CN101607987A - 一种植物乳酸杆菌素及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种植物乳酸杆菌素，其特征是由酸菜汁中的乳酸杆菌经增殖培养、UV光和DES复合诱变并发酵培养后分离、纯化得到的分子量≥10000的细菌素。本细菌素对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌(G⁺)有很强的抑制作用，而且对大肠杆菌(G^－)也有很强的抑制作用，同时对黑曲霉、酿酒酵母也有一定的抑制作用。

Description

一种植物乳酸杆菌素及其制备方法

一、技术领域

本发明涉及一种具有抑菌效果的细菌类抗菌肽及其制备方法，确切地说是一种植物乳酸杆菌素及其制备方法。

二、背景技术

目前，愈来愈严重的耐药性给未来的抗感染治疗带来了极大的威胁，针对这个问题，专家呼吁，医院应规范使用抗生素，农业应限制使用抗生素，同时应加强新型抗生素的研发，包括利用基因工程技术研究耐药性机理以改造现有的抗生素，研制和开发新的抗菌活性更强的抗生素，尤其是作用于新靶点的抗生素，而这将成为未来控制病原微生物必不可少的途径。在这样的背景下，抗菌肽逐渐引起了大家的注意，抗菌肽又称多肽类抗生素，它在自然界广泛存在，参与许多生物的自身防御性免疫，作用机理与传统抗生素不同，不易引起交叉抗性，因此具有成为新型抗生素的巨大潜力。

我国是乳酸菌资源丰富的国家，但对乳酸菌素的研究起步较晚。在近十几年内，中科院微生物研究所，山东大学等科研单位对乳酸菌素进行了大量的研究。但目前大多研究主要针对Nisin。其他乳酸菌素还相对较少。总体来讲，我国对乳酸菌素的研究还处在初级阶段，需大力进行乳酸菌素的基础研究和开发应用研究。

随着人们生活水平的提高，天然、绿色的食品越来越受到人们的关注。乳酸菌素作为一类天然食品防腐剂和饲料添加剂有着非常广阔的开发应用前景。但目前所研究的乳酸菌素主要对革兰氏阳性细菌有抑制或杀死作用，而对革兰氏阴性细菌无效。因而只能用于抑制革兰氏阳性细菌引起的食品腐败，而对一些由大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等革兰氏阴性细菌造成的食品腐败变质却无能为力。目前在国内外已研究的乳酸菌中，对革兰氏阴性细菌有抑制作用的乳酸菌素报道很少。所以研究开发一种新型的乳酸菌类细菌素成为当前的热点。

三、发明内容

本发明旨在提供一种对革兰氏阳性和阴性细菌同时具有抑菌作用的植物乳酸杆菌素，所要解决的技术问题是选择植物乳酸杆菌并通过筛选、诱变，得到乳酸杆菌素高产菌株以及乳酸杆菌素的分离和纯化。

本发明的技术方案是以酸菜汁中的乳酸杆菌(经鉴定为植物乳酸杆菌)为起始菌株，经增殖培养、抑菌实验后挑选抑菌圈最大的菌落(称LAB-X菌株)作为诱变出发菌株，LAB-X菌株经诱变处理得到变异菌株(称LABR-X菌株)，LABR-X菌株经发酵培养代谢生产植物乳酸杆菌素(下称细菌素或乳杆菌素)，最后自发酵液中分离、纯化得到所需的细菌素。

本发明所称的植物乳酸杆菌素就是以酸菜汁中的乳酸杆菌为起始菌株，经增殖培养、诱变处理和发酵培养后分离、纯化得到的分子量≥10000的细菌素。

本植物乳酸杆菌素的制备方法，以酸菜汁中的乳酸杆菌为起始菌株，包括增殖培养、诱变处理和发酵培养以及分离、提取、纯化各单元过程，所述的增殖培养就是将酸菜汁接种到MRS液体培养基中，37℃振荡培养24小时，经稀释后涂布在MRS培养基板上，37℃培养24小时，挑选LAB-X菌株作为诱变出发菌株，与现有技术的区别是诱变使用紫外光(UV)和硫酸二乙酯(DES)复合诱变各至少一次，UV光诱变为15-20W UV光照射菌悬液170～190秒，DES诱变为向菌悬液中加入DES，使DES的浓度1～2vt％(体积百分比)，振荡处理50～70分钟后加入0.5ml的25wt％(质量百分比)硫代硫酸钠溶液终止诱变，经复合诱变后得到变异高产LABR-X菌株，LABR-X菌株在MRS液体培养基中经种子培养和发酵培养后自发酵液中分离、提取细菌素并纯化，所述的分离提取是硫酸铵盐析沉淀法，就是向发酵液的上清液中加入浓度60wt％硫酸铵溶液，4℃下静置得到沉淀蛋白；所述的纯化是沉淀蛋白溶于25mmol/L磷酸缓冲液中用阳离子交换树脂层析纯化，层析柱初始PH值4.8～5.2、上柱后用浓度0.15～0.20mol/LNaCl溶液以4.5～5.5ml/mim流速洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥得到分子量≥10000的细菌素。

实验表明，本细菌素对金黄色葡萄球和枯草芽孢杆菌(G⁺)有很强的抑制作用，而且对大肠杆菌(G^-)也有很强的抑制作用，同时对黑曲霉、酿洒酵母也有一定的抑制作用。对金黄色葡萄球菌的效价由诱变前的3.2IU/ml增加到诱变后的89.17IU/ml。

本发明通过对LABR-X培养条件和分离于纯化工艺的优化，提高乳酸菌产生细菌的产量与纯度，并确定该细菌素分子的大小，为细菌素进一步的研究提供基础；为提高了细菌素的产量并为其工业化生产提供理论依据和技术指导。研究细菌素的生物学特性与抑制机理，开发出一种广谱、高效、高稳定性的安全可靠的适合在食品工业、饲料工业和医药行业中应用的新型乳酸杆菌细菌素。

四、附图说明

图1是UV照射菌悬液的致死率和正突变率曲线。

图2是变异菌株LABR-X发酵培养时的生长曲线。

图3是层析柱不同初始pH值洗脱下的细菌抑菌效果图。图中可见初始pH5时抑菌效果最好。

图4是不同浓度洗脱液洗脱下的细菌素抑菌效果图。图中可见浓度0.15～0.20mol/L为好，以0.15mol/L最佳。

图5是洗脱液不同流速下得到的细菌效果图。图中可见5ml/mim流速最佳。

图6是分子量大于10KD的A组分和杂蛋白B组分电泳图。图中i A组分，ii B组分，iii标准蛋白。

图7、图8是诱变前后菌株发酵浓缩液分别对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果照片，图中1、4为诱变前出发菌株抑菌效果，2、3是诱变后变异菌株抑菌效果。

图9是不同分子量的细菌素对大肠杆菌抑菌效果照片，图中A为分子量10000以上的抑菌效果，B为分子量1000～10000的抑菌效果，C为分子量1000以下的抑菌效果，D为B组分柱层分离的另一种蛋白质。

图10是分子量10000以上的A组分和B组分与nisin的抑菌效果对比，图中1.A组分含量为0.1mg/ml(20.28mm)，2.B组分含量为0.1mg/ml(8.00mm)，3.nisin含量为0.2mg/l(20.60mm)，4.nisin含量为0.1mg/ml(16.16mm)，5.nisin含量为0.02mg/ml(10.46mm)，6.nisin含量为0.01mg/ml(9.88mm)。

五、具体实施方式

实验过程

1实验材料与试剂准备

1.1实验样品

酸菜汁发酵液

1.2抑菌活性指示菌

大肠杆菌(Escherichia coli.)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

黑曲霉(Aspergillus niger)

酵母(Saccharomyces cerevisiae)

2培养基配制

2.1 MRS固体培养基(筛选培养基)：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，K₂HPO₄2g，柠檬酸铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，MgSO₄-7H₂O 0.58g，MnSO₄-4H₂O0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH6.2-6.4，121℃高压蒸汽灭菌15min。

2.2种子培养基和发酵培养基(MRS液体培养基)：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，K₂HPO₄ 2g，柠檬酸铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，MgSO₄-7H₂O 0.58g，MnSO₄-4H₂O 0.25g，蒸馏水1000mL，pH6.2-6.4，121℃高压蒸汽灭菌15min。

2.3供试菌生长培养基

(1)牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.4，121℃高压蒸汽灭菌15min。

(2)察氏(Czapack)培养基：蔗糖3g，NaNO₃ 0.3g，K₂HPO₄ 0.1g，KCl 0.05g，MgSO₄-7H₂O0.05g，FeSO₄ 0.001g，琼脂1.5g，蒸馏水100mL，自然pH(～7)121℃高压蒸汽灭菌15min。

2.4菌种鉴定用培养基

(1)淀粉培养基：蛋白胨10g，NaCl 5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000mL，琼脂15～20g，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌15min。

(2)明胶培养基：牛肉膏蛋白胨液100ml，明胶12-18g，pH 7.2-7.4，121℃高压蒸汽灭菌30min。

(3)蛋白胨水培养基：蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水1000ml，pH7.6，121℃高压蒸汽灭菌15min。

(4)葡萄糖蛋白胨水培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，K₂HPO₄ 2g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2，121℃高压蒸汽灭菌15min。

3实验方法

3.1检测方法采用牛津杯定量扩散法和双层平板法。即先倒入供试菌生长培养基为下层，待培养基冷却后，将灭菌后的牛津杯放上，然后倒入约15ml冷却至50℃上层培养基(100ml供试菌生长用培养基中加入1ml过夜培养的供试菌悬液)，冷凝后用无菌镊子取出牛津杯。乳酸菌发酵液离心后，取上清液150ul加入小孔中，然后在指示菌最适生长温度下培养24h，观察并测定抑菌圈直径。

3.2菌种的分离与初筛

3.2.1乳杆菌素产生菌的分离  为达到更好的分离效果，分离筛选前需进行增殖培养，按接种量10％将酸菜发酵液接入MRS液体培养基中，37℃振荡培养24小时。

使用血球计数板对增殖培养后的样品进行计数，根据计数结果用无菌水将样品逐级稀释至10^-1--10^-7，分别从10^-4-10^-6梯度的稀释液中吸取0.1ml菌液涂布于已经制备好的分离培养基平板上，37℃培养24h。

3.2.2产抑菌物质乳杆菌的筛选挑选分离平板上不同菌落形态的单菌落，接种到发酵培养基上，37℃振荡培养48h后，取发酵液于离心管中，12000r/min下离心20min。取150ul离心后发酵上清液，加到用抑菌活性检测用培养基制成的琼脂板小孔中，37℃培养24h，将在指示菌平板上形成透明圈的发酵上清液对应的菌株转接到斜面上，37℃培养24h，保存备用。

3.2.3酸性末端产物的排除发酵液对供试菌的抑制作用，可能是合成的乳酸菌素，也可能是酸性末端产物如乳酸、乙酸或其他有机酸作用的结果，为了排除酸性末端产物的干扰，将培养24h的发酵液离心，取上清调pH至6.0，进行抑菌实验(以大肠杆菌为供试菌)，以乳酸调等量的发酵培养基至pH6.0作为对照。

3.2.4过氧化氢干扰的排除将过氧化氢酶溶解在50mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)中配成母液，加入到上清液中使过氧化氢酶的终浓度为5mg/ml，在37℃水浴中温育2h后取出，检测过氧化氢酶处理后发酵液的抑菌活性。

3.3类细菌素产生菌的鉴定

3.3.1革兰氏染色法观察菌体形态

(1)涂片取抑菌效果较好的菌株斜面制成涂片，自然干燥后在酒精灯上固定。

(2)染色用草酸铵结晶紫染液染色1min，用水冲洗。

(3)媒染滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖1min，用水冲去碘液。

(4)乙醇脱色斜置载片与烧杯上，滴加95％乙醇，并轻轻摇动载片，至乙醇溶液不呈现紫色，立即用水冲去乙醇并用滤纸吸干。

(5)复染用蕃红染液复染1min，水洗。

(6)显微镜观察检验。

3.5乳杆菌素产生菌的培养特征  取隔夜培养的MRS发酵液1mL，用无菌水将样品逐级稀释至10^-1-10^-7，分别从10^-4-10^-7梯度的稀释液中吸取0.1ml菌液涂布于已经制备好的MRS固体培养基平板上，37℃培养24h。

3.6常规的生理生化鉴定

(1)过氧化氢酶测定将试验菌接种于MRS培养基斜面上，30℃培养18-24h，取一环接种的培养物，涂于干净的载玻片上，然后在其上滴加5％的过氧化氢，有气泡则为阳性反应，无气泡为阴性反应。(2)淀粉水解实验将菌种接种于淀粉培养基平板中，37℃培养24h，分别在接菌种的地方和没接菌种的地方加入卢哥氏碘液。接菌种的地方不显色表示淀粉水解，显蓝黑色或蓝紫色时，表示淀粉未水解或水解不完全。

(3)明胶水解实验将试验菌接种于明胶基础培养基中，置30℃培养，以一支来接种的试管作为对照管。将已接种的试管和未接种的对照管置于冰箱或冷水中，等待对照管凝固后，记录试验结果，应反复观察多次对比，如对照管凝固时，接种管液化为阳性反应，凝固为阴性反应。

(4)伏谱试验接种新鲜的试验菌种于MRS培养基中，30℃培养2d，取1ml培养液在其中加入1mL奈酚和1ml KOH，置于试管中混合，并陆续振荡30min，显示红色为阳性反应。

(5)吲哚试验接种新鲜的试验菌种于蛋白胨水培养基，培养2天后，在培养液中加3-4滴乙醚，摇动数次，静止1-3分钟，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。

(6)甲基红试验接种新鲜的试验菌种于葡萄糖蛋白陈水培养基，培养2天后，向葡萄糖蛋白陈水培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳性，变黄色者为阴性。

(7)氧的利用  采用深层琼脂法来测定氧对不同微生物生长的影响层培养基试管中接入各类微生物，根据微生物在试管中的生长部位，在适宜条件下培养后，在MRS琼脂深层观察生长状况，判断各类微生物对氧的需求及耐受能力，据此可将微生物分为五类：好氧菌，微好氧菌，兼性厌氧菌，专性厌氧菌，耐氧厌氧菌。

3.7高产菌株的诱变筛选

3.7.1紫外线(UV)诱变处理

(1)将活化后的菌株接到MRS液体培养基上，37℃振荡培养24小时，取出10ml，3000r/min下离心15min，弃上清，下面的菌体以10ml 0.1mol/LpH6.8～7.2的磷酸缓冲液洗涤两次，最后用原体积的磷酸缓冲液制成菌悬液，使菌体浓度约为10⁶个/mL。

(2)取以上制备好的菌悬液6mL于9cm的无菌培养皿中。选用15W紫外灯，打开预热15～20min以稳定光波。将盛有菌悬液的平皿放到离灯管30cm处，打开皿盖，分别照射30s、60s、120s、180s、240s、300s。经过紫外灯诱变后的菌体转入无菌试管内。

(3)分别取经UV照射处理过的和未经照射的(作为空白对照)菌悬液1mL进行梯度稀释。每个时间点取三个稀释度的菌悬液0.1mL涂于MRS固体培养基平板上，做三皿平行。

(4)37℃恒温培养24h，将存活的菌株接种到MRS发酵培养基中，培养24h，离心，取上清液进行抑菌实验。

3.7.2硫酸二乙酯(DES)的诱变处理

(1)将活化后的菌株接到MRS液体培养基上，37℃振荡培养24小时，取出10ml，3000r/min下离心15min，弃上清，下面的菌体以10ml 0.1mol/LpH6.8～7.2的磷酸缓冲液洗涤两次，最后用原体积的磷酸缓冲液制成菌悬液，使菌体浓度约为10⁶个/mL。

(2)吸取4ml菌悬液至三角瓶中，加入16mL 0.1mol/L pH6.8～7.2的磷酸缓冲液，制成约为10⁸个菌/ml菌悬液，再加入硫酸二乙酯0.1～0.3mL，使硫酸二乙酯在菌悬液中的浓度为1％～2％(V/V)，振荡处理60min。

(3)振荡处理60min后，立即加入0.5ml的25％硫代硫酸钠溶液终止反应。

(4)终止反应后的菌悬液以10倍稀释法坐一系列稀释至10^-7取后3个稀释度的菌悬液0.1ml涂布平板。以同样操作取未经硫酸二乙酯处理的菌液稀释涂布，37℃培养24h。

(5)将诱变所得存活菌株接种到MRS液体培养基中，培养24h，离心，取上清液进行抑菌实验。

3.7.3 UV与DES相结合的多轮复合诱变

对菌种进行UV与DES的多轮复合诱变，选取存活菌株进行抑菌实验。

2.3.5.4突变株的传代稳定性为考察突变株产类细菌素能力的稳定性，每隔一个星期转接一次，连续5个星期，然后做这五代的平行抑菌实验，考察其稳定性的变化。

3.8发酵条件的优化

选取单因素实验中抑菌效果较好的几个水平进行正交实验，初始培养基pH选4、6和8，培养温度选取30℃、35℃和40℃，接种量选取1％、3％和5％，装液量选取40％、60％和80％，选用L₉(3⁴)正交表。正交实验后，选取最优培养养条件进行抑菌实验。按2％～3％接种量，将活化18h的乳酸杆菌接入200mL MRS液体培养基中，37℃静置培养，于不同时间检测发酵液OD660nm，绘制优化后变异菌种LABR-X的生长曲线。

3.9乳酸杆菌素的提取与纯化

3.9.1硫酸铵盐析法粗提

LABR-X菌株发酵培养24h后，4000转4℃离心10～15min，收集离心上清液，采取硫酸铵不同浓度进行分级沉淀，缓慢搅拌1h后，放置4℃冰箱中过夜。取出后离心弃上清，各向沉淀中添加1ml的25nmol/L的磷酸盐缓冲液使沉淀溶解，测定沉淀蛋白的抑菌活性。

3.9.2 D151弱酸性阳离子交换树脂层析

细菌素的提取一般是根据其低分子量，阳离子性的特点来进行的，又由于乳酸菌产生的蛋白或肽在酸性条件下产生，推测其等电点PI＞PH，所以选择弱酸性阳离子交换树脂进行分离纯化。

(1)阳离子交换树脂的预处理与装柱将准备装柱使用的新树脂，先用70℃～80℃热水反复清洗，每隔约15分钟换水一次，浸洗时不要搅动，换水4～5次后，可隔约30分钟换水一次，总共换水7～8次，浸洗至泡沫很少时为止。然后将树脂装入层析柱。用1mol/L盐酸缓慢流过树脂，用量约为弱酸阳树脂的3～5倍，每小时1～2倍床层体积流过；用水冲洗，出水PH为6左右，用3倍树脂体积5％的NaCl溶液流过树脂，每小时1～2倍床层体积流过；用1mol/LNaOH流过树脂，用量约为树脂体积的3～5倍，流速约为每小时1～2倍床层体积；水冲洗至出水PH为9左右；用1mol/L盐酸缓慢流过树脂，用量与流速与前面相同；最后用去离子水冲洗至出水约为pH为7即可。

(2)层析柱初始pH值的选择用0.05mol/L的醋酸缓冲液缓慢流过层析柱，使层析柱的初始pH值为2、3、4、5、6、7。然后将洗脱下来的细菌素冷冻干燥后进行抑菌实验检测。结果见图3。

(3)洗脱液浓度的选择分别用浓度为0.05mol/L、0.10mol/L、0.15mol/L、0.20mol/L和0.25mol/L的NaCl溶液进行洗脱，然后将洗脱下来的细菌素冷冻干燥后进行抑菌试验。结果见图4。

(4)洗脱液流速的选择调整洗脱液的流速，使流速分别为1ml/min、3ml/min、5ml/min、7ml/min、9ml/min，将洗脱下来的细菌素冷冻干燥后进行抑菌实验检测和分子量测定。抑菌效果见图5。

4试验结果与分析

4.1类细菌素产生菌的初筛

酸菜汁发酵液经稀释涂布后在筛选培养基上长出大量菌落(图2-3)，在长出的菌落平板上挑选出8株典型菌株进行初筛，用牛津杯法检测初始菌株的抑菌作用。供试菌为大肠杆菌(Escherichia coli)，通过初筛，选出抑菌性最好的菌种LAB-X，其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌都有抑制性。

4.2酸性末端产物的干扰

乳酸菌发酵液对指示菌的抑菌作用，可能是代谢产生的细菌素引起的，也可能是发酵产物如乳酸、乙酸及其它有机酸作用的结果。所以应该排除有机酸的影响，试验结果见表2

表2排除有机酸的影响

Tab.2  Exclude the effects of organic acids

由表2可知，加入了乳酸的发酵培养基(pH6.0)，在供试菌生长平板上几乎没有产生的透明圈，而对照组的浓缩发酵上清液有较大的抑菌圈出现，说明起抑菌作用的物质除有酸性末端产物外，还有其他物质。

4.3过氧化氢干扰的排除

经过氧化氢酶处理的浓缩发酵上清液仍具有明显的抑菌作用(见表3)。

表3过氧化氢干扰的排除

Tab.3 Hydrogen peroxide to exclude interference

从表上可以看出该菌株的浓缩发酵上清液经过过氧化氢酶处理后，抑菌圈直径和浓缩发酵液的抑菌圈直径变化不大，活性下降了6.0％。从而证明该抑菌物质不完全是过氧化氢，而是其它物质具有抑菌作用。

4.4类细菌产生菌的鉴定和培养特征通过培养可以看到，菌落直径为为2mm，菌落呈圆形，乳白色，表面光滑，有光泽，边缘整齐。

4.6常规生理生化鉴定

细菌素产生菌的生理生化特征如表4所示。

根据LAB-X的形态、生长、生理生化特征，参照《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)与《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，初步认定该菌为植物乳杆菌。

表4细菌素产生菌的生理生化特征

Tab.4  Bacteriocin-producing strain of physiological and biochemical characteristics

注：+表示阳性；-表示阴性

4.7UV照射的最佳剂量

紫外线处理微生物时，在灯的功率和灯管距离都固定的情况下，其吸收剂量与照射时间成正比关系，只要控制照射时间，就可以控制剂量，因此选择照射时间作为相对剂量单位。出发菌株制成菌悬液经过UV照射不同时间，稀释涂布在MRS固体培养基上培养24小时后，选取存活菌落进行抑菌实验，其生长与抑菌情况如表5

表5 UV照射不同时间的菌悬液培养24h后的菌落计数结果

Tab.5 UV irradiation at different times of the bacteria suspensions after 24h culture colony count results

以死亡率和正突变率为纵坐标，照射时间为横坐标，制作UV对出发菌株的致死率与正突变率曲线，见图1。紫外线的照射时间与菌株致死率之间存在明显的剂量效应关系，随着紫外线时间的延长，致死率逐渐升高。正突变率随时间的延长而提高，但照射时间延长到180秒附近，正突变率逐渐下降，因此采用180s作为出发菌株的最佳照射时间，此时的致死率在76.2％，正突变率为11.9％最高。

4.8硫酸二乙酯(DES)诱变处理

将UV诱变后抑菌性明显的8株突变株为DES诱变的出发菌株，将该菌菌悬液进行DES诱变后定量涂布与筛选培养基平板上，37℃下培养24h，挑取长出的菌株进行抑菌试验以检测其抑菌活性变化。结果表明DES诱变的致死率为99.5％，正突变率为40％。

4.9 UV与DES相结合的多轮复合诱变

诱变育种往往采用诱变剂复合诱变，使它们产生协同效应，复合诱变处理可以扩大突变的位点范围，使获得正突变株的可能性增大，因此，诱变剂复合处理的效果往往好于单独处理。经过复合诱变后，LABR-X菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径明显增大，同时它对酵母菌与霉菌也有了一定的抑制作用。

4.10遗传稳定性

表6突变株LABR-X稳定性考察

Tab.6 Mutant LABR-X Stability

为考察突变株LABR-X发酵能力的稳定性，每隔一个星期转接一次斜面，摇瓶发酵测定其对大肠杆菌的的抑菌圈直径的大小，可以看出，该菌株摇瓶生产能力比较稳定。

经实验表明该诱变菌株LABR-X的发酵液不仅对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌(G⁺)有很强的抑制作用，而且对大肠杆菌(G^-)也有很强的抑制作用，同时对黑曲霉、酿酒酵母也有一定的抑制作用。依据通过效价的测定，其对金黄色葡萄球菌的效价由诱变前的3.2IU/ml增加到诱变后的89.17IU/ml。

4.11由正交试验得到的发酵液进行菌体密度和抑菌大小的测定，进而确定了最佳的培养条件：初始发酵液pH值为5～7，接种量(V/V)为1％～2％，装液量为55％～70％，培养温度为37℃。优化后变异菌种LABR-X的生长曲线如图2。

根据发酵生长曲线可知，发酵到18-26h为稳定期，发酵到28h后菌体浓度开始下降，进入衰退期。

4.12乳杆菌素纯化效果

表7乳杆菌素纯化表

Tab 7 The bacteriocins purification of comparison

4.13乳杆菌素分子量的估测

分别对洗脱过程得到的乳杆菌素和杂蛋白进行Tricine-SDS-PAGE测定其分子量的大小。通过同标准蛋白的条带比对。电泳效果见图6。LABR-X产生的乳杆菌素的分子量大约为20.1KD，而杂蛋白样品B电泳后发现明显拖尾的现象，可能是电泳条件不适合或发生了蛋白的降解产生的，其分子量小于14.4KD。

Claims (2)

1、一种植物乳酸杆菌素，其特征是由酸菜汁中的乳酸杆菌经增殖培养、UV光和DES复合诱变并发酵培养后分离、纯化得的分子量≥10000的细菌素。

2、一种植物乳酸杆菌素的制备方法，以酸菜汁中的乳酸杆菌为起始菌株，包括增殖培养、诱变处理和发酵培养以及分离和纯化，其特征在于：所述的诱变处理是对增殖培养后的菌悬液用UV光和DES复合诱变各至少一次，UV光诱变为15～20W UV光照射菌悬浮170～190秒，DES诱变为向菌悬浮中加DES，DES浓度为1～2vt％，振荡处理50～70分钟后加入25％wt硫代硫酸钠溶液终止反应；所述的分离是向发酵液中加入浓度60wt％硫酸铵溶液于4℃下静置得到沉淀蛋白；所述的纯化是沉淀蛋白溶于25mmol/L磷酸缓冲液中用阳离子树脂层析柱纯化，层析柱初始pH值4.8～5.2，用浓度0.15～0.20mol/LNaCl溶液以4.5～5.5ml/min流速洗脱。

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