CN102296042B - 地衣芽孢杆菌及用其制备凝乳酶冻干粉的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种地衣芽孢杆菌及用其制备凝乳酶冻干粉的方法。本发明将地衣芽孢杆菌经液体发酵培养的发酵液经高速冷冻离心、酶的分级沉淀、酶的纯化得到凝乳酶冻干粉。该凝乳酶冻干粉可用于干酪和干酪素的生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体的说是一种地衣芽孢杆菌及用其制备凝乳酶冻干粉的方法。
背景技术
凝乳酶是干酪制作过程中一种关键性酶，其主要作用是专一性的剪切酪蛋白Phe 105-Met 106的肽键，形成稳定的副κ-酪蛋白及亲水性的糖巨肽；当总κ-酪蛋白被水解掉约85 %时，在Ca2+存在下通过在酪蛋白胶粒间形成的化学键形成凝块或凝固的乳，从而使变化的凝乳酶、酪蛋白胶粒发生沉淀。凝乳酶主要有三种来源，分别为动物凝乳酶，植物凝乳酶和微生物凝乳酶。
动物凝乳酶中使用最广泛的是小牛皱胃酶。采用小牛皱胃酶生产干酪时具有较好的凝乳效果，所产干酪具有硬度和弹性均符合工艺要求，出品率较高，不产生苦味等特点，因此长期以来小牛皱胃酶一直得到人们的青睐。随着干酪工业的发展，据统计全世界每年要宰杀5000万头小牛，以获得凝乳酶，造成全球性小牛短缺，凝乳酶的来源不稳定，而且价格昂贵。另外，素食者认为用牛凝乳酶生产的乳酪是不可以接受的。
植物蛋白酶分布于植株的果实、叶、茎和根等部位，均可提取相应的蛋白酶。许多植物蛋白酶含有能使乳凝固的作用，如木瓜、无花果、波萝、南瓜和生姜等。木瓜蛋白酶是从番木瓜中提取的，可以使牛乳凝固，其对牛乳的凝乳作用比蛋白酶分解力强，脂肪损失少，收率较高，但制成的干酪带有一定的苦味；大多数植物蛋白酶在干酪生产过程中的蛋白质分解活性过强，使干酪产生苦味，而且成品得率较低，质地也稍软，致使商品价值很低。
自1964年Arima首先发现了微小毛霉（Mucor microus）可以产凝乳性的蛋白酶，并对其作了详细的研究以来，微生物凝乳酶就成为动物性凝乳酶替代品的研究重点。微生物具有生长周期短，生长速度快，生长条件易于控制，生产成本低等特点，目前各国的发酵工业都比较发达，发酵产物的提取工艺比较完善。因此，对由微生物所分泌的凝乳酶的研究和开放有广阔的前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种地衣芽孢杆菌。
本发明的另一个目的是提供一种用地衣芽孢杆菌制备凝乳酶冻干粉的方法。
本发明中的地衣芽孢杆菌D3.11从甘肃省天祝藏族自治县放牧牦牛生活环境土壤中筛选得到，分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) D3.11，于2009年09月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏号CGMCC No：3289。
本发明地衣芽孢杆菌D3.11的筛选方法是采集天祝藏族自治县放牧牦牛生活环境土壤样品，经酪蛋白平板培养，观察沉淀圈和蛋白水解圈进行筛选，并比较凝乳酶活性大小而得到。牧区土壤样品经培养基增殖培养，涂平板，选择沉淀圈大、无色透明圈小的菌落进行摇瓶发酵培养，通过比较凝乳酶活性大小，最终确定菌株。
酪蛋白培养基组成：蛋白胨2.5 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母膏1 g/L，干酪素10 g/L，琼脂20 g/L，脱脂牛乳50 g/L ，pH值7.0。
本发明地衣芽孢杆菌D3.11 CGMCC No：3289，具有产凝乳酶的能力。
本发明地衣芽孢杆菌制备凝乳酶冻干粉的方法为下列步骤：
（1）种子液制备
将地衣芽孢杆菌D3.11接种于液体发酵培养基中，在温度37 ℃，转速140 r/min 摇床培养24小时，得到种子液；
（2）发酵液制备
将种子液按3%的接种量，加入液体发酵培养基中，在温度37℃、转速200～240r/min振荡培养72小时，得到发酵液为凝乳酶液；
步骤（1）、（2）中液体发酵培养基的制法如下：
将麸皮按每10 g麸皮加入100 mL自来水的比例加水后煮沸10 min，过滤后用自来水补足原体积，得到麸皮汁；将所得的麸皮汁，在温度115℃灭菌20min，室温下冷却至30℃作为液体发酵培养基；
（3）发酵液的离心
将发酵液在温度4℃、转速8000r/min条件下离心10min，得到上清液；
（4）酶的分级沉淀
将硫酸铵烘干研细，取第三步得到的上清液，向其中缓慢加入硫酸铵粉末至其饱和度达到30%，在温度4℃静置2小时后，以7000转/分钟离心10min，取上清液，继续加入硫酸铵粉末至其饱和度达到70%，在温度 4℃静置2小时后，以8000转/分钟离心10min后，沉淀溶于0.01moI/L, pH6.8的磷酸盐缓冲液中，再在温度 4℃透析48小时，即为透析液；
（5）酶的纯化
将透析液加入DEAE-Sephadex A-25离子交换柱，以0.05mo1/L, pH 6.2的磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，采用NaCI梯度洗脱，分布收集，检测活性，合并有活性的洗脱液，浓缩冻干即可。
本发明菌株经种子培养和液体深层发酵制得凝乳酶，酶活力可达343.5 SU/ml ，可用于干酪和干酪素生产。
本发明地衣芽孢杆菌D3.11形态特征与生理生化特征如下：
1）形态特征：革兰氏染色结果为阳性，杆菌，柱状，单个排列，有芽孢，芽孢为中生芽孢，穿刺培养表明该菌株有运动性。在酪蛋白平板上菌落不规则，为微黄色，凸起，菌落表面有粘液。D3.11革兰氏染色见图1是地衣芽孢杆菌D3.11在显微镜下的菌体形态图。图2是地衣芽孢杆菌D3.11在扫描电镜下下的菌体形态图。图3是地衣芽孢杆菌D3.11的菌落形态图。
2）生物生化特征见表一：
表一
| 生化反应 | 结果 |
| 葡萄糖 | 产酸不产气 |
| 阿拉伯糖 | 产酸不产气 |
| 木糖 | 产酸不产气 |
| 甘露醇 | 不产酸不产气 |
| 乳糖 | 不产酸不产气 |
| NaCl | 7 %中可以生长 |
| 酪素 | 水解 |
| 酪氨酸 | 不分解 |
| 石蕊牛乳 | 还原 |
| 淀粉水解 | 阳性 |
| 过氧化氢酶 | 阳性 |
| 精氨酸双水解酶 | 阳性 |
3）地衣芽孢杆菌D3.11的16srRNA部分序列如下，共605bp，
在GenBank 中的登录号为GQ918134，查询网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/GQ918134.1?report=GenBank，可进行序列检索。
1 acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggacc gacgggagct tgctccctta
61 ggtcagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc
121 cgggaaaccg gggctaatac cggatgcttg attgaaccgc atggttcaat cataaaaggt
181 ggcttttagc taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg
241 gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga
301 gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt
361 ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaaact ctgttgttag
421 ggaagaacaa gtaccgttcg aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac
481 ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat
541 tgggcgtaaa gcgcgcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc
601 gggga
4）根据16S rDNA序列同源性构建的地衣芽孢杆菌D 3.11与相关菌株系统进化树见图4。
5）地衣芽孢杆菌凝乳酶酶学性质：
图5 示出了地衣芽孢杆菌凝乳酶最适作用温度图。图6示出了pH值对地衣芽孢杆菌凝乳酶活力影响图。图7示出了地衣芽孢杆菌凝乳酶凝乳酶pH稳定性图。图8示出了Ca2+浓度对地衣芽孢杆菌凝乳酶酶活力影响图。
地衣芽孢杆菌凝乳酶凝乳酶的热稳定性见下表二，不同金属离子对是地衣芽孢杆菌凝乳酶凝乳酶活性影响见下表三。
表二 凝乳酶的热稳定性
注：表中“+”表示酶活力增长；“-”表示酶活力降低。
表三不同金属离子对凝乳酶活性影响
结论如下：
A）最适作用温度为60 ℃；
B）60℃保温60 min凝乳酶活力降低73.27%，70 ℃下处理10 min后凝乳酶失活；最适pH值为5.5；
C）在pH值为5～6时最稳定；
D）K+和Mg2+对凝乳酶无影响，Li+、Na+、Cu2+、Zn2+对凝乳酶有抑制作用，Fe3+、Mn2+、Fe2+、Al3+、Ca2+对凝乳酶有激活作用。
本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) D3.11，于2009年09月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No：3289。
附图说明
图1是地衣芽孢杆菌D3.11在显微镜下的菌体形态图。
图2是地衣芽孢杆菌D3.11在扫描电镜下下的菌体形态图。
图3是地衣芽孢杆菌D3.11的菌落形态图。
图4 是地衣芽孢杆菌D 3.11与相关菌株系统进化树的图。
图5 是地衣芽孢杆菌凝乳酶最适作用温度图。
图6是pH值对地衣芽孢杆菌凝乳酶活力影响图。
图7是地衣芽孢杆菌凝乳酶凝乳酶pH稳定性图。
图8是Ca2+浓度对地衣芽孢杆菌凝乳酶酶活力影响图。
具体实施方式
下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
将麸皮按每10 g麸皮加入100 mL自来水的比例加水后煮沸10 min，过滤后用自来水补足原体积，得到麸皮汁。将所得的麸皮分装到500mL三角瓶，115℃灭菌20min，室温下冷却至30℃作为液体发酵培养基。
将地衣芽孢杆菌D3.11接种于液体发酵培养基中，37 ℃，140 r/min 摇床培养24小时，得到种子液。将种子液按3%的接种量，加入液体发酵培养基中，37℃、200r/min振荡培养72小时，得到发酵液。将发酵液在4℃、8000r/min条件下离心10min，得到上清液，测得凝乳活力为324.5SU/mL。
将硫酸铵烘干研细，向上清液中缓慢加入硫酸铵粉末至其饱和度达到30%，4℃静置2小时后，以7000转/分钟离心10min，取上清液，继续加入硫酸铵粉末至其饱和度达到70%， 4℃静置2小时后，以8000转/分钟离心10min，沉淀溶于0.01moI/L, pH6.8的磷酸盐缓冲液中，4℃透析48小时，即为透析液，测得凝乳活力为312.5SU/mL。
将透析液加入DEAE-Sephadex A-25离子交换柱，以0.05mo1/L, pH 6.2的磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，以含0.15mo1/L, 0.25 mol/L, 0.35 mol/L, 0.45 mo1/L以及0.55 mol/L NaCL浓度的缓冲液进行梯度洗脱，按照现有技术方法：分布收集，检测活性，合并有活性的洗脱液，浓缩冻干即得到高纯度的凝乳酶，凝乳活力达152820.SU/g。
实施例2
将麸皮按每10 g麸皮加入100 mL自来水的比例加水后煮沸10 min，过滤后用自来水补足原体积，得到麸皮汁。将所得的麸皮分装到500mL三角瓶，115℃灭菌20min，室温下冷却至30℃作为液体发酵培养基。
将地衣芽孢杆菌D3.11接种于液体发酵培养基中，37 ℃，140 r/min 摇床培养24小时，得到种子液。将种子液按3%的接种量，加入液体发酵培养基中，37℃、220r/min振荡培养72小时，得到发酵液。将发酵液在4℃、8000r/min条件下离心10min，得到上清液，测得凝乳活力为333.5SU/mL。
将硫酸铵烘干研细，向上清液中缓慢加入硫酸铵粉末至其饱和度达到30%，4℃静置2小时后，以7000转/分钟离心10min，取上清液，继续加入硫酸铵粉末至其饱和度达到70%， 4℃静置2小时后，以8000转/分钟离心10min，沉淀溶于0.01moI/L, pH6.8的磷酸盐缓冲液中，4℃透析48小时，即为透析液，测得凝乳活力为332.5SU/mL。
将透析液加入DEAE-Sephadex A-25离子交换柱，以0.05mo1/L, pH 6.2的磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，以含0.15mo1/L, 0.25 mol/L, 0.35 mol/L, 0.45 mo1/L以及0.55 mol/L NaCL浓度的缓冲液进行梯度洗脱，分布收集，检测活性，合并有活性的洗脱液，浓缩冻干得到高纯度的凝乳酶，凝乳活力达153820.SU/g。
实施例3
将麸皮按每10 g麸皮加入100 mL自来水的比例加水后煮沸10 min，过滤后用自来水补足原体积，得到麸皮汁。将所得的麸皮分装到500mL三角瓶，115℃灭菌20min，室温下冷却至30℃作为液体发酵培养基。
将地衣芽孢杆菌D3.11接种于液体发酵培养基中，37 ℃，140 r/min 摇床培养24小时，得到种子液。将种子液按3%的接种量，加入液体发酵培养基中，37℃、240r/min振荡培养72小时，得到发酵液。将发酵液在4℃、8000r/min条件下离心10min，得到上清液，测得凝乳活力为343.5SU/mL。
将硫酸铵烘干研细，向上清液中缓慢加入硫酸铵粉末至其饱和度达到30%，4℃静置2小时后，以7000转/分钟离心10min，取上清液，继续加入硫酸铵粉末至其饱和度达到70%， 4℃静置2小时后，以8000转/分钟离心10min，沉淀溶于0.01moI/L, pH6.8的磷酸盐缓冲液中，4℃透析48小时，即为透析液，测得凝乳活力为348.5SU/mL。
将透析液加入DEAE-Sephadex A-25离子交换柱，以0.05mo1/L, pH 6.2的磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，以含0.15mo1/L, 0.25 mol/L, 0.35 mol/L, 0.45 mo1/L以及0.55 mol/L NaCL浓度的缓冲液进行梯度洗脱，分布收集，检测活性，合并有活性的洗脱液，浓缩冻干得到高纯度的凝乳酶，凝乳活力达154620.SU/g。
Claims (2)
1.一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)D3.11，其保藏号为CGMCC No：3289，具有产凝乳酶的能力。
2.用权利要求1的地衣芽孢杆菌制备凝乳酶冻干粉的方法，其特征在于该制备方法为下列步骤：
（1）种子液制备
将地衣芽孢杆菌D3.11接种于液体发酵培养基中，在温度37 ℃，转速140 r/min 摇床培养24小时，得到种子液；
（2）发酵液制备
将种子液按3%的接种量，加入液体发酵培养基中，在温度37℃、转速200～240r/min振荡培养72小时，得到发酵液为凝乳酶液；
步骤（1）、（2）中液体发酵培养基的制法如下：
将麸皮按每10 g麸皮加入100 mL自来水的比例加水后煮沸10 min，过滤后用自来水补足原体积，得到麸皮汁；将所得的麸皮汁，在温度115℃灭菌20min，室温下冷却至30℃作为液体发酵培养基；
（3）发酵液的离心
将发酵液在温度4℃、转速8000r/min条件下离心10min，得到上清液；
（4）酶的分级沉淀
将硫酸铵烘干研细，取第三步得到的上清液，向其中缓慢加入硫酸铵粉末至其饱和度达到30%，在温度4℃静置2小时后，以7000转/分钟离心10min，取上清液，继续加入硫酸铵粉末至其饱和度达到70%，在温度 4℃静置2小时后，以8000转/分钟离心10min后，沉淀溶于0.01moI/L, pH6.8的磷酸盐缓冲液中，再在温度 4℃透析48小时，即为透析液；
（5）酶的纯化
将透析液加入DEAE-Sephadex A-25离子交换柱，以0.05mo1/L, pH 6.2的磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，采用NaCI梯度洗脱，分布收集，检测活性，合并有活性的洗脱液，浓缩冻干即可。
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