CN103937765A - 一种耐热α-葡萄糖苷酶的制备与固定化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种耐热α-葡萄糖苷酶的制备与固定化的方法，以嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)为菌种，对产α-葡萄糖苷酶的培养条件进行优化，确定实验最佳条件，在此基础之上，进行多批次的5L小型发酵实验和20L放大发酵实验，对收集的产物，采用离心、高压破壁法，得到α-葡萄糖苷酶粗酶。最后，以磁性壳聚糖微球为载体，采用吸附-交联法固定α-葡萄糖苷酶。本发明所得的α-葡萄糖苷酶是工业上生产低聚异麦芽糖的关键酶，作为主要酶制剂用于淀粉加工工业中的糖苷的转移提供了一种方法。

Description

一种耐热α-葡萄糖苷酶的制备与固定化的方法
技术领域
本发明涉及一种耐热α-葡萄糖苷酶的制备与固定化的方法。
 
背景技术
α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，EC.3.2.l.20)，系统命名为α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，又名α-葡萄糖基转移酶或麦芽糖酶，简称α-糖苷酶。它在糖的催化反应方面具有水解和转糖苷双重作用，可从α-葡萄糖苷、寡糖和葡聚糖的非还原性末端切开α-1,4糖苷键，释放出葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基以α-1,6糖苷键转移到另一个糖类底物上，从而得到非发酵性的异麦芽低聚糖（简称IMO）、糖脂或糖肽等。
不同来源的α-葡萄糖苷酶相对分子质量差异很大，一般在40000-150000之间。pI在3.0-5.0之间，多数具有较高的热稳定性和最适温度，属于键专一性酶，可专一性地切开糖类底物分子中的α-1,4糖苷键，个别种类的也可以作用于蔗糖的α-1,2糖苷键。目前，α-葡萄糖苷酶已广泛应用于基础和开发研究领域，主要包括生产低聚异麦芽糖、淀粉水解、酒精发酵、催化化学合成、代谢机理研究、食品成分分析、临床检测和医学诊断等方面。
自20世纪80年代日本从黑曲霉中筛选出α-葡萄糖苷酶生产菌种，并得以工业化生产酶制剂以来，α-葡萄糖苷酶在基础研究和工业生产上发挥着越来越重要的作用。目前，国外生产的α-葡萄糖苷酶大部分为纯酶，酶活较高；而国内主要以粗酶液为主，酶活较低。而且，国内尚未有商品化α-葡萄糖苷酶酶制剂出售，用于生产的酶均来自国外少数几个酶制剂厂，进口价格昂贵。微生物发酵是α-葡萄糖苷酶产业化的基础，研究其生化性质、转糖苷反应条件、优化发酵工艺和固定化等方面，不仅可弥补工业生产中该酶依赖进口所带来的不便，还可填补国内研究领域空白，具有重要的理论和应用价值。
在实际生产中，由于游离酶价格昂贵，难以回收利用，稳定性和可控性欠佳，难以在工业中得到广泛的应用。而酶固定化技术是实现酶重复连续使用和改善稳定性的有效手段。与游离酶相比，固定化酶具有储存稳定性高、易于分离回收、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等优点，不仅在化学生物学、生物工程医学及生命科学等领域异常活跃，而且具有节省能源与资源、减少污染的生成。在固定化酶领域中，关键技术是交联试剂与载体的选择。壳聚糖是一种生物相容性好、易生物降解、无毒无副作用的天然高分子材料，其分子表面存在着丰富的羟基和氨基等官能团。具有磁性的壳聚糖微球固定化酶技术，不但能保持酶催化高效性和专一性，而且易于分离，有利于酶的重复性使用及产品的纯化。
发明内容
鉴于上述，本发明的目的在于提供一种耐热α-葡萄糖苷酶的制备与固定化的方法。该方法以嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)为菌种，对产α-葡萄糖苷酶的培养条件进行优化，确定实验最佳条件，在此基础之上，进行多批次的5L小型发酵实验和20L放大发酵实验，对收集的产物，采用离心、高压破壁法，得到α-葡萄糖苷酶粗酶。最后，以磁性壳聚糖微球为载体，采用吸附-交联法固定α-葡萄糖苷酶。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种耐热α-葡萄糖苷酶的制备与固定化的方法，其步骤是：
1.产α-葡萄糖苷酶菌株的发酵
①营养肉汁培养基：分别称取蛋白胨(OXIDE)，牛肉提取物(BBI)，氯化钠，加入蒸馏水，混合均匀，使氢氧化钠调整至pH7.0，1.05Kg/cm2灭菌20min。
②产酶培养基：分别称取蛋白胨(OXIDE)，牛肉提取物(BBI)，氯化钠，加入蒸馏水，混合均匀，自然pH，1.05Kg/cm2灭菌20min。
③种子液的制备：将嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)为菌种接种营养肉汁培养基中，在40-50℃下振荡培养15-25h，初始pH5.0-7.0，装瓶量20-40ml，接种量5-20%，转速100-300 r/min。
2.粗酶液的制备
将③得到的种子液以10%的接种量，接种于产酶培养基，在45℃下振荡培养24h，于10000r/min离心20min，去除上清液，收集沉淀，将菌体沉淀使用高压破壁，即为α-葡萄糖苷酶。
3.α-葡萄糖苷酶的固定化
①磁性壳聚糖微球的制备：称取纳米Fe3O4微球与0.01 g/mL的壳聚糖乙酸溶液混合后，进行超声分散10-30min，边搅拌边缓慢加入液体石蜡和司盘-80，室温下充分搅拌10-30min，加入浓度为4%戊二醛溶液，在60-80℃下充分搅拌1-3 h，之后在70-90℃水浴中，熟化1-3 h，用磁铁收集得到的产物，最后依次用石油醚、丙酮、蒸馏水充分洗涤，在50-70℃下真空干燥，得到磁性壳聚糖微球；
②酶的固定化：将磁性壳聚糖微球加入三角瓶中，加入pH为7.0的磷酸-磷酸钾缓冲液，充分混合1-3h，将磁性壳聚糖微球取出，同时，将α-葡萄糖苷酶溶于pH4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液中，得到浓度为0.8 mg/mL的酶液，然后将磁性壳聚糖微球加入到配制好的酶液中，再加入浓度为1%的戊二醛溶液，恒温振荡1.5 h，用磁铁收集磁性固定化酶，用缓冲液充分洗涤，在4℃下保存固定化的α-葡萄糖苷酶。
本发明的优点和产生的有益效果：
1.本发明所得的α-葡萄糖苷酶是工业上生产低聚异麦芽糖的关键酶，作为主要酶制剂用于淀粉加工工业中的糖苷的转移。
2.本发明以纳米Fe3O4微球为基质，磁性壳聚糖微球为载体，采用吸附-交联法固定α-葡萄糖苷酶，将固定化的酶与游离的酶相比，均有较大提高，特别是在固定化过程中较高温度时，使酶活性损失减少，酶的复活回收率较高。
3.磁性壳聚糖微球是一种新型功能高分子材料，兼有磁性无机物与壳聚糖聚合物的优点，有利于固定化酶从反应体系中分离和回收，提高了酶的催化效率和回收率，操作简便、成本较低，可实现生产工艺的连续化和工业化。
具体实施方式
实施例1
本发明采用的菌株为：嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus )
本发明所使用的试剂：蛋白胨(OXIDE)，牛肉提取物(BBI)，医药用纳米Fe3O4微球（99.6%，≤20nm球形，市售），其他试剂均为分析纯。
本发明所采用的仪器：Mettler Toledo AL204分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；LDZM型立式智能压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)； SHA-B水浴恒温振荡器(江苏常州)；BS-1E恒温振荡培养箱(江苏金坛市亿通电子有限公司)； UV-1800PC紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；MD2300全自动5L液体发酵罐(B. E. Marubsishi 日本)。GL-21M高速冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司)。AH100B高压细胞破碎机（ATS 工业系统有限公司）；DL-SB-5Z20低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）
一种嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)产α-葡萄糖苷酶的方法，其步骤如下：
1.培养基的制备
①营养肉汁培养基：分别称取蛋白胨(OXIDE) 10.0g，牛肉提取物(BBI) 3.0g，氯化钠5.0g，加入蒸馏水1.0L，混合均匀，使用5mol/L氢氧化钠(约0.2ml)调整至pH7.0，1.05Kg/cm2灭菌20min；该培养基可用于Bacillus stearothermophilus菌株生长；
②产酶培养基：分别称取蛋白胨(OXIDE) 10.0g，牛肉提取物(BBI) 3.0g，氯化钠5.0g，加入蒸馏水1.0L，混合均匀，自然pH，1.05Kg/cm2灭菌20min。
③种子液的制备：将菌种嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)接种营养肉汁培养基中，在45℃下振荡培养24h；初始pH5.0-7.0，装瓶量20-40ml，接种量5-20%，转速100-300 r/min。
2.粗酶液的制备
将种子液以10%的接种量，接种于产酶培养基，在45℃下振荡培养24h，于10000r/min离心20min，去除上清液，收集沉淀，将菌体沉淀使用高压破壁，即为α-葡萄糖苷酶。
实施例2
α-葡萄糖苷酶的固定方法为：
1. 磁性壳聚糖微球的制备：取0.40 g Fe3O4粒子与100 mL 0.01 g/mL壳聚糖乙酸溶液混合后，进行30 min超声分散，边搅拌边缓慢加入到70 mL液体石蜡和3 mL 司盘-80中，常温下搅拌30min，加入25mL 4%戊二醛，在80℃下搅拌2 h，然后在90℃水浴中熟化1.5 h，得到的产物用磁铁收集。再依次用石油醚、丙酮、蒸馏水充分洗涤，于60℃真空干燥，得磁性壳聚糖微球；
2. 固定化酶的制备：将90 mg磁性壳聚糖微球加入锥形瓶中，用10 mLpH7.0的磷酸-磷酸钾缓冲液充分溶胀2.5h取出，同时将α-葡萄糖苷酶溶于pH4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液中，配制成0.8 mg/mL的酶液。然后将微球加入α-葡萄糖苷酶缓冲溶液中，并加20 mL 1%的戊二醛，恒温摇床振荡1.5 h，用磁铁收集磁性固定化酶，用缓冲液充分洗涤，最后在4℃下保存固定化的α-葡萄糖苷酶。
试验例1
酶的性质
将酶分别在40-60℃温度下，缓冲液用pH6.8的磷酸盐缓冲液（0.2mol/L），以pNPG作为底物进行酶活测定，最高酶活为100%。
用不同pH5.0-9.0的40mmol/L Brittion-Robinson 通用缓冲液（40 mmol/L磷酸-40 mmol/L硼酸-40 mmol/L乙酸，用NaOH调pH）取代酶活测定方法中的缓冲液进行酶活测定。
取适量酶液（终浓度为5mM）分别在不同温度45-60℃下保温4h，每隔1h取出一组样品，置于4℃冰箱内，待保温结束后统一在标准条件下测定残余酶活，以未处理的酶液的酶活设为100%。    
酶在不同pH4.0-9.0的0.2mol/L Brittion-Robinson通用缓冲液中常温下24h处理后，加入0.2mol/L、pH6.8缓冲液恢复pH，然后在标准条件下测定残余酶活，以未处理的酶液的酶活设为100%。
经金属离子（Fe3+、Al3+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、K+）和化学试剂（EDTA）与酶液混合，使其最终浓度分别达到1.0 mM，5.0 mM，然后在45℃下测定酶活。以未经金属离子和化学试剂处理的酶液的酶活设为100%。
试验例2
酶活测定
α-葡萄糖苷酶活测定方法：采用对硝基酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物。精确吸取0.1ml pNPG溶液(浓度为5mmol/L)、0.2ml0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）和0.2ml蒸馏水于60℃水浴中保温5min，加入0.1ml适度稀释的酶液，反应10min后，立即加入3.0ml 0.2mol/L硼酸钠终止反应，在400nm测定吸光度值。
酶活力定义：每分钟水解产生1μmol对硝基酚所需的酶量为一个酶活力单位。在如下公式中计算酶活力：
酶活力单位(μmol/ml)=Y(A样)/(M×V)
使用空白管作为参比溶液，将测得的吸光度值在对硝基酚标准曲线中查找生成对硝基酚的量Y(A样)，M代表反应时间(10min)，V代表加入酶量(0.1ml)。
试验例3
α-葡萄糖苷酶5L小型发酵实验和20L放大发酵实验
（1）产α-葡萄糖苷酶5L小型发酵实验
在试管和摇瓶培养的基础上采用5L 发酵罐完成小型发酵实验。培养基选用经优化的小型发酵用液体培养基，发酵条件：接种量为5-20%，pH5.0-7.0，培养温度40-50℃，培养时间15-25h。将试管培养的菌株接入到三角瓶中，放置在摇床上，搅拌速度100-300r/min，温度40-50℃培养15-25h后测定酶活力。把培养15-25h后的三角瓶中的菌株，接入到发酵罐中，搅拌速度100-300r/min，通气量1.0-2.0，温度40-50℃培养15-25h后测定酶活力，酶活力为2.80 U/mL，通过十批次的稳定性发酵试验，酶活力趋于恒定基本在2.5-3.0 U/mL之间。
（2）产α-葡萄糖苷酶20L放大发酵实验
在试管和摇瓶培养的基础上采用20L发酵罐完成放大发酵实验。培养基选用经优化的小型发酵用液体培养基，发酵条件：接种量为5-20%，pH5.0-7.0，培养温度40-50℃，培养时间15-25h。将试管培养的菌株接入到三角瓶中，放置在摇床上，搅拌速度100-300r/min，温度40-50℃培养15-25h后测定酶活力。把培养15-25h后的三角瓶中的菌株，接入到发酵罐中，搅拌速度100-300r/min，通气量2-4，温度40-50℃培养15-25h 后测定酶活力。酶活力为13.5U/mL，通过十二批次的稳定性发酵试验，酶活力趋于恒定基本在10-15U/mL之间。

Claims (1)

1.一种耐热α-葡萄糖苷酶的制备与固定化的方法，其步骤是：
（1）产α-葡萄糖苷酶菌株的发酵
①营养肉汁培养基：分别称取蛋白胨，牛肉提取物，氯化钠，加入蒸馏水，混合均匀，使氢氧化钠调整至pH7.0，1.05Kg/cm2灭菌20min；
②产酶培养基：分别称取蛋白胨，牛肉提取物，氯化钠，加入蒸馏水，混合均匀，自然pH，1.05Kg/cm2灭菌20min；
③种子液的制备：将嗜热脂肪芽孢杆菌为菌种接种营养肉汁培养基中，在40-50℃下振荡培养15-25h，初始pH5.0-7.0，装瓶量20-40ml，接种量5-20%，转速100-300 r/min；
（2）粗酶液的制备
将种子液以10%的接种量，接种于产酶培养基，在45℃下振荡培养24h，于10000r/min离心20min，去除上清液，收集沉淀，将菌体沉淀使用高压破壁，即为α-葡萄糖苷酶； 
（3）α-葡萄糖苷酶的固定化
①磁性壳聚糖微球的制备：称取纳米Fe3O4微球与0.01 g/mL的壳聚糖乙酸溶液混合后，进行超声分散10-30min，边搅拌边缓慢加入液体石蜡和司盘-80，室温下搅拌10-30min，加入浓度为4%戊二醛溶液，在60-80℃下充分搅拌1-3 h，之后在70-90℃水浴中，熟化1-3 h，用磁铁收集得到的产物，最后依次用石油醚、丙酮、蒸馏水充分洗涤，在50-70℃下真空干燥，得到磁性壳聚糖微球；
②酶的固定化：将磁性壳聚糖微球加入三角瓶中，加入pH为7.0的磷酸-磷酸钾缓冲液，充分混合1-3h，将磁性壳聚糖微球取出，同时，将α-葡萄糖苷酶溶于pH4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液中，得到浓度为0.8 mg/mL的酶液，然后将磁性壳聚糖微球加入到配制好的酶液中，再加入浓度为1%的戊二醛溶液，恒温振荡1.5 h，用磁铁收集磁性固定化酶，用缓冲液充分洗涤，在4℃下保存固定化的α-葡萄糖苷酶。
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