CN101665779A - 一株诱变得到的高产稳定产凝乳酶的枯草芽孢杆菌及应用 - Google Patents
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Abstract
一株诱变得到的高产稳定产凝乳酶的枯草芽孢杆菌及应用。发明所用出发菌株是本实验室筛选所得的用于发酵产生干酪等产品的枯草芽孢杆菌，于2008年2月保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏名为枯草芽孢杆菌QL－2(Bacillus subtilis QL2)，保藏号M208023。其诱变选育步骤包括：以保存于CCTCC、菌种保藏号M208023的枯草芽孢杆菌QL－2作为出发菌株，依次于复壮培养基、发酵培养基上培养，得到出发菌株悬液；将菌悬液用涡旋装置制成单孢子悬液后；再将此单孢子悬液进行多次紫外诱变和培养，最后得到可稳定高产凝乳酶的枯草芽孢杆菌YB－3(Bacillus subtilis YB－3，CCTCC NO：M209075)。该可稳定高产凝乳酶的枯草芽孢杆菌可用于液体发酵制备凝乳酶粗酶液，这些凝乳酶粗酶液可用制备奶酪和干酪素，缩短牛奶凝固时间。
Description
技术领域
本发明为一株诱变得到的高产稳定产凝乳酶的枯草芽孢杆菌及应用。具体来说，是涉及一株可高产凝乳酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YB-3，于2009年4月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，电话：(027)68754052，传真：(027)68754833，E-mail：cctcc@whu.edu.cn，其保藏号为CCTCC NO：M209075，及其诱变选育方法，属于食品生物技术领域。
背景技术
凝乳酶〔EC4.4.1.4)属于酸性蛋白酶，又称天冬氨酸蛋白酶，是生产干酪不可缺少的制剂，其产值占整个酶制剂总产值的15.5％。目前该酶的主要来源是未断奶小牛胃粘膜、部分植物组织和微生物。
凝乳酶的传统来源是哺乳期小牛的皱胃，动物凝乳酶以其凝乳活力与蛋白水解能力的高比值而成为制作奶酪的首选酶。但是动物生长缓慢且价格昂贵，容易增加企业生产成本，并且从动物中提取酶液程序和工艺较复杂。木瓜、无花果、菠萝、南瓜、合欢树、银杏等植物中都含有能使乳凝固的蛋白酶。植物来源的凝乳酶因有太高的蛋白水解活力或本身有毒，因此很多植物性凝乳酶没有得到大规模商业化应用。微生物凝乳酶来源广泛，目前发现有40余种微生物可生产一定量的凝乳酶。例如，芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、总状毛霉(Mucor-racelnosus)、乳白耙霉(Irpex-lacteus)、易脆毛霉(Mucor fragilis)、米黑毛霉(Mucor-michei)、寄生内座壳菌(Endothia parasitisa)等。微生物生长快，繁殖周期短，生长和产酶过程容易控制，且微生物所产的凝乳酶是一种胞外酶，提取方便，成本低。
枯草芽孢杆菌作为微生物源生产凝乳酶的为数不多的细菌，与霉菌比较具有许多优势：
生长速率快，发酵产酶周期在1-3天之间。而霉菌的发酵周期为7天；好氧生长，抗剪切力能力较强，可通过提高搅拌转速来加快菌体生长。霉菌生长产生大量菌丝体，容易受到剪切损伤，影响产酶。但到目前为止，其产生的凝乳酶活性和霉菌相比，还有一定差距。而且枯草芽孢杆菌产生的凝乳酶存在蛋白水解活性高的缺陷，影响奶酪的风味和口感。
本发明采用紫外或者化学诱变的方法，并采用合适的诱变模型可以筛选出稳定的高产的菌株，筛选出的菌株在快速生长的同时，也能产生大量的凝乳酶，并且具有比较低的蛋白水解活性，来弥补上述缺陷。
发明内容
本发明的目的在于通过对枯草芽孢杆菌野生菌株的诱变，得到具有高产凝乳酶能力的突
变株，并且该突变株所产的凝乳酶具有添加量低、催化位点专一、蛋白水解能力低、快速凝固等特点。
本发明的目的在于提供一株通过紫外诱变得到的具有高产凝乳酶能力的细菌-枯草芽孢杆菌的突变株-枯草芽孢杆菌YB-3，使其能经发酵生产出在牛奶等原料乳中添加量低，催化位点专一，蛋白水解能力低，具有凝固作用的凝乳酶。
本发明的目的通过以下技术路线实现：
本发明提供的可高产凝乳酶的枯草芽孢杆菌的诱变选育方法，其诱变步骤如下：
(1)菌种保藏。
出发菌株枯草芽孢杆菌QL-2，CCTCC NO：M208023(于2008年2月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，电话：(027)68754052，传真：(027)68754833，E-mail：cctcc@whu.edu.cn)分别保藏于含有30％甘油的改良NA液体培养基，分别置于-20℃和-80℃低温冰箱，半年接种复壮一次。
所述培养基组成(g/L)：蛋白胨5，牛肉膏3，葡萄糖10，酵母浸膏1，pH＝7.0。于121℃灭菌20分钟。
(2)出发菌株的培养
以枯草芽孢杆菌QL-2为出发菌株；将出发菌株接种于灭菌的改良NA液体培养基上28～30℃复壮培养2-3代；再将培养稳定的菌株接种于灭菌液体酪蛋白培养基中培养2代，使其达到正常的生长周期，即得到出发菌株，备用；
所述酪蛋白培养基组成为(g/L)：干酪素10，牛肉膏3，NaH2PO4·12H2O5，NaCl 5，pH＝7.0。于121℃灭菌20分钟。
(3)出发菌株单孢子悬液的制备
将步骤(2)中处于对数生长期的出发菌株菌液5ml于5000r/min离心10min；去上清，加灭菌的生理盐水3～5ml，轻微震荡洗涤菌体后，5000r/min离心10min，此步骤重复操作2～3次；去上清后，用斡旋器打散菌体，制备成菌悬液。用显微计数法，调整细胞浓度为107/ml。
(4)菌体的紫外诱变和中间培养
将制备好单孢子悬液吸取3ml移入φ6cm的无菌平皿，使液层厚度在0.3～0.5cm；进行紫
外诱变，紫外线诱变所用紫外灯功率为25W，照射时间为0.5～3min，照射距离10～30cm；照射后吸取1ml至用于中间培养的改良NA液体培养基和酪蛋白液体培养基中，27～35℃培养4～8h。采取十倍稀释法稀释经过中间培养的诱变菌体，取上述104～106三个稀释度的菌液0.25ml分别涂布于酪蛋白水解平板和脱脂牛奶平板上，27～35℃培养2～3天，进行初筛，挑取5个菌落生长速度较快，酪蛋白平板凝乳圈较大的单菌落，每个三个平行进行摇瓶发酵复筛，用IDF的相对牛奶凝结活力实验(REMCAT)测定凝乳酶活力。选择凝乳酶产量高，并且可以稳定传代3代以上的菌株，重复上述步骤进行紫外诱变及筛选，剔除菌种退化，生长速度下降，蛋白酶活力过高或产酶性能下降的菌株，保留生长速度快，产凝乳酶性能优良、稳定遗传的菌株、凝乳酶产量较高的枯草芽孢杆菌YB-3。
所述的用于中间培养的酪蛋白培养基按以下比例配制：干酪素10g，牛肉膏3g，NaH2PO4·12H2O 5g，NaCl 5g，CaCl21g，pH＝7.0。于121℃灭菌20分钟。
所述的凝乳酶测定方法参照IDF的方法157A：1997。
所述的蛋白酶测定方法参照改良的Lorry法。
(5)枯草芽孢杆菌YB-3的传代稳定性实验
将YB-3接种到灭菌液体培养基上，27～32℃摇瓶培养48h，取24h及48h发酵液，离心除去菌体，测定发酵液中凝乳酶的活力和蛋白酶活力。摇瓶培养48h转接到灭菌液体培养基中，27～32℃摇瓶培养48h，测定酶活，重复此步骤10次以上。
所述的传代培养基为酪蛋白培养基按以下比例配制：干酪素10g，牛肉膏3g，NaH2PO4·12H2O 5g，NaCl 5g，pH＝7.0。间歇式灭菌。
所述的间歇式灭菌为枯草芽孢杆菌培养基特有灭菌方式。步骤如下：
分装培养基后，121℃灭菌20min。
待经过初次灭菌的培养基冷却后，置于恒温摇床30℃震荡培养8h。
震荡培养过夜的培养基于121℃再次灭菌20min，冷却后4℃低温保存。
本发明提供的可高产凝乳酶的诱变选育方法，还包括将可得到高产菌株-枯草芽孢杆菌YB-3保存在液体培养基上，分别于-20℃和-80℃保藏，每半年转接一次。转接用于该菌株的正常传代，以防止菌株退化。
所述液体培养基按以下比例配制：蛋白胨5，牛肉膏3，葡萄糖10，酵母浸膏1，pH＝7.0。于121℃灭菌20分钟。
该可稳定高产凝乳酶的枯草芽孢杆菌可用于液体发酵制备凝乳酶粗酶液，这些凝乳酶粗酶液可用制备奶酪和干酪素，缩短牛奶凝固时间。
与现有技术相比，本发明提供的可高产凝乳酶的枯草芽孢杆菌及其制备方法优点在于：
(1)诱变方法不复杂，操作方便，诱变提高活力达170％；
(2)用该菌株发酵产酶过程比传统的霉菌相比，缩短生产周期达80％，降低发酵成本，使凝乳酶在曲拉大量优质生产中的应用成为可能；
(3)诱变育种的高产菌株可用于制备微生物食品用添加剂；
(4)诱变育种的高产菌株可用于制备微生物工业用添加剂；
(5)菌株稳定性良好，经过多次发酵生产，可保证其生产性能不发生较大程度的下降。
具体实施方式
实施例1、诱变育种发明的可高产凝乳酶的枯草芽孢杆菌YB-3
按照本发明提供诱变选育方法，诱变选育可高产凝乳酶的枯草芽孢杆菌，其步骤如下：
(1)出发菌株的培养
以本实验室筛选出的菌株枯草芽孢杆菌QL-2作为出发菌株；
将出发菌株枯草芽孢杆菌QL-2接种于灭菌的改良NA液体培养基上，30℃复壮培养2代；再将该稳定生长的菌株接种于灭菌液体酪蛋白培养基中培养2代，使其达到正常的生长周期，即得到出发菌株，备用：
所述酪蛋白培养基组成为(g/L)：干酪素10，牛肉膏3，NaH2PO4·12H2O5，NaCl 5，pH＝7.0。于121℃灭菌20分钟。
(2)出发菌株单孢子悬液的制备
取步骤(1)中处于对数生长期的出发菌株枯草芽孢杆菌QL-2的菌液5ml，5000r/min离心10min；倾去上清，加灭菌的生理盐水3ml，轻微震荡洗涤菌体后，5000r/min离心10min，此步骤重复操作2次；去上清后，用斡旋器打散菌体，制备成菌悬液。用显微计数法，调整细胞浓度为107/ml。
(3)菌体的紫外诱变和中间培养
将制备好的单孢子悬液吸取3ml移入φ6cm的无菌平皿中，液层厚度达到0.4cm左右；进行紫外诱变，紫外线诱变所用紫外灯功率为25W，照射时间为120s，照射距离25cm；在避光情况下，吸取经紫外灯照射的菌液1ml，加入改良NA液体培养基进行中间培养，28℃摇瓶培养8h。取出经过中间培养的菌液，采取十倍稀释的方法稀释菌液，吸取上述104～106三个稀释度的菌液0.25ml，分别涂布于酪蛋白水解平板，28℃培养2天。进行初筛，挑取4个菌落生长速度较快，酪蛋白平板凝乳圈较大的单菌落，接种于酪蛋白液体培养基中，摇瓶发酵复筛：采用IDF的相对牛奶凝结活力实验(REMCAT)测定凝乳酶活力。选择凝乳酶产量高，并且可以稳定传代3代以上的菌株，重复上述步骤进行紫外诱变及筛选，剔除菌种退化，生长速度下降，蛋白酶活力过高或产酶性能下降的菌株，保留生长速度快，产凝乳酶性能优良、稳定遗传的菌株、凝乳酶产量较高的枯草芽孢杆菌YB-3。
所述的用于中间培养的酪蛋白培养基按以下比例配制：干酪素10g，牛肉膏3g，NaH2PO4·12H2O 5g，NaCl 5g，CaCl21g，pH＝7.0。于121℃灭菌20分钟。
所述的凝乳酶测定方法参照IDF的方法157A：1997。
所述的蛋白酶测定方法参照改良的Lorry法。
凝乳酶高产菌株枯草芽孢杆菌YB-3的传代稳定性实验
将凝乳酶高产菌株枯草芽孢杆菌YB-3接种到灭菌液体培养基上，28℃摇瓶培养48h，取24h及48h发酵液，离心除去菌体，测定发酵液中凝乳酶的活力和蛋白酶活力。摇瓶培养48h转接到灭菌液体培养基中，28℃摇瓶培养48h，测定酶活，重复此步骤10次。此时，出发菌株与诱变菌株(第十代)的凝乳酶活性及蛋白酶活力如表1所示：
表1、出发菌株与诱变菌株(第十代)的凝乳酶活性及蛋白酶活力的比较
| 菌株编号 | 凝乳酶活力(u/ml) | 蛋白酶活力(u/ml) | 凝乳酶活力/蛋白酶活力 |
| QL-2 | 16.7 | 12.2 | 1.37 |
| YB-3 | 218.2 | 26.3 | 8.30 |
与出发菌株相比，诱变得到的枯草芽孢杆菌YB-3凝乳酶活性提高了1306％，凝乳酶活力与蛋白酶活力比值提高了605％。
所述的传代培养基为酪蛋白培养基按以下比例配制：干酪素10g，牛肉膏3g，NaH2PO4·12H2O 5g，NaCl 5g，pH＝7.0。间歇式灭菌。
所述的间歇式灭菌为枯草芽孢杆菌培养基特有灭菌方式。步骤如下：
分装培养基后，121℃灭菌20min。
待经过初次灭菌的培养基冷却后，置于恒温摇床30℃震荡培养8h。
震荡培养过夜的培养基于121℃再次灭菌20min，冷却后4℃低温保存。
实施例3、可高产凝乳酶的枯草芽孢杆菌YB-3的发酵产酶
将枯草芽孢杆菌YB-3接种于灭菌的改良NA液体培养基上30℃复壮培养3代；再将该稳定生长的菌株接种于灭菌液体酪蛋白培养基中培养3代，使其达到正常的生长周期，备用。
所述酪蛋白培养基组成为(g/L)：干酪素10，牛肉膏3，NaH2PO4·12H2O 5，NaCl 5，pH＝7.0。于121℃灭菌20分钟。
种子培养
将培养到对数生长期的枯草芽孢杆菌YB-3菌液接种到灭菌的种子培养基，于30℃，200rpm震荡培养36h，备用。
所述的种子培养基组成为(g/L)：乳清粉20，麸皮30，NaH2PO4·12H2O 5，NaCl5，CaCl21，pH＝7.0。除乳清粉外配成溶液，于121℃灭菌20分钟；乳清粉单独配成溶液，于108℃灭菌20分钟，冷却后混匀后即可使用。
发酵培养基的配制
为容量为20L的机械搅拌液体发酵罐配制发酵培养基：投入2L麸皮水解液，160g乳清粉，40g NaH2PO4·12H2O，40g NaCl和8g CaCl2，补水至8L，pH自然。
所述麸皮水解液制备方法为：准确称量麸皮240g，加入2.5L蒸馏水，加热煮沸30min，冷却后8层纱布过滤残渣，得到约2L滤液，备用。
灭菌
在压力和温度分别为0.05MPa、108℃条件下，对液体培养基进行高压灭菌
处理，处理时间为30min。
接种培养
当罐温降至30℃时，将预先经二级培养处于对数生长期的枯草芽孢杆菌YB-3菌株的细菌种子接入上述发酵罐中，接种量为100ml，在罐压、通气量、发酵罐转速和罐温分别为0.04MPa、600L/h、150rpm和30℃的条件下，对该菌株连续发酵48h。
收获凝乳酶粗酶液
经上步处理后，上述变异菌株大量繁殖，从发酵罐中收获发酵液，6000rpm离心15min除去菌体，即得凝乳酶粗酶液，4℃保藏，用于酶的纯化处理。同时取出过滤粗酶液，测定凝乳酶活力和蛋白水解活力，分别达到58u/ml和10u/ml。
实施例4、发酵的凝乳酶粗酶液的应用
调整粗酶液pH至6，于40℃保温15min，按1∶10的比例加入至含有0.01mol/LCaCl2的脱脂乳液中，40℃保温处理20min。脱脂乳液凝固成块后，70℃使酶失活，凝固后牛奶用于切割成奶酪；或者经过高温蒸干水分处理，制备干酪素，凝乳效果较原菌株有了很大的改善。
牛奶脱脂步骤如下：将鲜奶有小火煮沸后，离开火源，待其冷却后将表面结成的一层奶油皮用玻璃棒挑去，然后再煮开、冷却、去皮，这样反复几次，直到不在结皮为止。
Claims (3)
1.一株能产生凝乳酶的细菌，其特征在于，该细菌是一株枯草芽孢杆菌的突变株，能够利用麸皮发酵高产凝乳酶，保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO：M209075。
2.一种利用权利要求1所述细菌生产凝乳酶的方法，其特征在于，以麸皮及乳清粉为主要底物，添加磷酸氢二钾及氯化钙和水，调节pH为7.5左右，接种权力要求1所述的枯草芽孢杆菌变异株，采用液体发酵生产凝乳酶。
3.一种权利要求1所述的可高产凝乳酶的枯草芽孢杆菌变异株的用途，通过权利要求2液体发酵制备的凝乳酶粗酶液用于牛奶制备奶酪和干酪素，缩短牛奶凝固时间。
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