CN105274079A - 一种高度浓缩的凝乳酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高度浓缩的凝乳酶及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：1)取保藏编号为CGMCC？No.8333的类芽孢杆菌BD3526发酵液上清，经硫酸铵沉淀法获得沉淀物加入CaCl₂溶液溶解，即得粗凝乳酶液；2)将所得粗凝乳酶液装入透析袋中进行透析，透析液是CaCl₂溶液；3)透析结束后，将透析袋中的溶液进行真空冷冻干燥，所得到的酶制剂即为高度浓缩的凝乳酶。该制备方法简单易行，便于实际操作，且实施效果显著，有效提高了凝乳酶活保留率，极大提高了对类芽孢杆菌产凝乳酶活力的保护，得到的高度浓缩的凝乳酶的纯度和酶活满足了产业化需求，为类芽孢杆菌发酵制备的凝乳酶制剂在工业化中的应用提供了可能性。

Description

一种高度浓缩的凝乳酶及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高度浓缩的凝乳酶及其制备方法。

背景技术

微生物来源的凝乳酶以其产量大、成本较低、方便提取、经济效益高的优势，越来越广泛的应用于干酪工业化生产。国外一些公司已利用改良的菌种生产出高活力的凝乳酶，创造了巨大的经济效益，而我国干酪生产中使用的凝乳酶绝大部分尚依赖进口。目前，国内虽然已筛选出了大量不同来源的高产凝乳酶的菌株、优化菌种发酵条件及浓缩条件，并相关酶学性质分析等研究，然而在凝乳酶浓缩过程中发现其稳定性差，半衰期短，快速失活等问题，部分凝乳酶的工业应用受到限制。此外有研究报道，由细菌产生的中性蛋白酶存在自身降解的现象，易导致酶活降低甚至消失，对凝乳酶后续高度浓缩、保存及生产应用带来困难。因此提高酶的稳定性，保证凝乳酶在高度浓缩后仍维持较高酶活力，是扩大酶的应用范围的前提。

中国专利申请(CN10374061)公开的类芽孢杆菌属的一个新菌种Paenibacillusdamxungensissp.nov.(保藏编号为：CGMCCNo.8333)，该菌株发酵液上清具有一定的凝乳活力。在中国专利申请(CN103865842A)中公开了类芽孢杆菌BD3526菌株发酵产物的凝乳酶活性，通过麸皮培养基培养的BD3526发酵液上清中酶活很高，达到2660.6SU/mL，然而将该菌株发酵液上清中提取的粗酶液经过沉淀透析后发现，所得金属蛋白酶快速失活，无法同时满足高纯度、高酶活的品质，从而无法被有效利用，进而严重限制了其在工业化中的应用。急需一种方法，能在粗酶液浓缩时有效保存金属蛋白酶的酶活力，从而得到纯度高，酶活高适于产业化应用的凝乳酶。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有的来自于BD3526发酵液上清中高酶活的凝乳酶(即一种金属蛋白酶)经沉淀透析后快速失活，从而无法得到高纯度，高酶活的凝乳酶的问题，提供了一种高度浓缩的凝乳酶及其制备方法，该制备方法能够有效地在高度浓缩过程中保护凝乳酶的活力，并最终得到一种高度浓缩的凝乳酶，该高度浓缩的凝乳酶保留有较高的酶活力。

本发明人经过广泛的研究和反复的试验，发现在高度浓缩分离过程中通过改变类芽孢杆菌BD3526所产凝乳酶液中钙离子浓度，能够在高度浓缩过程中保护凝乳酶的活力，进而得到一种高度浓缩的具有凝乳功能的金属蛋白酶(即高度浓缩的凝乳酶)，使其酶活在高纯度下仍维持较高水平，从而完成了本发明。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一是，一种高度浓缩的凝乳酶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

1)取保藏编号为CGMCCNo.8333的类芽孢杆菌BD3526发酵液上清，经硫酸铵沉淀法获得沉淀物，加入CaCl₂溶液溶解，即为粗凝乳酶液；

2)将步骤1)中所得粗凝乳酶液装入透析袋中，进行透析，透析液是CaCl₂溶液；

3)透析结束后，将透析袋中的溶液进行真空冷冻干燥，所得到的酶制剂即为高度浓缩的凝乳酶。

其中，本发明步骤1)中保藏编号为CGMCCNo.8333的类芽孢杆菌BD3526发酵液上清由本领域常规方法得到，较佳地为类芽孢杆菌BD3526接种于麸皮培养基培养所得发酵液经离心得到，所述麸皮培养基较佳地包括小麦麸皮和水，其中小麦麸皮的含量较佳的为1％-14％，更佳的为2％-5％，最佳的为3％，所述百分比为质量百分比。所述类芽孢杆菌BD3526的接种量较佳的为0.4-3.2％，所述百分比为质量百分比。

本发明所述麸皮培养基的主要成分较佳地为：蛋白质13.9-18.6％，脂肪3.3-8.2％，总碳水化合物61.9-74.62％，水分4.8-18.02％，灰分3.38-6.50％，所述百分比为质量百分比(详见公开号为CN103865842A的中国专利申请)。

所述由麸皮培养基培养培养条件为常规培养条件(详见公开号为CN103865842A的中国专利申请)，较佳地采用摇床震荡培养，震荡速度较佳的为160r/min-180r/min，培养温度较佳的为20℃-40℃，更佳的为25℃-35℃，最佳的为35℃，培养时间较佳的为24-72小时(h)，最佳的为48小时。

本发明步骤1)中所述硫酸铵沉淀法为常规的，所述的硫酸铵沉淀法较佳地包括以下步骤：将硫酸铵加入步骤1)所述的发酵液上清中，至硫酸铵的浓度达到饱和度为50-75％，混合后离心收集沉淀物。所述的饱和度更佳的为60％。所述的硫酸铵沉淀法更佳地还包括在机械搅拌的情况下，加入硫酸铵粉末，最佳地为缓慢加入硫酸铵粉末。所述离心收集沉淀物的离心速度为常规的，较佳的为12000-20000g，更佳的为12000-15000g，最佳的为15000g，离心时间为5-25分钟(min)，更佳的为15分钟，离心温度为2-4℃。

本发明步骤1)所述的CaCl₂溶液为常规的，所述CaCl₂溶液的浓度较佳的为2.5-100mmol/L，更佳的为50mmol/L。

步骤1)较佳的还包括将所述沉淀物加入CaCl₂溶液溶解所得的溶液离心去除不溶物的步骤，取上清液即为粗凝乳酶液。其中所述的离心是常规的，只要沉淀下不溶物即可。

本发明步骤2)中所述的透析袋为常规的，较佳的为分子截流量为14kDa的透析袋。

本发明步骤2)中所述的透析操作时间为常规，较佳的为1-12小时，均可保证较高纯度的凝乳酶，更佳的为4小时。

本发明步骤2)所述的CaCl₂溶液为常规的，所述CaCl₂溶液的浓度较佳的为1-10mmol/L，更佳的为5mmol/L。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二是，一种由本发明所述制备方法制得的凝乳酶。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：将类芽孢杆菌BD3526发酵制备的粗凝乳酶液在沉淀浓缩过程中，通过一直保持有充足的钙离子供给，可有效维持该凝乳酶在沉淀浓缩操作中的稳定性，提高了浓缩后的凝乳酶酶活保留率。本发明在常温保存状态下(较佳为4-25℃)，高度浓缩后的凝乳酶可长时间维持凝乳酶活力在较高水平，其凝乳酶活力保留率可保持在90％以上。本发明所述的高度浓缩凝乳酶制备工艺简单，酶活保护效果显著有效，能够较好的满足工业化生产对高纯度、高酶活的凝乳酶的需求，能够改变我国在干酪生产方面对国外进口产品依赖性。

附图说明

图1为Ca²⁺的添加对凝乳酶活力的影响。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明实施例所使用的培养基(培养基配制方法参照中国专利申请CN104059899A)如下：

麸皮培养基：小麦麸皮的含量为3％，余量为水，所述百分比为质量百分比。

TYC培养基为常规的TYC培养基，由以下组分组成：胰蛋白酶胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5.0g/L，L-胱氨酸0.2g/L，乙酸纳20g/L，Na₂SO₄0.1g/L，NaCl1g/L，Na₂HPO₄·12H₂O2g/L，NaHCO₃2g/L，琼脂18g/L，余量为水。

实施例1类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的粗提及酶活测定

将类芽孢杆菌BD3526接种于TYC培养基中(TYC培养基配制方法参照中国专利申请CN104059899A)，30℃培养20h作为种子液，并将种子液按0.8％(V/V)接种于麸皮培养基；30℃，160r/min，培养48h，发酵液离心后，收集BD3526发酵液上清(方法参见公开号为CN103865842A中国专利申请)。

取上述发酵液上清800mL，此时测得凝乳酶活为2660.6SU/mL，将研磨后的硫酸铵固体粉末缓慢加入上清发酵液中，使最终发酵液上清中硫酸铵饱和度为60％，混合均匀。

15000g，4℃离心15min收集盐析沉淀物质，并用50mmol/L的CaCl₂溶液将其溶解，10000g，4℃离心10min去除不溶物，所得上清溶液即为类芽孢杆菌BD3526发酵产生的粗凝乳酶液(可简称为粗酶液)，所得粗凝乳酶液体积为40mL，所得粗凝乳酶液凝乳酶活力达到22349.1SU/mL。

凝乳酶活力(milkclottingactivity,MCA)(SU/mL)测定方法(参见公开号为CN103865842A中国专利申请)；将脱脂奶粉以10％(w/v)的比例配置成pH6.0含有0.01mol/LCaCl₂的溶液，在35℃水浴中孵育10min，分别加入500μl稀释酶液，每5s将样品取出并倾斜45°观察样品组织状态，以形成不连续颗粒的时间计作凝乳时间。按公式(1)计算样品中凝乳酶活力MCA(SU/mL)。

$MCA(SU/mL)=\frac{2400\×V_S}{T\×V_E}\×D---\left(1\right)$

其中，T—凝乳时间，秒；V_S—脱脂乳体积，mL；V_E—酶液体积，mL；D—稀释倍率。

如需测定干粉状酶制剂的酶活力，需要先将酶制剂制成酶溶液，先称取一定质量的凝乳酶粉末溶于水，然后按照上述步骤进行操作。按公式(2)计算样品中凝乳酶活力MCA(SU/g)。

$MCA(SU/g)=\frac{2400\×V_S}{T\×V_E}\×D\×M---\left(2\right)$

其中，T—凝乳时间，秒；V_S—脱脂乳体积，mL；V_E—酶液体积，mL；D—稀释倍率；M—单位质量凝乳酶的酶液体积，mL/g。

实施例2类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的粗提及酶活测定

取按照实施例1中的方法发酵并收集得到BD3526发酵液上清800mL，此时测得凝乳酶活为2660.6SU/mL，将研磨后的硫酸铵固体粉末缓慢加入发酵液上清中，使最终发酵液上清硫酸铵饱和度为60％，混合均匀。

20000g，2℃离心5min收集盐析沉淀物质，并用2.5mmol/L的CaCl₂溶液将其溶解，10000g，4℃离心10min去除不溶物，最终取得上清溶液即为类芽孢杆菌BD3526发酵产生的粗凝乳酶液。所得粗凝乳酶液40mL，凝乳酶活19343.2SU/mL。

本实施例采用实施例1凝乳酶活力测定方法测定凝乳酶活力。

实施例3类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的粗提及酶活测定

取按照实施例1中的方法发酵并收集得到BD3526发酵液上清800mL，此时测得凝乳酶活为2660.6SU/mL，将研磨后的硫酸铵固体粉末缓慢加入发酵液上清中，使最终发酵液上清硫酸铵饱和度为60％，混合均匀。

12000g，3℃离心25min收集盐析沉淀物质，并用75mmol/L的CaCl₂溶液将其溶解，10000g，4℃离心10min去除不溶物，最终取得上清溶液即为类芽孢杆菌BD3526发酵产生的粗凝乳酶液。所得粗凝乳酶液40mL，凝乳酶活22348.3SU/mL。

本实施例采用实施例1凝乳酶活力测定方法测定凝乳酶活力。

实施例4类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的浓缩及酶活测定

按照实施例1中的方法发酵并收集得到BD3526发酵液上清800mL，此时测得凝乳酶活为2660.6SU/mL，将研磨后的硫酸铵固体粉末缓慢加入发酵液上清中，使最终发酵液上清硫酸铵饱和度为60％，混合均匀。

15000g，4℃离心15min收集盐析沉淀物质，并用50mmol/L的CaCl₂溶液将其溶解，10000g，4℃离心10min去除不溶物，最终取得上清溶液即为类芽孢杆菌BD3526发酵产生的粗凝乳酶液。所得粗凝乳酶液40mL，凝乳酶活22349.1SU/mL。

将所得粗凝乳酶液装入分子截流量为14kDa透析袋，使用5mmol/L的CaCl₂溶液进行透析操作。分别将透析2h、4h、12h后透析袋中的溶液进行真空冷冻干燥，所得即为高度浓缩的凝乳酶制剂。分别测定所得高度浓缩的凝乳酶制剂酶活(详见表1)。

其中，透析4h后制备而得的高度浓缩的凝乳酶制剂活力达到1.56×10⁶SU/g。

本实施例采用实施例1凝乳酶活力测定方法测定凝乳酶活力。

实施例5类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的浓缩及酶活测定

取按照实施例1中的方法发酵并收集得到BD3526发酵液上清800mL，此时测得凝乳酶活为2660.6SU/mL，将研磨后的硫酸铵固体粉末缓慢加入发酵液上清中，使最终发酵液上清硫酸铵饱和度为60％，混合均匀。

12000g，2℃离心25min收集盐析沉淀物质，并用25mmol/L的CaCl₂溶液将其溶解，10000g，4℃离心10min去除不溶物，最终取得上清溶液即为类芽孢杆菌BD3526发酵产生的粗凝乳酶液。所得粗凝乳酶液40mL，凝乳酶活20845.3SU/mL。

将所得粗凝乳酶液装入分子截流量为14kDa透析袋，使用5mmol/L的CaCl₂溶液进行透析操作。透析8h后将透析袋中的溶液进行真空冷冻干燥，所得即为高度浓缩的凝乳酶制剂。

所得高度浓缩的凝乳酶的活力达到1.43×10⁶SU/g。

本实施例采用实施例1凝乳酶活力测定方法测定凝乳酶活力。

实施例6类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的浓缩及酶活测定

取按照实施例1中的方法发酵并收集得到BD3526发酵液上清800mL，此时测得凝乳酶活为2660.6SU/mL，将研磨后的硫酸铵固体粉末缓慢加入发酵液上清中，使最终发酵液上清硫酸铵饱和度为60％，混合均匀。

20000g，3℃离心15min收集盐析沉淀物质，并用100mmol/L的CaCl₂溶液将其溶解，10000g，4℃离心10min去除不溶物，最终取得上清溶液即为类芽孢杆菌BD3526发酵产生的粗凝乳酶液。所得粗凝乳酶液40mL，凝乳酶活22346.3SU/mL。

将所得粗凝乳酶液装入分子截流量为14kDa透析袋，使用10mmol/LCaCl₂溶液作透析液进行透析操作。透析4h后将透析袋中的溶液进行真空冷冻干燥，所得即为高度浓缩的凝乳酶制剂。

同时，采用实施例1凝乳酶活力测定方法测定粗凝乳酶液和高度浓缩凝乳酶的凝乳酶活力。

所得的高度浓缩的凝乳酶的活力达到1.56×10⁶SU/g。

本实施例采用实施例1凝乳酶活力测定方法测定凝乳酶活力。

实施例7类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的浓缩及酶活测定

取按照实施例1中的方法发酵并收集得到BD3526发酵液上清800mL，此时测得凝乳酶活为2660.6SU/mL，将研磨后的硫酸铵固体粉末缓慢加入发酵液上清中，使最终发酵液上清硫酸铵饱和度为50％，混合均匀。

15000g，4℃离心15min收集盐析沉淀物质，并用2.5mmol/L的CaCl₂溶液将其溶解，10000g，4℃离心10min去除不溶物，最终取得上清溶液即为类芽孢杆菌BD3526发酵产生的粗凝乳酶液。所得粗凝乳酶液40mL，凝乳酶活18446.4SU/mL。

本实施例采用实施例1凝乳酶活力测定方法测定凝乳酶活力。

实施例8类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的浓缩及酶活测定

取按照实施例1中的方法发酵并收集得到BD3526发酵液上清800mL，此时测得凝乳酶活为2660.6SU/mL，将研磨后的硫酸铵固体粉末缓慢加入发酵液上清中，使最终发酵液上清硫酸铵饱和度为75％，混合均匀。

15000g，4℃离心15min收集盐析沉淀物质，并用2.5mmol/L的CaCl₂溶液将其溶解，10000g，4℃离心10min去除不溶物，最终取得上清溶液即为类芽孢杆菌BD3526发酵产生的粗凝乳酶液。所得粗凝乳酶液40mL，凝乳酶活19341.8SU/mL。

本实施例采用实施例1凝乳酶活力测定方法测定凝乳酶活力。

实施例9类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的浓缩及酶活测定

将实施例2所得粗凝乳酶液装入分子截流量为14kDa透析袋，使用1.0mmol/LCaCl₂作透析液进行透析操作1h。透析结束后将透析袋中的溶液进行真空冷冻干燥，所得即为高度浓缩的凝乳酶制剂。

所得的高度浓缩的凝乳酶的活力达到6.63×10⁵SU/g。

本实施例采用实施例1凝乳酶活力测定方法测定凝乳酶活力。

对比实施例1类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的粗提及酶活测定

取按照实施例1中的方法发酵并收集得到BD3526发酵液上清800mL，此时测得凝乳酶活为2660.6SU/mL，将研磨后的硫酸铵固体粉末缓慢加入发酵液上清中，使最终发酵液上清硫酸铵饱和度为60％，混合均匀。

15000g，4℃离心15min收集盐析沉淀物质，并用去离子水将其溶解，10000g，4℃离心10min去除不溶物，所得上清溶液即为类芽孢杆菌BD3526发酵产生的粗凝乳酶液，所得粗凝乳酶液体积为40mL。

同时，采用实施例1凝乳酶活力测定方法测定粗凝乳酶液的凝乳酶活力，残留酶活仅为10057.1SU/mL。

通过比较实施例1与对比实施例1发现，经过硫酸铵沉淀后，未加入Ca²⁺的试验组，其凝乳酶活力保留率下降较快(如图1)，凝乳酶活力保留率损失近50％。而加入Ca²⁺的试验组，可有效减缓凝乳酶的自身降解。可以看出使用本发明提供的方法制备的粗酶液能够显著抑制金属蛋白酶自身降解，以保护凝乳酶活力，且随Ca²⁺浓度的升高，对凝乳酶活保护作用越强。

经过硫酸铵沉淀后的凝乳酶活力保留率R₁(％)按照公式(3)计算：

$R_1\left(\%\right)=\frac{{\mathrm{MCA}}_1\×V_1}{{\mathrm{MCA}}_2\×V_2}\×100\%---\left(3\right)$

MCA₁—硫酸铵沉淀所得沉淀物质溶解后凝乳酶活力，SU/mL；MCA₂—发酵液上清凝乳酶活力，SU/mL；V₁—硫酸铵沉淀所得沉淀物质溶解后的体积，mL；V₂—发酵液上清体积，mL。

对比实施例2类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的浓缩及酶活测定

取按照实施例1中的方法发酵并收集得到BD3526发酵液上清800mL，此时测得凝乳酶活为2660.6SU/mL，将研磨后的硫酸铵固体粉末缓慢加入发酵液上清中，使最终发酵液上清硫酸铵饱和度为60％，混合均匀。

15000g，4℃离心15min收集盐析沉淀物质，并用50mmol/L的CaCl₂溶液将其溶解，10000g，4℃离心10min去除不溶物，所得上清溶液即为类芽孢杆菌BD3526发酵产生的粗凝乳酶液。所得粗凝乳酶液40mL，凝乳酶活22349.1SU/mL。

将所得粗凝乳酶液装入分子截流量为14kDa透析袋，使用PBS作透析液进行透析操作。分别将透析2h、4h、12h后透析袋中的溶液进行真空冷冻干燥，所得即为高度浓缩的凝乳酶制剂。分别测定所得高度浓缩的凝乳酶制剂酶活(详见表1)。

其中，透析4h后制备而得的高度浓缩的凝乳酶制剂凝乳酶残留酶活仅为6.79×10⁴SU/g。

本对比实施例采用实施例1凝乳酶活力测定方法测定凝乳酶活力。

通过比较实施例4与对比实施例2发现，在透析过程中，保持充足的Ca²⁺能够有效的保护凝乳酶活力，以维持凝乳酶的稳定性(图1)；相反，在无Ca²⁺供给的条件下进行透析，浓缩后的凝乳酶自身降解严重，酶活稳定性差，凝乳酶活力保留率急剧降低60％。

经过透析后的凝乳酶活力保留率R₂(％)按照公式(4)计算：

$R_2\left(\%\right)=\frac{{\mathrm{MCA}}_3\×M_1}{{\mathrm{MCA}}_4\×V_2}\×100\%---\left(4\right)$

MCA₃—透析所得溶液冷冻干燥后的凝乳酶活力，SU/g；MCA₄—粗凝乳酶液冷冻干燥后凝乳酶活力，SU/mL；M₁—透析所得溶液冷冻干燥后所得物的质量，g；M₂—粗凝乳酶液冷冻干燥后所得物的质量，g。

透析12h后，实施例4和对比实施例2残留酶活的变化如表1所示，对比实施例2中凝乳酶活力快速失活。添加CaCl₂后实施例4中凝乳酶酶活基本保持不变，在透析4h后酶活达到最高，12h时由于酶自身降解等原因酶活出现下降。

表1高度浓缩后的凝乳酶的活力变化

对比实施例3类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的浓缩及酶活测定

将实施例2所得粗凝乳酶液装入分子截流量为14kDa透析袋，使用PBS作透析液进行透析操作。透析4h后将透析袋中的溶液进行真空冷冻干燥，所得即为高度浓缩的凝乳酶制剂。

所得的高度浓缩的凝乳酶的活力达到5.77×10⁴SU/g。

本对比实施例采用实施例1凝乳酶活力测定方法测定凝乳酶活力。

对比实施例4类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的浓缩及酶活测定

将实施例3所得粗凝乳酶液装入分子截流量为14kDa透析袋，使用PBS作透析液进行透析操作。透析4h后将透析袋中的溶液进行真空冷冻干燥，所得即为高度浓缩的凝乳酶制剂。

所得的高度浓缩的凝乳酶的活力达到6.79×10⁴SU/g。

本对比实施例采用实施例1凝乳酶活力测定方法测定凝乳酶活力。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种高度浓缩的凝乳酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

1)取保藏编号为CGMCCNo.8333的类芽孢杆菌BD3526发酵液上清，经硫酸铵沉淀法获得沉淀物，加入CaCl₂溶液溶解，即得粗凝乳酶液；

2)将步骤1)中所得粗凝乳酶液装入透析袋中，进行透析，透析液是CaCl₂溶液；

3)透析结束后，将透析袋中的溶液进行真空冷冻干燥，所得到的酶制剂即为高度浓缩的凝乳酶。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的发酵液上清由类芽孢杆菌BD3526接种于麸皮培养基培养所得发酵液经离心得到。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的培养为震荡培养。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的硫酸铵沉淀法包括以下步骤：将硫酸铵加入步骤1)所述的发酵液上清中，至硫酸铵的浓度达到饱和度为50-75％，混合后离心收集沉淀物。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的饱和度为60％，或所述的硫酸铵沉淀法为在机械搅拌的情况下，加入硫酸铵粉末。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述离心的离心速度为12000-20000g，较佳的为15000g，离心时间为5-25分钟，较佳的为15分钟，离心温度为2-4℃。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)还包括将所述沉淀物加入CaCl₂溶液溶解所得的溶液离心去除不溶物的步骤，取上清液即为粗凝乳酶液。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的透析袋分子截流量为14kDa；或者，步骤2)所述的透析的时间为1-12小时，较佳的为4小时。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的CaCl₂溶液的浓度为2.5-100mmol/L，较佳的为50mmol/L，或步骤2)所述的CaCl₂溶液的浓度为1-10mmol/L，较佳的为5mmol/L。

10.如权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的凝乳酶。