CN114717272B - 一种霍氏肠杆菌发酵生产庚二酸的方法 - Google Patents

一种霍氏肠杆菌发酵生产庚二酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种霍氏肠杆菌发酵生产庚二酸的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明从保存的菌株中筛选到一株可生产庚二酸的霍氏肠杆菌，该菌株为天然菌株，在发酵过程中无需添加抗生素及诱导剂，在降低工业生产成本的同时还有利于环境的保护。利用所述霍氏肠杆菌在摇瓶条件下发酵72h，庚二酸的产量为115.4mg/L；并通过对发酵工艺如碳源种类、氮源种类、碳氮源组合、接种量、外加无机盐种类及浓度等的优化，进一步提升了庚二酸的产量，庚二酸的产量达到217.3mg/L。利于庚二酸是规模化生产且，同时为庚二酸的生物法合成提供了新宿主，也为后续研究奠定了生物学基础。

Description

一种霍氏肠杆菌发酵生产庚二酸的方法
技术领域
本发明涉及一种霍氏肠杆菌发酵生产庚二酸的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
庚二酸，又称蒲桃酸，是一种重要的七碳二元羧酸，主要用作生物素合成的前体，除此以外还可用于聚酰胺、表面活性剂及杀虫剂的制备。目前，工业上主要是通过水杨酸的裂解来合成庚二酸，但该方法有着工艺复杂、收率较低等缺点。
随着现代生物技术的不断发展，生物法合成庚二酸获得了越来越多的关注，最早在部分微生物的培养过程中发现了微量庚二酸的存在。随后，利用代谢工程及合成生物学等方法，对庚二酸的生物合成进行了研究。通过在大肠杆菌中过表达五个基因(paaJ、paaH、paaF、tdTer和cat1)，可以利用非脱羧克莱森缩合反应构建二元羧酸的生物合成途径，在摇瓶发酵的条件下，工程菌株产生了25mg/L庚二酸。同样地，BioI是一种细胞色素P450酶，可以氧化裂解长链脂肪酸形成庚二酸，通过在谷氨酸棒杆菌中表达该酶的编码基因bioI，可以获得微量的庚二酸。上述方法的庚二酸产量均较低，不利于后续的工业化生产，因此有必要通过筛选获得一株高产庚二酸的菌株并进行发酵工艺优化，以期提高庚二酸的产量，为其工业化生产奠定基础。
发明内容
针对目前存在的问题，本发明提供一种高产庚二酸菌株的筛选及其发酵优化方法。具体表现在，从实验室现有菌株中筛选得到庚二酸产量较高的菌株，并对发酵工艺条件进行优化，提高菌株生物法合成庚二酸的能力，为其工业化生产奠定基础。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种生产庚二酸的方法，所述方法是利用霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaeechei)发酵生产庚二酸，所述霍氏肠杆菌已于2022年02月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022159。
在一种实施方式中，将所述霍氏肠杆菌培养至菌浓为OD600＝4±0.5，按照发酵体系体积的1％～10％的量添加至发酵体系中。
优选地，按照发酵体系体积的2％～8％的量添加菌浓为OD600＝4±0.5的霍氏肠杆菌。
更优选地，按照发酵体系体积的4％的量添加菌浓为OD600＝4±0.5的霍氏肠杆菌。
在一种实施方式中，所述发酵体系中以葡萄糖为碳源，以胰蛋白胨、(NH4)2HPO4或胰蛋白胨和酵母粉的组合物为氮源；或者以甘油为碳源，以胰蛋白胨或(NH4)2HPO4为氮源；或以蔗糖为碳源，以胰蛋白胨为氮源。
优选地，以甘油为碳源，以胰蛋白胨为氮源；或是以葡萄糖为碳源，以胰蛋白胨为氮源。
在一种实施方式中，所述发酵体系中碳源与氮源的比例为(3～4):1。
在一种实施方式中，所述碳源浓度为3～5g/L。
优选地，所述发酵体系以甘油为碳源，以胰蛋白胨为氮源，甘油浓度为4g/L，胰蛋白胨浓度为25g/L。
在一种实施方式中，所述发酵体系中还含有2～2.5g/L的MgCl2·6H2O，0～0.5g/L的NaCl，0～0.2g/L的KCl，pH为7.0±0.5。
在一种实施方式中，外源添加无机盐KCl、MnCl2、MgSO4或KH2PO4。
在一种实施方式中，所述无机盐的浓度为0.5～50mM。
优选地，外源添加的无机盐为KH2PO4，在反应体系中的浓度为20～50mM。
在一种实施方式中，发酵12～72h。
优选地，发酵时间为72h。
本发明还提供了所述生产庚二酸的方法在制备庚二酸中的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明从实验室的菌株中筛选获得了一株产庚二酸的霍氏肠杆菌Bpa-3，该菌株为野生菌，在发酵过程中无需添加昂贵的抗生素及诱导剂，大大降低了工业化成本。在摇瓶发酵条件下发酵72h，庚二酸的产量为115.4mg/L；通过发酵工艺优化，该菌株庚二酸的产量达到217.3mg/L，为庚二酸的生物法合成提供了新宿主，也为其工业化开发奠定了基础。
生物材料保藏
本发明所提供的霍氏肠杆菌Bpa-3，分类命名为Enterobacter hormaeecheiWM11，已于2022年02月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2022159，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
附图说明
图1为菌株Bpa-3庚二酸的产量及其发酵液液质联用检测分析图谱。
图2为不同种类碳源下菌株Bpa-3的庚二酸产量图。
图3为不同种类氮源下菌株Bpa-3的庚二酸产量图。
图4为不同碳氮源组合下菌株Bpa-3的庚二酸产量图。
图5为不同接种量下菌株Bpa-3的庚二酸产量图。
图6为不同无机盐种类下菌株Bpa-3的庚二酸产量图。
图7为不同KH2PO4浓度下菌株Bpa-3的庚二酸产量图。
具体实施方式
平板及斜面固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2％，pH自然。
SOB培养基：葡萄糖4g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，六水合氯化镁2.03g/L，氯化钠0.5g/L，氯化钾0.186g/L，pH自然；
LB培养基(种子富集培养基)：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH自然。
HPLC检测条件：安捷伦液相色谱仪，Aminex HPX-87H(300x7.8mm)柱，柱温：35℃；流动相：5mM硫酸；流速：0.6ml/min；进样量为10μL；检测器：示差折光检测器。
实施例1：庚二酸生产菌株筛选
对实验室保藏的菌株进行划线后挑取单菌落，制备二级种子液：接种菌株的单菌落于含有50mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃，250r/min培养12h制备一级种子液；将一级种子液以2％的接种量继续转接至三角瓶中，37℃，250r/min培养12h制备二级种子液。
通过48孔板进行初筛，30℃，250r/min发酵72h，利用HPLC检测发酵液中的庚二酸。随后将初筛得到的菌株利用摇瓶进行复筛，以2％的接种量将制备的二级种子液接种于含有50mL SOB培养基的250mL三角瓶中，30℃，250r/min发酵72h，每隔12h取一次样，冻存于-20℃冰箱中，利用HPLC对发酵液进行分析，选出庚二酸产量最高的菌株，将其命名为Bpa-3。
图1为菌株Bpa-3不同时间下庚二酸的产量及其发酵液液质联用检测分析图谱，表明菌株Bpa-3在发酵过程中生产了庚二酸，最终发酵72h，庚二酸产量为115.4mg/L。
实施例2：培养基成分优化
二级种子液制备：接种菌株Bpa-3的单菌落于含有50mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃，250r/min培养12h制备一级种子液；将一级种子液以2％的接种量继续转接至三角瓶中，37℃，250r/min培养12h制备二级种子液(OD600＝4±0.5)。
(1)碳源种类优化：分别用4g/L的蔗糖、4g/L的甘油替换SOB培养基中的葡萄糖，以2％(v/v)的接种量将菌株Bpa-3的二级种子液接种于培养基，30℃，250r/min发酵72h，每隔12h取样，利用HPLC对发酵液进行分析。结果如图2所示，发酵72h后，经HPLC检测，当碳源为甘油时，庚二酸的产量为122.5mg/L。
(2)氮源种类优化：分别用25g/L的有机氮源(酵母膏、大豆蛋白胨、鱼粉蛋白胨、酵母粉、牛肉浸粉、胰蛋白胨)或无机氮源(乙酸铵、(NH4)2SO4、NH4Cl、尿素、(NH4)2HPO4)替换SOB培养基中的混合氮源(酵母粉和胰蛋白胨)，以2％(v/v)的接种量将菌株Bpa-3的二级种子液接种于培养基，30℃，250r/min发酵72h，每隔12h取样，利用HPLC对发酵液进行分析。结果如图3所示，当氮源为胰蛋白胨或(NH4)2HPO4时，能够提升庚二酸的产量，庚二酸的产量分别为133.4mg/L、126.0mg/L。
(3)碳氮源组合优化：结合前期实验结果，对培养基中的碳源(葡萄糖、甘油及蔗糖)及氮源(胰蛋白胨及(NH4)2HPO4)进行组合，使其与SOB培养基中的碳氮比保持一致(C/N＝4)，以2％(v/v)的接种量将菌株Bpa-3的二级种子液接种于培养基，30℃，250r/min发酵72h，每隔12h取样，利用HPLC对发酵液进行分析。结果发现当碳源为甘油，氮源为胰蛋白胨时，庚二酸的产量最高(图4)，庚二酸产量为143.5mg/L。
综上所述，确定最优组分培养基成分以g/L计为胰蛋白胨25，甘油4，MgCl2·6H2O2.03，NaCl 0.5，KCl 0.186，加水定容，pH7.0，用该培养基对菌株Bpa-3进行发酵时，庚二酸的产量为143.5mg/L。
实施例3：接种量的优化
分别以1％、2％、4％、6％、8％、10％(v/v)的接种量转接菌株Bpa-3的二级种子液，利用最优组分培养基进行摇瓶发酵，30℃，250r/min发酵72h，每隔12h取样，利用HPLC对发酵液进行分析。结果如图5所示，当接种量为4％时，庚二酸的产量可达到最高为149.2mg/L，接种量为1％、2％、6％、8％、10％时，庚二酸的产量分别为113.4mg/L、123.5mg/L、140.3mg/L、140.8mg/L、124.0mg/L。
实施例4：外加无机盐的优化
(1)无机盐种类：以最优组分培养基为基础，发酵前向培养基中分别外加不同终浓度的KCl、MnCl2、MgSO4及KH2PO4溶液，以4％的接种量将菌株Bpa-3的种子液接种于培养基，30℃，250r/min发酵72h，每隔12h取样，利用HPLC对发酵液进行分析。结果如图6所示，除MgSO4外，其他无机盐均能够促进庚二酸的合成，其中，KH2PO4对于菌株产庚二酸的作用最大，当向最优组分培养基中外加KH2PO4时，庚二酸的产量为205.1mg/L；向培养基中外源添加KCl、MnCl2时，庚二酸的产量分别为123.2mg/L、130.4mg/L。
(2)KH2PO4浓度优化：以最优组分培养基为基础，发酵前向培养基中分别外加终浓度分别为5、10、20、30和50mmol/L的KH2PO4母液，接种量为4％(v/v)，30℃，250r/min发酵72h，每隔12h取样，利用HPLC对发酵液进行分析。发酵72h的结果如图7所示，随着KH2PO4浓度的不断增加，庚二酸的产量先升高后降低，当外加30mmol/L KH2PO4时，庚二酸的产量为217.3mg/L，当外加20mmol/L KH2PO4时，庚二酸的产量为206.0mg/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1. 一种生产庚二酸的方法，其特征在于，利用霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）发酵生产庚二酸，所述霍氏肠杆菌已于2022年02月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022159。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述霍氏肠杆菌培养至菌浓为OD600=4±0.5，按照发酵体系体积的1%~10%的量添加至发酵体系中。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵体系中以葡萄糖为碳源，以胰蛋白胨、(NH4)2HPO4或胰蛋白胨和酵母粉的组合物为氮源；或者以甘油为碳源，以胰蛋白胨或(NH4)2HPO4为氮源；或以蔗糖为碳源，以胰蛋白胨为氮源。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述发酵体系中碳源与氮源的比例为(3~4):1。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述碳源浓度为3~5 g/L。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵体系中还含有2~2.5 g/L的MgCl2·6H2O，0~0.5 g/L的NaCl，0~0.2 g/L的KCl。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，外源添加无机盐KCl、MnCl2、MgSO4或KH2PO4。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述无机盐的浓度为0.5~50mM。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，发酵12~72 h。
10.权利要求1~9任一所述方法在制备庚二酸中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113774097A (zh) * 2021-08-25 2021-12-10 河北科技大学 霍华德氏肠杆菌fx-02发酵生产吲哚乙酸的方法
CN113817782A (zh) * 2021-09-27 2021-12-21 江南大学 一种庚二酸的全生物合成方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113774097A (zh) * 2021-08-25 2021-12-10 河北科技大学 霍华德氏肠杆菌fx-02发酵生产吲哚乙酸的方法
CN113817782A (zh) * 2021-09-27 2021-12-21 江南大学 一种庚二酸的全生物合成方法

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