CN108048503B - 提高安丝菌素p-3生产的方法 - Google Patents

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Abstract

一种生物反应器中珍贵橙色束丝放线菌提高安丝菌素P‑3产量的分批补料发酵工艺，其特征在于，基于野生型菌株珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565的共表达菌株Oasm13‑17:asmUdpg划线YMG平板上常温培养至长出白色气生菌丝后移至种子培养基中摇床培养，然后取种子液并移至二级培养基中进行再次摇床培养后得到发酵种子液；最后将发酵种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐中，通过动态补液实现优化发酵。本发明的分批补料策略可以使得安丝菌素P‑3的产量相比于批次培养提高0.8～2.35倍。

Description

提高安丝菌素P-3生产的方法
技术领域
本发明涉及的是一种发酵工程领域的技术，具体涉及一种通过在生物反应器中分批补料培养尤其是分批补加果糖策略以提高生物反应器中安丝菌素P-3产量的方法。
背景技术
安丝菌素P-3(AP-3)是珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)中产生的美登醇类化合物(Higashide E等，Nature，2002，270(5639)：721-722)，由于其优异的抗肿瘤活性，AP-3被广泛用作抗体偶联药物(ADCs)的毒性分子。其中，AP-3作为导弹药物的曲妥珠单抗自2013年以来已经在美国、加拿大、欧盟、和日本等多个国家被批准用于乳腺癌的靶向治疗，这是首个用于实体瘤的ADCs(Martínez,M等，Critical Reviews in Oncology/Hematology.2016,97,96-106.)。目前，以AP-3作为效应分子ADCs很多处于临床(前)研究中，近年研究发现，AP-3及其类似物，对其他癌症也具有很强的抗性(Taft F等，Chemistry-A European Journal，2012，18(3)：880-886)，展示了其良好的应用前景。但是，目前AP-3产量水平仍较低，这限制了其广泛的工业化应用，因此，提高AP-3的生物合成产量具有重要的应用价值。
目前报道提高AP-3产量的方法集中在突变株筛选、培养基优化、培养工艺优化和代谢工程改造等方面。通过紫外和MNNG诱变技术结合得到一株高产突变株Actinosynnemapretiosum PF4-4(ATCC PTA 3921)摇瓶发酵20mL/250mL条件下最终确认有效的产量最高可以达到401mg/L，并在1500L规模发酵罐中通过优化分批补料工艺，在发酵过程中补加葡萄糖和异丁醇，最终AP-3产量为304mg/L(CN 101103120A、WO 03/064610A2)。董清风等人(CN 103805648A)在150-L规模生物反应器中采取分批补料策略，发酵结束后AP-3产量为290mg/L，并且研究了分批补料和重复分批补料相结合的策略，最终AP-3产量提高到410mg/L。尽管国内对AP-3发酵生产在生物反应器中有一定研究，但是目前AP-3的发酵产量仍然较低，生产成本高，因此优化AP-3发酵工艺，进一步提高AP-3的产量，具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种生物反应器中珍贵橙色束丝放线菌提高安丝菌素P-3产量的分批补料发酵工艺，可以使得安丝菌素P-3的产量相比于批次培养提高0.8～2.35倍。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明基于基于野生型菌株珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565的共表达菌株Oasm13-17:asmUdpg划线YMG平板上常温培养至长出白色气生菌丝后移至种子培养基中摇床培养，然后取种子液并移至二级培养基中进行再次摇床培养后得到发酵种子液；最后将发酵种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐中，通过动态补液实现优化发酵。
所述的共表达菌株Oasm13-17:asmUdpg采用Du ZQ等，Combination oftraditional mutation and metabolic engineering to enhance ansamitocin P-3production in Actinosynnema pretiosum.(结合传统的诱变筛选和代谢工程方法提高珍贵橙色束丝放线菌中安丝菌素P-3产量的方法)Biotechnology and Bioengineering，2017,114,2794-2806文中所述的方法构建得到，即以珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565基因组DNA为模板分别克隆和酶切后，连接至含有红霉素启动子permE*的pIB139载体上，得到共表达质粒pIB139-asm13-17:asmUdpg，将构建好的共表达质粒，通过结合转移转入ATCC31565菌株中，得到共表达菌株Oasm13-17:asmUdpg。
所述的YMG平板上含有0.4wt％酵母粉、1wt％麦芽糖提取物、0.4wt％葡萄糖、0.03wt％氯化镁。
所述的常温培养，优选为28℃下培养2-3天至长出白色气生菌丝。
所述的摇床培养，优选为28℃、220rpm的摇床中培养24～40小时。
所述的种子培养基每升中含有酵母提取物10g、牛肉浸膏10g、无水葡萄糖5g、甘油10g和氯化钠3g。
所述的二级培养基与种子培养基组分相同。
所述的接种，优选以1.5％-2％的接种量，接种到10L装有5L发酵培养基的发酵罐中。
所述的发酵培养基每升中含有无水葡萄糖5g、甘油40g、酵母提取物10g、蔗糖2.5g、碳酸钙2g、磷酸氢二钾0.65g、七水合硫酸镁0.5g、七水合硫酸亚铁0.002g、碳酸钙0.5g以及异丁醇200μL/60mL。
所述的发酵罐中采用0.1M的盐酸溶液和0.1M的氢氧化钠溶液控制pH值6.5～7.5之间。
所述的动态补液是指：在发酵培养48～60小时后，当发酵液中葡萄糖浓度低于1g/L时，开始补加糖溶液和异丁醇，使发酵液中糖浓度到2.5g/L～5g/L，并定时取样测定发酵液内糖浓度，当浓度低于1g/L时，重复补加。
所述的糖溶液为葡萄糖溶液和/或果糖溶液。
本发明通过上述方法发酵，发酵结束时AP-3含量为266～757mg/L。
技术效果
与现有发酵工艺相比，本发明通过在发酵培养48～60小时，发酵液葡萄糖浓度低于1g/L时，分批补加果糖溶液和异丁醇，促进菌体细胞生长，实现安丝菌素P-3产量的提高，且发酵过程易于控制，因此具有良好的产业应用前景。
附图说明
图1A～图1C依次为实施例1溶氧、pH以及AP-3变化动态过程示意图；
图2A～图2C依次为实施例2溶氧、pH以及AP-3变化动态过程示意图；
图3A～图3C依次为实施例3溶氧、pH以及AP-3变化动态过程示意图；
图4A～图4D依次为实施例4溶氧、pH、细胞量以及AP-3变化动态过程示意图。
具体实施方式
实施例1
共表达菌株Oasm13-17:asmUdpg先进行摇瓶种子培养，培养所采用的种子培养基含有(g/L)：酵母提取物10、牛肉浸膏10、无水葡萄糖5、甘油10和氯化钠3；上述菌株的发酵培养按照文献(Du ZQ等，Biotechnology and Bioengineering，2017,114,2794-2806)中所述的方法进行培养，分别经过一级和二级种子培养，待二级种子培养36小时左右，按照1.5％(v/v)比例进行接种。
使用10L发酵罐(迪必尔生物工程(上海)有限公司)，按照发酵培养基配方(发酵培养基(g/L)：无水葡萄糖5、甘油40、酵母提取物10、蔗糖2.5、碳酸钙0.5、磷酸氢二钾0.65、七水合硫酸镁0.5、七水合硫酸亚铁0.002和碳酸钙0.5)配制5L，121℃，灭菌30min，将培养好的二级种子无菌接入，同时加入17mL异丁醇，培养条件为温度28℃，pH 7.5，转速280rpm，通气量为1vvm，kLa＝70h-1条件下进行批次发酵。
本实施例通过HPLC测得发酵结束时AP-3含量为322mg/L。
本实施例发酵过程的溶氧，pH、细胞量以及AP-3变化动态过程见图1。
实施例2
按照实施例1中所述的进行一级和二级种子培养，发酵罐培养基配制和接种，发酵条件同实例1。
使用10L发酵罐(迪必尔生物工程(上海)有限公司)培养，当发酵到48-60小时，发酵液中葡萄糖浓度低于1g/L，一次性补加葡萄糖和异丁醇母液(葡萄糖500g/L，异丁醇34mL/L)50mL，培养60h补加后发酵液中的葡萄糖浓度达到5g/L，继续发酵培养。
本实施例通过HPLC测得发酵结束时AP-3含量为266mg/L。
本实施例通过发酵过程的溶氧，pH、细胞量以及AP-3变化动态过程见图2。
实施例3
按照实施例1中所述的进行一级和二级种子培养，发酵罐培养基配制和接种，发酵条件同实例1。
使用10L发酵罐(迪必尔生物工程(上海)有限公司)培养，当发酵到48-60小时，发酵液中葡萄糖浓度低于1g/L，补加葡萄糖和异丁醇母液(葡萄糖625g/L，异丁醇85mL/L)20mL，补加后发酵液中的葡萄糖浓度达到2.5g/L，继续发酵培养并实时监测发酵液中葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于1g/L时，继续补加补加葡萄糖和异丁醇母液(葡萄糖625g/L，异丁醇85mL/L)20mL，分别在发酵培养60h、72h、96h和120h时补加，一共补加4次。
本实施例通过HPLC测得发酵结束时AP-3含量为596mg/L。
本实施例通过发酵过程的溶氧，pH、细胞量以及AP-3变化动态过程见图3。
实施例4
按照实施例1中所述的进行一级和二级种子培养，发酵罐培养基配制和接种，发酵条件同实例1。
使用10L发酵罐(迪必尔生物工程(上海)有限公司)培养，当发酵到48-60小时，发酵液中葡萄糖浓度低于1g/L，补加果糖和异丁醇母液(葡萄糖625g/L，异丁醇85mL/L)20ml，补加后发酵液中的果糖浓度达到2.5g/L，继续发酵培养并实时监测发酵液中果糖浓度，当发酵液中果糖浓度低于1g/L时，继续补加果糖和异丁醇溶液(果糖625g/L，异丁醇85mL/L)20mL，分别在发酵培养60h、96h和120h时补加，一共补加4次。
本实施例通过HPLC测得发酵结束时AP-3含量为757mg/L。
本实施例通过发酵过程的溶氧，pH、细胞量以及AP-3变化动态过程见图4A～图4D。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

Claims (9)

1.一种生物反应器中珍贵橙色束丝放线菌提高安丝菌素P-3产量的分批补料发酵工艺，其特征在于，基于野生型菌株珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565的共表达菌株Oasm13-17:asmUdpg划线YMG平板上常温培养至长出白色气生菌丝后移至种子培养基中摇床培养，然后取种子液并移至二级培养基中进行再次摇床培养后得到发酵种子液；最后将发酵种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐中，通过动态补液实现优化发酵；
所述的动态补液是指：当发酵到48-60小时，发酵液中葡萄糖浓度低于1g/L，补加含葡萄糖或果糖625g/L，异丁醇85mL/L的母液20ml，补加后发酵液中的葡萄糖或果糖浓度达到2.5g/L，继续发酵培养并实时监测发酵液中果糖浓度，当发酵液中葡萄糖或果糖浓度低于1g/L时，继续补加含葡萄糖或果糖625g/L，异丁醇85mL/L的母液20mL，分别在发酵培养60h、96h和120h时补加，一共补加4次；
所述的共表达菌株Oasm13-17:asmUdpg，以珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565基因组DNA为模板分别克隆和酶切后，连接至含有红霉素启动子permE*的pIB139载体上，得到共表达质粒pIB139-asm13-17:asmUdpg，将构建好的共表达质粒，通过结合转移转入ATCC31565菌株中得到。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征是，所述的YMG平板上含有0.4wt％酵母粉、1wt％麦芽糖提取物、0.4wt％葡萄糖、0.03wt％氯化镁。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征是，所述的常温培养，为28℃下培养2-3天至长出白色气生菌丝。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征是，所述的摇床培养，为28℃、220rpm的摇床中培养24～40小时。
5.根据权利要求1所述的工艺，其特征是，所述的种子培养基每升中含有酵母提取物10g、牛肉浸膏10g、无水葡萄糖5g、甘油10g和氯化钠3g。
6.根据权利要求1所述的工艺，其特征是，所述的二级培养基与种子培养基组分相同。
7.根据权利要求1所述的工艺，其特征是，所述的接种，以1.5％-2％的接种量，接种到10L装有5L发酵培养基的发酵罐中。
8.根据权利要求1所述的工艺，其特征是，所述的发酵培养基每升中含有无水葡萄糖5g、甘油40g、酵母提取物10g、蔗糖2.5g、碳酸钙2g、磷酸氢二钾0.65g、七水合硫酸镁0.5g、七水合硫酸亚铁0.002g、碳酸钙0.5g以及异丁醇200μL/60mL。
9.根据权利要求1所述的工艺，其特征是，所述的发酵罐中采用0.1M的盐酸溶液和0.1M的氢氧化钠溶液控制pH值6.5～7.5之间。
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