CN102382808B - 凝乳酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种凝乳酶的制备方法，属生物工程和酶制剂制备技术领域。其主要特点包括如下步骤：（1）制备摇瓶摇瓶种子；（2）接种：液体菌种接种麸皮培养基；（3）发酵培养：33℃，培养48个小时；（4）浸提：物料用9%的盐水浸提过夜得粗酶液；（5）离心：粗酶液通过80000-10000rpm离心；（6）超滤：通过8k的超滤膜去除杂蛋白；（7）冷冻干燥：添加冷冻保护剂，真空冷冻干燥，得凝乳酶成品。本发明以麸皮为主要原料，原料价格低廉，操作工艺简单，发酵周期短，省时经济，降低了生产成本，适合工业化生产和推广。
Description
技术领域
本发明属于利用农产品副产物进行固体发酵生产酶制剂技术领域。
背景技术
麸皮是小麦加工面粉后得到的副产物。过去，麸皮主要是用作饲料，经济价值不高。实际上，麸皮可进行多层次的开发利用,利用发酵技术、酶技术等现代生物手段对麸皮进行综合利用和加工，使其综合利用价值得到全面的开发，生产高附加值的酶制剂产品，实现了农副产品的循环利用，解决了麸皮综合利用价值低的问题。
凝乳酶是生产奶酪和凝乳酶干酪素的关键性酶。凝乳酶是一种从未断奶的小牛胃中发现的天门冬氨酸蛋白酶,其主要的生物学功能是有限剪切κ-酪蛋白,导致牛奶凝结,因此被广泛用于乳酪制造业,成为重要的酶制剂,其产值占全世界酶制剂的15%。由于乳酪生产的需要,全球每年约屠宰5000万头小牛,造成全球性小牛短缺。我国自80年代末也开展了凝乳酶的研究,但到目前为止,国内大部分凝乳酶仍依赖于进口。
凝乳酶来源广泛，但动物和植物源的凝乳酶受到原材料、时间和地点的限制难以发展。微生物由于生产周期短，受气候、区域、时间的限制小，生产成本低，产量大，提取方便，经济效益高而得到广泛的应用。目前微生物凝乳酶份额已经占凝乳酶消费量的一半以上。
目前，国内微生物凝乳酶的产酶活力偏低，工艺复杂，间接导致生产成本过高，不易工业化大规模生产。如专利CN101974503 A公开了一种豆渣和菌糠混合发酵制备凝乳酶的方法，本发明采用国外菌种资源，凝乳酶粗酶活达到13000U/ml,酶活比CN101974503 A公开的粗酶活提高20倍。专利CN101514336 B公开了红曲米固态发酵生产凝乳酶的方法，采用醇沉，凝胶柱洗脱，分步收集等方法制备凝乳酶，工艺较复杂。同时两者用的都是未经活化处理的孢子或菌丝体，发酵的周期较长，达到90小时左右，本发明采用接种液体种子，缩短了发酵周期，60小时即可完成发酵。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足提供一种凝乳酶的制备方法。用麸皮固体发酵制备凝乳酶，实现了农副产品的综合利用，缓解凝乳酶市场供应不足的问题，工艺简单，产酶活力高，适合工业化推广生产。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种凝乳酶的制备方法，其主要特点是包括以下步骤：
（1）米黑毛霉菌株:购自ATCC美国模式培养物集存库，菌种编号NO.26282 Rhizomucor miehei；
（2）制备液体菌种：称取20-40g的麸皮煮沸8-12分钟，用四层纱布过滤，滤液用水定容至1000mL,取250mL装进500mL三角瓶，棉塞封口，121℃灭菌20分钟；冷却后，接种1环米黑毛霉孢子，33℃培养2天；
（3）液体菌种接种麸皮培养基：175g麸皮，加入150-210mL水，搅拌均匀，121℃灭菌25分钟，冷却后，接种液体种子，接种量20-60mL，25℃-50℃培养3天；
（4）浸提：1公斤发酵产物加入9%的氯化钠水溶液20升，室温浸提4 -12小时；
（5）离心：用80-150目滤布的板框压滤，过滤液用离心机8000-10000rpm转速离心，收集上清液，即为粗酶液。
所述的凝乳酶的制备方法，还包括以下步骤：
（6）超滤：取10升离心液，通过截留量为8k-10k的超滤膜，废弃透析液，当酶液体积为1升-2升，停止超滤，浓缩比例5-10倍；
（7）干燥：1升超滤液添加氯化钠50-100g，甘露醇30-60g，真空冷冻干燥72小时，得凝乳酶成品。
本发明的有益效果：
1.固体发酵培养基以麸皮为唯一原料，原料价格低廉；
2.操作工艺简单，发酵周期短，节约生产成本，省时经济，适合工业化生产和推广；
3.采用优质的菌种资源，凝乳酶酶活较高，凝乳酶粗酶液酶活13000U/mL，酶粉酶活,500000u/g以上。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：一种凝乳酶的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）米黑毛霉菌株:购自ATCC美国模式培养物集存库（American type culture collection），菌种编号NO.26282 Rhizomucor miehei；
（2）制备液体菌种：称取20-40g的麸皮煮沸8-12分钟，用四层纱布过滤，滤液用水定容至1000mL,取250mL装进500mL三角瓶，棉塞封口，121℃灭菌20分钟；冷却后，接种1环米黑毛霉孢子，33℃培养2天；
（3）液体菌种接种麸皮培养基：175g麸皮，加入150-210mL水，搅拌均匀，121℃灭菌25分钟，冷却后，接种液体种子，接种量20-60mL，25℃-50℃培养3天；
（4）浸提：1公斤发酵产物加入9%的氯化钠水溶液20升，室温浸提4 -12小时；
（5）离心：用80目滤布的板框压滤，过滤液用离心机8000-10000rpm转速离心，收集上清液，即为粗酶液。
实施例2：一种凝乳酶的制备方法，还包括以下步骤：
（6）超滤：取10升离心液，通过截留量为8k的超滤膜，废弃透析液，当酶液体积为1升-2升，停止超滤，浓缩比例5-10倍；
（7）干燥：1升超滤液添加氯化钠50-100g，甘露醇30-60g，真空冷冻干燥72小时，得凝乳酶成品。
酶活测定：采用Arima方法，用0.01mol/L CaCl2溶液配制10%的脱脂奶粉溶液，取5mL 10%的脱脂奶粉液于35℃保温10分钟，加入0.5mL适当稀释的酶液，立即摇匀，开始计时，并把试管倾斜45度以上，沿试管轴方向旋转，观察试管壁上开始出现凝结小颗粒为终点，记录凝乳时间。在上述条件下，40min凝乳1mL 10%脱脂奶粉的酶量定义为一个Soxhlet单位（SU）
酶活力（SU）=(供试乳体积/凝乳酶体积)×D×2400/t
式中：D为酶液稀释倍数；t为反应时间。
表1凝乳酶酶活计算实例
实施例3：
（1）制备液体种子：称取40g的麸皮煮沸10分钟，用四层纱布过滤，滤液用水定容至1000mL,取250mL装进500mL三角瓶，棉塞封口，121℃灭菌20分钟。冷却后，接种1环米黑毛霉孢子，35℃培养2天；
（2）制备培养基：175g麸皮，加入185mL水，搅拌均匀，121℃灭菌25分钟；
（3）接种：培养基冷却后，接种液体种子，接种量80mL，35℃培养60小时；
（4）浸提：加入9%的氯化钠水溶液3升，室温浸提12小时；
（5）离心：用80目滤布过滤，过滤液用离心机10000rpm/分钟转速离心，收集上清液，即为粗酶液；
（6）超滤：取3升离心液，通过截留量为8k的超滤膜，废弃透析液，当酶液体积为600mL,，停止超滤，浓缩比例5倍；
（7）干燥：600mL超滤液添加氯化钠45g，甘露醇18g，真空冷冻干燥72小时，得凝乳酶成品；
（8）经检测凝乳酶粗酶液酶活为12670U/mL。
实施例4：
（1）制备液体种子：称取20g的麸皮煮沸10分钟，用四层纱布过滤，滤液用水定容至1000mL,取250mL装进500mL三角瓶，棉塞封口，121℃灭菌20分钟。冷却后，接种1环米黑毛霉孢子，35℃培养2天；
（2）制备培养基：175g麸皮，加入210mL水，搅拌均匀，121℃灭菌25分钟；
（3）接种：培养基冷却后，接种液体种子，接种量60mL，35℃培养72小时；
（4）浸提：加入9%的氯化钠水溶液3.5升，室温浸提12小时；
（5）离心：用80目滤布过滤，过滤液用离心机10000rpm转速离心，收集上清液，即为粗酶液；
（6）超滤：取3.5L离心液，通过截留量为8k的超滤膜，废弃透析液，当酶液体积为500mL,，停止超滤，浓缩比例7倍；
（7）干燥：500mL超滤液添加氯化钠25g，甘露醇15g，真空冷冻干燥72小时，得凝乳酶成品；
（8）经检测凝乳酶粗酶液酶活为13650U/mL。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种凝乳酶的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）米黑毛霉菌株:购自ATCC美国模式培养物集存库，菌种编号NO.26282 Rhizomucor miehei；
（2）制备液体菌种：称取20-40g的麸皮煮沸8-12分钟，用四层纱布过滤，滤液用水定容至1000mL,取250mL装进500mL三角瓶，棉塞封口，121℃灭菌20分钟；冷却后，接种1环米黑毛霉孢子，33℃培养2天；
（3）液体菌种接种麸皮培养基：175g麸皮，加入150-210mL水，搅拌均匀，121℃灭菌25分钟，冷却后，接种液体种子，接种量20-60mL，25℃-50℃培养3天；
（4）浸提：1公斤发酵产物加入9%的氯化钠水溶液20升，室温浸提4 -12小时；
（5）离心：用80-150目滤布的板框压滤，过滤液用离心机8000-10000rpm转速离心，收集上清液，即为粗酶液；
（6）超滤：取10升离心液，通过截留量为8k-10k的超滤膜，废弃透析液，当酶液体积为1升-2升，停止超滤，浓缩比例5-10倍；
（7）干燥：1升超滤液添加氯化钠50-100g，甘露醇30-60g，真空冷冻干燥72小时，得凝乳酶成品。
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