CN104152511A - 一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺 - Google Patents
一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺，采用价格较低的无机Na2SeO3作为硒源，以液体发酵培养的方式，在用马铃薯葡萄糖制备的液体培养基中加入Na2SeO3溶液，通过荷叶离褶伞菌丝体的富集转化为有机硒，降低了硒的毒性，提高菌丝体的利用价值；将Na2SeO3在液体培养基的发酵中期加入，有效地降低硒对延滞期荷叶离褶伞菌丝体的抑制和毒害作用，提高荷叶离褶伞菌丝体中富硒胞内多糖的积累量。通过单因素试验和Box-Behnken试验设计以及响应面分析法，对富硒荷叶离褶伞胞内粗多糖发酵条件进行优化，得出最佳发酵条件，得到胞内粗多糖与各发酵条件各因素变量的二次回归方程模型，该模型回归极显著，对试验拟合较好，有一定的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及硒多糖的生产工艺，具体涉及一种荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖的发酵工艺。
背景技术
荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes ) 菌丝体中蛋白质含量高，氨基酸种类齐全，含有多种维生素，其多糖可以抑制肿瘤的生长，降低胰岛素依赖型小白鼠的血糖浓度，是一种营养价值和药用价值都很高的菌类。而且荷叶离褶伞菌丝体可以有效地富集一定量的硒。食用菌对硒具有较强的富集能力，通过菌丝体细胞内物质代谢，使无机硒安全有效地转化为有机硒多糖，其生物药理活性普遍高于多糖和硒，更容易被机体吸收和利用，同时营养成分因富硒得到改善。荷叶离褶伞人工栽培困难，其抗杂菌能力较差、出菇条件要求极高、子实体产量不稳定、栽培周期长等问题严重影响该菌的全面推广，改善荷叶离褶伞菌丝体的营养成分，提高其应用价值显得尤为重要。目前国内对食用菌中硒多糖研究仅限于从富硒子实体和菌丝体中的提取条件的优化，富硒多糖发酵条件的仅限于培养基成分，培养时间和pH因素等因素的改变，在优化的工艺条件下生产富硒粗多糖的产量仍然低，且工序复杂。
发明内容
本发明为了解决现有生产富硒粗多糖效率低的问题，提供一种荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖的发酵工艺。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺，具体包括以下步骤：
a)供试菌种
荷叶离褶伞菌种由河西学院甘肃省应用真菌工程实验室提供，菌种保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，菌种保藏号CGMCC No.1518，菌株号ZY48-1，专利号：ZL200510096405.0；
b)菌种活化
将荷叶离褶伞母种菌块接入新鲜的PDA固体培养基上，置于22℃恒温培养箱中培养15d后，再转接一次，22℃培养15d，备用；
c)液体培养基制备
将200g马铃薯洗净，去皮挖眼，切成2cm2的小块，加水煮沸20~30min，至马铃薯小块煮烂能被玻璃棒戳破即可，然后过300目筛得滤液，取其滤液800~900mL加入20g葡萄糖，使葡萄糖溶化后加水至1000mL，备用；
d)荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖发酵生产
将上述制备的液体培养基取100mL进行灭菌，所述的灭菌条件为115℃，20min、115℃，30min、121℃，15min、121℃，20min、121℃，30min其中的任意一种，冷却至20~25℃后接入荷叶离褶伞活化菌种块，接种后置于22℃、121rpm下培养发酵，至发酵的2~12d时，加入同等灭菌条件下灭菌的1mg/mL Na2SeO3溶液，使硒在液体培养基中的浓度为0~10ug/mL，然后继续在22℃、121rpm下培养发酵一定时间，在所述的继续培养发酵期间每天测定荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量；
e)利用响应面曲线法得到最优工艺条件
根据步骤d测定的荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的含量（mg/100mL），得到优化单因素发酵条件，然后利用响应面曲线法得到荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的最优发酵工艺条件。
1. 荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的生产
1.1灭菌条件对荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖生产的影响
将100mL的液体培养基和Na2SeO3溶液，采取将液体培养基和Na2SeO3溶液分别灭菌后再混合及两者混合后再灭菌的不同方式，在115~121℃、灭菌20~30min，混合时都使硒在液体培养基中的浓度为10ug/mL，冷却至20~25℃后，接入6片直径为6mm的荷叶离褶伞活化菌种块，在20~25℃、121rpm下培养至接种后第12d，测定荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量。
结合图1所示的标准曲线，从图2中得知，液体培养基和Na2SeO3溶液分别灭菌后再混合的方式培养的荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量高；灭菌条件为121℃，20min时，荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量达到最大，为70.8 mg/100mL。
优选的液体培养基和Na2SeO3溶液分别在121℃下灭菌20min后两者再混合。
1.2硒浓度对荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖含量的影响
分别对100mL的液体培养基和 1mg/mL Na2SeO3溶液在优选灭菌条件：121℃，20min下灭菌，将Na2SeO3溶液加入液体培养基中，使硒在液体培养基中的浓度为0~10ug/mL，冷却至20~25℃后接入6片直径为6mm的荷叶离褶伞活化菌种块，在20~25℃、121rpm下培养至接种后第12d，测定荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量。
从图3中得知，随着液体培养基中加入Na2SeO3量的增加，荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量呈现“N”字形，在浓度<4ug/mL和>4ug/mL时对荷叶离褶伞菌丝体中富硒胞内粗多糖含量的分泌均有抑制作用。在加硒浓度为4ug/mL时，荷叶离褶伞菌丝体中富硒胞内粗多糖含量达到113.2 mg/100mL高于不加Na2SeO3时菌丝体中胞内粗多糖103.6 mg/100mL的量。
优选的硒添加量为在液体培养基中加入Na2SeO3溶液使硒在液体培养基中的浓度为4ug/mL。
1.3硒添加时间对荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖含量的影响
将100mL的液体培养基，在121℃，20min下灭菌，冷却至20~25℃后接入6片直径为6mm的荷叶离褶伞活化菌种块，在20~25℃、121rpm下培养发酵至接种后第2~12d时，加入同等条件下灭菌的Na2SeO3溶液，使硒在液体培养基中的浓度均为4ug/mL，继续在20~25℃、121rpm下培养至接种后第12d，测定荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量。
如图4所示，随着硒添加时间的推迟，荷叶离褶伞菌丝体中富硒胞内粗多糖含量呈现波浪式增加，后逐步降低的趋势，在发酵的第6d加入Na2SeO3后，富硒胞内粗多糖含量达到最大，为320.6 mg/100mL，第6d后波浪式的降低，说明在菌丝体开始生长的过程中加入Na2SeO3有助于积累菌丝体中富硒胞内粗多糖。
优选的在液体培养基发酵的第6d加入硒为荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖合成的优选加入时间。
1.4培养时间对荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖含量的影响
将100mL的液体培养基，在121℃，20min下灭菌，冷却至20~25℃后接入6片直径为6mm的荷叶离褶伞活化菌种块，在20~25℃、121rpm下培养，至接种后发酵的第6d时，加入同等条件下灭菌的Na2SeO3溶液，使硒在液体培养基中的浓度均为4ug/mL，继续在22℃、121rpm下培养，培养时间分别设定为接种后第7~13d，测定荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量。
如图5所示，随着发酵培养时间的延长，荷叶离褶伞菌丝体内的富硒多糖含量呈现先增加后降低的趋势，在接种后发酵培养的第7～9d，荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖含量的增加比较缓慢，在接种后发酵培养的第9～10d，胞内粗多糖含量迅速增加，至发酵第10d达到最大值，为320.2 mg/100mL，第10d后富硒胞内粗多糖含量开始降低，降低幅度较慢。
优选的培养时间为加入Na2SeO3溶液后继续在22℃、121rpm下培养，至接种后的第10 d。
优选工艺条件为：在250mL三角瓶中，加入100mL的液体培养基，在121℃，20min下灭菌，冷却至20~25℃后接入6片直径为6mm的荷叶离褶伞活化菌种块，在22℃、121rpm下培养，至发酵至接种后第6d时，加入同等条件下灭菌的1mg/mL Na2SeO3溶液，使硒在液体培养基中的浓度为4ug/mL，继续在22℃、121rpm下培养发酵至接种后第10d，得到的荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量最高为320.2 mg/100mL。
2.Box-Behnken试验设计
根据单因素实验结果，固定灭菌条件，采用Box-Behnken 试验设计方法，以硒浓度、培养时间和添加硒的时间为相应变量，分别以X1、X2和X3表示，并以-1，0，1分别代表变量的水平，Box -Behnken 设计试验因素和水平见表1，以荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖为响应值，见表2。
表1 .Box-Behnken 设计试验因素与水平
表2 响应面分析实验方案与结果
应用Design Expert 软件进行多元回归拟合分析，得到荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖含量（Y）和各试验因素关系的方程：
Y=331.32+4.97X1+1.01X2+4.56X3-4.26X1X2-13.79X1X3-6.69X2X3+0.24X1 2+5.64X2 2-7.46X3 2，经检验，回归方程极显著（Ρ=0.0003），并且失拟项不显著，说明该方程对试验拟合较好，相关系数R2=0.9646，结果表明：加硒浓度和加硒时间两个因素在试验过程中起主要作用，对荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量的影响顺序为：加硒浓度>加硒时间>发酵时间。经方差分析得到：X1、X3、X1X3、X2X3、X2 2、X3 2 项极显著，X1X2项显著，因此各种因素和提取率的关系为二次曲线关系，因素X1和X2，X2和X2的交互作用的影响极显著，说明各因素之间的交互作用很大。
根据回归方程，做出响应曲面，考察拟合响应曲面的形状，分析培养时间、加硒浓度和加硒时间对富硒菌丝体胞内粗多糖含量的影响，如图6、图7、图8所示。
通过回归模型的预测，得到荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的最佳发酵工艺条件为：液体培养基在最佳灭菌条件下灭菌、冷却至20~25℃后接入荷叶离褶伞活化菌种块培养，至接种后的第129 h，在发酵液中添加同等条件下灭菌的1mg/mL Na2SeO3溶液，使硒在液体培养基中的浓度为4ug/mL ，继续培养发酵，至接种后的第244 h 时，胞内粗多糖含量349.8 mg/100mL。
本发明的有益效果是：
本发明的荷叶离褶伞菌丝体富硒粗多糖的制备工艺，采用价格较低的无机Na2SeO3作为硒源，成本低廉；以液体发酵培养的方式，在用马铃薯葡萄糖制备的液体培养基中加入Na2SeO3 溶液至硒在液体培养基中的浓度为1-10ug，通过荷叶离褶伞菌丝体的富集转化为有机硒，降低了硒的毒性，提高菌丝体的利用价值；将Na2SeO3在液体培养基的发酵中期加入，可以有效地降低硒对延滞期荷叶离褶伞菌丝体的抑制和毒害作用，提高荷叶离褶伞菌丝体中富硒胞内多糖的积累量，达到320.2mg/100mL，产率高。由于硒在高温条件下会和培养基成分发生反应，影响荷叶离褶伞菌丝体中富硒胞内粗多糖的发酵，本发明采用液体发酵培养，工艺条件易控制。对影响的单因素，灭菌条件、加入的硒量、加入硒的时间和发酵时间等，通过单因素试验和Box-Behnken 试验设计以及响应面分析法，对富硒荷叶离褶伞胞内粗多糖发酵条件进行优化，得出的最佳发酵条件为：在121℃下灭菌，20min，接种后发酵培养的第129h，发酵液中添加Na2SeO3，使硒在液体培养基中的浓度为4ug/mL，继续发酵培养至接种后第244h，测得的实际胞内粗多糖含量为349.8mg/100mL。并得到胞内粗多糖与各发酵条件各因素变量的二次回归方程模型，该模型回归极显著，对试验拟合较好，有一定的应用价值。
附图说明
图1.本发明糖含量的标准曲线图；
图2. 本发明灭菌条件对荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖含量的影响；
图3. 本发明硒浓度对荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖含量的影响；
图4. 本发明硒添加时间对荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖含量的影响；
图5. 本发明培养时间对荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖含量的影响；
图6.本发明硒浓度和发酵时间对荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖的响应面图；
图7. 本发明硒浓度和添加硒的时间对荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖的响应面图；
图8. 本发明发酵时间和添加硒的时间对荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖的响应面图。
具体实施方式
本发明使用的仪器与试剂：
Na2SeO3，KH2PO4，MgSO4，葡萄糖20g，KH2PO4 1g，MgSO4等化学试剂均为国产分析纯；
V-1200型可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；S70-CJ-18u洁净工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TDL-50大容量低速离心机 金坛市亿能实验仪器厂；LGJ-18冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司；DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；LDZX-50FBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；ZHWY-200B恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司。
供试菌种：荷叶离褶伞菌种，菌种保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，菌种保藏号CGMCC No.1518，菌株号ZY48-1。
菌种活化：将荷叶离褶伞母种菌块接入新鲜的PDA固体培养基上，置于22℃恒温培养箱中培养15d后，再转接一次，22℃培养15d，备用。
液体培养基制备：将200g马铃薯洗净，去皮挖眼，切成2cm2的小块，加水煮沸20~30min，至马铃薯小块煮烂能被玻璃棒戳破即可，然后过300目筛得滤液，取其滤液800~900mL加入20g葡萄糖，使葡萄糖溶化后加水至1000mL，备用。
实施例1
在250mL三角瓶中，取上述制备的液体培养基100mL和1mg/mL Na2SeO3溶液，将两者混合后置于121℃下灭菌20min，混合时使硒在液体培养基中的浓度为10ug/mL，冷却至20~25℃后，接入6片直径为6mm的荷叶离褶伞活化菌种块，在20~25℃、121rpm下培养至接种后第12d，得到的荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量为22.6mg/100mL。
实施例2
在250mL三角瓶中，取上述制备的液体培养基100mL和1mg/mL Na2SeO3溶液，两者分别在121℃下灭菌20min，然后将两者混合，混合时使硒在液体培养基中的浓度为10ug/mL，冷却至20~25℃后，接入6片直径为6mm的荷叶离褶伞活化菌种块，在20~25℃、121rpm下培养至接种后第12d，得到的荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量为70.8mg/100mL。
实施例3
在250mL三角瓶中，分别加入液体培养基100mL和1mg/mL Na2SeO3溶液，采取将液体培养基和Na2SeO3溶液分别灭菌后再混合及两者混合后再灭菌的不同方式，所述两种不同方式的灭菌条件都为115℃、20min，115℃、30min，121℃、15min，121℃、20min，121℃、30min；混合时都使硒在液体培养基中的浓度为10ug/mL，冷却至20~25℃后，接入6片直径为6mm的荷叶离褶伞活化菌种块，在22℃、121rpm下培养至接种后第12d，每个灭菌条件设三个平行对照实验，测定荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量，测定结果如图2所示，液体培养基和Na2SeO3溶液分别灭菌后再混合的方式生产的荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内多糖含量高。液体培养基和Na2SeO3溶液分别灭菌后混合，在不同灭菌条件下，荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量不同，灭菌条件为121℃，20min时，荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量达到70.8 mg/100mL。
实施例4
分别对100mL的液体培养基和 1mg/mL Na2SeO3溶液在最佳灭菌条件：121℃，20min下灭菌，将1mg/mL Na2SeO3溶液加入液体培养基中，使硒在液体培养基中的浓度分别达到0、1、2、4、5、6、8和10ug/mL，每个浓度设三个平行对照实验，冷却至20~25℃后接入6片直径为6mm的荷叶离褶伞活化菌种块，在22℃、121rpm下培养至接种后第12d，测定荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量，测定结果如图3所示，硒在液体培养基中的浓度为4??g/mL时，荷叶离褶伞菌丝体中富硒胞内粗多糖含量达到113.2 mg/100mL。
实施例5
在250mL三角瓶中，加入100mL的液体培养基，在121℃，20min下灭菌，冷却至20~25℃后接入6片直径为6mm的荷叶离褶伞活化菌种块，在22℃、121rpm下培养发酵至接种后第2、4、5、6、8、10和12d时，加入同等条件下灭菌的1mg/mL Na2SeO3溶液，使硒在液体培养基中的浓度均为4ug/mL，每一组设三个平行对照实验，继续在22℃、121rpm下培养至接种后第12d，测定荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量，测定结果如图4所示，至接种后发酵的第6d时加入Na2SeO3，荷叶离褶伞菌丝体中富硒胞内粗多糖含量达到320.6 mg/100mL。
实施例6
将100mL的液体培养基，在121℃，20min下灭菌，冷却至20~25℃后接入6片直径为6mm的荷叶离褶伞活化菌种块，在20~25℃、121rpm下培养，至发酵的第6d时，加入同等条件下灭菌的1mg/mL Na2SeO3溶液，使硒在液体培养基中的浓度均为4ug/mL，继续在22℃、121rpm下培养，培养时间分别设定为接种后第7~13d，每天测定荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量，测定结果如图5所示，接种后的第10d达到320.2 mg/100mL。
实施例7
在250mL三角瓶中，加入100mL的液体培养基，在121℃，20min下灭菌，冷却至20~25℃后接入6片直径为6mm的荷叶离褶伞活化菌种块，在22℃、121rpm下培养，至接种后第6d时，加入在121℃，20min下灭菌的1mg/mL Na2SeO3溶液，使硒在液体培养基中的浓度为4ug/mL，继续在22℃、121rpm下培养至接种后第10d，测得荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量达到最大为320.2mg/100mL。
Claims (6)
1.一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺，其特征在于：具体包括以下步骤：
a) 菌种活化
将荷叶离褶伞母种菌块接入新鲜的固体培养基上，置于22℃恒温培养箱中培养15d后，再转接一次，22℃培养15d，备用；
b) 液体培养基制备
将200g马铃薯洗净，去皮挖眼，切成2cm2的小块，加水煮沸20~30min，至马铃薯小块煮烂能被玻璃棒戳破即可，过300目筛得滤液，取其滤液800~900mL加入20g葡萄糖，使葡萄糖溶化后加水至1000mL定容，备用；
c) 荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵生产
取100mL步骤b制备的液体培养基置于115~121℃下灭菌15~30min，冷却后接入6片直径为6mm荷叶离褶伞活化菌种块，接种后放在20~25℃、121rpm下培养发酵，发酵期间加入同等条件下灭菌的Na2SeO3溶液，使硒在液体培养基中的浓度为0~10ug/mL，然后继续在20~25℃、121rpm下培养，每天测定荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的含量。
2.如权利要求1所述的一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺，其特征在于：所述的步骤c中接种后放在20~25℃、121rpm下培养发酵，接种后发酵2~12d时加入同等灭菌条件下灭菌的Na2SeO3溶液。
3.如权利要求1所述的一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺，其特征在于：所述的步骤c中加入Na2SeO3溶液后继续在20~25℃、121rpm下培养，培养至接种后的第7~13d。
4.如权利要求1所述的一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺，其特征在于：所述的步骤c取100mL的液体培养基，在121℃下灭菌20min，冷却至20~25℃后接入6片直径为6mm的荷叶离褶伞活化菌种块置于22℃、121rpm下培养发酵，至接种后的第6d时，加入同等条件下灭菌的1mg/mL Na2SeO3溶液，使硒在液体培养基中的浓度为4ug/mL，然后继续在22℃、121rpm下培养，直至接种后第10d测定荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的含量。
5.如权利要求1所述的一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺，其特征在于：根据步骤c得到优化单因素发酵条件，然后利用响应面曲线法得到荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的最佳发酵工艺条件。
6.如权利要求1所述的一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺，其特征在于：所述的步骤a的固体培养基为PDA固体培养基。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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