CN105907681A - 一种高产安丝菌素p-3的突变株及安丝菌素p-3的制备方法 - Google Patents

一种高产安丝菌素p-3的突变株及安丝菌素p-3的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高产安丝菌素P‑3的突变株及安丝菌素P‑3的制备方法，使用珍贵橙色束丝放线菌CJ14 Actinosynnema pretiosum CJ14进行补料分批发酵制备所述的安丝菌素P‑3，其中，控制发酵过程中通气比为1.0~2.0vvm，发酵溶氧大于30%，pH为6.0~8.0。本发明筛选出的珍贵橙色束丝放线菌CJ14 Actinosynnema pretiosum CJ14为高产菌株，采用该菌株配合优化的发酵培养基组分和发酵工艺，能够实现工业化大规模生产，不仅生产成本低，而且获得的安丝菌素P‑3产品纯度高。

Description

一种高产安丝菌素P-3的突变株及安丝菌素P-3的制备方法
技术领域
本发明涉及一种高产安丝菌素P-3的突变株及安丝菌素P-3的制备方法。
背景技术
安丝菌素P-3(Ansamitocin P-3，AP3)是小分子安莎类抗生素，具有抗肿瘤、抗结核杆菌、抗细菌等多种药理活性；其组分有P-0、P-1、P-2、P-3、P-3'、P-4和P-4'，其中安丝菌素P-3为主要合成产物，其通过阻碍微管形成从而阻止细胞的有丝分裂使细胞死亡，在体外及荷瘤动物中具有显著抗肿瘤作用。
安丝菌素P-3是以3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)为起始单元，多聚乙酰链的延伸包括3个丙酸盐、3个乙酸盐及1个特殊的羟乙酸盐单位的引入并闭环得到19个碳的大环内酯环，称为前-安丝菌素(proansamitocin)；再经过氯化、甲氨酰化、O-甲基化、酰基化、环氧化、N-甲基化等修饰反应而形成。
开发低毒高效抗肿瘤药物是缓解人类所面临的癌症困扰的有效方法之一。通过多年的临床实践表明，未来抗肿瘤药物研发的重点是应用更合理的靶向和细胞毒性药物的组合方式以达到更佳的治疗效果。美登醇类药物的抗肿瘤细胞活性为阿霉素的150-300倍，比放线菌素D、氨甲蝶呤(aminopterin)、丝裂霉素(mitomycin)等强100至1000倍。
安丝菌素的母核是大环内酯类美登醇，其同系物包括植物来源的美登素和美登普林等。美登素类化合物因其强细胞毒性而在肿瘤治疗领域受到极大关注，但是因为强烈的毒副作用导致临床失败。但是通过交联技术将美登素生物碱(maytansinoids)与抗体交联后，通过靶向治疗取得了积极的疗效和较低的毒副作用。例如，2013年抗体药物偶联物Kadcyla(T-DM1)被FDA批准用于治疗HER-2阳性晚期转移性乳腺癌；DM1就是美登醇的化疗药物经过化学修饰合成后的一种化学小分子，DM1可以通过连接分子(linker)与具有靶向性的抗体偶联，制备成具有靶向性的抗肿瘤药物，减少化疗的副作用，并增强疗效。
美登素类物质在植物中的含量极低，植物提取法效率低、成本高；美登素的结构复杂，若采用全合成法，其收率低、成本高，且污染严重，不具备实际应用价值。因此若能通过生物发酵分离其前体化合物，再进一步合成美登素，是最佳选择。安丝菌素P-3结构稳定、疏水性强易于萃取，是合成美登素的最佳前体；采用微生物规模化发酵生产安丝菌素P-3，有利于降低美登素的制备成本，同时减少杂质的产生，利于药品制备。
CN101319241 A公开了一种安丝菌素的固体发酵方法，该发明利用可再生纤维素薄膜支持物进行固体发酵，但是发酵产量低，难以实验工业规模化生产。CN103255184 A公开了一种包含铵离子和乙酸根或者包含乙酸铵的高效产生抗生素安丝菌素AP3的发酵新培养基；该专利生产工艺规模小，对现实工业生产指导性不大。国内公布的文献表明，目前安丝菌素P-3的研究集中于发酵条件优化，但发酵水平远未达到工业化规模生产水平，且纯化工艺过于复杂，制备成本高昂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于生产安丝菌素P-3的微生物，该微生物为高产菌株。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种适合工业化生产且成本低的安丝菌素P-3的制备方法。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种高产安丝菌素P-3的突变株，突变株为珍贵橙色束丝放线菌CJ14 Actinosynnema pretiosum CJ14，所述微生物保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M 2016214。
具体地，所述突变株是由珍贵橙色束丝放线菌ATCC 31565(Actinosynnemapretiosum)通过UV诱变与红酵母生测平板筛选得到，在进行UV诱变时采用20～40W的紫外线灯照射所述微生物100～130s。
优选地，所述紫外线灯距离所述微生物30～50cm。
本发明的另一个目的是提供一种上述突变株在制备安丝菌素P-3中的用途，将所述的微生物进行补料分批发酵5～7天，所述的安丝菌素P-3的发酵产量大于150mg/L。
本发明的第三个目的是提供一种安丝菌素P-3的制备方法，使用所述的珍贵橙色束丝放线菌CJ14 Actinosynnema pretiosum CJ14进行补料分批发酵制备所述的安丝菌素P-3，其中，控制发酵过程中通气比为1.0～2.0vvm，发酵溶氧大于30％，pH为6.0～8.0。
优选地，控制发酵过程中通气比为1.5～2.0vvm，发酵溶氧大于30％，pH为7.0～8.0。
优选地，进行所述发酵时采用的发酵培养基的碳源为麦芽糖，氮源为酵母粉、豆粕水解液、缬氨酸的混合物，其中，所述的麦芽糖的浓度为30～40g/L，所述的酵母粉的浓度为3～10g/L，所述的豆粕水解液的添加体积为所述的发酵培养基总体积的2～10mL/L，所述的缬氨酸的浓度为1～10g/L。
进一步优选地，所述的发酵培养基还包括浓度为0.1～0.8g/L的七水硫酸镁、浓度为1～5g/L的碳酸钙、浓度为0.1～0.5g/L的磷酸二氢钾、占所述的发酵培养基总体积0.2～1.5mL/L的消泡剂。
优选地，进行所述的发酵时通过加入补料培养基使所述的发酵培养基中菌体湿重保持在0.25～0.35g/mL。
进一步优选地，所述的补料培养基包括浓度为2～10g/L的缬氨酸、浓度为10～50g/L葡萄糖、浓度为10～50g/L的果糖。
具体地，所述的补料培养基通过蠕动泵加入。
进一步优选地，所述的补料培养基通过间隙补料方式添加，当所述的菌体湿重大于0.20g/mL时开始补料，自开始补料至发酵第四天，每天添加补料培养基的体积为发酵总体积的2～4％；后续每天添加补料培养基的体积为发酵总体积的1～2％。
最为优选地，自开始补料至发酵第四天，每天添加补料培养基的体积为发酵总体积的2～3％；后续每天添加补料培养基的体积为发酵总体积的1～1.5％。
优选地，在进行所述的发酵前，先将所述的珍贵橙色束丝放线菌CJ14Actinosynnema pretiosum CJ14进行培养至孢子成熟，洗下孢子进行种子培养。
具体地，采用固体培养基进行孢子培养，固体培养基采用本领域常用的固体培养基，例如：ISP3固体培养基、ISP4固体培养基、ISP5固体培养基。
具体地，采用种子培养基进行种子培养，种子培养基采用本领域常用的种子培养基，例如：葡萄糖20g/L，酵母浸粉5g/L，大豆蛋白胨10g/L。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明筛选出的珍贵橙色束丝放线菌CJ14 Actinosynnema pretiosum CJ14为高产菌株，采用该菌株配合优化的发酵培养基组分和发酵工艺，能够实现工业化大规模生产，不仅生产成本低，而且获得的安丝菌素P-3产品纯度高。
说明书附图
图1为珍贵橙色束丝放线菌致死率与不同UV照射时间的关系；
图2为PDA红酵母生测平板(左)，YM红酵母生测平板(右)；
图3为10吨罐发酵至161小时发酵液的液相分析图谱。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的限制。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1：菌株的UV诱变及筛选
紫外线(UV)是一种最常用的物理诱变因素，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变异。
采用传统的物理诱变(UV)，结合红酵母生测筛选方法，筛选出高产菌株。
将Actinosynnema pretiosum ATCC31565在ISP培养基培养5～7天产孢；用无菌生理盐水洗下孢子，取5ml孢子悬液于50ml无菌离心管中，加入5～10粒直径2mm玻璃珠，旋涡振荡10min；孢悬液用0.1％吐温60溶液稀释至10-3、10-4、10-5倍稀释液，取稀释液0.1mL于各个固体平板中，涂布均匀。
关闭房间照明灯，开启紫外灯预热约20min后，打开平板盖暴露于紫外线下(30W，40cm)，紫外线照射时间分别为0,20,40,60,90,120,150,180,240s，后缠上封口膜置于黑色盒子中，于28℃条件下培养2～3d。计数平板上单菌落数量，计算UV照射时间的致死率，珍贵橙色束丝放线菌致死率与不同UV照射时间的关系见图1。
从图1可见，UV照射120s时的致死率为81.16％，作为UV诱变照射时间较为合适。
在菌种初筛方面，优先选择红酵母生测法。采用单菌落“移植法”，将红酵母生测平板的琼脂打孔移出，同时将目的菌株单菌落琼脂移入，培养观察其抑菌圈的大小，抑菌圈大小与其安丝菌素P-3的合成能力成正比。
PDA红酵母生测平板制备：将红酵母单菌落接种到10mLTSBY液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养。将PDA固体培养基化开，冷却至50℃左右(烫手但能够握住)。向50mL无菌EP管中加30mL已经冷却好的PDA。吸取300μL(1/100的比例)红酵母培养液，加到50mLEP管中，上下颠倒混匀(不要太剧烈，否则容易有气泡)。倒大约15mL混合液到无菌平板中(倒两个平板)，待其冷却凝固。
用无菌打孔器将待测菌株从平板上以圆柱状取出，将上面制备而成的红酵母生测平板用打孔器打出大小相同的孔，并将待测菌株放到红酵母生测平板的孔中。将平板正面朝上放在30℃恒温箱中，培养2至4天观察抑菌圈的大小，选择抑菌圈直径最大的10株突变株，进行摇瓶复筛。
将红酵母生测筛选出来的突变株的平板单菌落接种到种子培养基培养2～3天；待菌密度为0.15g/ml左右时转入发酵培基(50ml)于250ml三角瓶中，发酵培养基体积与三角瓶体积1：5；摇瓶发酵28℃，220rpm培养7天；取1ml发酵液按1：1比例加入乙醇或乙腈，充分混匀2～3min，离心取上清液进行反相高效液相检测安丝菌素P-3(AP3)含量，取产量最高突变株为目的菌株。
将摇瓶复筛出产量最高的突变株再作为初始菌株，重复进行UV诱变、红酵母生测筛选、摇瓶复筛；而且摇瓶复筛时，将初始菌株作为对照，仍然选择产量最高突变株为目的菌株。可以重复多次“UV诱变——红酵母生测筛选——摇瓶复筛”操作，以筛选到安丝菌素P-3高产菌株。
突变株CJ14是由ATCC 31565经过UV诱变，红酵母生测筛选，摇瓶复筛，并重复三次后获得的AP3产量最高的突变株。
该高产菌株于2016年4月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.M 2016214，分类命名为珍贵橙色束丝放线菌CJ14Actinosynnema pretiosum CJ14。
实施例2：培养基优化实验
优选麦芽糖、七水硫酸镁、酵母粉、豆粕水解液、缬氨酸，进行正交实验设计(5因素4水平)。五因素四水平正交设计表参见表1，单位g/L或ml/L。
表1
因素名称 水平1 水平2 水平3 水平4
麦芽糖(A) 30 40 50 60
豆粕水解液(B) 2 6 10 14
酵母粉(C) 5 10 15 20
七水硫酸镁(D) 0.25 0.50 0.75 1.00
缬氨酸(E) 0 4 8 12
实验选用珍贵橙色束丝放线菌CJ14 Actinosynnema pretiosum CJ14；
250ml三角瓶装液量30mL，每一水平设计平行样3瓶，28℃，220rpm培养7d，第3d起开始补料，每天添加0.3mL补料培养基(葡萄糖、果糖、缬氨酸)。正交设计参数表及结果参见表2，表2为在Minitab 17.0软件通过“田口”设计生成L16(45)。
表2
通过软件Minitab 17.0田口分析AP3与麦芽糖，豆粕水解液，酵母粉，七水硫酸镁，缬氨酸，其均值响应见表3。
表3
在这五种因素中，显著性结果为：酵母粉>豆粕水解液>七水硫酸镁>缬氨酸>麦芽糖，由实验结果确定的各因素的最优水平为A2B2C1D1E3，即：麦芽糖40g/L，豆粕水解液6m L/L，酵母粉5g/L，七水硫酸镁0.25g/L，缬氨酸8g/L。
实施例3：300L发酵培养工艺
珍贵橙色束丝放线菌CJ14 Actinosynnema pretiosum CJ14甘油管转入1只茄子瓶固体培养基中(固体培养基为ISP4)，于28℃培养箱中培养6天后；用无菌水将茄子瓶固体培养基表面孢子洗下，移入接种瓶，在无菌条件下转入30L发酵罐，生长温度28℃，溶氧控制为30％，并与通气搅拌关联；pH值设定7.00；
培养周期53hr，取样显微镜镜检是否染菌，菌密度0.12g/mL，种子液体积13L，转入300L发酵罐，接种量6.8％；生长温度28℃，溶氧设置30％，并与通气搅拌关联，通气比控制在1.5vvm；pH值设定7.00；初始转速100rpm，转速上限设置400rpm；起始罐压0.01Mpa。
发酵罐中采用的发酵培养基为：麦芽糖40g/L，酵母粉5g/L，豆粕水解液6mL/L，七水硫酸镁0.25g/L，缬氨酸8g/L，碳酸钙5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L；消泡剂1.5mL/L，余量为水。
补料培养基为：缬氨酸10g/L，葡萄糖25g/L，果糖25g/L，余量为水。补料方法为间隙补料；当菌体湿重大于0.20g/ml时开始补料，至第四天每天补料量为发酵体积的2％；从第四起至发酵结束，每天补料量为发酵体积的1％；
发酵培养6天，发酵液安丝菌素P-3含量为220mg/L。
实施例4：10吨发酵培养工艺
珍贵橙色束丝放线菌CJ14 Actinosynnema pretiosum CJ14甘油管转入1只茄子瓶固体培养基中(固体培养基为ISP4)，于28℃培养箱中培养6天后；用无菌水将茄子瓶固体培养基表面孢子洗下，转入10个装有500ml种子培养基的三角摇瓶，培养2天，分别取样通过显微镜镜检是否染菌，合并摇瓶种子培养基，无菌转入1吨种子罐；
培养20小时，菌密度达到0.1～0.2g/ml时，转入10吨发酵罐；发酵培养基同实施例3。
10吨发酵罐通气比控制在1.5vvm，pH控制在7.5，溶氧量控制大于30％；控制补料培养基流加速率，使发酵培养基中菌体湿重保持在0.25～0.35g/ml；
补料培养基同实施例3；补料方法为间隙补料；当菌体湿重大于0.20g/ml时开始补料，至第四天每天补料量为发酵体积的2％；从第四起至发酵结束，每天补料量为发酵体积的1％；
发酵培养6天，发酵液安丝菌素P-3含量为152.21mg/L。
实施例5：发酵液中安丝菌素P-3的检测
取发酵液5ml于10ml离心管，按体积比1：1加入乙醇或乙腈，充分混匀后；取1.5ml溶液，于小型离心机上8000rpm，离心5min；取上清液用0.22μm膜过滤器过滤两次后，进行反相高效液相检测，优选SymmetryC18 5μm 4.6×150mm。流动相为流动相A：0.05％TFA的去离子水溶液；流动相B：0.05％TFA的乙腈溶液；流速：1.0mL/min，检测波长：252nm，梯度：15分钟B由30-90％，柱温：30℃；典型图谱见图3。
图3为10吨罐发酵至161小时发酵液的液相分析图谱，安丝菌素P-3的产量为152.21mg/L，纯度为89％。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高产安丝菌素P-3的突变株，其特征在于：所述突变株为珍贵橙色束丝放线菌CJ14 Actinosynnema pretiosum CJ14，所述微生物保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO. M 2016214。
2.根据权利要求1所述的高产安丝菌素P-3的突变株，其特征在于：所述突变株是由珍贵橙色束丝放线菌ATCC 31565（Actinosynnema pretiosum）通过UV诱变与红酵母生测平板筛选得到，在进行UV诱变时采用20~40W的紫外线灯照射所述微生物100~130s。
3.一种如权利要求1或2所述的突变株在制备安丝菌素P-3中的用途，将所述的突变株进行补料分批发酵5~7天，所述的安丝菌素P-3的发酵产量大于150mg/L。
4.一种安丝菌素P-3的制备方法，其特征在于：使用如权利要求1或2所述的珍贵橙色束丝放线菌CJ14 Actinosynnema pretiosum CJ14进行补料分批发酵制备所述的安丝菌素P-3，其中，控制发酵过程中通气比为1.0~2.0vvm，发酵溶氧大于30%，pH为6.0~8.0。
5.根据权利要求4所述的安丝菌素P-3的制备方法，其特征在于：进行所述发酵时采用的发酵培养基的碳源为麦芽糖，氮源为酵母粉、豆粕水解液、缬氨酸的混合物，其中，所述的麦芽糖的浓度为30~40g/L，所述的酵母粉的浓度为3~10 g/L，所述的豆粕水解液的添加体积为所述的发酵培养基总体积的2~10mL/L，所述的缬氨酸的浓度为1~10 g/L。
6.根据权利要求5所述的安丝菌素P-3的制备方法，其特征在于：所述的发酵培养基还包括浓度为0.1~0.8 g/L的七水硫酸镁、浓度为1~5 g/L的碳酸钙、浓度为0.1~0.5 g/L的磷酸二氢钾、占所述的发酵培养基总体积0.2~1.5 mL/L的消泡剂。
7.根据权利要求4所述的安丝菌素P-3的制备方法，其特征在于：进行所述的发酵时通过加入补料培养基使所述的发酵培养基中菌体湿重保持在0.25~0.35g/mL。
8.根据权利要求5所述的安丝菌素P-3的制备方法，其特征在于：所述的补料培养基包括浓度为2~10g/L的缬氨酸、浓度为10~50g/L葡萄糖、浓度为10~50g/L的果糖。
9.根据权利要求7或8所述的安丝菌素P-3的制备方法，其特征在于：所述的补料培养基通过间隙补料方式添加，当所述的菌体湿重大于0.20 g/mL时开始补料，自开始补料至发酵第四天，每天添加补料培养基的体积为发酵总体积的2~4%；后续每天添加补料培养基的体积为发酵总体积的1~2%。
10.根据权利要求4所述的安丝菌素P-3的制备方法，其特征在于：在进行所述的发酵前，先将所述的珍贵橙色束丝放线菌CJ14 Actinosynnema pretiosum CJ14进行培养至孢子成熟，洗下孢子进行种子培养。
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