第二阶段提供不少于500g/L浓度的缓释碳源，否则后期出现营养不足，导致质粒产量不高。对比组3在基础培养基中仅加入了10g/L的葡萄糖，但在培养周期8小时的时候OD600达到8，且此时的检测体系中含有醋酸盐产物进行了补料操作。
对比组1-3培养过程中检测到的乙酸浓度明显高于实施例6，特别是补料过程含有速效碳源葡萄糖的对比组，较高的乙酸含量一方面降低质粒纯度，另一方面也影响后续质粒超螺旋比例。同时实验发现，基础培养基采用甘油作为缓释碳源时，甘油浓度不宜太高，否则会导致菌体前期生长速度更慢，进而导致后续诱导时间延后。
整个实验对比结果来看，基础培养基以甘油作为碳源，菌体生长偏慢，乙酸积累较少，补料培养基中若存在葡萄糖，甘油积累明显偏高，进一步证实葡萄糖作为碳源培养存在的弊端。再结合质粒纯度和超螺旋比例数据来看，本发明提供的技术方案优势明显，即基础培养基采用较低浓度的甘油作为碳源，补料培养基同样采用甘油作为碳源，但需要提高补料培养基中甘油浓度值500g/L以上，以避免培养体积增加而引起的波动。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (14)
1.一种慢病毒包装辅助质粒的大肠杆菌发酵方法，其特征在于：使用基础培养基进行第一阶段培养，所述基础培养基的碳源具有能减缓大肠杆菌生长的浓度；在第一时刻加入补料培养基进行第二阶段培养，所述补料培养基中的碳源具有不低于500g/L的浓度；然后在第二时刻升温诱导培养。
2.根据权利要求1所述的一种慢病毒包装辅助质粒的大肠杆菌发酵方法，其特征在于：所述第一时刻的OD600为6-8且培养时间为11-13小时；所述第二时刻的OD600为40-50。
3.根据权利要求2所述的一种慢病毒包装辅助质粒的大肠杆菌发酵方法，其特征在于：所述基础培养基的碳源浓度不超过20g/L。
4.根据权利要求3所述的一种慢病毒包装辅助质粒的大肠杆菌发酵方法，其特征在于：所述基础培养基的碳源至少包括5-15g/L的甘油。
5.根据权利要求3所述的一种慢病毒包装辅助质粒的大肠杆菌发酵方法，其特征在于：所述基础培养基的碳源包含1-5g/L的柠檬酸，且取代基础培养基中的酸性调节剂。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的一种慢病毒包装辅助质粒的大肠杆菌发酵方法，其特征在于：所述补料培养基的碳源为缓释碳源。
7.根据权利要求6所述的一种慢病毒包装辅助质粒的大肠杆菌发酵方法，其特征在于：所述缓释碳源为550-700g/L的甘油。
8.根据权利要求7所述的一种慢病毒包装辅助质粒的大肠杆菌发酵方法，其特征在于，所述补料培养基按照如下公式进行补料，以维持发酵液中的甘油含量为3-7g/L：
F(t)＝0.08×e0.12(EFT-T)，
其中，F(t)为补料速度，mL/min；
0.08×e0.12为补料系数；
EFT为发酵培养的实时时间；
T为第一时刻。
9.根据权利要求8所述的一种慢病毒包装辅助质粒的大肠杆菌发酵方法，其特征在于：所述补料培养基中的甘油浓度为600-650g/L。
10.根据权利要求1-5,7-9任意一项所述的一种慢病毒包装辅助质粒的大肠杆菌发酵方法，其特征在于：所述第一阶段和第二阶段的培养温度为25-35℃，pH 6.0-8.0，DO 15-45％，通气量1.0-4.0L/min；所述诱导培养温度为42±3℃。
11.一种规模化质粒生产培养基体系，包括基础培养基和补料培养基，其特征在于，所述基础培养基包括如下组分：
所述补料培养基包括如下组分：
12.根据权利要求11所述的一种规模化质粒生产培养基体系，其特征在于，所述基础培养基包括如下组分：
所述补料培养基包括如下组分且不含任何快碳源：
13.根据权利要求12所述的一种规模化质粒生产培养基体系，其特征在于，所述基础培养基为：
所述补料培养基为：
14.如权利要求11-13任意一项所述的培养基体系在大肠杆菌规模化生产慢病毒包装辅助质粒上的应用。
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| CN202311033131.5A CN117025496A (zh) | 2023-08-16 | 2023-08-16 | 一种重组质粒的大肠杆菌发酵方法、培养基体系及其应用 |
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Citations (7)
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|---|---|---|---|---|
| CN101076597A (zh) * | 2004-08-19 | 2007-11-21 | 自然科技公司 | 用于质粒dna发酵的工艺 |
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2023
- 2023-08-16 CN CN202311033131.5A patent/CN117025496A/zh active Pending
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