CN108048503B - 提高安丝菌素p-3生产的方法 - Google Patents

提高安丝菌素p-3生产的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108048503B
CN108048503B CN201810061979.1A CN201810061979A CN108048503B CN 108048503 B CN108048503 B CN 108048503B CN 201810061979 A CN201810061979 A CN 201810061979A CN 108048503 B CN108048503 B CN 108048503B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
glucose
seed
culture medium
hours
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810061979.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108048503A (zh
Inventor
钟建江
杜志强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Priority to CN201810061979.1A priority Critical patent/CN108048503B/zh
Publication of CN108048503A publication Critical patent/CN108048503A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108048503B publication Critical patent/CN108048503B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种生物反应器中珍贵橙色束丝放线菌提高安丝菌素P‑3产量的分批补料发酵工艺，其特征在于，基于野生型菌株珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565的共表达菌株Oasm13‑17:asmUdpg划线YMG平板上常温培养至长出白色气生菌丝后移至种子培养基中摇床培养，然后取种子液并移至二级培养基中进行再次摇床培养后得到发酵种子液；最后将发酵种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐中，通过动态补液实现优化发酵。本发明的分批补料策略可以使得安丝菌素P‑3的产量相比于批次培养提高0.8～2.35倍。

Description

提高安丝菌素P-3生产的方法
技术领域
本发明涉及的是一种发酵工程领域的技术，具体涉及一种通过在生物反应器中分批补料培养尤其是分批补加果糖策略以提高生物反应器中安丝菌素P-3产量的方法。
背景技术
安丝菌素P-3(AP-3)是珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)中产生的美登醇类化合物(Higashide E等，Nature，2002，270(5639)：721-722)，由于其优异的抗肿瘤活性，AP-3被广泛用作抗体偶联药物(ADCs)的毒性分子。其中，AP-3作为导弹药物的曲妥珠单抗自2013年以来已经在美国、加拿大、欧盟、和日本等多个国家被批准用于乳腺癌的靶向治疗，这是首个用于实体瘤的ADCs(Martínez,M等，Critical Reviews in Oncology/Hematology.2016,97,96-106.)。目前，以AP-3作为效应分子ADCs很多处于临床(前)研究中，近年研究发现，AP-3及其类似物，对其他癌症也具有很强的抗性(Taft F等，Chemistry-A European Journal，2012，18(3)：880-886)，展示了其良好的应用前景。但是，目前AP-3产量水平仍较低，这限制了其广泛的工业化应用，因此，提高AP-3的生物合成产量具有重要的应用价值。
目前报道提高AP-3产量的方法集中在突变株筛选、培养基优化、培养工艺优化和代谢工程改造等方面。通过紫外和MNNG诱变技术结合得到一株高产突变株Actinosynnemapretiosum PF4-4(ATCC PTA 3921)摇瓶发酵20mL/250mL条件下最终确认有效的产量最高可以达到401mg/L，并在1500L规模发酵罐中通过优化分批补料工艺，在发酵过程中补加葡萄糖和异丁醇，最终AP-3产量为304mg/L(CN 101103120A、WO 03/064610A2)。董清风等人(CN 103805648A)在150-L规模生物反应器中采取分批补料策略，发酵结束后AP-3产量为290mg/L，并且研究了分批补料和重复分批补料相结合的策略，最终AP-3产量提高到410mg/L。尽管国内对AP-3发酵生产在生物反应器中有一定研究，但是目前AP-3的发酵产量仍然较低，生产成本高，因此优化AP-3发酵工艺，进一步提高AP-3的产量，具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种生物反应器中珍贵橙色束丝放线菌提高安丝菌素P-3产量的分批补料发酵工艺，可以使得安丝菌素P-3的产量相比于批次培养提高0.8～2.35倍。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明基于基于野生型菌株珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565的共表达菌株Oasm13-17:asmUdpg划线YMG平板上常温培养至长出白色气生菌丝后移至种子培养基中摇床培养，然后取种子液并移至二级培养基中进行再次摇床培养后得到发酵种子液；最后将发酵种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐中，通过动态补液实现优化发酵。
所述的共表达菌株Oasm13-17:asmUdpg采用Du ZQ等，Combination oftraditional mutation and metabolic engineering to enhance ansamitocin P-3production in Actinosynnema pretiosum.(结合传统的诱变筛选和代谢工程方法提高珍贵橙色束丝放线菌中安丝菌素P-3产量的方法)Biotechnology and Bioengineering，2017,114,2794-2806文中所述的方法构建得到，即以珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565基因组DNA为模板分别克隆和酶切后，连接至含有红霉素启动子permE*的pIB139载体上，得到共表达质粒pIB139-asm13-17:asmUdpg，将构建好的共表达质粒，通过结合转移转入ATCC31565菌株中，得到共表达菌株Oasm13-17:asmUdpg。
所述的YMG平板上含有0.4wt％酵母粉、1wt％麦芽糖提取物、0.4wt％葡萄糖、0.03wt％氯化镁。
所述的常温培养，优选为28℃下培养2-3天至长出白色气生菌丝。
所述的摇床培养，优选为28℃、220rpm的摇床中培养24～40小时。
所述的种子培养基每升中含有酵母提取物10g、牛肉浸膏10g、无水葡萄糖5g、甘油10g和氯化钠3g。
所述的二级培养基与种子培养基组分相同。
所述的接种，优选以1.5％-2％的接种量，接种到10L装有5L发酵培养基的发酵罐中。
所述的发酵培养基每升中含有无水葡萄糖5g、甘油40g、酵母提取物10g、蔗糖2.5g、碳酸钙2g、磷酸氢二钾0.65g、七水合硫酸镁0.5g、七水合硫酸亚铁0.002g、碳酸钙0.5g以及异丁醇200μL/60mL。
所述的发酵罐中采用0.1M的盐酸溶液和0.1M的氢氧化钠溶液控制pH值6.5～7.5之间。
所述的动态补液是指：在发酵培养48～60小时后，当发酵液中葡萄糖浓度低于1g/L时，开始补加糖溶液和异丁醇，使发酵液中糖浓度到2.5g/L～5g/L，并定时取样测定发酵液内糖浓度，当浓度低于1g/L时，重复补加。
所述的糖溶液为葡萄糖溶液和/或果糖溶液。
本发明通过上述方法发酵，发酵结束时AP-3含量为266～757mg/L。
技术效果
与现有发酵工艺相比，本发明通过在发酵培养48～60小时，发酵液葡萄糖浓度低于1g/L时，分批补加果糖溶液和异丁醇，促进菌体细胞生长，实现安丝菌素P-3产量的提高，且发酵过程易于控制，因此具有良好的产业应用前景。
附图说明
图1A～图1C依次为实施例1溶氧、pH以及AP-3变化动态过程示意图；
图2A～图2C依次为实施例2溶氧、pH以及AP-3变化动态过程示意图；
图3A～图3C依次为实施例3溶氧、pH以及AP-3变化动态过程示意图；
图4A～图4D依次为实施例4溶氧、pH、细胞量以及AP-3变化动态过程示意图。
具体实施方式
实施例1
共表达菌株Oasm13-17:asmUdpg先进行摇瓶种子培养，培养所采用的种子培养基含有(g/L)：酵母提取物10、牛肉浸膏10、无水葡萄糖5、甘油10和氯化钠3；上述菌株的发酵培养按照文献(Du ZQ等，Biotechnology and Bioengineering，2017,114,2794-2806)中所述的方法进行培养，分别经过一级和二级种子培养，待二级种子培养36小时左右，按照1.5％(v/v)比例进行接种。
使用10L发酵罐(迪必尔生物工程(上海)有限公司)，按照发酵培养基配方(发酵培养基(g/L)：无水葡萄糖5、甘油40、酵母提取物10、蔗糖2.5、碳酸钙0.5、磷酸氢二钾0.65、七水合硫酸镁0.5、七水合硫酸亚铁0.002和碳酸钙0.5)配制5L，121℃，灭菌30min，将培养好的二级种子无菌接入，同时加入17mL异丁醇，培养条件为温度28℃，pH 7.5，转速280rpm，通气量为1vvm，kLa＝70h-1条件下进行批次发酵。
本实施例通过HPLC测得发酵结束时AP-3含量为322mg/L。
本实施例发酵过程的溶氧，pH、细胞量以及AP-3变化动态过程见图1。
实施例2
按照实施例1中所述的进行一级和二级种子培养，发酵罐培养基配制和接种，发酵条件同实例1。
使用10L发酵罐(迪必尔生物工程(上海)有限公司)培养，当发酵到48-60小时，发酵液中葡萄糖浓度低于1g/L，一次性补加葡萄糖和异丁醇母液(葡萄糖500g/L，异丁醇34mL/L)50mL，培养60h补加后发酵液中的葡萄糖浓度达到5g/L，继续发酵培养。
本实施例通过HPLC测得发酵结束时AP-3含量为266mg/L。
本实施例通过发酵过程的溶氧，pH、细胞量以及AP-3变化动态过程见图2。
实施例3
按照实施例1中所述的进行一级和二级种子培养，发酵罐培养基配制和接种，发酵条件同实例1。
使用10L发酵罐(迪必尔生物工程(上海)有限公司)培养，当发酵到48-60小时，发酵液中葡萄糖浓度低于1g/L，补加葡萄糖和异丁醇母液(葡萄糖625g/L，异丁醇85mL/L)20mL，补加后发酵液中的葡萄糖浓度达到2.5g/L，继续发酵培养并实时监测发酵液中葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于1g/L时，继续补加补加葡萄糖和异丁醇母液(葡萄糖625g/L，异丁醇85mL/L)20mL，分别在发酵培养60h、72h、96h和120h时补加，一共补加4次。
本实施例通过HPLC测得发酵结束时AP-3含量为596mg/L。
本实施例通过发酵过程的溶氧，pH、细胞量以及AP-3变化动态过程见图3。
实施例4
按照实施例1中所述的进行一级和二级种子培养，发酵罐培养基配制和接种，发酵条件同实例1。
使用10L发酵罐(迪必尔生物工程(上海)有限公司)培养，当发酵到48-60小时，发酵液中葡萄糖浓度低于1g/L，补加果糖和异丁醇母液(葡萄糖625g/L，异丁醇85mL/L)20ml，补加后发酵液中的果糖浓度达到2.5g/L，继续发酵培养并实时监测发酵液中果糖浓度，当发酵液中果糖浓度低于1g/L时，继续补加果糖和异丁醇溶液(果糖625g/L，异丁醇85mL/L)20mL，分别在发酵培养60h、96h和120h时补加，一共补加4次。
本实施例通过HPLC测得发酵结束时AP-3含量为757mg/L。
本实施例通过发酵过程的溶氧，pH、细胞量以及AP-3变化动态过程见图4A～图4D。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

Claims (9)

1.一种生物反应器中珍贵橙色束丝放线菌提高安丝菌素P-3产量的分批补料发酵工艺，其特征在于，基于野生型菌株珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565的共表达菌株Oasm13-17:asmUdpg划线YMG平板上常温培养至长出白色气生菌丝后移至种子培养基中摇床培养，然后取种子液并移至二级培养基中进行再次摇床培养后得到发酵种子液；最后将发酵种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐中，通过动态补液实现优化发酵；
所述的动态补液是指：当发酵到48-60小时，发酵液中葡萄糖浓度低于1g/L，补加含葡萄糖或果糖625g/L，异丁醇85mL/L的母液20ml，补加后发酵液中的葡萄糖或果糖浓度达到2.5g/L，继续发酵培养并实时监测发酵液中果糖浓度，当发酵液中葡萄糖或果糖浓度低于1g/L时，继续补加含葡萄糖或果糖625g/L，异丁醇85mL/L的母液20mL，分别在发酵培养60h、96h和120h时补加，一共补加4次；
所述的共表达菌株Oasm13-17:asmUdpg，以珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565基因组DNA为模板分别克隆和酶切后，连接至含有红霉素启动子permE*的pIB139载体上，得到共表达质粒pIB139-asm13-17:asmUdpg，将构建好的共表达质粒，通过结合转移转入ATCC31565菌株中得到。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征是，所述的YMG平板上含有0.4wt％酵母粉、1wt％麦芽糖提取物、0.4wt％葡萄糖、0.03wt％氯化镁。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征是，所述的常温培养，为28℃下培养2-3天至长出白色气生菌丝。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征是，所述的摇床培养，为28℃、220rpm的摇床中培养24～40小时。
5.根据权利要求1所述的工艺，其特征是，所述的种子培养基每升中含有酵母提取物10g、牛肉浸膏10g、无水葡萄糖5g、甘油10g和氯化钠3g。
6.根据权利要求1所述的工艺，其特征是，所述的二级培养基与种子培养基组分相同。
7.根据权利要求1所述的工艺，其特征是，所述的接种，以1.5％-2％的接种量，接种到10L装有5L发酵培养基的发酵罐中。
8.根据权利要求1所述的工艺，其特征是，所述的发酵培养基每升中含有无水葡萄糖5g、甘油40g、酵母提取物10g、蔗糖2.5g、碳酸钙2g、磷酸氢二钾0.65g、七水合硫酸镁0.5g、七水合硫酸亚铁0.002g、碳酸钙0.5g以及异丁醇200μL/60mL。
9.根据权利要求1所述的工艺，其特征是，所述的发酵罐中采用0.1M的盐酸溶液和0.1M的氢氧化钠溶液控制pH值6.5～7.5之间。
CN201810061979.1A 2018-01-23 2018-01-23 提高安丝菌素p-3生产的方法 Active CN108048503B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810061979.1A CN108048503B (zh) 2018-01-23 2018-01-23 提高安丝菌素p-3生产的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810061979.1A CN108048503B (zh) 2018-01-23 2018-01-23 提高安丝菌素p-3生产的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108048503A CN108048503A (zh) 2018-05-18
CN108048503B true CN108048503B (zh) 2022-03-08

Family

ID=62127314

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810061979.1A Active CN108048503B (zh) 2018-01-23 2018-01-23 提高安丝菌素p-3生产的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108048503B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115322918B (zh) * 2021-05-11 2024-03-29 浙江珲达生物科技有限公司 一种高产安丝菌素p-3的菌株及其应用
CN115960976A (zh) * 2021-10-13 2023-04-14 杭州中美华东制药有限公司 一种安丝菌素p-3的发酵方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102732581A (zh) * 2012-07-18 2012-10-17 上海交联药物研发有限公司 一种高表达安丝菌素p-3的方法
CN103805648A (zh) * 2012-11-13 2014-05-21 百奥泰生物科技(广州)有限公司 高产安丝菌素发酵工艺
CN104894183A (zh) * 2015-06-25 2015-09-09 齐鲁制药有限公司 一种用珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素p-3的方法
CN105907681A (zh) * 2016-05-30 2016-08-31 苏州康聚生物科技有限公司 一种高产安丝菌素p-3的突变株及安丝菌素p-3的制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060084141A1 (en) * 2001-11-21 2006-04-20 Floss Heinz G Biosynthetic gene cluster for the maytansinoid antitumor agent ansamitocin

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102732581A (zh) * 2012-07-18 2012-10-17 上海交联药物研发有限公司 一种高表达安丝菌素p-3的方法
CN103805648A (zh) * 2012-11-13 2014-05-21 百奥泰生物科技(广州)有限公司 高产安丝菌素发酵工艺
CN104894183A (zh) * 2015-06-25 2015-09-09 齐鲁制药有限公司 一种用珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素p-3的方法
CN105907681A (zh) * 2016-05-30 2016-08-31 苏州康聚生物科技有限公司 一种高产安丝菌素p-3的突变株及安丝菌素p-3的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Combination of traditional mutation and metabolic engineering to enhance ansamitocin P-3 production in Actinosynnema pretiosum;Zhi-Qiang Du等;《Biotechnology and Bioengineering》;20170823;第114卷(第12期);摘要，第2795页2.1节 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108048503A (zh) 2018-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102015829B1 (ko) 온라인 산소 소비율과 전도율의 통합 제어를 기반으로 한 코엔자임 q10 발효 생산 공정
CN101603066B (zh) 一种阿卡波糖的制备方法
CN101831414B (zh) 一种胞外生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的生产方法
US20240102058A1 (en) Caproate-producing bacterium with multiple substrate utilization capabilities and its applications
CN105154381A (zh) 同时利用蔗糖和甘油的新的产琥珀酸突变微生物和利用其生产琥珀酸的方法
CN108048503B (zh) 提高安丝菌素p-3生产的方法
CN102220396B (zh) 阿卡波糖简易的发酵方法
CN116751731B (zh) 一种大规模质粒生产的发酵工艺
CN1282749C (zh) 利用糖蜜或淀粉糖原料中间补料发酵生产虾青素的方法
CN106834377A (zh) 一种生产埃博霉素b的方法
CN103525881A (zh) 用于20m3大罐发酵培养大肠埃希氏菌再转化富马酸生产L-天冬氨酸的方法
CN116064345A (zh) 高效生产岩藻糖基乳糖的无抗基因工程菌及其应用
CN113136358B (zh) 一种提高人参皂苷产量的好氧共培养益生菌发酵工艺
WO2008092297A1 (fr) Nouveau procédé de préparation d'acide abscissique naturel
CN111118090B (zh) 一种提高两性霉素b产量的补料控制发酵方法
CN112501219A (zh) 一种以蔗糖为原料发酵生产乳酸单体的方法
CN102041285B (zh) 一种恒pH补料策略发酵生产银耳多糖的方法
CN101698836B (zh) 一种谷氨酰胺转胺酶发酵过程中补料的方法
CN111424061B (zh) 一株赤红球菌及其用于烟酰胺生产的方法
CN109811017B (zh) 一种基于溶氧与pH调控高山被孢霉产EPA的发酵方法
CN114717272B (zh) 一种霍氏肠杆菌发酵生产庚二酸的方法
CN114990178B (zh) 一种提高阿维拉霉素发酵液质量的方法
CN115125179B (zh) 产雷帕霉素的基因工程菌及其应用
CN111303248B (zh) 一种提高替考拉宁发酵产量的补料方法
CN110272925B (zh) 一种苏沃雷生关键中间体的酶法制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant