CN106834377A - 一种生产埃博霉素b的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明具体公开了一种生产埃博霉素B的发酵方法，属于生物发酵领域。该方法在种子罐培养过程中流加氨水调节pH，得到大量种子菌体；在发酵过程中流加氨水或丙酸来调控pH，使得埃博霉素B的产量提高，简化了调控流程，降低了生产成本，利于工业化生产，具有良好的应用前景。

Description

一种生产埃博霉素B的方法
技术领域
本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种生产埃博霉素B的方法。
背景技术
埃博霉素(epothilones)是1993年在黏细菌纤维堆囊菌Sorangium cellulosum的次级代谢产物中发现的，其结构为大环内酯类化合物。抗肿瘤作用机理与紫杉醇相似，具有抑制微管解聚的作用，相比之下，埃博霉素的水溶性更好，并且对多重耐药肿瘤细胞和耐紫杉醇的肿瘤细胞都表现出强大的抗癌活性，也没有紫杉醇临床应用中的粒细胞减少症、外周神经病变、脱发、过敏等严重副作用。因此，开发埃博霉素类化合物具有临床价值和社会意义。2007年，埃博霉素类B的衍生物伊沙匹隆在美国批准上市，激发了人们对埃博霉素类化合物研究的热潮，现已有六种埃博霉素类化合物进入了临床研究阶段。
目前，埃博霉素全合成步骤大都在20步以上，无法满足生产规模；而大规模发酵生产又存在诸多困难：埃博霉素的产生菌纤维堆囊菌的代时较长，生长速度非常缓慢，营养摄取率很低，氧的消耗比较少，发酵周期长，发酵时细胞浓度较低。因此，如何使纤维堆囊菌迅速生长，并提高埃博霉素的产量，减少主要杂质的含量，降低生产成本成为目前埃博霉素B研究的一个重要课题。
现有文献，有报道通过优化菌株提高埃博霉素B产量的方法，但对于纤维堆囊菌ATCC25532的发酵培养方法报道不多。经研究，中国专利CN103937851A、CN103045675A、CN103772407A和CN103788105A发酵效价均低于52mg/L。现有技术发酵方法仍然无法满足大生产的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种埃博霉素B的发酵生产工艺，克服了埃博霉素B现有生产技术的不足，加速了菌体生长，提高了埃博霉素B的产量，减少了主要杂质埃博霉素A的含量，利于后期纯化，降低了生产成本。
本发明提供的发酵生产工艺具体包括种子培养和发酵培养方法。所述的埃博霉素B生产菌为纤维堆囊菌ATCC25532。
埃博霉素B的培养方法具体包括以下步骤：
1)固体平板培养：菌种涂布于固体平板培养基上，30℃培养6-7天；
2)摇瓶扩培：平板接种于摇瓶中，30℃，200rpm培养4-5天；
3)种子罐培养：将摇瓶接种于种子罐中，30℃培养，转速为200rpm，通气量为0.5vvm，罐压为0.04kg/cm2，并流加酸碱调节剂使pH维持在7.2，当溶氧下降缓慢时，进行移种；
4)发酵罐培养：利用压差法将种子液接入到发酵罐中，接种量为10％的体积比，30℃，200rpm培养，空气流量为0.5vvm，维持在50％附近；发酵过程中加入酸碱调节剂维持pH值在7.2，在发酵48小时加入大孔树脂XAD-16N，发酵96小时开始测定效价。
优选地，所述步骤3)种子罐酸碱调节剂为氨水。
优选地，所述步骤4)发酵罐酸碱调节剂为氨水和丙酸。
优选地，所述步骤3)种子罐和步骤4)发酵罐酸碱调节剂的配置浓度为20％-30％，121℃灭菌20min使用。
优选地，所述步骤4)发酵罐采用流加方式进行pH自动控制，前期补入氨水，后期补入丙酸。
优选地，所述步骤1)固体平板培养的培养基成份为，葡萄糖0.1％、蛋白胨0.2％、硫酸镁0.1％、氯化钙0.2％、磷酸氢二钾0.2％、酵母提取物0.3％。调节pH至7.2。
优选地，所述步骤2)摇瓶扩培和步骤3)种子罐培养的培养基组份为葡萄糖0.1％、可溶性淀粉2％、硫酸镁0.1％、氯化钙0.2％、磷酸氢二钾0.2％、酵母提取物0.3％。调节pH至7.2。
优选地，所述步骤4)发酵罐培养的培养基组份为可溶性淀粉0.3％、硫酸镁0.2％、氯化钙0.3％、磷酸氢二钾0.2％、酵母提取物0.3％，花生粉0.5％。
进一步优选的，纤维堆囊菌的培养方法为：
1)固体平板培养：其固体培养基成份为，葡萄糖0.1％、蛋白胨0.2％、硫酸镁0.1％、氯化钙0.2％、磷酸氢二钾0.2％、酵母提取物0.3％。调节pH至7.2，于121℃灭菌30分钟，菌种涂布于固体平板培养基上，30℃倒置培养6-7天。
2)摇瓶扩培：平板接种于摇瓶中，摇瓶培养基的组份为葡萄糖0.1％、可溶性淀粉2％、硫酸镁0.1％、氯化钙0.2％、磷酸氢二钾0.2％、酵母提取物0.3％。调节pH至7.2，于121℃灭菌30分钟，30℃，200rpm培养4-5天。
3)种子培养：将摇瓶接种于种子罐中，培养基与摇瓶培养基相同，121℃蒸汽灭菌30分钟，灭菌后接种，培养温度为30℃，转速为200rpm，通气量为0.5vvm，罐压为0.04kg/cm2，并流加氨水使pH维持在7.2，当溶氧下降变缓时，进行移种。
4)发酵培养：发酵培养基组份为可溶性淀粉0.3％、硫酸镁0.2％、氯化钙0.3％、磷酸氢二钾0.2％、酵母提取物0.3％，花生粉0.5％。121℃蒸汽灭菌30分钟，灭菌后压差接种，培养温度为30℃，转速为200rpm，通气量为0.5vvm，罐压为0.04kg/cm2，流加氨水或丙酸使pH维持在7.2。为了提高埃博霉素的产量，在培养48小时后，加入1.2％大孔树脂XAD-16N，这样既让菌体在发酵前期得到了充分生长，又能够避免发酵后期的产物抑制。发酵96小时开始测定效价，直至效价不再明显增加时结束发酵。
采用本发明所述的发酵方法，整个发酵过程操作简单，发酵产物埃博霉素B的含量高，通用性强，易推广，工业化成本较低。
本发明的方法与现有技术相比有如下优点：
本发明的方法中在种子培养过程中通过流加氨水调节pH，加速了菌体生长，为发酵提供了高质量的种子。
本发明的方法中在发酵培养过程初期通过流加氨水，调节pH的同时，也为纤维堆囊菌补充了氮源，加速了菌体的生长，增加了发酵前期的菌体量，为提高产量奠定了物质基础。
本发明的方法中在发酵培养中后期通过流加丙酸替代传统工艺的硫酸和丙酸钠，简化了发酵生产过程中的补料控制，既调节了pH，也为埃博霉素B提供了前体，增加了产物中埃博霉素B与埃博霉素A的比率，提高产量的同时降低了主要杂质的含量，利于后续提取纯化，适合工业化生产。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明予以进一步详细说明，但本发明不限于以下实施例。
实施例1.固体平板培养
其固体培养基成份为，葡萄糖0.1％、蛋白胨0.2％、硫酸镁0.1％、氯化钙0.2％、磷酸氢二钾0.2％、酵母提取物0.3％。调节pH至7.2，于121℃灭菌30分钟，涂布于固体平板培养基上，30℃倒置培养6-7天。
实施例2.纤维堆囊菌的种子培养
①摇瓶扩培
将长势良好的平板接种于摇瓶中，摇瓶培养基的组份为葡萄糖0.1％、可溶性淀粉2％、硫酸镁0.1％、氯化钙0.2％、磷酸氢二钾0.2％、酵母提取物0.3％。调节pH至7.2，于121℃灭菌30分钟，30℃，200rpm振荡培养4天。
②种子培养
将长势良好的摇瓶接种于种子罐中，培养基与摇瓶培养基相同，121℃蒸汽灭菌30分钟，灭菌后接种，培养温度为30℃，转速为200rpm，通气量为0.3vvm，罐压为0.04kg/cm2，并流加1M氢氧化钠使pH维持在7.2，当溶氧下降缓慢时，进行移种。测定菌体量为8％。
实施例3.埃博霉素B的种子培养
将长势良好的摇瓶接种于种子罐中，培养基与摇瓶培养基相同，121℃蒸汽灭菌30分钟，灭菌后接种，培养温度为30℃，转速为200rpm，通气量为0.3vvm，罐压为0.04kg/cm2，并流加20％氨水使pH维持在7.2，当溶氧下降缓慢时，进行移种。测定菌体量为13％。
实施例4.埃博霉素B的发酵培养a
①发酵前准备：将35L发酵培养基加到50L发酵罐中，121℃蒸汽灭菌30分钟，降温至30℃待用。
②发酵：利用压差法将实施例3中的种子液接入到发酵罐中，接种量为10％的体积比，30℃，200rpm培养，调节空气流量为0.5vvm，并更改转速和空气流量使溶氧维持在50％附近。用1M氢氧化钠维持pH在7.2，在发酵48小时加入大孔树脂XAD-16N，80-100小时pH开始上升，改用1M硫酸调节pH。发酵96小时开始测定效价，直至效价不再明显增加时结束发酵。
所述的发酵培养基成份为可溶性淀粉0.3％、硫酸镁0.2％、氯化钙0.3％、磷酸氢二钾0.2％、酵母提取物0.3％，花生粉0.5％。
发酵结果：发酵结束后，用甲醇浸泡树脂提取埃博霉素B，测得效价为26.1mg/L，埃博霉素A效价为72.5mg/L。
实施例5.埃博霉素B的发酵培养b
③发酵前准备：将35L发酵培养基加到50L发酵罐中，121℃蒸汽灭菌30分钟，降温至30℃待用。
④发酵：利用压差法将实施例3中的种子液接入到发酵罐中，接种量为10％的体积比，30℃，200rpm培养，调节空气流量为0.5vvm，并更改转速和空气流量使溶氧维持在50％附近。用1M氢氧化钠维持pH在7.2，在发酵48小时加入大孔树脂XAD-16N，80-100小时pH开始上升，改用1M硫酸调节pH，并流加3.5％的丙酸钠，补速为10ml/h。发酵96小时开始测定效价，直至效价不再明显增加时结束发酵。
所述的发酵培养基成份为可溶性淀粉0.3％、硫酸镁0.2％、氯化钙0.3％、磷酸氢二钾0.2％、酵母提取物0.3％，花生粉0.5％。
发酵结果：发酵结束后，用甲醇浸泡树脂提取埃博霉素B，测得效价为55.2mg/L，埃博霉素A效价为43.4mg/L。
实施例6.埃博霉素B的发酵培养c
①发酵前准备：将35L发酵培养基加到50L发酵罐中，121℃蒸汽灭菌30分钟，降温至30℃待用。
②发酵：利用压差法将实施例3中的种子液接入到发酵罐中，接种量为10％的体积比，30℃，200rpm培养，调节空气流量为0.5vvm，并更改转速和空气流量使溶氧维持在50％附近。用20％氨水调节维持pH在7.2，在发酵48小时加入大孔树脂XAD-16N，80-100小时pH开始上升，改用20％丙酸调节pH，待pH再次下降时继续用20％氨水维持pH。发酵96小时开始测定效价，直至效价不再明显增加时结束发酵。
所述的发酵培养基成份为可溶性淀粉0.3％、硫酸镁0.2％、氯化钙0.3％、磷酸氢二钾0.2％、酵母提取物0.3％，花生粉0.5％。
发酵结果：发酵结束后，用甲醇浸泡树脂提取埃博霉素B，测得效价为86.3mg/L，埃博霉素A效价为35.6mg/L。

Claims (9)

1.一种埃博霉素B的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)固体平板培养：菌种涂布于固体平板培养基上，30℃培养6-7天；
2)摇瓶扩培：平板接种于摇瓶中，30℃，200rpm培养4-5天；
3)种子罐培养：将摇瓶接种于种子罐中，30℃培养，转速为200rpm，通气量为0.5vvm，罐压为0.04kg/cm2，并流加酸碱调节剂使pH维持在7.2，当溶氧下降缓慢时，进行移种；
4)发酵罐培养：利用压差法将种子液接入到发酵罐中，接种量为10％的体积比，30℃，200rpm培养，空气流量为0.5vvm，维持在50％附近；发酵过程中加入酸碱调节剂维持pH值在7.2，在发酵48小时加入大孔树脂XAD-16N，发酵96小时开始测定效价。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的埃博霉素B生产菌为纤维堆囊菌ATCC25532。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，种子罐酸碱调节剂为氨水。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵罐酸碱调节剂为氨水和丙酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，种子罐和发酵罐酸碱调节剂的配置浓度为20％-30％，121℃灭菌20min使用。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵罐采用流加方式进行pH自动控制，前期补入氨水，后期补入丙酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，固体平板培养的培养基成份为：葡萄糖0.1％、蛋白胨0.2％、硫酸镁0.1％、氯化钙0.2％、磷酸氢二钾0.2％、酵母提取物0.3％；调节pH值至7.2。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，摇瓶扩培和种子罐培养的培养基的组份为：葡萄糖0.1％、可溶性淀粉2％、硫酸镁0.1％、氯化钙0.2％、磷酸氢二钾0.2％、酵母提取物0.3％；调节pH值至7.2。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵罐培养的培养基组份为：可溶性淀粉0.3％、硫酸镁0.2％、氯化钙0.3％、磷酸氢二钾0.2％、酵母提取物0.3％，花生粉0.5％。
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