具体实施方式
实施例1
本发明凝乳酶的发酵过程为:
步骤A、米黑毛霉菌种活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株购自美国模式培养物集存库,编号为ATCC No.16457,活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL;本发明中菌种活化采用常规的方法和试剂;
步骤B、按照下述配方配制发酵营养基:
称取大豆粉630g,玉米粉2400g,硫酸钠105g,葡萄糖183g,用水定容至30升。将发酵营养基灭菌后,接入步骤A中的菌悬液,接种量为发酵营养基体积的万分之一,在38℃下培养;
步骤C、从培养72h起、流加硫酸钠和葡萄糖的混合液,并继续发酵培养24h,发酵过程中维持葡萄糖的浓度为2%(即100mL发酵营养基中含有2g作为还原糖的葡萄糖),发酵结束后得凝乳酶的粗样品,测试该发酵液中凝乳酶的活力。
其中,硫酸钠与葡萄糖的比例为20g:1200g,混合液的总浓度为60%(100mL混合液中含有硫酸钠和葡萄糖共60g)。
凝乳酶活力的测试方法为:
一、试剂准备
1、 1mol/L醋酸溶液:吸取5.9mL的醋酸于100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,摇匀备用。
2、pH5.5缓冲溶液:量取10mL 1mol/L的醋酸溶液,称取10g三水合乙酸钠,将两者放入一烧杯中,溶解后转入1000mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,摇匀。若其pH在5.5,不用调节。
3、50g/L氯化钙溶液:称取5g氯化钙于烧杯中,用适量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,摇匀备用。
4、0.5g/L氯化钙溶液:吸取50g/L的氯化钙溶液5mL于500mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,摇匀备用。
5、底物溶液:称取22±0.1g的脱脂奶粉,量取200mL 0.5g/L氯化钙溶液,将两者放入一烧杯中,缓慢搅拌均匀,用磁力搅拌器搅拌30分钟,搅拌过程中避免产生泡沫。将该底物溶液在黑暗处室温放置30分钟,若其pH在6.5左右,不用调节。(该制备好的底物溶液在黑暗处室温放置不要超过4小时)。
6、凝乳酶标准品溶液制备:称取凝乳酶标准品2500±1mg于烧杯中,用适量pH5.5缓冲溶液溶解后转入50mL容量瓶中,用该缓冲溶液定容至刻度(第一次稀释),摇匀。将该凝乳酶标准品溶液做适当稀释(第二次稀释),使其凝结时间控制在350-550s范围。
二、测试步骤
1、样品处理:称取步骤C中一定量凝乳酶的粗样品,用缓冲溶液稀释成一定浓度,使其凝结时间控制在标准品溶液的凝结时间±40s的范围内,记录凝乳酶粗样品的稀释倍数(D)。
2、 量取25±0.1mL的所述底物溶液放入干燥的100mL三角瓶中,将三角瓶置于32±0.2℃的水浴槽中水浴至少12分钟(不要超过20分钟),吸取0.5mL的凝乳酶标准品溶液加入上述三角瓶中,并开始计时。边振荡边观察凝结情况(动作要轻,避免泡沫产生),记录瓶壁开始出现凝结物的时间,即凝乳酶标准品溶液所用的凝结时间tref,单位s。
样品(凝乳酶的粗样品)经步骤1处理后,进行上述相同的操作,记录凝乳酶的粗样品所用的凝结时间。
凝乳酶标准品溶液和凝乳酶的粗样品要使用同一批次底物溶液。凝乳酶标准品溶液和样品溶液各做2个平行,凝结时间取各自平行的平均值。
3. 计算
International Milk-clotting Units/mL=(tref×mref×V1×D×S)/(t×Vd1×Vd2)
式中 tref ----凝乳酶标准品溶液所用的凝结时间,s
mref ----称取的凝乳酶标准品的质量,g
V1----制备凝乳酶标准品溶液时,从第一次稀释液中所取的体积,mL
D----样品的稀释倍数
t----凝乳酶的粗样品所用的凝结时间,s
Vd1----制备凝乳酶标准品溶液时,第一次稀释所定容的体积,mL
Vd2----制备凝乳酶标准品溶液时,第二次稀释所定容的体积,mL
S----凝乳酶标准品的凝乳活力,IMCU/mL
按照上述公式计算发酵液样品的活力为298IMCU/mL。
实施例2
步骤A、米黑毛霉菌种活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株购自美国模式培养物集存库,编号为ATCC No.16457,活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL;
步骤B、按照下述配方配制发酵营养基:
称取大豆粉630g,玉米粉2400g,硫酸钠105g,葡萄糖183g,用水定容至30升。将发酵培养基灭菌后,接入步骤A中的菌悬液,接种量为发酵营养基体积的万分之一,在38℃下培养;
步骤C、从培养72h起、流加硫酸钾和葡萄糖的混合液,并继续发酵培养24h,发酵过程中维持葡萄糖的浓度为2%(同上),发酵结束后按照实施例1中的方法测试发酵液中凝乳酶的活力为302IMCU/mL。其中,硫酸钾和葡萄糖的比例为20g:1200g,混合液总浓度为60%(同上)。
实施例3
步骤A、米黑毛霉菌种活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株购自美国模式培养物集存库,编号为ATCC No.16457,活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL;
步骤B、按照下述配方配制发酵营养基:
称取大豆粉630g,玉米粉2400g,硫酸钠105g,葡萄糖183g,用水定容至30升;将发酵培养基灭菌后,接入步骤A中的菌悬液,接种量为发酵营养基体积的万分之一,在38℃下培养72h;
步骤C、培养72h起流加硫酸铵和葡萄糖的混合液,并继续发酵培养24h,发酵过程中维持葡萄糖的浓度为2%(同上),发酵结束后按照实施例1中的方法测试发酵液中凝乳酶的活力为286IMCU/mL。其中硫酸铵与葡萄糖的比例为20g:1200g,混合液总浓度为60%(同上)。
实施例4
步骤A、米黑毛霉菌种活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株购自美国模式培养物集存库,编号为ATCC No.16457,活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL;
步骤B、按照下述配方配制发酵营养基:
称取大豆粉630g,玉米粉2400g,硫酸钠105g,葡萄糖183g,用水定容至30升;将发酵培养基灭菌后,接入步骤A中的菌悬液,接种量为发酵营养基体积的万分之一,在42℃下培养72h;
步骤C、培养72h后起流加硫酸钠和葡萄糖的混合液,并继续发酵培养24h,发酵过程中维持葡萄糖的浓度为2%,发酵结束后按照实施例1中的方法测试发酵液中凝乳酶的活力为286IMCU/mL。其中硫酸钠与葡萄糖的比例为150g:1200g,混合液总浓度为60%(同上)。
实施例5
步骤A、米黑毛霉菌种活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株购自美国模式培养物集存库,编号为ATCC No.16457,活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL;
步骤B、按照下述配方配制发酵营养基:
称取大豆粉630g,玉米粉2400g,硫酸钠105g,葡萄糖183g,用水定容至30升;将发酵培养基灭菌后,接入步骤A中的菌悬液,接种量为发酵营养基体积的万分之一,在38℃下培养72h;
步骤C、培养72h起流加硫酸钾和葡萄糖的混合液,并继续发酵培养24h,发酵过程中维持葡萄糖的浓度为2%(同上),发酵结束后按照实施例1中的方法测试发酵液中凝乳酶的活力为295IMCU/mL。其中,硫酸钾和葡萄糖的比例为150g:1200g,混合液总浓度为60%(同上)。
实施例6
步骤A、米黑毛霉菌种活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株购自美国模式培养物集存库,编号为ATCC No.16457,活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL;
步骤B、按照下述配方配制发酵营养基:
称取大豆粉630g,玉米粉2400g,硫酸钠105g,葡萄糖183g,用水定容至30升;将发酵营养基灭菌后,接入步骤A中的菌悬液,接种量为发酵营养基体积的万分之一,在38℃下培养72h;
步骤C、培养72h后起流加硫酸铵和葡萄糖的混合液,并继续发酵培养24h,发酵过程中维持葡萄糖的浓度为2%(同上),发酵结束后按照实施例1中的方法测试发酵液中凝乳酶的活力为410IMCU/mL。其中硫酸铵与葡萄糖的比例为150g:1200g,混合液总浓度为60%(同上)。
若采用Arima 方法测定发酵液样品中凝乳酶的活力,具体方法如下:用0.01mol/L CaCl2 溶液配制10% 的脱脂奶粉溶液,取5mL 10% 的脱脂奶粉液于35℃保温10 分钟,加入0.5mL 适当稀释的酶液,立即摇匀,开始计时,并把试管倾斜45 度以上,沿试管轴方向旋转,观察试管壁上开始出现凝结小颗粒为终点,记录凝乳时间。在上述条件下,40min 凝乳1mL 10% 脱脂奶粉的酶量定义为一个Soxhlet单位(SU)
酶活力(SU)=( 供试乳体积/ 凝乳酶体积)×D×2400/t
式中, D 为酶液稀释倍数;t 为反应时间。
按照上述方法测得的凝乳酶活力为:82000U/mL。
实施例7
步骤A、米黑毛霉菌种活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株购自美国模式培养物集存库,编号为ATCC No.16457,活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL;
步骤B、按照下述配方配制发酵营养基:
称取大豆粉630g,玉米粉2400g,硫酸钠105g,葡萄糖183g,用水定容至30升;将发酵营养基灭菌后,接入步骤A中的菌悬液,接种量为发酵营养基体积的万分之一,在42℃下培养72h;
步骤C、培养72h后起流加硫酸钠和葡萄糖的混合液,并继续发酵培养24h,发酵过程中维持葡萄糖的浓度为2%(同上),发酵结束后按照实施例1中的方法测试发酵液中凝乳酶的活力为286IMCU/mL。其中硫酸钠与葡萄糖的比例为200g:1200g,混合液总浓度为60%(同上)。
实施例8
步骤A、米黑毛霉菌种活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株购自美国模式培养物集存库,编号为ATCC No.16457,活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL;
步骤B、按照下述配方配制发酵营养基:
称取大豆粉630g,玉米粉2400g,硫酸钠105g,葡萄糖183g,用水定容至30升;将发酵营养基灭菌后,接入步骤A中的菌悬液,接种量为发酵营养基体积的万分之一,在38℃下培养72h;
步骤C、培养72h后起流加硫酸钾和葡萄糖的混合液,并继续发酵培养24h,发酵过程中维持葡萄糖的浓度为2%(同上),发酵结束后按照实施例1中的方法测试发酵液中凝乳酶的活力为289IMCU/mL。其中,硫酸钾和葡萄糖的比例为200g:1200g,混合液总浓度为60%(同上)。
实施例9
步骤A、米黑毛霉菌种活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株购自美国模式培养物集存库,编号为ATCC No.16457,活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL;
步骤B、按照下述配方配制发酵营养基:
称取大豆粉630g,玉米粉2400g,硫酸钠105g,葡萄糖183g,用水定容至30升;将发酵培养基灭菌后,接入步骤A中的菌悬液,接种量为发酵营养基体积的万分之一,在38℃下培养72h;
步骤C、培养72h后起流加硫酸铵和葡萄糖的混合液,并继续发酵培养24h,发酵过程中维持葡萄糖的浓度为2%(同上),发酵结束后按照实施例1中的方法测试发酵液中凝乳酶的活力为285IMCU/mL。其中硫酸铵与葡萄糖的比例为200g:1200g,混合液总浓度为60%(同上)。
对比例1
按照以下配方配制营养基,大豆粉630g,玉米粉2400g,硫酸钠105g,葡萄糖183g,用水定容至30升,灭菌后接入提前在种子罐中培养好的米黑毛霉(Mucor miehei ATCC16457)种子培养物(按相同比例配制的种子培养基),接种量为万分之一(V/V,菌悬液中孢子浓度为1012CFU/mL),培养温度38℃,培养96小时后结束培养,测得的发酵样品中凝乳酶的活力为210IMCU/mL。
对比例2
按照以下配方配制营养基,大豆粉630g,玉米粉2400g,硫酸钠105g,葡萄糖183g,用水定容至30升;灭菌后接入提前在种子罐中培养好的米黑毛霉(Mucor miehei ATCC16457)种子培养物(按相同比例配制的种子培养基),接种量为万分之一(V/V,菌悬液中孢子浓度为1012CFU/mL),培养温度38℃,72小时起流加葡萄糖溶液,浓度为60%(同上),发酵过程维持葡萄糖浓度为2%(同上),继续培养24小时后结束培养,测得的发酵样品中凝乳酶活力为236IMCU/mL。
将对比例和实施例1~9进行比较,结果显示:菌种活化与菌种扩大培养相比,经活化后直接发酵所得的凝乳酶的粗产品活力明显提高,流加的葡萄糖和硫酸盐参与了凝乳酶的代谢过程,从而进一步提高了凝乳酶的活力。
综上所述,本发明去掉了菌种在种子罐中扩大培养的步骤,降低了微生物发酵生产过程中染菌的几率,减少了能量消耗;且发酵活力与原有工艺的210IMCU/mL相比,有了显著的提高,最高可提高95%。