CN103911411B - 含天蚕素AD和BuforinⅡ的抗菌肽复合液的生产及纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种有关抗菌肽复合液的生产及纯化方法，本方法以保藏编号为CGMCC No.4588的工程菌为出发菌种，经过发酵生产和分离纯化得到天蚕素AD和BuforinⅡ的抗菌肽复合液。本发明的有益效果是，以乳糖代替常规的诱导剂IPTG，降低了生产成本；实现乳糖自诱导表达融合蛋白CAD和Buforin II，简化操作规程，提高融合蛋白CAD和Buforin II表达稳定性，避免中途添加乳糖带来的染菌风险；利用中空纤维过滤、高压匀浆和层析柱分离技术，提高了融合蛋白CAD和Buforin II的得率；得到的天蚕素AD和蛙Buforin II复合溶液对E.coli DH5α有良好的杀菌活性，并且活性较单一抗菌肽增强。

Description

含天蚕素AD和BuforinⅡ的抗菌肽复合液的生产及纯化方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体是一种有关抗菌肽复合液的生产及纯化方法。

背景技术：

抗菌肽是生物体受到外界病原微生物入侵时产生的具有抗菌活性的阳离子多肽，是生物先天免疫重要的组成部分。抗菌肽对细菌有很强的杀伤作用，尤其是其对某些耐药性病原菌的杀灭作用更引起了人们的重视，并且抗菌肽还具有分子量低、水溶性好、热稳定、抗菌谱广、不易产生耐药性等特点，显示出了在医药、食品、农业等领域良好的应用前景。

天蚕素AD(Cecropin AD，CAD)是人工合成的由Cecropin A的N端1～11肽段和Cecropin D的C端12～37肽段组成的杂合肽，其能够作用于细菌细胞膜来发挥杀菌作用。抗菌肽BuforinⅡ是韩国学者Park等从亚洲蟾蜍的胃组织中分离纯化的有21个残基的抗菌肽，其抗菌活性很强，抗菌谱广，在不破坏细胞膜的前提下，高效穿过细胞膜后进入胞质强烈结合DNA，从而抑制微生物的生长。研究表明,上述两种抑菌机理不同的抗菌肽协同作用，能够有效的增强抑菌效果。

由于从动物或微生物中提取抗菌肽的产量少，成本高，所以用现代生物技术表达抗菌肽成为目前研究的热点。大肠杆菌系统因为遗传背景清楚、营养要求简单、生长速度快等优点，有利于重组蛋白的大规模生产，成为大量生产抗菌肽的首选途径。

大肠杆菌Trx-PC6/BL21（CGMCC No.4588 ）是将载有表达上述两种抗菌肽的基因的质粒pET-Trx-CAD-Buforin II转化到宿主细胞E.coli BL21(DE3)plysS中，得到的一株具有高效等比例表达含两种不同抑菌机制的抗菌肽能力的工程菌。

在大肠杆菌表达系统中，人们常常用 IPTG（异丙基-β-D-巯基半乳糖苷）作为表达诱导剂。然而，IPTG 不仅价格昂贵，而且具有潜在毒性，不利于应用于大规模生产。乳糖因其无毒、廉价等优点可作为IPTG的替代品用于诱导蛋白表达。与IPTG不同的是，乳糖必须借助于乳糖通透酶的作用进入细胞，并经过β-半乳糖苷酶的作用转化为半乳糖才能发挥诱导作用。而且，乳糖会作为碳源进入大肠杆菌的代谢途径而被逐渐消耗。因此，通常情况下，乳糖的诱导效果不如IPTG的诱导效果好，以乳糖作为诱导剂进行抗菌肽表达的研究也都停留在实验室阶段。而且，目前的研究采用的乳糖的诱导方式通常是在菌体生长到一定阶段再中途加入乳糖进行诱导。这种诱导方式操作繁琐，重复性差，还有染菌的风险。

另外，由于受到表达效率、生产成本等各种因素的影响，抗菌肽的研究开发工作尚不尽如人意。因此，如何提高抗菌肽的表达效率，降低生产成本，成为目前亟待解决的问题。而抗菌肽的纯化成本在其生产成本中占有非常重要的比重。研究抗菌肽的纯化工艺对于降低抗菌肽生产成本，推动抗菌肽的产业化具有举足轻重的作用。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题，就是针对现有技术所存在的不足，而提供一种从大肠杆菌表达系统出发，采用乳糖自诱导方式高效表达含等比例的两种不同抑菌机制的抗菌肽复合液，并将其分离纯化的生产工艺，实现了降低生产成本，提高抗菌肽得率。

本方案是通过如下技术措施来实现的：

本发明采用的表达pET-Trx-CAD-Buforin II的工程菌株Trx-PC6/BL21，具有氯霉素抗性，已保藏于“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，保藏编号为CGMCC No.4588，具有氯霉素抗性。

从该工程菌株出发，经过发酵生产和分离纯化得到天蚕素AD和BuforinⅡ的抗菌肽复合液， 其中发酵生产包括的步骤有活化、种子培养和发酵培养，

而分离纯化包括的步骤有发酵液浓缩、菌体收集、菌体破碎、蛋白质分离和蛋白质鉴定。

具体步骤如下，

1、活化：冷冻甘油管保存的大肠杆菌Trx-PC6/BL21划线接种于LB平板（1%蛋白胨，1% NaCl，0.5%酵母粉，1.5%琼脂粉），33-38℃培养8-12 h。

2、种子培养：将上述平板上长出的单菌落接入含有终浓度为80-120 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基（1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉）中，33-38℃，150-220 r/min转速震荡培养。

3、发酵培养：将上述培养好的种子培养液按照2-10%的接种量接种于含有终浓度为80-120 μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基（Na₂HPO₄ 4.475%，KH₂PO₄ 1.7%，(NH₄)₂SO₄7%，MgSO₄ 0.49%，酵母粉 5.5%）中，同时加入葡萄糖（浓度为1-3 g/L）、木糖（浓度为5-20g/L）和乳糖（浓度为0.1-0.5 g/L），温度控制在30-38℃，利用氨水维持pH为6-8， 每隔1小时取样测定糖含量，按照糖消耗情况流加30-50%的木糖使发酵液中木糖的浓度维持在6-12g/L左右，发酵15-30小时后收集菌体。

4、发酵液浓缩：使用陶瓷膜过滤设备一套，配有Exekia Membralox陶瓷膜进行菌体的收集。设定恒定过滤温度25-35℃，切向流设定为3-7 m/s，保持回流阀开放，滤出阀关闭，保持发酵液在系统内循环，待系统稳定后缓慢打开滤出阀，将初始过膜压力设定在0.5-1.2 Bar，滤出液返回原料罐，运行15-30 min以上，将发酵液浓缩10-15倍左右。

5、菌体收集：将上述浓缩的发酵液经3000-5000 r/min离心5-15 min后，利用PBS缓冲液（NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na₂HPO₄ 10mM， KH₂PO₄ 2mM）反复洗涤2-3次后，3000-5000r/min离心5-15 min后收集沉淀。

6、菌体破碎：在上述所得沉淀中加入破碎缓冲液（0.1%Triton X-100，100 mMNaCl， 25 mM Tris-HCl，0.2 M NaOH）在室温下裂解20-60 min后，3000-5000 r/min离心5-15 min保留破碎液上清。

7、蛋白质分离：向上述得到的菌体破碎液中加入羟胺溶液（终浓度为2 M）在45℃条件下处理6-8 h后，将处理液经过0.22 μm的纤维素薄膜过滤,上样到经过上样缓冲液[Na₂HPO₄ 50mM， （NH₄）₂SO₄ 2M]平衡30-60 min的HiTrap Pennyl FF（GE公司）的疏水柱中。然后利用上样缓冲液和50 mM的Na₂HPO₄溶液混合梯度洗脱，收集洗脱得到的蛋白峰。

8、蛋白质鉴定：在10-20mL LB培养基(温度60℃左右)中加入10-30μL对数生长期的大肠杆菌 DH5α(菌体数约107个/mL)，混匀，倒入直径9cm的玻璃平皿中,在水平台上迅速铺平，待培养基凝固后得到抑菌活性验证平皿。

将以上平皿在超净台内用灭过菌的牛津杯打孔，每孔加5μL前述收集得到的对应于不同蛋白峰的蛋白液，37℃培养过夜，观察抑菌情况。具有明显抑菌圈出现的蛋白即为天蚕素AD和蛙Buforin II抗菌肽等比例混合液。

本方案的有益效果有：1. 以乳糖代替常规的诱导剂IPTG，降低了生产成本；2. 通过检测，发现葡萄糖、乳糖和木糖同时添加，符合“碳源分解代谢阻遏”原理，如图1所示，实现乳糖自诱导表达融合蛋白CAD和Buforin II，简化操作规程，提高融合蛋白CAD和BuforinII表达稳定性，避免中途添加乳糖带来的染菌风险；3. 利用中空纤维过滤、高压匀浆和层析柱分离技术，提高了融合蛋白CAD和Buforin II的得率，可达到2～4g/L，占总蛋白的40%～60%，由于天蚕素AD和蛙Buforin II的疏水性十分接近，在疏水洗脱过程中可实现同时吸附和洗脱，从而能实现等比例分离；4.得到的天蚕素AD和蛙Buforin II复合溶液对E.coliDH5α有良好的杀菌活性，并且活性较单一抗菌肽增强。

由此可见，本发明与现有技术相比，具有突出的实质性特点和显著的进步，其实施的有益效果也是显而易见的。

附图说明：

图1为本发明具体实施方式的乳糖自诱导表达CAD（天蚕素AD）和Buforin II的代谢曲线图。

图2为CAD（天蚕素AD）和蛙Buforin II单一和混合溶液对大肠杆菌的抑菌圈照片。

具体实施方式：

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过一个具体实施方式，并结合其附图，对本方案进行阐述。

实施例1

摇瓶实验

工程菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）Trx-PC6/BL21，保藏编号为CGMCCNo.4588。

冷冻甘油管保存的大肠杆菌Trx-PC6/BL21划线接种于LB平板（1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉，1.5%琼脂粉），37℃培养10 h。

将上述平板上长出的单菌落接入装有50 mL的含有终浓度为100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基（1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉）的250 mL三角瓶中，37℃，200 r/min转速震荡培养活化。

将上述活化好的种子培养液按照5%的接种量接种于装有100 mL的含有终浓度为100 μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基（Na₂HPO₄ 44.75 g/L，KH₂PO₄ 17 g/L，(NH₄)₂SO₄ 70g/L，MgSO₄ 4.9 g/L，酵母粉 55 g/L）的500 mL三角瓶中，同时加入葡萄糖（浓度为1.5 g/L）、木糖（浓度为10 g/L）和乳糖（浓度为0.2 g/L），37℃，200 r/min转速震荡培养，定时取样分析糖消耗和蛋白表达情况。

图1中，正方形标记代表的葡萄糖浓度，三角形标记代表的是乳糖浓度，两者浓度由左边纵坐轴读取，圆形代表的木糖浓度，由右边第一个纵坐轴读取，矩形图代表的提取代表所占总蛋白比例，数值由右边第二个纵坐轴读取。可以看出，糖消耗情况严格遵守“分解代谢物阻遏”的规律，葡萄糖耗尽之后，木糖才开始消耗。而乳糖浓度都是在葡萄糖耗尽之后才开始减少，有效实现了乳糖的自诱导表达。从诱导效果上看，在培养16 h后，目的蛋白的表达量可占全菌总蛋白的45.2%。

实施例2

发酵罐实验

工程菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）Trx-PC6/BL21，保藏编号为CGMCCNo.4588。

冷冻甘油管保存的大肠杆菌Trx-PC6/BL21划线接种于LB平板（1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉，1.5%琼脂粉），37℃培养10 h。

将上述平板上长出的单菌落接入装有50 mL的含有终浓度为100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基（1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉）的250 mL三角瓶中，37℃，200 r/min转速震荡培养活化。

将上述活化好的种子培养液按照5%的接种量接种于工作体积为6 L的含有终浓度为100 μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基（Na₂HPO₄ 4.475%，KH₂PO₄ 1.7%，(NH₄)₂SO₄ 7%，MgSO₄ 0.49%，酵母粉 5.5%）的10 L发酵罐中，同时加入葡萄糖（浓度为1.5 g/L）、木糖（浓度为10 g/L）和乳糖（浓度为0.2 g/L），温度控制在35℃，利用氨水维持pH为6.8， 每隔1小时取样测定糖含量，按照糖消耗情况流加40%的木糖使发酵液中木糖的浓度维持在8 g/L左右，发酵20小时后收集菌体。经检测，发酵20 h后得到的菌体湿重为60 g/L。

实施例3

菌体的收集及蛋白纯化过程

使用实验用陶瓷膜过滤设备一套，配有Exekia Membralox陶瓷膜进行菌体的收集。设定恒定过滤温度30℃，切向流设定为5 m/s，保持回流阀开放，滤出阀关闭，保持发酵液在系统内循环，待系统稳定后缓慢打开滤出阀，将初始过膜压力设定在1.0 Bar，滤出液返回原料罐，运行20 min以上，将发酵液浓缩15倍左右。

将上述浓缩的发酵液经4000 r/min离心10 min后，利用PBS缓冲液（NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na₂HPO₄ 10mM， KH₂PO₄ 2mM）反复洗涤2-3次后，4000 r/min离心10 min后收集沉淀。在上述所得沉淀中加入破碎缓冲液（0.1%Triton X-100，100 mM NaCl， 25 mM Tris-HCl，0.2 M NaOH）在室温下裂解20-60 min后，4000 r/min离心10 min保留破碎液上清。

向上述得到的菌体破碎液中加入羟胺溶液（终浓度为2 M）在45℃条件下处理6-8h后，将处理液经过0.22 μm的纤维素薄膜过滤，上样到经过上样缓冲液[Na₂HPO₄ 50mM，（NH₄）₂SO₄ 2M]平衡30-60 min的HiTrap Pennyl FF（GE公司）的疏水柱中。然后利用上样缓冲液和50 mM的Na₂HPO₄溶液混合梯度洗脱，收集洗脱得到的蛋白峰。

在15mL LB培养基(温度60℃左右)中加入20 μL对数生长期的大肠杆菌 DH5α(菌体数约107个/mL)，混匀，倒入直径9cm的玻璃平皿中,在水平台上迅速铺平，待培养基凝固后得到抑菌活性验证平皿。

将以上平皿在超净台内用灭过菌的牛津杯打孔，每孔加5μL前述收集得到的对应于不同蛋白峰的蛋白液，37℃培养过夜，观察抑菌情况。具有明显抑菌圈出现的蛋白即为天蚕素AD和蛙Buforin II抗菌肽混合液，产量达到2.4 mg/L。

实施例4

天蚕素AD和蛙Buforin II单一和混合溶液对大肠杆菌的抑菌活性

分别将天蚕素AD、蛙Buforin II以及的天蚕素AD和蛙Buforin II不同比例的混合溶液（分别为1:1,1:2和2:1），以E.coli DH5α为实验菌株，采用标准琼脂孔穴扩散法，测定其抑菌活性。结果显示，天蚕素AD和蛙Buforin II的1:1混合溶液抑菌圈最大，直径可达到25 mm，明显大于其他溶液的抑菌直径（图2），其中，1为缓冲液空白对照，2为CAD溶液，3为Buforin II溶液，4为CAD和Buforin II的1:1混合溶液，5为CAD和Buforin II的1:2混合溶液，4为CAD和Buforin II的2:1混合溶液。表明，天蚕素AD和蛙Buforin II混合溶液对E.coli DH5α有良好的杀菌活性，并且等比例混合溶液具有最佳的抑菌活性。

本发明并不仅限于上述具体实施方式，本领域普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.含天蚕素AD和BuforinⅡ的抗菌肽复合液的生产及纯化方法，本方法以保藏编号为CGMCC No.4588的工程菌为出发菌种，经过发酵生产和分离纯化得到天蚕素AD和BuforinⅡ的抗菌肽复合液，其特征是：

所述的发酵生产包括的步骤有活化、种子培养和发酵培养，

所述的分离纯化包括的步骤有发酵液浓缩、菌体收集、菌体破碎、蛋白质分离和蛋白质鉴定;

所述的活化步骤使用的培养基为LB培养基；

所述的种子培养步骤使用的培养基为含有终浓度为80-120 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基；

所述的发酵培养步骤使用的培养基为Na₂HPO₄ 44.75 g/L、KH₂PO₄ 17 g/L、(NH₄)₂SO₄ 70g/L、MgSO₄ 4.9 g/L、酵母粉 55 g/L、80-120 μg/mL的氨苄青霉素、1-3 g/L的葡萄糖、5-20g/L的木糖和0.1-0.5 g/L的乳糖；

所述的发酵液浓缩采用陶瓷膜过滤；

所述的菌体破碎使用的缓冲液为0.1%Triton X-100，100 mM NaCl， 25 mM Tris-HCl和0.2 M NaOH；

所述的蛋白分离采用疏水柱洗脱；

所述的蛋白质鉴定采用管碟法;

所述的陶瓷膜过滤采用的Exekia Membralox陶瓷膜，浓缩工艺条件为恒定过滤温度25-35℃，切向流设定为3-7 m/s，保持回流阀开放，滤出阀关闭，保持发酵液在系统内循环，待系统稳定后缓慢打开滤出阀，将初始过膜压力设定在0.5-1.2 Bar，滤出液返回原料罐，运行15-30 min以上，将发酵液浓缩10-15倍，

所述的疏水柱洗脱工艺为将菌体破碎液经过0.22μm的纤维素薄膜过滤后，上样到经过上样缓冲液平衡30-60 min的HiTrap Pennyl FF的疏水柱中，所述的上样缓冲液为Na₂HPO₄ 50mM，（NH₄）₂SO₄ 2M，然后利用上样缓冲液和50 mM的Na₂HPO₄溶液混合梯度洗脱，收集洗脱得到的蛋白峰，

所述的管碟法为单层平板，表面涂布菌体的方法。