CN103555597A - 一种β-半乳糖苷酶的制备及其固定化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种β-半乳糖苷酶的制备与固定化的方法,以马克斯克鲁维酵母马克斯变种(Kluyveromyces marxianus)为菌种,进行发酵实验,离心收集细胞,高压破壁后得到β-半乳糖苷酶。然后,以磁性壳聚糖微球为载体,采用吸附-交联法固定β-半乳糖苷酶。本发明所得的β-半乳糖苷酶是食品工业中生产低聚半乳糖的关键酶,作为主要酶制剂为食品加工工业中的水解和转糖苷提供了一种方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种β-半乳糖苷酶的制备及其固定化方法。
背景技术
β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23 β-galactosidase),又称乳糖酶(Lactase),广泛存在于动物、植物、细菌和真菌中。β-半乳糖苷酶的分子质量在100-850 ku之间。根据其用途的不同,β-半乳糖苷酶最适pH范围较宽,在2.5-7.5之间。酶的最适作用温度范围也较宽,在20-90℃之间。它具有两种催化性质,可催化乳糖水解,将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖,或催化半乳糖基转移反应,在乳糖分子的半乳糖上连接1-4个半乳糖,生成低聚半乳糖(galactooligosaccharide,GOS)。目前,β-半乳糖苷酶在医药、食品、免疫、环境检测等领域应用广泛,用于提高乳制品的甜度,促进果蔬软化和成熟,生产低聚半乳糖,应用于发酵乳制品、乳清加工、基因诊断和基因治疗等方面。
目前,β-半乳糖苷酶应用的研究热点主要在固定化酶、生产低聚半乳糖和基因工程技术生产乳糖酶等方面。利用微生物发酵法生产β-半乳糖苷酶,酶源丰富,产量高,成本低,周期短,已成为工业化生产酶制剂的主要来源。近20多年来,人们对β-半乳糖苷酶进行了大量研究,由于游离酶在反应过程中不稳定,难以重复利用,生产成本高,不适合工业化生产。与游离酶相比,固定化酶具有催化效率高、稳定性好、低能耗、低污染,低成本,可重复使用、操作连续及工艺可控等优点,而且酶固定化技术是实现酶重复连续使用和改善稳定性的有效手段。壳聚糖是从甲壳类动物的外壳中提取的一种氨基多糖,易降解,无毒性,应用十分广泛。壳聚糖作为固定化酶载体具有机械性能好,化学性质稳定,耐热好,存在的游离氨基易与酶共价结合,又可络合金属离子,使酶免受金属离子的抑制。具有磁性的壳聚糖微球固定化酶技术,能保持酶催化高效性和专一性,有利于酶的重复性使用及产品的纯化。
发明内容
本发明在制备β-半乳糖苷酶的过程中采用菌种名称:马克斯克鲁维酵母马克斯变种15D(Kluyveromyces marxianus Var.marxianus15D),该菌种已2013年6月28日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC),保藏编号CCTCC No:M2013297.
菌种的来源:利用中科院微生物研究所提供的马克斯克鲁维酵母马克斯变种15D(Kluyveromyces marxianus Var.marxianus15D)为出发菌株,经紫外射线和硫酸二乙酯、亚硝基胍复合诱变,得到了马克斯克鲁维酵母马克斯变种15D。
菌种培养方法:
(1)诱变方法:菌体培养至对数期(测定A600nm=0.4-0.6之间),取 10ml菌液3000r/min离心15min,弃上清,用无菌生理盐水溶解沉淀,制成菌悬液,作为待处理菌液,取 5ml加到直径6cm的无菌培养皿内,并放人无菌磁力搅拌器,15W紫外灯50cm处分别照射0min、30min、60min,在红灯下将菌液稀释,
取0.5ml涂布于培养皿上,28℃恒温培养箱中培养72h,记录菌落数,计算致死率。取 10ml菌液 (测定A600nm=0.4-0.6之间),3000r/min离心15min,弃上清,用无菌生理盐水溶解沉淀,制成菌悬液加入到含有的亚硝基肌溶液的培养皿中,放入无菌磁力搅拌转子,在254nm紫外灯50cm处,分别照射30min、35min、40min后,分别取出0.5ml加入1ml生理盐水终止反应,涂布于麦芽汁固体培养皿,28℃培养72h之后测定酶活,从中选出了酶活最高的菌株 S8;再以菌株S8 为出发菌,用紫外线、硫酸二乙醋复合处理一次,测定酶活;最后再用紫外线、亚硝基肌复合处理一次,方法同上,最终得到酶活最高的菌株15D。
(2)突变株的筛选:随机挑取大、中、小菌落接入斜面,进一步用摇瓶发酵培养,从中筛选出高产β-半乳糖苷酶的菌株15D。
本发明提供一种β-半乳糖苷酶的制备与固定化的方法。该方法以马克斯克鲁维酵母马克斯变种 (Kluyveromyces marxianus var marxianus 15D)为菌种,进行发酵实验,离心收集细胞,高压破壁后得到β-半乳糖苷酶。最后,以磁性壳聚糖微球为载体,采用吸附-交联法固定β-半乳糖苷酶。
一种β-半乳糖苷酶的制备与固定化的方法,通过以下步骤来实现:
1.产β-半乳糖苷酶菌株的发酵
①麦芽汁培养基:麦芽汁配成10°Be, pH6.0-8.0,常压灭菌30min;
②产酶培养基:分别称取糖蜜,尿素,磷酸二氢铵,硫酸镁,硫酸铜,pH5.9,0.56-0.71 Kg/cm2压力,灭菌20min;
③种子液的制备:将马克斯克鲁维酵母马克斯变种 (Kluyveromyces marxianus var marxianus 15D)为菌种接种产酶培养基中,在25-45℃下振荡培养20-40h,初始pH5.0-7.0,装瓶量15-40ml,接种量5-10%,转速100-200 r/min;
2.粗酶液的制备
将③得到的种子液以2-8%的接种量,接种于产酶培养基,在25-45℃下振荡培养20-40h,于10000r/min离心20min,去除上清液,收集沉淀,将菌体沉淀溶于pH7.0的磷酸缓冲液中,使用高压破壁,即为β-半乳糖苷酶粗酶液;
3.β-半乳糖苷酶的固定化
①磁性壳聚糖微球的制备:称取纳米Fe3O4微球与4 mg/mL的壳聚糖乙酸溶液混合后,进行超声分散1-3h,混和均匀,在三角瓶中加入液体石蜡和司盘80,在40℃磁力搅拌下混合均匀,然后逐滴加入Fe3O4的壳聚糖溶液,40℃磁力搅拌10-40min,加入5-20mL 4%戊二醛溶液,反应0.5-2h,然后加入NaOH,使体系的pH达到9-11,升温至60℃,继续反应1-3h。减压过滤,依次用异丙醇,丙酮,乙醇,去离子水清洗,在60℃下真空干燥得磁性壳聚糖微球,置于4℃冰箱内保存;
②酶的固定化:称取一定量的的磁性壳聚糖微球加入到三角瓶中,用1.5%的乙酸溶液充分溶胀12h,加入0.1mol/l NaOH调节体系pH为7。同时,将a-葡萄糖苷酶溶于pH6.8 0.1 mol/l的磷酸缓冲液中,得到5-8 mg/mL的酶液,然后将配制好的酶液加入到磁性壳聚糖溶液中,在30℃、一定转速条件下,振荡吸附0.5-2h,再加入1%戊二醛溶液,在30℃、一定转速条件下,振荡交联0.5-2h,用磁铁收集磁性固定化酶,用缓冲液充分洗涤,用茚三酮法检测至无游离酶检出,在4℃下保存固定化的β-半乳糖苷酶。
本发明的优点和产生的有益效果:
1.本发明所得的β-半乳糖苷酶是食品工业中生产低聚半乳糖的关键酶,利用其催化乳糖水解功能,可生产低乳糖乳和奶粉等低乳糖制品。
2.本发明以纳米Fe3O4微球为基质,磁性壳聚糖微球为载体,采用吸附-交联法,固定β-半乳糖苷酶制备方便、简捷,酶活回收率高,具有良好的热稳定性和使用稳定性。
3.磁性壳聚糖微球是一种新型功能高分子材料,有利于固定化酶从反应体系中分离和回收,提高酶的催化效率和回收率。目前未见有以磁性壳聚糖微球为载体固定化β-半乳糖苷酶的报道及应用。
4、本发明采用马克斯克鲁维酵母马克斯变种产β-半乳糖苷酶,酶的活性较高,稳定性较好,克服了目前工业生产一般采用米曲霉和黑曲霉中的β-半乳糖苷酶,但存在产酶菌株的活力不高,稳定性较差等缺点。为进一步应用于工业化生产提供了一定的实验依据。
具体实施方式
实施例1:
本发明采用的菌株为:马克斯克鲁维酵母马克斯变种 (Kluyveromyces marxianus var marxianus 15D)
本发明所使用的试剂:糖蜜,尿素,麦芽汁培养基,医药用纳米Fe3O4微球(99.6%,≤20nm球形,市售),茚三酮,其他试剂均为分析纯。
本发明所采用的仪器:Mettler Toledo AL204分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司);LDZM型立式智能压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂);SHA-B水浴恒温振荡器(江苏常州);BS-1E恒温振荡培养箱(江苏金坛市亿通电子有限公司);UV-1800PC紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);MD2300全自动5L液体发酵罐(B. E. Marubsishi 日本)。GL-21M高速冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司)。AH100B高压细胞破碎机(ATS 工业系统有限公司);DL-SB-5Z20低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司);KQ3200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);791型磁力加热搅拌器(南汇电讯器材厂);DZG-6050型真空干燥箱(上海森信实验仪器有限公司);SHB-B95A型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。
下面结合实施例本发明的技术方案再作进一步的说明:
一种β-半乳糖苷酶的制备与固定化的方法,其步骤是:
1.产β-半乳糖苷酶菌株的发酵
一种β-半乳糖苷酶的制备及其固定化方法
其步骤如下:
1.培养基的制备
①麦芽汁培养基:麦芽汁配成10°Be, pH6.0-8.0,常压灭菌30min。该培养基可用于Kluyveromyces marxianus var marxianus 15D菌株生长;
②产酶培养基:20°Be糖蜜,尿素0.1%,磷酸二氢铵0.34%,硫酸镁0.15%,硫酸铜0.1%,pH5.9,0.56-0.71 Kg/cm2压力,灭菌20min。
③种子液的制备:将马克斯克鲁维酵母马克斯变种 (Kluyveromyces marxianus var marxianus 15D)为菌种接种产酶培养基中,在25-45℃下振荡培养20-40h,初始pH5.0-7.0,装瓶量15-40ml,接种量5-10%,转速100-200 r/min;
2.粗酶液的制备
将③得到的种子液以2-8%的接种量,接种于产酶培养基,在25-45℃下振荡培养20-40h,于10000r/min离心20min,去除上清液,收集沉淀,将菌体沉淀溶于pH7.0的磷酸缓冲液中,使用高压破壁,即为β-半乳糖苷酶粗酶液。
β-半乳糖苷酶的固定:
1.磁性壳聚糖微球的制备:称取0.16g纳米Fe3O4微球与4 mg/mL的壳聚糖乙酸溶液混合后,进行超声分散1.5h,混和均匀。在三角瓶中加入160mL液体石蜡和14mL司盘80,在40℃磁力搅拌下混合均匀,然后逐滴(10-15滴/分)加入Fe3O4的壳聚糖溶液,40℃磁力搅拌30min,加入10mL 4%戊二醛溶液,反应1h,然后加入12mL 1mol/L的NaOH,使体系的pH达到10,升温至60℃,继续反应2h。减压过滤,依次用异丙醇,丙酮,乙醇,去离子水清洗。在60℃下真空干燥得磁性壳聚糖微球,置于4℃冰箱内保存。
2.酶的固定化:称取8mg的磁性壳聚糖微球加入到三角瓶中,用2ml 1.5%的乙酸溶液充分溶胀12h,加入6ml 0.1mol/l NaOH调节体系pH为7。同时,将a-葡萄糖苷酶溶于pH6.8 0.1 mol/l的磷酸缓冲液中,得到浓度为6.5 mg/mL的酶液,然后吸取3ml配制好的酶液加入到磁性壳聚糖溶液中,在30℃、转速150 r/min条件下,振荡吸附1h,再加入2ml 1%戊二醛溶液,在30℃、转速150 r/min条件下,振荡交联1h,用磁铁收集磁性固定化酶,用pH6.8 0.1 mol/l的磷酸缓冲液洗涤,用茚三酮法检测至无游离酶检出,在4℃下保存固定化的β-半乳糖苷酶。
试验例
β-半乳糖苷酶5L发酵实验
在试管和摇瓶培养的基础上采用5L发酵罐完成发酵实验。培养基选用发酵用液体培养基,发酵条件:接种量为2-8%,pH5.0-7.0,培养温度25-45℃,培养时间20-40h。将试管培养的菌株接入到三角瓶中,放置在摇床上,搅拌速度100-200r/min,温度25-45℃培养20-40h后测定酶活力。把培养20-40h后的三角瓶中的菌株,接入到发酵罐中,搅拌速度400-600r/min,通气量2.0-2.5,温度25-45℃培养20-40h后测定酶活力,酶活力为22.1 U/mL,通过十批次的稳定性发酵试验,酶活力趋于恒定基本在20-30 U/mL之间。
Claims (1)
1.马克斯克鲁维酵母马克斯变种15D (Kluyveromyces marxianus var marxianus 15D)菌种,该菌种已于2013年6月28日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC),保藏编号CCTCC No:M2013297;马克斯克鲁维酵母马克斯变种 (Kluyveromyces marxianus var marxianus 15D)菌种,保藏编号CCTCC No:M2013297,通过中科院微生物研究所提供的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus Var.marxianus)为出发菌株,经紫外射线和硫酸二乙酯、亚硝基胍复合诱变,得到了马克斯克鲁维酵母马克斯变种15D;
培养方法:
(1)诱变方法:菌体培养至对数期(测定A600nm=0.4-0.6之间),取 10ml菌液3000r/min离心15min,弃上清,用无菌生理盐水溶解沉淀,制成菌悬液,作为待处理菌液,取 5ml加到直径6cm的无菌培养皿内,并放入无菌磁力搅拌器,15W紫外灯50cm处分别照射0min、30min、60min,在红灯下将菌液稀释,
取0.5ml涂布于培养皿上,28℃恒温培养箱中培养72h,记录菌落数,计算致死率;
取 10ml菌液 (测定A600nm=0.4-0.6之间),3000r/min离心15min,弃上清,用无菌生理盐水溶解沉淀,制成菌悬液加入到含有的亚硝基肌溶液的培养皿中,放入无菌磁力搅拌转子,在254nm紫外灯50cm处,分别照射30min、35min、40min后,分别取出0.5ml加入1ml生理盐水终止反应,涂布于麦芽汁固体培养皿,28℃培养72h之后测定酶活,从中选出了酶活最高的菌株 S8;再以菌株S8 为出发菌,用紫外线、硫酸二乙醋复合处理一次,测定酶活;最后再用紫外线、亚硝基肌复合处理一次,方法同上,最终得到酶活最高的菌株15D;
(2)突变株的筛选:随机挑取大、中、小菌落接人斜面,进一步用摇瓶发酵培养,从中筛选出高产β-半乳糖苷酶的菌株15D;
1、一种β-半乳糖苷酶的制备与固定化的方法,其步骤是:
(1)产β-半乳糖苷酶菌株的发酵
①麦芽汁培养基:麦芽汁配成10°Be, pH6.0-8.0,常压灭菌30min;
②产酶培养基:分别称取糖蜜,尿素,磷酸二氢铵,硫酸镁,硫酸铜,pH5.9,0.56-0.71 Kg/cm2压力,灭菌20min;
③种子液的制备:将马克斯克鲁维酵母马克斯变种 (Kluyveromyces marxianus)为菌种接种产酶培养基中,在25-45℃下振荡培养20-40h,初始pH5.0-7.0,装瓶量15-40ml,接种量5-10%,转速100-200 r/min;
(2)粗酶液的制备
将③得到的种子液以2-8%的接种量,接种于产酶培养基,在25-45℃下振荡培养20-40h,于10000r/min离心20min,去除上清液,收集沉淀,将菌体沉淀溶于pH7.0的磷酸缓冲液中,使用高压破壁,即为β-半乳糖苷酶;
(3)β-半乳糖苷酶的固定化
①磁性壳聚糖微球的制备:称取纳米Fe3O4微球与4 mg/mL的壳聚糖乙酸溶液混合后,进行超声分散1-3h,混和均匀;
在三角瓶中加入液体石蜡和司盘80,在40℃磁力搅拌下混合均匀,然后逐滴加入Fe3O4的壳聚糖溶液,40℃磁力搅拌10-40min,加入5-20mL 4%戊二醛溶液,反应0.5-2h,然后加入NaOH,使体系的pH达到9-11,升温至60℃,继续反应1-3h;
减压过滤,依次用异丙醇,丙酮,乙醇,去离子水清洗,在60℃下真空干燥得磁性壳聚糖微球,置于4℃冰箱内保存;
②酶的固定化:称取一定量的磁性壳聚糖微球加入到三角瓶中,用1.5%的乙酸溶液充分溶胀12h,加入0.1mol/l NaOH调节体系pH为7,同时,将a-葡萄糖苷酶溶于pH6.8 0.1 mol/l的磷酸缓冲液中,得到一定浓度的酶液,然后将配制好的酶液加入到磁性壳聚糖溶液中,在30℃、一定转速条件下,振荡吸附0.5-2h,再加入1%戊二醛溶液,在30℃、一定转速条件下,振荡交联0.5-2h,用磁铁收集磁性固定化酶,用缓冲液充分洗涤,用茚三酮法检测至无游离酶检出,在4℃下保存固定化的β-半乳糖苷酶。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C05 | Deemed withdrawal (patent law before 1993) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140205 |