CN112646854B - 一种棘白菌素b合成培养基及应用 - Google Patents

一种棘白菌素b合成培养基及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种棘白菌素B合成培养基及制备棘白菌素B的应用，所述培养基质量浓度组成为：油酸甲酯20‑100g/L，淀粉10‑60g/L，油酸10‑30g/L，组氨酸10‑30g/L，谷氨酸5‑20g/L，L‑苏氨酸2‑5g/L，L‑鸟氨酸盐酸盐5‑8g/L，硝酸钾5‑15g/L，K2HPO4·3H2O 5‑20g/L，MgSO4·7H2O 0.1‑1g/L，MnSO4·H2O 0.1‑0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01‑0.1g/L，CaCl2 0.1‑0.5g/L，CuSO4·5H2O 0.5‑1g/L，溶剂为水，pH6.5‑7.0。本发明棘白菌素B产量达到了1950mg/L。

Description

一种棘白菌素B合成培养基及应用
(一)技术领域
本发明涉及一种培养基，特别涉及一种生产棘白菌素B的合成培养基。
(二)背景技术
近年来，由于抗生素的滥用，环境恶化，人口老龄化，真菌感染越来越引起人们的关注。真菌感染是由真菌引起的人和动物的感染性疾病。其中，念珠菌感染是我国深部感染中占比最高的，达到91％。据报道，侵袭性念珠菌感染的致死率为30％，如果不及时治疗死亡率会高达100％。因此，抗真菌感染诊断和治疗，尤其是抗真菌药物的研发成为热点。
目前市场上的抗真菌药物主要有多烯类、唑类、氟嘧啶类和棘白菌素类。烯类、唑类药物普遍存在耐药性差、毒副作用大和抗菌谱窄等问题，棘白菌素类抗真菌药毒性低、抗菌作用强、不与其他药物存在拮抗作用、不经肝脏代谢、也不存在交叉耐药性，已经成为近年来人们研究的重点。
阿尼芬净是一种棘白菌素类抗真菌药物，用于治疗侵入性念珠菌。阿尼芬净的结构为一个环六肽加一条三苯甲酰基链，是一种半合成化合物。阿尼芬净是由棘白菌素B经过酰化酶作用脱去亚油酸侧链，再经过化学修饰得到的，是合成阿尼芬净的关键前体。
培养基一般包括复合培养基、半合成培养基和合成培养基。复合培养基的优点是营养成分丰富，培养效果较好，但其缺点是成分复杂，原料质量稳定性较差，原料的产地，批次都会影响棘白菌素B的生产，使得生产产品质量稳定性也较差。目前本领域中，棘白菌素B生产用的都是复合培养基，如使用黄豆饼粉，蛋白胨，花生油等，目前本领域中尚没有应用合成培养基生产棘白菌素B的报道。
因此，为了研究发酵条件与产物合成代谢机理的关系，开发一种适用于构巢曲霉产棘白菌素B的专属合成培养基具有重要的现实意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种高产棘白菌素B的合成培养基，来解决上述现有技术中棘白菌素B发酵过程中稳定性不好，可重复性差的问题，本发明合成培养基适用于培养构巢曲霉，使之高效生产棘白菌素B。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种棘白菌素B合成培养基，所述培养基质量浓度组成为：油酸甲酯20-100g/L，淀粉10-60g/L，油酸10-30g/L，组氨酸10-30g/L，谷氨酸5-20g/L，L-苏氨酸2-5g/L，L-鸟氨酸盐酸盐5-8g/L，硝酸钾5-15g/L，K2HPO4·3H2O 5-20g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1g/L，MnSO4·H2O 0.1-0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01-0.1g/L，CaCl2 0.1-0.5g/L，CuSO4·5H2O0.5-1g/L，溶剂为水，pH6.5-7.0。
优选的，所述棘白菌素B合成培养基质量浓度组成为：油酸甲酯70-90g/L，淀粉15-20g/L，油酸15-20g/L，组氨酸10-20g/L，谷氨酸8-12g/L，L-苏氨酸3-4g/L，L-鸟氨酸盐酸盐6-7g/L，硝酸钾8-12g/L，K2HPO4·3H2O 8-10g/L，MgSO4·7H2O 0.4-0.6g/L，MnSO4·H2O0.1-0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.05-0.1g/L，CaCl2 0.1-0.3g/L，CuSO4·5H2O 0.5-0.6g/L，溶剂为水，pH6.5-7.0。
更优选的，所述棘白菌素B合成培养基质量浓度组成为：油酸甲酯70g/L，淀粉15g/L，油酸20g/L，组氨酸10g/L，谷氨酸8g/L，L-苏氨酸3.1g/L，L-鸟氨酸盐酸盐6.1g/L，硝酸钾10g/L，K2HPO4·3H2O 8g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO4·H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，CaCl2 0.3g/L，CuSO4·5H2O 0.6g/L，溶剂为水，pH6.5-7.0。
本发明还提供一种所述棘白菌素B合成培养基在合成棘白菌素B中的应用，所述应用为：将构巢曲霉接种至棘白菌素B合成培养基，25-30℃、150-160rpm下发酵240h，获得含棘白菌素B的发酵液，将发酵液分离纯化，获得棘白菌素B。
所述构巢曲霉为构巢曲霉(Aspergillus nidulans)ZJB20027，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020495，保藏日期为2020年09月14日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
所述构巢曲霉在发酵前，先进行活化和种子扩大培养，再将种子液以体积浓度10％的接种量接种至棘白菌素B合成培养基，具体为：将构巢曲霉接种活化培养基，在25℃下避光培养12-14d，获得活化的构巢曲霉；所述活化培养基终浓度组成：硝酸钾3g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，蔗糖30g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH自然；将活化的构巢曲霉用无菌接种铲挖取体积约为1cm3菌块接种至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，于25℃，160rpm摇床避光培养3d，获得种子液；所述种子培养基质量浓度组成为：谷氨酸8g/L，硝酸钾5g/L，葡萄糖10g/L，甘油10g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，CaCO3 2g/L，溶剂为水，pH 6.5-7。
进一步，所述发酵培养在发酵罐中进行，发酵条件为：发酵温度25℃，通风比1:1-1:2，搅拌转速200-600rpm，溶氧维持在25％以上。
与现有培养基相比，本发明有益效果主要体现在：目前棘白菌素B的生产尚未有合成培养基的报道，而本发明培养基化学成分明确，可重复性好。同时，均是常见的商业化化学产品，制备简单。使用本培养基棘白菌素B产量达到了2000mg/L，较初始有显著提高。
(四)附图说明
图1为棘白菌素B标准品HPLC图。
图2为发酵液棘白菌素B HPLC图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1构巢曲霉(Aspergillus nidulans)CCTCC M 2020495
构巢曲霉(Aspergillus nidulans)CCTCC M 2020495由以下步骤获得
对构巢曲霉(Aspergillus nidulans)CCTCC NO:M 2012300(已在专利申请CN2013104776708中公开)进行ARTP诱变处理，涂布至平板，培养12-14d，得诱变处理突变株，具体方法如下：
(1)将构巢曲霉(Aspergillus nidulans)CCTCC M 2012300接种至活化培养基，在25℃下避光培养12-14d，获得活化的构巢曲霉。所述活化培养基终浓度组成：硝酸钾3g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，蔗糖30g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH自然；将生长12-14d表面有墨绿色孢子的平板用无菌生理盐水洗下后置于无菌三角瓶中充分吹打震荡均匀，使孢子与菌丝打散，用无菌滤纸过滤后，制备成单孢子悬液，通过血球计数板计数，无菌生理盐水稀释单孢子悬液，控制孢子数量在107-109/mL。
(2)将常压室温等离子体(ARTP)诱变育种仪(无锡源清天木生物科技有限公司，型号：ARTP-M)操作室用酒精棉擦拭，紫外照射30min灭菌。吸取5μL制备好的孢子悬浮液与5μL的10％(v/v)甘油水溶液在无菌载片中央混合并涂抹均匀。用无菌镊子夹取处理好的载片，放置在ARTP系统操作台的孔位上，对孢子进行ARTP诱变。诱变时间为280s。设置ARTP操作参数为：载气：高纯氦气，流速设定为10L/min；输入RF功率为140W；等离子炬喷嘴与载片之间的距离为4mm；等离子流的温度为25℃。将处理结束后的载片置于盛有990μL无菌生理盐水的2mL EP管中震荡均匀后取100μL涂布在平板培养基上，25℃避光培养12-14d。所述平板培养基终浓度组成：硝酸钾3g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，蔗糖30g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH自然；
(3)用无菌接种铲挖取体积约为1cm3形态各异的菌块接种至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，于25℃，160rpm摇床避光培养3d，获得种子液。所述种子培养基质量浓度组成为(g/L)：谷氨酸8，硝酸钾5，葡萄糖10，甘油10，K2HPO4·3H2O 1，CaCO3 2，溶剂为水，pH6.5-7.0。
(4)将种子液以体积浓度10％的接种量接种至棘白菌素B筛选合成培养基，转速150rpm，25℃发酵培养10d，取发酵液，液相测定产物棘白菌素B浓度。棘白菌素B筛选合成培养基质量浓度组成为(g/L)：油酸甲酯90，淀粉20，L-苏氨酸3.1，L-鸟氨酸盐酸盐6.1，硫酸铵10，K2HPO4·3H2O 10，MgSO4·7H2O 0.8，MnSO4·H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.05，CaCl2 0.3，CuSO4·5H2O 0.6，溶剂为水，pH 6.5-7.0。将各组分加入烧杯中，加水至1L并搅拌均匀，分装至500mL的锥形瓶中，每瓶50mL，121℃灭菌20min。
(5)从近2000个突变株中挑取棘白菌素B产量最高的菌株，得到了突变菌株ZJB20027，经18S rDNA鉴定为构巢曲霉(Aspergillus nidulans)ZJB20027，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M2020495，保藏日期2020年9月14日，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072。
产物浓度测定：取1mL发酵液，4℃，12000×g离心5min，弃上清液；加入甲醇稀释5倍，混合均匀，静置萃取24h。萃取液于4℃，12000×g离心5min，取上清用0.22μm有机膜过滤后，采用液相检测棘白菌素B峰面积，根据棘白菌素B标准曲线，获得棘白菌素B浓度。
棘白菌素B标准曲线：取棘白菌素B标品，溶于甲醇中，配制成不同浓度的标品溶液(0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L)，采用液相检测。以峰面积为纵坐标，棘白菌素B浓度(g/L)为横坐标，绘制标准曲线，标准曲线y＝7.4415x-9.8659。
液相检测条件：色谱柱为C18柱(4.6mm×250mm×5μm)；流动相为甲醇：乙腈：水＝7：1：2，v/v/v；流速1mL/min；紫外检测波长222nm；进样量20μL；柱温40℃。
(6)菌种鉴定：采用18S rDNA方法进行菌种鉴定。采用土壤基因组DNA提取试剂盒(购买于MP生物医学公司)提取菌种基因组后，进行PCR扩增。所用引物为真菌菌种鉴定通用引物ITS1与ITS4。ITS1与ITS4核酸序列分别是ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC。
25μL PCR反应体系：基因组模板1μL；5×Buffer 12.5μL；dNTP 1μL；DNA聚合酶1μL；ITS1 1μL；ITS4 1μL；加双蒸水至25μL。
PCR循环条件：94℃，4min；94℃，45s；55℃，45s；72℃，1min；30个循环，72℃，10min。
将PCR产物送至擎科生物技术有限公司用PCR引物直接测序，再将18S rDNA测序结果提交到NCBI数据库，并进行BLAST比对。该菌株18S rDNA序列为541bp，将其18S rDNA序列与GenBank中的基因序列进行同源性比较，发现其与Aspergillus nidulans同源性达99.22％。即所得菌种依然是构巢曲霉。
通用引物测序结果(SEQ ID NO.1)
GATTCGAGGTGCGGGCTGCCTCCGGGCGCCCACCTCCCACCCGTGACTACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAGCCCCCCAGGGGCGAGCCGCCGGGGACCACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTGAGCCTGAATACAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCGATTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGGCGTCTCCAACCTTATTTTTCTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAG
表1：不同合成培养基的组分及质量浓度
Figure BDA0002829273830000061
表1中培养基的各组分加入烧杯中，加水至1L并搅拌均匀，分装至500mL的锥形瓶中，每瓶50mL，121℃灭菌20min，即得发酵棘白菌素B的合成培养基。
对比例1
将构巢曲霉(Aspergillus nidulans)CCTCC M 2012300接种至活化培养基，在25℃下避光培养12-14d，获得活化的构巢曲霉。所述活化培养基终浓度组成：硝酸钾3g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，蔗糖30g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH自然；
将活化的构巢曲霉用无菌接种铲挖取体积约为1cm3菌块接种至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，于25℃，160rpm摇床避光培养3d，获得种子液。所述种子培养基质量浓度组成为(g/L)：谷氨酸8，硝酸钾5，葡萄糖10，甘油10，K2HPO4·3H2O 1，CaCO3 2，溶剂为水，pH 6.5-7.0。
将种子液以体积浓度10％的接种量接种至表1的培养基1，转速150rpm，25℃发酵培养10d，取发酵液，采用实施例1方法测定棘白菌素B产量达到了450mg/L。
实施例2-8
对比例1同样条件下，将培养基1替换为表1中培养基2-培养基8，对应的棘白菌素B的产量分别为568mg/L、1023mg/L、1196mg/L、1612mg/L、1359mg/L、1584mg/L、1877mg/L，结果见表2。
实施例9
将对比例1培养基改为表1中培养基5，将种子液按体积浓度10％的接种量接入装有3L发酵棘白菌素B合成培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，发酵培养240h，整个发酵培养过程中，控制发酵温度25℃，通风比1:1.8，450rpm发酵结束后，棘白菌素B的产量达到了1600mg/L。
实施例10
将对比例1培养基改为表1中培养基8，将种子液按体积浓度10％的接种量接入装有3L发酵棘白菌素B合成培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，发酵培养240h，整个发酵培养过程中，控制发酵温度25℃，通风比1:1.5，550rpm，溶氧维持在25％以上。发酵结束后，棘白菌素B的产量达到了1950mg/L。
实施例11
将对比例1培养基改为表1中培养基8，将种子液按体积浓度5％接种量接入装有30L发酵棘白菌素B合成培养基的50L发酵罐中进行发酵培养，发酵培养240h，整个发酵培养过程中，控制发酵温度25℃，通风比1:1.2，搅拌转速250rpm。发酵结束后，棘白菌素B的产量达到了1800mg/L。
表2：不同实施例中棘白菌素B的产量
Figure BDA0002829273830000071
对照组中使用硫酸铵作为无机氮源，ECB产量明显的低于实验组。在实验组中通过将硫酸铵换成更合适的硝酸钾，同时优化了油酸甲酯，油酸的添加量，使得棘白菌素B的产量显著提高。后续又通过优化筛选到的谷氨酸，组氨酸添加量，进一步的提高了ECB的产量，使得棘白菌素B的产量从450mg/L，提高到了1800mg/L。其后使用优化后的合成培养基在5L和50L发酵罐中培养，棘白菌素B的产量均在1600mg/L以上。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种棘白菌素B合成培养基及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 541
<212> DNA
<213> 构巢曲霉(Aspergillus nidulans)
<400> 1
gattcgaggt gcgggctgcc tccgggcgcc cacctcccac ccgtgactac ctaacactgt 60
tgcttcggcg gggagccccc caggggcgag ccgccgggga ccactgaact tcatgcctga 120
gagtgatgca gtctgagcct gaatacaaat cagtcaaaac tttcaacaat ggatctcttg 180
gttccggcat cgatgaagaa cgcagcgaac tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca 240
gtgaatcatc gagtctttga acgcacattg cgccccctgg cattccgggg ggcatgcctg 300
tccgagcgtc attgctgccc tcaagcccgg cttgtgtgtt gggtcgtcgt cccccccggg 360
ggacgggccc gaaaggcagc ggcggcaccg tgtccggtcc tcgagcgtat ggggctttgt 420
cacccgctcg attagggccg gccgggcgcc agccggcgtc tccaacctta tttttctcag 480
gttgacctcg gatcaggtag ggatacccgc tgaacttaag catatcaata agcggaggaa 540
g 541

Claims (6)

1.一种棘白菌素B合成培养基，其特征在于所述培养基质量浓度组成为：油酸甲酯20-100 g/L，淀粉10-60 g/L，油酸10-30 g/L，组氨酸10-30 g/L，谷氨酸5-20 g/L，L-苏氨酸2-5 g/L，L-鸟氨酸盐酸盐5-8 g/L，硝酸钾5-15 g/L，K2HPO4·3H2O 5-20 g/L，MgSO4·7H2O0.1-1 g/L，MnSO4·H2O 0.1-0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01-0.1 g/L，CaCl2 0.1-0.5 g/L，CuSO4·5H2O 0.5-1 g/L，溶剂为水，pH6.5-7.0。
2.如权利要求1所述棘白菌素B合成培养基，其特征在于所述棘白菌素B合成培养基质量浓度组成为：油酸甲酯70-90 g/L，淀粉15-20 g/L，油酸15-20 g/L，组氨酸10-20 g/L，谷氨酸8-12 g/L，L-苏氨酸3-4 g/L，L-鸟氨酸盐酸盐6-7g/L，硝酸钾8-12 g/L，K2HPO4·3H2O8-10 g/L，MgSO4·7H2O 0.4-0.6 g/L，MnSO4·H2O 0.1-0.2 g/L，FeSO4·7H2O 0.05-0.1 g/L，CaCl2 0.1-0.3 g/L，CuSO4·5H2O 0.5-0.6 g/L，溶剂为水，pH6.5-7.0。
3.如权利要求1所述棘白菌素B合成培养基，其特征在于所述棘白菌素B合成培养基质量浓度组成为：油酸甲酯70 g/L，淀粉15 g/L，油酸20 g/L，组氨酸10 g/L，谷氨酸8 g/L，L-苏氨酸3.1 g/L，L-鸟氨酸盐酸盐6.1 g/L，硝酸钾10 g/L，K2HPO4·3H2O 8 g/L，MgSO4·7H2O0.5 g/L，MnSO4•H2O 0.2 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，CaCl2 0.3 g/L，CuSO4·5H2O 0.6 g/L，溶剂为水，pH6.5-7.0。
4.一种权利要求1所述棘白菌素B合成培养基在合成棘白菌素B中的应用，其特征在于所述应用为：将构巢曲霉接种至棘白菌素B合成培养基，25-30℃、150-160rpm下发酵240h，获得含棘白菌素B的发酵液，将发酵液分离纯化，获得棘白菌素B；所述构巢曲霉为构巢曲霉（Aspergillus nidulans）CCTCC M 2012300。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述构巢曲霉在发酵前，先进行活化和种子扩大培养，再将种子液以体积浓度10%的接种量接种至棘白菌素B合成培养基，所述活化和种子扩大培养方法为：将构巢曲霉接种活化培养基，在25ºC下避光培养12-14天，获得活化的构巢曲霉；所述活化培养基终浓度组成：硝酸钾3 g/L，磷酸氢二钾1 g/L， MgSO4·7H2O 0.5g/L，氯化钾0.5 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，蔗糖30 g/L，琼脂20 g/L，溶剂为水，pH自然；将活化的构巢曲霉接种至种子培养基中，于25℃，160 rpm摇床避光培养3 d，获得种子液；所述种子培养基质量浓度组成为：谷氨酸8 g/L，硝酸钾5 g/L，葡萄糖10 g/L，甘油10 g/L，K2HPO4•3H2O1 g/L，CaCO3 2 g/L，溶剂为水，pH 6.5-7。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述发酵培养在发酵罐中进行，发酵条件为：发酵温度25℃，通风比1:1-1:2，搅拌转速200-600 rpm，溶氧维持在25％以上。
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