CN116200297B - 一种高产四氢嘧啶的嗜盐独岛枝芽孢杆菌及其培养方法与应用 - Google Patents

一种高产四氢嘧啶的嗜盐独岛枝芽孢杆菌及其培养方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高产四氢嘧啶的嗜盐独岛枝芽孢杆菌及其培养方法与应用。本发明中的嗜盐独岛枝芽孢杆菌(Virgibacillusdokdonensis)VD2211，于2022年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号CCTCC NO.M 20221944。该菌株可以在盐浓度为30～80g/L的条件下生长和持续发酵，并且能够产生四氢嘧啶，其发酵液中四氢嘧啶最高积累量达到20～22g/L。该菌株可以应用于四氢嘧啶的大规模工业化生产中，提高四氢嘧啶的产量，降低四氢嘧啶的成本。

Description

一种高产四氢嘧啶的嗜盐独岛枝芽孢杆菌及其培养方法与 应用
技术领域
本发明涉及一种高产四氢嘧啶的嗜盐独岛枝芽孢杆菌及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
依克多因，化学名称为1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，又称四氢嘧啶，是一种环状氨基酸衍生物，是微生物为适应一系列恶劣环境而产生的一种天然保护性物质，广泛分布在嗜盐菌、真菌以及盐藻细胞中。四氢嘧啶经试验证实具有抗紫外、补水保湿和对反应性皮炎、神经性皮炎有一定的治疗效果。四氢嘧啶这几年应用十分广泛，在生物保护、生物医药和科技领域都有一席之地。由于化学合成四氢嘧啶的前体物价格昂贵，且四氢嘧啶分子中有一个手性碳原子，所以很难用化学法合成，目前四氢嘧啶的主要生产方法为发酵法和酶催化法。
目前所报道的专利和文献中，生产四氢嘧啶所采用的方法为“挤奶法”，即在低盐浓度中培养，用高浓度盐多次低渗冲击获得比较高的四氢嘧啶产量。但是该方法对设备要求高，高盐浓度对设备损害大，而且在高-低盐浓度的多次冲击下，细胞后期几乎不再生长，以及不产生四氢嘧啶，四氢嘧啶产量仅在10～15g/L。天津科技大学通过改造谷氨酸棒杆菌获得的基因工程菌，在发酵条件下可得到四氢嘧啶21g/L。但是该实验操作过程复杂，可复制性较低，且产物为四氢嘧啶衍生物，后期需要进一步的分离提取纯化，生产成本高。
因此筛选获得较低盐浓度下生长发酵，且生成四氢嘧啶的菌株对于四氢嘧啶的工业化生产具有重要的意义。
发明内容
一株高产四氢嘧啶的嗜盐独岛枝芽孢杆菌(Virgibacillusdokdonensis)VD2211，于2022年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号CCTCC NO.M 20221944。
根据本发明优选的，所述嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211的16S rDNA的基因序列如SEQ IDNO.1所示。
根据本发明优选的，所述嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211是以菌种YT-357为出发菌株，经He-Ne激光诱变、紫外诱变和亚硝基胍诱变后得到。
进一步优选的，所述He-Ne激光诱变为：使用波长为632.8nm，光斑直径为1.5mm的He-Ne激光器照射25min，照射距离为25cm，输出功率为15mW。
进一步优选的，所述紫外诱变为：在离紫外灯5～10cm位置处照射30s。
进一步优选的，所述亚硝基胍诱变为：添加终浓度为0.75g/L的亚硝基胍。
上述嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211的培养方法，步骤如下：
(1)取嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211接种至种子培养基中，在摇床转速为200～240rpm、29～38℃下培养24～36h，得到种子液；
(2)将种子液按照5～10％的接种量接入发酵培养基中，在摇床转速为200～240rpm、29～38℃下发酵培养48～96h，得到嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211的菌液。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述种子培养基组分为：葡萄糖10-30g/L，酵母粉5-10g/L，柠檬酸1-3g/L，氯化钾2-4g/L，磷酸氢二钾5-10g/L，七水硫酸镁10-20g/L，氯化钠10-30g/L，硫酸铵10-20g/L，pH 7.0～7.4。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述发酵培养基组分为：氯化钠30-80g/L，七水硫酸镁5-15g/L，氯化钾2-5g/L，植物水解蛋白20-40g/L，硫酸铵10-20g/L，磷酸氢二钾5-10g/L，柠檬酸1-5g/L，葡萄糖10-50g/L，pH 7.0～7.4。
上述嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211在生产四氢嘧啶中的应用。
有益效果：
1、本发明通过筛选和诱变得到一株高产四氢嘧啶的嗜盐独岛枝芽孢杆菌(Virgibacillusdokdonensis)VD2211，它可以在盐浓度为30～80g/L的条件下生长和持续发酵，并且能够产生四氢嘧啶，其发酵液中四氢嘧啶最高积累量达到20～22g/L。该菌株可以应用于四氢嘧啶的大规模工业化生产中，提高四氢嘧啶的产量，降低四氢嘧啶的成本。
2、本发明提供的高产四氢嘧啶的嗜盐独岛枝芽孢杆菌(Virgibacillusdokdonensis)VD2211可以在较低盐浓度下生长发酵，无需使用高浓度盐就可以产生四氢嘧啶，可以减少发酵设备耐盐度的要求，进一步降低四氢嘧啶的生产成本。
附图说明
图1为四氢嘧啶标准品的高效液相色谱图。
图2为实施例6中嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211菌液的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源：嗜盐独岛枝芽孢杆菌(Virgibacillusdokdonensis)VD2211，于2022年12月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号保藏编号CCTCC NO.M 20221944。
种子培养基组分为：葡萄糖10-30g/L，酵母粉5-10g/L，柠檬酸1-3g/L，氯化钾2-4g/L，磷酸氢二钾5-10g/L，七水硫酸镁10-20g/L，氯化钠10-30g/L，硫酸铵10-20g/L，pH7.0～7.4。
发酵培养基组分为：氯化钠30-80g/L，七水硫酸镁5-15g/L，氯化钾2-5g/L，植物水解蛋白20-40g/L，硫酸铵10-20g/L，磷酸氢二钾5-10g/L，柠檬酸1-5g/L，葡萄糖10-50g/L，pH 7.0～7.4。
Gibbons改良固体培养基组分为：酸水解酪蛋白5g，酵母膏10g，蛋白胨5g，柠檬酸三钠3g，氯化钾2g，七水硫酸镁20g，琼脂20g，氯化钠70g，海水1000mL，pH 7.0～7.2。
Gibbons改良液体培养基组分为：酸水解酪蛋白5g，酵母膏10g，蛋白胨5g，柠檬酸三钠3g，氯化钾2g，七水硫酸镁20g，氯化钠70g，海水1000mL，pH 7.0～7.2。
实施例中培养基的配制原料均为本领域常用原料。
实施例1、菌株筛选
1、菌株初筛
将采集于烟台沿海海域的海泥样品于无菌水中进行稀释10倍，置于摇床上150r/min振荡30min充分混匀，然后再依次稀释104、105和106倍，分别吸取20mL稀释液均匀涂布在Gibbons改良固体培养基上，25℃倒置培养72h，直到Gibbons改良固体培养基上生长出形态各异的单菌落，将各个单菌落重复划线接种于Gibbons改良固体培养基，直至纯化得到单菌落，使用60％(v/v)甘油(3:7；甘油:菌液)将各个单菌落保存在-80℃。
2、菌株复筛
将上述保种的单菌落分别划线接种至NaCl梯度浓度为的30、40、50、60、70和80g/L的Gibbons改良固体培养基上，于25℃恒温培养，分离适应盐浓度范围广的菌株，保种记为YT-357。
3、发酵培养
取菌种YT-357接种至种子培养基中，在37℃下培养30h，得到种子液；将种子液按照5％的接种量接入发酵培养基中，在37℃下发酵培养72h，得到菌种YT-357的菌液。
采用HPLC法测定菌种YT-357菌液中四氢嘧啶的含量，结果为3.6g/L。
实施例2、He-Ne激光诱变育种
1、将实施例1培养72h的菌种YT-357用无菌水冲洗，冲洗液盛放在已灭菌的含有玻璃珠的三角瓶中，在往复式摇床上于150r/min、37℃充分振荡培养30min，使菌株充分分散，得到菌种YT-357细胞含量为1×106个/mL的菌悬液。
2、用灭菌的移液管吸取2mL菌悬液，装入无菌试管(直径1cm，壁厚0.1cm)中，使用He-Ne激光器(波长为632.8nm，光斑直径为1.5mm)照射，照射距离为25cm，输出功率为15mW，照射时间分别设置为5、10、15、20、25和30min，得到诱变后的菌悬液。然后以原菌悬液作为空白对照组每个试验组均重复3次，确定最佳诱导时间25min。
3、将诱变后的菌悬液依次稀释104、105和106倍后均匀涂布NaCl梯度浓度为的80、90、100、110、120、130、140和150g/L的Gibbons改良固体培养基上，收集在高浓度盐Gibbons改良固体培养基上长出的单菌落，按照相同的方法进行在含有NaCl的Gibbons改良液体培养基的摇瓶中复筛，经过大量筛选得到一株嗜盐且高产四氢嘧啶的菌株，保种记为HN-2589。
4、发酵培养
取菌种HN-2589接种至种子培养基中，在37℃下培养30h，得到种子液；将种子液按照5％的接种量接入发酵培养基中，在37℃下发酵培养72h，得到菌种HN-2589的菌液。
采用HPLC法测定菌种HN-2589菌液中四氢嘧啶的含量，结果为9.5g/L。
实施例3、紫外诱变育种
1、将实施例2培养72h的菌种HN-2589用无菌水冲洗，冲洗液盛放在已灭菌的含有玻璃珠的三角瓶中，在往复式摇床上于150r/min、37℃充分振荡培养30min，使菌株充分分散，得到菌种HN-2589细胞含量为1×106个/mL的菌悬液。
2、用灭菌的移液管吸取2mL菌悬液，加入无菌的培养皿中，放置在离紫外灯5～10cm位置处，分别照射15s、30s、60s、90s、120s，得到诱变后的菌悬液。然后以未经照射的菌悬液作为空白对照组，计算致死率在85～90％的剂量为最佳照射剂量，确定照射时间为30s。
3、将诱变后的菌悬液依次稀释104、105和106倍后均匀涂布NaCl梯度浓度为的80、90、100、110、120、130、140和150g/L的Gibbons改良固体培养基上，收集在高浓度盐Gibbons改良固体培养基上长出的单菌落，按照相同的方法进行在含有NaCl的Gibbons改良液体培养基的摇瓶中复筛，经过大量筛选得到一株嗜盐且高产四氢嘧啶的菌株，保种记为HN-UV-5518。
4、发酵培养
取菌种HN-UV-5518接种至种子培养基中，在37℃下培养30h，得到种子液；将种子液按照5％的接种量接入发酵培养基中，在37℃下发酵培养72h，得到菌种HN-UV-5518的菌液。
采用HPLC法测定菌种HN-UV-5518菌液中四氢嘧啶的含量，结果为16.1g/L。
实施例4、亚硝基胍诱变育种
1、将实施例2培养72h的菌种HN-UV-5518用无菌水冲洗，冲洗液盛放在已灭菌的含有玻璃珠的三角瓶中，在往复式摇床上于150r/min、37℃充分振荡培养30min，使菌株充分分散，得到菌种HN-UV-5518细胞含量为1×106个/mL的菌悬液。
2、用灭菌的移液管吸取1mL菌悬液，加入无菌的离心管中，分别加入终浓度为0.25g/L、0.5g/L、0.75g/L、1.0g/L的亚硝基胍，得到诱变后的菌悬液。然后未加入亚硝基胍的菌悬液作为空白对照组，放置摇床孵育30min，计算致死率在85-90％的剂量为最佳亚硝基胍浓度为0.75g/L。
3、将诱变后的菌悬液依次稀释104、105和106倍后均匀涂布NaCl梯度浓度为的80、90、100、110、120、130、140和150g/L的Gibbons改良固体培养基上，收集在高浓度盐Gibbons改良固体培养基上长出的单菌落，按照相同的方法进行在含有NaCl的Gibbons改良液体培养基的摇瓶中复筛，经过大量筛选得到一株嗜盐且高产四氢嘧啶的菌株，命名为VD2211。
实施例5、菌株的鉴定
收集实施例4培养的菌株VD2211菌体，利用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，按照试剂盒要求提取基因组。以提取到的基因组为模板，利用16S rDNA通用引物(27F/1495R)对16S rDNA基因扩增，PCR产物经过胶回收纯化，进行序列测定，测定由上海生工生物工程技术有限公司进行。
PCR引物采用通用引物：
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，
1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTTC-3'，
PCR反应体系为：10×PCR Buffer+dNTP(each 10mM)+Taq Plus DNA Polymerase(5U/μl)共12.5μl，引物F(10μM)1μl，引物R(10μM)1μl，Template(DNA)1μl，ddH2O 9.5μl，总体系25μl。
PCR反应条件为：温度为95℃预变性5min；94℃变性30s；57℃退火30s；72℃延伸90s；30个循环，72℃延伸5min，4℃保存。
测得菌株的16S rDNA序列见序列表SEQ No.1所示，并将所得到的全序列上传到NCBI网站上进行序列比对，经过16SrDNA比对，将该菌株鉴定为嗜盐独岛枝芽孢杆菌(Virgibacillusdokdonensis)，命名为嗜盐独岛枝芽孢杆菌VirgibacillusdokdonensisVD2211。
实施例6、菌株的发酵培养
一种嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211的培养方法，步骤如下：
(1)取嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211接种至种子培养基中，在摇床转速为220rpm、37℃下培养24h，得到种子液；
(2)将种子液按照10％的接种量接入发酵培养基中，在摇床转速为220rpm、37℃下发酵培养96h，得到嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211的菌液。
将嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211的菌液经过1000r/m离心10min，取上清液稀释100倍后采用HPLC法测定嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211的菌液中四氢嘧啶的含量，并同时采用HPLC法测定四氢嘧啶标准品，结果分别如图1和图2所示。
由图1和图2可知，嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211的菌液中含有四氢嘧啶，通过发酵培养嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211可以制备得到四氢嘧啶，嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211菌液中四氢嘧啶的含量为21.3g/L。
通过以上数据可知，本发明通过筛选和诱变得到一株高产四氢嘧啶的嗜盐独岛枝芽孢杆菌(Virgibacillusdokdonensis)VD2211，它可以在盐浓度为30～80g/L的条件下生长和持续发酵，并且能够产生四氢嘧啶，其发酵液中四氢嘧啶最高积累量达到20～22g/L。该菌株可以应用于四氢嘧啶的大规模工业化生产中，提高四氢嘧啶的产量，降低四氢嘧啶的成本。

Claims (5)

1.一株高产四氢嘧啶的嗜盐独岛枝芽孢杆菌（Virgibacillus dokdonensis）VD2211，于2022年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号CCTCC NO. M 20221944。
2.权利要求1所述的嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211的培养方法，其特征在于，步骤如下：
（1）取嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211接种至种子培养基中，在摇床转速为200~240rpm、29~38℃下培养24~36 h，得到种子液；
（2）将种子液按照5~10%的接种量接入发酵培养基中，在摇床转速为200~240rpm、29~38℃下发酵培养48~96h，得到嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211的菌液。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）中，所述种子培养基组分为：葡萄糖10-30 g/L，酵母粉 5-10 g/L，柠檬酸1-3 g/L，氯化钾 2-4 g/L，磷酸氢二钾5-10 g/L，七水硫酸镁10-20 g/L，氯化钠10-30 g/L，硫酸铵10-20 g/L，pH 7.0~7.4。
4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述发酵培养基组分为：氯化钠 30-80 g/L，七水硫酸镁 5-15 g/L，氯化钾2-5 g/L，植物水解蛋白20-40 g/L，硫酸铵10-20 g/L，磷酸氢二钾5-10 g/L，柠檬酸1-5 g/L，葡萄糖10-50 g/L，pH 7.0~7.4。
5.权利要求1所述的嗜盐独岛枝芽孢杆菌VD2211在生产四氢嘧啶中的应用。
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