CN117625706A - 一种提高l-脯氨酸发酵产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高L‑脯氨酸发酵产量的方法，属于发酵工程技术领域。本发明采用分批补料的方式发酵L‑脯氨酸，在发酵过程中，补料含有葡萄糖和柠檬酸铵的补料培养基，使L‑脯氨酸的产量达到90g/L以上，生产强度达到1.88g/(L·h)。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高L-脯氨酸发酵产量的方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术
脯氨酸(L-Proline,L-Pro)，是一种环状的α-亚氨基酸，属于谷氨酸家族。其化学式为C5H9NO2，分子量为115.13；中性，等电点为6.30，它在生物体中具有多种生理功能。
L-脯氨酸的生产主要有以下几种方法：化学合成法、蛋白质水解法和微生物发酵法。但是化学从头合成以及水解天然蛋白法都难以实现大规模生产。微生物发酵的原理是通过培养能够产生脯氨酸的微生物，发酵生产出脯氨酸，再通过分离纯化工艺，得到一定质量规格的脯氨酸产品。随着微生物和发酵技术研究的不断发展，使得氨基酸微生物发酵的成本越来越低，为实现工业化大生产提供了有力的支持。
目前，市场上的脯氨酸产品大部分是以微生物发酵方式，工业规模化大生产获得。L-脯氨酸合成是以埃姆登-迈耶霍夫途径(Embden-Meyerhof Pathway,EMP)或者戊糖磷酸途径(Pentose Phosphate Pathway,PPP)与三羧酸循环的中间物为碳链骨架，由谷氨酸或者鸟氨酸合成，并分解为有机酸和二氧化碳。以三羧酸循环中的α-酮戊二酸为碳骨架，在氮源相对较高的情况下合成谷氨酸，再以谷氨酸为前体合成脯氨酸。目前，常见的碳源补料物质为葡萄糖，常见的氮源补料物质有硫酸铵、氯化铵、氨水和尿素。氨水有调节pH的作用，但是单纯补加氨水达不到菌体生长与产酸的碳氮比需求，因此需要其他氮源补料。硫酸铵与氯化铵都呈弱酸性，补加会进一步降低脯氨酸发酵液的pH从而影响菌体生长，同时，硫酸根离子与氯离子的积累对菌体生长产酸也有负面影响，而尿素需要微生物分解后成为NH3，进一步作为氮源被微生物所利用。因此，补料物质对于菌体生长和L-脯氨酸合成有很大影响。
发明内容
[技术目的]
本发明的目的在于通过补料优化提高谷氨酸棒杆菌生产L-脯氨酸的方法。
[技术方案]
本发明的技术方案：为解决上述问题，本发明提供了一种高效生产L-脯氨酸的方法，其采用的补料可以为发酵提供充足的碳源以及氮源。对谷氨酸棒杆菌进行发酵优化，通过对菌体生长情况以及发酵液中残糖浓度和L-脯氨酸浓度检测来确定最优补料方案以及溶氧条件。
本发明提供了一种提高L-脯氨酸产量的发酵方法，所述方法是将谷氨酸棒杆菌在29-33℃发酵，当葡萄糖浓度低于30g/L时，流加补料培养基，并控制葡萄糖在发酵体系中的终浓度为30g/L左右的范围内；所述补料培养基中含有葡萄糖和柠檬酸铵。用柠檬酸铵代替部分葡萄糖的机理是柠檬酸可以代替葡萄糖直接进入三羧酸循环从而快速转化成为α-酮戊二酸，这样提高了细胞内合成脯氨酸前体物质的浓度，从而有利于脯氨酸的合成和积累。以柠檬酸铵作为补料氮源，既可以调节发酵液pH，柠檬酸根又可以调节菌体的三羧酸循环，为L-脯氨酸的合成提供充足的氮源与碳骨架。
在一种实施方式中，所述补料培养基包括葡萄糖补料液和柠檬酸铵补料液。
在一种实施方式中，所述葡萄糖补料液中含有450-700g/L葡萄糖，所述柠檬酸铵补料液中含有450-550g/L柠檬酸铵。
在一种实施方式中，通过调控流加速度，控制补料培养基中葡萄糖和柠檬酸铵的质量浓度比为(5～15)：1。
在一种实施方式中，所述补料培养基的流加方式为连续流加。
在一种实施方式中，用于发酵的培养基含有葡萄糖、硫酸铵、玉米浆、磷酸二氢钾和硫酸镁、FeSO4·7H 2O、MnSO4·4H2O、生物素和硫胺素。
在一种实施方式中，所述发酵在发酵罐中进行，控制溶氧在50％～65％范围内。
在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌为ATCC 13032(NC_003450.2)，购自中国菌种资源库(National Microbial Resource Center，NMRC)。
在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌以种子液的形式接种至发酵体系中，接种后的OD达0.5以上。
在一种实施方式中，至少发酵48h。
本发明还提供了所述方法在提高L-脯氨酸生产强度中的应用。
有益效果：
本发明采用分批补料的方式发酵L-脯氨酸，在发酵过程中，补料含有葡萄糖和柠檬酸铵的补料培养基，使L-脯氨酸的产量达到90g/L以上，生产强度达到1.88g/(L·h)。
具体实施方式
下面以谷氨酸棒杆菌为例，结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
L-脯氨酸的平均产量以及生产强度的检测方法如下：
1、试剂配置
①6mol/L磷酸溶液：量取81mL磷酸，纯水稀释至200mL，摇匀。
②酸性茚三酮溶液：称取0.5g茚三酮，加入20mL 6mol/L的磷酸溶液，加入30mL冰乙酸，搅拌至完全溶解，置于棕色瓶中。
③L-脯氨酸母液的配置：称取少量L-脯氨酸标准品，置于105℃烘箱中30min，精确称取L-脯氨酸标准品1.0g，加水溶解并定容至1L。
④标准液的配置：将L-脯氨酸母液分别稀释为1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL和40μg/mL浓度。
2、实验操作
①吸取稀释好的标准液1mL于试管，加1mL冰乙酸、1mL酸性茚三酮溶液，摇匀制成标准管；
②吸取稀释好的样品液1mL，加1mL冰乙酸、1mL酸性茚三酮溶液，摇匀制成样品管；
③吸取1mL纯水，加入1mL冰乙酸，1mL酸性茚三酮溶液，摇匀制成空白管；
④将空白管、样品管、标品管沸水浴1h后，加入1mL冰乙酸、冷却后再加入1mL冰乙酸，摇匀后在515nm波长处测定样品液、标准液的吸光度。
3、标曲绘制并计算样品浓度。
生产强度的计算方法：生产强度(g/L/h)＝L-脯氨酸产量(g/L)/发酵时间(h)。
下述实施例中涉及的培养基如下：
种子培养基：葡萄糖30g/L，硫酸铵5g/L，玉米浆粉10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L
发酵培养基：葡萄糖80g/L，硫酸铵10g/L，玉米浆30g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，FeSO4·7H 2O 0.01g/L，MnSO4·4H2O 0.01g/L，生物素2.0×10-4g/L，硫胺素1.0×10-4g/L。
葡萄糖补料液：500g/L葡萄糖水溶液。
柠檬酸铵补料液：500g/L柠檬酸铵水溶液。
下述实施例中使用的谷氨酸棒杆菌为ATCC 13032(NC_003450.2)。
实施例1：分批补料流加葡萄糖与柠檬酸铵(5:1)
将谷氨酸棒杆菌接种于种子培养基，培养9-12h后，以10％接种量转接到含有5-L发酵培养基的10-L发酵罐中，使接种后的OD为0.5。初始发酵条件为：初糖浓度80g/L，溶氧控制50％，温度31±2℃。
当发酵过程中，采用离线测定-人工控制的方法流加葡萄糖补料液，当发酵罐中葡萄糖浓度低于30g/L时，调控葡萄糖补料液和柠檬酸铵补料液的流加速度，使流加葡萄糖和柠檬酸铵的质量浓度比为5:1，使葡萄糖浓度维持在30g/L，在pH降低时自动补加50％氨水将pH维持在7.0。
发酵过程中检测L-脯氨酸的产量，当检测到脯氨酸浓度下降时，结束发酵，氨水总用量为0.25L。发酵结束后，检测L-脯氨酸的产量，并计算生产强度，检测结果为：L-脯氨酸的产量为81.6g/L，生产强度为1.45g/(L·h)。
实施例2：分批补料流加葡萄糖与柠檬酸铵(8:1)
具体实施方式参考实施例1，区别在于，补料过程中改变葡萄糖补料液和柠檬酸铵补料液的流加速度，使葡萄糖和柠檬酸铵的补料浓度比例改为8：1，发酵52h后结束发酵，氨水总用量为0.27L。检测L-脯氨酸的产量以及生产强度。检测结果为：L-脯氨酸的产量为85.4g/L，生产强度为1.64g/(L·h)。
实施例3：分批补料流加葡萄糖与柠檬酸铵(10:1)
具体实施方式参考实施例1，区别在于，补料过程中改变葡萄糖补料液和柠檬酸铵补料液的流加速度，使葡萄糖和柠檬酸铵的补料浓度比例改为10：1，发酵48h后结束发酵，氨水总用量为0.3L。检测L-脯氨酸的平均产量以及生产强度。检测结果为：L-脯氨酸的产量为90.3g/L，生产强度为1.88g/(L·h)。
实施例4：分批补料流加葡萄糖与柠檬酸铵(15:1)
具体实施方式参考实施例1，区别在于，补料过程中改变葡萄糖补料液和柠檬酸铵补料液的流加速度，使葡萄糖和柠檬酸铵的补料浓度比例改为15：1，发酵50h后结束发酵，氨水总用量为0.0.27L。检测L-脯氨酸的平均产量以及生产强度。检测结果为：L-脯氨酸的产量为86.2g/L，生产强度为1.72g/(L·h)。氨水总用量为0.27L。
表1
对比例1：分批补料流加葡萄糖
(1)将谷氨酸棒杆菌接种于种子培养基，培养9-12h后，以10％接种量转接到含有5-L发酵培养基的10-L发酵罐中，使接种后的OD为0.5。初始发酵条件为：初糖浓度80g/L，溶氧控制50％，温度31℃，通气量1vvm。
(2)当发酵过程中，葡萄糖浓度低于30g/L时，流加一定量的500g/L的葡萄糖补料液，采用离线测定-人工控制的方法流加葡萄糖补料液，使葡萄糖浓度维持在30g/L，以氨水为补料氮源在pH降低时自动补加50％氨水将pH维持在7.0。
(3)发酵过程中检测L-脯氨酸的产量，当检测到脯氨酸浓度下降时，结束发酵。发酵56h，检测L-脯氨酸产量以及生产强度，氨水总用量为1L。L-脯氨酸的产量为70.1g/L，生产强度为1.25g/(L·h)。
对比例2：分批补料流加葡萄糖与尿素
(1)将谷氨酸棒杆菌接种于种子培养基，培养9-12h后，以10％接种量转接到含有5-L发酵培养基的10-L发酵罐中，使接种后的OD为0.5。初始发酵条件为：初糖浓度80g/L，溶氧控制50％，温度31℃，通气量1vvm。
(2)当发酵过程中，葡萄糖浓度低于30g/L时，调控葡萄糖补料液和尿素补料液(500g/L尿素水溶液)的流加速度，使流加葡萄糖和尿素的质量浓度比为10:1，使葡萄糖浓度维持在30g/L，在pH降低时自动补加50％氨水将pH维持在7.0。
(3)发酵过程中检测L-脯氨酸的产量，当检测到脯氨酸浓度下降时，结束发酵。发酵60h，氨水总用量为0.2L，检测L-脯氨酸产量以及生产强度，检测结果为：L-脯氨酸的产量为74.5g/L，生产强度为1.24g/(L·h)。
对比例3：分批补料流加葡萄糖与(NH4)2SO4
(1)将谷氨酸棒杆菌接种于种子培养基，培养9-12h后，以10％接种量转接到含有5-L发酵培养基的10-L发酵罐中，使接种后的OD为0.5。初始发酵条件为：初糖浓度80g/L，溶氧控制50％，温度31℃，通气量1vvm。
(2)当发酵过程中，葡萄糖浓度低于30g/L时，以10:1质量浓度比例流加葡萄糖和(NH4)2SO4补料液，使葡萄糖浓度维持在30g/L，在pH降低时自动补加50％氨水将pH维持在7.0。
(3)发酵过程中检测L-脯氨酸的产量，当检测到脯氨酸浓度下降时，结束发酵。发酵70h，检测L-脯氨酸产量以及生产强度。氨水总用量为1.3L。检测结果为：L-脯氨酸的产量为68.1g/L，生产强度为0.97g/(L·h)。
对比例4：分批补料流加葡萄糖与NH4Cl
(1)将谷氨酸棒杆菌接种于种子培养基，培养9-12h后，以10％接种量转接到含有5-L发酵培养基的10-L发酵罐中，使接种后的OD为0.5。初始发酵条件为：初糖浓度80g/L，溶氧控制50％，温度31℃，通气量1vvm。
(2)当发酵过程中，葡萄糖浓度低于30g/L时，以10:1质量浓度比例流加葡萄糖和NH4Cl补料液，使葡萄糖浓度维持在30g/L。
(3)发酵过程中检测L-脯氨酸的产量，当检测到脯氨酸浓度下降时，结束发酵。发酵67h，氨水总用量为1.5L，检测L-脯氨酸产量以及生产强度。检测结果为：L-脯氨酸的产量为69.2g/L，生产强度为1.03g/(L·h)。
对比例5：调控残糖浓度为20g/L
具体实施方式参考实施例3，区别在于，当发酵过程中，采用离线测定-人工控制的方法流加葡萄糖补料液，当发酵罐中葡萄糖浓度低于20g/L时，调控葡萄糖补料液和柠檬酸铵补料液的流加速度，使流加葡萄糖和柠檬酸铵的质量浓度比为10:1，使葡萄糖浓度维持在20g/L。在pH降低时自动补加50％氨水将pH维持在7.0。
发酵过程中检测L-脯氨酸的产量，当检测到脯氨酸浓度下降时，结束发酵。发酵56h，氨水总用量为0.2L，检测L-脯氨酸产量以及生产强度。检测结果为：L-脯氨酸的产量为73.2g/L，生产强度为1.31g/(L·h)。
对比例6：调控残糖浓度为10g/L
具体实施方式参考实施例3，区别在于，当发酵过程中，采用离线测定-人工控制的方法流加葡萄糖补料液，当发酵罐中葡萄糖浓度低于10g/L时，调控葡萄糖补料液和柠檬酸铵补料液的流加速度，使流加葡萄糖和柠檬酸铵的质量浓度比为10:1，使葡萄糖浓度维持在10g/L。在pH降低时自动补加50％氨水将pH维持在7.0。
发酵过程中检测L-脯氨酸的产量，当检测到脯氨酸浓度下降时，结束发酵。发酵56h，氨水总用量为0.2L，检测L-脯氨酸产量以及生产强度。检测结果为：L-脯氨酸的产量为69.4g/L，生产强度为1.24g/(L·h)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种提高L-脯氨酸产量的发酵方法，其特征在于，所述方法是将谷氨酸棒杆菌在29-33℃发酵，当葡萄糖浓度低于30g/L时，流加补料培养基，并控制葡萄糖在发酵体系中的终浓度为30g/L；所述补料培养基包括葡萄糖补料液和柠檬酸铵补料液。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述葡萄糖补料液中含有450-700g/L葡萄糖，所述柠檬酸铵补料液中含有450-550g/L柠檬酸铵。
3.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，通过调控流加速度，控制补料培养基中葡萄糖和柠檬酸铵的质量浓度比为(5～15)：1。
4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述补料培养基的流加方式为连续流加。
5.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，用于发酵的培养基含有葡萄糖、硫酸铵、玉米浆、磷酸二氢钾、硫酸镁、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、生物素和硫胺素。
6.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵在发酵罐中进行，控制溶氧在50％～65％范围内。
7.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(NC_003450.2)。
8.根据权利要求7所述的发酵方法，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌以种子液的形式接种至发酵体系中，接种后的OD达0.5以上。
9.根据权利要求8所述的发酵方法，其特征在于，至少发酵48h。
10.权利要求1～9任一所述方法在提高L-脯氨酸生产强度中的应用。
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